ES2908885T3

ES2908885T3 - Método para fabricar una vacuna tumoral

Info

Publication number: ES2908885T3
Application number: ES17179714T
Authority: ES
Inventors: Helge Rönnau; Stephan Kiessig
Original assignee: Vcc Medical Deutschland GmbH
Current assignee: Vcc Medical Deutschland GmbH
Priority date: 2017-07-05
Filing date: 2017-07-05
Publication date: 2022-05-04
Anticipated expiration: 2037-07-05
Also published as: EP3425400A1; WO2019007665A1; EP3425400B1; US20210364528A1

Abstract

Método de identificación de una composición efectiva de antígenos para una vacuna tumoral, que comprende las etapas de: - determinar anticuerpos que se han producido en al menos 10 pacientes tras la vacunación con una vacuna autóloga, habiéndose obtenido la vacuna mediante material tumoral que se ha recogido de los pacientes, habiéndose separado las células tumorales del tejido acompañante, habiéndose inactivado las células tumorales y habiéndose proporcionado en una forma adecuada para su administración como vacuna autóloga, habiéndose aplicado la vacuna autóloga a los pacientes, habiéndose aislado los anticuerpos específicos de tumor producidos por los pacientes, - determinar los anticuerpos que se comparten en al menos un 80% de los pacientes, e - identificar los antígenos correspondientes a los anticuerpos determinados.

Description

DESCRIPCIÓN

Método para fabricar una vacuna tumoral

La presente invención se refiere a un método de identificación de mezclas de antígenos efectivas para vacunas tumorales.

El cáncer es una de las enfermedades más amenazantes en humanos, principalmente porque las perspectivas de un tratamiento exitoso son bajas. Un problema es que el cáncer compendia una multitud de enfermedades con origen y desarrollo muy diferentes que tienen solo la aparición de tumores malignos en común. Con creces, no se entiende completamente por qué y cómo un humano desarrolla tumores y otros no. Además, los procesos subyacentes a un tratamiento exitoso no están totalmente aclarados.

Aunque existen diversas propuestas para el tratamiento, el concepto de activar el sistema inmunitario propio de los pacientes parece uno de los enfoques más prometedores, dado que se espera que dé como resultado menos de los efectos secundarios comúnmente graves asociados con los tratamientos reconocidos de quimioterapia y radioterapia. Además, el sistema inmunitario estimulado debería ser más efectivo a la hora de eliminar las células tumorales residuales que permanecen en el cuerpo del paciente tras la eliminación quirúrgica del tumor primario que conllevan el riesgo de recidiva de la enfermedad y formación de metástasis.

El sistema inmunitario reacciona a un patógeno encontrado, como una célula tumoral, con varias etapas. En primer lugar, se inicia una acción inespecífica general por células como los macrófagos y las células dendríticas que están presentes en todo tejido y se activan mediante el reconocimiento de moléculas compartidas con los patógenos. Tras su activación, liberan mediadores inflamatorios que atraen células inmunitarias inespecíficas como los fagocitos que a su vez invocan a leucocitos y linfocitos. Una reacción más específica en respuesta a patógenos que presentan antígenos es la producción de anticuerpos y células inmunitarias específicas que son capaces de combatir los patógenos que presentan el mismo antígeno más rápidamente tras un encuentro adicional. El/los antígeno(s) se definen como cualquier sustancia que puede reconocerse específicamente por componentes de los sistemas inmunitarios, por ejemplo, células B (receptores y anticuerpos) y células T (receptor de células T). Antigenicidad significa la propiedad de una sustancia de ser reconocida por componentes del sistema inmunitario. Inmunogenicidad designa la propiedad de una sustancia de inducir una respuesta inmunitaria, para lo que se requieren dos cosas: el antígeno más la presencia simultánea de una señal de peligro. Un anticuerpo es el resultado de la respuesta inmunitaria humoral, presente en suero, plasma y en el fluido intersticial que reconoce el antígeno y activa varios mecanismos efectores (por ejemplo, ADCC = citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (antibody dependent cellular cytotoxicity)) para la eliminación del patógeno, por ejemplo, una célula cancerosa. Como resultado de la respuesta inmunitaria celular, células T específicas de patógeno están presentes solo en la corriente sanguínea. Las células T específicas reconocen el patógeno, específicamente células tumorales, por medio de los antígenos y activan mecanismos efectores (por ejemplo, células T citotóxicas).

Un ejemplo de un tratamiento que se basa en la activación del sistema inmunitario es el tratamiento de carcinoma de células renales con una vacuna obtenida a partir de células tumorales autólogas, designado RENIALE™. Tal como se notifica en Wittke et al. (“Rationales for a multi-epitope approach in autologous rean cell cancer tumor vaccine”, J. Vaccines Vaccin 2016, ISSN:2157-7560 JVV) pudo mostrarse eficacia en un estudio de fase III (Jocham et al.: Adjuvant autologous renal tumour cell vaccine and risk of tumour progression in patients with renal-cell carcinoma after radical nephrectomy: phase III, randomised controlled trial. Lancet 2004; 363: 594-99). Sin embargo, no es en absoluto una tarea fácil obtener una aprobación para vacunas autólogas. Cada vacuna se elabora individualmente a partir de material tumoral obtenido del paciente separando las células tumorales del tejido restante, inactivando las células tumorales y proporcionándolas en una forma adecuada para su administración. La vacuna obtenida es necesariamente una mezcla muy compleja de células y fragmentos de células que no pueden caracterizarse de manera apropiada. Pero exactamente eso es lo que se requiere para la aprobación como medicamento.

Por tanto, sería deseable encontrar un método para proporcionar vacunas más homogéneas con componentes bien definidos. Debido a la heterogeneidad de los tumores, incluso dentro de un tumor de un paciente, esto no se ha conseguido.

Se ha encontrado ahora sorprendentemente que una vacuna efectiva puede ensamblarse a partir de antígenos sintéticos, cuando se determinan los antígenos relevantes para un tipo específico de tumor para un conjunto de al menos 10 pacientes produciendo vacunas autólogas según el proceso aplicado para RENIALE™, la aplicación de esta vacuna autóloga a los pacientes, el aislamiento y la determinación de los anticuerpos y las señales de peligro producidas por los pacientes en respuesta y el ensamblaje de la vacuna a partir de todas las señales de peligro y los antígenos correspondientes a los anticuerpos determinados que se ha encontrado que se comparten en al menos un 80%.

Por tanto, la presente invención alcanza el objeto anterior mediante un método de identificación de una composición efectiva de antígenos para una vacuna tumoral (de manera abreviada método de identificación), que comprende las etapas de determinar anticuerpos producidos por al menos 10 pacientes, preferiblemente al menos 20, más preferiblemente al menos 50 y lo más preferiblemente al menos 100 pacientes, tras la vacunación con una vacuna autóloga obtenida recogiendo material tumoral de los pacientes, separando las células tumorales del tejido acompañante, inactivando las células tumorales y proporcionándolas en una forma adecuada para su administración como vacuna autóloga, la aplicación de la vacuna autóloga a los pacientes, el aislamiento y la determinación de los anticuerpos producidos por los pacientes que se ha encontrado que se comparten en al menos un 80% de los pacientes, preferiblemente en al menos un 50% y lo más preferiblemente en al menos un 30% de los pacientes, e identificar los antígenos correspondientes a los anticuerpos determinados. El objeto se alcanza adicionalmente, pero sin formar parte de la invención reivindicada, mediante un método de fabricación de una vacuna tumoral (de manera abreviada método de fabricación), que comprende identificar una composición efectiva de antígenos con el método de identificación y ensamblar la vacuna a partir de las señales de peligro y los antígenos sintéticos correspondientes a los antígenos identificados con el método de identificación. Por último, pero no menos importante, el objeto se alcanza, pero sin formar parte de la invención reivindicada, mediante una vacuna tumoral que puede obtenerse mediante el método de fabricación.

El método de identificación es capaz de identificar un conjunto de antígenos y señales de peligro adecuado para fabricar vacunas según el método de fabricación sin ninguna necesidad de material tumoral autólogo y su conversión en una vacuna. Aunque la efectividad de la vacuna aumenta con el número de pacientes incluidos en el método de determinación de los antígenos efectivos, se encontró que 10 pacientes ya proporcionan una base de datos muy buena. Sorprendentemente, era posible determinar un conjunto de antígenos que se comparte en todos los tumores de un tipo de cáncer específico como el cáncer de células renales.

El método de identificación requiere inicialmente tratar un número suficiente de pacientes con una vacuna autóloga. Adicionalmente, los pacientes tienen que dar su consentimiento para donar sangre o plasma o suero, que es necesario para la determinación de los anticuerpos producidos en respuesta a la vacunación.

El tratamiento con vacunas autólogas es estado de la técnica, pueden encontrarse descripciones detalladas, por ejemplo, en el documento EP 1305041 B1 y el documento EP 1974742 A1 y numerosas publicaciones académicas. El método específico de producción de la vacuna autóloga y de tratamiento de los pacientes no es crítico para el método de identificación según la invención, las características relevantes son el uso de una vacuna autóloga y obtener la sangre, el plasma o el suero para la determinación de la respuesta inmunitaria específica. La sangre, el plasma o el suero debe donarse aproximadamente de 3 a 12 meses, preferiblemente de 5 a 8 meses tras la vacunación.

A continuación, los anticuerpos (como sustitutos de las células T específicas) producidos por los pacientes en respuesta a la vacunación autóloga (con antígenos más señales de peligro) tienen que aislarse y determinarse. Esto se lleva a cabo mediante procedimientos estándar, por ejemplo, kits de prueba tales como ELISA, inmunotransferencia de tipo Western, proteómica topológica y FACS. Se encuentran detalles, por ejemplo, en:

Prikryl P, Vojtova L, Maixnerova D, Vokurka M, Neprasova M, Zima T, Tesar V. Physiol Res. 12 de abril de 2017.

[publicación electrónica antes de la impresión]: Proteomics approach for identification of IgA nephropathy-related biomarkers in urine. Rapp C, Warta R, Stamova S, Nowrouzi A, Geisenberger C, Gal Z, Roesch S, Dettling S, Juenger S, Bucur M, Jungk C, DaoTrong P, Ahmadi R, Sahm F, Reuss D, Fermi V, Herpel E, Eckstein V, Grabe N, Schramm C, Weigand MA, Debus J, von Deimling A, Unterberg A, Abdollahi A, Beckhove P, Herold-Mende C. Acta Neuropathol.

22 de marzo de 2017. doi: 10.1007/s00401 -017-1702-1. [publicación electrónica antes de la impresión] Identification of T cell target antigens in glioblastoma stem-like cells using an integrated proteomics-based approach in patient specimens. Ramirez Rodriguez PB, Rosario Cruz R, Domínguez Garcia DI, Hernández Gutiérrez R, Lagunes Quintanilla RE, Ortuño Sahagún D, González Castillo C, Gutiérrez Ortega A, Herrera Rodriguez SE, Vallejo Cardona A, Martinez Velázquez M. Exp Parasitol. Noviembre de 2016;170:227-235. doi: 10.1016/j.exppara.2016.10.005. publicación electrónica 8 de octubre de 2016: Identification of immunogenic proteins from ovarian tissue and recognized in larval extracts of Rhipicephalus (Boophilus) microplus, through an immunoproteomic approach. Bassani-Sternberg M, Braunlein E, Klar R, Engleitner T, Sinitcyn P, Audehm S, Straub M, Weber J, Slotta-Huspenina J, Specht ^{K, Martignoni ME, Werner A, Hein R, H Busch D, Peschel C, Rad R, Cox J, Mann M, Krackhardt}aM. ^{Nat Commun.}

21 de noviembre de 2016;7:13404. doi: 10.1038/ncomms13404. Direct identification of clinically relevant neoepitopes presented on native human melanoma tissue by mass spectrometry.

Una vez que se han aislado y determinado los anticuerpos, se seleccionan los relevantes mediante análisis estadístico. Se ha encontrado que seleccionar aquellos anticuerpos que se comparten en un 80% de los pacientes proporciona un conjunto de anticuerpos que corresponde a un conjunto de antígenos que es eficaz como vacuna. Preferiblemente se seleccionan los anticuerpos que se comparten en un 50% de los pacientes, más preferiblemente en un 30% de los pacientes, para proporcionar vacunas más potentes. Se indica que aunque seleccionando más anticuerpos es más probable que la vacuna contenga antígenos suficientes para estimular la respuesta inmunitaria frente a todas las células tumorales, los costes para la vacuna aumentan. Así, la selección es un compromiso entre la completitud y los costes.

La última etapa del método de identificación según la invención es la identificación de los antígenos correspondientes a los anticuerpos seleccionados. Esto puede conseguirse fácilmente con bases de datos existentes, por ejemplo, Expasy (https://www.expasy.org) o mediante la combinación de diferentes métodos como

• cromatografía de afinidad, HPLC, IEC, SEC y/o cromatografía de líquidos en combinación con diferentes clases de espectroscopía de masas

• el uso de bibliotecas de expresión génica (Protagen: http://protagen.com/tests/autoimmunebiomarkers. Aquí hay más de 7000 proteínas humanas expresadas. También pueden buscarse por la unión de autoanticuerpos específicos (preferiblemente), en este caso anticuerpos específicos antitumorales mediante ensayos en fase sólida clásicos (1. incubación del antisuero con la biblioteca de antígenos unidos en fase sólida, 2. incubación con un anticuerpo antiespecie etiquetado, 3. detección de la etiqueta [por ejemplo, fluorometría, colorimetría, fluorimetría resuelta en el tiempo, etc.]). Hay que tener en cuenta que la inmunidad tumoral es siempre autoinmunidad. La diferencia es la enfermedad. En enfermedades autoinmunitarias, el autoanticuerpo (o la reacción autoinmune) está implicado en la patogénesis primaria. En pacientes tumorales, la autoinmunidad frente al tumor debe pasar a formar parte del proceso de curación.

La fabricación de la vacuna tumoral se basa en los antígenos identificados con el método según la invención y posibilita fabricar una vacuna que es efectiva frente al tipo de tumor para el que se han identificado los antígenos independientemente del paciente específico. Al agrupar aquellos antígenos correspondientes a especificidades de anticuerpo que se encuentran de la manera más frecuente, se obtiene un conjunto que activa de manera fiable el sistema inmunitario frente al tipo de tumor. La vacuna se completa con señales de peligro conocidas como tal, véase, por ejemplo, Chen W, Syldath U, Bellmann K, Burkart V, Kolb H. J Immunol. 15 de marzo de 1999;162(6):3212-9. Human 60-kDa heat-shock protein: a danger signal to the innate immune system. Una vez que se identifican los anticuerpos y con ellos los antígenos necesarios para una vacuna frente a un tipo de tumor específico, ya no es necesario recoger tejido tumoral y producir una vacuna autóloga. Se obtiene una vacuna estándar adecuada para su aprobación y para su uso en todos los pacientes con el tipo de tumor específico.

Los antígenos sintéticos necesarios para ensamblar la vacuna están disponibles comercialmente de empresas como RD Systems, Wiesbaden-Nordenstadt, Alemania, AbD serotec, Düsseldorf, Alemania, etc. Si un antígeno específico no estuviera disponible, puede expresarse mediante sistemas conocidos como el sistema presentado por Protagen, para detalles véanse:

Wittke S, Baxmann S, Fahlenkamp D, Kiessig ST. Onco Targets Ther. 27 de enero de 2016;9:523-37. doi: 10.2147/OTT.S92182. eCollection 2016. Tumor heterogeneity as a rationale for a multi-epitope approach in an autologous renal cell cancer tumor vaccine.

Knudsen E, Vail P, Balaji U, Ngo H, Botros IW, Makarov V, Riaz N, Balachandran VP, Leach SD, Thompson DM, Chan TA, Witkiewicz AK. Clin Cancer Res. 27 de marzo de 2017. pii: clincanres.0162.2017. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-17-0162. [publicación electrónica antes de la impresión] Stratification of Pancreatic Ductal Adenocarcinoma: Combinatorial Genetic, Stromal, and Immunological Markers.

Wafa EI, Geary SM, Goodman JT, Narasimhan B, Salem AK. Acta Biomater. 1 de marzo de 2017;50:417-427. doi: 10.1016/j.actbio.2017.01.005. publicación electrónica 4 de enero de 2017. The effect of polyanhydride chemistry in particle-based cancer vaccines on the magnitude of the anti-tumor immune response.

Lokhov PG, Balashova EE. Recent Patents on Biotechnology, 2017, 11, 32-41. SANTAVAC™: A Novel Universal Antigen Composition for Developing Cancer Vaccines

Lokhov PG, Balashova EE. J Immunol Res. 2016; 2016: 5031529. Allogeneic Antigen Composition for Preparing Universal Cancer Vaccines

Andor N, et al.: Pan-cancer analysis of the extent and consequences of intra-tumor heterogeneity. Nat Med. enero de 2016; 22(1): 105-113.

En infecciones, daño tisular, infiltraciones tumorales los componentes microbianos o tisulares/celulares proporcionan señales que alertan al sistema inmunitario de peligro y fomentan la generación de inmunidad. En ausencia de tales señales, a menudo no hay respuesta inmunitaria o puede desarrollarse tolerancia. Esto ha conducido al concepto de que el sistema inmunitario responde solo a antígenos que se percibe que están asociados con una situación peligrosa tal como infección (Shi Y. et al.: Molecular identification of a danger signal that alerts the immune system to dying cells. Nature 425, 516-521 (2 de octubre de 2003 doi:10.1038/nature01991). Especialmente las proteínas de choque térmico (HSP, heat shock proteins) se identifican como señales de peligro potentes (Todryk SM et al.: Heat shock proteins refine the danger theory, Immunology. Marzo de 2000; 99(3): 334-337. doi: 10.1046/j.1365-2567.2000.00002.x). Las propiedades de recuperación de la conformación funcional de antígenos de las HSP se destacaron en el marco de la vacunación tumoral mediante el trabajo de Srivastava (Srivastava PK, Menoret A, Basu S, Binder RJ, McQuade KL. Heat shock proteins come of age: primitive functions acquire new roles in an adaptive world. Immunity. 1998;8:657.). Varias HSP han mostrado ahora la capacidad de portar antígenos tumorales y generar inmunidad protectora frente al reto de tumores vivos en modelos murinos, incluyendo HSP-70, HSP-90 y gp96. En estos experimentos, las moléculas de HSP se extrajeron y purificaron de tumores frente a los que se buscaba inmunidad. Las HSP de tejidos normales o las HSP de tumores, que entonces se desproveyeron de sus péptidos asociados mediante adenosina trifosfatasa (ATPasa) antes de la vacunación, no conferían protección frente al tumor (Udono H et al.: Cellular requirements for tumor-specific immunity elicited by heat shock proteins: tumor rejection antigen gp96 primes CD8+ T cells in vivo. Proc Natl Acad Sci USA. 1994;9:3077. Suto R, Srivastava PK. A mechanism for the specific immunogenicity of heat shockprotein-chaperoned peptides. Science. 1995;269:1585). Tales señales de peligro conocidas se combinan con los antígenos identificados en la vacuna.

La vacuna puede contener adyuvantes para potenciar la respuesta inmunitaria. Son adecuadas sustancias conocidas como tal, por ejemplo, Al(OH)³, emulsiones de aceite-en-agua, liposomas, acetato de tocoferol, saponina, LPS detox. de Salmonellae, ISCOMS (complejos inmunoestimulantes), oligonucleótidos CpG (ADN bacteriano) y combinaciones de los mismos. Detalles sobre adyuvantes pueden encontrarse, por ejemplo, en https://www.capnetz.de/html/capnetz/events/symposium2010/presentation/neue-adjuvantien-in-derimpfstoffentwicklung-chancen-und-risiken.pdf.

La aplicación de la vacuna para el tratamiento de un paciente que lo necesite se ajusta a la necesidad, es decir dependiendo predominantemente del tipo de tumor específico, la fase de la enfermedad y la respuesta del paciente. Normalmente, la vacunación empieza un mes tras la eliminación quirúrgica del/de los tumor(es), y se continúa mediante 1-12, por ejemplo, 5 pero también hasta 24 vacunaciones adicionales (habitualmente 1-3 por mes, preferiblemente una vez al mes). Una dosificación útil puede ser, por ejemplo, 4 - 6 x 10⁶células desvitalizadas/ml. La vacuna puede adaptarse para la aplicación i.m., i.v., i.c., i.d. o s.c. al paciente. La forma de dosificación preferida es la vacunación i.d.

La terapia de un paciente específico puede optimizarse adicionalmente analizando el tejido tumoral, la sangre (por ejemplo, células tumorales en circulación), el plasma o el suero del paciente tras el tratamiento con la vacuna. La donación de sangre, plasma o suero y el aislamiento/la determinación de anticuerpos se lleva a cabo como para el método de identificación según la invención. A partir de los anticuerpos determinados, pueden seleccionarse antígenos tumorales adicionales correspondientes a anticuerpos para individualizar/adaptar la composición de la vacuna. De esta manera se obtiene una vacuna específica para el paciente. Dado que los antígenos individuales y las señales de peligro pueden estar sujetos a aprobación como tal, es posible establecer un kit de señales de peligro y antígenos aprobados para el ensamblaje de vacunas específicas para pacientes y la individualización de la vacuna “estándar” para un paciente específico. De ese modo, se espera que los costes de tratamiento totales y los efectos secundarios puedan reducirse al tiempo que se potencia la efectividad.

Una ventaja importante del método de identificación según la invención y la optimización de la vacuna tal como se describe en el párrafo anterior es que se basan en la respuesta inmunitaria en el paciente humano para identificar antígenos relevantes. Los enfoques anteriores tenían que basarse en anticuerpos producidos en animales de laboratorio, en el mejor de los casos con un sistema inmunitario humano reconstituido. El método de optimización se basa en el sistema inmunitario humano del paciente que debe tratarse. El método de identificación se basa en un conjunto de sistemas inmunitarios humanos estimulados mediante antígenos tumorales autólogos.

El método de identificación según la invención es adecuado para todas las enfermedades cancerosas en las que se desarrolle un tipo de tumor específico que pueda usarse para fabricar la vacuna autóloga y proporcione una parte suficiente de antígenos relevantes compartidos. Por tanto, se espera que puedan tratarse especialmente tumores epiteliales y no epiteliales como cáncer de páncreas, cáncer de colon, melanoma maligno, carcinoma de próstata, carcinoma pulmonar no de células pequeñas, tumores de tejidos blandos operables, glioblastoma multiforme y cáncer de células renales con la vacuna obtenida mediante el ensamblaje de señales de peligro y antígenos identificados según el método de la invención.

La invención se ilustrará adicionalmente con referencia a los ejemplos que siguen, sin restringir el alcance a las realizaciones específicas descritas. Si no se especifica lo contrario, cualquier cantidad en % o partes es en peso y en caso de duda haciendo referencia al peso total de la composición/mezcla en cuestión.

La invención incluye además todas las combinaciones de características descritas y especialmente de características preferidas que no se excluyan entre sí. Una caracterización como “aproximadamente”, “alrededor de” y una expresión similar en relación con un valor numérico significa que se incluyen valores hasta un 10% mayores y menores, preferiblemente valores hasta un 5% mayores y menores, y en cualquier caso valores al menos hasta un 1 % mayores y menores, siendo el valor exacto el valor o límite más preferido.

El término “sustancialmente libre” significa que un material particular no se añade intencionadamente a una composición, y que solo está presente en cantidades traza o como impureza. Tal como se usa en el presente documento, a menos que se indique lo contrario, el término “libre de” significa que una composición no comprende un material particular, es decir que la composición comprende el 0 por ciento en peso de tal material.

Ejemplo 1: Método de identificación

Se recibió material tumoral de 133 pacientes que se sometieron a nefrectomía radical, donando el material de manera voluntaria. Todos los pacientes proporcionaron su consentimiento informado. El material tumoral (aproximadamente 1 g) se puso en medio de transporte RMPI 1640 estéril (Invitrogen; Karlsruhe, Alemania) y se envió a 2 - 82C en el plazo de 24 h al laboratorio central. La mediana de la edad de los pacientes en el diagnóstico primario es de 60 años y la relación de hombres con respecto a mujeres es de 2 a 1.

La preparación del lisado de células tumorales (TCL, tumor cell lysate) empezó con la eliminación de tejido no tumoral visible macroscópicamente. Con el fin de obtener una única suspensión celular, el tejido tumoral restante se cortó en pequeños trozos (~ 1 mm3) y entonces se hizo pasar a través de un tamiz con un tamaño de rejilla definido (50 de malla). Las células se purificaron mediante centrifugación en gradiente de densidad Percoll. Posteriormente, las células se incubaron con interferón-y y acetato de a-tocoferol. Se tomaron alícuotas de la suspensión de células tumorales en dosis individuales de 1 ml. Se usó una triple congelación rápida a -82 ± 5°C y descongelación para desvitalizar las células.

Para la detección de antígenos se usaron kits de prueba ELISA. Las diluciones de las muestras se ajustaron según experimentos previos. Se midió la hemoglobina libre (fHb) para asegurarse de que ninguna contaminación de glóbulos rojos residuales de plasma residual influía en los resultados.

Las concentraciones de las señales de peligro HSP-60 y HSP-70 se detectaron mediante kits de prueba ELISA. Se llevaron a cabo SDS-PAGE e inmunotransferencia de tipo Western según procedimientos estándar en minigeles con gradiente del 4 - 20% (SERVA, Heidelberg, Alemania) utilizando un marcador de peso molecular (BioRad, Hercules, CA, EE. UU.). Se insolubilizaron bandas de proteína sobre una membrana de PVDF. Se realizaron incubaciones con anticuerpos primarios o secundarios/proteína-A-HRP en TBS Tween 20 al 0,1%, BSA al 1% p/v. La reacción del sustrato (TMB insoluble H2O2) [Seramun, Wolzig, Alemania] se llevó a cabo durante 20 min. La reacción se detuvo mediante la eliminación (lavado) del sustrato. Se llevó a cabo un análisis estadístico mediante métodos descriptivos usando Microsoft Excel. Se realizó proteómica topológica para demostrar la heterogeneidad de las suspensiones de células y tejidos tumorales.

Los resultados pueden resumirse tal como sigue: hay una enorme heterogeneidad antigénica entre los tumores de los pacientes. La composición antigénica de los tumores es altamente individual en las concentraciones y el patrón de antígenos encontrados. Unos pocos antígenos están presentes en la mayoría de los tumores: TPS (antígeno específico polipeptídico tisular [van Poppel H et al.: Serum tissue polypeptide antigen (TPA) as tumor marker for bladder cancer. Anticancer Res. Julio-agosto de 1996;16(4B):2205-7.]), TPA (antígeno polipeptídico tisular [Weber K.: Tissue polypeptide antigen (TPA) is related to the non-epidermal keratins 8, 18 and 19 typical of simple and nonsquamous epithelia: re-evaluation of a human tumor marker. EMBO J. Noviembre de 1984; 3(11): 2707-2714.]), NSE (enolasa específica neuronal [Lorenz J et al.: Neuron-specific enolase (NSE) and squamous cell carcinoma antigen (SCC) as serum markers in the diagnosis of bronchial carcinoma. Pneumologie. Noviembre de 1990 ;44(11):1259-63.], CA-IX (anhidrasa carbónica IX [Lam JS, Pantuck AJ, Belldegrun AS, Figlin RA. G250: a carbonic anhydrase IX monoclonal antibody. Curr Oncol Rep. 2005;7:109-115. Said J. Biomarker discovery in urogenital cancer. Biomarkers.

2005; 10 supl. 1: pág. 83-pág. 86.] y CYFRA (CYFRA 21 -1 es un fragmento de citoqueratina 19 [Cytokeratin Fragment] [Pujol JL et al.: CYFRA 21-1: a new marker of epidermoid cancer of the bronchi. Comparison with 3 other markers. Presse Med. 19 de junio de 1993;22(22):1039-42.]) están presentes en la mayoría de los tumores (> 90%), en composición con al menos 2 de estos 5 en el 100% de todos los RCC. TPA, TOPA y CYFRA son citoqueratinas, que se representan mediante un péptido con una secuencia presente en los tres antígenos: secuencia peptídica: QRGELAIKDANAKLSELEAALQRAKQ (Johansson A, Sandstrom P, Ullén A, et al. Epitope specificity of the monoclonal anticytokeratin antibody TS1. Cancer Res. 1999;59(1): 48-51.). Este péptido puede usarse para el recubrimiento en fase sólida ya sea para técnicas analíticas para detectar anticuerpos específicos frente a citoqueratinas o también para la purificación cromatográfica de afinidad de anticuerpos humanos de sistemas de expresión de anticuerpo como bibliotecas de fagos.

La última etapa del método de identificación según la invención es la identificación de los antígenos reconocidos por los anticuerpos inducidos mediante la vacuna tumoral. Para esto se usa la biblioteca de expresión génica Protagen: http://protagen.com/tests/autoimmunebiomarkers. Se hace una búsqueda en las más de 7000 proteínas humanas expresadas para la unión de los anticuerpos identificados. Los portaobjetos que contienen esta biblioteca observada se incuban con el suero de los pacientes (preferiblemente suero extraído 4 semanas después de la última vacunación con la vacuna tumoral) a una dilución de 1:50 en PBS, Tween 20 al 0,1% v/v (PBST) durante 45 min. Los portaobjetos se lavan 3 veces en (PBST) y se incuban ahora con un anticuerpo anti-IgG humana etiquetado con fluorescencia durante otros 45 min (concentración: 1 pg/ml en PBST) antes de lavar de nuevo los portaobjetos 3 veces en PBST. La evaluación se lleva a cabo mediante un barrido de fluorescencia. Los antígenos reconocidos aparecen fluorescentes.

Ejemplo 2: Vacuna

Para fabricar una vacuna, los antígenos identificados o bien se obtienen comercialmente o bien se elaboran de una manera conocida, se ajustan a 106 células/ml y se combinan con las señales de peligro HSP-60 y/o HSP-70 en una concentración de 3 ng/ml hasta 1000 gg/ml en medio celular de NaCI/glucosa. La disolución se llena en viales estériles de 1 ml y pueden almacenarse por debajo de -40°C hasta su uso. La vacuna puede usarse para la vacunación de pacientes. La composición de la vacuna puede realizarse basándose en la evaluación estadística de los antígenos más presentes o a nivel individual, basándose en la respuesta antitumoral preexistente para obtener aquellos pacientes reforzados frente a su tumor.

Algunos pacientes ya muestran una respuesta inmunitaria a su tumor. Esta respuesta inmunitaria existente puede evaluarse de manera análoga al ejemplo 1. En aquellos casos, la composición de la vacuna se ajusta según el patrón de antígenos reconocido por el sistema inmunitario de los pacientes.

Claims

REIVINDICACIONES

1 Método de identificación de una composición efectiva de antígenos para una vacuna tumoral, que comprende las etapas de:

- determinar anticuerpos que se han producido en al menos 10 pacientes tras la vacunación con una vacuna autóloga, habiéndose obtenido la vacuna mediante material tumoral que se ha recogido de los pacientes, habiéndose separado las células tumorales del tejido acompañante, habiéndose inactivado las células tumorales y habiéndose proporcionado en una forma adecuada para su administración como vacuna autóloga, habiéndose aplicado la vacuna autóloga a los pacientes, habiéndose aislado los anticuerpos específicos de tumor producidos por los pacientes,

- determinar los anticuerpos que se comparten en al menos un 80% de los pacientes, e

- identificar los antígenos correspondientes a los anticuerpos determinados.
2. - Método según la reivindicación 1, en el que además de los anticuerpos compartidos en al menos un 80% de los pacientes tal como se define en la reivindicación 1 se aíslan y determinan los anticuerpos específicos de tumor que se han producido por los pacientes que se comparten en al menos un 50% de los pacientes, preferiblemente en al menos un 30% de los pacientes, y se identifican los antígenos correspondientes.
3. - Método según la reivindicación 1 o 2, en el que se determinan los anticuerpos producidos tras la vacunación con una vacuna autóloga por al menos 20 pacientes, preferiblemente por al menos 50 pacientes y lo más preferiblemente por al menos 100 pacientes.
4. - Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el tumor es de origen epitelial o endotelial o mesotelial o una leucemia.