KR101739046B1 - 종양 진단 및 치료용 나노입자 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 종양 진단 또는 치료용 나노입자에 관한 것으로 (a) 프루시안 블루 염료를 포함하는 코어부; 및 (b) 상기 프루시안 블루 코어 표면의 전체 또는 일부에 알부민이 코팅된 쉘부;를 포함함으로써, 핵자기공명 영상 장치 및 근적외선 형광영상 장치로 종양을 진단할 수 있을 뿐만 아니라 광열-광역학 병합 효과로 종양을 괴사시킬 수 있다.

Description

종양 진단 및 치료용 나노입자{Nanoparticles for Diagnosis and Treatment of Tumor}
본 발명은 핵자기공명 영상 장치 및 근적외선 형광영상 장치로 종양을 진단할 수 있을 뿐만 아니라 광열-광역학 병합 효과로 종양을 괴사시킬 수 있는 종양 진단 또는 치료용 나노입자에 관한 것이다.
바이오 기술 분야에서 나노입자들은 종양 조직 특이적 살상, 면역반응의 부스팅(boosting), 세포 융합, 유전자 또는 약물 전달, 진단 등에 이용되고 있다. 이러한 용도에 이용되기 위해서 나노입자들은 활성성분을 부착할 수 있는 부분을 구비해야할 뿐만 아니라 생체 내 즉, 수용성 환경에서 원활하게 운반 및 분산되어야 한다.
최근에는, 동시에 진단 및 치료에 사용할 수 있는 치료진단 나노입자가 암 치료를 위한 유망한 나노물질로 많은 주목을 받고 있다. 단일 재료로 진단 및 치료를 위하여 다양한 능력을 결합할 수 있다면, 유용한 나노물질로 이용될 수 있다.
그러나, 종양 조직에 대하여 진단 및 치료가 가능한 물질이 거의 없으므로 상기 특징을 갖는 다양한 방식의 기능제제의 개발이 진행되고 있다. 구체적으로, 근적외선 형광 영상의 높은 감도와 핵자기공명 영상의 높은 공간 해상도는 서로 잘 보완되며, 광역학 치료(PDT)와 광열치료(PTT)의 조합은 그 어떠한 것보다 우수한 치료 시스템을 제공할 수 있으므로 상기 기능성들을 모두 만족하는 나노물질이 필요하다.
한편, 프루시안 블루(PB)는 MRI 조영제로서 역할을 할 수 있도록, 프루시안 블루(PB) 및 그의 유사체가 자기 특성을 갖는다. 또한, 최근 프루시안 블루(PB) 나노입자는 NIR 스펙트럼에서의 높은 흡수에 기인한 광열제의 새로운 세대로 떠오르고 있다. 이에 따라, 최근에 여러 치료진단 나노입자는 프루시안 블루(PB) 나노입자를 이용하여 개발되었다.
프루시안 블루(PB)를 이용한 나노입자 합성 시스템의 최근 연구는 주로 시트르산 안정화 방법을 이용한다(비특허문헌 1 내지 3). 그러나 시트르산 안정화 방법을 이용을 이용한 나노입자는 특히 정맥주사 주입으로 생체 내(in vivo)에 응용하는 것은 바람직하지 못하다.
또한, PEG 및 PVA를 포함하는 고분자로 코팅된 표면은 프루시안 블루(PB)를 이용한 나노입자의 표면 안정화를 위해 이전에 사용되었다(비특허문헌 4). 이 역시 정맥주사 주입으로 생체 내(in vivo)에 응용하는 것은 바람직하지 못하다.
따라서, 생체 내 주입이 가능하도록 인간의 사용이 승인된 물질들을 이용할 뿐만 아니라, 종양 조직의 위치를 진단하고 괴사시켜 치료할 수 있도록 프루시안 블루(PB)를 이용한 나노입자가 요구되고 있다.
1. M. Shokouhimehr, E. S. Soehnlen, J. Hao, M. Griswold, C. Flask, X. Fan, J. P. Basilion, S. Basu, S. D. Huang, J. Mater. Chem. 2010, 20, 5251 2. G. Fu, W. Liu, S. Feng, X. Yue, Chem. Commun. 2012, 48, 11567 3. H. A. Hoffman, L. Chakrabarti, M. F. Dumont, A. D. Sandler, R. Fernandes, RSC Adv. 2014, 4, 29729 4. T. Uemura, M. Ohba, S. Kitagawa, Inorg. Chem. 2004, 43, 7339
본 발명의 목적은 핵자기공명 영상 장치 및 근적외선 형광영상 장치로 종양을 진단할 수 있을 뿐만 아니라 광열-광역학 병합 효과로 종양을 괴사시킬 수 있는 종양 진단 또는 치료용 나노입자를 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 나노입자를 이용하여 인간을 제외한 포유류의 생체 내 종양의 진단방법 또는 치료방법을 제공하는데 있다.
상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 종양 진단 또는 치료용 나노입자는 (a) 프루시안 블루 염료를 포함하는 코어부; 및 (b) 상기 프루시안 블루 코어부 표면의 전체 또는 일부에 알부민이 코팅된 쉘부;를 포함하는 프루시안 블루-알부민 나노입자일 수 있다.
또한, 종양 진단 또는 치료용 나노입자는 상기 쉘부의 알부민에 근적외선 형광 염료가 담지된 프루시안 블루-알부민-형광염료 나노입자일 수 있다.
상기 근적외선 형광 염료는 인도시아닌 그린(ICG), Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, 사이페이트(Cypate) 및 메틸렌블루(Methylene blue)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 프루시안 블루 염료 및 알부민은 10 : 1 내지 100 : 1의 몰비로 혼합될 수 있다.
상기 근적외선 형광 염료는 종양 영상화 및 치료용 나노입자 총 중량을 기준으로 60 중량%까지로 담지 될 수 있다.
상기 프루시안 블루-알부민 나노입자는 근적외선 레이저를 조사 시 인간을 제외한 포유류의 생체 내 종양의 온도가 45 ℃ 이상, 바람직하게는 45 내지 90 ℃로 상승할 수 있다.
상기 프루시안 블루-알부민-형광염료 나노입자는 근적외선 레이저를 조사 시 빛이 없는 상태에서는 독성이 없지만, 인간을 제외한 포유류의 생체 내 종양의 온도가 45 ℃ 이상, 바람직하게는 55 내지 90 ℃로 상승하는 동시에 활성 산소종이 발생될 수 있다.
상기 프루시안 블루-알부민-형광염료 나노입자는 포피린(porphyrin), 메틸렌블루(Methylene blue) 또는 프탈로사이아닌(Phthalocyanine)의 광역학치료 약물; 파클리탁셀(paclitaxel), 독소루비신(Doxorubicin) 또는 독세타셀(Docetaxel)의 항암제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 담지할 수 있다.
상기 나노입자는 비종양 부위에 비하여 종양 부위에서 형광 신호가 2배 이상, 바람직하게는 2 내지 5배 향상될 수 있다.
또한, 상기한 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 인간을 제외한 포유류의 생체 내 종양의 진단방법 또는 치료방법은 (A) 상기 나노입자를 인간을 제외한 포유류의 생체 내 또는 시료에 주입하는 단계; 및 (B) 상기 주입된 나노입자로부터 방출되는 신호를 감지하여 종양 유무 및 종양 위치를 진단하는 단계;를 포함할 수 있다.
상기 (B)단계에서 신호는 핵자기 공명 영상장치 및 근적외선 형광 영상장치로 감지할 수 있다.
상기 (B)단계에서 신호는 상기 나노입자를 주입하고 5 내지 25시간 후 감지할 수 있다.
상기 나노입자를 주입한 후 근적외선 레이저를 조사하여 종양 세포만을 선택적으로 괴사시킬 수 있다.
상기 근적외선 레이저는 상기 나노입자를 주입하고 5 내지 25시간 후에 조사될 수 있다.
본 발명의 종양 진단 또는 치료용 나노입자는 종양 조직에만 나노입자가 축적되고 비종양 조직에는 나노입자가 축적되지 않으므로 핵자기공명 영상 장치 및 근적외선 형광영상 장치로 종양 조직의 유무 및 종양 조직의 위치를 진단할 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명의 나노입자를 주입한 후 근적외선 레이저로 조사하면 광열-광역학 병합 효과로 인해 종양 조직을 모두 괴사시킬 수 있으며, 레이저로 조사 후에는 종양 조직이 다시 성장하지 않는다. 이는 본 발명의 종양 진단 또는 치료용 나노입자가 빛이 없는 상태에서는 무독성이지만 근적외선 레이저로 조사하면 독성을 발휘하여 상기 광열-광역학 병합 효과로 인해 종양 조직을 모두 괴사시키는 것이다.
또한, 본 발명의 종양 진단 또는 치료용 나노입자는 오직 생체적합성 물질들을 사용하였으며, 합성 시 어떠한 유기용매나 화학적 가교제를 사용하지 않는다.
도 1a는 실시예 1에 따라 제조된 PB-BSA 나노입자 및 실시예 2에 따라 제조된 PB-BSA-ICG 나노입자의 개략도이다.
도 1b는 상기 PB-BSA 나노입자 및 PB-BSA-ICG 나노입자의 흡수 스펙트럼이고, 도 1c는 DLS로 처리된 PB-BSA-ICG 나노입자의 크기 분포도이다.
도 2는 실시예 2의 PB-BSA-ICG 나노입자의 원자력 현미경 영상이다.
도 3a는 DIW, PBS, 및 DMEM(DMEM+10%FBS) 함유 혈청에서 동결 건조된 PB-BSA 나노입자의 재분산을 나타낸 사진이다.
도 3b는 시간에 따른 크기 변화에 의한 DIW, PBS, 및 DMEM(DMEM+10%FBS) 함유 혈청의 안정성을 나타낸 그래프이다.
도 4는 (i) PBS, (ii) PB-BSA-ICG 10, (iii) PB-BSA-ICG 25, 및 (iv) PB-BSA-ICG 50 용액의 NIR 형광 신호이다.
도 5a는 PB가 증가된 PB-BSA 나노입자의 T1-편중된 MR 영상이다.
도 5b는 T1 이완율 vs. PB 농도의 플롯이다.
도 5c는 NIR 레이저 조사 시 대조군, 프리 ICG, PB-BSA 나노입자, 및 PB-BSA-ICG 나노입자의 광열 안정성을 나타낸 그래프이다.
도 5d는 반복된 NIR 레이저 조사에 의한 프리 ICG, PB-BSA 나노입자, 및 PB-BSA-ICG 나노입자의 광열 안정성을 나타낸 그래프이다.
도 6a는 24시간 동안 다양한 농도의 PB-BSA 나노입자로 처리 후 SCC7 세포의 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 6b는 NIR 레이저 조사 후 프리 ICG, PB-BSA 나노입자, 및 PB-BSA-ICG 나노입자의 광선 요법의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 6c는 24시간 배양 후 SCC7 세포에서 프리 ICG 및 PB-BSA-ICG 나노입자의 세포 흡수의 유동세포 계측법으로 분석한 그래프이다.
도 6d는 세포 흡수의 유동세포 계측법으로부터 프리 ICG 및 PB-BSA-ICG 나노입자의 평균 형광강도를 나타낸 그래프이다.
도 6e는 ICG의 PDT 효과에서 발생된 세포 내 산화 후 그린 형광을 방출하는 H2DCF-DA 염료를 이용하여 프리 ICG 및 PB-BSA-ICG 나노입자에서 발생하는 세포 내 단일 산소(1O2)가 함유된 NIR 레이저의 사진이다.
도 7a는 PB-BSA-ICG 나노입자로 발생된 MR 신호에 의해 종양 부위의 시간 의존적 밝기를 나타낸 사진이다.
도 7b는 종양 부위에서 T1-편중된 MR 신호 변화의 정량적 분석을 나타낸 그래프이다.
도 8a는 PB-BSA-ICG 나노입자의 정맥 내 주입 시 무흉선 마우스의 생체 내(In vivo) NIR 형광 영상이다.
도 8b는 프리 ICG 용액의 정맥 내 주입시 무흉선 마우스의 생체 내(In vivo) NIR 형광 영상이다.
도 9a는 PB-BSA-ICG 나노입자 용액의 주입 24시간 후 희생된 마우스로부터 절제된 주요 장기 및 종양의 생체 밖(Ex vivo) 형광 이미지이다.
도 9b는 프리 ICG 용액의 주입 24시간 후 희생된 마우스로부터 절제된 주요 장기 및 종양의 생체 밖(Ex vivo) 형광 이미지이다.
도 9c는 PB-BSA-ICG 나노입자 및 프리 ICG 용액의 주입 24시간 후 주요 장기 및 종양의 형광 강도를 나타낸 그래프이다.
도 10a는 NIR 레이저로 조사하는 동안 종양 부위의 온도 변화를 나타낸 그래프이다.
도 10b는 레이저 조사하는 동안 종양관련 마우스의 IR 열 영상이다.
도 10c는 광선 요법으로 치료 후 마우스의 종양 부피의 변화를 측정한 그래프이다.
도 10d는 14일 동안 광선 요법 후 절제된 종양 조직의 이미지이다.
도 11은 식염수, 프리 ICG, PB-BSA 나노입자 및 PB-BSA-ICG 나노입자를 마우스의 정맥 내 주입 후 광선 요법으로 치료한 종양관련 마우스의 몸무게 변화를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 핵자기공명 영상 장치 및 근적외선 형광영상 장치로 종양을 진단할 수 있을 뿐만 아니라 광열-광역학 병합 효과로 종양을 괴사시킬 수 있는 종양 진단 또는 치료용 나노입자에 관한 것이다.
본 발명은 임상학적으로 승인된 생체 적합 물질들을 사용하여 제조하였으며, 이러한 나노입자는 생리학적 수용액에서 우수한 안정성을 가지고, 사용된 근적외선 형광 염료(예컨대, 인도시아닌 그린)의 빛에 대한 안정성을 효과적으로 증가시켰다.
본 발명의 나노입자는 듀얼 모드 핵자기공명(MR) 영상과 근적외선(NIR) 형광 영상뿐만 아니라 광열/광역학 병합 치료로의 사용이 가능하다. 또한, 본 발명의 나노입자는 빛이 없는 상태에서는 독성이 없지만, 근적외선 레이저를 조사한 경우에는 광열-광역학 효과에 의해 세포의 상당한 괴사가 일어난다. 뿐만 아니라, 본 발명의 나노입자는 종양이 있는 마우스에 정맥 주사하였을 때, 주요 장기로의 비특이적 축적은 최소화되고, 주로 종양에 축적이 일어남을 핵자기공명 영상과 근적외선 형광 영상으로 확인할 수 있다. 마지막으로, 본 발명의 나노입자가 주입된 마우스의 종양 조직은 근적외선 레이저 조사 후 효과적으로 제거되었고, 어떠한 재성장을 보이지 않는다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 코어쉘 구조의 종양 진단 또는 치료용 나노입자는 (a) 프루시안 블루 염료를 포함하는 코어부; 및 (b) 상기 프루시안 블루 코어 표면의 전체 또는 일부에 알부민이 코팅된 쉘부;를 포함한다. 또한, 상기 쉘부의 알부민에 근적외선 형광 염료가 담지 될 수 있다.
상기 코어부에 포함되는 프루시안 블루(PB) 염료는 Fe4[Fe(CN)6]3 · xH2O와 혼합된 철(II)헥사시아노퍼레이트로서, 방사성/비방사성 세슘 및/또는 탈륨에 노출된 환자의 치료를 위해 미국 식품 의약청(FDA)에 의해 승인된 물질이다.
또한, 상기 쉘부에 포함되는 알부민은 혈청에서 가장 풍부한 단백질이며 표면 안정제로서, 구체적으로는 소혈청 알부민(BSA) 또는 인간 혈청 알부민(HSA)을 들 수 있다. 본 발명에 사용되는 알부민은 나노입자의 안정성을 향상시켜 임상적으로 이용을 가능하게 할 뿐만 아니라 나노입자의 정맥 투여 시 생체로의 분포를 빠르게 한다.
상기 프루시안 블루 염료 및 알부민은 10 : 1 내지 100 : 1의 몰비, 바람직하게는 20 : 1 내지 80 : 1의 몰비로 혼합된다. 알부민을 기준으로 프루시안 블루 염료의 몰비가 상기 하한치 미만인 경우에는 나노입자가 안정화되지 못할 수 있으며, 상기 상한치 초과인 경우에는 나노입자의 크기가 더 이상 작아지는 현상이 없다. 또한, 상기 몰비로 사용하는 경우에는 근적외선 형광 염료의 담지에 문제가 발생하지 않는다.
본 발명과 같이 코어-쉘 구조로 형성된 나노입자는 코어-쉘 구조로 형성되지 않고 판상 등으로 형성되는 경우에 비하여 생체 내 분포가 빠르며, 암 조직에 효과적으로 축적되어 보다 강력한 신호를 방출할 수 있다.
또한, 상기 알부민층에 담지 되는 근적외선 형광 염료는 비공유결합 방식으로 알부민과 강하게 결합되며 근적외선 형광영상 장치로 신호를 감지할 수 있는 것으로서, 근적외선 형광 염료라면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 인도시아닌 그린(ICG), Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, 사이페이트(Cypate) 및 메틸렌블루 (Methylene blue)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 들 수 있으며, 바람직하게는 인도시아닌 그린(ICG)이다.
상기 근적외선 형광 염료로 인도시아닌 그린을 사용하는 경우에는 프루시안 블루 염료와 사용되어 근적외선 레이저 조사 시 광열 치료뿐만 아니라 활성 산소종에 의한 광역학 치료도 가능하다. 또한, 근적외선에 대한 안정성이 향상된다.
상기 근적외선 형광 염료는 나노입자 총 중량을 기준으로 최대 60 중량%이지만, 바람직하게는 1 내지 50 중량%, 더욱 바람직하게는 10 내지 20 중량%로 담지 된다. 근적외선 형광 염료의 함량이 상기 하한치 미만인 경우에는 형광 신호가 약하게 방출되고 광열-광역학 효과가 미미할 수 있으며, 상기 상한치 초과인 경우에는 형광 물질들 간의 소광효과에 의해 형광 신호가 감소되어 종양의 유무 및 종양 위치를 진단할 수 없다.
본 발명의 나노입자는 주요 장기, 예컨대 비종양 부위로의 축적은 최소화되고, 주로 종양 부위에 축적되므로 형광 신호를 정량적으로 분석하면 비 종양 부위에 비하여 종양 부위에서 형광 신호가 2배 이상, 바람직하게는 2 내지 5배 향상된다.
또한, 본 발명의 나노입자는 동결방지제 없이 동결건조가 가능하며, 모든 용액에서 쉽게 재분산이 가능할 뿐만 아니라 재분산 시 응집되지 않으므로 사용하기 용이하다.
또한, 본 발명은 인간을 제외한 포유류의 생체 내 종양의 진단방법 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명의 인간을 제외한 포유류의 생체 내 종양의 진단방법 또는 치료방법은 (A) 상기 종양 진단 또는 치료용 나노입자를 인간을 제외한 포유류의 생체 내 또는 시료에 주입하는 단계; 및 (B) 상기 주입된 나노입자로부터 방출되는 신호를 감지하여 종양 유무 및 종양 위치를 진단하는 단계;를 포함한다.
상기 (B)단계에서 나노입자로부터 방출되는 신호는 나노입자를 주입하고 5 내지 25시간 후 핵자기 공명 영상장치 및 근적외선 형광 영상장치로 감지할 수 있다. 상기 나노입자를 주입한 후 방치시간이 상기 하한치 미만인 경우에는 종양 조직에서의 신호가 강하게 방출되지 않아 진단의 정확성이 저하될 수 있으며, 상기 상한치 초과인 경우에는 더 이상 신호가 강해지지 않으므로 시간이 낭비될 뿐이다.
또한, 상기 나노입자를 주입하고 5 내지 25시간 후 나노입자가 종양 조직에 축적되면 근적외선 레이저를 조사하여 종양 조직만을 선택적으로 괴사시킨다. 구체적으로, 본 발명의 나노입자 중 프루시안블루 염료의 표면을 알부민으로 코팅된 코어-쉘 구조의 나노입자(프루시안블루-알부민)를 주입한 후 근적외선 레이저를 조사하는 경우에는 종양의 온도가 45 ℃ 이상, 바람직하게는 45 내지 90 ℃로 상승하여 종양을 일부 괴사시킬 수 있으며; 본 발명의 나노입자 중 상기 프루시안블루-알부민의 알부민에 근적외선 형광 염료를 담지시킨 나노입자(프루시안블루-알부민-형광 염료)를 주입한 후 근적외선 레이저를 조사하는 경우에는 종양의 온도가 45 ℃ 이상, 바람직하게는 55 내지 90 ℃로 상승하는 동시에 활성 산소종이 발생되어 종양을 완전히 괴사시킬 수 있다.
이하에서는 구체적인 실시예를 첨부된 도면과 함께 상세히 설명한다.
대조군.
식염수를 사용하였다.
실시예 1. 프루시안블루 -알부민 나노입자
K3Fe(CN)6와 FeCl2(시그마 알드리치)를 탈이온수(DIW)에 10 mmol의 농도로 각각 준비한다. 그리고 K3Fe(CN)6의 탈이온수를 각각 50, 100, 200 ul로 0.075 mmol의 농도로 녹아있는 소혈청 알부민(BSA, Mw ~66 kD, 시그마 알드리치)(5 mg/ml) 수용액 1 ml에 넣어주고, 이 혼합용액을 30분간 실온에서 교반하였다. 여기에 FeCl2의 탈이온수 50, 100, 200 ul를 첨가하여 혼합한 후, 30분간 실온에서 더 교반시켜 푸른 색상을 띠는 PB-BSA 나노입자를 형성하였다. 철염의 다양한 농도는 PB-BSA 나노입자의 크기에 대한 철 농도 비율의 효과를 확인하기 위하여 사용하였다. 반응 후, 5000 rpm 조건에서 10분간 실온에서 Nanosep® centrifugal devices(molecular weight 100kD)을 이용하여 스핀 여과에 의해 반응하지 않은 염과 알부민을 제거하였다. 이 과정을 3회 반복하여 나노입자의 순도를 높였다.
실시예 2. PB-BSA- ICG 나노입자
실시예 1에 따라 제조된 PB-BSA 나노입자에 인도시아닌 그린(시그마 알드리치)(1 mg/ml)을 첨가하여 진탕하 실온에서 1시간 동안 처리하여 소혈청 알부민에 인도시아닌 그린을 담지시킴으로써 PB-BSA-ICG 나노입자를 형성하였다. 그 후, ICG 분자는 스핀 여과에 의해 분리되었으며, 흡수율은 PB-BSA-ICG 나노입자의 양을 정량화하여 측정하였다.
비교예 1. 프리 인도사이아닌 그린
인도시아닌 그린만을 사용하였다.
도 1a는 실시예 1에 따라 제조된 PB-BSA 나노입자 및 실시예 2에 따라 제조된 PB-BSA-ICG 나노입자의 개략도이며, 도 1b는 상기 PB-BSA 나노입자 및 PB-BSA-ICG 나노입자의 흡수 스펙트럼이고, 도 1c는 DLS로 처리된 PB-BSA-ICG 나노입자의 크기 분포도이다.
또한, 도 2는 실시예 2의 PB-BSA-ICG 나노입자의 원자력 현미경 영상이며; 도 3a는 DIW, PBS, 및 DMEM(DMEM+10%FBS) 함유 혈청에서 동결 건조된 PB-BSA 나노입자의 재분산을 나타낸 사진이고, 도 3b는 시간에 따른 크기 변화에 의한 DIW, PBS, 및 DMEM(DMEM+10%FBS) 함유 혈청의 안정성을 나타낸 그래프이다.
또한, 도 4는 (i) PBS, (ii) PB-BSA-ICG 10, (iii) PB-BSA-ICG 25, 및 (iv) PB-BSA-ICG 50 용액의 NIR 형광 신호이다.
본 발명의 종양 진단 또는 치료용 나노입자는 실시예 1에 따라 제조된 프루시안 블루(PB) 염료의 표면에 소혈청 알부민(BSA)이 코팅된 코어-쉘 구조의 나노입자(PB-BSA 나노입자); 및 실시예 2에 따라 제조된 상기 코어-쉘 구조의 나노입자의 쉘부인 알부민층에 인도시아닌 그린(ICG)이 담지된 나노입자(PB-BSA-ICG 나노입자)를 들 수 있다(도 1a).
상기 PB-BSA 나노입자의 평균입경은 철염의 농도, Fe2+/Fe3+와 알부민의 비율로 변화되며, 이를 하기 [표 1]에 나타내었다.
Fe2 +/Fe3 +
(mmol)		 알부민
(mmol)		 알부민: Fe2 +/Fe3 + 비율 크기(nm) 제타전위(mV)
0.5 0.075 1 : 6.67 319 -163
1 0.075 1 : 13.33 5612 -183
2 0.075 1 : 26.67 9814 -192
위 표 1에 나타낸 바와 같이, 0.5 mmol의 Fe2 +/Fe3 +와 0.075 mmol의 알부민(BSA)의 농도는 DLS에 의한 측정으로 31 nm의 평균입경을 가진 나노입자로 제조되었다. PB-BSA 나노입자의 평균입경은 0.5 mmol에서 2 mmol로 증가된 Fe 염 농도 및 1:6.67에서 1:26.67로 증가된 알부민과 Fe2 +/Fe3 +의 비율로 31 nm에서 98 nm로 증가되는 것을 확인하였다. 또한, 제타 전위는 16 내지 19 mV 사이인 것을 확인하였다.
일반적으로, 작은 크기의 나노입자가 치료진단 응용에 더 효과적이므로 이후에는 평균입경이 31 nm 크기의 PB-BSA 나노입자를 이용하여 실험을 진행하였다.
상기 PB-BSA 나노입자는 ~710 nm에서 피크와 500 내지 850 nm의 파장에서 넓은 흡수 스펙트럼을 나타내는 것을 확인하였으며(도 1b), 원자력 현미경(AFM)으로 PB-BSA 나노입자가 ~20 nm의 평균입경을 가진 구형인 것을 확인하였다(도 2). 상기 원자력 현미경(AFM)을 이용한 측정은 PB-BSA 나노입자 용액의 방울을 유리 표면에 건조시켜 측정되므로 평균입경이 DLS 결과 보다 작다.
안정적 분석을 위해, 정제된 PB-BSA 나노입자는 동결방지제 없이도 동결건조가 가능하며, 상기 동결건조된 PB-BSA 나노입자는 탈이온수(DIW), 인산염 완충용액(PBS, 0.1M, pH 7.4) 및 10% FBS 함유된 세포 배양액(DMEM + 10% FBS)으로 용이하게 재분산될 뿐만 아니라, 이후에 응집이 일어나지 않으므로 크기에 변화없이 7일 이상 안정되는 것을 확인하였다(도 3).
상기 PB-BSA 나노입자의 알부민은 인도시아닌 그린(ICG)과 강하게 결합되며, 인도시아닌 그린(ICG)에 대하여 우수한 캐리어이므로 PB-BSA 나노입자와 인도시아닌 그린(ICG)의 단순 혼합에 의하여 PB-BSA 나노입자의 알부민층에 인도시아닌 그린(ICG)이 쉽게 담지된다.
이와 같이 제조된 실시예 2의 PB-BSA-ICG 나노입자는 ICG의 함량 증가로 담지되는 함량을 증가시킬 수 있으며, 이를 하기 [표 2]에 나타내었다.
구분 ICG (ug) 캡슐화 효율(%) 담지 농도(%)
PB-BSA-ICG 10 10 100 12.5
PB-BSA-ICG 25 25 94.4 29.5
PB-BSA-ICG 50 50 92.6 57.9
위 표 2에 나타낸 바와 같이, ICG의 담지 농도는 ICG 및 알부민 사이에 강한 상호작용 때문에 57.9%까지 높일 수 있다.
상기 PB-BSA-ICG 나노입자는 ICG의 담지 농도가 증가할수록 형광 신호가 감소되는 문제가 있는데, IVIS 영상을 측정한 결과 ICG 담지 농도 12.5%에서 우수한 형광 신호를 제공한다(도 4).
상기 PB-BSA-ICG 나노입자는 ~785 nm에서 흡수 피크가 명확히 관찰되며(도 1b), DLS 측정 결과 33 ± 5 nm의 평균입경(도 1c) 및 -17±5 mV의 제타전위를 보이는 것을 확인하였다.
도 5a는 PB가 증가된 PB-BSA 나노입자의 T1-편중된 MR 영상이며, 도 5b는 T1 이완율 vs. PB 농도의 플롯이다.
프루시안 블루(PB)는 물로부터 양성자의 종횡 완화시간(T1 및 T2)을 단축할 수 있는 능력을 가지므로 T1- 또는 T2-편중된 MR 영상을 이용할 수 있다.
그러나 진단의 경우에, T1-편중된 MR 영상은 T2-편중된 영상보다 임상 의학에서 더 바람직하므로 PB-BSA 나노입자의 T1-편중된 MR 영상의 특성에 초점을 맞추었다.
T1-기반 조영제는 물 양성자의 종횡 완화시간을 단축하고, 그들이 존재하는 영역을 밝게하는 포지티브 신호를 준다.
실시예 1의 PB-BSA 나노입자의 상이한 농도는 3T 임상 MRI 시스템을 사용하는 T1-편중된 MR 신호에 대해 분석하였으며, 그 결과 T1 신호에서 농도 의존적 증가뿐만 아니라 밝기 효과가 명확하게 관찰되었다(도 5a).
또한, 1/T1 vs. PB 농도의 플롯 기울기로부터 측정된 PB-BSA 나노입자의 세로길이 이완성(r1)은 ~1.48 mM-1s-1로 나타났다(도 5b). 종래 ~110 nm 크기의 PEGylated PB 나노입자는 9.4T의 작은 동물 MRI 시스템을 사용하였을 경우 6.4 mM1s1의 r1 값이 보고되었다(L. Cheng, H. Gong, W. Zhu, J. Liu, X. Wang, G. Liu, Z. Liu, Biomaterials 2014, 35, 9844.). 이러한 수치는 상기 PB-BSA 나노입자로 측정한 세로길이 이완성 (r1)에 비하여 우수하지만, 나노입자의 크기 면에서 훨씬 효과적으로 암 조직으로의 표적화 및 세포로의 축적량이 우수하여 보다 효율적인 MRI영상을 얻을 수 있다. 또한, 임상적으로 사용되는 T1 조영제인 Magnevist(가돌리늄디에틸렌트리아민펜타아세트산, 바이엘 헬스케어 제약)는 상기 PB-BSA 나노입자보다 높은 4.3 mM1s1의 r1 값을 가진다(M. F. Dumont, H. A. Hoffman, P. R. S. Yoon, L. S. Conklin, S. R. Saha, J. Paglione, R. W. Sze, R. Fernandes, Bioconjug. Chem . 2014, 25, 129).
도 5c는 NIR 레이저 조사(1 W/cm2) 시 대조군, 프리 ICG(비교예 1), PB-BSA 나노입자(실시예 1), 및 PB-BSA-ICG 나노입자(실시예 2)의 광열 안정성을 나타낸 그래프이며, 도 5d는 3 사이클 동안 반복된 NIR 레이저 조사(1W/cm2)에 의한 프리 ICG(비교예 1), PB-BSA 나노입자(실시예 1), 및 PB-BSA-ICG 나노입자(실시예 2)의 광열 안정성을 나타낸 그래프이다(각 사이클 당 3분의 레이저 조사).
연속파 NIR 레이저(808 nm, 1W/cm2)를 이용하여 PB-BSA 나노입자 및 PB-BSA-ICG 나노입자의 광열 속성을 알아본다.
5분 레이저 조사 후, PB-BSA 나노입자 용액(80 g/ml) 및 프리 ICG 용액(10 g/ml)은 각각 27 ℃ 및 10 ℃의 온도 증가를 보이며, PB-BSA-ICG 나노입자 용액의 온도 상승은 PB-BSA 나노입자 용액 또는 프리 ICG 보다 높은 39 ℃이다(도 5c). 상기 주요한 온도 상승은 PB-BSA 나노입자와 ICG 간의 협력 광열활동을 제안하며, 광열 안정성은 레이저 조사의 반복된 주기에서 프리 ICG, PB-BSA 나노입자 용액, 및 PB-BSA-ICG 나노입자 용액을 노광(exposing)에 의해 분석하였다.
상기 프리 ICG 용액(10 ㎍/ml)의 광열 효율은 각 사이클에서 상당히 감소되었으며, 구체적으로 첫 번째 사이클에서의 온도 증가는 ~10 ℃이고, 두 번째 사이클에서 ~6 ℃로 감소하였으며, 이는 ICG 분자 자신이 반복된 레이저 조사에 의해 불안정성을 보여 세 번째 사이클에서 2.5 ℃가 되었다(도 5d).
그러나, PB-BSA 나노입자 용액 및 PB-BSA-ICG 나노입자 용액은 각 사이클에서 각각 27 ℃ 및 39 ℃의 일정한 온도를 보이므로 우수한 광열 안정성이 입증되었다.
상기 PB-BSA-ICG 나노입자 용액은 ICG의 광열 안정성이 증가되며, 레이저 조사의 세 번째 사이클 후 광열 효율의 저하가 없는 것을 확인하였다(도 5d).
도 6은 생체 외(In vitro) 실험으로서, 도 6a는 24시간 동안 다양한 농도의 PB-BSA 나노입자로 처리 후 SCC7 세포의 생존율을 나타낸 그래프이며; 도 6b는 80 ㎍/ml의 PB 및 10 ㎍/ml의 ICG에 NIR 레이저 조사(1W/cm2, 5분) 후 프리 ICG, PB-BSA 나노입자, 및 PB-BSA-ICG 나노입자의 광선 요법의 효과를 나타낸 그래프이고; 도 6c는 24시간 배양 후 SCC7 세포에서 프리 ICG 및 PB-BSA-ICG 나노입자의 세포 흡수의 유동세포 계측법으로 분석한 그래프이며; 도 6d는 세포 흡수(n = 4)의 유동세포 계측법으로부터 프리 ICG 및 PB-BSA-ICG 나노입자의 평균 형광강도를 나타낸 그래프이고; 도 6e는 ICG의 PDT 효과에서 발생된 세포 내 산화 후 그린 형광을 방출하는 H2DCF-DA 염료를 이용하여 프리 ICG 및 PB-BSA-ICG 나노입자에서 발생하는 세포 내 단일 산소(1O2)가 함유된 NIR 레이저의 사진이다.
PB-BSA 나노입자의 독성은 편평암종(squamous carcinoma, SCC7) 세포를 이용하여 평가되었다.
10 ㎍/ml의 PB-BSA 나노입자에서 세포 생존율은 100%이고, 100 ㎍/ml의 고농도에서도 세포 생존율이 98%인 것을 확인하였다(도 6a).
또한, 프리 ICG, PB-BSA 나노입자, 및 PB-BSA-ICG 나노입자의 생체 외(in vitro) 광선치료 효과는 SCC7 세포에서 비교하였으며, 예상한 바와 같이 세포 생존율은 레이저 처리 없이 모든 그룹에 대하여 거의 100%였다(도 6b). 그러나, NIR 레이저 조사(1W/cm2, 5분) 후 세포 생존율은 프리 ICG 및 PB-BSA 나노입자에서 55% 및 38%로 감소된 것을 확인하였다. 더욱이, PB-BSA-ICG 나노입자에서는 NIR 레이저 조사(1W/cm2, 5분) 후 세포 생존율이 13%로 감소된 것을 확인하였다. 이는 광선치료 요법에 의해 향상된 세포 독성 효과를 보이는 것을 의미한다(도 6b).
PB-BSA-ICG 나노입자의 세포 흡수는 정량적으로 유동 세포 계측법으로 분석되고, 프리 ICG의 흡수로 비교된다.
세포와 관련된 NIR 형광은 프리 ICG 또는 PB-BSA-ICG 나노입자를 24시간 배양 후 관찰되며, PB-BSA-ICG 나노입자로 처리된 세포에서의 높은 형광 신호는 프리 ICG와 비교하여 향상된 세포 흡수를 의미한다(도 6c). 유동 데이터의 정량적 분석은 프리 ICG로 배양된 세포와 비교하여 PB-BSA-ICG 나노입자로 배양된 세포와 관련된 형광에서 2.9배 증가하였다(도 6d).
또한, 프리 ICG는 광역학적 특성을 보유하고 808nm NIR 레이저로 노출될 경우 단일 산소(1O2)를 생성할 수 있다. 세포 내의 1O2 생성은 활성 산소종(ROS) 프로브로서 2`,7`-dichlorodihydrofluorescein diacetate(H2DCF-DA) 염료에 의해 분석된다.
808 nm 레이저로 조사 후, 프리 ICG 또는 PB-BSA-ICG 나노입자로 처리된 SCC7 세포는 H2DCF-DA 배양되고, 형광 현미경에 의해 시각화되었다.
형광 신호는 1O2를 생성하지 않는 레이저 조사로 제안된 대조군 세포에서 관찰되지 않으며, 프리 ICG 또는 PB-BSA-ICG 나노입자로 배양된 세포는 세포 내 그린 형광 신호, 1O2 세대를 확인하는 레이저 조사에 의해 확인되었다(도 6e).
PB-BSA-ICG 나노입자로 처리된 세포로부터 발생된 그린 형광 신호는 그들의 높은 세포 흡수 때문에 프리 ICG 처리된 세포 보다 높으며, 이러한 결과는 PB-BSA-ICG 나노입자의 ICG가 NIR 레이저 조사에 의해 1O2를 발생할 수 있음을 의미한다.
따라서, 레이저 치료 후 PB-BSA 나노입자 또는 프리 ICG에 비해 PB-BSA-ICG 나노입자의 높은 세포독성 효과는 향상된 세포 흡수뿐만 아니라 결합된 PTT 및 PDT의 광선효과 때문이라고 결론지을 수 있다.
도 7a 내지 7b는 PB-BSA-ICG 나노입자를 정맥 내에 주입 후 종양 이종이식 마우스(n=4)에서의 T1-편중된 생체 내(in vivo) MR 이미지로서, 도 7a는 PB-BSA-ICG 나노입자로 발생된 MR 신호에 의해 종양 부위의 시간 의존적 밝기를 나타낸 사진이며(종양은 화살표로 표시); 도 7b는 종양 부위에서 T1-편중된 MR 신호 변화의 정량적 분석(n=4, *P > 0.05, **P < 0.05)을 나타낸 그래프이다.
또한, 도 8a는 PB-BSA-ICG 나노입자의 정맥 내 주입 시 무흉선 마우스(n=4)의 생체 내(In vivo) NIR 형광 영상이며; 도 8b는 프리 ICG 용액의 정맥 내 주입시 무흉선 마우스(n=4)의 생체 내(In vivo) NIR 형광 영상이다.
또한, 도 9a는 PB-BSA-ICG 나노입자 및 도 9b는 프리 ICG 용액의 주입 24시간 후 희생된 마우스(n=4)로부터 절제된 주요 장기 및 종양의 생체 밖(Ex vivo) 형광 이미지이며(상측: 종양, 간, 비장; 하측: 신장, 심장, 폐(왼쪽에서 오른쪽)); 도 9c는 PB-BSA-ICG 나노입자 및 프리 ICG 용액의 주입 24시간 후 주요 장기 및 종양의 형광 강도를 나타낸 그래프이다(n=4, *P < 0.01).
생체 내(in vivo) 종양 진단에 대한 듀얼 모드 MR 및 광학 영상화제로 PB-BSA-ICG 나노입자의 잠재적 응용은 마우스 이종이식 모델에서 평가하였다.
SCC7 종양 함유 마우스(n=4)는 PB-BSA-ICG 나노입자 용액(PB의 투여량 20 mg/kg, ICG의 투여량 2.5 mg/kg)이 정맥 내로 투여되고, T1-편중된 MR 신호는 3T 임상 MRI 스캐너에 의해 수득하였다.
마우스의 동일한 그룹은 생체 내(in vivo) 영상 시스템(IVIS)에 의해 NIR 형광 신호에 대해 조사하였다.
종양 영역에서 T1-편중된 MR 신호는 시간에 따라 크게 변화되는데, 주입 2시간 후, 종양 영역에서 MR 신호의 약한 증가가 관찰되었다. 그러나 22시간 후, 종양은 PB-BSA-ICG 나노입자 주입 전에 촬영된 영상에 비해 훨씬 밝아보였다(도 7a).
종양 부위에서 T1 신호 강도는 각각 주입 2시간 및 22시간 후 1.2배 및 1.7배 증가된 것을 확인하였다(도 7b).
상기 PB-BSA 나노입자는 종양에 국한될 수 있고, MR 영상에 대한 효과가 충분히 T1 신호를 발생할 수 있음을 확인하였다. 동시에, NIR 형광 영상은 PB-BSA-ICG 나노입자의 생체분포 및 종양 위치측정을 모니터링으로 수득하였다.
PB-BSA-ICG 주입 3시간 및 6시간 후, 형광 신호는 종양을 포함하여 몸 전체에서 널리 분포되었으나, 12시간 후, 강한 형광 신호는 모든 마우스에서 종양부위에만 관찰되었다(도 8a). 또한, 종양 부위에서의 상기 강한 형광 신호는 24시간 유지되는 것을 확인하였다(도 8a).
종양 부위에서 증진된 시간 의존 형광 신호는 PB-BSA-ICG 나노입자가 두 방식의 영상에 사용될 수 있음을 증명하는 MR 영상 데이터와 잘 일치한다.
한편, 프리 ICG 용액(2.5 mg/kg)은 IVIS 영상에 대하여 대조군으로 다른 마우스에 주입하였다. 마우스에 주입된 프리 ICG은 주입 3시간 후 간장 부위에서 강한 신호를 보이며 강한 신호는 시간에 따라 서서히 감소되었다. 상기 신호가 서서히 감소하는 것은 마우스 몸으로부터 프리 ICG 분자가 빠르게 배출된다는 것이다(도 8b).
본 발명의 PB-BSA-ICG 나노입자는 장기간의 혈액 순환 및 보다 효과적인 종양 축적을 암시하는 주입 24시간 후 종양 부위에서 상당히 강한 신호를 보인다. 장기간의 혈액 순환 특성으로 전신 투여된 나노입자는 종양 부위에서 PB-BSA 나노입자 및 PB-BSA-ICG 나노입자의 높은 축적에 대한 주요 원인인 EPR 효과에 의해 종양 조직에서 축적될 수 있다.
주입 24시간 후, 모든 마우스는 주요 장기를 수집하기 위해 희생되고, 형광 신호는 PB-BSA-ICG 나노입자 및 프리 ICG의 생체분포를 분석하기 위해 기록되었다. 예상대로, 높은 형광 신호는 PB-BSA-ICG 나노입자가 주입된 마우스(n=4)의 종양에서 관찰되었으며, 다른 주요 장기의 신호는 매우 낮았다(도 9a). 대조적으로, 프리 ICG 주입된 마우스의 종양은 낮은 신호를 보였으나, 간장은 상당히 높은 형광 신호를 보였다(도 9b). 이와 유사한 경향은 폐에서도 관찰되었다.
이러한 관찰은 PB-BSA-ICG 나노입자가 종양 조직에 선택적으로 축적될 수 있으며, 듀얼 모드 MR 영상 및 NIR 형광 영상에 의해 진단 목적으로 사용될 수 있다는 것을 입증한다.
적출된 주요 조직에서 얻은 형광 신호의 정량적 분석은 간장과 비교하여 종양에서 PB-BSA-ICG 나노입자의 3.5배 높은 축적을 보인다.
도 10a 내지 10d는 종양 이종이식 마우스에서 생체 내(in vivo) 광선 요법이 유도된 NIR 레이저에 관한 것으로서, 도 10a는 NIR 레이저로 조사(808 nm, 1 W/cm2) 하는 동안 종양 부위의 온도 변화를 나타낸 그래프이며; 도 10b는 레이저 조사하는 동안 종양관련 마우스의 IR 열 영상이고; 도 10c는 광선 요법으로 치료 후 마우스의 종양 부피의 변화를 측정(n = 3, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001)한 그래프이며; 도 10d는 14일 동안 광선 요법 후 절제된 종양 조직의 이미지이다.
또한, 도 11은 식염수, 프리 ICG, PB-BSA 나노입자 및 PB-BSA-ICG 나노입자를 마우스의 정맥 내 주입 후 광선 요법으로 치료한 종양관련 마우스의 몸무게 변화를 나타낸 그래프이다.
PB-BSA-ICG 나노입자의 우수한 생체분포 및 높은 종양 지역화는 생체 내(in vivo) 치료 가능성이 높다. 종양 함유 마우스는 4 그룹(식염수, 프리 ICG, PB-BSA 나노입자, 및 PB-BSA-ICG 나노입자)으로 무작위로 나누고, 꼬리 정맥을 통해 각각의 샘플을 주입한다.
주입 24시간 후, 모든 마우스의 종양 부위는 광선 치료를 위해 연속파 NIR 레이저(808 nm, 1W/cm2, 10분)로 조사되었으며, 상기 레이저가 조사되는 동안 실시간 온도 증가는 IR 열 카메라에 의해 모니터되었다(도 10a 및 도 10b).
식염수를 주입한 마우스에서 온도 증가는 최소화되고, 최종 온도는 종양에서 광열화제의 부재로 39 ℃로 제한되었으며, 프리 ICG 그룹 마우스는 ~6 ℃의 평균 온도 상승을 보였고, 종양의 최종 온도는 42 ℃이다. ICG 자체는 우수한 광열 변환 효율을 가지고 있지만, 광열 불안정성과 빈곤한 종양 지역화가 비효율적 광열 효과의 이유가 될 수 있다.
대조적으로, PB-BSA 나노입자가 주입된 마우스는 높은 종양 축적 및 우수한 광열 안정성 때문에 49 ℃까지 종양 온도의 급격한 증가를 보였으며, PB-BSA-ICG가 주입된 마우스는 종양 부위에서 55 ℃까지 종양 온도의 급격한 증가를 보였다(도 10a 및 도 10b). 상기 온도는 주변보다 표적된 종양 부위에서 높은 온도를 보이며, PB 및 ICG의 상승효과로 인해 PB-BSA 나노입자에 비해 PB-BSA-ICG 나노입자에 의한 높은 광열효과를 보인다.
레이저 치료 후 종양 성장을 2주 동안 모니터하였는데, 상기 기간 동안 PB-BSA 나노입자 및 PB-BSA-ICG 나노입자가 주입된 모든 마우스는 생존하였고, 그들의 몸무게 감소 역시 없는 것이 관찰되었다(도 11).
치료 반응이 식염수가 주입된 마우스에서는 발견되지 않아 급격히 성장한 종양이 관찰되었다(도 10c). 유사하게, 프리 ICG로 처리된 마우스는 식염수 그룹에 비하여 유의한 종양 퇴행을 나타내지 않았다.
PB-BSA 그룹의 경우, 상당한 종양 퇴행이 초기에 발견되었지만 5일 후 상기 종양이 빠르게 성장하기 시작하여 재성장을 방지하는데 실패하였다. 그러나, 레이저 치료된 PB-BSA-ICG 나노입자가 주입된 마우스는 종양 조직의 완벽한 제거가 관찰되었으며, 종양의 재성장이 14일 동안 발견되지 않았다(도 10c). 상기 PB-BSA-ICG 나노입자의 우수한 치료효율은 PB-BSA 나노입자에 비해 PB 및 ICG의 상승효과 때문인 것으로 보인다. ICG의 존재는 오직 광열효과만 향상시키지만, 레이저 조사 하에서 단일 산소 생성에 의해 광역학 효과를 유도할 수 있다.
본 발명의 종양 진단 또는 치료용 나노입자는 이미 증명된 생체 적합성 물질을 이용한 것이다. 이 중 프루시안 블루(PB)는 우수한 광열 특성을 갖는 MR 조영제이고, ICG는 광열 및 광역학 특성을 갖는 NIR 형광 염료이다.
그러므로 단일 시스템에서 치료된 두개가 보완적이며, 비침습적이고, 비교적 안정한(방사성 동위원소 프리) 영상의 결합은 개선된 임상진단을 위한 큰 잠재력을 제공할 수 있다.
광열-광역학의 결합된 광선요법은 본 발명의 나노입자가 정맥 내로 주입되는 마우스 모델에서 우수한 종양 회귀결과를 초래한다.
따라서, 본 발명의 다기능 종양 진단 또는 치료용 나노입자는 개선된 영상 및 광선 요법 적용에 위한 다양한 플랫폼을 제공할 수 있다.
-재료 및 장치
재료: DMEM, 소태아혈청(FBS, fetal bovine serum), 페니실린-스트렙코마이신(penicillin-streptomycin) 및 트립신-EDTA(trypsin-EDTA)은 Gibco(Grand Island, NY, USA)에서 구입하였으며; WST-8는 Dojindo Laboratories(Kumamoto, Japan)에서 구입하였고; SCC7(squamous cell carcinoma, 편상상피암) 세포주는 한국 세포주 은행(Seoul, Korea)에서 얻었다.
PB 나노입자 및 ICG 담지의 특성: PB-BSA 나노입자 및 PB-BSA-ICG 나노입자의 크기 및 표면 특성은 동적 레이저 산란(DLS) 측정으로 분석하였으며, 나노입자의 형태는 AFM 분석(NanoScope, Digital Instruments-Veeco, Santa Barbara, CA, USA)으로 측정하였다.
PB-BSA 나노입자의 안정성은 완충액(0.1M PBS, pH 7.4) 및 세포 배양 배지(DMEM containing 10% FBS)로 평가하였다.
동결 건조된 PB-BSA 나노입자는 탈이온수(DIW), PBS, 또는 배지로 재현탁 후 37 ℃에서 진탕배양하여 유지하였으며, 나노입자의 크기분포는 DLS 측정에 의해 여러 시점에서 수득되었다.
생체 외(In vitro) MR & T1 이완성 분석: 탈이온수에서 본 발명 나노입자의 상이한 농도의 T1-편중된 MR 영상 및 T1 이완성은 3T 임상 MRI 장비(Magnetom Tim Trio, Siemens Medical Solutions, Erlangen, Germany)에 의해 측정된다. 반향 시간은 12 ms로 설정; 반복 시간은 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 및 1000 ms; 시야 24 cm, 단면 두께 of 3 mm, 및 매트릭스 256 X 256.
광열 특성: 프리 ICG, PB-BSA 나노입자 및 PB-BSA-ICG 나노입자의 광열 효율은 808 nm 연속파(CW) NIR 레이저(Dragon Lasers Co., Changchun, China)로 조사한 후 분석되었다. 상기 PB 농도는 80 ㎍/ml이고, ICG 농도는 10 ㎍/ml이다.
500 ㎕의 각 용액은 2 ml 원심분리 튜브에 취하고, 1 W/cm2의 파워 밀도 NIR 레이저로 조사되었으며, 용액에서 레이저 광이 함유된 온도 변화는 적외선(IR) 열 영상 시스템(FLIR SC-300, FLIR Systems Inc, Danderyd, Sweden)에 의해 실시간으로 측정되었다.
생체 외(In vitro) 세포 연구: SCC7 종양 세포주는 10% FBS이 포함된 DMEM 및 1% 항생제(페니실린스트렙토마이신)에서 유지되었다. 생체 외(In vitro) 독성 확인을 위해, SCC7 세포는 96-웰 플레이트 (1X104cells/well)에서 씨드되고, CO2 배양기에서 37 ℃로 8시간 동안 배양되었다. 그 후, 10 내지 100 ㎍/ml 농도의 나노입자는 세포에 첨가되었다. 배양 24시간 후, 상등액은 제거되고, 세포는 세척되며, WST-8 시약을 함유하는 신선한 배지는 웰에 첨가되었다.
세포는 37 ℃에서 1시간 동안 더 배양하고, 배지 색깔의 흡광도를 멀티웰 분광광도계(SpectraMax M2e, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 450 nm에서 측정하였다.
PB-BSA-ICG 나노입자의 세포 흡수는 유동세포 분석법(flow cytometry)으로 분석하여 정량하였다. SCC7 세포는 프리 ICG(10 ㎍/ml) 및 PB-ICG 나노입자(PB: 80 ㎍/ml, ICG: 10 ㎍/ml)로 24시간 동안 처리된다. 그 후, 세포는 트립신 처리에 의해 분리된 PBS로 3번 세척되고, 원심분리(1500 rpm로 5분)에 의해 수집되었다. 수득된 세포는 10% FBS가 함유된 차가운 PBS로 재분산되고, 유동세포 분석법(FACS Calibur, BD Biosciences, San Jose, CA, USA)에 의해 즉시 분석된다. 30000 이벤트는 각 샘플에 대하여 수집되고, 무처리 SCC7 세포는 대조군으로 이용되었다.
광선 요법으로 유도된 레이저의 효과를 결정하기 위하여, 세포는 이전과 같이 씨드되고 프리 ICG (10 ㎍/ml), PB-BSA 나노입자(80 ㎍/ml) 및 PB-BSA-ICG 나노입자(80 ㎍/ml)로 24시간 동안 처리된다. 그 후, 세포는 완전히 세척되고, 신선한 배지는 각 웰에 첨가되었다. 다음으로, 세포는 5분 동안 808 nm NIR 레이저로 조사되었다.
레이저 조사 후, 세포는 12시간 동안 더 배양되고, 세포 생존능력은 WST-1 분석법에 의해 측정되었다.
생체 내(In vivo) MR 영성 및 생체 분포: BALB/c 무흉선 누드 마우스(male, 6-7weeks)는 오리엔트 바이오 주식회사(Seoul, Korea)에서 구입하였으며, 광주과학기술연구원(GIST)의 동물관리 및 사용위원회의 지침에 따라 처리되었다.
마우스의 오른쪽 후방 측면 영역은 피하 주사에 의해 SCC7 세포(1X106 cells in 50 ㎕ serum free DMEM media)에 이식하였다.
종양이 ~100-150 mm3 부피로 성장한 10 내지 12일 후, PB-BSA-ICG 나노입자 용액(PB 20 mg/kg, ICG 2.5 mg/kg)은 각 마우스의 꼬리 정맥을 통해 주사하였다. 샘플 주입 전과 후 종양의 T1-편중된 MR 영상은 3T 임상 MRI 장비(Magnetom Tim Trio, Siemens Medical Solutions, Erlangen, Germany)를 사용하여 수행하였다.
PB-BSA-ICG 나노입자 및 프리 ICG의 생체 내(in vivo) 생체 분포는 광학 형광 영상에 의해 분석된다. MR 영상 후, PB-BSA-ICG 나노입자가 주입된 마우스에서 NIR 형광 신호는 주입 3, 6, 12, 및 24시간 후 IVIS 100 영상 시스템(Xenogen Corp., Alameda, CA, USA)을 이용하여 기록하였다. 프리 ICG(2.5 mg/kg)가 주입된 마우스에서 형광 신호 역시 유사한 시간 간격으로 기록되었다.
상기 마우스는 주입 24시간 후 희생되고, 절제된 종양 및 주요장기(간, 폐, 비장, 심장 및 신장)로부터 형광 신호를 측정하였다.
생체 내(In vivo) 광선 요법: 종양 이종이식 마우스는 전술한 바와 같이, 동일한 방법으로 생성하였다. 종양이 성장하여 원하는 부피(~100 mm3)에 도달한 마우스는 각각 식염수 그룹, 프리 ICG 그룹, PB-BSA 나노입자 그룹, 및 PB-BSA-ICG 나노입자 그룹의 4개 그룹으로 나누었다. 그룹에 따라 마우스 정맥에 각 샘플을 주입하였다(ICG는 2.5 mg/kg, PB는 20 mg/kg 투여).
주입 24시간 후, 각 마우스의 종양은 10분 동안 808 nm NIR 레이저(1 W/cm2)에 노출되었으며, 레이저로 치료하는 동안 종양 영역의 실시간 온도 변화는 IR 열 영상 시스템에 의해 모니터링되었다. 처리 후 종양 크기는 디지털 캘리퍼에 의해 특정 시점에서 측정하였다.

Claims (14)

  1. (a) 프루시안 블루 염료를 포함하는 코어부; 및
    (b) 상기 프루시안 블루 코어부 표면의 전체 또는 일부에 알부민이 코팅된 쉘부;를 포함하는 나노입자를 포함하며,
    상기 쉘부의 알부민에 인도시아닌 그린(ICG)이, 종양 진단 또는 치료용 나노입자 총 중량을 기준으로 1 내지 50 중량%로 담지되는 것을 특징으로 하는 종양 진단 또는 치료용 약제학적 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 나노입자는 포피린(porphyrin), 메틸렌블루(Methylene blue) 또는 프탈로사이아닌(Phthalocyanine)의 광역학치료 약물; 파클리탁셀(paclitaxel), 독소루비신(Doxorubicin) 또는 독세타셀(Docetaxel)의 항암제;로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 담지하는 것을 특징으로 하는 종양 진단 또는 치료용 약제학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 프루시안 블루 염료 및 알부민은 10 : 1 내지 100 : 1의 몰비로 혼합되는 것을 특징으로 하는 종양 진단 또는 치료용 약제학적 조성물.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서, 상기 나노입자는 빛이 없는 상태에서는 독성이 없고, 근적외선 레이저를 조사하면 인간을 제외한 포유류의 생체 내 종양의 온도가 45 ℃이상으로 상승하는 동시에 활성 산소종이 발생되는 것을 특징으로 하는 종양 진단 또는 치료용 약제학적 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 나노입자는 비종양 부위에 비하여 종양 부위에서 형광 신호가 2 배 이상 향상된 것을 특징으로 하는 종양 진단 또는 치료용 약제학적 조성물.
  10. (A) 제1항, 제4항 내지 제5항, 제8항 및 제9항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물을 인간을 제외한 포유류의 생체 내 또는 시료에 주입하는 단계; 및
    (B) 상기 주입된 약제학적 조성물로부터 방출되는 신호를 감지하여 종양 유무 및 종양 위치를 진단하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 포유류의 생체 내 종양의 진단방법 또는 치료방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 (B)단계에서 신호는 핵자기 공명 영상장치 및 근적외선 형광 영상장치로 감지하는 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 포유류의 생체 내 종양의 진단방법 또는 치료방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 (B)단계에서 신호는 상기 나노입자를 주입하고 5 내지 25시간 후 감지하는 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 포유류의 생체 내 종양의 진단방법 또는 치료방법.
  13. 제10항에 있어서, 상기 나노입자를 주입한 후 근적외선 레이저를 조사하여 종양 세포만을 선택적으로 괴사시키는 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 포유류의 생체 내 종양의 진단방법 또는 치료방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 근적외선 레이저는 상기 나노입자를 주입하고 5 내지 25시간 후에 조사하는 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 포유류의 생체 내 종양의 진단방법 또는 치료방법.
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