WO2019022306A1 - 광열 처리된 세포 용해물을 유효성분으로 함유하는 백신 또는 면역치료제 조성물 - Google Patents

광열 처리된 세포 용해물을 유효성분으로 함유하는 백신 또는 면역치료제 조성물 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a vaccine or an immunotherapeutic composition comprising a photothermal-treated cell lysate as an active ingredient.
  • cancer is a disease caused by a mutation in the gene of a cell, which causes abnormally mature and excessive proliferation when the cell is damaged. These cancer cells penetrate into tissues and organs in the body and weaken their function and are sometimes transferred to other organs. In addition, various types of cancer can occur depending on race, sex, age, and dietary habits.
  • Treatment of cancer is divided into aggressive therapy that eliminates solid cancer tissues in the long term or kills cancer cells, and relaxation therapy that slows the progress of cancer cells and minimizes side effects.
  • the three major cancer treatments are surgery, chemotherapy, and radiotherapy, which induce clinically meaningful anticancer effects.
  • the conventional methods are to treat cancer, which is the leading cause of cancer death, as well as recurrent cancer It is not enough. Therefore, a strategy to treat a new concept of cancer has been studied variously, and photothermal therapy (PTT) using light has been attracting attention of many researchers.
  • PTT photothermal therapy
  • a PTT is a treatment that treats a specific wavelength of laser light and absorbs light and converts the absorbed light into heat energy to treat the cancer by increasing heat in the cell.
  • the light absorber such as the gold nanoparticles, absorbs light by free electrons on the surface, and surface plasmon resonance effect, in which heat energy is generated by the kinetic energy of the free electrons absorbing the light, , And cancer cells are removed by such heat energy.
  • PTT has a few side effects because it has cancer specificity compared with conventional treatment methods, and it can treat cancer with minimal scarring.
  • the effect of PTT in suppressing the growth of cancer is compared with conventional treatment methods such as radiotherapy or chemotherapy It has the advantage of showing strong effect.
  • photodynamic therapy is a technique for removing cancer cells by utilizing a light absorbing agent (or a photosensitizer) capable of forming a singlet oxygen by light.
  • a light absorbing agent or a photosensitizer
  • the light absorbent accumulated in the cancer cells causes a chemical reaction by light to generate singlet oxygen and highly reactive free radicals, which can chemically destroy the cell components and induce apoptosis. Therefore, both PTT and PDT use the same light absorber and light.
  • the type and action mechanism of the light absorber to be used are different from each other. In recent years, .
  • the depth of penetration of light through the tissue is limited to such a degree that light of the wavelength with the best transmittance can only penetrate about 2 to 3 mm, Although it is effective for the treatment of primary tumors, there is a limitation that it is limited to distant metastatic cancer treatment and recurrent cancer treatment. Therefore, it is necessary to develop more effective anti-cancer therapy.
  • Another object of the present invention is to provide an immunotherapeutic composition capable of effectively inhibiting cancer.
  • Another object of the present invention is to provide a method for effectively increasing the immunogenicity of a cell.
  • Another object of the present invention is to provide a method for effectively increasing the expression of heat shock protein in a cell.
  • the present invention provides a vaccine composition containing a photothermal-treated cell lysate as an active ingredient.
  • an immunotherapeutic composition comprising a photothermal-treated cell lysate as an active ingredient.
  • the present invention provides a method of increasing the immunogenicity of a cell, comprising the step of photo-thermally treating cells in vitro.
  • the present invention provides a method for increasing the expression of a heat shock protein (HSP) in a cell, comprising the step of photothermalizing cells in vitro.
  • HSP heat shock protein
  • the present invention maximizes the expression of heat shock protein (HSP) which induces immunogenicity in cells by using phototherapy (PTT) in vitro (ex vivo), maximizes the expression efficiency and tissue damage And the cancer-specific immune response can be established more efficiently than the conventional cancer vaccine. Therefore, the photo-thermally treated cell lysate according to the present invention can be effectively utilized as a vaccine composition or an immunotherapeutic composition.
  • HSP heat shock protein
  • PTT phototherapy
  • FIG. 1 is a graph illustrating a comparison of temperature increase and cell survival rate according to an extracorporeal PTT treatment and a heating treatment according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 shows the results of examining the expression levels of HSP70 according to the extracorporeal PTT treatment and the heat treatment according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 shows the results of measuring the expression levels of HSP27 (left) and HSP90 (right) in cancer cells after the in vitro PTT treatment according to an embodiment of the present invention (100 ug / ml - 4 W / cm 2 , ug / ml - 4 W / cm 2 , solid line: 4 ug / ml - 4 W / cm 2 , dotted line, water bath heat treatment, tight dotted line).
  • FIG. 4 is a graph showing the results of measuring the cancer antigen-specific solubility in vivo after immunizing a mouse cancer cell lysate treated with an extracorporeal PTT according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 is a result of in vivo examination of anticancer activity of a dendritic cell vaccine using CT-26-HER2 / neu cell lysate treated with an ex vivo PTT according to an embodiment of the present invention.
  • the present invention provides a vaccine composition containing a photothermal-treated cell lysate as an active ingredient.
  • the photothermal treatment was performed in the group consisting of IndoCyanine Green, Gold nanorod, Gold nanosphere and Carbon Chitosan covered CuS as a light absorber
  • the present invention is not limited to the material which can be used as the light absorber.
  • the photothermal processing may irradiate laser of any one wavelength selected from the group consisting of 360-430 nm, 480-680 nm, 630-670 nm, 700-2500 nm and 780-850 nm, Do not.
  • the photothermal treatment may also be a laser irradiation with an intensity of 0.5 W / cm 2 to 20 W / cm 2 , and preferably a laser irradiation with an intensity of 2 W / cm 2 to 4 W / cm 2 And it is more preferable to irradiate the laser with an intensity of 4 W / cm 2.
  • the intensity of the laser since the laser directly shoots the living body, the intensity of the laser is limited to reduce the side effect caused by the light. And the skin penetration efficiency of the laser is extremely low. Therefore, the intensity of the exposure of the cancer cells through the PTT to the cancer tissue is also limited.
  • HSP heat shock protein
  • the photothermal processing can increase the temperature of the cells to 35 to 100 DEG C, preferably to 40 to 65 DEG C. In this temperature range, the expression of HSP of cells is maximized and the immunogenicity And can be maximized.
  • the cell may be any one selected from the group consisting of a cancer cell, a pathogen-infected cell, an immune cell loaded with an antigen, and an immunogenic cell.
  • the photothermal processing proceeds in vitro.
  • the vaccine composition of the present invention may comprise a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a pharmaceutically acceptable carrier refers to any component suitable for delivering an antigenic material to an in vivo site and includes, for example, water, saline, phosphate buffered saline, Ringer's solution, dextrose solution, serum containing solution, Hans's solution, , Oils, esters, glycols, and the like.
  • the carrier may contain suitable auxiliary ingredients and preservatives to enhance chemical stability and isotonicity and may include a stabilizer such as trehalose, glycine, sorbitol, lactose or monosodium glutamate (MSG) to effect a temperature change or lyophilization
  • a stabilizer such as trehalose, glycine, sorbitol, lactose or monosodium glutamate (MSG) to effect a temperature change or lyophilization
  • the vaccine composition can be protected against.
  • the vaccine composition of the present invention may comprise a suspending liquid such as sterile water or saline (preferably buffered saline).
  • the vaccine composition of the present invention may contain an amount of any adjuvant sufficient to enhance the immune response to the immunogen.
  • Suitable adjuvants are described in the literature, Takahashi et al. (SAF-1), muramyl peptides, saponin derivatives, mycobacterial cell wall preparations, monophosphates, and the like, which are described in Nature 344: 873-875 (1990) But are not limited to, a polyol lipid A, a micolic acid derivative, a nonionic block copolymer surfactant, Quil A, cholera toxin B subunits, polyphosphazene and derivatives, and immunostimulatory complexes (ISCOMs).
  • the immunologically effective amount of an immunogen should be determined empirically, and factors considered in this case include immunogenicity, route of administration and the number of immunized administrations administered.
  • Cell lysates which are antigenic substances in the vaccine composition of the present invention, may be present at various concentrations in the compositions of the present invention, but typically the antigenic material is included at a concentration necessary to induce proper level of antibody formation in vivo .
  • the administration of the vaccine composition can be carried out in a conventional manner via intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, intraperitoneal, intrasternal, percutaneous, nasal, inhalation, topical, rectal, In method.
  • the present invention provides an immunotherapeutic composition comprising a photothermal-treated cell lysate as an active ingredient.
  • the photothermal treatment was performed in the group consisting of IndoCyanine Green, Gold nanorod, Gold nanosphere and Carbon Chitosan covered CuS as a light absorber
  • the present invention is not limited to the material which can be used as the light absorber.
  • the photothermal processing may irradiate laser of any one wavelength selected from the group consisting of 360-430 nm, 480-680 nm, 630-670 nm, 700-2500 nm and 780-850 nm, Do not.
  • the photothermal treatment may also be a laser irradiation with an intensity of 0.5 W / cm 2 to 20 W / cm 2 , and preferably a laser irradiation with an intensity of 2 W / cm 2 to 4 W / cm 2 And it is more preferable to irradiate the laser with an intensity of 4 W / cm 2.
  • the intensity of the laser since the laser directly shoots the living body, the intensity of the laser is limited to reduce the side effect caused by the light. And the skin penetration efficiency of the laser is extremely low. Therefore, the intensity of the exposure of the cancer cells through the PTT to the cancer tissue is also limited.
  • HSP heat shock protein
  • the photothermal processing can increase the temperature of the cells to 35 to 100 ° C, preferably to 40 to 65 ° C. In this temperature range, the expression of HSP is maximized and the immunogenicity is also maximized It is preferable.
  • the cell may be any one selected from the group consisting of a cancer cell, a pathogen-infected cell, an immune cell loaded with an antigen, and an immunogenic cell.
  • the photothermal processing proceeds in vitro.
  • the immunotherapeutic composition may be administered orally in any form selected from the group consisting of injections, granules, powders, tablets, pills, capsules, suppositories, gels, suspensions, emulsions, One formulation can be used.
  • the immunotherapeutic composition is administered in combination with suitable carriers, excipients, disintegrants, sweeteners, coatings, swelling agents, lubricants, lubricants, flavors, antioxidants, buffers, One or more additives selected from the group consisting of a bacteriostatic agent, a diluent, a dispersant, a surfactant, a binder and a lubricant.
  • carriers, excipients and diluents include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methylcellulose, Cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil.
  • Solid formulations for oral administration may be in the form of tablets, pills, powders, granules, capsules These solid preparations can be prepared by mixing at least one excipient, for example, starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, gelatin, etc., into the composition. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc may also be used. Examples of the liquid preparation for oral use include suspensions, solutions, emulsions, syrups and the like, and various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives and the like may be included in addition to water and liquid paraffin which are commonly used simple diluents.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, suppositories, and the like.
  • the suspending agent include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like.
  • As the suppository base witepsol, macrogol, tween 61, cacao paper, laurin, glycerogelatin and the like can be used.
  • the immunotherapeutic composition may be administered orally, intraarterally, intraperitoneally, intramuscularly, intraarterally, intraperitoneally, intrasternally, transdermally, nasally, inhaled, topically, rectally, Subcutaneous or intradermal route.
  • the present invention provides a method of increasing the immunogenicity of a cell, comprising the step of photo-thermally treating cells in vitro.
  • the present invention provides a method for increasing the expression of Heat Shock Protein (HSP) in a cell, comprising the step of photo-thermally treating cells in vitro.
  • HSP Heat Shock Protein
  • the HSP may be selected from the group consisting of HSP10, HSP27, HSP47, HSP56, HSP60, HSP70, HSP90 and HSP110, but is not limited thereto.
  • the photothermal treatment is carried out by using carbon nanotubes (Carbon Chitosan covered) coated with indo cyanine green, gold nanorod, gold nanosphere and copper sulfide CuS).
  • carbon nanotubes Carbon Chitosan covered
  • indo cyanine green, gold nanorod, gold nanosphere and copper sulfide CuS the material is not limited to a material that can be used as a light absorber.
  • the photothermal processing may irradiate laser of any one wavelength selected from the group consisting of 360-430 nm, 480-680 nm, 630-670 nm, 700-2500 nm and 780-850 nm, Do not.
  • the photothermal treatment may also be a laser irradiation with an intensity of 0.5 W / cm 2 to 20 W / cm 2 , and preferably a laser irradiation with an intensity of 2 W / cm 2 to 4 W / cm 2 And it is more preferable to irradiate the laser with an intensity of 4 W / cm 2.
  • the intensity of the laser since the laser directly shoots the living body, the intensity of the laser is limited to reduce the side effect caused by the light. And the skin penetration efficiency of the laser is extremely low. Therefore, the intensity of the exposure of the cancer cells through the PTT to the cancer tissue is also limited.
  • HSP heat shock protein
  • the photothermal processing can increase the temperature of the cells to 35 to 100 DEG C, preferably to 40 to 65 DEG C, so that the expression and immunogenicity of HSP can be maximized Therefore, it is preferable.
  • the cell may be any one selected from the group consisting of a cancer cell, a pathogen-infected cell, an immune cell loaded with an antigen, and an immunogenic cell.
  • ICG indocyanine green
  • ICG which is a substance used ex vivo and in clinical practice, was absorbed into CT-26-HER2 / neu cell line to measure the temperature which can be considered as the efficiency of photothermal treatment.
  • the cells were then washed with warm PBS and eluted with 50 ⁇ l of fresh DMEM containing 10% heat-inactivated fetal bovine serum, penicillin and streptomycin and G418 medium. Thereafter, the samples were irradiated with laser power of 4 W / cm 2 , 2 W / cm 2 , and 1 W / cm 2 , respectively, in succession from 100 to 500 s, and recovery time was 1 hour. It is important that all samples are irradiated with a laser fiber at a constant height.
  • HSP heat shock protein
  • PTT was co-incubated with CT-26-HER2 / neu cells and ICG in a 96-well plate 24 hours prior to the procedure described in Example 1, and irradiated for 300 s for each intensity (W / cm 2 ) Respectively.
  • Fix / Perm staining was performed after 1 hour of HSP recovery time.
  • the fix / perm kit was used to fix / filter according to the protocol of the product, and then to PE-labeled anti-HSP70 antibody (Santacruz) for 1 hour. After staining, FACS software).
  • HSP70 expression was observed at 100 ug / ml of ICG treatment regardless of laser output (FIG. 2 (a)), and 1 W / cm 2 and 2 W / cm 2 Showed low levels of HSPs induction but induced relatively high levels of HSPs (Figure 2 (b)) at 4 W / cm < 2 > than cells with or without heat treatment.
  • optimal HSP70 expression was induced at 41 ° C, but its level was relatively lower than that of PTT, and a higher level of HSP70 could not be induced even at a higher temperature 2 (c)).
  • HSP27 and HSP90 were measured in cancer cells after photothermal treatment by ICG concentration and laser intensity, respectively, in order to confirm that the expression of other HSPs which contribute to immunogenicity in addition to HSP70 can be induced by in vitro photothermal treatment. More specifically, CT-26-HER2 / neu cells and indocyanine green were co-cultured in a 96-well plate 24 hours before the PTt treatment in the same manner as in Example 2 and irradiated with each output (W) Respectively. Fix / firm dyeing was performed after HSPs recovery time for 1 hour after PTt treatment. The fix / perm staining was fixed / fixed according to the protocol of the product using the Fix / Perm kit. Afterwards, FITC-labeled anti-HSP27 (ENZO) and PE-labeled anti-HSP90 (ENZO) And finally analyzed using FACS (CELL Quest software).
  • a dendritic cell (DC) vaccine using cancer cell lysate was prepared and injected into mice to see if the immunogenicity of PTT cancer cells was increased.
  • DCs dendritic cells
  • GM-CSG medium 20 ng / ml
  • CT-26-HER2 / neu cells and ICG were co-cultured and treated with PTt for one hour to provide HSPs recovery time.
  • the cells were then collected in an ep tube and subjected to 5 cycles of freezing and thawing for 15 minutes each in liquid nitrogen and 37 ° C water bath. After freezing and thawing, the supernatant was taken by centrifugation (12000 rpm, 10 min, 4 ° C). The supernatant was then incubated with DC cultured as described above for one day.
  • the control DC vaccine was seeded with the same amount of cells and then the cells were taken to perform water bath warming. After 5 cycles of freezing and thawing, the supernatant was incubated with DC for one day.
  • the cancer cell lysate vaccine prepared by the above method was immunized by subcutaneous injection into a naive mouse (balb / c, Orient). Two weeks later, another na ⁇ ve mouse was sacrificed to obtain spleen cells to obtain spleen cells. Subsequently, the spleen cells are divided into precisely half and divided into peptide non-pulsed group and pulsed group. At this time, the peptide-pulsed group was treated with p63 peptide (CTL epitope of Her-2 / neu cancer antigen) for 90 minutes. After 90 minutes, CFSE labeling was performed.
  • CTL epitope of Her-2 / neu cancer antigen p63 peptide
  • the peptide pulse group was labeled with a high dose and the non-pulse group was labeled with a low dose.
  • Each labeled cell was then injected intravenously at 1 x 10 7 / mice into mice immunized two weeks prior. Twenty-four hours later, the immunized mice were sacrificed and the spleen was excised to obtain spleen cells.
  • HER2 peptide-specific CTL activities were analyzed using FACS equipment using some of them.
  • the DC vaccine using the photothermalized cancer cell lysate effectively induced the activation of the cytotoxic T-cell response, and this level was significantly higher than that of the DC vaccine using the conventional heat cancer cell lysate.
  • mice were injected with CT-26-HER2 / neu cells at 3 ⁇ 10 5 / mice by subcutaneous injection, and the cancer cell melts-pulses using PTt prepared by the method described in Example 4 one day later DC vaccine and heat-treated cancer cell lysate-pulsed DC vaccine were subcutaneously injected. After that, tumor growth of mice in each group was compared and analyzed at intervals of two days.
  • tumor growth was remarkably suppressed in the DC vaccination group treated with 100 g / ml of ICG and laser irradiation at 4 W / cm < 2 > 100 ⁇ g / ml ICG and 2 W / cm 2 treatment groups.
  • the vaccine composition according to the present invention induces an excellent anti-cancer effect as compared with the prior art.

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Abstract

본 발명은 광열 처리된 세포 용해물을 이용한 백신 조성물 및 면역치료제 조성물에 관한 것으로, 체외(ex vivo)에서 광열요법(PTT)를 처리(PTt)한 세포 용해물은 면역원성 증강을 유도하는 HSP의 발현이 극대화되어, 생체에서 암 특이적인 면역 반응을 확립할 수 있고, 체내 레이저 조사 시의 적용 한계를 극복할 수 있으므로, 본 발명에 따른 광열 처리된 세포 용해물은 백신 조성물 또는 면역치료제 조성물로 유용하게 활용될 수 있다.

Description

광열 처리된 세포 용해물을 유효성분으로 함유하는 백신 또는 면역치료제 조성물
본 발명은 광열 처리된 세포 용해물을 유효성분으로 함유하는 백신 또는 면역치료제 조성물에 관한 것이다.
일반적으로 암은 세포의 유전자에 변이가 생겨 세포가 손상을 받는 경우 비정상적으로 성숙하고 과다하게 증식하게 됨에 따라 발생하는 질환이다. 이러한 암세포는 신체 내 조직 및 장기에 침투해 기능을 약화시키고 다른 장기로 전이되기도 한다. 또한, 인종, 성별, 나이, 식이 습관에 따라 다양한 종류의 암이 발생할 수 있다.
암의 치료는 장기에 고형화된 암 조직을 제거하거나 암세포를 죽이는 적극적인 치료요법과 암세포의 진행을 지연시켜 부작용을 최소화하는 완화요법으로 구분된다. 3대 암 치료법으로서 수술, 화학(항암)요법, 방사선 요법을 통해 임상에서 의미 있는 항암 효과를 유도하고 있으나, 기존 방법으로는 암환자의 주요 사망원인인 암 전이는 물론 재발하는 암을 치료하기는 역부족이다. 따라서 새로운 개념의 암을 치료하는 전략이 다양하게 연구되고 있고, 그 중의 하나로서 빛을 이용한 광열 치료(Photothermal therapy; PTT)가 많은 연구자들의 주목을 받고 있다.
PTT란 특정파장의 레이저를 조사하면 광흡수제가 빛을 흡수하고 흡수된 빛이 열에너지로 전환되어 세포 내에서 증가하는 열에 의해 암을 치료하는 치료법이다. 투입시킨 금 나노입자와 같은 광흡수제는 그들의 외부에 있는 자유전자들에 의하여 빛을 흡수하고, 이때 빛을 흡수한 자유전자들의 운동에너지에 의하여 열에너지가 생성되는 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance) 효과를 나타내는데, 이러한 열에너지에 의하여 암세포가 제거된다. PTT는 기존 치료방법들과 비교하였을 때, 암 특이성이 있으므로 부작용이 적고, 최소한의 흉터로 암 치료가 가능하며, 암의 성장을 억제하는 측면에서의 효과는 방사선요법이나 화학요법과 같은 기존 치료법 대비 강력한 효과를 보여주고 있다는 장점이 있다.
이에 반하여, 광역학 치료(photodynamic therapy; PDT)란, 빛에 의하여 단일한 산소(singlet oxygen)를 형성할 수 있는 광흡수제(또는 광감작제라고 표현)를 활용하여 암세포를 제거하는 기술이다. 암세포에 축적된 광흡수제는 빛에 의하여 화학 반응을 일으켜 단일한 산소(singlet oxygen) 및 반응성이 높은 자유 라디칼을 발생시키고, 이들은 화학적으로 세포의 성분을 파괴하여 세포 사멸을 유도할 수 있다. 따라서 PTT와 PDT는 둘 다 동일하게 광흡수제와 빛을 사용하는 구성이지만, 사용되는 광흡수제의 종류 및 작용 기전이 상이한 기술이며, 최근에는 이를 병행하면 상승효과를 유도할 수 있음이 보고된 바 있다.
전술한 바와 같이, PTT가 유도하는 신개념의 항암 효과에도 불구하고, 가장 투과율이 좋은 파장의 빛이 2~3 mm 정도밖에 투과하지 못할 정도로, 빛이 조직을 관통하는 깊이가 제한적이고, 이의 작용이 1차 종양의 치료에는 효과적이지만 멀리 떨어진 전이된 암 치료와 재발하는 암 치료에는 제한적이라는 한계가 있다. 따라서, 더욱 효과적인 항암 요법의 개발이 필요한 실정이다.
본 발명의 목적은 효과적으로 암을 억제할 수 있는 백신 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 효과적으로 암을 억제할 수 있는 면역치료제 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 효과적으로 세포의 면역원성을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 효과적으로 세포의 열충격단백질의 발현을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 광열 처리된 세포 용해물을 유효성분으로 함유하는 백신 조성물을 제공한다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 광열 처리된 세포 용해물을 유효성분으로 함유하는 면역치료제 조성물을 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 체외에서, 세포에 광열 처리하는 단계를 포함하는, 세포의 면역원성을 증가시키는 방법을 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 체외에서, 세포에 광열 처리하는 단계를 포함하는, 세포의 열충격단백질(Heat Shock Protein; HSP)의 발현을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 체외(ex vivo)에서의 광열요법(PTT)을 이용하여 세포에 면역원성 증강을 유도하는 열 충격 단백질(HSP)의 발현을 극대화하고, 체내 레이저 조사 시의 노출 효율 및 조직 손상 등의 한계를 극복하였으며, 기존의 암 백신 대비 보다 효율적으로 암 특이적인 면역 반응을 확립할 수 있으므로, 본 발명에 따른 광열 처리된 세포 용해물은 백신 조성물 또는 면역치료제 조성물로 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 체외 PTT 처리 및 온열(heating) 처리에 따른 온도 증가량 및 세포 생존율을 비교한 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 체외 PTT 처리 및 온열 처리에 따른 HSP70의 발현량을 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 체외 PTT 처리 후 암세포에서 HSP27(왼쪽) 및 HSP90(오른쪽)의 발현량을 측정한 결과이다(100 ug/ml - 4 W/cm2, 굵은실선; 20 ug/ml - 4 W/cm2, 실선; 4 ug/ml - 4 W/cm2, 띄어진 점선; 워터 배쓰 열처리, 촘촘한 점선).
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 체외 PTT 처리된 암 세포 용해물을 백신화하여 마우스에 면역 반응을 일으킨 후, in vivo 에서 암 항원 특이적인 용해도를 측정한 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 체외 PTT 처리된 CT-26-HER2/neu 세포 용해물을 이용한 수지상 세포 백신의 항암 효과를 in vivo에서 확인한 결과이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 광열 처리된 세포 용해물을 유효성분으로 함유하는 백신 조성물을 제공한다.
이때, 상기 광열 처리는 광흡수제로서 인도시아닌 그린(IndoCyanine Green), 금 나노로드(Gold nanorod), 금 나노스피어(Gold nanosphere) 및 황화구리로 덮인 카본 키토산(Carbon Chitosan covered CuS)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 사용하여 이루어질 수 있으나, 광흡수제로 사용될 수 있는 물질이면 이에 제한되지는 않는다.
상기 광열 처리는 360-430 nm, 480-680 nm, 630-670 nm, 700-2500 nm 및 780-850 nm로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 파장대의 레이저를 조사할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 상기 광열 처리는 0.5 W/cm2 내지 20 W/cm2의 세기로 레이저를 조사하는 것일 수 있고, 바람직하게는, 2 W/cm2 내지 4 W/cm2의 세기로 레이저를 조사하는 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 4 W/cm2의 세기로 레이저를 조사하는 것일 수 있는 바, 종래의 광열 치료 시에는 생체에 레이저를 직접 쏘게 되므로 빛에 의한 부작용을 줄이기 위해 레이저의 세기에 한계가 있었으며, 또한 레이저의 피부 투과 효율은 극히 낮으므로, 실제 암 조직으로의 PTT를 통하여 암세포가 노출되는 레이저의 세기 또한 제한적이었다. 반면, 본 발명에 따르면 체외에서 열 충격 단백질(HSP)의 발현을 극대화하기 위해 광열 요법을 활용하는 바, 상기와 같은 높은 세기의 레이저를 직접 암세포에 조사할 수 있으며, 이에 따라 면역원성을 향상시키는 HSP의 발현을 극대화하여 면역항암 효과를 나타낼 수 있다.
또한, 상기 광열 처리는 세포의 온도를 35℃ 내지 100℃로 증가시킬 수 있고, 바람직하게는 40℃ 내지 65℃로 증가시킬 수 있는 바, 이러한 온도 범위에서 세포의 HSP의 발현이 극대화되어 면역원성 또한 극대화될 수 있으므로 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 세포는 암세포, 병원체 감염 세포, 항원을 적재한 면역 세포 및 면역원성이 있는 세포로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
또한, 상기 광열 처리는 체외에서 진행되는 것이 바람직하다.
본 발명의 백신 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 항원 물질을 생체 내 부위에 전달하는데 적합한 임의의 성분을 의미하며, 예를 들어, 물, 식염수, 인산염 완충 식염수, 링거 용액, 덱스트로스 용액, 혈청 함유 용액, 한스 용액, 기타 수용성의 생리학적 평형 용액, 오일, 에스테르 및 글리콜 등이 포함되나, 이에 한정되지 않는다.
상기 담체는 화학적 안정성 및 등장성을 증진시키기 위해 적합한 보조성분과 보존제를 포함할 수 있으며, 트레할로스, 글라이신, 솔비톨, 락토오스 또는 모노소듐 글루타메이트(MSG)와 같은 안정화제를 포함시켜 온도 변화 또는 동결건조에 대해 백신 조성물을 보호할 수 있다. 본 발명의 백신 조성물은 멸균수 또는 식염수(바람직하게는 완충된 식염수)와 같은 현탁 액체를 포함할 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 면역원에 대한 면역반응을 향상시키기에 충분한 양의 임의의 애쥬번트(adjuvant)를 함유할 수 있다. 적합한 애쥬번트는 문헌 Takahashi et al. (1990) Nature 344:873-875에 기술되어 있으며, 예컨대, 알루미늄염(알루미늄 포스페이트 또는 알루미늄 히드록시드), 스쿠알렌 혼합물(SAF-1), 무라밀 펩티드, 사포닌유도체, 마이코 박테리아 세포벽 제조물, 모노포스포릴 지질A, 미콜산 유도체, 비이온성 블록 공중합체 계면활성제, Quil A, 콜레라 독소 B 서브유닛, 폴리포스파젠 및 유도체, 및 면역자극 복합체(ISCOMs)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
다른 모든 백신 조성물과 마찬가지로, 면역원의 면역학적 유효량은 경험적으로 결정되어야 하며, 이 경우 고려될 수 있는 인자는 면역원성, 투여 경로 및 투여되는 면역 투여 회수를 들 수 있다.
본 발명의 백신 조성물 중의 항원물질인 세포 용해물은 본 발명의 조성물 내에서 다양한 농도로 존재할 수 있으나, 통상적으로, 상기 항원물질이 생체 내에서 적절한 수준의 항체 형성을 유도하기에 필요한 농도로 포함된다.
상기 백신 조성물의 투여는 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내, 피하 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 이루어질 수 있다.
또한, 본 발명은 광열 처리된 세포 용해물을 유효성분으로 함유하는 면역치료제 조성물을 제공한다.
이때, 상기 광열 처리는 광흡수제로서 인도시아닌 그린(IndoCyanine Green), 금 나노로드(Gold nanorod), 금 나노스피어(Gold nanosphere) 및 황화구리로 덮인 카본 키토산(Carbon Chitosan covered CuS)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 사용하여 이루어질 수 있으나, 광흡수제로 사용될 수 있는 물질이면 이에 제한되지는 않는다.
상기 광열 처리는 360-430 nm, 480-680 nm, 630-670 nm, 700-2500 nm 및 780-850 nm로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 파장대의 레이저를 조사할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 상기 광열 처리는 0.5 W/cm2 내지 20 W/cm2의 세기로 레이저를 조사하는 것일 수 있고, 바람직하게는, 2 W/cm2 내지 4 W/cm2의 세기로 레이저를 조사하는 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 4 W/cm2의 세기로 레이저를 조사하는 것일 수 있는 바, 종래의 광열 치료 시에는 생체에 레이저를 직접 쏘게 되므로 빛에 의한 부작용을 줄이기 위해 레이저의 세기에 한계가 있었으며, 또한 레이저의 피부 투과 효율은 극히 낮으므로, 실제 암 조직으로의 PTT를 통하여 암세포가 노출되는 레이저의 세기 또한 제한적이었다. 반면, 본 발명에 따르면 체외에서 열 충격 단백질(HSP)의 발현을 극대화하기 위해 광열 요법을 활용하는 바, 상기와 같은 높은 세기의 레이저를 직접 암세포에 조사할 수 있으며, 이에 따라 면역원성을 향상시키는 HSP의 발현을 극대화하여 면역항암 효과를 나타낼 수 있다.
또한, 상기 광열 처리는 세포의 온도를 35℃ 내지 100℃로 증가시킬 수 있고, 바람직하게는 40℃ 내지 65℃로 증가시킬 수 있는 바, 이러한 온도 범위에서 HSP의 발현이 극대화되어 면역원성 또한 극대화될 수 있으므로 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 세포는 암세포, 병원체 감염 세포, 항원을 적재한 면역 세포 및 면역원성이 있는 세포로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
또한, 상기 광열 처리는 체외에서 진행되는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 면역치료제 조성물은 통상적인 방법에 따라 주사제, 과립제, 산제, 정제, 환제, 캡슐제, 좌제, 겔, 현탁제, 유제, 점적제 또는 액제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형을 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서, 상기 면역치료제 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면 상기 면역치료제 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내, 피하 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 이루어질 수 있다.
더불어, 본 발명은 체외에서, 세포에 광열 처리하는 단계를 포함하는, 세포의 면역원성을 증가시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 체외에서, 세포에 광열 처리하는 단계를 포함하는, 세포의 열충격단백질(Heat Shock Protein; HSP)의 발현을 증가시키는 방법을 제공한다.
이때, 상기 HSP는 HSP10, HSP27, HSP47, HSP56, HSP60, HSP70, HSP90 및 HSP110으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 광열 처리는 광흡수제로서 인도시아닌 그린(IndoCyanine Green), 금 나노로드(Gold nanorod), 금 나노스피어(Gold nanosphere) 및 황화구리로 덮인 카본 키토산(Carbon Chitosan covered CuS)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 사용하여 이루어질 수 있으나, 광흡수제로 사용될 수 있는 물질이면 이에 제한되지는 않는다.
상기 광열 처리는 360-430 nm, 480-680 nm, 630-670 nm, 700-2500 nm 및 780-850 nm로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 파장대의 레이저를 조사할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 상기 광열 처리는 0.5 W/cm2 내지 20 W/cm2의 세기로 레이저를 조사하는 것일 수 있고, 바람직하게는, 2 W/cm2 내지 4 W/cm2의 세기로 레이저를 조사하는 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 4 W/cm2의 세기로 레이저를 조사하는 것일 수 있는 바, 종래의 광열 치료 시에는 생체에 레이저를 직접 쏘게 되므로 빛에 의한 부작용을 줄이기 위해 레이저의 세기에 한계가 있었으며, 또한 레이저의 피부 투과 효율은 극히 낮으므로, 실제 암 조직으로의 PTT를 통하여 암세포가 노출되는 레이저의 세기 또한 제한적이었다. 반면, 본 발명에 따르면 체외에서 열 충격 단백질(HSP)의 발현을 극대화하기 위해 광열 요법을 활용하는 바, 상기와 같은 높은 세기의 레이저를 직접 암세포에 조사할 수 있으며, 이에 따라 면역원성을 향상시키는 HSP의 발현을 극대화할 수 있다.
또한, 상기 광열 처리는 세포의 온도를 35℃ 내지 100℃로 증가시킬 수 있고, 바람직하게는 40℃ 내지 65℃로 증가시킬 수 있는 바, 이러한 온도 범위에서 HSP의 발현 및 면역원성이 극대화될 수 있으므로 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 세포는 암세포, 병원체 감염 세포, 항원을 적재한 면역 세포 및 면역원성이 있는 세포로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이며 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐이므로 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 인도시아닌 그린을 이용한 PTT 처리 후 온도 및 생존율 확인
PTT는 빛을 이용한 치료방법이기 때문에 사용하는 빛의 종류가 중요한데, 현재 가장 일반적으로 활용되는 것은 808 nm 파장 대의 레이저로 효율적으로 높은 온도를 유도할 수 있음이 알려져 있다. 본 발명에서는 이 파장의 빛을 흡수할 수 있는 광흡수제로서 임상에서도 활용될 정도로 안전성이 입증된 인도시아닌 그린(indocyanine green; ICG)을 활용하였으며, 먼저 ICG가 암세포주인 CT-26-HER2/neu에 효과적으로 흡수되어 레이저 조사 후 열을 발생시킬 수 있는지 확인하였다.
구체적으로, ex vivo 및 실제 임상에서 사용하고 있는 물질인 ICG(MPbio)를 CT-26-HER2/neu 세포주에 흡수시켜 실제 광열치료의 효율이라 할 수 있는 온도를 측정하였다. 우선 10 mg/ml의 농도의 ICG를 각 100 ug/ml, 20 ug/ml, 4 ug/ml로 만들어, 24시간 전에 5 X 105으로 96 웰에 시딩해놓은 CT-26-HER2/neu 세포와 1시간 30분 인큐베이터에서 공배양시켰다. 이후 따뜻한 PBS로 세척해주고 10% 열-불활성화 태아우혈청, 페니실린과 스트렙토마이신 및 G418 배지를 포함한 신선한 DMEM 50 ul로 풀어주었다. 이후, 각각 4 W/cm2, 2 W/cm2, 1 W/cm2의 세기의 레이저로 100 s o 내지 500 s까지 차례로 조사하였고 1시간 동안 회복시간을 가졌다. 이때 모든 샘플을 일정한 높이에서 레이저 피버(laser fiber)로 조사해주는 것이 중요하다.
워터 배스 온열(water bath heating) 시에는 PTT와 같은 동량의 세포를 하루 전에 96 웰 플레이트에 시딩하고 다음날 세포를 적은 양의 배지로 재현탁(resuspension)시켜서 가열되고 있는 워터 배스에서 온열 처리하고 1시간 동안 회복시켰다.
온도의 변화는 레이저 조사 및 워터 배스 온열 이후 즉각 측정하였으며, 세포 생존율은 1시간 회복 시간을 두고 측정을 진행하였다.
PTT 및 워터 배스 온열 처리한 세포를 96 웰에 넣고 WST 용액(EZ-Cytox, Dogen)을 넣어주어 시간에 따라 시약의 색의 변화를 관찰하여 적절한 수준의 색으로 변했을 때 샘플의 O.D(450 nm) 값을 XFlour 소프트웨어를 이용하여 측정함으로써 각 암세포의 생존율을 확인하였다.
상기와 같은 방법으로, ICG 각 농도별 암세포주의 온도의 증가(도 1(a)), 생존율의 감소(도 1(b))를 확인한 결과, 100 ug/ml의 ICG를 적용한 후 808 nm 레이저를 4 W/cm2로 조사하면 65℃까지 증가하며, 생존율은 10% 미만이 되는 것으로 확인되었다. 기존의 기술로서 워터 배스(water bath)에서 온열을 통하여 암세포의 면역원성을 증가시키는 방법이 있었으며, 65℃ 온수에서 1시간 동안 암세포를 온열 처리하면 약 60℃까지 온도가 증가하며 생존율은 감소하는 것을 확인하였다(도 1(c)).
<실시예 2> HSP 단백질 유도 발현량 확인
기존에도 워터 배스에서 온열을 통하여 암세포의 면역원성을 증가시키는 전략이 사용되어 왔다. 온열 처리 시 암세포에서 열 충격 단백질(heat shock protein; HSP)의 발현이 증가되는데, 샤페론의 일종인 HSP은 열적 스트레스에 대한 세포의 자가 보호뿐만 아니라 암 항원과 결합하여 암 항원의 면역원성을 증강시키는 작용을 하는 것으로도 알려져있다. 구체적으로, 수지상 세포(DC)에 종양을 흡수시켜서 종양의 항원들이 DC 내부에서 처리되는 과정에서 HSP과 함께 복합체화가 일어나며, 이를 암 백신으로 활용하는 경우 좀 더 강력한 항원 특이적인 면역 반응의 활성화가 유도될 수 있다. 또한 면역원성 증가에 주요한 역할을 하는 HSP은 HSP70이라는 것이 보고된 바 있다.
이에, PTT를 하기 24시간 전에 96 웰 플레이트에 상기 실시예 1에서 수행한 방법대로 CT-26-HER2/neu 세포와 ICG와 공배양하여 각 세기(W/cm2) 별로 300 s 동안 레이저를 조사하였다. 이후 1시간동안 HSPs 회복시간을 거친 후 픽스/펌(Fix/Perm) 염색을 수행하였다. 픽스/펌 같은 경우는 Fix/Perm kit를 사용하여 제품의 프로토콜에 따라 픽스/펌 과정을 거친 후 PE-표지 항-HSP70 항체(Santacruz)를 이용하여 1시간 동안 수행하였으며, 염색 후 FACS(CELL Quest software)를 이용하여 분석하였다.
그 결과, ICG 100 ug/ml 처리 시에 레이저 출력과 상관없이 현저한 HSP70 발현의 증가가 나타났으며(도 2(a)), 20 ug/ml에서도 1 W/cm2, 2 W/cm2 세기에서는 낮은 수준의 HSPs 유도를 나타냈지만 4 W/cm2에서 세포만 있거나 온열처리를 수행한 그룹보다 상대적으로 높은 수준의 HSPs을 유도하였다(도 2(b)). 기존의 워터 배스 온열 기술의 경우, 41℃에서 최적의 HSP70 발현이 유도되었으나, PTT에 비하여 그 수준이 상대적으로 낮았으며, 더 높은 온도에서 온열하여도 더 높은 수준의 HSP70이 유도되지는 못하였다(도 2(c)).
<실시예 3> HSP27 및 HSP90의 발현 증진 효과 확인
HSP70 이외에도 면역원성에 기여할 수 있는 다른 HSP의 발현을 체외 광열 처리로 유도할 수 있는지 확인하기 위해, 각 ICG 농도별 및 레이저 세기 별 광열 처리 후, 암세포에서 HSP27 및 HSP90의 발현 수준을 측정하였다. 보다 구체적으로, PTt 처리하기 24시간 전에 96 웰 플레이트에 실시예 2와 같은 방법으로 CT-26-HER2/neu 세포와 인도시아닌그린을 공배양하여 각 아웃풋(W)과 최적 시간으로 레이저를 조사하였다. PTt 처리 후 1시간 동안 HSPs 회복 시간을 거친 후 픽스/펌 염색을 수행하였다. 픽스/펌 염색은 Fix/Perm kit를 사용하여 제품의 프로토콜에 따라 픽스/펌 과정을 거쳤고, 이후 FITC-표지된 항-HSP27(ENZO), PE-표지된 항-HSP90(ENZO)를 이용하여 1시간 동안 염색하였으며, 마지막으로 FACS(CELL Quest software)를 이용하여 분석하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, HSP70과 유사하게, HSP27(도 3 왼쪽) 및 HSP90(도 3 오른쪽) 모두 ICG 농도와 레이저의 세기에 비례하여 발현이 유도됨을 확인할 수 있었다. 따라서, 이러한 결과로부터 체외 광열 처리는 다양한 HSP의 발현을 효율적으로 증가시켜 면역원성을 향상시키는 데에 기여할 수 있음을 알 수 있다.
<실시예 4> 광열처리된 세포 용해물의 면역원성 확인
(1) 광열처리된 암 세포 용해물을 포함하는 수지상 세포(DC) 백신 제조
실제 체외 광열 처리된(PTt) 암세포의 면역원성이 증가되는지 살펴보기 위하여 암세포 용해물을 이용한 수지상 세포(dendritic cell; DC) 백신을 제작하여 마우스에 투여하였다.
구체적으로, 수지상 세포(DC)는 마우스의 골수에서 얻은 골수 세포를 배지를 포함하는 GM-CSG(20 ng/ml)에서 6일 동안 공배양하여 얻었다. 이 과정 중 이전과 동일하게 CT-26-HER2/neu 세포와 ICG를 공배양하고 PTt를 행하고 1시간 HSPs 회복 시간을 제공하였다. 이후 세포를 ep 튜브에 모으고 액체질소와 37℃ 워터 배스에서 각 15분씩 5 사이클의 얼림 & 녹임(Freezing & Thawing) 과정을 수행하였다. Freezing & Thawing 하고 난 후에 원심분리(12000 rpm, 10 분, 4℃)를 하여 상등액을 취하여주었다. 이후 상등액을 전술한 바와 같이 배양한 DC와 하루 동안 인큐베이션 시켜주었다. 대조군 DC 백신은 동량으로 세포를 시딩한 후 세포를 취해 워터 배스 온열을 수행하였다. 이후 같은 방법으로 5 사이클의 Freezing & Thawing 과정을 수행하고 상등액을 취하여 배양한 DC와 하루 동안 인큐베이션시켰다.
(2) 백신의 면역원성 확인
위의 방법으로 만들어진 DC에 적재된 암세포 용해물 백신을 나이브 마우스(balb/c, Orient)에 피하 주입을 통해 면역화시켰고, 2주 후 또 다른 나이브 마우스를 희생시켜 비장을 축출하여 지라세포를 얻었다. 이후 상기 지라세포를 정확하게 절반으로 나누어 펩타이드 비펄스된 그룹과 펄스된 그룹으로 나누어 준다. 이 때 펩타이드 펄스된 그룹은 p63 펩타이드(Her-2/neu 암 항원의 CTL 에피톱)를 90분 동안 처리해주었다. 90분 후 CFSE 표지를 하는데, 이때에도 고용량과 저용량으로 구분하여 펩타이드 펄스 그룹은 고용량으로, 비펄스 그룹은 저용량으로 각각 표지하였다. 이후, 각 표지된 세포를 2주 전 면역화시킨 마우스들에 정맥 주사로 1 x 107/mice 만큼 주입하였다. 24시간 후 면역화된 마우스들을 희생시켜 비장을 축출하여 지라세포를 얻고 그 중의 일부를 사용하여 FACS 장비를 통하여 HER2 펩타이드 특이적 CTL 활성을 분석하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, ICG 100ug/ml로 처리 후 4 W/cm2의 레이저에 노출된 암세포 용해물을 이용한 DC 백신에서 90% 이상의 항원 특이적인 표적 세포 사멸이 유도되었고, PTT DC 백신(100 ug/ml, 2 W/cm2)을 면역화한 마우스에서도 80% 수준의 항원 특이적인 표적세포 사멸이 관찰되었다. 이에 반해, 온열 DC 백신을 면역화한 마우스에서는 약 30%의 특이적 용해를 유도하였다.
결과적으로, 광열 처리된 암세포 용해물을 이용한 DC 백신은 세포독성 T-세포 반응의 활성화를 효율적으로 유도하였고, 이 수준은 기존 기술인 온열 암세포 용해물을 이용한 DC 백신에 비하여 현저히 높다는 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 5> in vivo 항암 효과의 확인
마우스에 CT-26-HER2/neu 세포를 3 x 105 cells/mouse의 농도로 피하 주사하고 하루 후 각각의 조건으로 DC 백신을 면역화한 후, 본 발명에 따른 백신 조성물의 항암 효과를 확인하였다.
보다 구체적으로, 마우스에 CT-26-HER2/neu 세포를 피하 주사(Subcutaneous injection)로 3 X 105/mice 주사하고, 하루 후 실시예 4에 개시된 방법으로 제작된 PTt를 이용한 암세포 용해물-펄스 DC 백신과, 열처리 암세포 용해물-펄스 DC 백신을 피하주사 하였다. 이후 각 그룹별 마우스들의 종양 성장을 이틀 간격으로 비교 분석하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 100 μg/ml의 ICG를 흡수하고 4 W/cm2 로 레이저를 조사한 DC 백신 처리 그룹에서 현저하게 종양의 성장이 억제되었으며, 그 다음으로는 열처리 DC 백신, 100 μg/ml ICG 및 2 W/cm2 처리군 순으로 종양이 성장하는 것을 확인하였다.
결과적으로, 본 발명에 따른 백신 조성물은 기존 기술에 비하여 더욱 우수한 항암 효과를 유도함을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.

Claims (17)

  1. 광열 처리된 세포 용해물을 유효성분으로 함유하는 백신 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 광열 처리는 광흡수제로서 인도시아닌 그린(IndoCyanine Green), 금 나노로드(Gold nanorod), 금 나노스피어(Gold nanosphere) 및 황화구리로 덮인 카본 키토산(Carbon Chitosan covered CuS)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 사용하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 광열 처리는 360-430 nm, 480-680 nm, 630-670 nm, 700-2500 nm 및 780-850 nm로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 파장대의 레이저를 조사하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 광열 처리는 0.5 W/cm2 내지 20 W/cm2의 세기로 레이저를 조사하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 광열 처리는 세포의 온도를 35℃ 내지 100℃로 증가시키는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 세포는 암세포, 병원체 감염 세포, 항원을 적재한 면역 세포 및 면역원성이 있는 세포로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 광열 처리는 체외에서 진행되는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  8. 광열 처리된 세포 용해물을 유효성분으로 함유하는 면역치료제 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 광열 처리는 광흡수제로서 인도시아닌 그린(IndoCyanine Green), 금 나노로드(Gold nanorod), 금 나노스피어(Gold nanosphere) 및 황화구리로 덮인 카본 키토산(Carbon Chitosan covered CuS)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 사용하는 것을 특징으로 하는 면역치료제 조성물.
  10. 제 8 항에 있어서, 상기 광열 처리는 360-430 nm, 480-680 nm, 630-670 nm, 700-2500 nm 및 780-850 nm로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 파장대의 레이저를 조사하는 것을 특징으로 하는 면역치료제 조성물.
  11. 제 8 항에 있어서, 상기 광열 처리는 0.5 W/cm2 내지 20 W/cm2의 세기로 레이저를 조사하는 것을 특징으로 하는 면역치료제 조성물.
  12. 제 8 항에 있어서, 상기 광열 처리는 세포의 온도를 35℃ 내지 100℃로 증가시키는 것을 특징으로 하는 면역치료제 조성물.
  13. 제 8 항에 있어서, 상기 세포는 암세포, 병원체 감염 세포, 항원을 적재한 면역 세포 및 면역원성이 있는 세포로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 면역치료제 조성물.
  14. 제 8 항에 있어서, 상기 광열 처리는 체외에서 진행되는 것을 특징으로 하는 면역치료제 조성물.
  15. 체외에서, 세포에 광열 처리하는 단계를 포함하는, 세포의 면역원성을 증가시키는 방법.
  16. 체외에서, 세포에 광열 처리하는 단계를 포함하는, 세포의 열충격단백질(Heat Shock Protein; HSP)의 발현을 증가시키는 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 HSP는 HSP10, HSP27, HSP47, HSP56, HSP60, HSP70, HSP90 및 HSP110으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 세포의 열충격단백질의 발현을 증가시키는 방법.
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