CN110522925A - 一种功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子及其制备方法和应用 - Google Patents

一种功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子及其制备方法和应用 Download PDF

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CN110522925A CN201810506554.7A CN201810506554A CN110522925A CN 110522925 A CN110522925 A CN 110522925A CN 201810506554 A CN201810506554 A CN 201810506554A CN 110522925 A CN110522925 A CN 110522925A
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Abstract

本申请公开了一种功能化纳米材料‑抗原复合纳米粒子及其制备方法和应用。所述复合纳米粒子包括功能化纳米材料、抗原；其制备方法简单；避免了自由抗原免疫原性弱所导致的无法达到理想肿瘤免疫效果的缺点并解决了目前成像与肿瘤免疫治疗分立的问题，达到了荧光成像或磁共振成像和肿瘤免疫治疗的双重目的。

Description

一种功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子及其制备方法和 应用
技术领域
本申请涉及一种功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子及其制备方法和应用，属于材料制备方法及应用领域。
背景技术
恶性肿瘤是继心脑血管疾病后最威胁人类健康和生命的疾病，且其发病率仍逐年增高。根据世界卫生组织预测，2020年肿瘤新发病例将达到2000万，其中死亡病例1200万，肿瘤将成为新世纪人类的第一杀手。
肿瘤的治疗依然是医学界的难题。作为三大常规手段的手术，放疗和化疗并非能治愈所有的肿瘤，且上述三大常规治疗方法的特异性不足，常对正常组织和器官造成不同程度的损伤。肿瘤治疗的理想方法是在特异性清除肿瘤细胞的同时，正常组织不受损伤。
随着目前生物技术的迅速发展和对肿瘤发生分子机制的深入研究，特异性较强的肿瘤免疫治疗近来备受关注，成为肿瘤治疗领域的焦点。肿瘤免疫治疗通常通过调动宿主的防御机制或者借助生物制剂的作用，以调节机体的抗肿瘤免疫应答，从而杀伤或者抑制肿瘤生长的治疗方法。由于其卓越的疗效和创新性，在2013年被《科学》杂志评为年度最重要的科学突破。目前常用的肿瘤免疫治疗手段主要包括肿瘤疫苗，细胞治疗，分子靶向治疗，细胞因子以及基因治疗等。近十几年以来，肿瘤疫苗的研发倍受重视，是利用疫苗引发特异性抗肿瘤T细胞反应，从而消灭肿瘤的一种治疗性疫苗。肿瘤疫苗主要包括：肿瘤抗原肽段疫苗，树突状细胞疫苗，溶瘤病毒疫苗。
纳米体系已用于靶向传递治疗性药物、纳米器件以及诊断治疗的分析体系，其应用范围包括药物传递、肿瘤及基因治疗、通过生物标记及生物传感来实现成像及细胞示踪，已用于提高临床成像分辨率、灵敏度以及特异性，实现早期诊断及实时监控。荧光成像能够简单明了的对体外细胞以及体内部位进行成像，体内可视化能帮助分析肿瘤免疫治疗所处阶段，有利于检测治疗效果。
发明内容
根据本申请的一个方面，提供了一种功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子及其制备方法，避免了自由抗原免疫原性弱所导致的无法达到理想肿瘤免疫效果的缺点并解决了目前成像与肿瘤免疫治疗分立的问题，达到了荧光成像或磁共振成像和肿瘤免疫治疗的双重目的。
所述功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子，其组分包括功能化纳米材料、抗原；
其中，所述抗原位于功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子内侧；功能化纳米材料堆积搭载于抗原外侧并将抗原包覆；或
所述功能化纳米材料位于功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子内侧；功能化纳米材料外侧搭载抗原。
可选地，所述功能化纳米材料和抗原的质量比为0.01～6.25:1。
可选地，所述功能化纳米材料和抗原的质量比为0.025～2:1。
可选地，所述功能化纳米材料和抗原的质量比为0.625～6.25:1。
可选地，所述功能化纳米材料和抗原的质量比为0.01～0.25:1。
可选地，所述功能化纳米材料和抗原的质量比为5：8或1:100。
可选地，所述功能化纳米材料和抗原的质量比上限选自20:1、5:1、2:1、5:8、1:4、1:5、1:10、1:20、1:40或1:100；下限选自5:0.8、5:2、5:8、1:4、1:5、1:10、1:20、1:40或1:50。
可选地，所述碳量子点、四氧化三铁纳米粒子通过原料反应后具有羧基官能团，用于制备功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子。
可选地，所述功能化纳米材料选自碳量子点、四氧化三铁纳米粒子中的至少一种；
所述抗原选自卵清蛋白、卵清蛋白多肽中的至少一种。
可选地，所述的抗原包括具有抗原特性的卵清蛋白、卵清蛋白多肽或其他抗原蛋白或其他抗原多肽。
可选地，所述的具有抗原性质的鸡卵清蛋白为本领域具有抗原性质的蛋白模型，可以为卵清蛋白、卵清蛋白多肽以及类似的抗原蛋白及其多肽。
可选地，所述的具有功能化的纳米材料为碳量子点、四氧化三铁纳米粒子中的一种或多种。
可选地，所述功能化纳米材料的粒径为1～5nm。
可选地，所述的具有荧光性或磁共振功能的碳量子点或四氧化三铁纳米粒子的粒径为1～5nm。
可选地，所述功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子的粒径为1～200nm。
可选地，所述功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子的粒径为40～100nm。
可选地，所述功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子在488nm激发波长照射下发射绿光。
可选地，所述功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子在552nm激发波长照射下发射黄光。
可选地，所述功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子在638nm激发波长照射下发射红光。
本申请中，将具有荧光性能的碳量子点与具有抗原特性的蛋白或者具有抗原特性的多肽通过反应复合，或具有磁共振成像四氧化三铁纳米粒子与具有抗原特性的蛋白或者具有抗原特性的多肽通过反应复合，制得包括碳量子点-抗原复合纳米粒子以及四氧化三铁-抗原复合纳米粒子在内的功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子。
本申请的另一方面，提供了所述的功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子的制备方法，其特征在于，至少包括以下步骤：
(1)获得功能化纳米材料；
(2)将含有功能化纳米材料和抗原的混合物在4℃～50℃的条件下反应16h以上，得到所述功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子。
可选地，步骤(1)中所述功能化纳米材料具有羧基官能团。
可选地，步骤(1)中所述功能化纳米材料的制备方法包括高温热解法、共沉淀法中的至少一种。
可选地，所述高温热解法的温度为20℃～200℃，反应时间在1h以上；
所述共沉淀法的温度为20℃～400℃，反应时间在0.5h以上。
可选地，所述高温热解法制备得到碳量子点；所述共沉淀法制备得到四氧化三铁纳米粒子。
可选地，所述碳量子点的制备方法包括：将含有碳源、钝化剂和溶剂的混合物在20℃～200℃的条件下，反应时间在1h以上，得到所述碳量子点；
所述四氧化三铁纳米粒子的制备方法包括：将含有铁盐、沉淀剂和溶剂的混合物在20℃～400℃的条件下，反应时间在0.5h以上，得到所述四氧化三铁纳米粒子。
可选地，所述碳量子点的制备方法包括高温热解法；
所述四氧化三铁纳米粒子的制备方法包括共沉淀法。
可选地，所述碳量子点的制备温度为20℃～200℃，反应时间在1h以上，
所述四氧化三铁纳米粒子的制备温度为20℃～400℃，反应时间在0.5h以上。
可选地，所述碳量子点的制备温度为160℃～180℃。
本领域的技术人员可以根据上述制备条件，选择具体的反应温度和反应条件制备得到碳量子点或四氧化三铁纳米粒子。
可选地，所述的用于制备具有荧光性质的碳量子点的原料包括柠檬酸、聚乙二醇1500、乙二胺的三乙醇胺溶液，所述的用于制备具有磁共振成像的四氧化三铁原料包括水合三氯化铁、正己烷、油醇以及十八烯酸。
可选地，所述碳量子点的制备方法，至少包括：将含有柠檬酸、PEG-1500、三乙醇胺的混合物，加热至160～180℃时，加入乙二胺，充分搅拌，待混合液降至室温后，加入去离子水，并转移至2000Da透析袋内，透析3天，冷冻干燥得到碳量子点粉末，尺寸为1～5nm。
作为一种具体的实施方式，所述碳量子点的制备方法，至少包括：分别取柠檬酸1g、PEG-1500 1g、三乙醇胺10mL，混合并搅拌，加热至160-180℃时，加入乙二胺5mL，充分搅拌60min后，待混合液降至室温后，加入20～50mL去离子水，并转移至2000Da透析袋内，透析3天，冷冻干燥得到碳量子点粉末，尺寸为1-5nm。
可选地，所述四氧化三铁的制备方法，至少包括：将FeCl3·6H2O溶于去离子水中，随后加入油酸钠。正己烷以及乙醇混合液加入反应混合液中并加入至70℃保持4小时。反应结束后，通过分液漏斗获取最上方有机层(即油酸铁)，并通过去离子水清洗三次。通过低速旋转蒸发去除正己烷，以获得油酸铁纳米颗粒。
通过油酸铁、油醇以及十八烯酸获取四氧化三铁纳米颗粒。将2g油酸铁复合物溶于油醇以及十八烯酸混合液中。经过氮气脱气后，在氮气保护下于320℃回流60分钟。溶液由棕色变为黑色。冷却至室温后，加入丙酮以稳定纳米颗粒，通过离心分离纳米颗粒。
可选地，所述的碳量子点为具有荧光性质的水溶性碳量子点，四氧化三铁为具有磁共振成像的纳米粒子。
可选地，所述的碳量子点、四氧化三铁纳米粒子通过原料反应后具有羧基官能团，用于制备功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子。
可选地，步骤(2)中所述反应条件为室温反应16-18小时。
可选地，步骤(2)中所述反应温度的上限选自5℃、室温或50℃；下限选自4℃或室温。所述的功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子可以以反应生成物即功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子水溶液的形式装入试剂瓶中，放入-20℃-4℃的冰箱中保存待用；或者，将反应生成物进行冷冻干燥处理后，得到粉末状产物保存待用。
可选地，所述的功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子的制备方法，至少包括：所述将具有荧光性能的碳量子点与具有抗原特性的蛋白(如卵清蛋白)或者具有抗原特性的多肽(如卵清蛋白多肽段)，或将具有磁共振成像的四氧化三铁纳米粒子与具有抗原特性的蛋白(如卵清蛋白)或者具有抗原特性的多肽(如卵清蛋白多肽段)通过反应复合，制得功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子。
所述方法所制备的碳量子点-抗原卵清蛋白复合纳米粒子是一种具有荧光成像和肿瘤免疫治疗双重性质的复合纳米材料，其中的碳量子点具有光致发光荧光成像功能，卵清蛋白具有抗原特性，可用作荧光成像和肿瘤免疫治疗的纳米材料。
作为一种具体的实施方式，所述功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子的制备方法，至少包括：
将获得的功能化纳米材料活化，然后加入去离子水充悬，再加入抗原，反应，得到所述功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子。
具体的，所述功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子的制备方法，至少包括：取制备的碳量子点粉末溶于去离子水，加入EDC室温搅拌后，离心去除多余EDC；加入去离子水重悬碳量子点，加入NHS以及卵清蛋白，室温反应16h，最终获得碳量子点-抗原卵清蛋白复合纳米粒子水溶液。
具体的，所述功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子的制备方法，至少包括：取制备的四氧化三铁纳米粒子粉末溶于去离子水，加入EDC室温搅拌后，离心去除多余；加入去离子水重悬四氧化三铁纳米粒子，加入NHS以及卵清蛋白，室温反应16h，最终获得四氧化三铁-抗原卵清蛋白复合纳米粒子水溶液。
可选地，所述的功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子在作为荧光成像或磁共振成像和肿瘤免疫治疗的纳米材料中的应用。
所述的功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子可用作荧光或磁共振成像和肿瘤免疫治疗的纳米材料。在所述的功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子表面搭载不同的免疫佐剂，通过体内树突状细胞的摄取，能够增强肿瘤免疫效果。
本申请的又一方面，提供了一种肿瘤免疫治疗的纳米材料，其特征在于，包含所述的功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子和/或根据所述的方法制备得到的功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子中的至少一种。
可选地，所述纳米材料为荧光成像和/或磁共振成像和肿瘤免疫治疗的纳米材料。
可选地，所述的功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子和/或根据所述的方法制备得到的功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子中的至少一种在荧光成像中的应用。
可选地，所述的功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子和/或根据所述的方法制备得到的功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子中的至少一种在磁共振成像中的应用。
本申请中，“卵清蛋白多肽”是指卵清蛋白经过酶分解形成的多肽。
本申请中，所有涉及数值范围的条件均可独立地选自所述数值范围内的任意中间范围。
本申请中，如无特别说明，所有涉及数值范围的条件均包含端点值。
本申请能产生的有益效果包括：
1)本发明所提供的功能化纳米材料的制备方法简单，产物具有小尺寸效应、粒径分布均匀、水溶性好、生物相容性好等优点。
2)本发明所提供的功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子的制备方法同样简便，产物粒径分布均匀、水溶性好、免疫原性好等优点，且能够实现荧光或磁共振成像以及肿瘤免疫治疗多功能结合。
3)本发明所提供的制备方法所制备的功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子是一种具有荧光或磁共振成像性质的复合纳米材料；卵清蛋白具有免疫原性性质，通过与功能化纳米材料连接能在体内生理环境汇总保护其抗原不受降解及失活，提供肿瘤免疫治疗功能。基于功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子的荧光或磁共振成像和免疫治疗可以实现高效、无创、低损伤、治疗性与预防性结合的医学成像与治疗，在恶性肿瘤等重大疾病的阶段成像及治疗中具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为样品C1#的TEM图谱。
图2为样品C1#的共聚焦显微镜成像；其中a为488nm激发波长照射下能发射绿光，b为552nm激发波长照射下能发射黄光，c为638nm激发波长照射下能发射红光。
图3为实施例5中样品搭载率计算结果图。
图4为Fe2#-Fe5#磁共振的测试结果；其中，(a)为不同Fe浓度的Fe2#的MRI成像结果；(b)为不同Fe浓度的Fe3#的MRI成像结果；(c)为不同Fe浓度的Fe4#的MRI成像结果；(d)为不同Fe浓度的Fe5#的MRI成像结果。
具体实施方式
下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。
如无特别说明，本申请的实施例中的原料均通过商业途径购买。
本申请的实施例中分析方法如下：
利用日本电子JEOL-2100F进行TEM分析。
利用莱卡TCS SP5II进行共聚焦显微镜成像分析。
利用安捷伦1260液相色谱仪进行HPLC检测。
利用MesoMR23-060H-1磁共振仪(Niumag)进行磁共振成像分析。
所述卵清蛋白购自Sigma。
所述卵清蛋白多肽购自上海德翅生物科技有限公司。
实施例1
首先制备荧光碳量子点，分别取柠檬酸1g、PEG-1500 1g、三乙醇胺10mL，混合并搅拌，加热至160℃时，加入乙二胺5mL，充分搅拌60min后，待混合液降至室温后，加入50mL去离子水，并转移至2000Da透析袋内，透析3天，冷冻干燥得到碳量子点粉末，尺寸为1-5nm。
取制备的碳量子点粉末5mg溶于去离子水，加入10mg/mL EDC 0.5mL室温搅拌30min后，3000Da超滤管3500g离心60min去除多余EDC；加入2mL去离子水重悬碳量子点，加入10mg/mL NHS 0.5mL以及8mg/mL卵清蛋白1mL，室温反应16h，最终获得碳量子点-抗原卵清蛋白复合纳米粒子水溶液。所得碳量子点-抗原卵清蛋白复合纳米粒子记为样品C1#。
制得的碳量子点-抗原卵清蛋白复合纳米粒子尺寸在40-100nm，具有荧光成像功能，分别在488nm、552nm、638nm激发波长照射下，可发出绿光、黄光、红光。
实施例2
首先制备荧光碳量子点，分别取柠檬酸1g、PEG-1500 1g、三乙醇胺10mL，混合并搅拌，加热至160℃时，加入乙二胺5mL，充分搅拌60min后，待混合液降至室温后，加入50mL去离子水，并转移至2000Da透析袋内，透析3天，冷冻干燥得到碳量子点粉末，尺寸为1-5nm。
取制备的碳量子点粉末5mg溶于去离子水，加入10mg/mL EDC 0.5mL室温搅拌30min后，3000Da超滤管3500g离心30min去除多余EDC；加入2mL去离子水重悬碳量子点，加入10mg/mL NHS 0.5mL以及0.8mg/mL卵清蛋白多肽1mL，室温反应18h，最终获得碳量子点-抗原卵清蛋白多肽复合纳米粒子水溶液。所得碳量子点-抗原卵清蛋白多肽复合纳米粒子记为样品C2#。
实施例3
首先制备四氧化三铁纳米粒子，将12.6mmol FeCl3·6H2O溶于12mL去离子水中，随后加入34.5mmol油酸钠。45mL正己烷以及25mL乙醇混合液加入反应混合液中并加入至70℃保持4小时。反应结束后，通过分液漏斗获取最上方有机层(即油酸铁)，并通过去离子水清洗三次。通过低速旋转蒸发去除正己烷，以获得油酸铁纳米颗粒。
通过油酸铁、油醇以及十八烯酸获取四氧化三铁纳米颗粒。将2g油酸铁复合物溶于20mL油醇以及0.3mL十八烯酸混合液中。经过氮气脱气后，在氮气保护下于320℃回流60分钟。溶液由棕色变为黑色。冷却至室温后，加入50mL丙酮以稳定纳米颗粒，通过离心分离纳米颗粒。
取制备的四氧化三铁纳米粒子粉末20μg溶于去离子水，加入10mg/mL EDC 0.5mL室温搅拌30min后，3000Da超滤管3500g离心30min去除多余EDC；加入2mL去离子水重悬四氧化三铁纳米粒子，加入10mg/mL NHS0.5mL以及2mg/mL卵清蛋白1mL，室温反应16h，最终获得四氧化三铁-抗原卵清蛋白复合纳米粒子水溶液。所得四氧化三铁-抗原卵清蛋白复合纳米粒子记为样品Fe1#。
实施例4
首先制备四氧化三铁纳米粒子，将12.6mmol FeCl3·6H2O溶于12mL去离子水中，随后加入34.5mmol油酸钠。45mL正己烷以及25mL乙醇混合液加入反应混合液中并加入至70℃保持4小时。反应结束后，通过分液漏斗获取最上方有机层(即油酸铁)，并通过去离子水清洗三次。通过低速旋转蒸发去除正己烷，以获得油酸铁纳米颗粒。
通过油酸铁、油醇以及十八烯酸获取四氧化三铁纳米颗粒。将2g油酸铁复合物溶于20mL油醇以及0.3mL十八烯酸混合液中。经过氮气脱气后，在氮气保护下于320℃回流60分钟。溶液由棕色变为黑色。冷却至室温后，加入50mL丙酮以稳定纳米颗粒，通过离心分离纳米颗粒。
取制备的四氧化三铁纳米粒子粉末200μg溶于去离子水，加入10mg/mL EDC 0.5mL室温搅拌30min后，3000Da超滤管3500g离心60min去除多余EDC；加入2mL去离子水重悬四氧化三铁纳米粒子，加入10mg/mL NHS0.5mL以及0.8mg/mL卵清蛋白多肽1mL，室温反应16h，最终获得四氧化三铁-抗原卵清蛋白多肽复合纳米粒子水溶液。所得四氧化三铁-抗原卵清蛋白多肽复合纳米粒子记为样品Fe2#。
实施例5
首先制备四氧化三铁纳米粒子，将12.6mmol FeCl3·6H2O溶于12mL去离子水中，随后加入34.5mmol油酸钠。45mL正己烷以及25mL乙醇混合液加入反应混合液中并加入至70℃保持4小时。反应结束后，通过分液漏斗获取最上方有机层(即油酸铁)，并通过去离子水清洗三次。通过低速旋转蒸发去除正己烷，以获得油酸铁纳米颗粒。
通过油酸铁、油醇以及十八烯酸获取四氧化三铁纳米颗粒。将2g油酸铁复合物溶于20mL油醇以及0.3mL十八烯酸混合液中。经过氮气脱气后，在氮气保护下于320℃回流60分钟。溶液由棕色变为黑色。冷却至室温后，加入50mL丙酮以稳定纳米颗粒，通过离心分离纳米颗粒。
取4份反应瓶，每份中加入制备的四氧化三铁纳米粒子粉末200μg溶于去离子水，加入10mg/mL EDC 0.5mL室温搅拌30min后，3000Da超滤管3500g离心45min去除多余EDC；加入2mL去离子水重悬四氧化三铁纳米粒子，加入10mg/mL NHS 0.5mL，每份反应瓶中分别加入10mg/mL卵清蛋白多肽0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.8mL，并分别补足去离子水0.9mL、0.8mL、0.6mL、0.2mL，室温反应16h，最终获得四氧化三铁-抗原卵清蛋白多肽复合纳米粒子水溶液。所得四氧化三铁-抗原卵清蛋白多肽复合纳米粒子记为样品Fe3#、Fe4#、Fe5#、Fe6#。
实施例6形貌测试
分别对样品C1#、C2#、Fe1#、Fe2#进行TEM表征，结果显示所述抗原位于功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子内侧；碳量子点或四氧化三铁纳米粒子堆积搭载于抗原卵清蛋白多肽或卵清蛋白外侧并将抗原包覆。功能化纳米材料碳量子点或四氧化三铁纳米粒子的粒径在1～5nm之间，功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子样品C1#、C2#、Fe1#、Fe2#的粒径在1～200nm之间。
典型代表如样品C1#，其TEM照片如图1所示。
从图1中可以看出该复合纳米粒子粒径分布在40～100nm，其内侧为卵清蛋白，粒径分布在1～5nm的碳量子点堆积搭载于卵清蛋白外侧并将其包覆。
样品Fe1#的TEM照片与样品C1#类似，随着制备条件、功能化纳米材料的种类、抗原种类的不同，功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子的粒径在1～200nm之间变化。
样品Fe2#、C2#与样品C1#类似，功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子的粒径在1～200nm之间变化。
实施例7
实施例6中制备得到的四氧化三铁纳米粒子与抗原卵清蛋白多肽室温反应16h后，3000Da超滤管3500g离心45min，滤出未反应的卵清蛋白多肽，对其进行高效液相色谱检测分析得知其质量，从而通过已知多肽初始加入量以及四氧化三铁加入量，能计算出已结合于四氧化三铁纳米粒子表面的抗原卵清蛋白多肽。结果如图3所示。
其中，所述搭载率的计算公式为：
搭载率＝(卵清蛋白多肽的初始加入质量-HPLC测量的卵清蛋白多肽的质量)/四氧化三铁加入质量×100％
从图中可以看出，多肽与纳米粒子的结合，可以通过高效液相色谱(HPLC)方法测定未搭载上的多肽质量，即可计算出搭载于纳米粒子上的多肽量，从而证明多肽能结合与纳米粒子表面。
C2#的测试结果与上述样品的测试结果类似，碳量子点外侧搭载卵清蛋白多肽。
实施例8荧光分析
分别对样品C1#和C2#进行荧光分析，得到的共聚焦显微镜成像，结果显示，样品C1#和C2#均在不同激发波长条件下发射不同波长的可见光，如488nm激发波长照射下能发射绿光、552nm激发波长照射下能发射黄光、638nm激发波长照射下能发射红光。
典型代表如样品C1#，其与小鼠树突状细胞共孵育的共聚焦显微镜成像如图2所示。
从图2中可以看出，光致发光碳量子点能在不同激发波长条件下发射不同波长的可见光，488nm激发波长照射下能发射绿光(图2a)、552nm激发波长照射下能发射黄光(图2b)、638nm激发波长照射下能发射红光(图2c)，且搭载卵清蛋白并不会将碳量子点的荧光产生淬灭作用。且通过图2共聚焦显微镜成像照片还能看出，荧光信号在细胞膜轮廓之内，表明大量碳量子点-抗原卵清蛋白复合纳米粒子成功被小鼠树突状细胞吞噬，被吞噬的抗原卵清蛋白能引起后续的肿瘤免疫效应刺激树突状细胞，从而诱导激活T细胞介导的肿瘤免疫。
样品C2#的测试结果与样品C1#的测试结果类似。
实施例9磁共振成像
对实施例3至实施例5制备得到的复合纳米粒子Fe1#-Fe6#进行磁共振成像，得到的MRI图，典型的如Fe2#-Fe5#测试得到的结果，如图4所示。
图4(a)-(d)分别为Fe2#-Fe5#的MRI成像结果，从左到右Fe浓度分别为0、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.15、0.2M。图中结果可以看到，复合纳米粒子中的四氧化三铁纳米粒子有优异的T1信号，并随着浓度增加，T1信号亮度增加。表明此四氧化三铁纳米粒子有着优异的T1信号的MRI成像功能，并且和抗原复合成纳米粒子后，并未对其T1的MRI成像功能造成影响。
其他样品Fe1#和Fe6#的测试结果与图4中测试结果类似，即复合纳米粒子中的四氧化三铁纳米粒子有优异的T1信号，并随着浓度增加，T1信号亮度增加。表明此四氧化三铁纳米粒子有着优异的T1信号的MRI成像功能，并且和抗原复合成纳米粒子后，并未对其T1的MRI成像功能造成影响。
以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。

Claims (10)

1.一种功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子，其特征在于，其组分包括功能化纳米材料、抗原；
其中，所述抗原位于功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子内侧；功能化纳米材料堆积搭载于抗原外侧并将抗原包覆；或
所述功能化纳米材料位于功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子内侧；功能化纳米材料外侧搭载抗原。
2.根据权利要求1所述的功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子，其特征在于，所述功能化纳米材料和抗原的质量比为0.01～6.25:1；
优选地，所述功能化纳米材料和抗原的质量比为0.025～2:1；
优选地，所述功能化纳米材料选自碳量子点、四氧化三铁纳米粒子中的至少一种；
所述抗原选自卵清蛋白、卵清蛋白多肽中的至少一种；
优选地，所述功能化纳米材料的粒径为1～5nm；
优选地，所述功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子的粒径为1～200nm。
3.根据权利要求1至2任一项所述的功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子，其特征在于，所述功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子在488nm激发波长照射下发射绿光。
4.根据权利要求1至2任一项所述的功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子，其特征在于，所述功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子在552nm激发波长照射下发射黄光。
5.根据权利要求1至2任一项所述的功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子，其特征在于，所述功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子在638nm激发波长照射下发射红光。
6.权利要求1至5任一项所述的功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子的制备方法，其特征在于，至少包括以下步骤：
(1)获得功能化纳米材料；
(2)将含有功能化纳米材料和抗原的混合物在4℃-50℃的条件下反应16h以上，得到所述功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述功能化纳米材料具有羧基官能团；
优选地，步骤(1)中所述功能化纳米材料的制备方法包括高温热解法、共沉淀法中的至少一种；
优选地，所述高温热解法的温度为20℃～200℃，反应时间在1h以上；
所述共沉淀法的温度为20℃～400℃，反应时间在0.5h以上；
优选地，所述高温热解法制备得到碳量子点；所述共沉淀法制备得到四氧化三铁纳米粒子；
优选地，所述碳量子点的制备方法包括：将含有碳源、钝化剂和溶剂的混合物在20℃-200℃的条件下，反应时间在1h以上，得到所述碳量子点；
所述四氧化三铁纳米粒子的制备方法包括：将含有铁盐、沉淀剂和溶剂的混合物在20℃～400℃的条件下，反应时间在0.5h以上，得到所述四氧化三铁纳米粒子。
8.一种肿瘤免疫治疗的纳米材料，其特征在于，包含权利要求1至5任一项所述的功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子和/或根据权利要求6至7任一项所述的方法制备得到的功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子中的至少一种。
9.权利要求1至5任一项所述的功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子和/或根据权利要求6至7任一项所述的方法制备得到的功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子中的至少一种在荧光成像中的应用。
10.权利要求1至5任一项所述的功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子和/或根据权利要求6至7任一项所述的方法制备得到的功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子中的至少一种在磁共振成像中的应用。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112057610A (zh) * 2019-06-10 2020-12-11 中国科学院宁波材料技术与工程研究所 一种超小纳米免疫增强剂-抗原复合纳米粒子及其制备方法和应用
CN113679855A (zh) * 2021-09-07 2021-11-23 湖南大学 T2-T1型超细Fe3O4磁共振成像探针及其制备方法和应用
CN114958338A (zh) * 2022-05-11 2022-08-30 北京兴德通医药科技股份有限公司 采用氧化碳纳米角猝灭荧光探针对蛋白激酶a检测方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100233219A1 (en) * 2006-03-30 2010-09-16 Fujifilm Corporation Inorganic nanoparticle compromising an active substance immobilized on the surface and a polymer
CN104027824A (zh) * 2014-06-24 2014-09-10 西安电子科技大学 具有抗体介导的光磁双模态介孔硅纳米颗粒的制备方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100233219A1 (en) * 2006-03-30 2010-09-16 Fujifilm Corporation Inorganic nanoparticle compromising an active substance immobilized on the surface and a polymer
CN104027824A (zh) * 2014-06-24 2014-09-10 西安电子科技大学 具有抗体介导的光磁双模态介孔硅纳米颗粒的制备方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LIJIA LUO ET AL: "Engineered fluorescent carbon dots as promising immune adjuvants to efficiently enhance cancer immunotherapy", 《NANOSCALE》 *
LIJIA LUO ET AL: "Engineered nano-immunopotentiators efficiently promote cancer immunotherapy for inhibiting and preventing lung metastasis of melanoma", 《BIOMATERIALS》 *
SHA LI ET AL: "Polyethylenimine-Modified Fluorescent Carbon Dots As Vaccine Delivery System for Intranasal Immunization", 《ACS BIOMATER. SCI. ENG.》 *
YI ZHAO ET AL: "Iron Oxide Nanoparticles-Based Vaccine Delivery for Cancer Treatment", 《MOL. PHARMACEUTICS》 *
陈璐扬 等: "肿瘤免疫治疗中的生物医用载体", 《化学进展》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112057610A (zh) * 2019-06-10 2020-12-11 中国科学院宁波材料技术与工程研究所 一种超小纳米免疫增强剂-抗原复合纳米粒子及其制备方法和应用
CN113679855A (zh) * 2021-09-07 2021-11-23 湖南大学 T2-T1型超细Fe3O4磁共振成像探针及其制备方法和应用
CN113679855B (zh) * 2021-09-07 2022-06-07 湖南大学 T2-T1型超细Fe3O4磁共振成像探针及其制备方法和应用
CN114958338A (zh) * 2022-05-11 2022-08-30 北京兴德通医药科技股份有限公司 采用氧化碳纳米角猝灭荧光探针对蛋白激酶a检测方法

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