JPH1067681A - 癌ワクチン及びその製造法 - Google Patents
癌ワクチン及びその製造法Info
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- JPH1067681A JPH1067681A JP22624396A JP22624396A JPH1067681A JP H1067681 A JPH1067681 A JP H1067681A JP 22624396 A JP22624396 A JP 22624396A JP 22624396 A JP22624396 A JP 22624396A JP H1067681 A JPH1067681 A JP H1067681A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】癌ワクチンの安全で簡単な製造方法を提供す
る。 【解決手段】形状を保持し、かつ、蛋白が熱処理又は抱
水クロラール処理により変性してなるＲａｊｉ細胞及び
／又は癌特異的抗原を発現する癌細胞を有効成分とする
癌ワクチン及びその製造法。
る。 【解決手段】形状を保持し、かつ、蛋白が熱処理又は抱
水クロラール処理により変性してなるＲａｊｉ細胞及び
／又は癌特異的抗原を発現する癌細胞を有効成分とする
癌ワクチン及びその製造法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、癌ワクチンおよび
その安全で簡単な製造方法に関する。
その安全で簡単な製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】これまでの腫瘍免疫療法では、Ｏ
Ｋ432、ＩＬ−２などの免疫賦活療法や、患者の末梢リ
ンパ球から誘導したリンホカイン活性化キラー（ＬＡ
Ｋ）や腫瘍内浸潤リンパ球を移入する養子免疫療法、あ
るいは腫瘍マーカーに対するモノクローナル抗体を用い
たミサイル療法など、種々の方法が試みられてきたが、
一部の症例を除いて満足する治療効果は得られていな
い。
Ｋ432、ＩＬ−２などの免疫賦活療法や、患者の末梢リ
ンパ球から誘導したリンホカイン活性化キラー（ＬＡ
Ｋ）や腫瘍内浸潤リンパ球を移入する養子免疫療法、あ
るいは腫瘍マーカーに対するモノクローナル抗体を用い
たミサイル療法など、種々の方法が試みられてきたが、
一部の症例を除いて満足する治療効果は得られていな
い。
【０００３】最近、癌の遺伝子治療も盛んに行われてい
る。特にサイトカインや接着因子遺伝子導入癌細胞を移
植して、癌に対する非特異的な免疫を誘導し、癌を治療
する癌ワクチン療法が注目を集めている。しかし、遺伝
子導入腫瘍細胞は、ヒト体内に治療用のワクチンとして
接種するので、腫瘍細胞の増殖性をなくしておかねばな
らない。同時に、腫瘍細胞の持つ抗原性もできる限り維
持されなければならない。そのために通常、ワクチン化
薬物処理よりも放射線処理を行っている。
る。特にサイトカインや接着因子遺伝子導入癌細胞を移
植して、癌に対する非特異的な免疫を誘導し、癌を治療
する癌ワクチン療法が注目を集めている。しかし、遺伝
子導入腫瘍細胞は、ヒト体内に治療用のワクチンとして
接種するので、腫瘍細胞の増殖性をなくしておかねばな
らない。同時に、腫瘍細胞の持つ抗原性もできる限り維
持されなければならない。そのために通常、ワクチン化
薬物処理よりも放射線処理を行っている。
【０００４】例えば、Ｘ線照射を利用すれば、Ｘ線照射
器の管球の下に癌ワクチン細胞を含むフラスコを置き、
総放射線量１０００〜３３００Ｒａｄで照射する。
器の管球の下に癌ワクチン細胞を含むフラスコを置き、
総放射線量１０００〜３３００Ｒａｄで照射する。
【０００５】マイトマイシンＣ処理法は、癌ワクチン細
胞（１〜３×１０7個細胞／ｍｌ）が試験管に浮遊させ
るようにする。具体的には、マイトマイシンＣを細胞浮
遊液１ｍｌ当たり２５〜５０μｇの比で添加して、３７
℃、３０〜６０分間保温処理する。
胞（１〜３×１０7個細胞／ｍｌ）が試験管に浮遊させ
るようにする。具体的には、マイトマイシンＣを細胞浮
遊液１ｍｌ当たり２５〜５０μｇの比で添加して、３７
℃、３０〜６０分間保温処理する。
【０００６】しかし、Ｘ線照射による方法では、癌細胞
を死滅させるためには、Ｘ線が核（ＤＮＡ）などの細胞
内の致死的な部分に照射される必要があり、癌ワクチン
細胞が１００％死滅するかどうかが疑問である問題点が
ある。癌細胞の完全な死滅は、人体に接種するために必
須の条件である。一方、マイトマイシンＣ処理法では、
癌細胞を大量のマイトマイシンＣで処理すると、死滅し
た癌細胞の細胞毒性が問題となり、マイトマイシンＣ濃
度が低いと毒性は低下するが、細胞が完全に死滅すると
は限らない問題がある。さらに、Ｘ線照射或いはマイト
マイシンＣ処理した癌細胞は細胞自体の構造は保持さ
れ、生体内で免疫系を賦活する作用は有しているが、生
体内に導入後短期間で分解されるため、癌ワクチンの持
続的な効果が得られない。
を死滅させるためには、Ｘ線が核（ＤＮＡ）などの細胞
内の致死的な部分に照射される必要があり、癌ワクチン
細胞が１００％死滅するかどうかが疑問である問題点が
ある。癌細胞の完全な死滅は、人体に接種するために必
須の条件である。一方、マイトマイシンＣ処理法では、
癌細胞を大量のマイトマイシンＣで処理すると、死滅し
た癌細胞の細胞毒性が問題となり、マイトマイシンＣ濃
度が低いと毒性は低下するが、細胞が完全に死滅すると
は限らない問題がある。さらに、Ｘ線照射或いはマイト
マイシンＣ処理した癌細胞は細胞自体の構造は保持さ
れ、生体内で免疫系を賦活する作用は有しているが、生
体内に導入後短期間で分解されるため、癌ワクチンの持
続的な効果が得られない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、癌細胞が完
全に死滅した、長期間にわたり生体内で免疫賦活作用を
有する、安全な癌ワクチンおよびその製造方法を提供す
ることを目的とする。
全に死滅した、長期間にわたり生体内で免疫賦活作用を
有する、安全な癌ワクチンおよびその製造方法を提供す
ることを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題に
鑑み検討を重ねた結果、癌細胞をタンパク質が変性する
程度の条件下で加熱処理するか、あるいは抱水クロラー
ルで処理すると、タンパク質の変性により癌細胞は完全
に死滅するが、抗原性を失うことはなく、しかもタンパ
ク質が適度に変性しているため、放射線やマイトマイシ
ンＣで処理した場合と異なり長期間生体内で残存し、持
続的な免疫賦活作用を有するため、癌ワクチンとして極
めて有用であることを見出した。
鑑み検討を重ねた結果、癌細胞をタンパク質が変性する
程度の条件下で加熱処理するか、あるいは抱水クロラー
ルで処理すると、タンパク質の変性により癌細胞は完全
に死滅するが、抗原性を失うことはなく、しかもタンパ
ク質が適度に変性しているため、放射線やマイトマイシ
ンＣで処理した場合と異なり長期間生体内で残存し、持
続的な免疫賦活作用を有するため、癌ワクチンとして極
めて有用であることを見出した。
【０００９】すなわち、本発明は下記の癌ワクチン及び
その製造方法を提供するものである。
その製造方法を提供するものである。
【００１０】項１． 形状を保持し、かつ、蛋白が熱処
理又は抱水クロラール処理により変性してなるＲａｊｉ
細胞及び／又は癌特異的抗原を発現する癌細胞を有効成
分とする癌ワクチン。
理又は抱水クロラール処理により変性してなるＲａｊｉ
細胞及び／又は癌特異的抗原を発現する癌細胞を有効成
分とする癌ワクチン。
【００１１】項２． 癌特異的抗原がＨＳ１及び／又は
Ｂ７である項１記載の癌ワクチン。
Ｂ７である項１記載の癌ワクチン。
【００１２】項３． Ｒａｊｉ細胞及び／又は癌特異的
抗原を発現する癌細胞を熱処理又は抱水クロラール処理
し、その形状を実質的に保持しつつ蛋白を変性させるこ
とを特徴とする癌ワクチンの製造法。
抗原を発現する癌細胞を熱処理又は抱水クロラール処理
し、その形状を実質的に保持しつつ蛋白を変性させるこ
とを特徴とする癌ワクチンの製造法。
【００１３】項４． 癌特異的抗原がＨＳ１及び／又は
Ｂ７である項３記載の癌ワクチンの製造法。
Ｂ７である項３記載の癌ワクチンの製造法。
【００１４】
【発明の実施の形態】本発明の癌ワクチンは、リンパ球
の腫瘍細胞障害活性を高める作用を有し、この作用に基
づき、例えば癌を外科的に手術した後に投与すれば癌の
再発を予防することができる。また、癌患者に投与すれ
ば、癌の成長の抑制または癌の縮小・治癒を図ることが
できる。従って、本発明の癌ワクチンは、「形状を保持
し、かつ、蛋白が熱処理又は抱水クロラール処理により
変性してなるＲａｊｉ細胞及び／又は癌特異的抗原を発
現する癌細胞を有効成分とする癌の再発予防剤・癌の転
移抑制剤・癌治療剤などの概念を含むものであり、本発
明は、癌の再発予防剤、癌の転移抑制剤、抗癌剤を提供
するものでもある。
の腫瘍細胞障害活性を高める作用を有し、この作用に基
づき、例えば癌を外科的に手術した後に投与すれば癌の
再発を予防することができる。また、癌患者に投与すれ
ば、癌の成長の抑制または癌の縮小・治癒を図ることが
できる。従って、本発明の癌ワクチンは、「形状を保持
し、かつ、蛋白が熱処理又は抱水クロラール処理により
変性してなるＲａｊｉ細胞及び／又は癌特異的抗原を発
現する癌細胞を有効成分とする癌の再発予防剤・癌の転
移抑制剤・癌治療剤などの概念を含むものであり、本発
明は、癌の再発予防剤、癌の転移抑制剤、抗癌剤を提供
するものでもある。
【００１５】本発明において、熱処理又は抱水クロラー
ル処理に供される癌細胞としては、Ｒａｊｉ細胞および
癌特異的抗原を発現する癌細胞が挙げられる。細胞表面
に発現される癌特異的抗原としては、ヒトの免疫系を賦
活する限りにおいて特に限定されないが、例えばＨＳ
１、Ｂ７などが例示される。これらの癌特異的抗原は単
独で細胞表面に発現されていてもよく、２種以上が同時
に細胞表面に発現されていてもよい。癌ワクチン用途に
最も好ましい癌細胞は、Ｒａｊｉ細胞である。
ル処理に供される癌細胞としては、Ｒａｊｉ細胞および
癌特異的抗原を発現する癌細胞が挙げられる。細胞表面
に発現される癌特異的抗原としては、ヒトの免疫系を賦
活する限りにおいて特に限定されないが、例えばＨＳ
１、Ｂ７などが例示される。これらの癌特異的抗原は単
独で細胞表面に発現されていてもよく、２種以上が同時
に細胞表面に発現されていてもよい。癌ワクチン用途に
最も好ましい癌細胞は、Ｒａｊｉ細胞である。
【００１６】Ｒａｊｉ細胞および癌特異的抗原を発現す
る癌細胞は、ヒト由来のものであれば特に限定されず、
ＨＳ１、Ｂ７などの癌特異的抗原を発現する公知の癌細
胞株などが広く利用可能である。
る癌細胞は、ヒト由来のものであれば特に限定されず、
ＨＳ１、Ｂ７などの癌特異的抗原を発現する公知の癌細
胞株などが広く利用可能である。
【００１７】タンパク質の変性は、熱処理または抱水ク
ロラール処理により行うことができる。
ロラール処理により行うことができる。
【００１８】熱処理は、タンパク質の変性により癌細胞
が死滅し、抗原性は保持し、かつ、生体内での分解・吸
収により除去されるまでの期間が長く、癌ワクチンとし
ての効果が長期間持続する条件であれば特に限定されな
いが、例えば１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩのような培地中に
存在するＲａｊｉ細胞を約５０〜６５℃、好ましくは６
０℃程度の温度下に１０分間〜１時間程度処理すること
により行うことができる。処理温度が高くなりすぎる
と、蛋白がより高度に変性するため、細胞の形状が変形
し、抗原性が失われる傾向にあり、処理温度が低くなり
すぎると、蛋白の変性の程度が低下するため、処理時間
にもよるが、細胞が１００％死滅しない場合や、細胞中
のタンパク質の変性の程度が低く、生体内で速やかに分
解除去され、癌ワクチンの持続時間が短くなる等の問題
がある。
が死滅し、抗原性は保持し、かつ、生体内での分解・吸
収により除去されるまでの期間が長く、癌ワクチンとし
ての効果が長期間持続する条件であれば特に限定されな
いが、例えば１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩのような培地中に
存在するＲａｊｉ細胞を約５０〜６５℃、好ましくは６
０℃程度の温度下に１０分間〜１時間程度処理すること
により行うことができる。処理温度が高くなりすぎる
と、蛋白がより高度に変性するため、細胞の形状が変形
し、抗原性が失われる傾向にあり、処理温度が低くなり
すぎると、蛋白の変性の程度が低下するため、処理時間
にもよるが、細胞が１００％死滅しない場合や、細胞中
のタンパク質の変性の程度が低く、生体内で速やかに分
解除去され、癌ワクチンの持続時間が短くなる等の問題
がある。
【００１９】抱水クロラールを用いた処理条件は、抗原
性は保持したまま癌細胞が死滅する限り特に限定されな
いが、例えば抱水クロラール溶液にＲａｊｉ細胞または
癌特異的抗原（ＨＳ１、Ｂ７等）を発現する癌細胞を浸
漬し、室温程度の温度下に１０分〜１時間程度固定すれ
ばよい。抱水クロラール溶液は、溶媒中に抱水クロラー
ルを１５〜４０重量％程度の濃度に溶解して調製する。
抱水クロラールを溶解する好適な溶媒は、水と、エタノ
ール、メタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノー
ルなどのアルコールの混合溶媒が挙げられ、好ましくは
水とエタノールの混合溶媒が挙げられる。
性は保持したまま癌細胞が死滅する限り特に限定されな
いが、例えば抱水クロラール溶液にＲａｊｉ細胞または
癌特異的抗原（ＨＳ１、Ｂ７等）を発現する癌細胞を浸
漬し、室温程度の温度下に１０分〜１時間程度固定すれ
ばよい。抱水クロラール溶液は、溶媒中に抱水クロラー
ルを１５〜４０重量％程度の濃度に溶解して調製する。
抱水クロラールを溶解する好適な溶媒は、水と、エタノ
ール、メタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノー
ルなどのアルコールの混合溶媒が挙げられ、好ましくは
水とエタノールの混合溶媒が挙げられる。
【００２０】抱水クロラールの溶液量は、処理される癌
細胞の例えば３０〜４０倍量を用いて行うことができ
る。
細胞の例えば３０〜４０倍量を用いて行うことができ
る。
【００２１】本発明の癌ワクチンで用いる癌細胞（Ｒａ
ｊｉ細胞及び／又は癌特異的抗原を発現する癌細胞）
は、熱処理又は抱水クロラール処理の一方のみを行って
もよく、熱処理と抱水クロラール処理の両方を順次行っ
たものであってもよい。
ｊｉ細胞及び／又は癌特異的抗原を発現する癌細胞）
は、熱処理又は抱水クロラール処理の一方のみを行って
もよく、熱処理と抱水クロラール処理の両方を順次行っ
たものであってもよい。
【００２２】本発明の癌ワクチンは、血液、リンパ液中
に投与してもよく、癌細胞が存在する臓器、器官などに
注入してもよい。
に投与してもよく、癌細胞が存在する臓器、器官などに
注入してもよい。
【００２３】本発明の癌ワクチンは、熱処理又は抱水ク
ロラール処理された前記癌細胞に、等張化剤、ｐＨ調整
剤などの各種添加剤を加えた水分散液として調製され
る。
ロラール処理された前記癌細胞に、等張化剤、ｐＨ調整
剤などの各種添加剤を加えた水分散液として調製され
る。
【００２４】本発明の癌ワクチンは、肝癌、腎癌、肺
癌、胃癌、膵臓癌、大腸癌、結腸癌、膀胱癌、食道癌、
皮膚癌、脳腫瘍、乳癌、子宮体癌、子宮頚癌、卵巣癌、
前立腺癌、悪性リンパ腫、白血病、骨髄腫等の各種の癌
に有効である。
癌、胃癌、膵臓癌、大腸癌、結腸癌、膀胱癌、食道癌、
皮膚癌、脳腫瘍、乳癌、子宮体癌、子宮頚癌、卵巣癌、
前立腺癌、悪性リンパ腫、白血病、骨髄腫等の各種の癌
に有効である。
【００２５】本発明の癌ワクチンの投与量は、患者の年
齢、体重、性別、癌の種類及び進行度、症状等により異
なり、一概に決定できないが、現在行われている癌ワク
チン療法で注入されるのと同程度の量が患者に投与され
る。
齢、体重、性別、癌の種類及び進行度、症状等により異
なり、一概に決定できないが、現在行われている癌ワク
チン療法で注入されるのと同程度の量が患者に投与され
る。
【００２６】
【発明の効果】本発明によれば、癌細胞が１００％死滅
しているため安全で、しかも長期保存性に優れた癌ワク
チンが得られる。
しているため安全で、しかも長期保存性に優れた癌ワク
チンが得られる。
【００２７】
【実施例】以下、本発明を実施例を用いてより詳細に説
明する。
明する。
【００２８】なお、以下において、熱処理後のＲａｊｉ
細胞をＲａｊｉ（Ｈ）細胞、抱水クロラール処理後のＲ
ａｊｉ細胞をＲａｊｉ（Ｃ）細胞と記載し、単にＲａｊ
ｉ細胞と記載した場合には、未処理のＲａｊｉ細胞を意
味するものとする。
細胞をＲａｊｉ（Ｈ）細胞、抱水クロラール処理後のＲ
ａｊｉ細胞をＲａｊｉ（Ｃ）細胞と記載し、単にＲａｊ
ｉ細胞と記載した場合には、未処理のＲａｊｉ細胞を意
味するものとする。
【００２９】実施例１：熱による腫瘍細胞処理方法 例えば、以下の具体的な条件で処理すればよい。
【００３０】１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩで培養しているＲ
ａｊｉ細胞を１５ｍｌ遠心管に適当な量を取り、遠沈
（１５００ｒｐｍ）と血清を含まないＲＰＭＩでの再浮
遊を繰り返して３回洗浄し、トリパンブルーにて生細胞
数をカウントした。
ａｊｉ細胞を１５ｍｌ遠心管に適当な量を取り、遠沈
（１５００ｒｐｍ）と血清を含まないＲＰＭＩでの再浮
遊を繰り返して３回洗浄し、トリパンブルーにて生細胞
数をカウントした。
【００３１】次に、Ｒａｊｉ細胞の生細胞濃度を１×１
０7個／ｍｌに調製して浮遊させる。遠心管を５０〜６
５℃で２０分間加熱処理した後、トリパンブルーにて生
細胞数をカウントした。このとき、細胞の形を光学顕微
鏡で確認した。該方法によれば、完全にＲａｊｉ細胞が
死滅し、細胞の形態も異常を起こさないことを確認し
た。
０7個／ｍｌに調製して浮遊させる。遠心管を５０〜６
５℃で２０分間加熱処理した後、トリパンブルーにて生
細胞数をカウントした。このとき、細胞の形を光学顕微
鏡で確認した。該方法によれば、完全にＲａｊｉ細胞が
死滅し、細胞の形態も異常を起こさないことを確認し
た。
【００３２】実施例２：抱水クロラールを用いた腫瘍細
胞固定方法 Ｒａｊｉ細胞を１５ｍｌ遠心管に適当な量を取り、遠沈
（１５００ｒｐｍ）と血清を含まないＲＰＭＩでの再浮
遊を繰り返して３回洗浄し、トリパンブルーにて細胞数
をカウントした。次に、浮遊細胞液を１５００ｒｐｍ、
５分間遠心し、上清は捨てた。
胞固定方法 Ｒａｊｉ細胞を１５ｍｌ遠心管に適当な量を取り、遠沈
（１５００ｒｐｍ）と血清を含まないＲＰＭＩでの再浮
遊を繰り返して３回洗浄し、トリパンブルーにて細胞数
をカウントした。次に、浮遊細胞液を１５００ｒｐｍ、
５分間遠心し、上清は捨てた。
【００３３】２５重量％抱水クロラールで室温下に１０
〜２０分間処理した後、固定された（死滅した）細胞は
１５００ｒｐｍ、５分間遠心し、上清を捨てた。抱水ク
ロラールで固定された細胞を、血清を含まないＲＰＭＩ
で再浮遊する操作を３回繰り返して洗浄し、トリパンブ
ルーにて生細胞数をカウントした。このとき、細胞の形
を光学顕微鏡で確認した。該方法によれば、完全にＲａ
ｊｉ細胞が死滅し、細胞の形態も異常を起こさないこと
を確認した。
〜２０分間処理した後、固定された（死滅した）細胞は
１５００ｒｐｍ、５分間遠心し、上清を捨てた。抱水ク
ロラールで固定された細胞を、血清を含まないＲＰＭＩ
で再浮遊する操作を３回繰り返して洗浄し、トリパンブ
ルーにて生細胞数をカウントした。このとき、細胞の形
を光学顕微鏡で確認した。該方法によれば、完全にＲａ
ｊｉ細胞が死滅し、細胞の形態も異常を起こさないこと
を確認した。
【００３４】実施例３ （１）エフェクター細胞としての末梢血液リンパ球の分
離 1) ヘパリンを５〜２０単位／ｍｌ含む採血した血液を
１５ｍｌ遠心管に入れて１４００ｒｐｍ／４００Ｇ、１
０分間遠心する。
離 1) ヘパリンを５〜２０単位／ｍｌ含む採血した血液を
１５ｍｌ遠心管に入れて１４００ｒｐｍ／４００Ｇ、１
０分間遠心する。
【００３５】2) リンパ球に富んだ細胞層をパスツール
ピペットで集めて遠心管に入れる。 3) １０ｍｌ程度になるように薄める。
ピペットで集めて遠心管に入れる。 3) １０ｍｌ程度になるように薄める。
【００３６】4) パスツールピペットの両側を火炎消毒
して遠心管に立て、Ficoll-paque４ｍｌを注射針にて入
れる。
して遠心管に立て、Ficoll-paque４ｍｌを注射針にて入
れる。
【００３７】5) ２０００ｒｐｍ／８００Ｇ、１５分間
遠心する。
遠心する。
【００３８】6) リンパ球の層（中間層）をパスツール
ピペットで集めて遠心管に入れる。
ピペットで集めて遠心管に入れる。
【００３９】7) 血清を含まないＲＰＭＩを加え、１４
００ｒｐｍで５分ずつ計２回洗浄する。
００ｒｐｍで５分ずつ計２回洗浄する。
【００４０】8) １０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩで１回洗浄
し、トリパンブルーにて染色し、細胞数をカウントす
る。
し、トリパンブルーにて染色し、細胞数をカウントす
る。
【００４１】9) これによって分離された細胞は、８０
〜９０％のリンパ球と１０〜２０％の単球の混合物であ
る。従って、目的によっては単球の除去が必要になる。
単球はそのプラスチック付着性を利用して除去する。す
なわち、細胞浮遊液（２×１０6個／ｍｌ）をプラスチ
ックシャーレに入れ、３７℃、６０分間インキュベーシ
ョンする。その後、沈んだ細胞を静かに再浮遊させ、ピ
ペットで回収する。プラスチックシャーレ上に再度培養
液を加え、残りの浮遊細胞を回収し、最初に回収したも
のと合わせて遠心し、リンパ球を集める。
〜９０％のリンパ球と１０〜２０％の単球の混合物であ
る。従って、目的によっては単球の除去が必要になる。
単球はそのプラスチック付着性を利用して除去する。す
なわち、細胞浮遊液（２×１０6個／ｍｌ）をプラスチ
ックシャーレに入れ、３７℃、６０分間インキュベーシ
ョンする。その後、沈んだ細胞を静かに再浮遊させ、ピ
ペットで回収する。プラスチックシャーレ上に再度培養
液を加え、残りの浮遊細胞を回収し、最初に回収したも
のと合わせて遠心し、リンパ球を集める。
【００４２】（２）リンパ球と腫瘍細胞の混合培養 培養は、９６の平底ウエルを備えた培養プレート中で行
う。上記（１）で得たリンパ球０．１ｍｌ（すなわち２
×１０5個）と実施例１で得たＲａｊｉ細胞０．１ｍｌ
（即ち、０．２〜１×１０5個）とをマイクロプレート
の各ウエルに分注し、各組合せにつき３個の培養を各ウ
エルで行う。プレートは縁に沿ってガス交換可能なプラ
スチック製の蓋でゆるく覆い、３７℃、５％ＣＯ2、９
５％空気の培養基内に置く。７日間培養後、１００μｌ
を除去し、１００μｌの新しいＲａｊｉ細胞浮遊液を添
加する。
う。上記（１）で得たリンパ球０．１ｍｌ（すなわち２
×１０5個）と実施例１で得たＲａｊｉ細胞０．１ｍｌ
（即ち、０．２〜１×１０5個）とをマイクロプレート
の各ウエルに分注し、各組合せにつき３個の培養を各ウ
エルで行う。プレートは縁に沿ってガス交換可能なプラ
スチック製の蓋でゆるく覆い、３７℃、５％ＣＯ2、９
５％空気の培養基内に置く。７日間培養後、１００μｌ
を除去し、１００μｌの新しいＲａｊｉ細胞浮遊液を添
加する。
【００４３】（３）リンパ球腫瘍細胞障害活性測定 1) １０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩにてＲａｊｉ細胞を１回洗
浄して、新しい１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩにてＲａｊｉ細
胞を浮遊させる。細胞をトリパンブルーで染色し、生細
胞数をカウントしておき、生細胞濃度を５×１０4個／
ｍｌに調製して浮遊させる。
浄して、新しい１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩにてＲａｊｉ細
胞を浮遊させる。細胞をトリパンブルーで染色し、生細
胞数をカウントしておき、生細胞濃度を５×１０4個／
ｍｌに調製して浮遊させる。
【００４４】2) エフェクター細胞の入っている各ウエ
ルにＲａｊｉ細胞浮遊液（５×１０4個／ｍｌ）を０．
１ｍｌずつ加える（Ｒａｊｉ細胞が５×１０3／ウエ
ル）。これによって、エフェクター／ターゲット比が４
０：１の希釈となる。
ルにＲａｊｉ細胞浮遊液（５×１０4個／ｍｌ）を０．
１ｍｌずつ加える（Ｒａｊｉ細胞が５×１０3／ウエ
ル）。これによって、エフェクター／ターゲット比が４
０：１の希釈となる。
【００４５】3) 対照群として、Ｒａｊｉ細胞浮遊液を
３ウエルに０．１ｍｌずつ入れて１０％ＦＣＳ−ＲＰＭ
Ｉ０．１ｍｌずつを加える。同時にエフェクター細胞を
０．１ｍｌずつ入れて、１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ０．１
ｍｌずつを加える。
３ウエルに０．１ｍｌずつ入れて１０％ＦＣＳ−ＲＰＭ
Ｉ０．１ｍｌずつを加える。同時にエフェクター細胞を
０．１ｍｌずつ入れて、１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ０．１
ｍｌずつを加える。
【００４６】4) プレートに蓋をして、４時間、３７℃
でインキュベーションする。
でインキュベーションする。
【００４７】5) 各ウエルに１０μｌ（５ｍｇ／ｍｌ）
ＭＴＴ（３−〔４，５−ジメチルチアゾール−２−イ
ル〕−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド：チ
アゾリルブルー）ずつ加えて、さらに４時間、３７℃で
インキュベートする。
ＭＴＴ（３−〔４，５−ジメチルチアゾール−２−イ
ル〕−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド：チ
アゾリルブルー）ずつ加えて、さらに４時間、３７℃で
インキュベートする。
【００４８】6) プレートをインキュベーターから取り
出し、１４００ｒｐｍで５分間遠心する。
出し、１４００ｒｐｍで５分間遠心する。
【００４９】7) 細胞が浮き上がらないように注意しな
がらピペットの先端をウエル側壁に固定し、上清をゆっ
くり吸引する。
がらピペットの先端をウエル側壁に固定し、上清をゆっ
くり吸引する。
【００５０】8) イソプロパノール１００μｌずつ加え
て、ＭＴＴフォルマザンを溶解する。
て、ＭＴＴフォルマザンを溶解する。
【００５１】9) プレートをマルチスキャンの上に載せ
て細胞内コハク酸デヒドロゲナーゼにより発色したＭＴ
Ｔを５４０ｎｍの波長で吸光度を測定する。
て細胞内コハク酸デヒドロゲナーゼにより発色したＭＴ
Ｔを５４０ｎｍの波長で吸光度を測定する。
【００５２】10) 測定された３つのウエルの吸光度の平
均値を取り、次式によって特異的腫瘍細胞活性を計算す
る： 特異的腫瘍細胞活性（％）＝〔１−（実験群吸光度−リ
ンパ球吸光度）／腫瘍細胞吸光度〕×１００ 上記の特異的腫瘍細胞活性は、９０〜９５％という極め
て高い値を示し、本発明の癌ワクチンが、リンパ球の活
性化し、免疫系を賦活することにより癌の治癒、再発の
防止、転移の抑制などに効果を示すことが明らかになっ
た。
均値を取り、次式によって特異的腫瘍細胞活性を計算す
る： 特異的腫瘍細胞活性（％）＝〔１−（実験群吸光度−リ
ンパ球吸光度）／腫瘍細胞吸光度〕×１００ 上記の特異的腫瘍細胞活性は、９０〜９５％という極め
て高い値を示し、本発明の癌ワクチンが、リンパ球の活
性化し、免疫系を賦活することにより癌の治癒、再発の
防止、転移の抑制などに効果を示すことが明らかになっ
た。
【００５３】比較例 熱処理、抱水クロラール処理に代えて、ホルマリン、イ
ソプロパノール、アセトン、メタノール、エタノール、
グルタルアルデヒド、酢酸等で処理した癌細胞は、リン
パ球に対し強い細胞毒性を生じたり、細胞の形状まで変
化してしまうため、抗原性が大幅に低下し、癌ワクチン
として十分な特異的腫瘍細胞活性が得られないことが明
らかになった。
ソプロパノール、アセトン、メタノール、エタノール、
グルタルアルデヒド、酢酸等で処理した癌細胞は、リン
パ球に対し強い細胞毒性を生じたり、細胞の形状まで変
化してしまうため、抗原性が大幅に低下し、癌ワクチン
として十分な特異的腫瘍細胞活性が得られないことが明
らかになった。
【００５４】結果 最近、サイトカインや接着分子、例えば皮膚細胞を遺伝
子導入癌細胞を移植して癌に対する免疫を誘導し、癌を
治療するために癌ワクチン療法が注目を集めている。し
かし、それらの生癌細胞はヒトの体内に移植してはいけ
ないから、腫瘍細胞の増殖を停止するために癌ワクチン
として用いる細胞は必要に応じて放射線照射或いは細胞
分裂阻害剤であるマイトマイシンＣで処理などを行う。
この方法は、癌ワクチン細胞は１００％殺せるかどうか
がわからないこと、及び長期保存性が疑問であるなどの
問題が残っている。
子導入癌細胞を移植して癌に対する免疫を誘導し、癌を
治療するために癌ワクチン療法が注目を集めている。し
かし、それらの生癌細胞はヒトの体内に移植してはいけ
ないから、腫瘍細胞の増殖を停止するために癌ワクチン
として用いる細胞は必要に応じて放射線照射或いは細胞
分裂阻害剤であるマイトマイシンＣで処理などを行う。
この方法は、癌ワクチン細胞は１００％殺せるかどうか
がわからないこと、及び長期保存性が疑問であるなどの
問題が残っている。
【００５５】本発明者は、上記の従来の癌ワクチンの製
造方法の欠点を克服するために、熱及び抱水クロラール
によりＲａｊｉ細胞を固定する方法で癌ワクチンを調製
した。５０〜６５℃、２０分間にＲａｊｉ細胞は全て
（１００％）殺される。これは、トリパンブルーにて生
細胞をカウントすることにより確認した。細胞の形態は
変化していなかったことも光学顕微鏡で確認した。これ
らの固定した細胞は、１週間保存しても、形態に変化は
なかった。また、該処理方法は簡単なので、特殊な装置
が不要である。熱で固定された細胞は有害薬剤を使用し
ていないので、将来人体に注射すれば、副作用は低いと
考えられる。かつ、腫瘍細胞は１００％殺されているた
め、癌が増殖する心配はない。
造方法の欠点を克服するために、熱及び抱水クロラール
によりＲａｊｉ細胞を固定する方法で癌ワクチンを調製
した。５０〜６５℃、２０分間にＲａｊｉ細胞は全て
（１００％）殺される。これは、トリパンブルーにて生
細胞をカウントすることにより確認した。細胞の形態は
変化していなかったことも光学顕微鏡で確認した。これ
らの固定した細胞は、１週間保存しても、形態に変化は
なかった。また、該処理方法は簡単なので、特殊な装置
が不要である。熱で固定された細胞は有害薬剤を使用し
ていないので、将来人体に注射すれば、副作用は低いと
考えられる。かつ、腫瘍細胞は１００％殺されているた
め、癌が増殖する心配はない。
【００５６】抱水クロラールで固定したＲａｊｉ細胞
は、１０分間の処理でも１００％殺すことができる。こ
のことは、トリパンブルー染色により、生細胞数をカウ
ントすることで確認した。
は、１０分間の処理でも１００％殺すことができる。こ
のことは、トリパンブルー染色により、生細胞数をカウ
ントすることで確認した。
【００５７】細胞の形態は変化していないことも確認し
た。この固定化された細胞は、１ヶ月以上変化しなかっ
た。従って、該方法で製造されたワクチンは、１ヶ月程
度保存することができる。従って、体内に持続的に免疫
力を高めることができることが示される。
た。この固定化された細胞は、１ヶ月以上変化しなかっ
た。従って、該方法で製造されたワクチンは、１ヶ月程
度保存することができる。従って、体内に持続的に免疫
力を高めることができることが示される。
【００５８】これは通常使用されている免疫剤、例えば
インターロイキン−２の有効血中濃度の持続時間が１〜
２時間程度に比べて大変な利点がある。
インターロイキン−２の有効血中濃度の持続時間が１〜
２時間程度に比べて大変な利点がある。
【００５９】Ｒａｊｉ細胞（Burtt's lymphocyte)は、
このＲａｊｉ細胞表面上にＢ7分子及びＩＣＡＭ−１
（細胞間接着分子−１）が強く（１００％）発現される
ため好ましい。。Ｂ7分子及びＩＣＡＭ−１といった第
二シグナル(costimulatory signal)は、Ｔ細胞及びＮＫ
細胞（ナチュラルキラー）の活性化に重要な役割を果た
している。免疫応答が成立するのは、第二シグナルの有
無によって決定される。一般にこの様な第二シグナル
は、単球や樹状細胞、活性化Ｂ細胞といった一部の免疫
後の細胞に限定されている。癌細胞がＢ7やＩＣＡＭ−
１といった補助刺激(co-stimulatory)がなければリンパ
球によって活性化されないだけでなく、その後の刺激に
も反応し得ない不応答状態に陥ることが示されている。
癌細胞にＢ7やＩＣＡＭ−１遺伝子を導入して、癌細胞
に対する免疫応答を誘導できた。Ｂ7及びＩＣＡＭ−１
遺伝子が発現されているＲａｊｉ細胞と、リンパ球を混
合培養すると、リンパ球の免疫力がかなり高くなること
も明らかになった。これはＢ7及びＩＣＡＭ−１といっ
た補助刺激の役割を果たしている。上述のように、この
Ｂ7及びＩＣＡＭ−１を発現しているＲａｊｉ細胞を固
定して１００％死滅させ、Ｂ7及びＩＣＡＭ−１を利用
して体内に注入することにより、リンパ球の活性化の際
に第二シグナルを提供し、抗癌免疫力が増強されること
が示唆される。
このＲａｊｉ細胞表面上にＢ7分子及びＩＣＡＭ−１
（細胞間接着分子−１）が強く（１００％）発現される
ため好ましい。。Ｂ7分子及びＩＣＡＭ−１といった第
二シグナル(costimulatory signal)は、Ｔ細胞及びＮＫ
細胞（ナチュラルキラー）の活性化に重要な役割を果た
している。免疫応答が成立するのは、第二シグナルの有
無によって決定される。一般にこの様な第二シグナル
は、単球や樹状細胞、活性化Ｂ細胞といった一部の免疫
後の細胞に限定されている。癌細胞がＢ7やＩＣＡＭ−
１といった補助刺激(co-stimulatory)がなければリンパ
球によって活性化されないだけでなく、その後の刺激に
も反応し得ない不応答状態に陥ることが示されている。
癌細胞にＢ7やＩＣＡＭ−１遺伝子を導入して、癌細胞
に対する免疫応答を誘導できた。Ｂ7及びＩＣＡＭ−１
遺伝子が発現されているＲａｊｉ細胞と、リンパ球を混
合培養すると、リンパ球の免疫力がかなり高くなること
も明らかになった。これはＢ7及びＩＣＡＭ−１といっ
た補助刺激の役割を果たしている。上述のように、この
Ｂ7及びＩＣＡＭ−１を発現しているＲａｊｉ細胞を固
定して１００％死滅させ、Ｂ7及びＩＣＡＭ−１を利用
して体内に注入することにより、リンパ球の活性化の際
に第二シグナルを提供し、抗癌免疫力が増強されること
が示唆される。
Claims (4)
- 【請求項１】形状を保持し、かつ、蛋白が熱処理又は抱
水クロラール処理により変性してなるＲａｊｉ細胞及び
／又は癌特異的抗原を発現する癌細胞を有効成分とする
癌ワクチン。 - 【請求項２】癌特異的抗原がＨＳ１及び／又はＢ７であ
る請求項１記載の癌ワクチン。 - 【請求項３】Ｒａｊｉ細胞及び／又は癌特異的抗原を発
現する癌細胞を熱処理又は抱水クロラール処理し、その
形状を実質的に保持しつつ蛋白を変性させることを特徴
とする癌ワクチンの製造法。 - 【請求項４】癌特異的抗原がＨＳ１及び／又はＢ７であ
る請求項３記載の癌ワクチンの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22624396A JPH1067681A (ja) | 1996-08-28 | 1996-08-28 | 癌ワクチン及びその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22624396A JPH1067681A (ja) | 1996-08-28 | 1996-08-28 | 癌ワクチン及びその製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1067681A true JPH1067681A (ja) | 1998-03-10 |
Family
ID=16842145
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22624396A Pending JPH1067681A (ja) | 1996-08-28 | 1996-08-28 | 癌ワクチン及びその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1067681A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20040094635A (ko) * | 2003-05-02 | 2004-11-10 | 주식회사 엠디바이오알파 | 항종양 활성의 유도를 위한 종양 백신의 제조방법 및그것을 함유하고 있는 약제 조성물 |
| JP5653447B2 (ja) * | 2010-10-12 | 2015-01-14 | 株式会社日立製作所 | 生体模擬ファントムおよび校正装置 |
-
1996
- 1996-08-28 JP JP22624396A patent/JPH1067681A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20040094635A (ko) * | 2003-05-02 | 2004-11-10 | 주식회사 엠디바이오알파 | 항종양 활성의 유도를 위한 종양 백신의 제조방법 및그것을 함유하고 있는 약제 조성물 |
| WO2004096244A1 (en) * | 2003-05-02 | 2004-11-11 | Md Bioalpha Co. Ltd. | Method of preparing tumor vaccine for the inducement of anti-tumor activity and a pharmaceutical composition containing the same |
| JP5653447B2 (ja) * | 2010-10-12 | 2015-01-14 | 株式会社日立製作所 | 生体模擬ファントムおよび校正装置 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Effective date: 20070509 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20070912 |