KR20040094635A - 항종양 활성의 유도를 위한 종양 백신의 제조방법 및그것을 함유하고 있는 약제 조성물 - Google Patents
항종양 활성의 유도를 위한 종양 백신의 제조방법 및그것을 함유하고 있는 약제 조성물 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20040094635A KR20040094635A KR1020040030443A KR20040030443A KR20040094635A KR 20040094635 A KR20040094635 A KR 20040094635A KR 1020040030443 A KR1020040030443 A KR 1020040030443A KR 20040030443 A KR20040030443 A KR 20040030443A KR 20040094635 A KR20040094635 A KR 20040094635A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- tumor
- vaccine
- cells
- antigen
- activity
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 431
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 343
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 79
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 title abstract description 53
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title abstract description 13
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 91
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 91
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 89
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims abstract description 68
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 claims abstract description 22
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 167
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 77
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 67
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 65
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 65
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 claims description 62
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 claims description 61
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 46
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 46
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 45
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 41
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 claims description 30
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 19
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 12
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 claims description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 9
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 7
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 claims description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 claims description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 4
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 claims description 3
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 claims description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 83
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 72
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 55
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 45
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 41
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 37
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 35
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 34
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 32
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 32
- 230000005809 anti-tumor immunity Effects 0.000 description 31
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 29
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 29
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 27
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 27
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 25
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 25
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 25
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 20
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 20
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 20
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 18
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 18
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 16
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 15
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 15
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 description 14
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 14
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 13
- 201000005296 lung carcinoma Diseases 0.000 description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 13
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 13
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 12
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 12
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 12
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 11
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 11
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 11
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 11
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 11
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 11
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 10
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 10
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 10
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 9
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 9
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 9
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 8
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 8
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 8
- 230000006433 tumor necrosis factor production Effects 0.000 description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 7
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 7
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 7
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 7
- CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-M thioglycolate(1-) Chemical compound [O-]C(=O)CS CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 6
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 6
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 6
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 6
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 6
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 6
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 6
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 6
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 5
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 5
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 5
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 5
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 4
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 description 4
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 4
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 4
- 230000017188 evasion or tolerance of host immune response Effects 0.000 description 4
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 4
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 4
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 4
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 4
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 4
- 101100125027 Dictyostelium discoideum mhsp70 gene Proteins 0.000 description 3
- 101150031823 HSP70 gene Proteins 0.000 description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 3
- 101150052825 dnaK gene Proteins 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 210000005007 innate immune system Anatomy 0.000 description 3
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 3
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 3
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 3
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 3
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 3
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 230000005760 tumorsuppression Effects 0.000 description 3
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 3
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 3
- 101710170920 62 kDa protein Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100507655 Canis lupus familiaris HSPA1 gene Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 2
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- 101710204410 Scaffold protein Proteins 0.000 description 2
- 101710146343 Scaffold protein D13 Proteins 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 230000014102 antigen processing and presentation of exogenous peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 230000005907 cancer growth Effects 0.000 description 2
- 238000009566 cancer vaccine Methods 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000007012 clinical effect Effects 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 2
- 230000005965 immune activity Effects 0.000 description 2
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 2
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 2
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 2
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- -1 oral Substances 0.000 description 2
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000012134 supernatant fraction Substances 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 2
- 230000005909 tumor killing Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 239000011547 Bouin solution Substances 0.000 description 1
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100035793 CD83 antigen Human genes 0.000 description 1
- 102000006303 Chaperonin 60 Human genes 0.000 description 1
- 108010058432 Chaperonin 60 Proteins 0.000 description 1
- 101100016370 Danio rerio hsp90a.1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100285708 Dictyostelium discoideum hspD gene Proteins 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 101150089023 FASLG gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 206010019695 Hepatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101000946856 Homo sapiens CD83 antigen Proteins 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 231100000002 MTT assay Toxicity 0.000 description 1
- 238000000134 MTT assay Methods 0.000 description 1
- 230000006051 NK cell activation Effects 0.000 description 1
- 102000004503 Perforin Human genes 0.000 description 1
- 108010056995 Perforin Proteins 0.000 description 1
- KHGNFPUMBJSZSM-UHFFFAOYSA-N Perforine Natural products COC1=C2CCC(O)C(CCC(C)(C)O)(OC)C2=NC2=C1C=CO2 KHGNFPUMBJSZSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 101150066681 Rae1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100071627 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) swo1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 102100031988 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 6 Human genes 0.000 description 1
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 230000002001 anti-metastasis Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 239000000337 buffer salt Substances 0.000 description 1
- 231100000357 carcinogen Toxicity 0.000 description 1
- 239000003183 carcinogenic agent Substances 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 229940030156 cell vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000001587 cholestatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000012642 immune effector Substances 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 230000002434 immunopotentiative effect Effects 0.000 description 1
- 230000005917 in vivo anti-tumor Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000019734 interleukin-12 production Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000007914 intraventricular administration Methods 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000037841 lung tumor Diseases 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000174 oncolytic effect Effects 0.000 description 1
- 229960005030 other vaccine in atc Drugs 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229930192851 perforin Natural products 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002428 photodynamic therapy Methods 0.000 description 1
- 239000003504 photosensitizing agent Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 239000012130 whole-cell lysate Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L9/00—Disinfection, sterilisation or deodorisation of air
- A61L9/01—Deodorant compositions
- A61L9/012—Deodorant compositions characterised by being in a special form, e.g. gels, emulsions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4615—Dendritic cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
- A61K39/4622—Antigen presenting cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464476—Heat shock proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/515—Animal cells
- A61K2039/5152—Tumor cells
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Oncology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Virology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 항종양 활성의 유도를 위한 종양 백신의 제조방법, 그러한 종양 백신을 함유하고 있는 약제 조성물, 및 이를 바탕으로 종양에 대해 증진된 면역원성을 부여함으로써 궁극적으로 종양의 예방 및 치료를 행하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 종양 백신은 주로 항원제시 세포의 항원제시능을 증진시킴으로써 이후 종양 특이적인 CD4+또는 CD8+T cell을 활성화시키고, 궁극적으로 종양에 대한 체액성 및 세포성 면역반응을 유도한다. 또한, 종양에 대한 교차반응성이 있어서 여러 종류의 종양들에 대한 면역반응을 유도하므로, 종양의 증식 및 전이에 대한 예방을 위한 백신 효과와 이미 생성된 종양에 대한 치료 효과를 나타낸다.
Description
본 발명은 항종양 활성의 유도를 위한 종양 백신의 제조방법, 그러한 종양 백신을 함유하고 있는 약제 조성물, 및 그것을 이용하여 종양에 대한 면역원성 증진에 따른 종양의 증식 및/또는 전이를 억제하여 궁극적으로 종양의 예방 및 치료를 행하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 종양으로부터 유래된 종양세포를 가열처리하여 종양에 대한 면역원성이 증진된 불활성화 종양세포 및/또는 그것으로부터 얻어지는 종양 항원을 포함하는 종양 백신을 제조하는 방법과, 그러한 불활성화 종양세포 및/또는 거기에 함유되어 있는 항종양 활성을 유도하는 종양 항원을포함하는 약제 조성물을 제공하며, 이를 이용하여 종양에 대한 객체의 면역원성을 증가시킴으로써 종양의 증식 억제 및 전이 억제에 의해 궁극적으로 종양의 발생을 예방하고 치료하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "종양 백신"은, 설명의 편의를 위하여, 때때로 "불활성화 종양세포", "종양 항원" 등으로 혼용하여 사용한다.
궁극적으로 항종양 활성의 유도를 위하여 종양 백신의 면역 요법을 개발하기 위한 연구가 광범위하게 진행되고 있으며, 항종양 면역능의 유도에 기인한 일부 종양의 예방 및 치료가 인정되고는 있지만, 아직 임상에서 실질적으로 유효하게 적용될 수 있는 방법은 개발되지 못하고 있다.
종양의 면역 요법이 성공하지 못하고 있는 가장 중요한 이유는 이들 종양의 낮은 면역원성 등 종양세포 자신의 면역회피기전에 의하는 것으로 알려져 있다. 구체적으로, class Ⅰ- 및 Ⅱ-MHC 발현이 억제되거나, 또는 면역반응을 유도하는 항원이 없거나, 또는 항원이 존재한다고 하더라도 시알산(sialic acid)이 포함된 점액 다당류에 의해 항원이 감추어짐으로써 CTL 작용 및 헬퍼 T 세포의 기능을 방해하며, 종양세포가 T 세포를 자극하는 공자극 신호(co-stimulator signal)를 만들어내지 않아서 T 세포를 무기력상태(anergy)로 전환시킨다. 또한, 종양세포는 면역억제 작용을 가지는 TGF-β를 생산하여 종양에 대한 면역반응을 억제하고, FASL의 발현이 없어 CTL과 같은 작동세포의 살해기전을 무능화시킨다. 아직까지 여러 종류의 종양들의 특이 항원동정이 완전히 밝혀지지 않은 상태이다. 동정된 단일 항원으로는 유효한 종양 면역이 유도되지 않기에, 여러 연구자들은 최소한 3 개 이상의 항원들을 동시에 면역하는 다가 항원의 사용으로 유효한 항종양 면역이 유도될 것으로 기대하고 있으며, 현재는 whole tumor vaccine에 의한 면역반응의 유도가 연구되고 있다.
일반적으로 항종양 면역에 관여하는 생체의 작동세포로는, 종양 특이적인 헬퍼 T 세포, 세포독성 T 림프구 등과, 종양 비특이적인 마크로파지, NK-세포 등이 알려져 있다. 세포성 면역에 관련된 세포독성 T 림프구(CTL)는 종양에 대항하는 작동세포로 가장 잘 알려져 있다. 종양에 대항하는 CTL의 유도는 주로 종양의 MHC-Ⅰ을 인식하거나 또는 항원제시 세포로부터 헬퍼 T 세포 매개로 증식(proliferation)된다. 그러나, 암세포는 MHC-Ⅰ의 발현에 매우 제한적인 것으로 알려져 있고, 주로 항원제시 세포를 경유하는 cross priming에 의한 방법이 주로 연구되고 있다. 따라서, 강력한 항원제시 세포인 수지상 세포를 이용하는 면역법에 대한 관심도 고조되고 있다.
한편, 항종양 NK-세포는 종양의 전이 또는 증식 억제에 활성을 가지는 세포로 알려져 있으며, 최근에 그 작동기전으로서 종양세포에 발현된 특이 리가드(Rae1 및 H60)와 반응하는 활성화된 NK-세포는 페르포린(perforin) 매개의 종양살해를 유도하므로, 이들 특이 리간드를 종양에 대한 백신으로 사용하는 가능성이 제시되고 있다.
악성 종양의 치료 또는 예방을 위한 종양 백신의 유도기전에서, 전문(professional) APC인 DC와 마크로파지의 항원제시능의 유도는 가장 중요한 요소로 간주되고 있다. 이전의 연구에서 여러 연구자들은in vitro에서 DC 또는 마크로파지와 종양 백신으로서 apoptotic 또는 necrotic tumor 세포를 동시 배양시킨 후 이들을 담암 숙주에 면역함으로써 종양의 증식 및 전이에 유의적인 억제 활성을 유도할 수 있었다. 이는, 앞서 언급한 종양의 면역 회피기전이 종양 항원을 제시하기 위한 강력한 항원제시 세포를 이용하여 극복될 수 있음을 암시하는 것이다.
따라서, 항종양 면역을 유도하기 위한 암 항원의 제시능을 여러 면역증강제(adjuvant)를 이용하여 극복하려는 노력도 진행되고 있다. 이러한 노력은 궁극적으로 낮게 발현된 암 항원의 면역원성을 높이려는 노력이다. 여러 연구자들은 분자생물학적 기법을 이용하여 암 항원이 표지된 종양을 이용하거나 항원제시능의 유도에 직접 관련이 있는 싸이토카인 유전자가 도입된 종양세포를 이용한 방법을 연구하였다. 그러한 연구결과는 종양 백신의 임상에의 적용을 위한 작동기전 연구에 중요한 기초연구가 된다.
종양 백신을 이용한 암면역의 유도는 다음의 3 단계로 진행된다: 항원의 제시 단계, APC에 의한 T 세포의 프라이밍 단계(priming stage), 및 활성화된 T 세포에 의한 작동 단계(effector stage). 항원의 제시를 위하여,in vivo에서 종양 항원은 미성숙(immature) APC를 성숙(mature) APC로 분화시키는 작용이 있어야 한다. 항원을 업테이크한 APC는 항원의 제시가 가능한 성숙 상태로 전환되면서, TNF-α 및 IL-12를 생산하게 된다. 이들 싸이토카인은 세포성 면역의 유도에서 가장 중요한 요소로 간주되고 있다. 이러한 싸이토카인이 항원제시를 위한 T 세포의 성숙을 유도하게 되면, 항원을 제시받은 T 세포는 GM-CSF를 생산하여, 다시 항원제시 세포의 증식을 유도하게 된다. 따라서, T 세포로부터 GM-CSF의 생산은 전문 APC의 증식에 필수적인 요소이다. 이러한 싸이토카인 조절작용에 의하여 특이종양에 살해능을 획득한 CTL의 성숙이 유도된다. CTL이 종양세포와 접촉하면서 종양살해능을 획득시, IFN-γ이 생산되고 동시에 costimulatory molecule이 표현된다. 따라서, T 세포로부터 IFN-γ의 생산능은 CTL의 종양살해 작동에 있어 중요한 지표가 된다. 결론적으로, 종양에 대한 세포성 면역증의 유도에 있어서, 항원제시 세포의 종양 항원의 제시와 T 세포에서 Th1 type 싸이토카인의 생산이 가장 중요한 요소로 고려되며, 따라서 상기 활성을 유도하기 위한 종양 백신의 제조방법이 요구되고 있다.
이와 관련하여, Gough MJ 등(Cancer Res. 2001, 61, 7240-7247)은 동물실험에 의한 연구에서 apoptotic cell 및 necrotic cell의 면역에 의한 종양의 증식억제 실험을 실시하였다. 그 결과, necrotic cell은 마크로파지를 활성화시켜 TNF-α, IL-1 및 IL-6의 유의적인 생산을 유도하였으므로, necrotic cell과 동시배양된 마크로파지의 면역은 예방뿐만 아니라 치료적으로 종양의 증식을 유의하게 억제하였다고 설명하였다. 이들 저자들은, apoptotic cell의 면역은 마크로파지의 탐식작용(phagocytosis)에 의하여 종양을 제거하지만, necrotic cell의 면역은 일부 탐식작용의 유도와 상기 싸이토카인의 생산에 의한 면역활성의 유도로 백신 효과가 얻어지는 것으로 보고하였다. 더불어, 이들 저자들은 이러한 결과가 주로 스트레스에 기인된 hsp70의 발현에 기인되는 활성임을 증명하였다.
마크로파지의 항원제시와 관련하여 Barker RN 등(Exp Immunol. 2002, 127, 220-225)은 마크로파지와 접한 necrotic cell이 CD40의 발현을 유도하여 T 세포의 활성화에 영향을 주는 것을 확인함으로써, 상기의 결과를 지지하였다.
그러나, Schnurr M 등(Cancer res, 2002, 62, 2347-2352)은, apoptotic cell과 DC의 배양에서 TNF-α의 존재시 DC가 CD83을 발현함으로써 성숙 DC로 분화되며, 이 경우 T 세포와의 동시배양은 유의한 IFN-γ의 생산을 유도함으로써 apoptotic cell의 백신 활성을 보고하였다. 한편, 이들 저자들은 necrotic cell인 freezing/thawing cell의 경우는 유의적인 IFN의 생산효과가 없음으로 항종양 면역이 유도되지 않음을 보고하였다. Mass D 등(Cancer Res. 2002, 62, 1050-1056)은, apoptotic cell과 DC의 배양이 DC를 미성숙 형태(immature form)에서 CD86이 발현된 성숙(mature form)으로 전환시키고, 따라서 T 세포의 활성화에 중요한 역할을 한다고 보고하였다. 이후, Strome SE 등(Cancer res 2002, 62, 1884-1889)은, 동물실험에서 조사(irradiation)된 세포에 의한 DC의 면역은 유의한 암증식 억제활성을 유도하였으나, necrotic cell(freeze-thawing cell)의 경우는 암증식 활성이 없음을 확인함으로써, 앞선 결과와 상반되는 결과를 보고하였다. 즉, Strome SE 등은 조사된 세포만이 T 세포로부터 CTL 관련 IFN-γ의 생산이 유도됨을 보고하였고, 이러한 현상은 세포가 조사되면서 스트레스 상태를 유지하여야 한다고 설명함으로써, hsp이 항종양 면역에 관여함을 암시하였다.
상기 결과를 요약하면, 백신으로 사용하는 종양 백신은 저자들에 따라 apoptotic cell이든 necrotic cell이든 간에 실험에 적용한 세포에 따라서는 항종양 활성의 유도가 가능하다는 것을 보여주고 있고, 악성종양의 방어를 위하여 가장 중요한 것은 항원제시 세포의 항원제시능(성숙)이 항종양 면역의 유도에서 개시인자로 작용하고 결국 작동계로서 세포성 면역계인 CTL의 유도에 기인한 백신 효과를설명하고 있다. 동시에, hsp가 종양 면역능의 유도를 위한 종양 항원으로서 직접 또는 간접적으로 관련되며, 암의 전이적 측면보다는 증식의 억제 측면에서 고려되고 있는 실정이다.
그러나, 아직까지 암의 제거를 위하여 유효한 면역반응을 유도하는 항원에 대한 본질은 밝혀지지 않고 있다. 발암성 물질(carcinogen)에 의한 일부 암의 유도 후 그 암을 설치류에 이식한 경우에, 암화되는 과정에서 생긴 항원이 담암 숙주에서 암에 대한 면역반응을 유도하는 것이 알려져 있지만, 그 항원에 대한 본질은 아직 많이 알려져 있지 않을 뿐만 아니라, 알로타입(allotype)의 설치류에 대한 교차적 방어 효과에 대한 연구는 미미한 실정이다. 한편, 인간에 대해서 암 항원은 여러 암에 대하여 넓은 방어적 면역력을 획득할 수 있는 것으로 보고되고 있고, 이를 이용한 예방 또는 치료요법에 많은 연구가 진행되고 있으나, 아직 만족할 만한 결과는 없는 실정이다.
일반적으로 종양에 대하여 유효한 면역반응을 유도하기 위하여, 궁극적으로는 종양 증식 및 전이에 대한 효과적인 치료 또는 예방법 개발을 위하여, 선행되어야 할 점은 1) 악성종양 항원의 규명, 2) 종양 항원 면역반응의 효과적인 유도 방법, 3) 종양의 면역회피 기작 극복 방법의 개발이다. 그 중에서 종양 항원의 효과적인 유도 방법은 면역증강제(adjuvant)의 개념이 접목되어야 하고, 악성종양 항원의 규명 및 종양의 면역회피 기작의 극복은 현재 가장 많이 연구되고 있는 분야이다. 결국, 여러 종류의 종양에 대하여 항종양 활성을 유도하는 하나의(고유의) 악성종양 항원의 규명은 항종양 면역의 유도에 가장 중요한 사실이 될 것으로 사료된다. 그러나, 하나의 종양 항원에 대한 연구결과 이후 변종(variant) 종양의 출현으로 야기되는 치료적 한계로 인하여, 여러 학자들은 whole tumor cell을 이용한 항 종양 면역의 유도를 연구중에 있다.
현재까지 whole tumor cell을 이용한 백신의 예는 다음과 같고, 이의 응용 가능성에 대해서는 학자들간에 이견이 많은 실정이다. 즉, 현재까지의 연구에는 주로 apoptotic cells, freezing/thawing에 의한 necrotic cells, irradiated cells, formaldehyde fixed cells, heat shock proteins, photoreactive 또는 photosensitizer cells(photodynamic therapy; PDT)의 면역방법 등이 사용되고 있다. 이러한 whole cell lysates의 전문 항원제시 세포(dendritic cell)에 프라이밍법은 동물실험에서 우수한 효과를 보임으로써, 일부 전임상 실험을 실시하고 있다. 그러나, 현재까지 임상에 적용하여 만족할 만한 활성을 나타내는 유효한 종양 백신의 제조에 대한 구체적인 방법은 제시되지 못하고 있는 실정이다.
이에, 본 발명자들은 유효한 항종양 면역의 유도를 위한 백신의 제조방법을 확립하였고, 종양의 증식억제를 포함하여 실질적으로 임상에서 가장 치명적인 요소로 간주되는 원격전이에 의한 사망을 억제하기 위한 전이억제 활성이 포함되는 강력한 암 백신을 제조하고 활성을 나타내는 물질의 규명하고 작동 기전을 조사하였다.
즉, 본 발명의 목적은 항종양 활성을 유도할 수 있는 종양 백신의 제조방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 방법으로 제조된 종양 백신은 면역 객체내에서 종양의 증식 및 전이를 억제하는 우수한 항종양 면역반응을 유도하며, 다른 종양의 증식 및 전이 억제에 대해서도 교차반응성을 나타낸다.
본 발명의 다른 목적은 이러한 항종양 활성을 나타내는 활성성분을 포함하는 약제 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 이러한 종양 백신 또는 약제 조성물을 사용하여 종양에 대한 객체의 면역원성을 증진시키는 방법과 종양의 증식 및 전이를 억제함으로써 종양을 예방 및 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
도 1a 내지 1c는 colon 26-M3.1 carcinoma (Balb/c)을 사용하여 본 발명의 방법에 따라 제조한 백신의 암 증식 억제, 연명율, 및 백신 면역에 따른 종양 생성의 억제에 관한 실험 결과를 보여주는 그래프들이다;
도 2a 내지 2c는 CT-26 colon carcinoma (Balb/c)를 사용하여 본 발명의 방법에 따라 제조한 백신의 암 증식 억제, 연명율, 및 백신 면역에 따른 종양 생성의 억제에 관한 실험 결과를 보여주는 그래프들이다;
도 3a 및 3b는 B16-BL6 melanoma (C57BL/6)를 사용하여 본 발명의 방법에 따라 제조한 백신의 암 증식 억제 및 연명율에 관한 실험 결과를 보여주는 그래프들이다;
도 4는 L1210 leukemia (DBA2)를 사용하여 본 발명의 방법에 따라 제조한 백신의 담암 마우스 연명율에 관한 실험 결과를 보여주는 그래프이다;
도 5는 본 발명의 방법에 따라 제조된 하나의 실시예에 따른 백신(이하, 때때로 "MD-J 백신"이라 함)의 전기영동 및 western blotting 결과를 보여주는 사진들이다;
도 6은 MD-J 백신의 anti-hsp70 항체에 대한 western blotting 분석 결과를 보여주는 사진이다;
도 7은 DC로부터 IL-12의 생산에 미치는 MD-J 백신의 효과를 나타낸 그래프이다;
도 8a 및 8b는 MD-J 백신의 펠렛 및 상등액 분획에 의한 TNF-α의 생산 양식을 보여주는 그래프들이다;
도 9a 및 9b는 MD-J 백신의 펠렛 및 상등액 분획에 의한 TNF-α의 생산에서 내독소의 효과를 보여주는 그래프들이다;
도 10은 MD-J 백신과 기타 대조군 백신들로 면역된 마우스의 종양이식에 의한 연명율을 보여주는 그래프이다;
도 11은 NK-세포가 제거된 마우스에서 MD-J 백신과 기타 대조군 백신들의 효과를 보여주는 그래프이다;
도 12는 MD-J 백신과 기타 대조군 백신들의 복강세포로부터 TNF-α 유도활성을 보여주는 그래프이다;
도 13은 MD-J 백신과 기타 대조군 백신들의 복강세포 증식활성을 보여주는 그래프이다;
도 14a 및 14b는 MD-J 백신과 기타 대조군 백신들의 마크로파지 자극에 의한 싸이토카인의 생산 결과를 보여주는 그래프들이다;
도 15는 MD-J 백신의 면역 후 비장세포의 재자극 활성을 측정한 결과를 보여주는 그래프이다;
도 16a 내지 16d는 MD-J 백신과 기타 대조군 백신들의 면역 및 암접종 후의 Th1 type (IFN-γ, GM-CSF)의 유도 양식 결과를 보여주는 그래프이다;
도 17a 및 17b는 MD-J 백신과 기타 대조군 백신들의 면역 및 암접종 후의 Th2 type (IL-10)의 유도 양식 결과를 보여주는 그래프이다;
도 18은 MD-J 백신과 기타 대조군 백신들을 면역하고 종양을 접종한 후, 비장세포의 재자극 실험 결과를 보여주는 그래프이다;
도 19a 및 19b는 MD-J 백신 면역 마우스의 항체가 및 항체의 subisotype 분석에 대한 실험 결과를 보여주는 그래프이다.
이러한 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 종양 백신의 제조방법은, 종양으로부터 유래된 종양세포를 가열처리하여 종양에 대한 면역원성이 증진된 불활성화 종양세포 및/또는 그것으로부터 얻어진 종양 항원을 포함하는 백신을 제조하는 것으로 구성되어 있다.
본 발명의 방법에 사용될 수 있는 종양은 특별히 제한되는 것이 아니며, 본 발명의 실시예에서 사용한 colon 26-M3.1 carcinoma (Balb/c), CT-26 colon carcinoma (Balb/c), B16-BL6 melanoma (C57BL/6), L1210 leukemia (DBA2) 등을 예로 들 수 있지만, 이들만으로 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 종양은 종양 원발소(primary tumor) 또는 다른 기관으로 전이된 악성종양일 수 있다. 본 발명의 면역에 의한 항종양효과의 유도는 이하 실시예에서 기술한 바와 같이 고형암의 증식에 대하여도 효과적이지만 특히 전이력을 획득한 악성종양세포에 대하여 탁월한 활성을 제공하였다. 본 발명에 따른 종양 항원은 동계(syngeneic) 및 동종(allogeneic) 객체의 종양에 대해서도 면역성이 있으므로, 종양 항원의 공여개체와 종양 항원의 수여개체가 동일한 종양(autologous tumor)과 다른 종양(allogeneic tumor)을 포함한다. 또한, 본 발명의 방법으로 제조된 백신은 다른 종류의 종양들의 면역반응에도 교차반응성이 있다. 따라서, 본 명세서에서 사용된 용어 "종양"은 이들 개념들을 모두 포함하며, 종양조직, 종양세포 등 형태의 차이를 구별짓지 않고 이들을 모두 포함하는 개념으로 사용되고 있다.
상기 가열처리는 다양한 방법에 의해 수행될 수 있으며, 예를 들어, 중탕, 가압멸균, 습식멸균 등을 들 수 있지만, 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
가열처리의 온도 및 시간은, 종양에 대한 면역원성의 증진과 종양 자체의 불활성화를 위하여, 적어도 45℃ 이상, 바람직하게는 60 내지 130℃, 더욱 바람직하게는 90 내지 110℃의 범위내이고, 적어도 5 분 이상, 바람직하게는 10 내지 60 분, 더욱 바람직하게는 20 내지 40 분의 범위내이다. 특히 바람직하게는 90 내지 100℃에서 20 내지 30 분간 가열처리를 행할 수 있다.
경우에 따라서는, 종양으로부터 유래된 종양세포를 적절한 조건에서 배양하여 증식시키는 과정, 상기 가열처리 중에 및/또는 가열처리 이후에 종양세포를 초음파 처리(sonication)하는 과정, 및 상기 불활성화 종양세포로부터 종양 항원을 정제하는 과정을 선택적으로 포함할 더 수도 있다.
상기 종양세포의 배양과 불활성화 종양세포로부터 종양 항원의 정제는, 본발명의 내용을 바탕으로, 당업계에 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 용이하게 실시될 수 있으므로, 이에 대한 자세한 설명은 생략한다. 다만, 종양 항원의 정제는 이후에서 설명하는 종양 항원에 대한 정보를 바탕으로 하여 수행될 수 있다.
상기 종양세포의 초음파 처리는 가열처리 중 또는 후의 종양세포에 초음파를 조사하는 것으로서, 이러한 초음파 처리에 의해 종양 특이적인 항원의 노출이 증가된 백신이 얻어질 가능성이 있다. 초음파 조사시간은 특별히 제한되는 것은 아니며, 대략 10 내지 40 분 일 수 있다.
상기 불활성화 종양세포는 구조적으로 세포의 원형을 유지한 형태(intact form)일 수 있으며 또는 파쇄물 형태(lysate form)일 수도 있다. 또한, 상기 종양 항원은 이러한 불활성화 종양세포에 포함되어 있는 면역원성을 발휘하는 항원으로서 상기 파쇄물 자체 또는 그것의 일부일 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 얻어진 불활성화 종양세포는, 이후의 실시예에서도 확인할 수 있듯이, 가열처리 후 얻어진 45, 57, 62, 74 및 75 KDa의 단백질들에서 선택된, 종양에 대한 면역원성을 부여하거나 종양의 증식 및 전이를 억제하여 종양에 대한 치료 및 예방 활성을 나타내는 하나 또는 그 이상의 종양 항원인 일가 또는 다가 항원을 포함하고 있다.
이러한 종양 항원은 가열처리에 의해 구조적으로 변형이 일어난 항원 단백질이거나, 또는 표현되지 않은 단백질이 가열처리에 의해 새로이 세포 표면에 노출된 항원 단백질일 수 있다. 그러나, 본 발명의 방법에서 얻어진 종양 항원은 열충격단백질(heat shock protein: hsp)은 아니다. 또한, 이러한 종양 항원은 항원제시 세포(Antigen Presenting Cell: APC)의 MHC 분자를 통해 항원제시함으로써 면역 대상 개체의 세포성 면역반응을 유도한다.
본 발명의 방법으로 제조된 항암 백신(이하, "MD-J 백신"이라 약칭하기도 함)의 작용기전을 확인하기 위하여 이후의 실시예에 기재되어 있는 바와 같은 다수의 실험들을 실행하였으며, 그 결과를 정리하면 다음과 같다.
ⅰ) MD-J 백신의 전기영동 및 anti-MD-J 백신 항체를 이용한 western blotting 실험 결과, MD-J 백신은 살아있는 종양세포에서 발견되지 않은 약 75 KDa의 새로운 단백질을 포함하고 있으며, 이 단백질은 최소한 면역자극활성을 유도하는 hsp은 아닌 것으로 실험을 통해 확인되었다.
ⅱ) MD-J 백신은 항원제시 세포를 성숙시키는 활성을 유도하는 바, 이는 MD-J 백신으로 면역된 숙주의 T 세포가 항원제시 세포의 성숙을 유도하는 GM-CSF를 생산한 실험 결과로부터 확인되었다.
ⅲ) MD-J 백신은 항원제시 세포인 수지상 세포와 마크로파지의 항원제시능을 증진시키는 바, 이는in vitro에서 MD-J 백신과 각 항원제시 세포와의 동시배양 후의 배양 상등액에서 이들 항원제시 세포가 작동단계에서 관여하는 TNF-α 및 IL-12가 생산된 실험 결과로부터 확인되었다.
ⅳ) MD-J 백신 면역 마우스의 항 종양활성은 종양 비특이적 작동세포인 NK-세포의 활성화에 기인한 기전은 아닌 바, 이는 MD-J 백신의 항종양전이 활성이 anti-asialo-GM1 항체를 이용한 NK 세포가 제거된 마우스에서도 동일하게 유도된 실험결과로부터 확인되었다.
ⅴ) MD-J 백신으로 인한 항원제시 세포 의존적 T 세포의 활성화는 이후 종양에 대하여 방어력이 획득된 CTL을 유도하는 바, 이는 MD-J 백신으로 면역된 숙주의 T 세포가 CTL의 작동단계에서 발현하는 IFN-γ를 생산하였고 이러한 활성은 MD-J 백신의 재자극시 유의적으로 증가한 실험 결과로부터 확인되었다.
ⅵ) MD-J 백신의 면역에 의해 항종양 활성을 가지는 CTL 유도는 CD4+및 CD8+T 세포에 의존적인 바, 이는 CD8+T 세포의 녹아웃 마우스에서 암전이 활성이 완전히 소멸되고 CD4+T 세포의 녹아웃 마우스에서도 일부 항종양활성이 확인되는 실험을 통해, CD4+T 세포를 경유한 CD8+T 세포의 활성화 또는 암세포에 대한 직접적인 CD8+T 세포의 활성화로 인한 것임이 확인되었다.
ⅶ) MD-J 백신의 면역에 의해 MD-J 백신 특이적인 항체가 생산된다는 실험 결과로부터, 숙주의 항종양 면역에 이들이 직접 또는 간접적으로 관여할 수 있다는 가능성을 확인하였다.
ⅷ) 항종양 활성을 유도하는 항원의 존재는 MD-J 백신의 수용성 부분에도 존재하지만 주로 백신화된 세포에 존재하는 바, 이는 MD-J 백신의 제조과정에서 생성되는 특이 항원(75 KDa의 단백질 및 기타 항원)이 제조과정중에 PBS 버퍼내에 용해되지만 대부분의 항종양 활성을 유도하는 성분은 세포에 존재한다는 실험 결과로부터 확인되었다.
따라서, 본 발명의 항암 백신의 면역에 의한 종양 면역의 유도는, 백신화 과정에서 생성된 항원을 항원제시 세포가 항원제시함으로써 종양에 대한 특이적인 세포성 면역능을 활성화시키는 기전에 의하며, 동계는 물론 동종 종양에 대하여도 활성을 나타내고, 이는 가열처리 과정에서 생산되는 75 KDa의 단백질, 기타 항원 등의 생성에 기인한 결과인 것으로 추측된다.
본 발명은 또한 (a) 약리학적 유효량의 상기 불활성화 종양세포 및/또는 그것으로부터의 얻어진 종양 항원; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제, 또는 이들의 조합;을 포함하는 것으로 구성된, 종양의 예방 및 치료용 약제 조성물을 제공한다.
용어 "약제 조성물(pharmaceutical composition)"은 상기 불활성화 종양세포 및/또는 종양 항원(이하, "활성성분"으로 표현하기도 함)과 희석제 또는 담체와 같은 다른 화학 성분들의 혼합물을 의미한다. 약제 조성물은 생물체내로 활성성분의 투여를 용이하게 한다. 활성성분을 투여하는 다양한 기술들이 존재하며, 여기에는 주사, 경구, 에어로졸, 비경구, 국소 투여 등이 포함되지만, 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
용어 "약리학적 유효량(therapeutically effective amount)"은 투여되는 활성성분의 량이 종양의 예방 및 치료가 가능한 정도의 것을 의미한다.
용어 "담체(carrier)"는 세포 또는 조직내로의 활성성분의 부가를 용이하게 하는 화합물로 정의된다. 예를 들어, 디메틸 술폭사이드(DMSO)는 생물체의 세포또는 조직내로의 많은 유기물질들의 투입을 용이하게 하는 통상 사용되는 담체이다.
용어 "희석제(diluent)"는 대상체의 생물학적 활성 형태를 안정화시킬 뿐만 아니라, 이를 용해시키게 되는 물에서 희석되는 화합물로 정의된다. 버퍼 용액에 용해되어 있는 염은 당해 분야에서 희석제로 사용된다. 통상 사용되는 버퍼 용액은 포스페이트 버퍼 식염수이며, 이는 인간 용액의 염 상태를 모방하고 있기 때문이다. 버퍼 염은 낮은 농도에서 용액의 pH를 제어할 수 있기 때문에, 버퍼 희석제가 화합물의 생물학적 활성을 변형하는 일은 드물다.
용어 "약제학적으로 허용되는(physiologically acceptable)"은 소망하는 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는 담체 또는 희석제로 정의된다.
용어 "예방 및/또는 치료(prevention and/or treatment)"는, 활성성분에 의해 종양에 대한 객체의 면역원성을 증가시키는 것, 그것으로부터 얻어지는 임상학적 효과, 종양에 대한 면역원성의 증가에 기인하지 않더라도 상기 활성성분에 의해 얻어지는 임상학적 효과를 모두 포함하는 것으로 정의된다. 객체내에서 종양의 증식을 억제하고 종양의 전이를 억제하여 암을 예방하거나 암을 치료하는 것을 예로 들 수 있지만, 그것만으로 한정되는 것은 아니다. 상기 예방에는 당연히 객체에 대한 면역을 포함하므로, 본 발명의 약제 조성물은 면역 백신 조성물을 포함하는 의미로 사용된다.
적절한 투여 경로는, 예를 들어, 경구, 비강, 투과점막, 또는 장 투여; 격막내, 직접 심실내, 복강내, 또는 안내 주사뿐만 아니라, 근육내, 피하, 정맥, 골수주사를 포함한 비경구 전달을 포함한다. 바람직하게는, 경피투여(intradermally administering, intermittently intradermally administering), 근육주사(intramuscularly administering), 혈중투여(intravenously administering) 등으로 실행될 수 있다.
본 발명의 약제 조성물은, 예를 들어, 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 당제-제조, 분말화, 에멀션화, 캡슐화, 트래핑과 또는 동결건조 과정들의 수단에 의해, 공지 방식으로 제조될 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 사용을 위한 약제 조성물은, 약제학적으로 사용될 수 있는 제형으로의 활성성분의 처리를 용이하게 하는 부형제들 또는 보조제들을 포함하는 것으로 구성되어 있는 하나 또는 그 이상의 약제학적으로 허용되는 담체를 사용하여 통상적인 방법으로 제조될 수도 있다. 적합한 제형은 선택된 투여 루트에 따라 좌우된다. 공지 기술들, 담체 및 부형제들 중의 어느 것이라도 적합하게, 그리고 당해 분야, 예를 들어, Remingston's Pharmaceutical Sciences에서 이해되는 바와 같이 사용될 수 있다.
예를 들어, 주사 투여를 위하여, 본 발명의 조성물은 액상 용액으로, 바람직하게는 Hank 용액, Ringer 용액, 또는 생리 식염수 버퍼와 같은 약제학적으로 맞는 버퍼로 제형될 수 있다. 점막 투과 투여를 위해서, 통과할 배리어에 적합한 비침투성제가 제형에 사용된다. 그러한 비침투성제들은 당업계에 일반적으로 공지되어 있다.
본 발명의 조성물이 투여되는 량은 세포배양 분석으로부터 초기에 측정될 수도 있다. 예를 들어, 선량(dose)은 세포배양에서 결정된 IC50를 포함하는 순환 농도 범위를 얻기 위하여 동물 모델에서 계산될 수 있다. 그러한 정보는 인간에서의 유용한 선량을 더욱 정확히 결정하는데 사용될 수 있다. 활성성분의 투여량(dosage)은 바람직하게는 독성이 없거나 거의 없는 상태에서 ED50(군집의 50%에 대해 효과를 갖는 선량)을 포함하는 순환 농도의 범위내에 있다. 투여량은 채용된 투여 형태와 이용된 투여 루트에 따라 상기 범위에서 변화될 수 있다. 정확한 산정, 투여 루트 및 투여량은 환자의 상태를 고려하여 개개의 의사에 의해 선택될 수 있다(예를 들어, Fingl et al. 1975, in "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p. 1 참조).
본 발명의 조성물에는 본 발명의 효과를 저해하지 않는 범위내에서 기타 공지의 물질들이 더 포함될 수도 있다.
본 발명은 또한 상기 불활성화 종양세포 및/또는 종양 항원을 유효량 이상으로 객체에 투여하여 종양에 대한 객체의 면역원성을 증가시키는 방법을 제공한다. 이러한 면역원성의 증가에 의해, 예를 들어, 객체내에서의 종양의 증식 및/또는 전이를 억제할 수 있다.
상기의 방법에는, 유전적으로 동일한(동계; syngeneic) 객체의 종양으로부터 수득하여, 본 발명의 방법에 따라 불활성화 종양세포 및/또는 종양 항원을 제조하고, 이를 유전적으로 동일한 객체에 투여하는 방법과; 유전적으로 유사한(동종;allogeneic) 객체의 종양으로부터 수득하여, 본 발명의 방법에 따라 불활성화 종양세포 및/또는 종양 항원을 제조하고, 이를 유전적으로 유사한 객체에 투여하는 방법이 모두 포함된다.
상기 객체는 바람직하게는 척추동물이고, 더욱 바람직하게는 인간이다.
경우에 따라서는, 상기 불활성화 종양세포 및/또는 종양 항원(활성성분)에 의해 자극된 항원제시 세포(APC)를 단독으로, 또는 상기 활성성분과 병용하여 추가로 투여하는 과정을 더 포함할 수도 있다.
본 발명에 따른 종양에 대한 면역원성의 증가 방법은 종양 백신을 일회 투여함으로써 행하는 면역 방법과 연속 투여함으로써 행하는 면역 방법을 모두 포함한다. 상기 종양 백신은, 앞서의 설명과 같이, 다른 종류의 종양들에 대해서도 교차반응성이 있으므로, 면역 대상의 종양은 종양 백신의 종양과 반드시 동일할 필요는 없다.
본 발명은 또한 상기 불활성화 종양세포 및/또는 종양 항원을 유효량 이상으로 객체에 투여하여 종양의 예방 및 치료를 행하는 방법을 제공한다. 객체에 투여하는 방식은 다양할 수 있으며, 예를 들어, 앞서 설명한 약제 조성물의 형태로 제조한 후 역시 앞서 설명한 다양한 투여 경로를 통해 행해질 수 있다.
이하에서는, 실시예를 통해, 본 발명의 종양 백신의 제조, 유효성분 탐색, 제조된 백신의 면역에 의한in vivo(동물실험) 항종양 억제 활성 규명, 그것의 작용기전의 탐색 등을 자세히 설명하지만, 본 발명의 범주가 그것에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 암백신(tumor vaccine)의 제조
실험에 사용한 종양세포는 colon 26-M3.1 lung carcinoma cell line이다. Colon 26-M3.1 lung carcinoma 세포주는 7% FBS를 함유한 EMEM 배지를 이용하여 37℃의 배양기에서 배양하였다. 세포주가 배양 플라스크에 약 60% 정도 단일층(monolayer)을 이루고 성장했을 때, 세포를 회수하여 백신을 제조하였다. 각각의 백신화(vaccination)를 위하여 종양세포를 다음과 같이 처리하였다.
1) Boiled vaccine(MD-J 백신)의 제조
본 발명에 따른 종양 백신의 제조를 위해 7% FBS를 함유하는 RPMI-1640 또는 EMEM 배지를 사용하였다. Colon 26-M3.1 carcinoma 및 B16-BL6 melanoma와 같은 접착성 세포주는 trypsin-EDTA를 이용하여 세포를 분리한 후, 배양배지를 첨가 하였고, L1210 leukemia 주 같은 부유성 세포주는 배양배지 상태에서 원심분리함으로서 배지를 제거하였다. 그런 다음, PBS에 현탁하고 3회의 원심분리를 통하여 배지중에 잔류할 수 있는 FBS(fetal bovine serum) 성분을 제거하였다. 적정수의 세포(1×107/㎖)에 PBS를 넣고 끓는 물 안에서 30 분간 중탕 가열하였다. 그런 다음, 얼음안에서 급속 냉각시키고 4℃로 저장하여 백신("MD-J 백신"으로 칭함)으로사용하였다. 설명의 편의를 위하여, 이하의 실시예들 및 그와 관련된 도면들에서 본 발명에 따른 백신들은 때때로 "X-백신"으로 표기하기도 한다.
2) Formaldehyde fixed vaccine (F-백신)
배양중인 세포를 PBS를 넣고 3 회 세척함으로써 FBS 성분을 제거하였다. 준비된 세포(1×107/㎖)는 PBS에 대하여 0.1% 포름알데하이드를 넣고 1 일간 배양기에서 고정하였다. 그런 다음, PBS로 3 회 세척하고 4℃로 저장하여 백신("F- 백신"으로 칭함)으로 사용하였다.
3) 기타 대조군 백신
배양배지에서 성장한 종양세포의 FBS 성분의 제거를 위하여 PBS를 이용하여 세척한 후, PBS에서 5 일간 37℃의 CO2배양기에서 배양하여 생산된 암세포로부터 수용성 표면항원(surface Ag)을 원심분리(9000 rpm/10 min)하여 회수하였다. 상등액에 함유된 단백질은 단백질 분석 키트(Boi-rad)를 사용하여 단백질을 정량한 후 4℃에서 보관하였다(이하 "Sur-백신"으로 칭함). 또한, 배양중인 세포를 trypsin-EDTA를 이용하여 분리한 후, 배양배지를 넣고 1 회, 그런 다음 PBS를 넣고 3 회 세척하여 FBS 성분을 제거하였다. 세포(1×107/㎖)를 PBS에 현탁한 후, 액체 질소를 이용하여 급속 냉동시키고, 상온에서 자연적으로 녹였으며, 이 과정을 3 회 반복하여 백신("F/T-백신"으로 칭함)을 제조하였다. 또한, 암세포를 lysis buffer를 이용하여 완전하게 파쇄된 세포로부터 단백질을 정량한 후 4℃에 보관하였고, 이를 "cell lysate"로 칭하였다.
실시예 2: 백신의 면역이 실험동물에서 고형암의 증식에 미치는 효과
본 실험에서는, colon 26-M3.1 carcinoma (Balb/c), CT-26 colon carcinoma (Balb/c), B16-BL6 melanoma (C57BL/6), 및 L1210 leukemia (DBA2)를 사용하여, 실시예 1에서와 같이, 각각의 백신을 제조하고, 이들 백신들의 면역이 각 세포주의 증식에 미치는 효과를 조사하였다. 면역은 1 주일 간격으로 3 회 실시하였고, 암의 이식은 최종면역 1 주일 후에 피하주사(s.c. injection) 또는 복강주사(i.p. injection; L1210)로 행하였다. 면역을 실시한 백신들의 농도는 각각 1×104, 1×105및 1×106이었고, 살아있는 암주는 각각 1.5×104을 이식하였다. 각 백신들의 면역에 의한 종양의 증식은 암괘가 보이기 시작하는 15 일 이후에 1-3 일 간격으로 측정하였고, 동시에 암이 없는 마우스(tumor free mouse)의 수 및 연명율을 확인하였다. 그 결과를 도 1 내지 4에 개시한다. 이들 도면에서, "X5"는 본 발명에 따른 백신들의 1×105농도 면역군을 의미하고,"X6"은 본 발명에 따른 백신의 1×106농도 면역군을 의미한다.
도 1a 내지 1c 및 2a 내지 2c에서 바와 같이, colon 26-M3.1 lung carcinoma와 CT-26 colon carcinoma의 경우는 백신 면역에 의한 항종양 면역의 유도 효과가우수하여, 1×106cell 백신 면역에서 각각 80% 및 60%로 암의 생성이 억제되었다. colon 26-M3.1 cell의 이식 후 암의 크기가 약 25 ㎟이 되었을 때, 백신의 재면역은 암의 크기를 약 1 주일간 억제하였으며, 그 이후부터 다시 성장하는 결과를 보였다. CT-26 cell 모델에서 대조군의 암의 크기가 약 300 ㎟이 되었을 때에도 백신 면역은 약 4 일간 종양의 성장을 억제하였다. 두 세포주에 의한 연명율 및 종양의 성장속도는 면역 세포의 농도 의존적인 경향을 보였으며, 본 실험의 마우스 모델에서 백신 면역을 위한 적정 세포수는 1×106cells인 것으로 판단되었다.
도 3a 및 3b에서 보는 바와 같이, B16-BL6 melanoma 모델에서 백신의 면역에 의한 암괘의 증식 및 연명율의 경우에도, colon 26-M3.1 및 CT-26 cell와 유사한 경향을 보였는 바, 암괘가 성장하는 중의 백신 재면역은 약 7 일간 암의 증식을 유의적으로 억제하였다. 대조군의 경우에는, 암의 이식 37 일째에 모든 종양 이식 마우스가 폐사하였으나, 1×106cell이 면역된 경우 50 일째까지 40%의 생존율을 보였고, 20%의 마우스는 100 일까지 생존하였다.
도 4에서 보는 바와 같이, L1210 leukemia 모델의 경우에도, 1×106cells 및 1×105cell의 면역시 종양 대조군에 비하여 유의적인 종양증식 억제 효과를 보였고, 종양 이식 75 일 후에는 각각 40% 및 20%의 마우스가 생존하였다.
이상의 결과는, 본 발명에 따른 백신이 종양의 성장에 치료적으로 사용가능함을 제시하고 있으며, 백신의 연속투여에 의하여 종양의 증식 억제활성은 더 증가될 것으로 추측된다. 또한, 본 발명에 따른 백신 면역은 종양의 전이 및 증식에서 유의적으로 종양에 대한 면역반응을 유도하는 것으로 판단되며, 이러한 백신의 작동기작에 대해서는 이후의 실시예들에서 구체적으로 설명한다.
실시예 3: 백신 제조시 가열 온도에 따른 동종 암세포의 항종양전이 활성
MD-J 백신의 제조를 위한 최적 가열조건을 구하기 위하여, 가열온도에 따라 colon26-M3.1 lung carcinoma cells의 세포 파쇄물(cell lysate)을 제조하고, colon26-M3.1 lung carcinoma cell line을 이용하는 실험전이(experimental metastasis) 모델에 적용한 후 그 활성을 조사하였다. 세포의 가열온도는 세포가 불활성화되는 45℃, 60℃, 80℃ 및 100℃에서 각각 30 분간 중탕에 의하여 가열한 세포를 마우스당 5×105cells의 농도로 10 일 간격으로 총 3 회 면역하였다. 실험을 위한 colon 26-M3.1 lung carcinoma cell의 이식은 최종면역 10 일 후에 마우스당 2.7×104cells를 혈관주사하여 행하였고, 그 결과를 하기 표 1에 개시한다.
| 세포처리 조건 | Number oftumors | Inhibition % | Range | |
| 중탕온도 | 실온도 | |||
| Tumor control | 114.2±10.1 | - | 102, 112, 123, 108, 126 | |
| 45℃ | 40±5℃ | 85.4±12.6 | 25.2 | 86, 94, 68, 100, 79 |
| 60℃ | 55±5℃ | 68.8±8.2 | 39.8 | 67, 80, 60, 74, 63 |
| 80℃ | 75±5℃ | 41.4±15.0 | 63.7 | 32, 50, 36, 26, 20 |
| 100℃ | 95±5℃ | 5.2±2.9 | 95.4 | 5, 3, 9, 2, 7 |
상기 표 1에서 바와 같이, 항종양 면역 활성은 종양세포의 처리온도 의존적임을 확인할 수 있고, 종양을 90℃ 내지 110℃로 처리하는 것이 가장 유효한 백신을 제공함을 알 수 있다.
종양세포의 가열처리에 의한 항종양 면역의 유도는 열처리에 의한 열충격 단백질(hsp)의 생산과 관련이 있는 지에 대한 확인이 필요하다. hsp은 여러 종류의 세포, 세균 등에서 열처리 등의 스트레스 부가시 발현되는 단백질로서, 이러한 단백질을 총칭하여 "hsp family"라 한다. 이러한 hsp family 중에서 hsp60, hsp70, hsp90, gp96 등이 유명한데, 이들은 주로 숙주의 선천적 면역계를 활성화시키는 것으로 알려져 있다. 미생물이 아닌 세포로부터, 특히, 암세포의 hsp 중에서는 hsp70이 가장 잘 알려져 있으며, 이들은 항원제시 세포의 항원제시능을 증진시킴으로써 항종양 면역을 유도하며, 동시에 선천적 면역계의 자극에 의한 활성도 알려져 있다. 따라서, 상기 표 1의 실험 결과가 hsp에 의하여 유도된 결과인지에 대한 확인이 필요하다.
실시예 4: 백신의 가열시간에 따른 동종 암세포의 항종양 면역능의 유도
MD-J 백신의 제조를 위한 최적 가열시간을 구하기 위하여, 중탕온도를 100℃로 설정하고 가열시간을 각각 10, 20, 30 및 60 분으로 변경하였다는 점을 제외하고는 실시예 3에서와 동일한 방법으로 실험을 행하였다. 그 결과를 하기 표 2에 개시한다.
| 세포처리 조건 | Number oftumors | Inhibition % | Range | |
| 중탕온도 | 가열시간 | |||
| Tumor control | 145.8±15.3 | - | 131, 154, 162, 154, 128 | |
| 100℃ | 10 분 | 74.8±36.3 | 48.7 | 65, 85, 28, 68, 45 |
| 20 분 | 9.2±5.8 | 93.7 | 10, 10, 18, 5, 3 | |
| 30 분 | 4.8±1.8 | 96.7 | 5, 7, 6, 3, 8 | |
| 60 분 | 6.6±4.0 | 95.5 | 7, 2, 3, 11, 10 |
상기 표 2에서 보는 바와 같이, 100℃에서 중탕하는 가열시간은 20 분 이상에서는 유의적 차이가 인정되지 않았다. 따라서, 이후의 실험에서는 안정적인 30 분간의 중탕에 의하여 제조된 백신을 사용하였고, 설명의 편의를 위하여, 종양세포간의 이름은 따로 구별하여 칭하지 않고 "MD-J 백신"으로 통칭한다.
실시예 5: 각 백신의 전기영동 및 Western blotting
본 실험에서는, 각 백신들 및 live tumor cell을 lysis buffer(M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent 10 ㎖에 Complete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablet의 혼합액)로 완전히 분해한 후, 각각의 단백질 농도를 측정하고(Boirad 사), 전기영동을 실시하여, 구성 단백질의 존재를 확인하였다. 전기영동은 10% 아크릴아마이드 겔(acrylamide gel)에 3 ㎍의 단백질을 로딩하고 20 V에서 약 2 시간 동안 실시하였으며, 전기영동이 완료된 겔은 코마시스(comassi blue)로 염색하고 탈색 후 건조시켜 보관하였다. 전기영동에 의하여 분석된 단백질의 western blotting은 각 백신의 면역에 의하여 생산된 항체를 이용하였다. 각 백신에 의한 항체는 기존의 상용 면역증강제(adjuvant) 없이 MD-J 백신만을 5×105cells/mouse로 2 주 간격으로 총 3 회 피하주사법으로 면역하였으며, 최종면역 2주 후에 부스터 면역(booster immunization)으로서 live colon 26-M3.1 lung carcinoma 세포(2.7×104cells/mouse)를 혈관주사하였다. 최종면역 14 일 후에 마우스로부터 혈액을 채취하고 혈청을 분리하여 항체로 사용하였다. Western blotting 분석에 사용된 2 차 항체는 goat-anti-mouse IgG-HRP였으며, ECL 키트를 사용하여 검출하였다.
이상의 결과들은 도 5에 개시되어 있는 바, 도 5의 (a)는 전기영동 결과를, 도 5의 (b)는 western blotting 결과를 각각 보여주고 있다. 도 5에서 레인 M은 molecular marker를, 레인 1은 liver tumor를, 레인 2는 F/T-백신을, 레인 3은 45℃ 가열 백신을, 레인 4는 MD-J 백신을 각각 나타낸다.
도 5의 (a)에서 보는 바와 같이, 전기영동상에서 실험에 사용한 live tumor의 파쇄물과, 45℃ 가열 세포의 파쇄물은 유사한 전기영동 양식을 보여주었고, F/T-백신의 경우도 상당히 많은 단백질로 구성됨을 알 수 있다. 전기영동상에서, live tumor의 파쇄물, 45℃ 가열 세포의 파쇄물 및 F/T-백신은 상당히 많은 단백질 밴드를 보여줌으로써 서로간의 차이를 정확하게 비교할 수는 없지만, F/T-백신의 경우는 10만 이상 및 3만 이하의 밴드가 나머지 두 시료에 비하여 비교적 단순화된 형태를 보임을 알 수 있다. 그리고, live tumor의 파쇄물 및 45℃ 가열 세포의 파쇄물의 경우는 전기영동상에서 유의한 차이가 인정되지 않았다. 반면에, 본 발명의 MD-J 백신은 상기 대조군들에 비하여 상당히 단순화된 형태를 보여주었으며, 단백질의 주요 구성 분자량들로서 대략적으로 102, 78, 34, 29, 28 kDa의 5 개의 짙은 밴드가 확인됨으로써, 기타 대조군과의 전기영동상에서의 차이가 인정된다.
이러한 백신을 구성하는 각 단백질에 대한 특성 조사를 위하여 MD-J 백신의 면역에 의한 항체를 이용한 western blotting 실험을 실시하였다. MD-J 백신에 대한 항체는 MD-J 백신을 면역한 마우스에서 항혈청을 수집하여 제작하였고, 실험에 적용한 항체는 200배 희석액으로 실시하였다.
그 결과, anti-MD-J 백신 항체에 의한 western blotting의 결과는 흥미로운 사실을 제시하였다. 즉, 전기영동상에서 anti-MD-J 백신 항체와 반응하는 각 백신의 단백질들은 매우 제한적이며, 주로 62 kDa, 74 kDa 및 75 KDa의 3 가지 단백질임을 알 수 있었다. 우선, 항체와 반응한 약 62 kDa의 단백질은 처리온도 의존적인 경향을 보임으로써, 대조군으로 사용한 45℃ 가열 세포의 파쇄물에 비하여 진한 경향의 밴드를 보였다. 이러한 62 kDa의 단백질은 live cell 파쇄물 및 F/T-백신에서는 존재하지 않았다. 따라서, 이러한 62 KDa 단백질은 가열처리시 발현이 되며 생산정도는 가열온도가 높을수록 많이 생산되는 것으로 추측된다. 또한, 항체와 반응한 약 74 kDa의 단백질은 대조군으로 사용한 3 가지 백신인 live tumor의 파쇄물, 45℃ 가열 세포의 파쇄물 및 F/T-백신과 반응하여 밴드를 확인할 수 있었으나, 본 발명인 MD-J 백신에서는 발견되지 않았다. 그러나, 이와 분자량이 유사한 약 75 kDa에서 밴드가 MD-J 백신에서 유일하게 확인되었다. 따라서, MD-J 백신을 구성하는 단백질에서 가장 중요한 단백질 중의 하나는, MD-J 백신에 대한 항체와 특이적으로 반응하는 약 75 KDa의 단백질인 것으로 추측된다. 전기영동 결과 얻은 겔에서는 75 KDa의 단백질이 잘 확인되지 않았으나, western blotting 결과실질적으로 MD-J 백신의 파쇄물에 상당히 미량 함유되어 있는 것으로 생각된다. 이 단백질의 생화학적 특징으로 인해 reduction 및 non-reduction 상태의 전기영동에 대한 western blotting의 결과가 같은 양식을 보임으로써, 단백질의 구조는 monomer의 특성을 나타낸다.
결론적으로, MD-J 백신에서 항체와 반응하는 단백질은, 전기영동상에서 잘 나타나지 않는 미량의 단백질로서, 온도의 상승에 의해 유의적으로 많이 생성되는 62 kDa 및 MD-J 백신에서 특이적으로 나타나는 약 75 kDa의 단백질이며, 이는 항종양 면역을 유도하는데 있어 중요하게 작용하는 물질로 추측된다.
실시예 6: MD-J 백신에서 열충격 단백질(hps)의 발현 여부 확인
열(heat) 및 스트레스(stress) 등에 의해 세포로부터 발현되는 hsp는, 주로 마크로파지 및 DC에 작용하여, 선천적 면역계와 관련된 싸이토카인인 IL-12, TNF-α, IL-1β, IL-6 등을 생산케 함으로써, 항원제시능 및 NK-세포 등을 활성화시킨다. 이들의 항원제시 세포에 대한 긍정적 작용은 결국 항원제시 세포를 성숙시켜, 궁극적으로 이후의 면역 작동세포(effector cell)를 활성화시키는 항원 특이적인 면역작용을 유도하게 된다. 따라서, 본 발명의 방법에서 제조과정 중에 종양세포로부터의 hsp의 발현 여부의 측정은 종양 항원의 규명차원에서 중요한 의미를 가진다.
MD-J 백신에 hsp이 발현되었는지에 대한 본 실험은, MD-J 백신으로부터 생산된 세포 파쇄물에서 수용성 부분만을 원심분리(10,000 rpm/10 min)를 통해 분리하고, 전기영동 후에 anti-hsp70 항체를 이용한 western blotting을 실시하여 조사하였다. 이때, 대조군으로는 정상 및 45℃로 가열된 세포 파쇄물을 각각 사용하였다.
실험에 사용한 세포주는 colon 26-M3.1 carcinoma cell 및 U937 monocytes cell이었으며, 실험결과가 도 6에 개시되어 있다. 두 가지 세포들에서의 전기영동의 결과는 유사한 경향을 보여 주었다. 도 6에서 보는 바와 같이, 정상 세포 및 45℃ 가열처리 세포 파쇄물은 전기영동 겔의 전 영역에서 많은 밴드를 보여주고 있으나, MD-J 백신는 두 세포간에서 유사하게 몇몇 특이한 밴드의 형식을 보여 주었다. U937 cell의 여러 파쇄물과 anti-hsp70을 이용한 western blotting의 결과를 보면, 추출과정에서 스트레스를 받은 정상 세포 및 45℃ 가열처리 세포의 파쇄물에서는 항체와 반응하는 hsp70 밴드가 확인되었으나, U937 cell의 100℃ 가열처리의 경우는 항체와 특이하게 반응하는 밴드가 나타나지 않았다. 한편, colon 26-M3.1 carcinoma의 결과를 보면, anti-hsp70 항체와 반응하는 유효한 밴드는 관찰되지 않았다. 그러나, colon 26-M3.1 carcinoma의 경우, 사용한 anti-hsp70 항체와의 반응성이 없다는 것은 항체의 특이성에 기인한 결과로 판단된다. 또한, 최소한 U937 cell의 경우도 100℃의 가열처리에서는 hsp70이 발현되지 않은 결과로 볼 때, 본 실험에 사용된 colon carcinoma로 제조된 MD-J 백신내에서 hsp가 발현되지 않음을 간접적으로 확인할 수 있었다. 따라서, 이후의 활성실험에 나타난 MD-J 백신에 의한 항종양 면역의 유도는 최소한 hsp가 관여하지 않는 결과임을 강력히 시사한다.
실시예 7: 가열시간에 따른 DC로부터의 IL-12 (p40)의 유도능
hsp가 DC를 자극하고 IL-12를 생산함으로써 NK-세포 및 CD8+T 세포의 활성화를 유도한다는 것은 잘 알려져 있는 사실이다. 본 실험은 마우스(balb/c)에 실리카를 복강투여하여 얻은 DC(DC like cell)에 1.5×104cells의 MD-J 백신(DC : vaccine = 1 : 50)을 가하고 1 일간 배양한 후 얻은 상등액에서 생산된 IL-12를 조사한 결과이다. IL-12은 성숙 DC로부터 생산되므로 백신의 동시배양에 의한 DC의 IL-12 생산능은 DC의 항원제시능의 지표로 간주될 수 있고, 따라서 이후 면역반응의 주요한 지표로 될 수 있다.
실험 결과가 도 7에 개시되어 있는 바, MD-J 백신의 배양은 가열시간 의존적인 IL-12의 생산능을 보였으며, 60 분 가열시 정점을 이루지만, 이는 30 분의 가열시간과 유의적인 차이를 나타내지는 않았다. 한편, 도 7에 표시하지는 않았으나, DC 대조군(media 배양)은 54.6±0.8를 F/T-백신으로 자극된 상등액에서 176.1±7.1의 IL-12가 존재하였다.
이러한 결과는 상기 실시예 4의 표 1의 결과인 백신의 가열시간에 따른 항종양전이능에 대한in vivo결과를 지지한다. 또한, 실시예 6(도 6)에서 MD-J 백신이 hsp을 발현하지 않음을 확인하였으므로, DC를 성숙시켜 항원제시능을 유도하는 성분은 hsp이 아니고, MD-J 백신의 제조과정에서 새로이 나타난 75 KDa 등의 단백질이 포함된 성분임을 시사한다. 다만, 이러한 항종양 활성을 유도하는 항원이 상기 75 KDa만을 의미하는 것은 아니며 다른 분자량을 가지는 단백질일 가능성도 존재한다.
실시예 8: MD-J 백신에서 활성성분을 함유하는 분획의 확인
본 실험은 MD-J 백신에서 활성을 가지는 성분을 함유하는 분획의 탐색을 위한 실험으로서, MD-J 백신의 마크로파지 자극에 의해 배양 상등액에 함유되어 있는 TNF-α를 측정하였다. 본 실험에 사용한 마크로파지는 C57BL/6 마우스에 3% thioglycollate(TG)의 복강주사에 의하여 유도된 것을 사용하였다. 우선 항종양 면역을 유도하는 MD-J 백신의 성분이 가용성(soluble)인지 또는 불용성(non-soluble)인지를 확인하기 위하여, 원심분리(1000 rpm/5 min)에 의해 침전물 부분과 상등액 부분을 나누었다. 그 후, 제조된 세포가 주로 함유된 침전물 부분은 동량의 PBS를 재첨가하여 현탁시켰다. 상등액 부분은 다시 한번 원심분리(10,000 rpm/10 min)하여 상등액을 회수하고 0.2 ㎛의 공극(pore size)을 가진 필터로 필터링하였으며, 단백질 키트를 사용하여 단백질 농도를 정량한 후 4℃에서 저장하며 사용하였다. 단백질 정량 결과, 침전물을 PBS로 재현탁한 후의 상등액에는 검출한계(1 ㎍/㎖) 이하의 단백질이 함유되어 있었고, MD-J 백신 5×105/㎖로부터의 상등액에 함유되어 있는 용해성 단백질의 농도는 10 - 30 ㎍/㎖ (20 ㎍/㎖) 이었다.
MD-J 백신의 각 분획의 자극에 의한 TNF-α의 생산양식은 도 8a 및 8b에 개시되어 있다. 또한, MD-J 백신에 의한 마크로파지의 자극 활성이 혹시 오염된 내독소(endotoxin)에 기인한 결과인지를 확인하기 위하여, 10 ㎍/㎖의 polymicin을첨가한 후 측정한 결과가 도 9a 및 9b에 개시되어 있다.
실험 결과를 정리하면 다음과 같다. MD-J 백신과 MD-J 백신의 펠렛(pellet) 부분의 TNF-α 생산능을 비교한 결과, 펠렛 부분이 MD-J 백신보다 우수한 TNF-α의 생산능을 보였다 (도 8a 참조). 따라서, MD-J 백신의 제조과정에서 구조적으로 변한 암세포 자신이 면역계를 자극하는 활성부분으로 변화되었음을 시사하고 있다.
또한, MD-J 백신에서 펠렛 부분이 제거된 수용성 항원을 함유하는 상등액의 TNF-α 생산능을 조사하였다. 이 상등액 부분은 다시 분자량 5만의 공극을 가진 아미콘 필터(amicon filter)를 사용하여 >5만 및 <5만의 두가지 분획으로 분리하였다. 이들 두 분획의 단백질 분자량을 키트로 측정한 결과, 단백질을 함유하는 분획은 분자량 5만 이상(>5만)의 분획이었다. 따라서, 상등액인 Sup. 분획, >5만 및 <5만의 3 가지 분획에 대한 TNF-α 생산능을 조사하였다. 그 결과 Sup. 분획 및 >5만 분획은 유의적인 TNF-α 생산력을 가졌으며, 특히, 5만 이상의 분획이 Sup. 분획보다 높은 활성을 가지는 것으로 볼 때, TNF-α생산을 증진하는 물질은 5만 이상의 물질임을 추측할 수 있다.
한편, 앞서도 증명되었지만 Sur-백신의 경우는 마크로파지로부터 TNF-α 생산능이 전혀 없었고, 본 실험의 결과에 제시하지는 않았지만, Sur-백신은 TNF-α 생산능이 없음이 재입증되었다. 이러한 결과는, colon cell로부터 분비되는 수용성 물질은 마크로파지를 자극하는 활성이 없음을 의미하는 것이다. 그러나, MD-J 백신으로부터의 Sup. 분획이 TNF-α의 생산능을 가진다는 결과는, MD-J 백신의 제조과정중에서 면역자극활성을 가지는 물질이 세포로부터 유리되었다는 것을 의미한다. 즉, Sup. 분획에는 원래 면역자극활성을 가지는 물질이 없었지만, 백신의 제조과정에서 면역자극활성을 가지는 활성물질의 일부가 상등액으로 유리되었다는 것을 추론할 수 있었다. 즉, MD-J 백신은 제조과정에서 세포벽을 구성하는 단백질을 포함하는 물질이 원래상태에서 변형이 일어남으로써 마크로파지를 자극하는 활성을 획득하였고, 그러한 성분 중 일부는 PBS에 용해되며, 일부는 암자체가 아직 가지고 있는 성분으로 생각된다.
한편, MD-J 백신에 의한 마크로파지의 자극활성이 혹시 오염된 내독소에 기인한 결과인지를 확인하기 위하여, 10 ㎍/㎖의 polymicin(PM)을 첨가하고 측정하였다. 그 결과, polymicin의 처리는 대조군인 LPS의 경우에 70% 이상의 억제활성을 보였으나, MD-J 백신의 분획에 의한 활성이 감소되지 않음으로써, 본 실험에 의한 마크로파지의 자극활성이 내독소 오염으로 유발되는 것이 아님이 확인되었다 (도 9a 및 9b 참조).
실시예 9: MD-J 백신 및 각 분획의 면역에 의한 항종양전이 효과
실시예 8의 결과를 근거로 하여, 본 실험에서는 MD-J 백신 및 그의 각 분획인 Sup.-분획 및 펠렛 분획의 면역에 의한 항종양 면역의 유도활성을 colon 26-M3.1 cell을 이용하는 암전이 모델에 적용하였고, 그 결과를 하기 표 3에 개시한다.
| Treatment | Number of tumors | Inhibition % | Range | |
| Samples | Conc. | |||
| Untreated | PBS | 153±33 | - | 117 - 148 |
| MD-J 백신 | 5×105cells | 41±12 | 73.3 | 28 - 52 |
| Sup. 분획 | 20 ㎍ | 82±8 | 46.4 | 71 - 90 |
| Pellet 분획 | 5×105cells | 31±9 | 79.7 | 18 - 40 |
상기 표 3에서 보는 바와 같이, MD-J 백신은 약 73.3%의 암전이 억제효과를, 그의 분획인 Sup. 분획 및 펠렛 분획은 각각 46.4% 및 79.7%의 억제효과를 보였다. MD-J 백신과 펠렛 분획의 항종양전이 활성은 실시예 8의 TNF-α 유도능과 일치하는 결과를 보였으나, Sup. 분획은 일부 종양전이 억제활성을 유도하지만 이후의 실험(실시예 10)에서 제시한 Sur-백신과 유사한 항종양전이 활성을 보였다. 따라서, MD-J 백신에서 종양 면역능을 유도하는 성분은 주로 세포에 존재하는 물질로 판단된다.
실시예 10: 백신의 면역에 의한 동종 암세포의 항종양전이 활성
실험에 사용한 마우스는 제조된 백신의 colon 26-M3.1 lung carcinoma cell line과 동종인 Balb/c를 사용하였고, 수용성 백신인 Sur-Ag(Surface Ag)의 경우는 20 ㎍/mouse을 접종하였으며, 종양세포가 함유되어 있는 whole vaccine인 MD-J 백신, F-백신 및 F/T-백신의 경우는 5×105cells/mouse를 2 주 간격으로 총 3 회 접종하였다. 최종면역 2 주일 후에 배양중인 colon 26-M3.1 종양세포(2.0×104/mouse; 표 4a, 2.7×104/mouse; 표 4b)를 꼬리정맥을 통해 접종하였다. 종양접종 14 일 후에 마우스 희생시키고 폐를 회수하여 Bouin's 용액에넣고 종양의 colony를 염색한 후, lung tumor colony의 수를 측정하였다. 그 결과를 하기 표 4a 및 4b에 개시한다.
| Treatment | Number oftumors | Inhibition% | Range | |
| Group | Vaccineconc. | |||
| Tumor control | PBS | 31.3±13.1 | - | 57, 25, 15, 30, 24, 25, 31, 43 |
| F-백신 | 5×105cells | 18.4±7.6 | 41.2 | 14, 19, 11, 16, 34, 14, 21 |
| Sur-백신 | 20 ㎍ | 16.1±5.7 | 48.6 | 19, 10, 12, 11, 13, 16, 23, 25 |
| MD-J 백신 | 5×105cells | 1.3±1.4 | 95.8 | 3, 0, 0, 2, 2, 1, 0, 0, 1, 4 |
| F/T-백신 | 5×105cells | 23.5±6.8 | - | 20, 22, 19, 16, 32, 17, 29, 33 |
| Treatment | Number oftumors | Inhibition% | Range | |
| Group | Vaccineconc. | |||
| Tumor control | PBS | 110.6±11.5 | - | 94, 113, 110, 117, 130, 101, 109 |
| F-백신 | 5×105cells | 74.6±11.9 | 32.5 | 88, 67, 75, 59, 84 |
| Sur-백신 | 20 ㎍ | 82.0±10.0 | 25.9 | 71, 97, 85, 75, 82 |
| MD-J 백신 | 5×105cells | 2.4±1.9 | 97.8 | 3, 1, 3, 0, 5 |
| F/T-백신 | 5×105cells | 104.0±18.4 | - | 102, 131, 96, 89, 84 |
상기 표에서 보는 바와 같이, MD-J 백신의 경우, 2 회의 실험 모두에서 종양의 전이를 95% 이상 유의적으로 억제하는 결과를 얻었다. 실험 1에서는 대조군으로 사용한 F-백신, F/T-백신 및 Sur-백신 경우도 일부 유의한 활성을 나타냈으나, 실험 2의 경우에서는 유의적인 억제효과가 인정되지 않았다. 즉, 기존의 연구에의하면 암세포의 면역은 일부 항종양활성을 유도함이 알려져 있는바, 본 실험에서도 대조군으로 사용한 F-백신, F/T-백신 및 Sur-백신은 동물실험에서 일부 항종양 면역이 유도됨을 알 수 있었다. 즉, 실험적으로 종양 대조군의 경우 암전이가 약하게 실행된 실험 1의 경우에서는 통계적인 유의성이 있는 억제 효과가 인정되었고, 상대적으로 암전이가 많이 실행된 실험 2의 경우에는 통계적인 유의성은 있었으나 억제 비율이 상대적으로 낮은 결과를 보였다. 그러나, 동일한 조건에서 본 발명의 MD-J 백신의 경우, 실험 1 및 2에서 모두 90% 이상의 높은 항종양전이 활성이 유도됨으로써, MD-J 백신만이 유효한 항종양 면역을 유도함을 확인할 수 있다.
실시예 11: 백신의 면역에 의한 이종 암세포의 항종양전이 활성
이종 마우스에 대한 항종양 면역 유도를 실험전이 모델에서 조사하기 위하여, colon 26-M3.1 lung carcinoma cell (H-2d)의 MD-J 백신을 단상형(haplotype)을 달리하는 동종 마우스(allogenic mouse)인 C57BL/6 (H-2b)에 적용하였다. 면역은 실시예 10과 동일한 방법으로 행하였다. 면역 완료 후, C57BL/6 마우스 유래의 종양세포주인 B16-BL6 melanoma(4.5×104/mouse)를 꼬리정맥을 통해 접종하고 암전이 억제능을 조사하여 이종 암주에 대한 교차반응이 유도되는지를 확인하였다. 그 결과를 하기 표 5에 개시한다.
| Treatment | Number oftumors | Inhibition% | Range | |
| Group | Vaccineconc. | |||
| Untreated | PBS | 170±20 | - | 142, 177, 169, 164, 196 |
| F-백신 | 5×105cells | 152±22 | - | 129, 142, 157, 181 |
| Sur-백신 | 20 ㎍ | 134±16 | - | 132, 119, 150, (82) |
| MD-J 백신 | 5×105cells | 63±18 | 63.1 | 51, 52, 70, 91, 49 |
| F/T-백신 | 5×105cells | 162±20 | - | 164, 189, 155, 167, 133 |
상기 표 5에서 보는 바와 같이, 본 발명의 MD-J 백신(H-2d)은 단상종을 달리하는 동종의 동물인 C57BL/6의 유래의 종양세포 B16-BL6 melanoma(H-2b) 주에 대하여도 유의적인 항종양전이 활성을 보인 반면에, F-백신, Sur-백신 및 F/T-백신의 경우는 백신 활성이 유도되지 않았다. 이 결과로부터, 본 발명에 따른 MD-J 백신은 이종 암주에 대해서도 유효한 항종양 면역반응을 유도할 수 있음을 알 수 있으므로, 본 발명은 여러 종류의 암세포주, 특히, 전이력을 획득한 암주에 대하여 유의한 활성을 유도하는 것으로 확인되었다. 이러한 결과는, 본 발명의 방법으로 제조한 종양 백신이 실험에 적용하지 않는 여러 종류의 다른 암종들에 대해, 특히, 사람유래의 암에 대하여도 유효한 면역반응을 유도할 수 있다는 사실을 강력히 시사한다.
실시예 12: 백신 면역 마우스의 연명율 조사
본 실험에서는 colon 26-M3.1 세포주로부터 제조된 MD-J 백신을 포함하여 여러 대조군 백신들이 각각 면역된 마우스에 colon 26-M3.1 세포주를 접종한 후, 생존율에 미치는 활성을 조사하였다. 즉, 2 주 간격으로 각 백신(5×105/mouse)을 면역하고, 최종 면역 10 일 후에 colon 26-M3.1 lung carcinoma 세포(2.7×105/mouse)를 혈관주사한 후 연명율을 조사하였고 그 결과를 도 10에 개시한다. 도 10에서 보는 바와 같이, 대조군은 종양 접종 27 일째에 모두 폐사(24.5±1.6일)하였고, Sur-백신 면역군은 31 일(26.9±2.2 일)째에 모두 폐사하여, 두 군간의 유의성은 없었다. 그러나, 실험전이 모델에서 Sur-백신 면역군과 유사한 종양전이 억제능이 유도된 F-백신 면역군은 66 일째까지 생존마우스가 존재함으로써 다른 양상을 보여 주었다. 즉, Sur-백신 면역군은 종양 대조군에 비하여 통계적인 유의성이 없이 단지 4 일 정도의 연명효과만 인정되었으나, F-백신 면역군은 대조군에 비하여 유의한 담암 마우스(tumor bearing mouse) 연명율이 인정되었다. Sur-백신과 F-백신의 이러한 연명율 결과에 대하여 명쾌한 해석을 내릴 수는 없지만, 최소한 이하 실시예 14의 결과를 근거로, F-백신 면역의 경우에 유의적인 연명율이 유도된 것은 강한 NK-세포의 활성화에 기인한 결과로 추측된다. 이러한 현상에 대해서는 다음의 추론이 가능하다. 수용성인 Sur-백신의 경우,in vivo에서 면역원성이 있다 하여도 바로 마크로파지에 의한 항원의 제거가 일어났지만, F-백신의 경우는 세포의 면역에 기여하는 항원의 생체 잔류시간이 연장됨에 기인한 것으로 판단된다. 그러나, F-백신의 면역에 의한 생존율의 증진은, 하기 실시예 14의 결과에서 제시한 바와 같이, 항원 특이적인 면역증강 활성으로 인한 효과가 아니라, 항원의 잔류시간 연장으로 인한 NK-세포 활성화에 의한 것으로 판단된다. 이에 대한 확실한 연구는 앞으로 수행되어야 하지만, 만약 이 추론이 사실이라면, 이는 항종양 면역의 유도를 위하여 whole 백신의 면역이 수용성 항원의 면역보다 유용할 수 있고, 본 발명의 whole 백신 자체가 종양에 대한 면역증강제 활성(생체의 저장작용)을 유도할 수 있는 결과로도 해석이 가능하다.
한편, MD-J 백신의 경우는 F-백신을 포함하는 대조 면역군과 비교하여 높은 우수성을 보였는바, 종양접종 100 일 후에 70%의 마우스가 생존함으로써, 강력한 항종양 활성이 유도되었음을 알 수 있다. 이하 실시예 14의 결과에서, MD-J 백신에 의한 종양전이 억제효과는 NK-세포의 활성화와 무관함이 증명되었고, 따라서 MD-J 백신의 면역에 의한 담암 마우스의 생명연장율은 B 세포 및 T 세포가 관여하는 종양 특이적인 항종양 면역능의 유도로 인한 활성으로 추측되며, 이에 대해서는 다시 설명한다.
실시예 13: 항종양 활성의 연속성 실험
본 실험에서는 실시예 12에서 MD-J 백신의 면역으로 인해 생존한 마우스에 암을 재접종하고, 14 일 후에 종양에 형성된 암괘의 숫자를 평가하였다. MD-J 백신이 면역된 마우스에서 종양 특이적인 항종양 면역능이 유도되었다면, 이후 동일한 항원인 colon 26-M3.1 lung carcinoma에 노출시, 유효한 방어효과를 유도할 것이다. 따라서, MD-J 백신의 면역 마우스와 동일한 연령의 새로운 마우스를 종양 대조군으로 사용하고 실시예 12의 생존 마우스를 사용하여, 이를 실험전이 모델에 적용함으로써, 항종양 면역의 유도능에 대한 실험을 실시하였다. 그 결과를 하기 표 6에 개시한다.
| Treatment | Number oftumors | Inhibition% | Range |
| Group | |||
| Tumor control | 43.6±6.6 | - | 42, 52, 35, 48, 37, 41, 50 |
| MD-J 백신 | 0.4±0.5 | 99.1 | 0, 0, 1, 0, 1, 1, 0 |
상기 표 6에서 보는 바와 같이, MD-J 백신의 면역 후에 종양을 이식하고 100 일 후에 다시 살아있는 암주의 재접종시 99.1%의 암괘 형성을 억제하였다. 이 결과는, MD-J 백신의 면역이 숙주의 종양에 대한 항원특이적인 면역능을 유발하며, 그 활성은 최소한 100 일 이상 유지된다는 것을 보여준다. 이는 MD-J 백신의 면역이 종양에 대한 항종양 면역 유도를 확실하게 증명하는 것으로서, 일단 본 발명의 MD-J 백신을 투여할 경우, 숙주는 항원에 대한 기억력을 획득함으로써, 예방접종으로의 개발 가능성을 제시하고 있다. 즉, MD-J 백신의 면역은 종양에 대한 면역력을 획득한 후, 일부 세포를 항원에 대한 기억세포로의 전환을 충실하게 유도함으로써, 이후에 종양세포와 접촉할 경우에 강한 종양 면역을 유발하여 종양에 대항하는 것으로 추측된다.
실시예 14: NK-세포가 제거된 마우스에서 종양 백신에 의한 항종양전이 억제 활성
항종양 활성을 나타내는 작동세포 중에서, 종양 비특이적인 것으로서 NK-세포와 종양 특이적인 것으로서 세포독성 T 세포(cytotoxic T-cell)를 들 수가 있다. 본 실험은 각 종양 백신에 의한 항종양 활성의 유도에 의한 작동세포가 종양 특이적인 면역세포에 의한 것인지 또는 다른 작용기전(항원 비특이적 NK-세포 등)에 기인한 활성인지를 확인하기 위한 것이다. 각 백신의 면역 과정과 사용한 마우스는 실시예 10에서와 동일하다. 실험 마우스에서 NK-세포의 제거를 위하여 anti-asialo GM-1 항체를 이용하였다. 즉, 종양접종 3 일 및 1 일 전에 각각 20 배로 희석된 anti-asialo GM1 항체를 꼬리정맥에 투여하였고, 이후 백신이 면역된 마우스의 항종양 전이활성 유도를 확인하였다. 그 결과를 도 11에 개시한다.
즉, anti-asialo GM1 항체를 처리하지 않은 정상 마우스에 종양만을 접종한 경우는 약 157 개의 암괘가 폐에 형성되었다. 그러나, anti-asialo GM1 항체를 처리한 군에서는 그보다 3 배 이상인 약 371 개의 암괘가 형성이 되었으므로, 항체 처리에 의한 NK-세포의 제거는 우수하게 이루어져 있음을 확인하였다. 정상 마우스에 MD-J 백신을 면역한 경우는 약 4 개의 암괘만이 형성되어 우수한 백신 활성이 유도되었음을 확인할 수 있고, F-백신의 경우에도 약 21 개의 암괘만이 형성이 되어 유의적인 항종양전이 활성이 유도되었음을 확인할 수 있다. 그러나, MD-J 백신 면역이 F-백신 면역에 비하여 우수한 항종양 활성을 보임은 실시예 9의 결과와 유사하다.
다만, 이들 백신으로 NK-세포가 제거된 마우스를 면역한 경우는 완전한 차이를 보이는 바, MD-J 백신 면역으로 4 개의 암괘가 형성되었고 F-백신 면역으로 171 개의 암괘가 형성되었음을 확인할 수 있었다. 이는, MD-J 백신 및 F-백신의 면역에 의한 항종양전이 활성의 유도가 각기 다른 기작으로 이루어짐을 의미하는 것으로서, 이후의 실험에서 중요한 의미를 제시한다. 즉, MD-J 백신 면역은 종양에 대한 항원 비특이적인 작동세포중의 하나인 NK-세포의 활성화와는 관계가 없는 종양특이적인 면역계가 활성화된 것을 간접적으로 시사하는 반면에, F-백신 면역에 의한 항종양전이 활성의 유도는 최소한 anti-asialo GM1 항체와 반응하는 NK-세포가 주로 관여한다는 것을 보여준다.
실시예 15: 각 백신의 마크로파지로부터의 TNF-α 생산 및 증식 활성
마우스 복강세포(peritoneal exaudative cells; PEC)의 자극에 관한 실험은 정상 마우스의 복강세포에 직접자극 및 3% thioglycollate의 복강투여에 의하여 유도된 복강세포 두 가지로 실시하였다.
도 12는 정상 마우스로부터 복강세포를 취하여 각 백신으로 자극한 후 배양 상등액에 유도된 TNF-α의 생산 양식을 보여주고 있다. 마우스의 복강내에 존재하는 마크로파지는 성숙한 상태 또는 비성숙 상태로 존재하고 있음은 이미 잘 알려져 있다. 따라서, 정상 마우스로부터 복강세포를 회수하고,in vitro에 플레이팅한 후 배양용기에 붙어 있는 마크로파지의 특성을 가지는 세포만을 분리한 후, MD-J 백신, F-백신 및 F/T-백신을 첨가하여 복강세포와 3 일간 배양하였다. 배양완료 후에 복강세포의 활성화 정도는 배양 상등액에 존재하는 TNF-α의 양과 MTT법으로 증식활성을 측정함으로써 확인하였다. TNF-α는 pre-effector T 세포를 immunocompetent T 세포로 전환시키고, T 세포로부터의 IFN-γ의 생산을 증진시킴으로써, 항종양 면역을 유도하는 작용을 한다. 따라서, 마크로파지를 포함하는 복강세포로부터 MD-J 백신의 TNF-α 생산능은 이후 종양에 대한 항원 특이적 면역 증강능의 유도에 직접적인 영향을 줄 것으로 생각된다. 도 12로부터 확인할 수 있는바와 같이, 정상 마우스의 복강세포를 자극하여 가장 높은 TNF-α 생산 활성을 보인 군은 MD-J 백신이고, F-백신과 F/T-백신도 유의적인 TNF-α 생산능을 보였지만, MD-J 백신에 의한 생산량과 비교하여 50% 이하였다. 또한, 도 13의 복강세포의 백신 처리에 의한 증식 실험결과도 TNF-α의 생산능과 동일한 경향을 보임으로써 도 12의 결과를 지지하였다.
도 14a는 3% thioglycollate(TG)의 복강주사에 의해 유도된 마크로파지를 자극한 실험 결과를 보여주고 있다. 1 ㎖의 TG를 복강주사하고 3 일 후에 복강세포를 취하여 24-well 플레이트의 well 당 1.5×106/㎖의 농도로 플레이팅하고 2 시간 배양 후에 세포를 배양배지로 세척하였다. 그런 다음, MD-J 백신을 포함한 각 백신을 well 당 5×105/㎖의 농도로 첨가하고 24시간 배양하였다. 배양 완료 후에 상등액을 회수하고 각 상등액에 생성된 싸이토카인의 양을 ELISA 키트를 이용하여 측정하였다. 도 14a에서 보는 바와 같이, MD-J 백신 및 live colon 세포와 동시 자극한 경우는 2767.9 및 2322.6 pg/㎖의 높은 TNF-α 생산성을 보인 반면에, 대조군 백신인 F-백신과 F/T-백신은 각각 686.1 및 791.3 pg/㎖ 생산성을 보였다. 따라서, 마크로파지의 자극에 의한 TNF-α의 생산성은 MD-J 백신의 경우가 3배 높은 생산성을 보임으로써, TG 처리하지 않은 정상 마크로파지의 자극결과와 동일한 경향을 보였다. 한편, Sur-백신의 경우는 배양배지만으로 배양한 대조군과 유사한 10 pg/㎖ 이하의 TNF-α 생산성을 보였다. 이러한 결과는, MD-J 백신의 경우가 다른 대조군 백신들에 비하여 직접적으로 마크로파지 자극 활성이 높음을 의미한다.
또한, 도 14b는 IL-12의 생산성을 확인한 결과를 보여주고 있는 바, TNF-α의 결과와 동일한 경향을 보인다. IL-12는 주로 활성화된 대식세포 또는 DC에서 생산되는 싸이토카인으로서, NK-세포 또는 Th1 type 세포의 활성화에 작용하므로, 항종양 면역에서 자연 및 획득 면역계의 활성화에 중요한 요소로 작용한다. 따라서, MD-J 백신의 IL-12 유도 생산능에 대한 이러한 우수성은, 면역반응의 개시단계인 마크로파지의 활성화 단계를 포함하여 이후 종양 특이적인 항종양 면역의 유도기전을 설명함에 있어 중요한 요소이다.
실시예 16: 백신 면역 마우스로부터 비장세포의 백신 재자극 실험 및 싸이토카인 유도 양식
재자극 실험을 위한 MD-J 백신 또는 F-백신의 농도는 각각 5×105, 5×105및 5×103/mouse 이였으며, 2 주 간격으로 총 3 회 피하주사법으로 면역하였다. 최종면역 10 일 후에 각 면역 마우스로부터 분리한 비장세포(5×105)에 1×105/well의 MD-J 백신을 첨가하고in vitro에서 3 일간 재자극한 후 MTT법으로 세포증식 활성을 조사하였다. 재자극 활성의 실험을 위한 대조군으로는 T 세포의 유사분열물질(mitogen)인 Con-A(최종농도 5 ㎍/㎖)를 사용하였다. 실험 결과가 도 15에 개시되어 있다.
Con-A의 처리군에 있어서, 정상 마우스 또는 각 백신이 면역된 마우스로부터의 비장세포 증식 활성이 유사한 결과를 보여줌으로써, 본 실시예의 재자극 실험은정상적으로 유도되었음을 확인하였다. MD-J 백신으로 재자극한 군의 실험결과, MD-J 백신을 면역한 마우스의 비장세포 증식활성에 있어서, 5×105및 5×104cells를 면역한 경우에는 증식활성이 인정되고, 5×103cells를 면역한 경우에는 유의적인 증식활성이 인정되지 않는 등 면역 백신의 농도 의존적인 증식활성을 보였다. 그러나, F-백신을 면역한 군의 경우는 정상 마우스의 경우와 유사한 OD 값을 보임으로써 재자극 활성이 유도되지 않았다.
재자극 활성이 MD-J 백신의 면역군에서만 유도되고 F-백신의 면역군에서는 유도되지 않는다는 사실은, MD-J 백신의 세포성 면역반응의 유도를 설명할 수 있는 것으로서, 실시예 13 및 14의in vivo결과를 지지하는 것으로 판단된다. 한편, 실험전이 모델에서 주로 NK-세포의 활성화에 기인한 항종양 활성을 나타낸 F-백신의 경우, 항원 재자극에 의한 비장세포 증식활성은 유도되지 않았다. 이러한 MD-J 백신의 면역증강 작용기전 실험으로 배양 상등액에 생산된 싸이토카인의 유도 양식을 조사하였다.
싸이토카인의 유도 양식은 각각 MD-J 백신 및 F-백신 면역 마우스의 비장세포를 MD-J 백신으로 3 일간 재자극한 후 측정하였다. 이러한 항원 특이적(백신 특이적) 싸이토카인의 양식은 생산하는 T 세포에 따라 Th1 싸이토카인 및 Th2 싸이토카인으로 분류한다. Th1 type의 싸이토카인은 주로 IFN-γ, GM-CSF, TNF-α 등이며, Th2 type의 싸이토카인은 IL-4, IL-10 등이다. Th1 싸이토카인은 주로 CD8+CTL 세포의 활성화를 포함하는 세포성 면역능의 증진을 유도하며, Th2 type 싸이토카인은 주로 항체생산에 관여하는 체액성 면역능을 증진시키는 것으로 알려져 있다. 실험 결과, 재자극 없이 각 비장 세포를 배양배지 하에서 배양한 후의 싸이토카인의 유도 양식과 MD-J 백신으로 재자극한 유도 양식을 비교하여 보면, 재자극에 의한 싸이토카인의 생산이 증가한 결과를 보였고, 증진되는 싸이토카인의 유도양식 경향은 유사하였다. 즉, Th1 type 싸이토카인인 IFN-γ, GM-CSF 및 IL-2와 Th2 type 싸이토카인인 IL-4, IL-10 및 IL-6의 모든 경우, 주로 MD-J 백신의 면역 경우가 F-백신의 면역 경우에 비하여 우수한 유도양식을 보이고, 그 활성은 면역한 MD-J 백신의 농도 의존적인 경향을 나타내었다(도 16a - 16d 및 하기 표 7 참조, 도 16b와 16d는 재자극 실험 결과를 나타냄). 특히, 실험에 적용한 여러 종류의 싸이토카인 중에서 CTL의 활성과 직접 관련있는 IFN-γ의 생산과 항원제시 세포인 수지상 세포의 항원제시능의 상승에 직접 영향을 주는 GM-CSF의 생산이 MD-J 백신 면역마우스의 비장세포에서 높게 나왔다는 점은, MD-J 백신의 항종양 활성이 주로 CTL의 직접적인 활성화 또는 헬퍼 T 세포를 경유하는 cross-priming에 의한 CTL의 활성화에 기인한 결과임을 보여주는 것으로 판단된다.
한편, 본 발명에서도 MD-J 백신의 면역에 의한 Th2 type 싸이토카인은 이후 종양 특이적인 항체생산과 관련이 있을 것으로 생각되며 이들 항체는 주로 항체의존성세포살해능(antibody dependent cellular cytotoxicity; ADCC)등에 의한 항종양 활성을 유도할 것으로 추론된다. 다만, 현재 이들 Th2 type 싸이토카인도 일부의 학자들이 세포성면역능의 증진에도 관여함을 보고하고 있는 바, 본 백신에 의한 Th2 type 싸이토카인에 의한 CTL의 유도에 조력인자로서의 역할을 함을 전혀 배제할 수는 없다.
| Cytokine | No. ofimmunized | F-백신 immunized | MD-J 백신 immunized | ||
| with media | with MD-J 백신 | with media | with MD-J 백신 | ||
| IFN-γ;(OD value) | 0; normal | 0.046±0.003 | 0.051±0.001 | 0.046±0.003 | 0.051±0.001 |
| 5×103 | 0.057±0.004 | 0.161±0.013 | 0.086±0.004 | 0.179±0.013 | |
| 5×104 | 0.056±0.005 | 0.145±0.012 | 0.320±0.006 | 0.351±0.027 | |
| 5×105 | 0.047±0.004 | 0.079±0.004 | 0.217±0.025 | 0.311±0.013 | |
| GM-CSF | 0; normal | 0.5±0.8 | 0.5±0.7 | 0.5±0.8 | 0.5±0.7 |
| 5×103 | 2.6±0.4 | 64.8±0 | 32.8±1.6 | 79.7±2.0 | |
| 5×104 | 6.5±0 | 58.3±3.6 | 300.0±18.7 | 258.1±1.3 | |
| 5×105 | 0.6±0.6 | 7.3±2.2 | 190.1±2.4 | 201.3±1.2 | |
| IL-2 | 0; normal | 4.2±0.8 | 11.0±0.9 | 4.2±0.8 | 11.0±0.9 |
| 5×103 | 137.0±1.4 | 192.9±5.7 | 162.3±5.2 | 162.3±5.1 | |
| 5×104 | 134.0±7.2 | 164.2±4.1 | 263.4±6.8 | 263.4±6.8 | |
| 5×105 | 65.9±3.4 | 159.5±4.1 | 271.8±10.5 | 268.8±4.0 | |
| IL-4 | 0; normal | 24.5±2.2 | 65.1±16.7 | 24.5±2.2 | 65.1±16.7 |
| 5×103 | 22.9±4.5 | 77.7±11.6 | 35.6±5.5 | 63.3±14.1 | |
| 5×104 | 34.4±0 | 88.2±13.3 | 228.1±3.1 | 354.6±6.4 | |
| 5×105 | 47.6±8.0 | 86.1±20.8 | 228.1±3.1 | 276.4±10.8 | |
| IL-10 | 0; normal | 1.0±0 | 50.9±0 | 1.0±0 | 50.9±0 |
| 5×103 | 15.7±12.4 | 77.6±2.6 | 6.9±3.7 | 22.9±2.2 | |
| 5×104 | 18.3±0 | 86.8±0 | 1025.9±105.7 | 1134.7±62.8 | |
| 5×105 | 6.9±0 | 75.8±5.2 | 951.2±0 | 1005.2±76.4 | |
| IL-6 | 0; normal | 1.0±3.0 | 1.0±2.0 | 1.0±3.0 | 1.0±2.0 |
| 5×103 | 1.5±3.0 | 454.2±0 | 1.5±2.1 | 409.8±24.6 | |
| 5×104 | 1.1±2.0 | 507.9±37.9 | 221.9±59.0 | 767.5±29.2 | |
| 5×105 | 1.2±2.0 | 117.3±37.6 | 101.0±14.6 | 671.4±64.1 |
실시예 17: 백신 면역 후 암접종한 마우스로부터 비장세포와 암세포의 배양에 의한 싸이토카인 유도 양식
본 실험에서는, 각 백신의 면역 마우스에 살아있는 종양세포(colon 26-M3.1 cells)를 접종한 후 분리한 비장세포와 살아있는 종양세포(colon 26-M3.1 cells; 1×103/well)의 동시배양에 의한 싸이토카인 유도 양식을 조사하였다. 본 실험에서의 MD-J 백신은 colon 26-M3.1 lung carcinoma의 불활성화 암세포이다. 실시예 16에서, MD-J 백신의 면역이 MD-J 백신에 대한 세포성 면역인 비장세포의 증식활성을 유도하고 그 작동기전은 Th1 및 Th2 type의 싸이토카인의 생성에 기인되는 면역반응임을 확인하였다. 그러나, MD-J 백신은 결국 생체내에서 암세포에 대한 작동세포의 활성화를 유도하여야 하고, 따라서in vivo에서 종양에 대한 전이 또는 증식에 대한 방어력이 유도되어야 한다. 따라서, 살아있는 종양세포인 colon 26-M3.1 cell에 대한 면역반응이 MD-J 백신의 면역에 의해 유도됨을 확인하기 위하여, 본 실험에서는 MD-J 백신이 면역된 마우스의 비장세포의 살아있는 종양세포에 대한 반응성을 면역매개 물질인 싸이토카인의 유도 양식으로 확인하였다.
본 실험의 결과에서, 살아있는 종양세포의 재자극은 MD-J 백신 면역 마우스의 비장세포 및 F-백신 또는 F/T-백신 면역 마우스의 비장세포로부터 높은 양의 INF-γ 생산을 유도하였다. 즉, 대조군인 재자극 없는 비장세포만의 결과는 실시예 16과 동일한 경향을 보임으로써, MD-J 백신 면역 마우스, F-백신 또는 F/T-백신 면역 마우스 및 정상 마우스의 순으로 IFN-γ 생산능을 보였다. MD-J 백신 면역 마우스에 대한 살아있는 종양세포의 자극은 배양액에서 약 10 배의 많은 량의 INF-γ를 유도함으로써, MD-J 백신 면역이 특히 살아있는 종양에 대해 높은 면역 반응성을 유도함을 확인하였다. 즉, MD-J 백신 면역은,in vivo의 실험결과에서 나타난 바와 같이, 종양의 전이를 90% 이상 충분히 억제할 수 있는 항종양 면역반응을 유도한다는 사실이 입증되었다.
한편, F-백신 및 F/T-백신 면역의 경우도 살아있는 종양세포의 재자극에 의해 IFN-γ의 생산을 증가시켰으나, 그 량은 모두 MD-J 백신 면역의 약 1/2 배 이하였다. 이는, F-백신 면역이 연명율 실험결과에서처럼, MD-J 백신 면역보다 낮은 항종양 면역반응을 유도하지만, Sur-백신 또는 백신 무처리 대조군의 경우에 비하여 일정한 종양 억제능이 있음을 확인시키는 것이며, 다른 연구자들이 언급한 것처럼, 불활성화된 whole tumor 백신(apoptotic 혹은 necrotic cell)은 어느 정도 유의적인 항종양 면역반응을 유도함을 나타낸다.
이러한 경향은, 도 16c에서 보는 바와 같이, APC의 항원제시능을 높이는 동일한 Th1 type 싸이토카인인 GM-CSF의 생산양식에서도 동일하게 나타났다. 다만, live cell의 재자극없는 배양배지만의 비장세포에서도, MD-J 백신의 경우가 F- 및 F/T-백신의 경우보다 유의하게 높은 GM-CSF의 생산양식을 보였다. 결국, MD-J 백신 면역 마우스는 종양이 존재하는 경우에 살아있는 종양에 대해 지속적인 항원제시를 함으로써 종양이 생체에 존재하는 한 계속적인 면역능을 유도하는 결과로 추측된다.
한편, Th2 type의 싸이토카인인 IL-4 및 IL-10은 CD8+T 세포의 활성을 억제하고 B 세포의 항체생성을 유도하는 싸이토카인으로 알려져 왔으나, 최근의 여러연구들에서 이들 IL-4 및 IL-10이 세포독성 CD8+의 유도 및 활성 유지에 관여한다는 것이 밝혀지면서, 이들 싸이토카인의 생리활성에 대해 새로운 논란이 제기되고 있다. 본 발명의 MD-J 백신의 항종양 면역의 유도 활성과 관련한 이들 싸이토카인의 유도 양식을 아직 정확하게 설명할 수는 없지만, MD-J 백신의 항종양 면역의 유도에 의한in vivo에서의 종양전이 억제 효과는, 도 17a에서 보는 바와 같이, IL-4 및 IL-10 등의 Th2 type 싸이토카인에 의한 B 세포의 활성화를 포함하여 CTL 활성의 조력 인자로서의 활성화 측면도 포함될 것으로 추측된다. 특히, IL-10의 유도양식은, 도 17b에서 보는 바와 같이, 살아있는 종양의 재자극이 있는 경우가 비장세포 단독의 경우에 비하여 정상 대조군, F-백신 및 MD-J 백신 면역의 모든 군에서 생성이 증진되는 경향을 보였으나, 유도되는 IL-10의 양은 정상 대조군 및 F-백신과 F/T-백신 대조군이 유사한 경향을 보였고, MD-J 백신 군은 이들보다 2 배 이상의 높은 생산을 보였다.
실시예 18: 백신 면역 마우스의 종양전이 실험 후 비장세포의 백신 재자극에 의한 증식 활성
각 백신의 면역 마우스로부터 비장세포를 회수하여 재자극 실험을 실시하였다. 실험에 사용한 백신은 MD-J 백신, F/T-백신 및 F-백신이었으며, 면역은 각각 3 회 실시하였다. 최종면역 2 주 후에 마우스에 colon 26-M3.1 lung carcinoma를 접종하고, 접종 2 주 후에 마우스를 희생시켜 비장을 멸균적으로 회수한 다음,homogenizer를 이용 mono-cell로 만들고, 이를 96 well plate의 각 well에 2.5×105/well/100 ㎕가 되도록 분주하였다. 대조군으로는 백신을 면역하지 않은 정상 마우스 및 백신을 면역하지 않고 종양만을 접종한 마우스의 비장세포를 사용하였다. 각각의 비장세포에 배양배지만 처리한 군, B-백신(104/well)으로 재자극한 군, T 세포의 mitigen인 Con-A(최종농도 5 ㎍/㎖)로 재자극한 군으로 각각 나누어 실험을 실시하였다. 배양기간은 3 일이었고, 비장세포의 증식은 MTT법으로 조사하였다.
실험결과가 도 18에 개시되어 있는 바, 실시예 16의 백신면역 후의 실험결과와 동일한 경향을 보였다. 즉, 각각의 비장세포에 배양배지만을 첨가하고 배양한 결과에서, 정상 마우스의 비장세포는 0.33 정도의 OD 값을 보인 반면에, 종양처리 대조군, F/T-백신 및 F-백신이 면역된 마우스의 비장세포는 0.37-0.40 정도의 OD 값을 보임으로써, 정상군에 비하여 약간 높은 정도의 증식활성을 보였으나, 유의적인 차이는 아니었다. 반면에, MD-J 백신이 면역된 마우스의 비장세포는 0.64 정도의 OD 값을 보임으로써, 재자극 항원의 존재와 상관없이 정상군에 비하여 유의적인 증식 활성을 보였다. 이러한 결과는, 백신 면역 마우스에 살아있는 암종을 접종한 후의 결과이므로, MD-J 백신 면역군의 비장세포는 계속하여 종양의 자극을 받고 있으므로 재자극 백신이 없어도 이미 활성화 상태를 유지하지만, 대조군으로 사용한 기타 백신의 경우는 살아있는 암종세포에 대한 유의한 면역반응이 유도되지 않음을 의미한다.
한편,in vitro에서 MD-J 백신으로의 재자극 실험 결과에서, 정상 비장세포, 종양 대조군, F/T-백신 면역군 및 F-백신 면역군의 비장세포는 재자극원인 MD-J 백신에 대하여 비장세포 증식활성을 유도하지 못하였고, MD-J 백신의 면역 비장세포는 자극원(stimulant)에 대한 재자극 활성을 나타내어 증진된 OD 값을 보임으로써, MD-J 백신은 종양 특이적인 비장세포 증식 활성이 있음을 확인하였다. 실험에 적용한 모든 군에서 T 세포 자극인자인 Con-A로의 자극은 정상 대조군뿐만 아니라 MD-J 백신 및 F-백신 대조군의 면역 비장세포에 증식 활성을 유도하여 모두 유사한 정도의 증식 활성을 보임으로써, MD-J 백신의 재자극만이 종양에 특이적인 증식활성을 유도한다는 사실을 확인하였다.
실시예 19: 백신 면역 마우스의 암전이 실험 후의 항체 생산 및 그의 subisotype 결정
백신 면역 마우스를 이용한 암전이 실험을 종료한 후, 혈액으로부터 종양 항원에 대한 항체가를 ELISA법으로 측정하였다. 구체적으로, MD-J 백신의 수용성 물질을 원심분리를 통해 분획하고 단백질 농도를 측정(Bio-Rad protein assay Kit)하였다. MD-J 백신 상등액의 단백질 농도를 500 ㎍/㎖의 농도로 하여 ELISA 플레이트의 각 well에 코팅 버퍼(pH 8.6 bicarbonate buffer)를 이용하여 부착한 후, 각 군의 마우스 혈액을 ×100부터 3배 희석법으로 희석하여 첨가하였다. 그런 다음, 마우스의 IgG1 또는 IgG2 type에 대한 2차 항체에 HRP가 접합된 컨쥬게이트(conjugate)를 첨가하고 기질로서 TMB 용액(Sigma Ltd)을 이용하여 발색하였다. 발색의 정지는 2M H2SO4용액을 첨가하여 실시하였고, 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과가 도 19a 및 19b에 개시되어 있다. 항체가는 MD-J 백신 면역 마우스에서 가장 높았고 나머지 군은 유사한 경향을 보였다. 상기 결과는 항혈청의 300배 희석액의 결과이다. 결과에 제시한 바와 같이, 정상 대조군, 종양처리 대조군 및 F-백신 면역군의 IgG1 및 igG2 type의 항체가는 유사한 반면에, MD-J 백신 면역군의 항체가는 유의적으로 높은 결과를 보였다. 종양 특이적으로 생성된 항체가 실제로 체내에서 어떠한 역할을 수행하는 지에 대한 결과는 없지만, 최소한 본 발명의 MD-J 백신은 종양에 대한 체액성 면역능을 유도함을 알 수 있다.
실시예 20: 자연전이 모델에서 백신의 면역에 의한 담암숙주의 치료 및 연명 효과
C57BL/6 마우스에 B16-BL6 melanoma의 footpad 접종에 의한 자연전이(spontaneous metastasis) 모델에서 F/T-백신 및 MD-J 백신의 면역에 의한 종양의 증식 및 전이에 미치는 활성을 조사하였다. 백신의 면역은 B16-BL6를 이용하여 제조한 MD-J 백신을 2 주 간격으로 총 3 회 면역(5×105cell/mouse)하였고 최종면역 10 일 후에 살아있는 B16-BL6를 마우스의 발바닥(footpad)에 피하(s.c.)주사로 이식(5×105cell/mouse) 하였다. 종양 이식 21 일 후에 종양의 이식부위(종양 원발소)를 수술적으로 제거하여 종양의 크기를 측정하였고, 원발소의 제거 14 일 후에 마우스를 희생시켜 폐로 전이하여 성장한 종양의 군집수를 측정하였다.그 결과를 하기 표 8에 개시한다.
| Treatment | Tumor growth | No. of lung metastasis | |
| Group | Size of primary tumor (mm)(mean±SD) | Mean±SD(Inhibition %) | Range |
| Untreated | 9.34±0.94 | 58.5±10.6 | 42, 58, 48, 71, 68, 52, 60, 69 |
| F-백신 | 8.16±1.43 | 47.3±7.5 | 44, 45, 51, 60, 38, 45, 55, 40 |
| F/T-백신 | 8.49±1.09 | 42.0±10.7 | 35, 30, 42, 60, 56, 33, 40, 39 |
| MD-J 백신 | 7.69±1.23 | 9.4±5.4 (83.9) | 6, 12, 8, 9, 5, 21, 4, 10 |
상기 표 8에서 보는 바와 같이, F-백신 및 F/T-백신은 종양의 원발소의 크기를 일부 억제하였으나, 종양 원발소로부터의 자연전이는 억제하지 못하였다. 한편, MD-J 백신은 이식된 종양 원발소의 크기를 유의하게 억제하였고, 동시에 종양의 전이를 대조군에 비하여 83.9% 억제하는 활성이 인정됨으로서 MD-J 백신의 면역은 종양의 증식 및 전이에 대하여 유효한 활성을 나타냄을 알 수 있다.
실시예 21: 각 백신 면역 마우스로부터 얻은 비장세포의 입양면역에 의한 종양전이 치료효과의 유도
MD-J 백신의 면역에 의한 항종양 면역의 유도가 종양 특이적인 작동세포에 의하여 유도됨을 확인하기 위하여, 백신 면역 마우스의 비장세포를 입양면역 하였다. 즉, balb/c 마우스에서 MD-J 백신 및 F/T-백신을 각각 3 회 피하(s.c.) 면역하고 최종면역 10일 후에 살아있는 colon cell을 혈관주사(i.v. inoculation, 2.5×104/mouse)법으로 이식 후 14 일 된 마우스의 비장세포를 이용하여 입양면역에 의한 항종양활성을 측정하였다. 입양면역에 의한 항종양 활성의 측정은 colon 26-M3.1 carcinoma를 이용하는 실험전이 모델 혈관을 이용하였다. 즉, 정상 마우스에 살아있는 colon 26-M3.1 cell을 혈관 주사로 이식하고, 3 일 후에 각 백신이 면역된 마우스로부터의 비장세포(2×106/mouse)를 혈관주사하였다. 실험결과를 하기 표 9에 개시한다.
| Passive immunizedLymphocytes | No. of lung metastasis | ||
| vaccin immunization | Survial mouse after tumor inoculation | Mean±SD(Inhibition %) | Range |
| Control | 134.4±12.2 | 136, 128, 152, 119, 137 | |
| Normal mouse | 130.4±16.7 | 116, 109, 146, 139, 142 | |
| Tumor inoculated mouse | 120.0±17.5 | 135, 105, 136, 126, 98 | |
| X-vaccine; s.c. | tumor i.v. inoculated | 12.2±5.1 (90.9) | 15, 12, 9, 19, 6 |
| F/T-vaccine; s.c. | tumor i.v. inoculated | 126.4±17.0 | 119, 132, 153, 109, 119 |
상기 표 9에서 보는 바와 같이, 정상 마우스의 비장세포 또는 종양이 접종되고 14 일 후의 마우스로부터 얻은 비장세포를 이용한 입양면역에 의한 종양전이의 치료적 효과는 대조군과 비교하여 인정되지 않았다.
한편, MD-J 백신 및 F/T-백신을 피하 면역하고 종양세포를 혈관주사법으로 접종한 후에 생존한 마우스의 비장세포를 이용한 입양면역은 MD-J 백신 처리군에서만 90.9%의 유의적인 종양전이 억제능이 인정됨으로써, MD-J 백신의 면역은 종양 특이적인 세포성 면역능을 유도에 기인되는 결과임을 확인하였다.
실시예 22: CD4 또는 CD8 T cell 제거 마우스에서의 종양전이억제 효과
본 실험에서는 MD-J 백신의 항종양 면역증진능에 관여하는 작동기작을 조사하기 위하여, CD4+또는 CD8+T 세포를 각 세포에 대한 항체를 사용하여 생체에서 제거하였다. Balb/c 마우스에 MD-J 백신을 면역하기 3 일 및 4 일 전에 각각 200 ㎕의 anti-CD4(rat IgG2b) 또는 anti-CD8 (rat IgG2b) 항체를 혈관주사하였다. 각 항체는 백신 면역 후 3, 7 및 10 일 후에도 투여하여 완전하게 각 cell type를 제거하였다. MD-J 백신의 면역은 2 주 간격으로 총 3 회 실시하였으며, 대조군에는 isotype-matched rat IgG를 투여하였다.
실험 결과, CD8+제거 마우스의 경우는 거의 완전한 암전이억제 효과가 제거되었고 CD4+제거 마우스에서는 유의적인 약 59.7%의 부분적인 항종양전이억제 효과가 인정되었다. 상기 결과는, MD-J 백신의 암에 대한 면역 유도가 CD4+또는 CD8+작동 T 세포에 의한 기전임을 보여주고 있다.
| Treatment | Number oftumors | Inhibition% | Range |
| Group | |||
| Tumor control | 135.1±18.1 | - | 156, 125, 146, 128, 121, 158, 112 |
| MD-J 백신 + Rat IgG | 4.9±3.7 | 96.4 | 11, 6, 8, 1, 1, 3, 4 |
| MD-J 백신 + anti-CD4 | 59.7±11.7 | 55.8 | 68, 45, 78, 65, 51, 50, 61 |
| MD-J 백신 + anti-CD8 | 131.4±13.7 | - | 115, 120, 119, 135, 138, 152, 141 |
본 발명의 방법으로 제조된 종양 백신은 종양에 대해 증진된 면역원성을 가짐으로써 여러 종류의 종양에 대한 예방 및 치료 활성을 나타낸다. 그러한 종양 백신은 주로 항원제시 세포의 항원제시능을 증진시킴으로써 이후 종양 특이적인 CD4+또는 CD8+T cell을 활성화시키고, 궁극적으로 종양에 대한 체액성 및 세포성 면역반응을 유도한다. 또한, 본 발명의 종양 백신은 종양에 대한 교차반응성이 있어서 여러 종류의 종양들에 대한 면역반응을 유도하므로, 종양의 증식 및 전이에 대한 예방을 위한 백신 효과와 이미 생성된 종양에 대한 치료 효과를 가진다.
본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 상기 내용을 바탕으로 본 발명의 범주내에서 다양한 응용 및 변형을 행하는 것이 가능할 것이다.
Claims (19)
- 종양으로부터 유래된 종양세포를 가열처리하여 종양에 대한 면역원성이 증진된 불활성화 종양세포 및/또는 그것으로부터 얻어진 종양 항원을 포함하는 종양 백신의 제조방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 종양은 종양 원발소(primary tumor) 또는 다른 기관으로 전이된 악성종양인 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 가열처리는 중탕, 가압멸균, 또는 습식멸균으로 수행하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 가열처리는 45℃ 이상에서 5 분 이상 수행하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제 4 항에 있어서, 상기 가열처리는 60 내지 130℃에서 10 내지 60분간 수행하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제 1 항에 있어서, 종양으로부터 유래된 종양세포를 배양하여 증식시키는 과정, 상기 가열처리 중에 및/또는 가열처리 이후에 종양세포를 초음파 처리하는 과정, 및 상기 불활성화 종양세포로부터 종양 항원을 정제하는 과정으로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 과정을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 불활성화 종양세포는 구조적으로 세포의 원형을 유지한 형태(intact form)이거나 또는 파쇄물 형태(lysate form)인 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 불활성화 종양세포는 가열처리 후 얻어진 45, 57, 62, 74 및 75 KDa의 단백질들에서 선택된, 종양에 대한 면역원성을 부여하거나 종양의 증식 및 전이를 억제하여 종양에 대한 치료 및 예방 활성을 나타내는, 하나 또는 그 이상의 종양 항원인 일가 또는 다가 항원을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 종양 항원은 가열처리에 의해 구조적으로 변형이 일어난 항원 단백질이거나, 또는 표현되지 않은 단백질이 가열처리에 의해 세포 표면에 새로이 노출된 항원 단백질인 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 종양 항원은 항원제시 세포(Antigen Presenting Cell: APC)의 MHC 분자를 통해 항원제시함으로써 면역 대상 개체의 세포성 면역반응을 주로 유도하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
- (a) 약리학적 유효량의 제 1 항에 따른 불활성화 종양세포 및/또는 그것으로부터의 얻어진 종양 항원; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제, 또는 이들의 조합;을 포함하는 것으로 구성된, 종양의 예방 및 치료용 약제 조성물.
- 제 1 항에 따른 불활성화 종양세포 및/또는 종양 항원(이하, "종양 백신")을 유효량 이상으로 객체에 투여하여 종양에 대한 객체의 면역원성을 증가시키는 방법.
- 제 12 항에 있어서, 상기 방법은, 유전적으로 동일한(동계; syngeneic) 객체의 종양으로부터 수득하여, 제 1 항의 방법에 따라 종양 백신을 제조하고, 이를 유전적으로 동일한 객체에 투여하는 방법, 또는 유전적으로 유사한(동종; allogeneic) 객체의 종양으로부터 수득하여, 제 1 항의 방법에 따라 종양 백신을 제조하고, 이를 유전적으로 유사한 객체에 투여하는 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 12 항에 있어서, 상기 객체는 척추동물인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 14 항에 있어서, 상기 척추동물은 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 12 항에 있어서, 상기 종양 백신에 의해 자극된 항원제시 세포(APC)를 단독으로, 또는 상기 종양 백신과 병용하여 추가로 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 12 항에 있어서, 상기 방법은 상기 종양 백신을 일회 투여함으로써 행하는 면역 방법 또는 연속 투여함으로써 행하는 면역 방법인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 12 항에 있어서, 상기 종양 백신은 다른 종류의 종양들의 면역화에 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 따른 불활성화 종양세포 및/또는 종양 항원을 유효량 이상으로 객체에 투여하여 종양의 예방 및 치료를 행하는 방법.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR20030028145 | 2003-05-02 | ||
| KR1020030028145 | 2003-05-02 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20040094635A true KR20040094635A (ko) | 2004-11-10 |
Family
ID=33411622
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020040030443A KR20040094635A (ko) | 2003-05-02 | 2004-04-30 | 항종양 활성의 유도를 위한 종양 백신의 제조방법 및그것을 함유하고 있는 약제 조성물 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20040094635A (ko) |
| WO (1) | WO2004096244A1 (ko) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101290641B1 (ko) * | 2007-04-27 | 2013-07-29 | 페트로 겐리예비치 로크호프 | 표면 내피세포 항원을 기초로 하는 종양 백신의 제조방법 |
| KR101523584B1 (ko) * | 2007-12-11 | 2015-06-01 | 배일주 | 선천면역 및 획득면역능을 갖는 종양 백신 및 이를유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20090162405A1 (en) * | 2006-12-14 | 2009-06-25 | Yong Qian | Proteinase-engineered cancer vaccine induces immune responses to prevent cancer and to systemically kill cancer cells |
| CN115634287A (zh) * | 2022-09-30 | 2023-01-24 | 苏州系统医学研究所 | 一种基于砷化合物的肿瘤疫苗及其制备方法和应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5273745A (en) * | 1988-03-01 | 1993-12-28 | Volker R. Schirrmacher | Virus-modified tumor vaccines for immunotherapy of tumor metastases |
| JPH1067681A (ja) * | 1996-08-28 | 1998-03-10 | Yoshida Seibutsu Kenkyusho:Kk | 癌ワクチン及びその製造法 |
| WO2000003732A1 (fr) * | 1998-07-15 | 2000-01-27 | Vacs International | Utilisation de proteines immunogenes immunosuppressives et/ou angiogeniques rendues inactives, procede de preparation et applications pharmaceutiques ou vaccinales |
| EP1293212A1 (en) * | 2001-08-21 | 2003-03-19 | National Research Council Of Canada | Anti cancer vaccine comprising whole cancer cells with modified sialic acid |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20000049096A (ko) * | 1996-10-11 | 2000-07-25 | 린다 에스. 스티븐슨 | 혼합 림프구와 조합된 종양세포를 사용하는 암 면역요법 |
| US5948646A (en) * | 1997-12-11 | 1999-09-07 | Fordham University | Methods for preparation of vaccines against cancer comprising heat shock protein-peptide complexes |
-
2004
- 2004-04-30 WO PCT/KR2004/001025 patent/WO2004096244A1/en active Application Filing
- 2004-04-30 KR KR1020040030443A patent/KR20040094635A/ko not_active Application Discontinuation
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5273745A (en) * | 1988-03-01 | 1993-12-28 | Volker R. Schirrmacher | Virus-modified tumor vaccines for immunotherapy of tumor metastases |
| JPH1067681A (ja) * | 1996-08-28 | 1998-03-10 | Yoshida Seibutsu Kenkyusho:Kk | 癌ワクチン及びその製造法 |
| WO2000003732A1 (fr) * | 1998-07-15 | 2000-01-27 | Vacs International | Utilisation de proteines immunogenes immunosuppressives et/ou angiogeniques rendues inactives, procede de preparation et applications pharmaceutiques ou vaccinales |
| EP1293212A1 (en) * | 2001-08-21 | 2003-03-19 | National Research Council Of Canada | Anti cancer vaccine comprising whole cancer cells with modified sialic acid |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101290641B1 (ko) * | 2007-04-27 | 2013-07-29 | 페트로 겐리예비치 로크호프 | 표면 내피세포 항원을 기초로 하는 종양 백신의 제조방법 |
| KR101523584B1 (ko) * | 2007-12-11 | 2015-06-01 | 배일주 | 선천면역 및 획득면역능을 갖는 종양 백신 및 이를유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2004096244A1 (en) | 2004-11-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Finn | Cancer vaccines: between the idea and the reality | |
| JP5579586B2 (ja) | 腫瘍ワクチン | |
| Ishida et al. | Dendritic cells transduced with wild‐type p53 gene elicit potent anti‐tumour immune responses | |
| Yoshikawa et al. | Nanoparticles built by self-assembly of amphiphilic γ-PGA can deliver antigens to antigen-presenting cells with high efficiency: a new tumor-vaccine carrier for eliciting effector T cells | |
| US20170281743A1 (en) | Th1 vaccination priming for active immunotherapy | |
| Liu et al. | Synthetic MUC1 breast cancer vaccine containing a Toll‑like receptor 7 agonist exerts antitumor effects | |
| US20100092499A1 (en) | Alpha Thymosin Peptides as Cancer Vaccine Adjuvants | |
| CA2700942A1 (en) | An ex vivo, fast and efficient process to obtain activated antigen-presenting cells that are useful for therapies against cancer and immune system-related diseases | |
| JP2004538000A (ja) | 樹状突起細胞の成熟化の方法 | |
| KR20090047289A (ko) | 엑소좀 및 이를 함유한 암 백신 조성물 | |
| KR20040094635A (ko) | 항종양 활성의 유도를 위한 종양 백신의 제조방법 및그것을 함유하고 있는 약제 조성물 | |
| RU2333767C2 (ru) | Вакцинные композиции, способы их применения для профилактики и лечения меланомы и генетические конструкции для получения действующих компонентов композиции | |
| JP2005528899A (ja) | 抗原提示細胞の生成方法 | |
| Al Saihati | Overview of Dendritic Cell Vaccines as Effective Approaches in Cancer Immunotherapy. | |
| US5208022A (en) | Non-malignant cells coupled to adjuvants and their use in a method to induce anti-tumor immunity | |
| JP4688254B2 (ja) | 腫瘍ワクチン | |
| Xie et al. | Inhibitory effects of a dendritic cell vaccine loaded with radiation-induced apoptotic tumor cells on tumor cell antigens in mouse bladder cancer | |
| KR20190011179A (ko) | 광열 처리된 세포 용해물을 유효성분으로 함유하는 백신 또는 면역치료제 조성물 | |
| AU2003277641B2 (en) | Remedy for cancer | |
| KR101523584B1 (ko) | 선천면역 및 획득면역능을 갖는 종양 백신 및 이를유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물 | |
| RU2784803C1 (ru) | Тестикулярная вакцина как противоопухолевое профилактическое средство | |
| KR100954315B1 (ko) | 종양성장 억제능을 갖는 광역동성 치료 매개 자가 유래수지상 세포 | |
| AU782196B2 (en) | Activation of antigen-specific T cells by virus/antigen-treated dendritic cells | |
| EP0615758B1 (en) | Anti-tumor vaccines | |
| WO2020032904A2 (en) | Cancer vaccine treatment by synchronously culturing and immunizing of autologous nk (natural killer) cells with autologous cancer cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E601 | Decision to refuse application |