JP2004505058A - 悪性腫瘍の免疫治療のための薬剤 - Google Patents
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Abstract
本発明は、薬剤として、または腫瘍の免疫治療のための、もしくは腫瘍の種痘のための薬剤の調製のために使用され得る組成物に関する。本発明はまた、腫瘍の免疫治療のための、または腫瘍の種痘のための薬剤の調製方法に関する。
Description
【0001】
本出願は、悪性腫瘍の免疫治療に特に適している組成物、およびそれらの調製方法、および薬剤の調製のためのそれら組成物の使用に関する。
【0002】
通常、腫瘍の治療的処置は、過激な(radical)手術、化学療法、放射線療法、またはホルモン療法によって行われる。これらの治療法は、多くの望ましくない副作用を有し、かつ患者への多大な負担を伴う。更に、いくつかの腫瘍形態では、これらの治療では、ほとんど何の改善も得られないので、副作用の観点からは、それらの使用は、妥当ではないようである。これらの形態は、特に、悪性腫瘍、悪性黒腫、腎癌、腸癌、および膵臓癌を含む。従って、例えば、腎癌の死亡率は、85%である。
【0003】
近年、腫瘍と免疫系との間の複合体相互作用に関する知識がますます得られてきており、免疫系を刺激する、腫瘍の治療のためのストラテジーに興味が向けられてきている。一般に、そのような治療の目的は、免疫系において、健康な細胞には存在しないか、またはわずかしか(only so to a lower extent)存在しない腫瘍細胞から特異的抗原を認識できるようにすることである。これは、例えば、アンチキャンサー・リサーチ(Anticancer Research)[(1997) No. 17, 2879−2882頁, 及び3117−3120頁]に記載の薬剤を投与することによって達成される;腫瘍組織は、患者から取り出され、自己由来腫瘍細胞溶菌液に加工され、患者に注射される。これは、腫瘍抗原に対する免疫性が、溶菌液にもたらされることを期待して行われる。別のストラテジーは、公開特許出願WO−A 99/47687に記載されている。そこでは、それらの表面に特別な腫瘍の決定基(determinant)が現れた自己由来抗原を有する(autologous antigen−presenting)細胞が、患者に注射される。
【0004】
腫瘍治療の目的は、腫瘍の成長および転移の形成を妨げることだけではなく、それらの退行を促進することでもある。患者の寿命の予想は延長されるべきであり、そして、彼の健康および生命の質は向上されるべきである。免疫治療の成功について、現在のところ、今まで使用された治療的処置は、不幸にも、単一の場合のみか、または一部においてのみ成功を達成することができたと言うことができる。多くの腫瘍マーカーが、分化の特定の段階において、所定の量で健康な細胞にも存在することは、基本的な問題である。従って、そのような腫瘍マーカーに対する免疫系の活性化が、所望の程度まで、または要求される特異性とともに起こらないことが多い。
【0005】
本発明の目的は、上記目的を高レベルで(to a high extent)達成する、腫瘍治療のための薬剤を開発することである。さらに、本発明による薬剤が使用される場合、比較的迅速かつ簡便に腫瘍治療が行われ得るべきである。
【0006】
本発明は、腫瘍の免疫治療のための組成物に関する。腫瘍材料が評価され、粉砕され、そして精製された細胞懸濁液中に移され、次いでインターフェロン−ガンマおよび酢酸トコフェロールとともにインキュベートされ、そして凍結されて腫瘍細胞溶菌液が形成され、かつ、単球が、軟膜(buffy coats)または全血液から単離され、次いで、サイトカインとのインキュベーションによって樹枝状細胞への分化が引き起こされ、そして非粘着性段階へ移され、そこで、算出した量の上記凍結腫瘍細胞溶菌液を解凍し、抗原として添加し、サイトカインを添加し、インキュベーションを行い、そして生成された成熟樹枝状細胞を採取する方法によって、その組成物を得ることができる。
【0007】
腫瘍材料の“評価”とは、組織の巨視的評価を意味し、そこでは、脂肪性の連結性および機能性腎臓組織、血管、ならびに他の非腫瘍組織の明らかに認識できる一部が同定され、次いで取り除かれ、そして廃棄される。
【0008】
特定の態様において、自己由来腫瘍材料が、組成物の生成のために使用される。組成物を生成する場合、IL−4およびGM−CSF、ならびに/またはIFN−ガンマを、分化のために未成熟樹枝状細胞に添加することが好ましい。
【0009】
本発明による組成物は、薬剤として、または、免疫治療のための薬剤の調製に特に適している。本発明による細胞溶菌液を含む薬剤は、皮内または皮下注射されることが好ましい。
【0010】
全ての考えられるタイプの固形腫瘍疾患は、本発明による薬剤によって治療され得る。本発明による組成物を含む薬剤は、他の治療方法がわずかしか有効ではない腫瘍の治療に特に適している。特に、他の悪性固形腫瘍のほかに、これらは、悪性黒腫、腎癌、腸癌、膵臓癌、リンパ腫、気管支癌および婦人科的腫瘍を含む。
【0011】
患者が、腫瘍治療の範囲内で本発明の薬剤によって治療されると、患者に対する予期せず現れたプラスの効果(unexpectedly pronounced positive effects)が観察される。腫瘍の成長および転移の形成を、驚くほど高い程度まで防ぐことができたのに対し、腫瘍の退行は促進された。患者の健康、生命の質、および寿命の予想は、明らかに向上した。おそらく、本発明による薬剤が、重要な面において既知のものとは異なっているために、これらの効果が達成され得る。多くの既知の方法との1つの特別な違いは、腫瘍マーカーは、患者に単に投与されるのではなく、輸送手段として、樹枝状細胞中の患者の免疫系内へ直接導入されることである。驚くべきことに、それは、腫瘍細胞の未精製細胞溶菌液を、インビトロで樹枝状細胞に添加するのに十分であるのに対し、WO−A−99/47687によれば、抗原を有する細胞は、精製された抗原と混合されるか、またはそれとともにトランスフェクトされる。従って、本発明による方法は、既知の方法と比べて、より迅速かつより簡単に行うこともできる。このことは、そのような治療用物質の調製において、汚染の危険性を低く保つために、特に重要である。また、細胞溶菌液は、腫瘍の全抗原レパートリーが利用できるという利点を有する。
【0012】
本発明はまた、腫瘍細胞の懸濁液が調製され、腫瘍細胞が殺され、そして単球が血液から単離され、樹枝状細胞へのそれらの分化が引き起こされ、それによって得られた“未成熟”樹枝状細胞が、殺された腫瘍細胞の細胞溶菌液とともにインキュベートされ、樹枝状細胞の成熟が引き起こされ、そして“成熟”樹枝状細胞が採取される、薬剤の調製方法にも関する。
【0013】
単球は、軟膜、分離された幹細胞、白血球除去血(leukapheretic)生成物、または全血液から単離されることが好ましい。
【0014】
“未成熟”樹枝状細胞への単球の分化は、サイトカイン、IL−4、およびGM−CSFによって引き起こされることが好ましい。“未成熟”から“成熟”樹枝状細胞への成熟を引き起こすのに特に適しているのは、IL−4およびGM−CSFのほかに、プロスタグランジンE2およびTNF−α、ならびに/またはIL−1βおよびIL−6である。腫瘍細胞懸濁液の調製は、一般に、腫瘍材料を単離し、任意に評価することによって行われ、それは、次いで粉砕され、精製した細胞懸濁液中に移される。本発明による方法の特定の態様において、腫瘍細胞の懸濁液は、自己由来腫瘍材料から調製される。別の好ましい態様では、膜を有する(membrane−borne)蛋白質複合体の発現が、前記の腫瘍細胞を殺す前に、腫瘍細胞懸濁液中で引き起こされる。その誘発は、インターフェロン−ガンマおよび酢酸トコフェロールによって行われることが好ましい。腫瘍細胞は、特に、凍結によって殺される。顕微鏡的確認により、および/または蛍光性抗体を用いた表面抗原の特徴付けによって評価する場合に、典型的な形態的特徴(例えば、ベール(veil)形成)が存在するときに、成熟樹枝状細胞の採取が行われることが好ましい。本発明はまた、記載の組成物の使用、および腫瘍治療のための薬剤の調製のための、その考えられ得る態様に関する。
【0015】
本発明によれば、記載の組成物およびその考えられ得る態様は、腫瘍の種痘(vaccination)のための薬剤の調製のためにも使用される。
【0016】
【実施例】
腫瘍治療のための組成物の調製
A)腫瘍細胞溶菌液の調製
腫瘍組織の調製のために、巨視的に明らかに認識できる、脂肪性の連結性および機能性腎臓組織、ならびに血管および壊死組織の一部が注意深く取り除かれ、廃棄される。あらかじめ調製された組織が、できるだけ小さいサイズ(直径約2−3mmの小片)に粉砕され、および/または脱核され、次いで、周辺培地とともに、滅菌したふるい(50−100メッシュ)中に移される。ふるい中に存在する組織片を、加圧することなく、ガラス棒によってゆっくり攪拌することによって通過させる。通過した細胞は、RPMI 1640培地とともに、滅菌ビーカー内へ移され、15mlのRPMI培地(25mmolのHEPESを含むRPMI1640)をふるい中へ添加した後、ふるい中の組織残留物を、ガラス棒によって再度通過させる。
【0017】
細胞懸濁液を、45%パーコール(Percoll)クッション上へ積層する。この段階は、存在する全ての赤血球の除去およびパーコールクッション上の単核細胞を多くするために役立つ。充填された管を遠心分離し、単核細胞との中間相(interphase)を吸い取り、管内へ移し、遠心分離によってペレット化し、そしてNaCl/グルコース溶液によって洗浄する。トリパンブルー(trypan blue)によって細胞を染色した後、ノイバウアー計数チャンバー(Neubauer counting chamber)を用いて、元気な(vital)細胞の総数を、顕微鏡によって決定する。また、テストシンプレッツ(TestSimplets)(登録商標)(ベーリンガー・マンハイム(Boehringer Mannheim))を用いて、細胞タイピング(typing)を行う。これは、迅速な染色法によって癌細胞を他の細胞と区別できるようにするのに適している。塩化ナトリウム/グルコース溶液中に細胞を再懸濁させた後、ビタミンE(調製されるべき一回の服用量当たり700μg)およびインターフェロン−ガンマ(調製されるべき一回の服用量当たり1500IU)が添加される。37℃で2時間、水浴中で混合物をインキュベートし、遠心分離し、そして塩化ナトリウム/グルコース溶液によって2回洗浄する。混合物を、凍結管(cryotubes)へ等分し、−85℃±5℃で凍結することによって、腫瘍細胞溶菌液に転換する。品質の調整は、細胞計数、滅菌、および活力喪失に関する詳細(specification)による試験を含む。
【0018】
B)樹枝状細胞および腫瘍治療のための組成物の調製
使用する培地:
培地A:RPMI培地+1%自己由来血漿
培地B:培地A+GM−CSF(800U/ml)+IL−4(1000U/ml)
培地C:培地B+TNF−α(1000U/ml)+プロスタグランジンE2(1μg/ml)
【0019】
譲り受けた(released)献血、白血球除去血(leukaphereses)からの軟膜、または血液バッグからの全血液を、遠心分離管内へ移して遠心分離する。中間相は、単核細胞(=軟膜)を含み、赤血球(底部)および血漿(最上部)から分離される。血漿および単核細胞は、リンホプレップ(Lymphoprep)(登録商標)(ナイカムド(Nycomed))上に積層され、遠心分離される。その後、血漿および単核細胞は、ピペットで取り出され、再度遠心分離される。血漿を取り出し、培地の調製のために使用する。必要であれば、更なる培地Aを調製するために、残留血漿を+2℃〜+8℃で保存する。細胞ペレットを、NaCl溶液(0.9%)で2回洗浄し、遠心分離する。2回目の洗浄段階の前に、トリパンブルーで染色した後に、元気な細胞を数える。遠心分離残留物を、細胞濃度4×106/mlで培地Aに入れる。細胞懸濁液を、ペトリ(Petri)皿に載せ、37℃±1℃、5%CO2で2時間インキュベートする。次いで、粘着性細胞(単球)の顕微鏡による確認を行い、そこで、培地Aを注意深く吸い出し、非粘着性細胞を除去する。
【0020】
培地Bをペトリ皿へ添加した後、37℃±1℃および5%CO2でインキュベートする。1日目に、培地Bを吸い出し、新しい培地を添加する。2日目に、培地Bの一部(3ml)を取り出し、新しい培地B(3ml)を添加する。5日目に、顕微鏡による確認を行い、粘着性細胞が、非粘着性段階へ移行したかを見る。一価(one charge)の細胞を組み合わせ、トリパンブルーによって染色した後に、元気な細胞を数える。細胞を、遠心分離で取り除き、算出した量(5×105/ウェル/3ml)を培地Cへ入れ、最終量の1/10に相当する量である、算出した量(5×104/ウェル/3ml)の腫瘍細胞溶菌液を添加した後、均質化し、37℃±1℃および5%CO2で1時間インキュベートし、次いで、培地Cを最終量まで充填する。細胞懸濁液を、6−ウェルプレート上で平板培養し、37℃±1℃/5%CO2で更にインキュベートする。6日目および7日目に、顕微鏡による確認を行う:樹枝状細胞の成熟プロセスが始まり、“ベール形成”を示す。8日目に、顕微鏡による確認において、“ベール形成”が現れ始めたときに、成熟樹枝状細胞を“採取する”。成熟樹枝状細胞を、遠心分離によってペレット化し、そして2回洗浄する。遠心分離残留物を、0.9%NaCl溶液中へ取り出し、トリパンブルーによって染色した後に、元気な細胞を数え、そしてNaCl溶液を、所望の細胞数に調整するために使用する。
本出願は、悪性腫瘍の免疫治療に特に適している組成物、およびそれらの調製方法、および薬剤の調製のためのそれら組成物の使用に関する。
【0002】
通常、腫瘍の治療的処置は、過激な(radical)手術、化学療法、放射線療法、またはホルモン療法によって行われる。これらの治療法は、多くの望ましくない副作用を有し、かつ患者への多大な負担を伴う。更に、いくつかの腫瘍形態では、これらの治療では、ほとんど何の改善も得られないので、副作用の観点からは、それらの使用は、妥当ではないようである。これらの形態は、特に、悪性腫瘍、悪性黒腫、腎癌、腸癌、および膵臓癌を含む。従って、例えば、腎癌の死亡率は、85%である。
【0003】
近年、腫瘍と免疫系との間の複合体相互作用に関する知識がますます得られてきており、免疫系を刺激する、腫瘍の治療のためのストラテジーに興味が向けられてきている。一般に、そのような治療の目的は、免疫系において、健康な細胞には存在しないか、またはわずかしか(only so to a lower extent)存在しない腫瘍細胞から特異的抗原を認識できるようにすることである。これは、例えば、アンチキャンサー・リサーチ(Anticancer Research)[(1997) No. 17, 2879−2882頁, 及び3117−3120頁]に記載の薬剤を投与することによって達成される;腫瘍組織は、患者から取り出され、自己由来腫瘍細胞溶菌液に加工され、患者に注射される。これは、腫瘍抗原に対する免疫性が、溶菌液にもたらされることを期待して行われる。別のストラテジーは、公開特許出願WO−A 99/47687に記載されている。そこでは、それらの表面に特別な腫瘍の決定基(determinant)が現れた自己由来抗原を有する(autologous antigen−presenting)細胞が、患者に注射される。
【0004】
腫瘍治療の目的は、腫瘍の成長および転移の形成を妨げることだけではなく、それらの退行を促進することでもある。患者の寿命の予想は延長されるべきであり、そして、彼の健康および生命の質は向上されるべきである。免疫治療の成功について、現在のところ、今まで使用された治療的処置は、不幸にも、単一の場合のみか、または一部においてのみ成功を達成することができたと言うことができる。多くの腫瘍マーカーが、分化の特定の段階において、所定の量で健康な細胞にも存在することは、基本的な問題である。従って、そのような腫瘍マーカーに対する免疫系の活性化が、所望の程度まで、または要求される特異性とともに起こらないことが多い。
【0005】
本発明の目的は、上記目的を高レベルで(to a high extent)達成する、腫瘍治療のための薬剤を開発することである。さらに、本発明による薬剤が使用される場合、比較的迅速かつ簡便に腫瘍治療が行われ得るべきである。
【0006】
本発明は、腫瘍の免疫治療のための組成物に関する。腫瘍材料が評価され、粉砕され、そして精製された細胞懸濁液中に移され、次いでインターフェロン−ガンマおよび酢酸トコフェロールとともにインキュベートされ、そして凍結されて腫瘍細胞溶菌液が形成され、かつ、単球が、軟膜(buffy coats)または全血液から単離され、次いで、サイトカインとのインキュベーションによって樹枝状細胞への分化が引き起こされ、そして非粘着性段階へ移され、そこで、算出した量の上記凍結腫瘍細胞溶菌液を解凍し、抗原として添加し、サイトカインを添加し、インキュベーションを行い、そして生成された成熟樹枝状細胞を採取する方法によって、その組成物を得ることができる。
【0007】
腫瘍材料の“評価”とは、組織の巨視的評価を意味し、そこでは、脂肪性の連結性および機能性腎臓組織、血管、ならびに他の非腫瘍組織の明らかに認識できる一部が同定され、次いで取り除かれ、そして廃棄される。
【0008】
特定の態様において、自己由来腫瘍材料が、組成物の生成のために使用される。組成物を生成する場合、IL−4およびGM−CSF、ならびに/またはIFN−ガンマを、分化のために未成熟樹枝状細胞に添加することが好ましい。
【0009】
本発明による組成物は、薬剤として、または、免疫治療のための薬剤の調製に特に適している。本発明による細胞溶菌液を含む薬剤は、皮内または皮下注射されることが好ましい。
【0010】
全ての考えられるタイプの固形腫瘍疾患は、本発明による薬剤によって治療され得る。本発明による組成物を含む薬剤は、他の治療方法がわずかしか有効ではない腫瘍の治療に特に適している。特に、他の悪性固形腫瘍のほかに、これらは、悪性黒腫、腎癌、腸癌、膵臓癌、リンパ腫、気管支癌および婦人科的腫瘍を含む。
【0011】
患者が、腫瘍治療の範囲内で本発明の薬剤によって治療されると、患者に対する予期せず現れたプラスの効果(unexpectedly pronounced positive effects)が観察される。腫瘍の成長および転移の形成を、驚くほど高い程度まで防ぐことができたのに対し、腫瘍の退行は促進された。患者の健康、生命の質、および寿命の予想は、明らかに向上した。おそらく、本発明による薬剤が、重要な面において既知のものとは異なっているために、これらの効果が達成され得る。多くの既知の方法との1つの特別な違いは、腫瘍マーカーは、患者に単に投与されるのではなく、輸送手段として、樹枝状細胞中の患者の免疫系内へ直接導入されることである。驚くべきことに、それは、腫瘍細胞の未精製細胞溶菌液を、インビトロで樹枝状細胞に添加するのに十分であるのに対し、WO−A−99/47687によれば、抗原を有する細胞は、精製された抗原と混合されるか、またはそれとともにトランスフェクトされる。従って、本発明による方法は、既知の方法と比べて、より迅速かつより簡単に行うこともできる。このことは、そのような治療用物質の調製において、汚染の危険性を低く保つために、特に重要である。また、細胞溶菌液は、腫瘍の全抗原レパートリーが利用できるという利点を有する。
【0012】
本発明はまた、腫瘍細胞の懸濁液が調製され、腫瘍細胞が殺され、そして単球が血液から単離され、樹枝状細胞へのそれらの分化が引き起こされ、それによって得られた“未成熟”樹枝状細胞が、殺された腫瘍細胞の細胞溶菌液とともにインキュベートされ、樹枝状細胞の成熟が引き起こされ、そして“成熟”樹枝状細胞が採取される、薬剤の調製方法にも関する。
【0013】
単球は、軟膜、分離された幹細胞、白血球除去血(leukapheretic)生成物、または全血液から単離されることが好ましい。
【0014】
“未成熟”樹枝状細胞への単球の分化は、サイトカイン、IL−4、およびGM−CSFによって引き起こされることが好ましい。“未成熟”から“成熟”樹枝状細胞への成熟を引き起こすのに特に適しているのは、IL−4およびGM−CSFのほかに、プロスタグランジンE2およびTNF−α、ならびに/またはIL−1βおよびIL−6である。腫瘍細胞懸濁液の調製は、一般に、腫瘍材料を単離し、任意に評価することによって行われ、それは、次いで粉砕され、精製した細胞懸濁液中に移される。本発明による方法の特定の態様において、腫瘍細胞の懸濁液は、自己由来腫瘍材料から調製される。別の好ましい態様では、膜を有する(membrane−borne)蛋白質複合体の発現が、前記の腫瘍細胞を殺す前に、腫瘍細胞懸濁液中で引き起こされる。その誘発は、インターフェロン−ガンマおよび酢酸トコフェロールによって行われることが好ましい。腫瘍細胞は、特に、凍結によって殺される。顕微鏡的確認により、および/または蛍光性抗体を用いた表面抗原の特徴付けによって評価する場合に、典型的な形態的特徴(例えば、ベール(veil)形成)が存在するときに、成熟樹枝状細胞の採取が行われることが好ましい。本発明はまた、記載の組成物の使用、および腫瘍治療のための薬剤の調製のための、その考えられ得る態様に関する。
【0015】
本発明によれば、記載の組成物およびその考えられ得る態様は、腫瘍の種痘(vaccination)のための薬剤の調製のためにも使用される。
【0016】
【実施例】
腫瘍治療のための組成物の調製
A)腫瘍細胞溶菌液の調製
腫瘍組織の調製のために、巨視的に明らかに認識できる、脂肪性の連結性および機能性腎臓組織、ならびに血管および壊死組織の一部が注意深く取り除かれ、廃棄される。あらかじめ調製された組織が、できるだけ小さいサイズ(直径約2−3mmの小片)に粉砕され、および/または脱核され、次いで、周辺培地とともに、滅菌したふるい(50−100メッシュ)中に移される。ふるい中に存在する組織片を、加圧することなく、ガラス棒によってゆっくり攪拌することによって通過させる。通過した細胞は、RPMI 1640培地とともに、滅菌ビーカー内へ移され、15mlのRPMI培地(25mmolのHEPESを含むRPMI1640)をふるい中へ添加した後、ふるい中の組織残留物を、ガラス棒によって再度通過させる。
【0017】
細胞懸濁液を、45%パーコール(Percoll)クッション上へ積層する。この段階は、存在する全ての赤血球の除去およびパーコールクッション上の単核細胞を多くするために役立つ。充填された管を遠心分離し、単核細胞との中間相(interphase)を吸い取り、管内へ移し、遠心分離によってペレット化し、そしてNaCl/グルコース溶液によって洗浄する。トリパンブルー(trypan blue)によって細胞を染色した後、ノイバウアー計数チャンバー(Neubauer counting chamber)を用いて、元気な(vital)細胞の総数を、顕微鏡によって決定する。また、テストシンプレッツ(TestSimplets)(登録商標)(ベーリンガー・マンハイム(Boehringer Mannheim))を用いて、細胞タイピング(typing)を行う。これは、迅速な染色法によって癌細胞を他の細胞と区別できるようにするのに適している。塩化ナトリウム/グルコース溶液中に細胞を再懸濁させた後、ビタミンE(調製されるべき一回の服用量当たり700μg)およびインターフェロン−ガンマ(調製されるべき一回の服用量当たり1500IU)が添加される。37℃で2時間、水浴中で混合物をインキュベートし、遠心分離し、そして塩化ナトリウム/グルコース溶液によって2回洗浄する。混合物を、凍結管(cryotubes)へ等分し、−85℃±5℃で凍結することによって、腫瘍細胞溶菌液に転換する。品質の調整は、細胞計数、滅菌、および活力喪失に関する詳細(specification)による試験を含む。
【0018】
B)樹枝状細胞および腫瘍治療のための組成物の調製
使用する培地:
培地A:RPMI培地+1%自己由来血漿
培地B:培地A+GM−CSF(800U/ml)+IL−4(1000U/ml)
培地C:培地B+TNF−α(1000U/ml)+プロスタグランジンE2(1μg/ml)
【0019】
譲り受けた(released)献血、白血球除去血(leukaphereses)からの軟膜、または血液バッグからの全血液を、遠心分離管内へ移して遠心分離する。中間相は、単核細胞(=軟膜)を含み、赤血球(底部)および血漿(最上部)から分離される。血漿および単核細胞は、リンホプレップ(Lymphoprep)(登録商標)(ナイカムド(Nycomed))上に積層され、遠心分離される。その後、血漿および単核細胞は、ピペットで取り出され、再度遠心分離される。血漿を取り出し、培地の調製のために使用する。必要であれば、更なる培地Aを調製するために、残留血漿を+2℃〜+8℃で保存する。細胞ペレットを、NaCl溶液(0.9%)で2回洗浄し、遠心分離する。2回目の洗浄段階の前に、トリパンブルーで染色した後に、元気な細胞を数える。遠心分離残留物を、細胞濃度4×106/mlで培地Aに入れる。細胞懸濁液を、ペトリ(Petri)皿に載せ、37℃±1℃、5%CO2で2時間インキュベートする。次いで、粘着性細胞(単球)の顕微鏡による確認を行い、そこで、培地Aを注意深く吸い出し、非粘着性細胞を除去する。
【0020】
培地Bをペトリ皿へ添加した後、37℃±1℃および5%CO2でインキュベートする。1日目に、培地Bを吸い出し、新しい培地を添加する。2日目に、培地Bの一部(3ml)を取り出し、新しい培地B(3ml)を添加する。5日目に、顕微鏡による確認を行い、粘着性細胞が、非粘着性段階へ移行したかを見る。一価(one charge)の細胞を組み合わせ、トリパンブルーによって染色した後に、元気な細胞を数える。細胞を、遠心分離で取り除き、算出した量(5×105/ウェル/3ml)を培地Cへ入れ、最終量の1/10に相当する量である、算出した量(5×104/ウェル/3ml)の腫瘍細胞溶菌液を添加した後、均質化し、37℃±1℃および5%CO2で1時間インキュベートし、次いで、培地Cを最終量まで充填する。細胞懸濁液を、6−ウェルプレート上で平板培養し、37℃±1℃/5%CO2で更にインキュベートする。6日目および7日目に、顕微鏡による確認を行う:樹枝状細胞の成熟プロセスが始まり、“ベール形成”を示す。8日目に、顕微鏡による確認において、“ベール形成”が現れ始めたときに、成熟樹枝状細胞を“採取する”。成熟樹枝状細胞を、遠心分離によってペレット化し、そして2回洗浄する。遠心分離残留物を、0.9%NaCl溶液中へ取り出し、トリパンブルーによって染色した後に、元気な細胞を数え、そしてNaCl溶液を、所望の細胞数に調整するために使用する。
Claims (16)
- 腫瘍材料が評価され、粉砕され、そして精製された細胞懸濁液中に移され、次いでインターフェロン−ガンマおよび酢酸トコフェロールとともにインキュベートされ、そして凍結されて腫瘍細胞溶菌液が形成され、かつ
単球が、軟膜または全血液から単離され、次いで、サイトカインとのインキュベーションによって樹枝状細胞への分化が引き起こされ、そして非粘着性段階へ転換され、
そこで、算出した量の上記凍結腫瘍細胞溶菌液を解凍し、抗原として添加し、サイトカインを添加し、インキュベーションを行い、そして生成された成熟樹枝状細胞を採取する方法によって得られ得る組成物。 - 自己由来腫瘍材料が、調製のために使用される、請求項1に記載の組成物。
- 調製における“未成熟”樹枝状細胞への分化のために、IL−4およびGM−CSFが添加される、請求項1に記載の組成物。
- 請求項1〜3の少なくとも1項に記載の組成物を含む薬剤。
- 腫瘍細胞の腫瘍細胞懸濁液が調製され、腫瘍細胞が殺され、そして単球が血液から単離され、樹枝状細胞へのそれらの分化が引き起こされ、かつ
それにより得られた“未成熟”樹枝状細胞が、殺された腫瘍細胞の細胞溶菌液とともにインキュベートされ、樹枝状細胞の成熟が引き起こされ、そして“成熟”樹枝状細胞が採取される、薬剤の調製方法。 - 単球が、軟膜、全血液、白血球除去血、または分離された幹細胞から単離される、請求項5に記載の方法。
- インターフェロン−ガンマありで、またはなしで、サイトカイン、IL−4およびGM−CSFによって、“未成熟”樹枝状細胞への単球の分化が引き起こされる、請求項5および/または6に記載の方法。
- “未成熟”から“成熟”樹枝状細胞への成熟が、IL−4およびGM−CSFに加えて、プロスタグランジンE2およびTNT−αならびに/またはIL−1βおよびIL−6によって引き起こされる、請求項5〜7の少なくとも1項に記載の方法。
- 腫瘍細胞懸濁液が、腫瘍材料を単離し、かつ任意に評価することによって調製され、次いで、それが粉砕され、そして精製された細胞懸濁液中に移される、請求項5〜8の少なくとも1項に記載の方法。
- 腫瘍細胞懸濁液が、自己由来腫瘍材料を単離し、かつ任意に評価することによって調製され、次いで、それが粉砕され、そして精製された細胞懸濁液中に移される、請求項5〜9の少なくとも1項に記載の方法。
- 膜を有する蛋白質複合体の発現が、前記の腫瘍細胞を殺す前に、腫瘍細胞懸濁液中で引き起こされる、請求項5〜10の少なくとも1項に記載の方法。
- 膜を有する蛋白質複合体の発現が、インターフェロン−ガンマおよび酢酸トコフェロールによって引き起こされる、請求項11に記載の方法。
- 腫瘍細胞が、凍結によって殺される、請求項5に記載の方法。
- 顕微鏡的確認により、および/または蛍光性抗体を用いた表面抗原の特徴付けによって評価する場合に、典型的な形態的特徴(例えば、ベール形成)が存在するときに、“成熟”樹枝状細胞が採取される、請求項5に記載の方法。
- 腫瘍治療のための薬剤の調製のための請求項1に記載の組成物の使用。
- 腫瘍の種痘のための薬剤の調製のための請求項1に記載の組成物の使用。
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