CN118252946A - 多克隆抗体Anti-DR5 Ab在促进细菌载药系统与肿瘤细胞特异性结合和提高细菌载药系统对肿瘤细胞生长抑制能力中的应用 - Google Patents
多克隆抗体Anti-DR5 Ab在促进细菌载药系统与肿瘤细胞特异性结合和提高细菌载药系统对肿瘤细胞生长抑制能力中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了多克隆抗体Anti‑DR5Ab在促进细菌载药系统与肿瘤细胞特异性结合和提高细菌载药系统对肿瘤细胞生长抑制能力中的应用；所述细菌载药系统是指在细菌中装载光敏剂，并在细菌的细胞壁上共价连接抗体；所述的在细菌中装载光敏剂是通过光敏剂与细菌物理混合或共价连接实现的；本发明中的多克隆抗体Anti‑DR5Ab可促进细菌与肿瘤细胞的特异性结合，进而促进光敏剂释放到肿瘤细胞内，从而增强对肿瘤细胞的生长抑制。而且，激光或超声波可激发细菌载药系统中的光敏剂产生活性氧，同时也刺激细菌载药系统中细菌产生活性氧；在激光‑超声波的联合作用下，则进一步提高细菌载药系统产生的活性氧，进而提高细菌载药系统对肿瘤细胞的杀伤能力。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，更具体地说是涉及多克隆抗体Anti-DR5 Ab在促进细菌载药系统与肿瘤细胞特异性结合和提高细菌载药系统对肿瘤细胞生长抑制能力中的应用。
背景技术
光动力治疗和声动力治疗是肿瘤治疗的重要方法，如何将光敏剂或声敏剂递送至肿瘤组织或炎症部位，是提高治疗效率的关键。由于肿瘤和炎症组织都存在乏氧区域，游离药物和无生命的纳米粒子都难以进入乏氧区域，导致治疗效果不佳。以活的某些细菌和细胞作为载体，则可克服上述缺陷。专性厌氧细菌、微好氧细菌和兼性厌氧细菌，容易在肿瘤及炎症部位的乏氧区域成活和繁殖，繁殖能力要高出在正常组织中繁殖能力的1000倍，成为药物靶向递送较理想的载体。
现有技术中，CN113398275A公开了一种用于光动力治疗的细菌载体，采用非致病性大肠杆菌作为光敏剂载体，通过大肠杆菌负载有效量的酞菁光敏剂，结合光动力治疗法，实现对肿瘤的光动力治疗；该专利主要是通过改造的大肠杆菌将光敏剂递送至肿瘤组织处，提高肿瘤细胞对光敏剂的摄取量。也就是说，现有技术中仅是利用细菌作为载体将药物输送到实体瘤中，从而达到治疗效果。
然而，细菌自身也可以通过分泌毒素和酶来抑制肿瘤生长和发挥抗炎作用。研究表明，静脉注射细菌之后，细菌会逐渐在肿瘤组织积累。例如，广泛存在于人和动物的消化道等生物环境中的双歧杆菌是一种严格厌氧的革兰氏阳性细菌，将5×106-6×106个长双歧杆菌通过尾静脉注射到荷瘤小鼠体内后，168h内双歧杆菌在肿瘤组织逐渐积累，而在肺、肝、脾、肾等其它器官中则很快清除[Hu B,et al.Bifidobacterium longum as adelivery system of TRAI L and endostatin cooperates with chemotherapeuticdrugs to inhibit hypoxic tumor growth.Cancer Gene Therapy.2009,16:655-663.]，目前已用于化疗药物[Sasaki T,Fujimori M,Hamaji Y,Hama Y,Ito K,Amano J,Taniguchi S.Genetically engineered Bifidobacterium longum for tumor-targetingenzyme-pr odrug therapy of autochthonous mammary tumors in rats.CancerSci.2006,97:649-657]、基因[Hu B,et al.Bifidobacterium longum as a deliverysystem of TRAIL and endostatin cooperates with chemotherapeutic drugs toinhibit hypoxic tumor growth.Cancer Gene Therapy.2009,16:655-663.]的载体用于肿瘤靶向治疗。再如，将趋磁细菌AMB-1通过荷瘤小鼠尾静脉注入小鼠体内，该趋磁细菌能长时间定殖于肿瘤组织，随着时间延长，趋磁细菌在肿瘤组织逐渐积累，但在其它主要器官例如肝脏和脾脏则逐渐消退[Benoit,M.R.et al.,Visualizing implanted tumors inmice with magnetic resonance imaging usin g magnetotactic bacteria.ClinCancer Res 2009,15(16):5170-5177.]表现出良好的肿瘤靶向性。对于趋磁细菌，还可通过外加磁场的引导，对肿瘤组织进行磁靶向输送。
但细菌必须在成活的条件下才能进入肿瘤和炎症组织及其乏氧区域，因此，所装载的药物必须对细菌毒性低；细菌与肿瘤细胞紧密结合，才能更好地发挥所载药物对肿瘤细胞的杀伤作用。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了多克隆抗体Anti-DR5 Ab在促进细菌载药系统与肿瘤细胞特异性结合和提高细菌载药系统对肿瘤细胞生长抑制能力中的应用，本发明中的多克隆抗体Anti-DR5 Ab能够促进细菌与肿瘤细胞的特异性结合，进而促进光敏剂释放到肿瘤细胞内，从而更好地抑制肿瘤细胞的生长。而且，在激光或超声波或激光-超声波的联合作用下，可促进细菌载药系统中细菌和光敏剂均产生活性氧，也就是，细菌既是药物载体，也是在激光或超声波或激光-超声波联合作用下通过产生活性氧来杀伤肿瘤细胞的“活药”，进而提高细菌载药系统对肿瘤细胞的杀伤能力，抑制肿瘤的生长。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
多克隆抗体Anti-DR5 Ab在促进细菌载药系统与肿瘤细胞特异性结合和提高细菌载药系统对肿瘤细胞生长抑制能力中的应用，其特征在于，所述细菌载药系统是指在细菌中装载光敏剂，并在细菌的细胞壁上共价连接抗体；所述的在细菌中装载光敏剂是指通过将光敏剂与细菌物理混合或共价连接而实现；所述多克隆抗体Anti-DR5 Ab促进细菌与肿瘤细胞的特异性结合，进而促进光敏剂释放到肿瘤细胞内。
进一步地，所述细菌包括双歧杆菌、趋磁细菌；所述双歧杆菌是指两岐双歧杆菌。
进一步地，所述多克隆抗体Anti-DR5 Ab提高细菌载药系统对肿瘤细胞的结合能力，进而增强对肿瘤细胞的杀伤作用。
进一步地，所述光敏剂为二氢卟吩e6。
作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护激光或超声波或激光-超声波的联合在提高细菌载药系统抑制肿瘤生长中的应用，所述激光或超声波促进所述细菌载药系统中细菌和光敏剂均产生活性氧，激光-超声波的联合作用进一步提高细菌载药系统的活性氧产量，进而提高细菌载药系统对肿瘤细胞的杀伤能力。
进一步地，所述激光的波长为655nm-808nm，所述激光照射时间为1-20min；所述超声波频率为0.5-1MHz，所述超声波处理时间为1-10min。
作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种治疗肿瘤的药物，包括细菌载药系统，所述细菌载药系统包括细菌、光敏剂以及多克隆抗体Anti-DR5 Ab，所述光敏剂与细菌物理混合或共价连接，所述多克隆抗体Anti-DR5 Ab与细菌共价连接。
进一步地，所述药物在激光或超声波或激光-超声波的作用下产生活性氧，抑制肿瘤的生长。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了多克隆抗体Anti-DR5 Ab在促进细菌载药系统与肿瘤细胞特异性结合和提高细菌载药系统对肿瘤细胞生长抑制能力中的应用，其有益效果：
本发明经过大量的实验筛选发现，光敏剂是较好的药物选择，光敏剂只有在光照下才能产生对细胞或细菌有毒性的活性氧，在避光条件下，由于不存在电子跃迁而基本不产生活性氧，对细胞或细菌毒性低；所以，本发明将光敏剂装载于细菌中，在避光条件下可使细菌保持较好的活性；并且，本发明还发现在细菌表面连接可识别肿瘤细胞表面抗原的抗体，则可使细菌长时间滞留在肿瘤组织中；因此，本发明将光敏剂通过与细菌物理混合或共价连接的方式载入细菌中，然后再以共价连接的方式，将抗体和装载光敏剂的细菌进行连接，获得细菌载药系统。
本发明中的多克隆抗体Anti-DR5 Ab能够促进细菌与肿瘤细胞的特异性结合，进而促进光敏剂释放到肿瘤细胞内，提高载药系统对肿瘤细胞的杀伤作用，从而抑制肿瘤生长。而且，激光或超声波可激发细菌载药系统中的光敏剂产生活性氧，同时也刺激细菌载药系统中细菌产生活性氧；在激光-超声波的联合作用下，则进一步提高细菌载药系统产生的活性氧，进而提高细菌载药系统对肿瘤细胞的杀伤能力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明Ce6和Ce6纳米粒子(Ce6NPs)水溶液分别在白光和365nm激发光照射下的荧光结果图；
图2附图为本发明不同浓度的Ce6纳米粒子与1×109个B.bifidum在不同混合时间下B.bifidum对Ce6的负载量结果图；
图3附图为本发明B.bifidum、Ce6—B.bifidum和Ce6—B.bifidum—Anti-DR5 Ab的生长曲线结果图；
图4附图为本发明Ce6—B.bifidum、Ce6—B.bifidum—Anti-DR5 Ab分别与癌细胞结合情况对比结果图(蓝色箭头指向的是细菌B.bifidum)；
图5附图为本发明Ce6 NPs—B.bifidum—Anti-DR5 Abs、Ce6 NPs—B.bi fidum、B.bifidum和Free Anti-DR5 Abs分别对喉癌细胞TU212、鼻咽癌细胞CNE及食管癌细胞Eca-109的毒性结果对比图；
图6附图为本发明在有或没有超声波作用下，趋磁细菌AMB-1对食管癌细胞的毒性结果对比图；
图7附图为本发明在超声波或超声波与激光共同作用下，Ce6 NPs—B.bi fidum—Anti-DR5 Abs、Ce6 NPs—B.bifidum、B.bifidum和Anti-DR5 Abs对鼻咽癌细胞CNE的杀伤能力对比图；
图8附图为本发明在荷瘤小鼠中分别尾静脉注射Ce6、Ce6—B.bifidum和Ce6—B.bifidum—Anti-DR5 Ab后第6h和12h时的肿瘤及主要器官的荧光照片图；
图9附图为本发明向小鼠注射不同样品后小鼠的肿瘤大小图；其中，I为尾静脉注射Ce6—B.bifidum—Anti-DR5 Ab；II为尾静脉注射Ce6—B.bifidum—Anti-DR5 Ab，超声波处理；III为尾静脉注射Ce6—B.bifidum—Anti-DR5Ab，激光照射；IV为尾静脉注射Ce6—B.bifidum—Anti-DR5 Ab，超声波和激光照射双重处理；V为尾静脉注射PBS，超声波和激光照射双重处理；VI为尾静脉注射PBS；
图10附图为本发明Ce6—AMB-1细菌载药系统在激光共聚焦荧光显微镜下的荧光照片。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1Ce6—B.bifidum—Anti-DR5 Ab细菌载药系统的制备
(1)Ce6纳米粒子(即Ce6 NPs)的制备
将光敏剂二氢卟吩e6(Ce6)溶于二甲基亚砜(DMSO)溶液中，得到浓度为3mM的Ce6溶液。取该溶液0.2mL，滴加到10mL去离子水中，超声波分散30min，然后透析除去DMSO，即得Ce6纳米粒子。
如图1所示，Ce6纳米粒子可在365nm发射光激发下发射明亮的红色荧光。这是因为Ce6纳米粒子在水溶液中能得到很好的溶解(分散)，而Ce6的荧光很弱，这是由于Ce6溶解性差，Ce6分子聚集严重而使荧光淬灭。由此可见，通过上述方法使Ce6纳米化之后，可显著增强其在水相中的分散能力。
(2)在两岐双歧杆菌(B.bifidum)中装载Ce6纳米粒子
将Ce6纳米粒子分散于无菌的磷酸盐缓冲液(PBS)中，制备浓度为0.5mg/mL、1mg/mL和2mg/mL的Ce6纳米粒子混悬液，取该混悬液1mL(即Ce6纳米粒子为0.5mg、1mg和2mg)，加入到含1×109个B.bifidum沉淀中，在避光、无氧和室温条件下按照表1中的混合时间进行混合，然后离心，收集沉淀，沉淀即为装载了Ce6的B.bifidum(简写为Ce6—B.bifidum)；每组实验重复3次。
表1
| 组别序号 | Ce6浓度 | Ce6体积 | B.bifidum数量 | 混合时间 |
| 1 | 0.5mg/mL | 1mL | 1×109个 | 1h |
| 2 | 0.5mg/mL | 1mL | 1×109个 | 2h |
| 3 | 0.5mg/mL | 1mL | 1×109个 | 4h |
| 4 | 1mg/mL | 1mL | 1×109个 | 1h |
| 5 | 1mg/mL | 1mL | 1×109个 | 2h |
| 6 | 1mg/mL | 1mL | 1×109个 | 4h |
| 7 | 2mg/mL | 1mL | 1×109个 | 1h |
| 8 | 2mg/mL | 1mL | 1×109个 | 2h |
| 9 | 2mg/mL | 1mL | 1×109个 | 4h |
采用上述9组方法得到的Ce6—B.bifidum，细菌B.bifidum对Ce6纳米粒子均能很好的负载，装载Ce6的B.bifidum呈现明亮的红色荧光，可根据Ce6吸收光谱的标准曲线，计算上述9组Ce6—B.bifidum中Ce6的量，结果如图2所示；具体来说，当Ce6纳米粒子的量为0.5mg(即0.5mg/mL，1mL)与1×109个B.bifidum混合1h、2h、4h时，B.bifidum对Ce6的负载量基本维持在约为485μg(Ce6)/1×109个B.bifidum的水平，也就是说，这些细菌能在1h左右的时间内可将0.5mg的Ce6吸附接近完全；当Ce6纳米粒子的量为1mg(即1mg/mL，1mL)与1×109个B.bifidum混合1h、2h、4h时，B.bifidum对Ce6的负载量分别为661.17±6.43、935.58±3.82、968.88±1.45(单位均为：μg(Ce6)/1×109个B.bifidum)；当Ce6纳米粒子的量为2mg(即2mg/mL，1mL)与1×109个B.bifidum混合1h、2h、4h时，B.bifidum对Ce6的负载量分别为885.49±4.34、1018.63±20.25、1100.66±7.57(单位均为：μg(Ce6)/1×109个B.bifidum)。
(3)在Ce6—B.bifidum表面连接抗体
任选第五组(1mg的Ce6纳米粒子与1×109个B.bifidum混合2h)获得的Ce6—B.bifidum，在其表面连接抗死亡受体5的多克隆抗体(Anti-DR5 Ab)。并按照表2的Anti-DR5Ab浓度和混合时间进行试验，例如，向Ce6-B.bifidum(B.bifidum:1×109/mL，1mL)中加入PBS分散的表2浓度的Anti-DR5Ab(2μL)、EDC(1mol/L，20μL)和NHS(0.7mol/L，20μL))，在避光、无氧和室温条件下按照表2的反应时间反应，然后离心，沉淀即为装载Ce6并连接抗体Anti-DR5Ab的B.bifidum(简写为Ce6—B.bifidum—Anti-DR5 Ab)。该实验重复3次。
表2
采用上述9种方法得到的Ce6—B.bifidum—Anti-DR5 Ab，均有明亮的红色荧光；具体来说，当Anti-DR5 Ab的量为“0.1mmol/L，2μL”，与含1×109各细菌的Ce6-B.bifidum反应1、2、4h后，Ce6-B.bifidum对Anti-DR5 Ab的负载量分别为4.03±1.02、5.07±0.95、6.19±1.17(单位均为：μg(Anti-DR5 Ab)/1×109个B.bifidum)；当Anti-DR5Ab的量为“0.2mmol/L，2μL”，与含1×109各细菌的Ce6-B.bifidum反应1、2、4h后，Ce6-B.bifidum对Anti-DR5 Ab的负载量分别为5.07±1.63、6.43±2.03、7.03±1.46(单位均为：μg(Anti-DR5 Ab)/1×109个B.bifidum)；当Anti-DR5 Ab的量为“0.4mmol/L，2μL”，与含1×109各细菌的Ce6-B.bifidum反应1、2、4h后，Ce6-B.bifidum对Anti-DR5 Ab的负载量分别为5.87±1.36、6.98±1.38、8.09±1.60(单位均为：μg(Anti-DR5 Ab)/1×109个B.bifidum)；并且，通过图3可以看出，当细菌B.bifidum负载了Ce6和Anti-DR5 Ab时，其仍能表现较好的活性。
实施例2产活性氧实验
(1)细菌B.bifidum在激光和超声波作用下产生活性氧
在96孔板中，采用200μL无菌PBS分散的1×108个/mL B.bifidum经671nm激光(50mW/cm2)照射2、5、10min；另取同样量的B.bifidum，用超声波(1W/cm2，1.0MHz)处理1、2、3min。然后用活性氧检测探针2,7-Dichlo rodihydrofluorescein diacetate(DCFH-DA)检测总活性氧；每个实验重复5次。
结果表明，采用671nm激光照射2-10min后，B.bifidum中所产生的活性氧大约是对照组的(PBS，无激光照射)1-4倍；而在超声波处理1-3min后，B.bifidum中所产生的活性氧大约是对照组的5-8倍，且超声处理时间越长，产生的活性氧越多。
(2)Ce6—B.bifidum—Anti-DR5 Ab在激光和超声波作用下产生活性氧
将实验共分为四组，其中，A组：在96孔板中，采用200μL无菌PBS分散的Ce6—B.bifidum—Anti-DR5 Ab(1×108个/mL)经671nm激光(50mW/cm2)照射5min；B组：Ce6—B.bifidum—Anti-DR5 Ab样品经超声波(1W/cm2，1.0MHz)处理2min；C组：Ce6—B.bifidum—Anti-DR5 Ab样品先超声波处理2min，再以671nm激光照射5min；D组：Ce6—B.bifidum—Anti-DR5Ab样品先经671nm激光照射5min，再以超声波处理2min。最后采用DCFH-DA检测总活性氧，每个实验重复5次。
结果表明，A组经671nm激光照射5min后，其所产生的活性氧是对照组的108.47±12.85倍；B组经超声波处理2min后，其所产生的活性氧是对照组的10.98±2.53倍；C组先以超声波处理2min，再以671nm激光照射5min后其所产生的活性氧是对照组的155.57±20.79倍；D组先以671nm激光照射5min，再以超声波处理2min后，其所产生的活性氧是对照组的137.71±19.27倍。由此可知，本发明中的Ce6—B.bifidum—Anti-DR5 Ab细菌载药系统可以产生更多的活性氧。
实施例3考察Ce6—B.bifidum—Anti-DR5 Ab与癌细胞的结合能力
按照实施例1的方法制备连接抗体的载药细菌Ce6—B.bifidum—Anti-DR 5Ab细菌载药系统。然后向培养于96孔板中的喉癌细胞Tu212中加入无血清培养基分散的Ce6—B.bifidum—Anti-DR5 Ab，细菌B.bifidum浓度约为1×108organisms/mL；并于37℃恒温细胞培养箱分别避光培养1、2和3h，用无菌PBS洗涤3次，于激光共聚焦显微镜下进行观察分析；并以在Tu212细胞中加入未连接抗体的载药细菌Ce6—B.bifidum(B.bifidum：1×108organisms/mL)作为对照。
由图4可知，未连接抗体的载药细菌Ce6—B.bifidum与细胞共培育2h时，与细胞结合的细菌的量明显多于共培育1h的，共培育3h时细胞上结合的细菌的量与培育2h的接近；而连接抗体的载药细菌Ce6-B.bifidum—Ant i-DR5 Ab与细胞结合的量显著多于未连抗体的载药细菌Ce6—B.bifidum(图中箭头所指即为细菌B.bifidum)。由于，在肿瘤细胞表面高表达死亡受体DR5，DR5可通过与其对应的抗体Anti-DR5 Ab之间的特异性识别作用，捕获Anti-DR5 Ab及其与之连接的材料，所以，本发明通过在细菌表面连接抗体，可有效促进细菌与癌细胞的特异性结合，从而提高载药细菌在癌细胞中的释放。
实施例4考察Ce6—B.bifidum—Anti-DR5 Ab对癌细胞的毒性的影响
向培养于96孔板中的喉癌细胞TU212、鼻咽癌细胞CNE和食管癌细胞Eca-109中分别加入由无血清培养基分散的Ce6 NPs—B.bifidum—Anti-DR5 Ab s、Ce6 NPs—B.bifidum、B.bifidum和Free Anti-DR5 Abs，于37℃恒温细胞培养箱中避光孵育24h，用无血清细胞培养基洗涤3次后，以CCK-8试剂盒检测细胞活性。
由图5可知，单独抗体Anti-DR5 Abs对3种癌细胞几乎无毒性；单独的细菌B.bifidum对这些细胞有一定毒性；载药细菌Ce6 NPs—B.bifidum对3中癌细胞有显著的毒性，而在载药细胞表面连接抗体后得到的Ce6 NPs—B.bifi dum—Anti-DR5 Abs，其对3种癌细胞的毒性更强。这主要是由于连接了抗体之后，与癌细胞结合的载药细菌更多(实施例3已证明)，导致更多的药物Ce6释放到癌细胞中，Ce6的暗毒性与B.bifidum毒性均影响了癌细胞的活性。由此可知，本发明通过在细菌表面连接抗体，可有效提高其对癌细胞的毒性。
实施例5考察Ce6-B.bifidum-Anti-DR5 Ab在激光和超声波作用下对细胞毒性的影响
(1)超声波可增强细菌对细胞的毒性
将无血清培养基分散的趋磁细菌AMB-1加入到食管癌细胞Eca-109中，AMB-1浓度为2×108CFU/mL，然后对细胞进行超声波(1W/cm2，1.0MHz，50％占空比)处理5min，用CCK-8试剂检测细胞成活率，以无超声波处理和PBS组作为对照。
由图6可知，向细胞中加入PBS然后进行或不进行超声波处理，对Eca-109细胞活性基本没有影响，细胞仍然保持高活性；向细胞中加入AMB-1且不经过超声波处理时，对Eca-109细胞活性影响很小，但当向细胞中加入AMB-1并经过超声波处理后，细胞活性明显下降。这可能是由于超声波破坏了细菌，使细菌释放出活性氧等有毒物质，影响细胞的活性；而对于趋磁细菌AMB-1，超声波还会促进细菌释放铁离子，诱导细胞铁死亡。
(2)Ce6—B.bifidum—Anti-DR5 Ab在激光和超声波作用下可增强对细胞的毒性
向培养于96孔板中的鼻咽癌细胞CNE中分别加入无血清培养基分散的Ce6 NPs-B.bifidum-Anti DR5 Abs、Ce6 NPs-B.bifidum、B.bifidum和Anti DR5Abs，B.bifidum浓度约为4×106organisms/mL，样品加入细胞后，于37℃恒温培养箱避光培养2h，然后用超声波处理细胞1min(超声条件：1W/cm2，1.0MHz，50％占空比)，或671nm激光照射2min(激光条件：1mW/cm2)，或先对细胞用超声波处理1min，接着用激光照射2min(US→Laser)，或先对细胞用激光照射2min，接着用超声波处理1min(Laser→US)；并以CCK-8试剂检测细胞活性。
由图7可知，细菌B.bifidum在超声波作用下对CNE细胞活性有一定影响，在超声波和激光的共同作用下，B.bifidum对CNE细胞的杀伤效果更显著；抗体Anti DR5 Abs在超声波以及超声波联合激光的作用下对CNE细胞活性的影响较小。而连接抗体后的载药细菌Ce6NPs-B.bifidum-Anti DR5 Abs在超声波刺激下对CNE细胞有很强的杀伤作用，杀伤效率显著高于未连接抗体的载药细菌Ce6 NPs-B.bifidum；并且，在超声波刺激的基础上进一步用激光照射，则细胞活性进一步极显著地下降，而且连接抗体的比未连接抗体的载药细菌在超声波和激光联合作用下对CNE细胞的杀伤效果更好；当超声波与激光作用顺序互换后，得到类似的结果。由此可知，在细菌表面连接抗体可提高对肿瘤细胞的杀伤能力，且在超声波和激光的双重作用下可进一步提高其对肿瘤细胞的杀伤能力，从而抑制肿瘤的生长。
实施例6考察Ce6—B.bifidum—Anti-DR5 Ab在激光和超声波作用下对小鼠肿瘤的生长抑制能力
将喉癌细胞Tu212细胞注射到裸鼠皮下，当肿瘤尺寸达6mm时，按照以下分组进行实验：
Ι组：向荷瘤小鼠尾静脉注射200μL由磷酸盐缓冲液(PBS)分散的Ce6—B.bifidum—Anti-DR5 Ab(B.bifidum：1×108，Ce6：94μg)，每隔1天注射1次，共注射3次；
Ⅱ组：向荷瘤小鼠尾静脉注射200μL由PBS分散的Ce6—B.bifidum—An ti-DR5 Ab(B.bifidum：1×108，Ce6：94μg)，每隔1天注射1次，共注射3次，在每次注射后的第6h和第24h，对肿瘤进行超声波处理(1W/cm2，1.0MHz，50％占空比)，每个时间点各处理10min；超声处理时，超声探头涂覆超声耦合剂；
Ш组：向荷瘤小鼠尾静脉注射200μL由PBS分散的Ce6—B.bifidum—Anti-DR5 Ab(B.bifidum：1×108，Ce6：94μg)，每隔1天注射1次，共注射3次，在每次注射后的第6h和第24h，对肿瘤进行671nm激光照射(激光功率密度：50mW/cm2)，每个时间点各照射20min；
Ⅳ组：向荷瘤小鼠尾静脉注射200μL由PBS分散的Ce6—B.bifidum—An ti-DR5 Ab(B.bifidum：1×108，Ce6：94μg)，每隔1天注射1次，共注射3次，在每次注射后的第6h和第24h，对肿瘤进行超声波和激光双重处理(先对肿瘤进行超声波处理10min，再以671nm激光照射20min，超声波和激光功率等条件与上述相同)；
V组：向荷瘤小鼠尾静脉注射200μL的磷酸盐缓冲液(PBS)，每隔1天注射1次，共注射3次，在每次注射后的第6h和第24h，对肿瘤进行超声波和激光双重处理，操作方法同Ⅳ组；
VI组：向荷瘤小鼠尾静脉注射200μL的磷酸盐缓冲液(PBS)，每隔1天注射1次，共注射3次。
结果表明，在向小鼠尾静脉注射Ce6—B.bifidum—Anti-DR5 Ab后，在激光或超声波作用下，均能显著抑制小鼠肿瘤生长；当先对肿瘤进行超声波处理，然后进行激光照射，则可进一步抑制肿瘤生长，甚至使小鼠肿瘤消失。在注射各组样品第21天时，各组小鼠及其肿瘤大小如附图9所示。
实施例7Ce6—AMB-1细菌载药系统
将Ce6粉末溶解于DMSO溶液中，获得含40mg/mL Ce6的DMSO溶液，用EDC和NHS与Ce6于室温下反应2h，Ce6:EDC:NHS＝1:5:5(摩尔比)，取该溶液25μL，加入到10mL细菌培养基分散的趋磁细菌AMB-1中，AMB-1浓度为2.8×108个/mL，在室温下轻轻振荡2h，然后离心，用PBS洗涤AMB-1达3次，沉淀再分散于PBS中，即得负载Ce6的趋磁细菌Ce6—AMB-1。
如图10所示，Ce6—AMB-1有明亮的红色荧光，表明Ce6成功负载到AMB-1中；并且，在避光条件下，Ce6—AMB-1表现出良好活性，其生长速度与未装载Ce6的AMB-1相当。
通过Transwell细胞迁移实验发现，Ce6—AMB-1能迁移至低氧区域，在磁场引导下，可进一步促进Ce6—AMB-1聚集到低氧区域。
在上述说明书的描述过程中：
术语“单克隆抗体”是指由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤(hybridoma)抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。
术语“多克隆抗体”是指由多种抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体，机体内所产生的抗体就是多克隆抗体；除了抗原决定簇的多样性以外，同样一种抗原决定簇，也可刺激机体产生IgG、IgM、IgA、IgE和IgD等五类抗体。抗原刺激机体，产生免疫学反应，由机体的浆细胞合成并分泌的与抗原有特异性结合能力的一组球蛋白，这就是免疫球蛋白，这种与抗原有特异性结合能力的免疫球蛋白就是抗体。
术语“细菌”包括广义的细菌，即为原核生物。是指一大类细胞核无核膜包裹，只存在称作拟核区(nuclearregion)的裸露DNA的原始单细胞生物，包括真细菌(eubacteria)和古生菌(archaea)两大类群。人们通常所说的即为狭义的细菌，狭义的细菌为原核微生物的一类，是一类形状细短，结构简单，多以二分裂方式进行繁殖的原核生物，是在自然界分布最广、个体数量最多的有机体，是大自然物质循环的主要参与者。
术语“肿瘤”是指无论在细胞形态和组织结构上，都与其发源的正常组织有不同程度的差异，这种差异称为异型性。异型性是肿瘤异常分化在形态上的表现。异型性小，说明分化程度高，异型性大，说明分化程度低。区别这种异型性的大小是诊断肿瘤，确定其良、恶性的主要组织学依据。良性肿瘤细胞的异型性不明显，一般与其来源组织相似。恶性肿瘤常具有明显的异型性。
术语“炎症”是指具有血管系统的活体组织对损伤因子所发生的防御反应。血管反应是炎症过程的中心环节。炎症，就是平时人们所说的“发炎”，是机体对于刺激的一种防御反应，表现为红、肿、热、痛和功能障碍。炎症，可以是感染引起的感染性炎症，也可以不是由于感染引起的非感染性炎症。通常情况下，炎症是有益的，是人体的自动的防御反应，但是有的时候，炎症也是有害的，例如对人体自身组织的攻击、发生在透明组织的炎症等等。
术语“本实施例”、“本发明实施例”、“如……所示”、“进一步的”、“进一步改进的技术分方案”等的描述，意指该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中；在本说明书中，对上述术语的示意性表述不是必须针对相同的实施例或示例，而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点等可以在任意一个或者多个实施例或示例中以合适的方式结合或组合；此外，在不产生矛盾的前提下，本领域的普通技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合或组合。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (8)
1.多克隆抗体Anti-DR5 Ab在促进细菌载药系统与肿瘤细胞特异性结合和提高细菌载药系统对肿瘤细胞生长抑制能力中的应用，其特征在于，所述细菌载药系统是指在细菌中装载光敏剂，并在细菌的细胞壁上共价连接抗体；所述的在细菌中装载光敏剂是指通过将光敏剂与细菌物理混合或共价连接而实现；所述多克隆抗体Anti-DR5 Ab促进细菌与肿瘤细胞的特异性结合，进而促进光敏剂释放到肿瘤细胞内。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述细菌包括双歧杆菌、趋磁细菌；所述双歧杆菌是指两岐双歧杆菌。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多克隆抗体Anti-DR5Ab提高细菌载药系统对肿瘤细胞的结合能力，进而增强对肿瘤细胞的杀伤作用。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述光敏剂为二氢卟吩e6。
5.激光或超声波或激光-超声波的联合在提高细菌载药系统抑制肿瘤生长中的应用，其特征在于，所述激光或超声波促进所述细菌载药系统中细菌和光敏剂均产生活性氧，激光-超声波的联合作用进一步提高细菌载药系统的活性氧产量，进而提高细菌载药系统对肿瘤细胞的杀伤能力。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述激光的波长为655nm-808nm，所述激光照射时间为1-20min；所述超声波频率为0.5-1MHz，所述超声波处理时间为1-10min。
7.一种治疗肿瘤的药物，其特征在于，包括细菌载药系统，所述细菌载药系统包括细菌、光敏剂以及多克隆抗体Anti-DR5 Ab，所述光敏剂与细菌物理混合或共价连接，所述多克隆抗体Anti-DR5 Ab与细菌共价连接。
8.根据权利要求7所述的一种治疗肿瘤的药物，其特征在于，所述药物在激光或超声波或激光-超声波的作用下产生活性氧，抑制肿瘤的生长。
Related Parent Applications (1)
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