TWI670282B - 治療幾種血液腫瘤特別是慢性淋巴白血病（ｃｌｌ）的新型免疫療法 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及用於免疫治療方法的肽、核酸和細胞。特別是，本發明 涉及癌症的免疫療法。本發明還涉及單獨使用或與其他腫瘤相關肽(刺激抗腫瘤免疫反應疫苗複合物的活性藥物成分)聯合使用的腫瘤相關細胞毒性T輔助細胞(CTL)肽表位。本發明涉及數種新型肽序列及其變體，它們源自人腫瘤細胞HLA-I類和HLA-II類分子，可用於疫苗組合物中以引發抗腫瘤免疫反應。

Description

治療幾種血液腫瘤特別是慢性淋巴白血病(CLL)的新型免 疫療法
本發明涉及用於免疫治療方法的肽、核酸和細胞。特別是，本發明涉及癌症的免疫療法。本發明還涉及單獨使用或與其他腫瘤相關肽(刺激抗腫瘤免疫反應疫苗複合物的活性藥物成分)聯合使用的腫瘤相關細胞毒性T輔助細胞(CTL)肽表位。本發明涉及數種新型肽序列及其變體，它們源自人腫瘤細胞HLA-I類和HLA-II類分子，可用於疫苗組合物中以引發抗腫瘤免疫反應。
B細胞慢性淋巴細胞白血病(B-CLL)，也被稱為慢性淋巴白血病(CLL)，是最常見的白血病類型。
白血病是白細胞的癌症。CLL影響B細胞淋巴細胞。B細胞起源於骨髓，在淋巴結中發育，通常透過產生抗體對抗感染。在CLL中，B細胞生長失控，並在骨髓和血液中聚集並擠出健康的血細胞。CLL是小淋巴細胞淋巴瘤(SLL)的一個階段，是一種B細胞淋 巴瘤，主要出現在淋巴結中。CLL和SLL被視為是相同的基礎疾病，只是外觀不同。
CLL是一種成人疾病，但在極少數情況下，也可發生於青少年，偶爾發生于兒童中(遺傳)。大多數(>75%)新診斷患有CLL的患者為50歲以上，且大部分是男性，確診時中位年齡為70歲。有時，CLL也會影響30至39歲之間的人群，雖然這不太常見。CLL的發病率隨著年齡增加會很快上升。
在美國，2012年預計約有16,060例新病例得到確診，預計有4,580例患者因CLL死亡。
CLL在亞洲國家(如日本和中國)非常罕見，可能只占這些區域所有白血病病例的10%。
考慮上述情況，對於癌症仍然需要新型有效和安全的治療方案，特別是慢性淋巴白血病(CLL)以及不同表型的其他血液癌症，這樣可在不需要過量使用化療藥物或其他可能導致嚴重副作用的藥物的情況下，即可改善患者的健康。
本發明採用肽刺激患者免疫系統，並以一種無創方式充當抗腫瘤製劑。
在本發明的第一方面，本發明涉及一種肽，包含選自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：225、SEQ ID NO：226至SEQ ID NO：542或SEQ ID NO：543至 SEQ ID NO：1016組的一個氨基酸序列，或該序列的一種變體序列，其與SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：225或SEQ ID NO：543至SEQ ID NO：1016具有至少80%，優選至少90%同源(優選至少80%或至少90%相同)，其中所述變體誘導T細胞與所述肽發生交叉反應，或該序列的藥用鹽(其中所述肽不是潛在全長多肽)。
本發明還涉及本發明的一種肽，包含選自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：225、SEQ ID NO：226至SEQ ID NO：542或SEQ ID NO：543至SEQ ID NO：1016組的一個序列、或該序列的的一種變體，其與SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：225或SEQ ID NO：543至SEQ ID NO：1016具有至少80%，優選至少90%同源(優選至少80%或至少90%相同)，其中所述肽或其變體的總長度對於SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：225為8至100個氨基酸，優選為8至30、最優選為8至14個氨基酸，而對於SEQ ID NO：SEQ ID NO：543至SEQ ID NO：1016為12至100個氨基酸，優選為12至30並最優選為12至18個氨基酸。
下表顯示了根據本發明的肽、它們各自的SEQ ID NO、以及這些肽的可能源(潛在)蛋白。表1a和1b中所有肽與HLA-A、HLA-B或HLA-C等位基因結合，表2中的肽與HLA-DR等位基因(MHC-II類)結合。表3中的肽還可用於診斷和/或治療CLL、 急性骨髓性白血病(AML)和其他惡性血液病，這些疾病涉及過量表達或過度提呈各潛在多肽。
因此，本發明特別涉及本發明的一種肽，包含選自SEQ ID NO：543至SEQ ID NO：1016的一個序列、或與SEQ ID NO：543至SEQ ID NO：1016具有至少80%、優選90%同源性的一種變體，其中所述肽或其變體的總長度為12至100個、優選為12至30個、最優選為12至18個氨基酸。本發明特別涉及本發明的一種肽，其由SEQ ID NO：543至SEQ ID NO：1016的序列組成。
因此，特別優選的情況是為至少一種本發明中的肽，其選自SEQ ID NO：710、878、879、533、476、892、111、178、181、184、882、363、42、163、137、713、532、734、736、737、738、534、535、914、739、477、164、364、531、536、186、179、159、365、895、44和180的組，且用於AML和/或CML中的治療，如本文所述。
本發明還涉及本發明的肽用於治療CLL/AML。如下面表3所示，其中本發明中的許多肽還可用於其他癌性和增殖性疾病的適應症。
因此，本發明的另一個方面涉及使用本發明的肽(優選為組合使用)來治療選自腎上腺皮質腺瘤組群中的增殖性疾病；非骨化性纖維瘤；腦癌和選自腎嗜酸細胞瘤、腎母細胞腎瘤、淋巴結惡性黑色素瘤及大網膜平滑肌肉瘤的增殖性疾病；膠質母細胞瘤和選自少突膠質細胞瘤、腎血管肌脂瘤、肝腺瘤、肝細胞癌、肺小細胞癌、腮腺多形性腺瘤、胸膜惡性間皮瘤、神經鞘瘤、小腸胃腸道 間質瘤(GIST)和甲狀腺乳頭狀癌的的增殖性疾病；乳腺癌；軟骨肉瘤；結腸或直腸癌和選自骨巨細胞瘤、骨、非骨化性纖維瘤、乳腺粘液癌、結腸腺癌、結腸腺瘤、子宮內膜型子宮內膜腺癌、食道腺癌、腎血管肌脂瘤、腎細胞癌、脂肪肉瘤、肝細胞癌、卵巢顆粒細胞瘤、胰腺微囊腺瘤、胸膜惡性間皮瘤、攝護腺良性結節性增生、脾臟非霍奇金淋巴瘤、胃粘液腺癌、胸腺胸腺瘤、惡性甲狀腺結節增生、膀胱、移行細胞癌和外陰鱗狀細胞癌的增殖性疾病；結腸腺瘤；食管腺癌；腸惡性癌樣瘤；肌內脂肪瘤；腎透明細胞癌和選自腎上腺、腎上腺皮質癌、子宮內膜型子宮內膜腺癌、子宮內膜型子宮內膜腺癌、腎血管肌脂瘤平滑肌肉瘤、脂肪瘤肝細胞癌、淋巴結霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、胰腺腺癌、腮腺多形性腺瘤、攝護腺癌、直腸腺癌、脾慢性骨髓性白血病、脾臟非霍奇金淋巴瘤、和甲狀腺濾泡腺瘤的增殖性疾病；腎嗜酸細胞瘤；腎多囊腎病；腎細胞癌；脂肪瘤；肝細胞癌和選自腎上腺皮質腺瘤、乳腺癌、肝臟局灶性結節性增生、直腸腺癌、甲狀腺癌、結節性增生、甲狀腺癌、乳頭狀癌、結腸非霍奇金淋巴瘤、子宮內膜增生、肝腺瘤、腎癌、腎嗜酸細胞瘤、脂肪瘤、脂肪肉瘤、肝局灶性結節性增生、肝腺瘤、胸膜惡性間皮瘤、神經母細胞瘤、胰腺腺癌、胰腺微囊腺瘤、腮腺多形性腺瘤、胸膜惡性間皮瘤、滑膜肉瘤、甲狀腺結節性增生、宮頸鱗狀細胞癌的增殖性疾病；肺，非小細胞肺癌和選自乳腺癌、軟骨肉瘤、腎嗜酸細胞瘤、肝細胞癌、肺腺癌、 淋巴結霍奇金病、淋巴結非霍奇金淋巴瘤、甲狀腺淋巴結乳頭狀癌、網膜腺癌、卵巢苗勒氏混合瘤、胰腺癌、睾丸混合生殖細胞腫瘤、良性胸腺瘤的增殖性疾病以及甲狀腺、結節性增生；淋巴結霍奇金病；甲狀腺淋巴結乳頭狀癌；甲狀腺淋巴轉移性乳頭狀癌；子宮肌層肌瘤；非霍奇金淋巴瘤；非霍奇金淋巴瘤、外周T細胞型或小淋巴細胞型；胰腺腺癌和選自骨巨細胞瘤、結腸腺癌、纖維瘤病、肌內脂肪瘤、腎血管肌脂瘤、腎細胞癌、肝腺瘤、肺腺癌、子宮肌層平滑肌瘤、小淋巴細胞型非霍奇金淋巴瘤、胰腺腺癌、攝護腺良性增生結節、直腸腺癌、脾慢性粒細胞白血病、胸腺、胸腺瘤惡性的增殖性疾病；直腸腺癌；脾慢性髓細胞性白血病；脾髓外造血；胃、腺癌和選自腎上腺皮質腺瘤、骨巨細胞瘤、骨非骨化性纖維瘤、乳腺癌、結腸腺癌、結腸非霍奇金淋巴瘤、子宮內膜腺癌、腎血管肌脂瘤、腎癌、腎嗜酸細胞瘤、肝、局灶性結節性增生、肝細胞癌、淋巴結霍奇金病、甲狀腺淋巴結乳頭狀癌、甲狀腺原髓樣癌、胃轉移腺癌、神經纖維瘤、卵巢卵泡膜-纖維瘤、胰腺腺癌、胰腺微囊腺瘤、甲狀旁腺瘤、直腸腺癌、皮膚鱗狀細胞癌、脾慢性骨髓性白血病、胃腸道間質瘤(GIST)、甲狀腺結節性增生、甲狀腺乳頭狀癌、子宮頸鱗狀細胞癌和白血細胞慢性淋巴細胞性白血病的增殖性疾病；胃腸道間質瘤(GIST)；胃癌轉移性癌和選自腎上腺皮質癌、甲狀腺乳頭狀癌、皮膚、鱗狀細胞癌、乳腺癌、結腸腺癌、子宮內膜苗勒氏混合瘤、腎癌、肉瘤、肺 癌神經內分泌癌(非小細胞型)、淋巴結非霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、卵巢苗勒氏混合瘤、胰腺腺癌、直腸腺癌、皮膚基底細胞癌、胃腸道間質瘤(GIST)和宮頸腺癌的增殖性疾病；睾丸精原細胞瘤；良性胸腺瘤；甲狀腺濾泡性腺瘤；以及甲狀腺結節狀增生。
本發明的另一個優選方面涉及本發明的肽的使用，優選為聯合用於免疫治療如下表4中列出的疾病。
本發明的另一個更優選方面涉及本發明的肽的使用，更優選為聯合用於免疫治療如下表5中列出的疾病。
最後，本發明的最優選方面涉及本發明中肽的使用，最優選為聯合用於免疫治療如下表6中列出的疾病。
B4GALT1編碼似乎對有供體基質UDP-半乳糖有獨有特異性的II型膜結合糖蛋白(RefSeq)。B4GALT1被證明在多種高轉移性細胞系(例如人肺癌和卵巢癌細胞系)中上調，被描述為大腸癌侵襲性表型的一種有價值的候選生物標誌物(Poeta et al.,2012；Zhou et al.,2012)。
CP編碼一種金屬蛋白，其與血漿中大多數銅結合，並參與Fe(II)轉鐵蛋白至Fe(III)轉鐵蛋白的過氧化(RefSeq)。
CST3編碼許多胱抑素超家族，其包括多個胱抑素樣序列在內的蛋白(RefSeq)。
CTSH編碼一種溶酶體半胱氨酸蛋白酶，其對於溶酶體蛋白質總體降解非常重要(RefSeq)。CTSH在病理情況下(包括乳腺癌、黑色素瘤、膠質瘤、結直腸癌和前列腺癌)表達增加。CTSH介導的踝蛋白處理被認為可透過影響整合素的活化和粘合強度來促進癌細胞的進展(Jevnikar et al.,2013)。
DNAJC5編碼J蛋白家族中的一個成員。J蛋白透過調節70kDa熱休克蛋白的ATP酶活性而在許多細胞過程中發揮作用(RefSeq)。
FAIM3也稱為TOSO，編碼IgM的一個Fc受體(RefSeq)。FAIM3被鑒定為慢性淋巴細胞性白血病中過量表達，並與抗凋亡特性相關聯，並且受B細胞受體啟動調節。這些研究表明，FAIM3可以作為高風 險慢性淋巴細胞性白血病的預後指標(Pallasch et al.,2008；Yi et al.,2011；Yu et al.,2011)。
FCER2編碼B細胞特異性抗原和IgE的低親和力受體。它在B細胞生長和分化以及IgE產生調節中發揮重要作用(RefSeq)。
FMOD編碼小間隙蛋白聚糖家族中的一員。所編碼的蛋白質具有一個中心區域，其含有富含亮氨酸重複與4個硫酸角質素鏈，側翼有含有二硫鍵的末端結構域(RefSeq)。FMOD被證明在慢性淋巴細胞白血病細胞中高度過量表達。因此，FMOD可作為慢性淋巴細胞性白血病的潛在腫瘤相關抗原(Mayr et al.,2005)。
GALNT1編碼酶的UDP-N-乙醯基-α-D-半乳糖胺：多肽N-乙醯氨基半乳糖轉移酶(GalNAc-T)家族的一員(RefSeq)。研究顯示，GALNT1表達與人乳腺癌、卵巢癌和膀胱癌的增殖和復發程度相關。後者表明，可使用GALNT1作為人膀胱癌的臨床預後指標(Ding et al.,2012)。
GLT8D1編碼糖基轉移酶家族的一員(RefSeq)。研究顯示，GLT8D1在多數人類癌症，如腦、肝、乳腺、肺、胃、胰腺、結腸、腎、膀胱、前列腺和睾丸中表達普遍上調。GLT8D1誘導的差異甲基化基因具有作為早期癌症篩查、診斷、預後和治療干預的表觀遺傳學生物標誌物的很大可能性(Teh et al.,2012)。
GPI編碼葡萄糖磷酸異構酶蛋白家族的一員(RefSeq)。GPI基因已被確定為在人胰腺癌中可由缺氧誘導。使用GPI抑制劑(如赤蘚糖-4-磷酸)可減少幾種乳腺癌細胞系二維培養物的遷移和侵襲能力，這表明GPI抑制可能是阻斷腫瘤轉移的一種選擇策略(Yoon et al.,2001；Gallardo-Perez et al.,2014)。
GPX1編碼谷胱甘肽過氧化物酶家族的一員(RefSeq)。GPX1 rs1050450 C□>□T多態性與膀胱癌風險增加相關，但與前列腺癌無關。GPX1在患者乳腺癌細胞中高表達與較差的臨床轉歸以及接受化療後的患者總體生存期降相關，提示GPX1可作為這些患者的預後指標(Jardim et al.,2013；Men et al.,2014)。
TFRC編碼轉鐵蛋白受體，位於染色體3q29處(RefSeq)。TFRC在口腔鱗狀細胞癌中的表達率較顯著高於發育不良，這表明口腔鱗狀細胞癌病情惡化可能與TFRC表達有關。抗TFRC抗體阻斷運鐵蛋白和TFRC以及鐵攝取之間的相互作用。鐵喪失抑制細胞生長並誘導細胞凋亡(Nagai et al.,2014)。
UGCG編碼一種酶，其催化鞘糖脂生物合成中第一個糖基化步驟，鞘糖脂為含脂質和糖部分的膜組分。研究表明，UGCG在白血病、乳腺癌、腎細胞癌和乳頭狀甲狀腺癌中過量表達。UGCG透過啟動cSrc和 β-catenin信號通路來上調MDR1表達(Zhang et al.,2013；Liu et al.,2010)。
本發明還涉及本發明的肽，其具有與主要組織相容性複合體(MHC)I或II類分子結合的能力。
本發明進一步涉及本發明的肽，其中所述肽(每個)均系由或基本系由根據SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：225、SEQ ID NO：226至SEQ ID NO：542或SEQ ID NO：543至SEQ ID NO：1016的一個氨基酸序列組成。
基本上由所指氨基酸序列組成的一種肽可能有一個或兩個非錨定氨基酸(見下面錨基序相關內容)被交換，而不存在這種情況，即相比於未修飾的肽，與人類主要組織相容性複合體(MHC)-I或II類分子的能力基本上被改變或受到不利影響。在另一種基本上由氨基酸序列組成的肽中，一個或兩個氨基酸與其保守交換夥伴交換(見下文)，而不存在這種情況，即相比於未修飾的肽，與人類主要組織相容性複合體(MHC)-I或II類分子的能力基本上被改變或受到不利影響。
本發明進一步涉及本發明的肽，其中所述肽被修飾和/或包含非肽鍵。
本發明進一步涉及本發明的肽，其中所述肽為融合蛋白的一部分，特別是與HLA-DR抗原相關不變鏈(Ii)的N-端氨基酸融合，或與抗體(例如，樹突狀細胞特定抗體)或抗體的序列融合。
本發明進一步涉及一種核酸，其編碼本發明的肽。
本發明進一步涉及一種本發明的核酸，為DNA、cDNA、PNA、RNA，也可能為其組合物。
本發明進一步涉及一種能表達和/或表達本發明核酸的表達載體。
本發明進一步涉及本發明中的一種肽根據SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：225、SEQ ID NO：226至SEQ ID NO：542或SEQ ID NO：543至SEQ ID NO：1016、本發明的一種核酸或本發明的一種藥用表達載體。
本發明進一步涉及本發明中特定於根據SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：225、SEQ ID NO：226至SEQ ID NO：542或SEQ ID NO：543至SEQ ID NO：1016的肽的抗體，及其製備方法。
本發明進一步涉及T細胞受體(TCR)，特別是靶向作用於根據SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：225、SEQ ID NO：226至SEQ ID NO：542或SEQ ID NO：543至SEQ ID NO：1016的肽的可溶性TCR(sTCR)和/或本發明中所述肽與MHC的複合物，及其製備方法。
本發明進一步涉及含本發明核酸或前述表達載體的一種宿主細胞。
本發明進一步涉及為一種抗原提呈細胞的本發明宿主細胞。
本發明進一步涉及本發明的宿主細胞，其中抗原提呈細胞為樹突細胞。
本發明進一步涉及配製本發明一種肽的一種方法，該方法包括培養本發明的宿主細胞和從宿主細胞或其培養基中分離肽。
本發明進一步涉及一種體外製備啟動的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的方法，該方法包括將CTL與載有抗原的人I或II類MHC分子進行體外連接，這些分子在合適的抗原提呈細胞表面表達足夠的一段時間從而以抗原特異性方式啟動CTL，其中所述抗原為本發明的任何一種肽。
本發明進一步涉及本發明中的方法，其中抗原透過與足夠量的含抗原提成細胞的抗原結合被載入表達於合適抗原提呈細胞表面的I或II類MHC分子。
本發明進一步涉及本發明的方法，其中抗原提呈細胞由能表達含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：225、SEQ ID NO：527至SEQ ID NO：551或SEQ ID NO：552至SEQ ID NO：1016所述肽的表達載體、或所述氨基酸序列組成。
本發明進一步涉及以本發明方法製備的啟動細胞毒性T淋巴細胞(CTL)，該淋巴細胞有選擇性地 識別一種細胞，該細胞異常表達含一種本發明氨基酸序列的多肽。
本發明進一步涉及一種殺傷患者靶細胞的方法，其中患者的靶細胞異常表達含本發明任何氨基酸序列的多肽，該方法包括給予患者本方法有效量的毒性T淋巴細胞(CTL)。
本發明進一步涉及任何所述肽、本發明的一種核酸、本發明的一種表達載體、本發明的一種細胞、本發明一種作為藥劑或製造藥劑的啟動細胞毒性T淋巴細胞的用途。
本發明進一步涉及一種本發明的用途，其中所述藥劑為一種疫苗。
本發明進一步涉及一種本發明的用途，其中藥劑可有效抗癌。
本發明進一步涉及一種本發明的用途，其中所述癌細胞為血液惡性腫瘤細胞，如：CLL或AML細胞。
本發明進一步涉及一種基於本發明的肽的特定標誌物蛋白和生物標誌物，其可用於診斷和/或判斷血液惡性腫瘤，特別是慢性淋巴性白血病(CLL)細胞。
此外，本發明涉及這些供癌症治療使用的新靶點。
此外，本發明涉及一種使用預篩選腫瘤相關肽的資料庫(「存儲庫」)製備個性化抗癌疫苗用於單個患者的方法。
是否能刺激免疫反應取決於是否存在被宿主免疫系統視為異物的抗原。發現腫瘤相關抗原的存在增加了運用宿主免疫系統干預腫瘤生長的可能性。目前，針對癌症免疫治療，正在探索利用免疫系統的體液和細胞進行免疫的各種機制。
細胞免疫反應的特定元素能特異性地識別和破壞腫瘤細胞。從腫瘤浸潤細胞群或外周血中分離出的細胞毒性T-細胞(CTL)表明，這些細胞在癌症的天然免疫防禦中發揮了重要作用。特別是CD8陽性T細胞在這種反應中發揮重要作用，TCD8+能識別通常8至10個源自蛋白或位於細胞質的缺損核糖體產物(DRIP)的氨基酸殘基的主要組織相容性複合體(MHC)所載的肽中所含的I類分子。人MHC分子也稱為人白細胞-抗原(HLA)。
MHC分子有兩類：大部分有細胞核的細胞上都可發現的MHC-I類分子。MHC分子分別由一條α重鏈和β-2-微球蛋白(MHC-I類受體)或一條α和一條β鏈(MHC-II類受體)組成。其三位構造形成一個結合槽，用於與肽進行非共價相互作用。MHC-I類分子提呈主要為內源性的蛋白、DRIPS和較大肽裂解生成的肽。MHC II類分子主要發現于專業抗原提呈細胞(APC)上，並且主要提呈在內吞作用過程中由APC佔據並且隨後被加工的外源性或跨膜蛋白的肽。肽和MHC I類分子的複合體由負載相應TCR(T細胞受體)的CD8 陽性細胞毒性T淋巴細胞進行識別，而肽和MHC II類分子的複合體由負載相應TCR的CD4陽性輔助T細胞進行識別。因此，TCR、肽和MHC因此按照1：1：1的化學計量呈現，這一點已是共識。
CD4陽性輔助T細胞在誘導和維持CD8陽性細胞毒性T細胞的有效反應中發揮重要作用。腫瘤相關抗原(TAA)衍生的CD4陽性T細胞表位元的識別對開發能引發抗腫瘤免疫反應的藥物產品可能非常重要(Gnjatic S,et al.Survey of naturally occurring CD4+ T cell responses against NY-ESO-1 in cancer patients：correlation with antibody responses.Proc Natl Acad Sci U S A.2003 Jul 22；100(15)：8862-7)。在腫瘤部位，T輔助細胞支持CTL友好型細胞因數環境(Mortara L,et al.CIITA-induced MHC II類expression in mammary adenocarcinoma leads to a Th1 polarization of the tumor microenvironment,tumor rejection,and specific antitumor memory.Clin Cancer Res.2006 Jun 1；12(11 Pt 1)：3435-43)並吸引效應細胞，如CTL、NK細胞、巨噬細胞、粒細胞(Hwang ML,et al.Cognate memory CD4+ T cells generated with dendritic cell priming influence the expansion,trafficking,and differentiation of secondary CD8+ T cells and enhance tumor control.J Immunol.2007 Nov 1；179(9)：5829-38)。
在沒有炎症的情況下，MHC II類分子的表達主要局限於免疫系統細胞，尤其是專業抗原提呈細胞(APC)，例如，單核細胞、單核細胞源性細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞。出人意料的是，在癌症患者的腫瘤細胞中發現有MHC II類分子的表達(Dengjel J,et al.Unexpected abundance of HLA II類presented peptides in primary renal cell carcinomas.Clin Cancer Res.2006 Jul 15；12(14 Pt 1)：4163-70)。
哺乳動物(如小鼠)模型顯示，即使沒有細胞毒性T淋巴細胞(CTL)效應細胞(如，CD8陽性T淋巴細胞)，CD4陽性T細胞也能透過分泌干擾素-γ(IFN γ)。
此外，研究還顯示，由於CD4陽性T細胞可從由HLA II類分子提呈的腫瘤相關抗原中識別出肽，因此能夠透過誘導抗體(Ab)反應而阻止腫瘤進展。
與結合至HLA I類分子的腫瘤相關肽相反，迄今只有少量的腫瘤相關抗原(TAA)的II類配體獲得描述。
因為HLAII類分子的組成性表達通常僅限於免疫系統細胞，所以直接從原發性腫瘤中分離II類肽被認為是不可能的。然而，Dengjel等人成功地在腫瘤中直 接識別了多個MHC II類表位(WO 2007/028574,EP 1 760 088 B1；(Dengjel et al.,2006)。
腫瘤特異性細胞毒性T淋巴細胞所識別的抗原，即它們的表位，可以是源自所有蛋白類型的分子，如酶、受體、轉錄因數等，它們在相應腫瘤的細胞中被表達，並且與同源未變的細胞相比，其表達上調。
由於CD8依賴型和CD4依賴型這兩種反應共同並協同地促進抗腫瘤作用，因此，確定和表徵由CD8+ CTL(配體：MHC I類分子+肽表位)或CD4陽性T輔助細胞(配體：MHC II類分子)識別的腫瘤相關抗原對開發腫瘤疫苗非常重要。
本發明還涉及兩種很有用的新MHC-II類肽(根據SEQ ID NO：543至SEQ ID NO：1016)。這些肽特別有利於診斷和/或治療CLL和其他過量表達和/或過度提呈抗原的癌症(其中所述抗原分別源自這些肽)，如AML。
本發明還涉及本發明MHC-II類肽(根據SEQ ID NO：543至SEQ ID NO：1016)的所述長度變體。
長度變體一般為N-和/或C-末端延伸(1至5個氨基酸，優選為1至10個氨基酸)或N-和/或C-末端縮短(1至5個氨基酸)的肽，其中所述肽還可以與MHC結合，並且可引發本文所述的細胞免疫應答。本領域已知，與II類蛋白結合的肽尺寸不受限，長度可 能為11-30個氨基酸。與MHC-II類分子槽結合的肽兩端是開放的，從而使之可與相對較長的肽結合。雖然「核心」9殘基長片段最有助於識別肽，但是側翼區對於識別II類等位基因的肽特異性也很重要(例如：Meydan C,et al.,Prediction of peptides binding to MHC class I and II alleles by temporal motifmining.BMC Bioinformatics.2013；14 Suppl 2：S13)。使用很多種可用的軟體工具(如上所述)，本領域技術人員可識別結合基序，從而識別延伸和/或刪除表1c中MHC-II類肽的可能性，以便建立長度變體。
對於觸發(引發)細胞免疫反應的肽，它必須與MHC分子結合。這一過程依賴於MHC分子的等位基因以及肽氨基酸序列的特異性多態性。MHC-I類-結合肽的長度通常為8-12個氨基酸殘基，並且在其與MHC分子相應結合溝槽相互作用的序列中通常包含兩個保守殘基(「錨」)。這樣，每個MHC的等位基因都有「結合基序」，從而確定哪些肽能與結合溝槽特異性結合。
在MHC-I類依賴性免疫反應中，肽不僅能與腫瘤細胞表達的某些MHC-I類分子結合，而且它們還必須能被T細胞特異性T細胞受體(TCR)識別。
腫瘤特異性細胞毒性T淋巴細胞所識別的抗原，即它們的表位，可以是源自所有蛋白類型的分子，如 酶、受體、轉錄因數等，它們在相應腫瘤的細胞中被表達，並且與同源未變的細胞相比，其表達上調。
目前將腫瘤相關肽分類為以下主要幾組：
a)癌-睾丸抗原：T細胞能夠識別的最先確認的TAA屬於這一類抗原，由於其成員表達于組織學相異的人腫瘤中、正常組織中、僅在睾丸的精母細胞/精原細胞中、偶爾在胎盤中，因此，它最初被稱為癌-睾丸(CT)抗原。由於睾丸細胞不表達HLA I類和II類分子，所以，在正常組織中，這些抗原不能被T細胞識別，因此在免疫學上可考慮為具有腫瘤特異性。CT抗原大家熟知的例子是MAGE家族成員或NY-ESO-1。
b)分化抗原：腫瘤和正常組織(腫瘤源自該組織)都含有TAA，大多數TAA發現于黑色素瘤和正常黑色素細胞中。許多此類黑色素細胞譜系相關蛋白參與黑色素的生物合成，因此這些蛋白不具有腫瘤特異性，但是仍然被廣泛用於癌症的免疫治療。例子包括，但不僅限於，黑色素瘤的酪氨酸酶和Melan-A/MART-1或攝護腺癌的PSA。
c)過量表達的TAA：在組織學相異的腫瘤中以及許多正常組織中都檢測到了基因編碼被廣泛表達的TAA，一般表達水準較低。有可能許多由正常組織加工和潛在提呈的表位低於T細胞識別的閾值水準，而它們在腫瘤細胞中的過量表達能夠透過打破先前確立的耐 受性而引發抗癌反應。這類TAA的典型例子為Her-2/neu、生存素、端粒酶或WT1。
d)腫瘤特異性抗原：這些獨特的TAA產生于正常基因(如β-catenin、CDK4等)的突變。這些分子變化中有一些與致瘤性轉化和/或進展相關。腫瘤特異性抗原一般可在不對正常組織帶來自體免疫反應風險的情況下誘導很強的免疫反應。另一方面，這些TAA在多數情況下只與其上確認了有TAA的確切腫瘤相關，並且通常在許多個體腫瘤之間並不都共用TAA。
e)由異常翻譯後修飾產生的TAA：此類TAA可能由腫瘤中既不具有特異性也不過量表達的蛋白產生，但其仍然具有腫瘤相關性(該相關性由主要對腫瘤具有活性的翻譯後加工所致)。此類TAA產生於變糖基化模式的改變，導致腫瘤產生針對MUC1的新型表位或在降解過程中導致諸如蛋白拼接的事件，這可能具有也可能不具有腫瘤特異性。
f)腫瘤病毒蛋白：這些TTA是病毒蛋白，可在致癌過程中發揮關鍵作用，並且由於它們是外源蛋白(非人源蛋白)，所以能夠激發T細胞反應。這類蛋白的例子有人乳頭狀瘤16型病毒蛋白、E6和E7，它們在宮頸癌中表達。
對於被細胞毒性T淋巴細胞識別為腫瘤特異性抗原或相關性抗原以及用於治療的蛋白質，必須具備特殊的條件。該抗原應主要由腫瘤細胞表達，而不由正常健 康組織表達，或表達數量相對較少；或在另一優選實施方案中，與正常健康組織相比，腫瘤細胞應該過度提呈肽。更為適宜的情況是，該相應抗原不僅出現於一種腫瘤中，而且濃度(即每個細胞的相應肽拷貝數目)高。腫瘤特異性抗原和腫瘤相關抗原往往是源自直接參與因細胞週期控制或凋亡抑制中的一項功能而發生的正常細胞向腫瘤細胞轉化的蛋白。另外，這些直接導致轉化事件的蛋白的下游靶標可能會被上調，因此可能與腫瘤間接相關。這些間接腫瘤相關抗原也可能是預防接種方法的靶標(Singh-Jasuja et al.,2004)。在這兩種情況中，至關重要的是，都要存在抗原氨基酸序列的表位，所以這種來自腫瘤相關抗原的肽(「免疫原性肽」)可導致體外或體內T細胞反應。
基本上，任何能與MHC分子結合的肽都可能充當一個T細胞表位。誘導體外或體內T細胞反應的前提是存在具有相應TCR的T細胞並且不存在對該特定表位的免疫耐受性。
因此，TAA是腫瘤疫苗研製的起點。識別和表徵TAA的方法基於對患者或健康受試者CTL的使用情況，或基於腫瘤與正常組織肽之間差別轉錄特性或差別表達模式的產生。
然而，對腫瘤組織或人腫瘤細胞株中過量表達或選擇性表達的基因的識別並不提供在免疫療法中使用這些基因所轉錄抗原的準確資訊。這是因為，有著相應 TCR的T細胞必須要存在而且對這個特定表位的免疫耐受性必須不存在或為最低水準，因此，這些抗原的表位只有一部分適合這種應用。因此，在本發明的一非常優選的實施例中，只選擇那些針對可發現功能性和/或增殖性T細胞情況的過量提呈或選擇性提呈肽，這一點非常重要。這種功能性T細胞被定義為在以特異性抗原刺激後能夠克隆地擴展並能夠執行效應子功能(「效應子T細胞」)的T細胞。
在本發明的TCR和抗體下，潛在肽的免疫原性是次要的。對於本發明的TCR和抗體，提呈是決定性因素。
輔助T細胞在編排抗腫瘤免疫的CTL效應子功能中發揮著重要作用。觸發TH1細胞反應的輔助T細胞表位支援CD8陽性殺傷T細胞的效應子功能，其中包括直接作用於腫瘤細胞的細胞毒性功能(該類腫瘤細胞表面顯示有腫瘤相關肽/MHC複合體)。這樣，腫瘤相關T輔助細胞表位單獨使用或與其他腫瘤相關肽結合使用可作為刺激抗腫瘤免疫反應的疫苗化合物的活性藥物成分。
發明人發現了新型配體組源性腫瘤相關抗原(LiTAA)，其經常只在CLL患者中檢測到。只在CLL患者中觀察到相應HLA配體(LiTAP)的特定免疫識別，明顯顯示出與HLA限制提呈頻率存在著直接的關係。此外，對33名CLL患者的回顧性生存分析表明， CLL患者中LiTAP特異性免疫應答可能與總體生存率改善存在關聯。
針對其他癌症的用途在本發明肽的蛋白描述中進行披露。
圖1顯示了原發性CLL樣本的HLA表面表達。與7個原發性CLL樣本中自體CD5-CD19+ B細胞相比時的CD5+CD19+ CLL細胞(a)HLA I類和(b)HLA II類的表達。三次試驗的資料用平均值±SD表示。與自體CD5-CD19+ B細胞(n=7)相比時的CD5+CD19+ CLL細胞(c)HLA I類和(d)HLA II類的表達。* P<0.01縮寫詞：UPN,uniform patient number(統一患者號)。
圖2顯示了用HLA配體組譜鑒定新型腫瘤相關抗原。(a)原發性CLL樣本(n=30)和HV PBMC(n=30)HLA I類配體源蛋白的重疊分析。(b)基於CLL和HV PBMC配體組的HLA限制提呈的頻率，比較分析HLA I類配體源蛋白。各源蛋白(x軸)HLA限制提呈陽性的CLL患者/HV的頻率[%]都在y軸上表示。左側方框示突出顯示了源蛋白的子集，顯示在>20%患者中CLL獨有性提呈(LiTAA：配體源性腫瘤相關抗原)。(c)HLA-I類配體組的發表的CLL相關抗原的提呈。縱軸表示CLL和HV PBMC的HLA I類配體對相應抗原的相對提呈[%]。根據抗原的CLL-關聯度，用虛線將其分為三組。(d)不同期別疾病CLL樣本的源蛋白重疊(Binet A(n=9),Binet B(n=7),Binet C(n=14))。(e)不同期別疾病LiTAA提呈頻率[%]的熱圖分析(Binet A-C，如(d)))(f)有del17p(n=5)和無del17p(n=25)的原發性CLL樣本LiTAA提呈[%]的熱圖分析。縮寫詞：CLL，慢性淋巴細胞白血病；HV，健康志願者。
圖3顯示LiTAA由CLL患者的免疫應答特異性地識別。(a)用IFNα ELISPOT檢測法進行功能評估的HLA I類LiTAA和相應LiTAP(3 HLA-A*03,5 HLA-A*02,5 HLA-B*07)。透過CLL患者PBMC的肽特異性免疫識別的絕對數量和頻率列於右列中。(b)使用HV PBMC作為對照採用EELISPOT評估的A*03 LiTAP實例。含4個經常識別肽(......)的EBV抗原表位元混合物作為陽性對照，HIV GAG18-26 A*03肽作為陰性對照。(c)對3位不同CLL患者PBMC使用HLA-A*03 LiTAPs(n=3)進行EELISPOT檢測的實例。結果顯示免疫反應LiTAP。EBV表位元混合物作為陽性對照，HIV GAG18-26 A*03肽作為陰性對照。(d)用CLL患者的PBMC作為靶向選擇策略的內部對照物測試HLA-A*03良性組織來源LiBAP(N=3)的實例。EBV表位元混合物作為陽性對照，HIV GAG18-26 A*03肽作為陰性對照。(e)CLL配體組中LiTAP提呈的等位元基因調整頻率(用MS檢測)以及用IFNγ ELISPOT中CLL患者的PBMC免疫識別的相應等位元基因調整頻率的散點圖。顯示的資料為可免疫識別的14/15 LiTAP。縮寫詞：LiTAP，配體組源性腫瘤相關肽；HV，健康志願者；neg.，陰性；pos.，陽性；UPN，統一患者編號；LiBAP，配體組源性良性組織相關肽；MS，質譜分析。
圖4顯示了附加/協同HLA II類LiTAA和LiTAP的識別。(a)原發性CLL樣本(n=20)和HV PBMC(n=13)HLA II類配體源蛋白的重疊。(b)基於CLL和HV PBMC配體組的HLA限制提呈的頻率，比較分析HLA II類配體源蛋白。各源蛋白(x軸)HLA限制提呈陽性的CLL患者/HV的頻率[%]都在y軸上表示。左側方框示突出顯示了源蛋白的子集，顯示在>20%患者中CLL獨有性提呈(LiTAA：配體源性腫瘤相關抗原)。(c)用IFNα ELISPOT檢測法進行功能評估的HLA II類LiTAA和相應LiTAP(n=6)。透過CLL患者PBMC的肽特異性免疫識別的絕對數量和頻率列於右列中。(d)使用HV PBMC作為對照採用EELISPOT評估的HLA II類LiTAP實例。PHA作為陽性對照。FLNA1669-1683 HLA-DR肽作為陰性對照。(e)對3位不同CLL患者PBMC使用HLA-II類LiTAPs(n=6)進行EELISPOT檢 測的實例。結果顯示免疫反應LiTAP。PHA作為陽性對照，FLNA1669-1683 HLA-DR肽作為陰性對照。(f)對共用/協同疫苗靶標進行CLL-獨有HLA I類和HLA II類配體源蛋白的重疊分析。(g)132個HLA I/II類LiTAA((d)中識別)的熱圖分析。指出了顯示在20% HLA I類和II類CLL患者配體組中表達的兩個源蛋白。
圖5顯示了接受化療/免疫治療的CLL患者的縱向HLA I類配體組分析。與治療前各自豐度相比較時的患者治療後HLA I類配體組中配體相比豐度的火山圖(治療後/治療前之比)。虛線表示豐度有顯著變化的閾值(>2倍，p<0.05)，右上方的配體顯著上調，左上方的配體顯著下調。顯著調節配體的頻率在各自象限中指出。在治療期間顯著調節的LiTAP用紅色標記並指出它們的序列。(a)治療前以及用利妥昔單抗/苯達莫司汀治療後48h/24h的CLL患者配體組分析(375mg/m2/90mg/m2)。1/28(3.6%)可檢測的LiTAP顯示豐度顯著變化。(b)治療前以及用阿侖單抗治療首次治療7天后CLL患者配體組分析(3劑阿侖單抗，第1、3、5天10mg、20mg和30mg；第7天配體組分析)。3/24(12.5%)可檢測的LiTAP顯示豐度顯著變化。(c)治療前以及用300mg atumumab治療後24h的CLL患者配體組分析。2/10(20.0%)可檢測的LiTAP顯示豐度顯著變化。
圖6顯示了CLL患者有關LiTAP免疫識別的回顧性生存分析。(a)44名CLL患者總體生存的Kaplan Meier圖。(b)接受LiTAP特異性免疫反應受試者的總體生存，他們分類如下：黑色，免疫反應>1LiTAP的CLL患者(n=10)。紅色，免疫反應>0LiTAP的CLL患者(n=34)。
圖7顯示了CLL患者HLA I類配體源蛋白質識別的飽和分析。獨特HLA配位體源蛋白識別次數作為30名CLL患者HLA配位元體源蛋白識別總次數的函數。不同源蛋白識別最多次數魯棒計算(R2=0.9912)的指數回歸(虛線)。虛線描繪了本組CLL患者實現的源蛋白質組覆蓋。
圖8顯示HLA-A*02和B*07 LiTAP由CLL患者的免疫應答特異性地識別。(a)用CLL患者的PBMC作為靶向選擇策略的內部對照物測試HLA-A*02(n=3)和(d)HLA-B*07(n=3)良性組織來源LiBAP的實例。EBV表位混合物作為陽性對照，HIV XXxx-xx A*02和HIV XXxx-xx HLA-B*07肽分別作為陰性對照。(b)使用HV PBMC作為對照採用EELISPOT評估的HLA-A*02(n=6)和(e)HLA-B*07(n=5)的實例。陽性和陰性對照如(a)所述。(c)對3位不同HLA匹配的CLL患者PBMC每位使用HLA-A*02(n=6)和(f)HLA-B*07(n=5)LiTAP進行EELISPOT檢測的實例。結果顯示免疫 反應LiTAP。陽性和陰性對照如(a)所述。縮寫詞：LiBAP，配體組源性良性組織相關肽；LiTAP，配體組源性腫瘤相關肽；HV，健康志願者；neg.，陰性；pos.，陽性；UPN，統一患者編號。
圖9顯示了HLA-A*03 LiTAP特異性CLL患者T細胞的細胞內細胞因數和四聚體染色。(a)PA*03 3(DMXL11271-1279 SSSGLHPPK(SEQ ID NO：77)刺激的CLL患者PBMC的IFN-γ和TNF-α細胞內染色。PMA/離子黴素作為陽性對照，HIV GAG18-26 A*03肽作為陰性對照。(b)用PA*03 3(DMXL11271-1279 SSSGLHPPK(SEQ ID NO：77)四聚體對CLL患者CD8+ T細胞進行四聚體染色。作為對照，顯示在同一名患者中用非識別的PA*02 1(ABCA61270-1278 ILDEKPVII(SEQ ID NO：63)進行四聚體染色。
圖10顯示了接受化療/免疫治療患者的原發性CLL細胞上HLA表面表達定量。CD5+CD19+ CLL細胞上的HLA表面表達在治療前後透過流式細胞儀定量。三次試驗的資料用平均值±SD表示。治療前和用利妥昔單抗治療後24h時4名患者原發性CLL細胞上(a)HLA I類和(b)HLA II類表面表達。治療前和用阿侖單抗治療後72h(10mg)和7d(60mg)時患者原發性CLL細胞上(c)HLA I類和(d)HLA II類 表面表達。* P<0.01縮寫詞：UPN，統一患者號編號；h，小時；d，天。
圖11顯示了與CLL樣本相比正常組織中肽ILDEKPVII的過量提呈。顯示的僅是檢測到肽的樣本。檢查組包括12個CLL樣本和下列正常樣本：1×脂肪組織，3×腎上腺，6×動脈，5×骨髓，7×腦，3×乳房，5×神經，13×結腸，7×食道，2×膽囊，5×心臟，12×腎，20×肝，44 x肺，3×淋巴結，4×外周血單核細胞，2×卵巢，6×胰腺，1×腹膜，3×垂體，2×胎盤，3×胸膜，3×前列腺，6×直腸，7×唾液腺，4×骨骼肌，5×皮膚，3×小腸，4×脾，5×胃，4×睾丸，3×胸腺，3×甲狀腺，3×氣管，2×輸尿管，5×膀胱，2×子宮，2×靜脈。
除非另有說明，否則本文使用的所有術語定義如下。
本文所用「肽」這一術語，系指一系列氨基酸殘基，通常透過相鄰氨基酸的α-氨基和羰基之間的肽鍵來連接。這些肽的長度優選為9個氨基酸，但至短可為8個氨基酸長度，至長可為10、11、12、13或14個氨基酸長度，如果為MHC-II類肽時，至長可為15、16、17、18、19或20個氨基酸長度。
因此，「肽」這一術語應包括一系列氨基酸殘基的鹽，通常透過相鄰氨基酸的α-氨基和羰基之間的肽 鍵來連接。優選的情況是，鹽為肽的藥用鹽，例如：氯化物或乙酸(三氟乙酸)鹽。
術語「肽」應包括「寡肽」。本文使用的術語「寡肽」是指一系列氨基酸殘基，通常透過相鄰氨基酸的α-氨基和羰基之間的肽鍵來連接。寡肽的長度對於本發明來說並不十分關鍵，只要在寡肽中保持正確的表位即可。通常，寡肽長度約小於30個氨基酸殘基，約長於15個氨基酸。
本發明的「肽」這一術語包括的肽應由根據SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：225、SEQ ID NO：527至SEQ ID NO：551或SEQ ID NO：552至SEQ ID NO：1016的如上定義的一個肽組成。
「多肽」這一術語是指一系列氨基酸殘基，通常透過相鄰氨基酸的α-氨基和羰基之間的肽鍵來連接。多肽的長度對於本發明來說並不十分關鍵，只要保持正確的表位即可。與術語肽或寡肽相對，「多肽」這一術語是指包含多於約30個氨基酸殘基的分子。
一種肽、寡肽、蛋白質或編碼該分子的核苷酸如果能誘導免疫反應，則具有「免疫原性」(因此是本發明中的一種「免疫原」)。在本發明的情況下，免疫原性的更具體定義是誘導T細胞反應的能力。因此，「免疫原」是一種能夠誘導免疫反應的分子，並且在本發明的情況下，是一種能誘導T細胞反應的分子。在另一方面， 所述免疫原可以是肽，肽與MHC的複合物、和/或用於提高特異性抗體或TCR抗性的蛋白。
I類T細胞「表位」要求的是一種結合至MHC I類受體上的短肽，從而形成一種三元複合體(MHC I類α鏈、β-2-微球蛋白和肽)，其可以透過T細胞負載匹配T細胞受體與具有適當親和力的MHC/肽複合物結合來識別。結合至MHC I類分子的肽的典型長度為8-14個氨基酸，最典型為9個氨基酸長度。
在人類中，有三種編碼MHC I類分子的不同基因位點(人MHC分子也是指定的人白細胞抗原(HLA))：HLA-A、HLA-B和HLA-C。HLA-A*01、HLA-A*02和HLA-B*07是可從這些基因位點表達的不同MHC I類等位元基因的實例。
表7：HLA-A*02和最常見HLA-DR血清類型的表達頻率F。頻率根據Mori等人(Mori M,et al.HLA gene and haplotype frequencies in the North American population：the National Marrow Donor Program Donor Registry.Transplantation.1997 Oct 15；64(7)：1017-27)使用的Hardy-Weinberg公式F=1-(1-Gf)2改編，從美國人群範圍內的單體型頻率中推導出。由於連鎖不平衡，某些HLA-DR等位基因內的A*02組合與其預期單一頻率相比，可能是濃縮的或頻率較低。有關詳細資訊，請參閱Chanock等人的文獻(S.J.Chanock,et
因此，為了治療和診斷目的，與數種不同的HLA II類受體以合適的親和力結合的肽是非常理想的。與數種不同的HLA II類分子結合的肽被稱為混雜結合劑。
本文提到的DNA序列既包括單鏈DNA也包括雙鏈DNA。因此，除非本文另有所指，否則具體的序列是該序列的單鏈DNA、該序列與其互補序列的雙工(雙鏈DNA)以及該序列的互補序列。「編碼區」這一術語是指在基因的天然基因組環境中天然或正常編碼該基因的表達產物的那部分基因，即，體內編碼該基因的天然表達產物的區域。
編碼區可來自非突變(「正常」)基因、突變基因或異常基因，甚至還可以來自DNA序列，完全可在實驗室中使用本領域熟知的DNA合成方法合成。
術語「核苷酸序列」系指去氧核苷酸的雜聚物。
編碼特定肽、寡肽或多肽的核苷酸序列可為天然核苷酸序列，也可為合成核苷酸序列。一般來說，編碼肽、多肽以及本發明蛋白的DNA片段由cDNA片段和短寡核苷酸銜接物，或一系列寡核苷酸組成，以提供一種合成基因，該基因能夠在包含源自微生物或病毒操縱子的調節元素的重組轉錄單元中被表達。
如本文所用的術語肽的「核苷酸編碼」系指對肽進行核苷酸序列編碼，其中該肽包括與將要表達該序列的生物系統相容的人工(人造)啟動和停止密碼子。
「表達產物」這一術語是指多肽或蛋白，它是基因和遺傳碼退化並因而編碼同樣的氨基酸所造成的任何核酸序列編碼同等物的翻譯產物。
「片斷」這一術語，當指的是一種編碼序列時，表示包含非完整編碼區的DNA的一部分，其表達產物與完整編碼區表達產物基本上具有相同的生物學功能或活性。
「DNA片段」這一術語是指一種DNA聚合物，以單獨的片段形式或一種較大DNA結構的組分形式存在，它們從至少分離過一次的DNA中以基本純 淨的形式獲得，即不含污染性內源性材料，並且獲得的數量或濃度能夠使用標準生化方法，例如使用克隆載體，進行識別、操縱和回收該片段及其組分核苷酸序列。此類片段以開放閱讀框架(未被內部未翻譯序列打斷)或內含子(通常提呈于真核基因中)的形式存在。未翻譯DNA序列可能存在於開放閱讀框架的下游，在那裏其不會干預編碼區的操縱或表達。
「引物」這一術語表示一種短核酸序列，其可與一個DNA鏈配對，並在DNA聚合酶開始合成去氧核糖核酸鏈之處提供一個游離的3'-OH末端。
「啟動子」這一術語表示參與RNA聚合酶的結合從而啟動轉錄的DNA區域。
術語「分離」表示一種物質從其原來的環境(例如，如果是天然發生的則是天然環境)中被移走。例如，活體動物中的天然核苷酸或多肽不是分離的，但是，從天然系統中一些或所有共存物質中分離出來的核苷酸或多肽是分離的。此類多核苷酸可能是載體的一部分和/或此類多核苷酸和多肽可能是一種組合物的一部分，並且由於該載體或組合物不是其天然環境的一部分，因此它仍然是分離的。
本發明中披露的多核苷酸和重組或免疫原性多肽也可能以「純化」的形式存在。術語「純化」並非要求絕對的純度；它只是一個相對的定義，可以包括高度純化或部分純化的製劑，相關領域技術人員能理解這些術 語。例如，各個從已用傳統方法純化為具有電泳同質性的cDNA庫中分離出的各種克隆物。明確考慮到將起始材料或天然物質純化至少一個數量級，優選為兩或三個數量級，更優選為四或五個數量級。此外，明確考慮到所述多肽的純度優選為99.999%，或至少為99.99%或99.9%；甚而適宜為以重量計99%或更高。
根據本發明公開的核酸和多肽表達產物，以及包含此類核酸和/或多肽的表達載體可能以「濃縮的形式」存在。本文使用的術語「濃縮」是指材料的濃度至少是其自然濃度的大約2、5、10、100或1000倍，有優勢的是，按重量計為0.01%，優選為至少0.1%。也明確考慮到，按重量計約為0.5%、1%、5%、10%和20%的濃縮製劑。序列、構型、載體、克隆物以及包含本發明的其他材料可有優勢地以濃縮或分離的形式存在。
「活性片段」這一術語是指產生免疫反應的片段(即具有免疫原性活性)，不論是單獨或可選地與合適的佐劑一起給予一種動物，比如哺乳動物，例如兔子或小鼠，也包括人；這種免疫反應採用的形式是在接受動物(如：人)體內刺激T細胞反應。或者，「活性片段」也可用於誘導體外T細胞反應。
本文使用的「部分」(portion)、「節段」(segment)、「片段」(fragment)這幾個術語，當與多肽相關地使用時是指殘基的連續序列，比如氨基酸殘基，其序列形成一個較大序列的子集。例如，如果一個多 肽以任一種肽鏈內切肽酶(如胰蛋白酶或糜蛋白酶)進行處理，則該處理獲得的寡肽會代表起始多肽的部分、節段或片段。當與多核苷酸相關地使用時，這些術語系指用任何核酸內切酶處理所述多核苷酸產生的產物。
根據本發明，術語「等同度百分比」或「等同百分比」，如果指的是序列，則表示在待對比序列(「被對比序列」)與所述序列或權利要求的序列(「參考序列」)對準之後將被對比序列與所述序列或權利要求的序列進行比較。然後根據下列公式計算等同度百分比：等同度百分比=100[1-(C/R)]其中C是參考序列與被對比序列之間對準長度上參考序列與被對比序列之間的差異數量，其中(i)參考序列中每個堿基或氨基酸序列在被對比序列中沒有對應的對準堿基或氨基酸；(ii)參考序列中每個空隙，以及(iii)參考序列中每個對準堿基或氨基酸與被比對比序列中對準堿基或氨基酸不同，即構成一個差異以及(iiii)必須在對準序列的第1位置開始對準；並且R是參考序列與被對比序列對準長度上在參考序列中產生任何空隙也計算為一個堿基或氨基酸的參考序列中的堿基或氨基酸數目。
如果「被對比序列」和「參考序列」之間存在的一個對準按上述計算的等同度百分比大致等於或大於指定的最低等同度百分比，則被對比序列與參考序列具有 指定的最低等同度百分比，雖然可能存在按本文上述計算的等同度百分比低於指定等同度百分比的對準。
如果無另有說明，那麼本文公開的原始(未修飾)肽可以透過在肽鏈內的不同(可能為選擇性)位點上取代一個或多個殘基而被修飾。優選情況時，這些取代位於氨基酸鏈的末端。此取代可能是保守性的，例如，其中一個氨基酸被具有類似結構和特點的另一個氨基酸所取代，比如其中一個疏水性氨基酸被另一個疏水性氨基酸取代。更保守的取代是具有相同或類似的大小和化學性質的氨基酸間的取代，例如，亮氨酸被異亮氨酸取代。在天然同源蛋白質家族序列變異的研究中，某些氨基酸的取代往往比其他氨基酸更具有耐受性，這些氨基酸往往表現出與原氨基酸的大小、電荷、極性和疏水性之間的相似性相關，這是確定「保守取代」的基礎。
在本文中，保守取代定義為在以下五種基團之一的內部進行交換：基團1-小脂肪族、非極性或略具極性的殘基(Ala,Ser,Thr,Pro,Gly)；基團2-極性、帶負電荷的殘基及其醯胺(Asp,Asn,Glu,Gln)；基團3-極性、帶正電荷的殘基(His,Arg,Lys)；基團4-大脂肪族非極性殘基(Met,Leu,Ile,Val,Cys)以及基團5-大芳香殘基(Phe,Tyr,Trp)。
較不保守的取代可能涉及一個氨基酸被另一個具有類似特點但在大小上有所不同的氨基酸所取代， 如：丙氨酸被異亮氨酸殘基取代。高度不保守的取代可能涉及一個酸性氨基酸被另一個具有極性或甚至具有鹼性性質的氨基酸所取代。然而，這種「激進」取代不能認為是無效的而不予考慮，因為化學作用是不完全可預測的，激進的取代可能會帶來其簡單化學原理中無法預見的偶然效果。
當然，這種取代可能涉及普通L-氨基酸之外的其他結構。因此，D-氨基酸可能被本發明的抗原肽中常見的L-氨基酸取代，也仍在本公開的範圍之內。此外，具有非標準R基團的氨基酸(即，除了天然蛋白的20個常見氨基酸之外的R基團)也可以用於取代之目的，以生產根據本發明的免疫原和免疫原性多肽。
如果在一個以上位置上的取代發現導致肽的抗原活性基本上等於或大於以下定義值，則對這些取代的組合進行測試，以確定組合的取代是否產生對肽抗原性的疊加或協同效應。肽內被同時取代的位置最多不能超過4個。
本發明的肽可被拉長多達四個氨基酸，即1、2、3或4個氨基酸，可按照4：0與0：4之間的任何組合添加至任意一端。
本發明的拉長組合情況如表8所示：
拉伸的氨基酸可以是所述蛋白或任何其他氨基酸的原序列肽。拉長可用于增強所述肽的穩定性或溶解性。
術語「T細胞反應」是指由一種肽在體外或體內誘導的效應子功能的特異性擴散和啟動。對於MHC I類限制性CTL，效應子功能可能為溶解肽脈衝的、肽前體脈衝的或天然肽提呈的靶細胞、分泌細胞因數，優選為肽誘導的干擾素-γ，TNF-α或IL-2，分泌效應分子，優選為肽誘導的顆粒酶或穿孔素，或脫顆粒。
優選情況是，當本發明的肽特異性CTL相比于取代肽受到檢測時，如果取代肽在相對於背景肽溶解度增加達到最大值的一半，則該肽濃度不超過約1mM，優選為不超過約1μM，更優選為不超過約1nM，再優選為不超過約100pM，最優選為不超過約10pM。也優選為，取代肽被一個以上的CTL識別，最少為2個，更優選為3個。
因此，本發明所述的表位可能與天然腫瘤相關表位或腫瘤特異性表位相同，也可能包括來自參考肽的不超過4個殘基的不同肽，只要它們有基本相同的抗原活性即可。
是否能刺激免疫反應取決於是否存在被宿主免疫系統視為異物的抗原。發現腫瘤相關抗原的提呈增加了運用宿主免疫系統干預腫瘤生長的可能性。對於癌症免疫療法，目前正在探索控制免疫系統中的體液和細胞免疫的各種機制。
細胞免疫反應的特定元素能特異性地識別和破壞腫瘤細胞。從腫瘤浸潤細胞群或外周血中分離出的細胞毒性T-細胞(CTL)表明，這些細胞在癌症的天然免疫防禦中發揮了重要作用。特別是CD8陽性T細胞在這種反應中發揮重要作用，他能識別通常8至12個源自蛋白或位於細胞質的缺損核糖體產物(DRIP)的氨基酸殘基的主要組織相容性複合體(MHC)所載的肽中所含的I類分子。人MHC分子也稱為人白細胞-抗原(HLA)。
MHC-I類分子，在細胞核提呈因主要內源性、細胞質或細胞核蛋白質、DRIPS和較大肽蛋白裂解產生的肽的細胞上都能發現此類分子。然而，源自內體結構或外源性來源的肽也經常在MHC-I類分子上發現。這種I-類分子非經典提呈方式在文獻中被稱為交叉提呈。
由於CD8及CD4依賴型反應共同和協同促進抗腫瘤作用，因此，CD8陽性CTL(MHC-I分子)或CD4陽性CTL(MHC-II類分子)對腫瘤相關抗原的識別和鑒定對開發腫瘤疫苗非常重要。因此，提出含有與任一類MHC複合體結合的肽組合物是本發明的一個目標。
考慮到治療癌症相關的嚴重副作用和費用，迫切需要更好的預後和診斷方法。因此，有必要確定代表癌症生物標誌物的其他因數，尤其是CLL。此外，有必要確定可用於治療癌症的因數，尤其是CLL。
本發明提出了有利於治療癌腫/腫瘤，優選為治療過量提呈或只提呈本發明肽的CLL。這些肽由質譜分析法直接顯示出，而由HLA分子自然提呈于人原發性人CLL樣本中。
與正常組織相比，疾病組織(如，癌組織)中高度過量表達肽來源的源基因/蛋白質(也指定為「全長蛋白」或「潛在蛋白」)。本發明相關的「正常組織」應特指來自健康供體的血液樣本和亞群血細胞，尤其是白細胞(參見實施例2和圖2)，表明腫瘤與源基因高度關聯。此外，這些肽本身也在腫瘤組織中大量提呈(本發明相關的「腫瘤組織」是指來自CLL患者的血液樣本和亞群血細胞，尤其是白細胞)，但不在正常組織中提呈(見實施例3和圖3)。
HLA結合肽能夠被免疫系統識別，特別是T淋巴細胞/T細胞。T細胞可破壞提呈被識別HLA/肽複合體，如，提呈本發明中基礎蛋白衍生肽的細胞。
本發明的所有肽已被證明具有刺激T細胞反應的能力，並過量提呈，因而可用于製備本發明的抗體和/或TCR，特別是sTCR(參見實施例4和圖4)。此外，肽與相應的MHC組合時，也可用于製備本發明的抗體和/或TCR，特別是sTCR。各個方法均為技術人員所熟知，並在各個文獻中可找到。因此，本發明的肽可用于在患者中產生免疫反應，從而能夠毀滅腫瘤細胞。患者的免疫反應能夠透過直接給予患者所述肽或前體物質(如，加長肽、蛋白或編碼這些肽的核酸)，較理想是與加強免疫原性的製劑相結合，而進行誘導。源自該治療性疫苗的免疫反應預期能夠高度特異性地對抗腫瘤細胞，因為本發明的目標肽在正常組織上提呈的複製數目較少，防止患者發生對抗正常細胞的不良自體免疫反應的風險。
「藥物組合物」是指適合在醫療機構用於人體的組合物。優選地，所述藥物組合物為無菌狀態，並根據GMP指南生產。
藥品組合物包括游離形式或以一種藥用鹽形式存在的肽(也參見上文)。此處使用的「藥用鹽」系指所公開的肽的一種衍生物，其中該肽由制酸或藥劑的堿鹽進行改性。例如，用與適合的酸反應的游離堿(通常其中的中性藥物有一個中性-NH2基團)製備酸式鹽。適合 製備酸鹽的酸包括有機酸，如：乙酸、丙酸、羥基酸、丙酮酸、草酸、蘋果酸、丙二酸、丁二酸、馬來酸、富馬酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、甲磺酸、苯磺酸、水楊酸等等、以及無機酸，如：鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸和磷酸等。相反，可在一種肽上提呈的酸性基團的堿鹽製劑使用藥用堿基進行製備，如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣、三甲胺等等。
在特別優選的實施例中，藥物組合物包括乙酸(醋酸鹽)，三氟乙酸鹽或鹽酸(氯化物)形式的肽。
本發明的肽除了用於治療癌症，也可用於診斷。由於肽由CLL(白血病)細胞產生，並且已確定這些肽在正常組織(例如，白血細胞)中不存在或水準較低，因此這些肽可用於診斷癌症是否存在。
血液樣本中含權利要求的肽，可有助於病理師診斷癌症。用抗體、質譜或其他本領域內已知的方法檢測某些肽可使病理師判斷該樣本為惡性的還是一般病變，也可用作CLL的生物標誌物。肽基團的提呈使得能對病變組織進行分類或進一步分成子類。
對病變標本中肽的檢測使得能對免疫系統治療方法的利益進行判斷，特別是如果T-淋巴細胞已知或預計與作用機制有關。MHC表達的缺失是一種機制，充分說明了哪些受感染的惡性細胞逃避了免疫監視。因此，肽的提呈表明，分析過的細胞並沒有利用這種機制。
本發明的肽可用於分析淋巴細胞對肽的反應(如T細胞反應)，或抗體對肽或MHC分子絡合的肽發生的反應。這些淋巴細胞反應可以作為預後指標，決定是否採取進一步的治療。這些反應也可以用作免疫療法中的替代指標，旨在以不同方式誘導淋巴細胞反應，如接種蛋白疫苗、核酸、自體材料、淋巴細胞過繼轉移。基因治療中，淋巴細胞對肽發生的反應可以在副作用的評估中考慮。淋巴細胞反應監測也可能成為移植療法隨訪檢查中的一種有價值的工具，如，用於檢測移植物抗宿主和宿主抗移植物疾病。
本發明中的肽可用于生成和開發出針對MHC/肽複合物的特定抗體。這些抗體可用於治療，將毒素或放射性物質靶向病變組織。這些抗體的另一用途是為了成像之目的(如PET)將放射性核素靶向病變組織。這可有助於檢測小轉移灶或確定病變組織的大小和準確位置。
因此，本發明的另一方面是提出產生特異性結合至與HLA限制性抗原絡合的I或II類人主要組織相容性複合體(MHC)的一種重組抗體的方法，該方法包括：用可溶形式的與HLA限制性抗原絡合的(MHC)I或II類分子對包含表達所述主要組織相容性說複合體(MHC)I或II類的基因工程非人哺乳動物進行免疫；將mRNA分子與產生所述非人哺乳動物細胞的抗體分離；產生一個噬菌體顯示庫，顯示由所述mRNA分子編 碼的蛋白分子；以及將至少一個噬菌體與所述噬菌體顯示庫分離，所述的至少一個噬菌體顯示所述抗體特異性地結合至與HLA限制性抗原絡合的所述人主要組織相容性說複合體(MHC)I或II類。
本發明的另一方面提出一種抗體，其特異性結合至與一種HLA限制性抗原絡合的I或II類人主要組織相容性說複合體(MHC)，其中該抗體優選為多克隆抗體、單克隆抗體、雙特異性抗體和/或嵌合抗體。
此外，本發明的另一個方面涉及產生特異性結合至與HLA限制性抗原絡合的I或II類人主要組織相容性複合體(MHC)的一種抗體的方法，該方法包括：用可溶形式的與HLA限制性抗原絡合的(MHC)I或II類分子對包含表達所述主要組織相容性說複合體(MHC)I或II類的基因工程非人哺乳動物進行免疫；將mRNA分子與產生所述非人哺乳動物細胞的抗體分離；產生一個噬菌體顯示庫，顯示由所述mRNA分子編碼的蛋白分子；以及將至少一個噬菌體與所述噬菌體顯示庫分離，所述的至少一個噬菌體顯示所述抗體可特異性地結合至與HLA限制性抗原絡合的所述人主要組織相容性說複合體(MHC)I或II類。產生這種抗體和單鏈I類主要組織相容性複合物的相應方法，以及產生這些抗體的其他工具在WO 03/068201、WO 2004/084798、WO 01/72768、WO 03/070752以及Cohen CJ,et al.Recombinant antibodies with MHC-restricted,peptide-specific,T-cell receptor-like specificity：new tools to study antigen presentation and TCR-peptide-MHC interactions.J Mol Recognit.2003 Sep-Oct；16(5)：324-32.；Denkberg G,et al.Selective targeting of melanoma and APCs using a recombinant antibody with TCR-like specificity directed toward a melanoma differentiation antigen.J Immunol.2003 Sep 1；171(5)：2197-207；以及Cohen CJ,etal.Direct phenotypic analysis of human MHC class I antigen presentation：visualization,quantitation,and in situ detection of human viral epitopes using peptide-specific,MHC-restricted human recombinant antibodies.J Immunol.2003 Apr 15；170(8)：4349-61中進行了披露，為了本發明之目的，所有參考文獻透過引用被完整地併入本文。
優選地，該抗體與複合體的結合親和力低於20納摩爾，優選為低於10納摩爾，這在本發明情況下被視為具有「特異性」。
本發明的另一方面提出了製備識別特異性肽-MHC複合物的可溶性T細胞受體的一種方法。這種可溶性T細胞受體可從特異性T細胞克隆中產生，並且 它們的親和力可以透過互補決定區靶向誘變而增加。為了T細胞受體選擇之目的，可以使用噬菌體展示(美國2010/0113300，Liddy N,et al.Monoclonal TCR-redirected tumor cell killing.Nat Med 2012 Jun；18(6)：980-987)。為了在噬菌體展示期間以及實際使用為藥物時穩定T細胞受體之目的，可透過非天然二硫鍵、其他共價鍵(單鏈T細胞受體)或透過二聚化結構域連接α和β鏈(參見Boulter JM,et al.Stable,soluble T-cell receptor molecules for crystallization and therapeutics.Protein Eng 2003 Sep；16(9)：707-711.；Card KF,etal.A soluble single-chain T-cell receptor IL-2 fusion protein retains MHC-restricted peptide specificity and IL-2 bioactivity.Cancer Immunol Immunother 2004 Apr；53(4)：345-357；以及Willcox BE,et al.Production of soluble alphabeta T-cell receptor heterodimers suitable for biophysical analysis of ligand binding.Protein Sci 1999 Nov；8(11)：2418-2423)。T細胞受體可以連接到毒素、藥物、細胞因數(參見US 2013/0115191)、域招募效應細胞，如抗CD3域等，以便對靶細胞執行特定的功能。此外，它可能表達於用於過繼轉移的T細胞。
進一步的資訊可在WO 2004/033685A1和WO 2004/074322A1中找到。sTCR的組合在WO 2012/056407A1中進行了描述。WO 2013/057586A1中公開了製備的進一步的方法。
此外，可用這些TUMAP在活檢樣本的基礎上驗證病理師對癌症的診斷。
為了選擇過度提呈的肽，計算了提呈圖，其顯示樣本中位元提呈量以及複製變化。該特點使相關腫瘤實體的樣本與正常組織樣本的基線值並列。透過計算調節線性混合效應模型(J.Pinheiro,et al.The nlme Package：Linear and Nonlinear Mixed Effects Models.2007)的p值可以將以上每個特點併入過度提呈分數中，從而透過假髮現率調整多項檢驗(Y.Benjamini and Y.Hochberg.Controlling the False Discovery Rate：A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing.Journal of the Royal Statistical Society.Series B(Methodological),Vol.57(No.1)：289-300,1995)。
對於透過質譜法對HLA配體的識別和相對定量，對來自衝擊冷凍組織樣本的HLA分子進行純化並對HLA相關肽進行分離。分離的肽分開，並透過線上納米-電噴霧-電離(nanoESI)液相色譜-譜(LC-MS)實驗進行鑒定。由此產生的肽序列的驗證方法 是，將CLL樣本中記錄的天然TUMAP的片段模式與相同序列相應合成參考肽的片段模式進行比較。由於這些肽被直接鑒定為原發性腫瘤HLA分子的配體，因此這些結果為獲得自CLL患者的原發性癌症組織上確定肽的天然加工和提呈提供了直接證據。
發現管道XPRESIDENT® v2.1(例如，參見US 2013-0096016，並在此透過引用將其整體併入本文)考慮到識別和選擇相關過量提呈的候選肽疫苗，這基於與幾種不同的非癌組織和器官相比癌症或其他受感染組織的HLA限制肽水準直接相對定量結果。這透過以下方法實現：使用專有資料分析管道處理的LC-MS採集資料、結合序列識別演算法、譜聚類、計算離子、保留時間調整、充電狀態卷積以及正態化而開發無標記差異化定量方法。
為每種肽和樣本確立了提呈水準，包括誤差估計值。腫瘤組織大量提呈的肽以及腫瘤與非腫瘤組織和器官中過量提呈的肽已經得到確定。
對來自CLL組織樣本的HLA肽複合物進行純化，並且對HLA相關肽使用LC-MS進行分離和分析(見實施例)。本申請中包含的所有TUMAP使用原發性CLL樣本的方法進行鑒定，確認其在原發性CLL上的提呈。
本申請中包含的所有TUMAP使用原發性CLL樣本的方法進行鑒定，確認其在原發性CLL上的提呈。
在多個CLL腫瘤和正常組織上確定的TUMAP用無標記LC-MS資料的離子計數方法進行量化。該方法假定肽的LC-MS信號區域與樣本中其豐度相關。各種LC-MS實驗中肽的所有量化信號在集中趨勢基礎上進行正常化，根據每個樣品進行平均，併合併入柱狀圖(被稱為提呈圖)。提呈圖整合了不同分析方法，如：蛋白資料庫檢索、譜聚類、充電狀態卷積(除電)和保留時間校準和正態化。
因此，本發明涉及一種肽，包含選自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：225、SEQ ID NO：527至SEQ ID NO：551或SEQ ID NO：552至SEQ ID NO：1016的組的一個序列、或與SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：225、SEQ ID NO：527至SEQ ID NO：551或SEQ ID NO：552至SEQ ID NO：1016具有至少90%同源(優選為相同)的一種變體、或誘導與所述肽發生T細胞交叉反應的一種變體，其中所述肽不是基礎全長多肽。
本發明進一步涉及一種肽，包含選自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：225、SEQ ID NO：527至SEQ ID NO：551或SEQ ID NO：552至SEQ ID NO：1024的組的一個序列、或與SEQ ID NO：1至 SEQ ID NO：225、SEQ ID NO：527至SEQ ID NO：551或SEQ ID NO：552至SEQ ID NO：1016具有至少90%同源(優選為相同)的一種變體，其中該肽或變體的總長度為8至100個氨基酸，優選為8至30個氨基酸，最優選為8至14個氨基酸。
本發明進一步涉及本發明的肽，其具有與主要組織相容性複合體(MHC)I或II類分子結合的能力。
本發明進一步涉及本發明的肽，其中該肽系由或基本系由根據SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：225、SEQ ID NO：527至SEQ ID NO：551或SEQ ID NO：552至SEQ ID NO：1016的一個氨基酸序列組成。
本發明進一步涉及本發明的肽，其中該肽(在化學上)被修飾和/或包含非肽鍵。
本發明進一步涉及本發明的肽，其中該肽為融合蛋白的一部分，特別包括HLA-DR抗原相關不變鏈(Ii)的N-端氨基酸，或其中該肽與一種抗體(例如，樹突狀細胞特定抗體)融合。
本發明進一步涉及一種核酸，其編碼本發明所述肽，前提是該肽並非完整的人蛋白。
本發明進一步涉及一種本發明的核酸，為DNA、cDNA、PNA、RNA，也可能為其組合物。
本發明進一步涉及一種能表達本發明核酸的表達載體。
本發明進一步涉及本發明的一種肽、本發明的一種核酸或本發明的一種藥用表達載體。
本發明進一步涉及含本發明核酸或本發明表達載體的一種宿主細胞。
本發明進一步涉及為一種抗原提呈細胞的本發明宿主細胞。
本發明進一步涉及本發明的宿主細胞，其中抗原提呈細胞為樹突細胞。
本發明進一步涉及配製一種本發明肽的一種方法，該方法包括培養所述宿主細胞和從宿主細胞或其培養基中分離肽。
本發明進一步涉及一種體外製備啟動的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的方法，該方法包括將CTL與載有抗原的人I或II類MHC分子進行體外連接，這些分子在合適的抗原提呈細胞表面表達足夠的一段時間從而以抗原特異性方式啟動CTL，其中所述抗原為本發明的任何一種肽。
本發明進一步涉及所述方法，其中所述抗原透過與足夠量的含抗原提成細胞的抗原結合被載入表達於合適抗原提呈細胞表面的I或II類MHC分子。
本發明進一步涉及本發明的方法，其中抗原提呈細胞由能表達含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：225、SEQ ID NO：527至SEQ ID NO：551或 SEQ ID NO：552至SEQ ID NO：1016所述肽的表達載體、或所述氨基酸序列組成。
本發明進一步涉及以本發明中方法製備的啟動細胞毒性T淋巴細胞(CTL)，該淋巴細胞有選擇性地識別一種細胞，該細胞異常表達含一種所述氨基酸序列的多肽。
本發明進一步涉及一種殺傷患者靶細胞的方法，其中患者的靶細胞異常表達含本發明任何氨基酸序列的多肽，該方法包括給予患者本方法有效量的毒性T淋巴細胞(CTL)。
本發明進一步涉及本發明的任何肽、本發明的一種核酸、本發明的一種表達載體、本發明的一種細胞、或本發明一種作為藥劑或製造藥劑的啟動細胞毒性T淋巴細胞的用途。
本發明進一步涉及一種本發明的用途，其中該藥劑為一種疫苗。
本發明進一步涉及一種本發明的用途，其中藥劑可有效抗癌。
本發明進一步涉及一種本發明的用途，其中所述癌細胞為CLL細胞或其他非實體腫瘤細胞。
本發明進一步涉及可用作CLL預後的特殊標誌物蛋白和生物標誌物。
此外，本發明涉及按本發明所述使用新型靶點來進行癌症治療。
本文中術語「抗體」為廣義上的定義，既包括多克隆也包括單克隆抗體。除了完整或「全部」的免疫球蛋白分子，「抗體」這一術語還包括這些免疫球蛋白分子和人源化免疫球蛋白分子的片段或聚合物，只要它們表現出本發明的任何期望屬性(例如，CLL標誌物多肽的特異性結合、將毒素傳遞給CLL(白血病)標誌物基因表達水準增加時的CLL細胞和/或CLL標誌物多肽的活性)。
只要有可能，本發明的抗體可從商業來源購買。本發明的抗體也可能使用已知的方法制得。技術人員會瞭解全長CLL標誌物多肽或其片段可用于製備本發明的抗體。用於產生本發明抗體的多肽可部分或全部地由天然源經純化而得，也可利用重組DNA技術生產。
例如，本發明的編碼肽的cDNA，例如，該肽為根據SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：225、SEQ ID NO：226至SEQ ID NO：542或SEQ ID NO：543至SEQ ID NO：1016多肽的肽，或其中一個變體或片段，可在原核細胞中(如：細菌)或真核細胞(如：酵母、昆蟲或哺乳動物細胞)中表達，之後，可純化重組蛋白，並用於產生一種特異性結合用於產生本發明抗體的CLL標誌物多肽的單克隆或多克隆抗體製劑。
本領域的技術人員會認識到，兩種或兩種以上不同集合的單克隆抗體或多克隆抗體能最大限度地增加獲得一種含預期用途所需的特異性和親和力(例如， ELISA法、免疫組織化學、體內成像、免疫毒素療法)的抗體的可能性。根據抗體的用途，用已知的方法對其期望活性進行測試(例如，ELISA法、免疫組織化學、免疫治療等；要獲取產生和測試抗體的進一步指導，請參閱，例如，Harlow and Lane,Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1988,new 2nd edition 2013)。例如，抗體可用ELISA測定法或Western印跡法進行檢測。在初次體外表徵後，用於治療或體內診斷用途的抗體根據已知的臨床測試方法進行檢測。
此處使用的術語「單克隆抗體」系指從大量同質抗體中獲得的一種抗體，即，由相同的抗體組成的抗體群，但可能少量提呈的自然突變除外。此處所述的單克隆抗體具體包括「嵌合」抗體，其中一部分重鏈和/或輕鏈與從特定物種中獲得的抗體或屬於特定抗體類型和分類型抗體的相應序列相同(同質)，同時，剩餘鏈與從其他物種中獲得的抗體或屬於特定抗體類型和子類型抗體的相應序列以及這些抗體的片段相同(同質)，只要他們表現出預期的拮抗活性(美國4816567號專利，其在此以其整體併入)。
本發明的單克隆抗體可能使用雜交瘤方法制得。在雜交瘤方法中，老鼠或其他適當的宿主動物，通常 用免疫製劑以引發產生或能產生將特異性結合至免疫製劑的抗體。或者，淋巴細胞可在體外進行免疫。
單克隆抗體也可由DNA重組方法制得，如：美國4816567號專利所述。編碼本發明單克隆抗體的DNA可很容易地使用傳統程序進行分離和測序(例如：透過使用能與編碼鼠抗體重鏈和輕鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針)。
體外方法也適用於製備單價抗體。抗體消化以產生抗體的片段，尤其是Fab片段，可以透過使用本領域已知的常規技術完成。例如，可以透過使用木瓜蛋白酶完成消化。木瓜蛋白酶消化的實施例在WO 94/29348和美國4342566號專利中有描述。抗體的木瓜蛋白酶消化通常產生兩種相同的抗原結合性片段，稱為Fab片段(每個片段都有一個抗原結合點)和殘餘Fc片段。胃蛋白酶處理產生aF(ab')2片段和pFc'片段。
抗體片段，不論其是否附著於其他序列，均可包括特定區域或特定氨基酸殘基的插入、刪除、替換、或其他選擇性修飾，但前提是，片段的活性與非修飾的抗體或抗體片段相比沒有顯著的改變或損害。這些修飾可提供一些額外的屬性，如：刪除/添加可與二硫鍵結合的氨基酸，以增加其生物壽命、改變其分泌特性等。在任何情況下，抗體片段必須擁有生物活性的特性，如：結合活性、調節結合域的結合力等。抗體的功能性或活性區域可透過蛋白特定區域的基因突變、隨後表達和測試所表達的多肽 進行確定。這些方法為本行業技術人員所熟知，可包括編碼抗體片段的核酸的特定位點基因突變。
本發明的抗體可進一步包括人源化抗體或人抗體。非人(如：鼠)抗體的人源化形式為嵌合抗體免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(如：Fv、Fab、Fab'或抗體的其他抗原結合序列)，其中包含從非人免疫球蛋白中獲得的最小序列。人源化抗體包括人免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體互補決定區(CDR)的殘基被來自非人物種(供體抗體)(如具有與其特異性、親和力和能力的小鼠、大鼠或兔子)CDR的殘基取代。在某些情況下，人類免疫球蛋白的Fv框架(FR)殘基被相應的非人殘基取代。人源化抗體可能還包括既非受體抗體、也非輸入CDR或框架序列中發現的殘基。一般來說，人源化抗體將包括幾乎所有的至少一個、通常為二個可變域，其中，全部或幾乎全部的CDR區域均對應於非人免疫球蛋白的區域並且全部或幾乎全部的FR區域均為人免疫球蛋白相同序列的區域。理想情況是，人源化抗體還將包括至少免疫球蛋白恒定區(Fc)的一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定區的一部分。
人源化非人抗體的方法為本行業所熟知。一般來說，人源化抗體具有一個或多個從非人源頭引入的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基往往被稱為「輸入」殘基，通常從「輸入」可變域中獲得。人源化基本上可以透過將齧齒動物CDR或CDR序列取代為相應的人抗體序列 而完成。因此，這種「人源化」抗體為嵌合抗體(美國4816567號專利)，其中大大少於完整的人可變域被來自於非人物種的相應序列取代。在實踐中，人源化抗體通常為人抗體，其中有些CDR殘基以及可能的一些FR殘基被來自齧齒動物抗體中的類似位點的殘基取代。
可使用免疫後在內源性免疫球蛋白產生缺失時能產生完整人抗體的轉基因動物(如：小鼠)。例如，它被描述為，嵌合和種系突變小鼠中的抗體重鏈連接區域基因的純合性缺失導致內源性抗體生成的完全抑制。在此種系變種小鼠中人種系免疫球蛋白基因陣列的轉移在抗原挑戰後將導致人抗體的生成。人抗體也可在噬菌體展示庫中產生。
本發明的抗體優選為透過藥用載體的形式給予受試者。通常，在製劑中使用適量的藥用鹽，以使製劑等滲。藥用載體的例子包括生理鹽水、林格氏液和葡萄糖溶液。溶液的pH值優選為約5至8，更優選為約7至7.5。此外，載體還包括緩釋製劑，如：含有抗體的固體疏水性聚合物半透性基質，其中基質為有形物品形式，如：薄膜、脂質體或微粒。本行業的技術人員熟知，某些載體可能為更優選，取決於例如，抗體的給藥途徑和濃度。
該抗體可透過注射(如：靜脈內、腹腔內、皮下、肌肉內)或透過輸注等其他方法給予受試者、患者或細胞，確保其以有效的形式傳輸到血液中。這些抗體也可 以透過瘤內或瘤周途徑給予，從而發揮局部和全身的治療作用。局部或靜脈注射為優選。
抗體給藥的有效劑量和時間表可根據經驗確定，並且作出此類決定屬本行業的技術範圍內。本行業的技術人員會明白，必須給予的抗體劑量根據以下因素會有所不同，例如：接受抗體的受試者、給藥途徑、使用的抗體以及其他正在使用的藥物的特定類型。單獨使用的抗體的通常日劑量可能為約1μg/kg至最多100mg/kg體重或更多，這取決於上述因素。給予抗體治療CLL後，治療抗體的療效可透過技術人員熟知的不同方法評估。
由於以上表格中所述本發明中的肽(特別是與CLL相關的肽)，它們的基礎多肽在CLL中呈高表達，並在正常細胞中表達水準很低，因此，抑制蛋選自APOBEC3D、CDK14、RASGRF1、CDCA7L、CELSR1、AKAP2、CTDP1、DNMBP、TAGAP、ABCA6、DMXL1、PARP3、TP53I11、B4GALT1、IRF9、KDM2B、TBC1D22A、ZNF296、BACH2、PRR12、ZFAND5、ATP5G1、DMD、ARID5B、ZNF638、DDX46、RRM2B、BLNK、HSH2D、ERP44、METTL7A、ELP3、NLRP2、ZC3H12D、NELFE、ATP6V1C1、HLA-DMA、TUFM、EIF6、CKAP4、COBLL1、TMED4、TNFRSF13C、UBL7、CXorf21、ASUN、SL24D1和TRAF3IP3組成組 的蛋白的表達及其活性可優選融入治療或預防CLL的治療策略中。
反義治療的原理是基於這樣的假設：基因表達的序列特異性抑制(透過轉錄或翻譯)可能是透過基因組DNA或mRNA與互補反義種類之間的雜交而實現。這種雜交核酸雙工的形成干擾目標腫瘤抗原編碼基因組DNA的轉錄，或目標腫瘤抗原mRNA的加工/運輸/翻譯和/或穩定性。
反義核酸可用各種方法傳遞。例如，反義寡核苷酸或反義RNA可以讓腫瘤細胞吸收的方式直接給予(例如，透過靜脈注射)受試者。另外，編碼反義RNA(或RNA片段)的病毒或質粒載體可導入體內細胞。還可透過有義序列誘發反義效果；然而，表型變化的程度大不相同。透過有效的反義治療誘導的表型變化可根據，例如，靶mRNA水準、靶蛋白水準、和/或靶蛋白活性水準的變化進行評估。
在一個具體的實施例中，可透過直接向受試者給予反義肺腫瘤標誌物RNA而實現反義基因治療抑制CLL標誌物的功能。腫瘤標誌物反義RNA可透過任何標準技術製造和分離，但最容易的製造方法是在控制高效啟動子(例如，T7啟動子)的情況下使用腫瘤標誌物反義cDNA經體外轉錄制得。腫瘤標誌物反義RNA給到細胞可透過下文所述的核酸直接給藥方法中的任何一種進行。
另一種策略使用基因療法抑制選自一組包括APOBEC3D、CDK14、RASGRF1、CDCA7L、CELSR1、AKAP2、CTDP1、DNMBP、TAGAP、ABCA6、DMXL1、PARP3、TP53I11、B4GALT1、IRF9、KDM2B、TBC1D22A、ZNF296、BACH2、PRR12、ZFAND5、ATP5G1、DMD、ARID5B、ZNF638、DDX46、RRM2B、BLNK、HSH2D、ERP44、METTL7A、ELP3、NLRP2、ZC3H12D、NELFE、ATP6V1C1、HLA-DMA、TUFM、EIF6、CKAP4、COBLL1、TMED4、TNFRSF13C、UBL7、CXorf21、ASUN、SL24D1和TRAF3IP3組成組的蛋白質的功能涉及在細胞內表達抗蛋白質抗體或抗蛋白質抗體的一部分。例如，編碼單克隆抗體並特異性結合於選自APOBEC3D、CDK14、RASGRF1、CDCA7L、CELSR1、AKAP2、CTDP1、DNMBP、TAGAP、ABCA6、DMXL1、PARP3、TP53I11、B4GALT1、IRF9、KDM2B、TBC1D22A、ZNF296、BACH2、PRR12、ZFAND5、ATP5G1、DMD、ARID5B、ZNF638、DDX46、RRM2B、BLNK、HSH2D、ERP44、METTL7A、ELP3、NLRP2、ZC3H12D、NELFE、ATP6V1C1、HLA-DMA、TUFM、EIF6、CKAP4、COBLL1、TMED4、TNFRSF13C、UBL7、CXorf21、ASUN、SL24D1和TRAF3IP3組成組的蛋白質並抑制其生物活性的基 因(或基因片段)在核酸表達載體內受特定(例如，組織或腫瘤特定)基因調控序列的轉錄控制。然後，載體給予受試者，以便被CLL細胞或其他細胞吸收，之後，這些細胞分泌抗蛋白質抗體而且阻滯各個多肽的生物活性。優選情況是，蛋白質提呈於CLL癌症細胞的細胞表面上。
在上述的方法中，其中包括將外源性DNA給入受試者的細胞並被其吸收(即，基因轉導或轉染)，本發明的核酸可為裸露DNA形式或核酸可位於載體中將核酸傳遞至細胞以抑制CLL癌標誌物蛋白的表達。該載體可以是一種市售的製劑，如腺病毒載體(量子生物技術公司，Laval,Quebec,Canada)。核酸或載體可透過多種機制傳遞至細胞中。例如，可使用市售的脂質體，如：LIPOFECTIN、LIPOFECTAMINE(GIBCO--25BRL公司，Gaithersburg,Md.)、SUPERFECT(Qiagen公司，Hilden,Germany)和TRANSFECTAM(Promega Biotec公司，Madison,Wis.,US)以及根據本領域標準程序開發的其他脂質體，透過這些脂質體傳遞。此外，本發明的核酸或載體可透過體內電穿孔傳遞，該技術可從Genetronics公司(San Diego,US)獲得，以及透過SONOPORATION機(ImaRx制藥公司，Tucson,Arizona,US)的方式傳遞。
例如，載體可透過病毒系統(如可包裹重組逆轉錄病毒基因組的逆轉錄病毒載體系統)傳遞。隨後，可 用重組逆轉錄病毒感染並由此傳遞至抑制選自APOBEC3D、CDK14、RASGRF1、CDCA7L、CELSR1、AKAP2、CTDP1、DNMBP、TAGAP、ABCA6、DMXL1、PARP3、TP53I11、B4GALT1、IRF9、KDM2B、TBC1D22A、ZNF296、BACH2、PRR12、ZFAND5、ATP5G1、DMD、ARID5B、ZNF638、DDX46、RRM2B、BLNK、HSH2D、ERP44、METTL7A、ELP3、NLRP2、ZC3H12D、NELFE、ATP6V1C1、HLA-DMA、TUFM、EIF6、CKAP4、COBLL1、TMED4、TNFRSF13C、UBL7、CXorf21、ASUN、SL24D1和TRAF3IP3組成組的蛋白表達的被感染細胞反義核酸。當然，將改變的核酸準確地導入至哺乳動物細胞細胞內並不限於使用逆轉錄病毒載體。對於這以程序有廣泛的其他技術可供使用，包括使用腺病毒載體、腺相關病毒(AAV)載體、慢病毒載體、假型逆轉錄病毒載體。也可使用物理轉導技術，如脂質體傳遞和受體介導的及其它內吞作用機制。本發明可與這些技術或其他常用基因轉移方法中的任何方法配合使用。
該抗體也可用於體內診斷實驗。一般來說，抗體用放射性核素標記(如：111In、99Tc、14C、131I、3H、32P或35S)，從而可免疫閃爍掃描法使腫瘤局限化。在一實施方案中，抗體或其片段與選自APOBEC3D、CDK14、RASGRF1、CDCA7L、 CELSR1、AKAP2、CTDP1、DNMBP、TAGAP、ABCA6、DMXL1、PARP3、TP53I11、B4GALT1、IRF9、KDM2B、TBC1D22A、ZNF296、BACH2、PRR12、ZFAND5、ATP5G1、DMD、ARID5B、ZNF638、DDX46、RRM2B、BLNK、HSH2D、ERP44、METTL7A、ELP3、NLRP2、ZC3H12D、NELFE、ATP6V1C1、HLA-DMA、TUFM、EIF6、CKAP4、COBLL1、TMED4、TNFRSF13C、UBL7、CXorf21、ASUN、SL24D1和TRAF3IP3組成組的蛋白的兩個或更多靶標的胞外結構域結合，並且親和力值(Kd)小於1×10μM。
診斷用抗體可透過各種影像學方法使用適合檢測的探針進行標記。探針檢測方法包括但不限於，螢光、光、共聚焦和電鏡方法；磁共振成像和光譜學技術；透視、電腦斷層掃描和正電子發射斷層掃描。合適的探針包括但不限於，螢光素、羅丹明、曙紅及其它螢光團、放射性同位素、黃金、釓和其他稀土、順磁鐵、氟-18和其他正電子發射放射性核素。此外，探針可能是雙功能或多功能的，並且用一種以上的上述方法可進行檢測。這些抗體可用所述的探針直接或間接進行標記。抗體探針的連接，包括探針的共價連接、將探針融合入抗體、以及螯合化合物的共價連接從而結合探針、以及其他本行業熟知的方法。對於免疫組織化學方法，疾病組織樣本可能是新鮮或冷凍或可能包埋於石蠟中以及用福馬林等防腐劑固 定。固定或包埋的切片包括與標記一抗和二抗接觸的樣本，其中該抗體用於檢測原位蛋白的表達。
因此，本發明提出了一種肽，包含選自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：225、SEQ ID NO：226至SEQ ID NO：542或SEQ ID NO：543至SEQ ID NO：1016的組的一個序列、或與SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：225、SEQ ID NO：226至SEQ ID NO：542或SEQ ID NO：543至SEQ ID NO：1016具有90%同源的一種變體、或將誘導與所述肽發生T細胞交叉反應的一種變體。
本發明所訴的肽具有與主要組織相容性複合體(MHC)I或II類分子結合的能力。
在本發明中，「同源性」一詞系指兩個氨基酸序列之間的同一度(參見上文的等同度百分比，如肽或多肽序列。前文所述的「同源」是透過將理想條件下調整的兩個序列與待比較序列進行比對後確定的。此類序列同源性可透過使用ClustalW等演算法創建一個排列而進行計算。也可用使用一般序列分析軟體，更具體地說，是Vector NTI、GENETYX或由公共資料庫提供的其他分析工具。
本領域技術人員能評估特定肽變體誘導的T細胞是否可與該肽本身發生交叉反應(Fong L,et al.Altered peptide ligand vaccination with Flt3 ligand expanded dendritic cells for tumor immunotherapy.Proc Natl Acad Sci USA.2001 Jul 17；98(15)：8809-14；Zaremba S,et al.Identification of an enhancer agonist cytotoxic T lymphocyte peptide from human carcinoembryonic antigen.Cancer Res.1997 Oct 15；57(20)：4570-7；Colombetti S,et al.Impact of orthologous melan-A peptide immunizations on the anti-self melan-A/HLA-A2 T cell cross-reactivity.J Immunol.2006 Jun 1；176(11)：6560-7；Appay V,et al.Decreased specific CD8+ T cell cross-reactivity of antigen recognition following vaccination with Melan-A peptide.Eur J Immunol.2006 Jul；36(7)：1805-14)。
發明人用給定氨基酸序列的「變體」表示，一個或多個氨基酸殘基等的側鏈透過被另一個天然氨基酸殘基的側鏈或其他側鏈取代而發生改變，這樣，這種肽仍然能夠以含有給定氨基酸序列(由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：225、SEQ ID NO：226至SEQ ID NO：542或SEQ ID NO：543至SEQ ID NO：1016組成)的肽大致同樣的方式與HLA分子結合。例如，一種肽可能被修飾以便至少維持(如沒有提高)其能與HLA-A*02或-DR等合適MHC分子的結合槽相互 作用和結合，以及至少維持(如沒有提高)其與啟動CTL的TCR結合的能力。
隨後，這些CTL可與細胞和殺傷細胞發生交叉反應，這些細胞表達多肽(其中包含本發明中定義的同源肽的天然氨基酸序列)。正如科學文獻(Godkin A,et al.Use of eluted peptide sequence data to identify the binding characteristics of peptides to the insulin-dependent diabetes susceptibility allele HLA-DQ8(DQ 3.2).Int Immunol.1997 Jun；9(6)：905-11)和資料庫(Rammensee H.et al.SYFPEITHI：database for MHC ligands and peptide motifs.Immunogenetics.1999 Nov；50(3-4)：213-9)中所述，HLA-A結合肽的某些位點通常為錨定殘基，可形成一種與HLA結合槽的結合模序相稱的核心序列，其定義由構成結合槽的多肽鏈的極性、電物理、疏水性和空間特性確定。因此，本領域技術人員能夠透過保持已知的錨殘基來修飾SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：225、SEQ ID NO：226至SEQ ID NO：542或SEQ ID NO：543至SEQ ID NO：1016提出的氨基酸序列，並且能確定這些變體是否保持與MHC I或II類分子結合的能力。本發明的變體保持與啟動的CTL的TCR結合的能力，隨後，這些CTL可與表達一種包含本發明 定義的同源肽的天然氨基酸序列的多肽的細胞發生交叉反應並殺死該等細胞。
這些基本不與T細胞受體互動的氨基酸殘基可透過取代另一個幾乎不影響T細胞反應並不妨礙與相關MHC結合的氨基酸而得到修飾。因此，除了特定限制性條件外，本發明的肽可能為任何包括給定氨基酸序列或部分或其變體的肽(發明人所用的這個術語包括寡肽或多肽)。
較長的肽也可能適合。MHC I類表位(通常長度為8至11個氨基酸)也可能由肽從較長的肽或包含實際表位的蛋白中加工而產生。兩側有實際表位的殘基優選為在加工過程中幾乎不影響暴露實際表位所需蛋白裂解的殘基。
因此，本發明還提出了MHC I類表位的肽和變體，其中所述肽或抗體的總長度為8至100個、優選為8至30個、最優選為8至14個氨基酸長度(即10、11、12、13、14個氨基酸，如果為II類結合肽時，長度也可為15、16、17、18、19、20、21或22個氨基酸)。
當然，本發明的肽或變體能與人主要組織相容性複合體(MHC)I或II類分子結合。肽或變體與MHC複合體的結合可用本領域內的已知方法進行測試。
在本發明的一個特別優選的實施方案中，該肽系由或基本系由根據SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：225、SEQ ID NO：226至SEQ ID NO：542或SEQ ID NO：543至SEQ ID NO：1016的一個氨基酸序列組成。
基本由「組成」系指本發明的肽，除了根據SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：225、SEQ ID NO：226至SEQ ID NO：542或SEQ ID NO：543至SEQ ID NO：1016中的任一序列或其變體組成外，還含有位於其他N和/或C端延伸處的氨基酸，而它們不一定能形成作為MHC分子表位的肽。
但這些延伸區域對有效將本發明中的肽引進細胞具有重要作用。在本發明的一實施例中，肽為融合蛋白，含來自NCBI、GenBank登錄號X00497的HLA-DR抗原相關不變鏈(p33，以下稱為「Ii」)的80個N-端氨基酸等。在其他的融合中，本發明的肽可以被融合到本文所述的抗體、或其功能性部分，特別是融合入抗體的序列，以便所述抗體進行特異性靶向作用，或者，例如進入樹突狀細胞特異性抗體。
此外，該肽或變體可進一步修飾以提高穩定性和/或與MHC分子結合，從而引發更強的免疫反應。肽序列的該類優化方法是本領域內所熟知的，包括，例如，反式肽鍵和非肽鍵的引入。
在反式肽鍵氨基酸中，肽(-CO-NH-)並未連接其殘基，但是其肽鍵是反向的。這種逆向反向模擬肽(retro-inverso peptidomimetics)可透過本領域已 知的方法製備，例如：Meziere等在《免疫學雜誌》((1997)J.Immunol.159,3230-3237)中所述的方法，以引用的方式併入本文。這種方法涉及製備包含骨架(而並非側鏈)改變的模擬肽。Meziere等人(1997年)的研究顯示，這些類比肽有利於MHC的結合和輔助性T細胞的反應。以NH-CO鍵替代CO-NH肽鍵的逆向反向肽大大地提高了抗水解性能。
非肽鍵為-CH2-NH、-CH2S-、-CH2CH2-、-CH=CH-、-COCH2-、-CH(OH)CH2-和-CH2SO-等。美國4897445號專利提出了多肽鏈中非肽鍵(-CH2-NH)的非固相合成法，該方法涉及按標準程序合成的多肽以及透過氨基醛和一種含NaCNBH3的氨基酸相互作用而合成的非肽鍵。
含上述序列的肽可與其氨基和/或羧基末端的其他化學基團進行合成，從而提高肽的穩定性、生物利用度、和/或親和力等。例如，苄氧羰基、丹醯基等疏水基團或叔丁氧羰基團可加入肽的氨基末端。同樣，乙醯基或9-芴甲氧羰基可能位於肽的氨基末端。此外，疏水基團、叔丁氧羰基團或氨基團都可能被加入肽的羧基末端。
另外，本發明中的所有肽都可能經合成而改變其空間構型。例如，可能使用這些肽的一個或多個氨基酸殘基的右旋體，通常不是其左旋體。更進一步地，本發明中肽的至少一個氨基酸殘基可被熟知的一個非天然氨基 酸殘基取代。諸如此類的改變可能有助於增加本發明肽的穩定性、生物利用度和/或結合作用。
同樣，本發明中的肽或變體可在合成肽之前或之後透過特異氨基酸的反應而進行化學修飾。此類修飾的實施例為本領域所熟知，例如，在R.Lundblad所著的《Chemical Reagents for Protein Modification》(3rd ed.CRC Press,2005)中有概述，以參考文獻的方式併入本文。雖然氨基酸的化學修飾方法無限制，但其包括(但不限於)透過以下方法修飾：醯基化、脒基化、賴氨酸吡哆基化、還原烷基化、以2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)三硝基苯基化氨基團、透過將半胱氨酸過甲酸氧化為磺基丙氨酸而對羧基團和巰基進行氨基修飾、形成易變衍生物、與其他巰基化合物形成混合二硫化合物、與馬來醯亞胺反應，與碘乙酸或碘乙醯胺羧甲基化、在鹼性pH值下與氰酸鹽甲氨醯化。在這方面，技術人員參考了《Current Protocols In Protein Science》(Eds.Coligan et al.(John Wiley and Sons NY 1995-2000))中第15章所述的在蛋白質化學修飾相關的廣泛方法。
簡言之，修飾蛋白質的精氨醯殘基等往往基於於鄰二羰基化合物(如苯甲醯甲醛、2,3-丁二酮以及1,2-烯巳二酮)的反應而形成加合物。另一個實施例是丙酮醛與精氨酸殘基的反應。半胱氨酸可在賴氨酸和組氨酸等親核位點不作隨同修飾的情況下就得到修飾。因此， 有大量試劑可進行半胱氨酸的修飾。Sigma-Aldrich(http：//www.sigma-aldrich.com)等公司的網站含有具體試劑的資訊。
蛋白質中二硫鍵的選擇性還原也很普遍。二硫鍵可在生物制藥熱處理中形成和氧化。
伍德沃德氏試劑K可用於修飾特定的谷氨酸殘基。N-(3-二甲氨基丙基)-N′-乙基-碳二亞胺可用于形成賴氨酸殘基和谷氨酸殘基的分子內交聯。
例如：焦碳酸二乙酯是修飾蛋白質組氨酸殘基的試劑。組氨酸也可使用4-羥基-2-壬烯醛進行修飾。
賴氨酸殘基與其他α-氨基團的反應，例如，有利於肽結合到蛋白/肽的表面或交聯處。賴氨酸聚是多(乙烯)乙二醇的附著點，也是蛋白質糖基化的主要修飾位點。
蛋白質的蛋氨酸殘基可透過碘乙醯胺、溴乙胺、氯胺T等被修飾。
四硝基甲烷和N-乙醯基咪唑可用於酪氨酸殘基的修飾。經二酪氨酸形成的交聯可透過過氧化氫/銅離子完成。
對色氨酸修飾的最近研究中使用了N-溴代琥珀醯亞胺、2-羥基-5-硝基苄溴或3-溴-3-甲基-2-(2-硝苯巰基)-3H-吲哚(BPNS-糞臭素)。
當蛋白與戊二醛、聚乙二醇二丙烯酸酯和甲醛的交聯用於配製水凝膠時，治療性蛋白和含聚乙二醇的肽 的成功修飾往往可延長迴圈半衰期。針對免疫治療的變態反應原化學修飾往往透過氰酸鉀的氨基甲醯化實現。
一種肽或變體，其中肽被修飾或含非肽鍵，優選為本發明的實施例。一般來說，肽和變體(至少含氨基酸殘基之間的肽聯接)可使用Lukas et al.(Solid-phase peptide synthesis under continuous-flow conditions.Proc Natl Acad Sci U S A.May 1981；78(5)：2791-2795)中以及本文列出的參考文獻所披露的固相肽合成Fmoc-聚醯胺模式進行合成。芴甲氧羰基(Fmoc)團對N-氨基提供臨時保護。使用N,N-二甲基甲醯胺中的20%二甲基呱啶中對這種堿高度敏感的保護基團進行重複分裂。由於它們的丁基醚(在絲氨酸蘇氨酸和酪氨酸的情況下)、丁基酯(在谷氨酸和天門冬氨酸的情況下)、叔丁氧羰基衍生物(在賴氨酸和組氨酸的情況下)、三苯甲基衍生物(在半胱氨酸的情況下)及4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯磺醯基衍生物(在精氨酸的情況下)，側鏈功能可能會受到保護。只要穀氨醯胺和天冬醯胺為C-末端殘基，側鏈氨基功能保護所使用的是由4,4'-二甲氧基二苯基團。固相支撐基於聚二甲基丙烯醯胺聚合物，其由三個單體二甲基丙烯醯胺(骨架單體)、雙丙烯醯乙烯二胺(交聯劑)和N-丙烯醯肌胺酸甲酯(功能劑)構成。使用的肽-樹脂聯劑為酸敏感的4-羥甲基苯氧乙酸衍生物。所有的氨基酸衍生物均作為其預製對稱酸酐衍生物加入，但是天冬醯胺 和穀氨醯胺除外，它們使用被逆轉的N,N-二環己基碳二亞胺/1-經基苯並三唑介導的耦合程序而加入。所有的耦合和脫保護反應用茚三酮、硝基苯磺酸或isotin測試程序監測。合成完成後，用濃度為95%含50%清道夫混合物的三氟醋酸，從伴隨去除側鏈保護基團的樹脂支承物中裂解肽。常用的清道夫混合物包括乙二硫醇、苯酚、苯甲醚和水，準確的選擇依據合成肽的氨基酸組成。此外，固相和液相方法結合使用對肽進行合成是可能的(例如，請參閱Bruckdorfer et al.,2004以及本文引用的參考文獻)
三氟乙酸用真空中蒸發、隨後用承載粗肽的二乙基乙醚滴定進行去除。用簡單萃取程序(水相凍幹後，該程序制得不含清道夫混合物的肽)清除任何存在的清道夫混合物。肽合成試劑一般可從Calbiochem-Novabiochem(英國)公司(NG7 2QJ,英國)獲得。
純化可透過以下技術的任何一種或組合方法進行，如：再結晶法、體積排阻色譜法、離子交換色譜法、疏水作用色譜法以及(通常)反相高效液相色譜法(如使用乙腈/水梯度分離)。
可以使用薄層色譜法、電泳特別是毛細管電泳、固相萃取(CSPE)、反相高效液相色譜法、酸解後的氨基酸分析、快原子轟擊(FAB)質譜分析以及MALDI和ESI-Q-TOF質譜分析進行肽分析。
另一方面，本發明提出了一種編碼本發明中肽或肽變體的核酸(如多聚核苷酸)。多聚核苷酸可能為，例如，DNA、cDNA、PNA、RNA或其組合物，它們可為單鏈和/或雙鏈、或多聚核苷酸的原生或穩定形式(如：具有硫代磷酸骨架的多聚核苷酸)，並且只要它編碼肽，就可能包含也可能不包含內含子。當然，多聚核苷酸只能編碼加入天然肽鍵並含有天然氨基酸殘基的肽。另一個方面，本發明提出了一種可根據本發明表達多肽的表達載體。
對於連接多核苷酸，已經開發出多種方法，尤其是針對DNA，可透過向載體補充可連接性末端等方法進行連接。例如，可向DNA片段加入補充性均聚物軌道，之後DNA片段被插入到載體DNA。然後，透過補充性均聚物尾巴的氫鍵結合，將載體和DNA片段結合，從而形成重組DNA分子。
含有一個或多個酶切位點的合成接頭為DNA片段與載體連接提供了另一種方法。含各種限制性核酸內切酶的合成接頭可透過多種管道購得，其中包括從國際生物技術公司(International Biotechnologies Inc,New Haven,CN，美國)購得。
編碼本發明多肽的DNA理想修飾方法是使用Saiki等人所採用的聚合酶鏈反應方法。(Diagnosis of sickle cell anemia and beta-thalassemia with enzymatically amplified DNA and nonradioactive allele-specific oligonucleotide probes.N Engl J Med.1988 Sep 1；319(9)：537-41)。此方法可用於將DNA引入合適的載體(例如，透過設計合適的酶切位點)，也可用於本領域已知的其他有用方法修飾DNA。如果使用病毒載體，痘病毒載體或腺病毒載體為優選。
之後，DNA(或在逆轉錄病毒載體情況下，RNA)可能表達於合適的宿主，從而製成含本發明肽或變體的多肽。因此，可根據已知技術使用編碼本發明肽或變體的DNA，用本文所述方法適當修飾後，構建表達載體，然後表達載體用於轉化合適宿主細胞，從而表達和產生本發明中的多肽。這些方法包括下列美國專利中披露的方法：4,440,859、4,530,901、4,582,800、4,677,063、4,678,751、4,704,362、4,710,463、4,757,006、4,766,075和4,810,648。
編碼含本發明化合物多肽的DNA(或在逆轉錄病毒載體情況下，RNA)可能被加入到其他多種DNA序列，從而引入到合適的宿主中。同伴DNA將取決於宿主的性質、DNA引入宿主的方式、以及是否需要保持為游離體還是要相互結合。
一般來說，DNA可以適當的方向和正確的表達閱讀框架附著到一種表達載體(如質粒)中。如有必要，該DNA可能與所需宿主所識別的相應轉錄和翻譯調節 控制核苷酸序列連接，儘管表達載體中一般存在此類控制功能。然後，該載體透過標準方法被引入宿主。一般來說，並不是所有的宿主都會被載體轉化。因此，有必要選擇轉化過的宿主細胞。選擇方法包括用任何必要的控制元素向表達載體插入一個DNA序列，該序列對轉化細胞中的可選擇性屬性(如抗生素耐藥性)進行編碼。
另外，有這種選擇屬性的基因可在另外一個載體上，該載體用來協同轉化所需的宿主細胞。
然後，本發明中的重組DNA所轉化的宿主細胞在本文中所述本領域技術人員熟悉的合適條件下培養足夠長的時間，從而表達之後可回收的肽。
有許多已知的表達系統，包括細菌(如大腸桿菌和枯草芽孢桿菌)、酵母(如酵母菌)、絲狀真菌(如曲黴菌)、植物細胞、動物細胞及昆蟲細胞。該系統可優選為哺乳動物細胞，如來自ATCC細胞生物學庫(Cell Biology Collection)中的CHO細胞。
典型的哺乳動物細胞組成型表達載體質粒包括CMV或含一個合適的多聚A尾巴的SV40啟動子以及抗性標誌物(如新黴素)。一個實例為從Pharmacia公司(Piscataway，新澤西，美國)獲得的pSVL。一種可誘導型哺乳動物表達載體的例子是pMSG，也可以從Pharmacia公司獲得。有用的酵母質粒載體是pRS403-406和pRS413-416，一般可從Stratagene Cloning Systems公司(La Jolla,CA 92037，美 國)獲得。質粒pRS403、pRS404、pRS405和pRS406是酵母整合型質粒(YIp)，並插入了酵母可選擇性標記物HIS3、TRP1、LEU2和URA3。pRS413-416質粒為酵母著絲粒質粒(Ycp)。基於CMV啟動子的載體(如，來自於Sigma-Aldrich公司)提供了暫態或穩定的表達、胞漿表達或分泌，以及FLAG、3xFLAG、c-myc或MATN不同組合物中的N-端或C-端標記。這些融合蛋白可用於檢測、純化及分析重組蛋白。雙標融合為檢測提供了靈活性。
強勁的人巨細胞病毒(CMV)啟動子調控區使得COS細胞中的組成蛋白表達水準高達1mg/L。對於較弱的細胞株，蛋白水準一般低於0.1mg/L。SV40複製原點的出現將導致DNA在SV40複製容納性COS細胞中高水準複製。例如，CMV載體可包含細菌細胞中的pMB1(pBR322的衍生物)複製原點、細菌中進行氨苄青黴素抗性選育的鈣-內醯胺酶基因、hGH poly A和f1的原點。含前胰島素原引導(PPT)序列的載體可使用抗FLAG抗體、樹脂和板引導FLAG融合蛋白分泌到進行純化的培養基中。其他與各種宿主細胞一起應用的載體和表達系統是本領域熟知眾所周知的。
在另一個實施方案中，對本發明的兩個或更多的肽或肽變體進行編碼，因此，以一個連續順序(類似於「一串珠子」的構建體)表達。在達到目標，所述肽或肽變體可能透過連接子氨基酸的延伸處(例如LLLLLL) 連接或融合一起，也可能他們之間沒有任何附加的肽而被連接。
本發明還涉及一種宿主細胞，其以本發明的多核苷酸載體構建轉化而來。宿主細胞可為原核細胞，也可為真核細胞。在有些情況下，細菌細胞為優選原核宿主細胞，典型為大腸桿菌株，例如，大腸桿菌菌株DH5(從Bethesda Research Laboratories公司(Bethesda,MD，美國)獲得)和RR1(從美國菌種保藏中心(ATCC,Rockville,MD，美國)，ATCC編號31343獲得)。首選的真核宿主細胞包括酵母、昆蟲和哺乳動物細胞，優選為脊椎動物細胞，如：小鼠、大鼠、猴子或人成纖維細胞和結腸癌細胞株中的細胞。酵母宿主細胞包括YPH499、YPH500和YPH501，一般可從Stratagene Cloning Systems公司(La Jolla,CA 92037，美國)獲得。首選哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞為ATCC中的CCL61細胞、NIH瑞士小鼠胚胎細胞NIH/3T3為ATCC中的CRL 1658細胞、猴腎源性COS-1細胞為ATCC中的CRL 1650細胞以及人胚胎腎細胞的293號細胞。首選昆蟲細胞為Sf9細胞，可用杆狀病毒表達載體轉染。有關針對表達選擇合適宿主細胞的概要，可從教科書(Paulina Balbás and Argelia Lorence《Methods in Molecular Biology Recombinant Gene Expression,Reviews and Protocols》Part One, Second Edition,ISBN 978-1-58829-262-9)和本領域技術人員知道的其他文獻中查到。
含本發明DNA結構的適當宿主細胞的轉化可使用大家熟知的方法完成，通常取決於使用載體的類型。對於原核宿主細胞的轉化，可參閱，如：Cohen等人(1972)在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1972,69,2110中以及Sambrook等人(1989)所著《Molecular Cloning,A Laboratory Manual》Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY中使用的方法。酵母細胞的轉化在Sherman等人(1986)在Methods In Yeast Genetics,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,NY中有描述。Beggs(1978)Nature 275,104-109中所述方法也很有用。對於脊椎動物細胞，轉染這些細胞的試劑等，例如，磷酸鈣和DEAE-葡聚糖或脂質體配方，可從Stratagene Cloning Systems公司或Life Technologies公司(Gaithersburg,MD 20877，美國)獲得。電穿孔也可用於轉化和/或轉染細胞，是本領域用於轉化酵母細胞、細菌細胞、昆蟲細胞和脊椎動物細胞大家熟知的方法。
被成功轉化的細胞(即含本發明DNA結構的細胞)可用大家熟知的方法(如PCR)進行識別。另外，上清液存在的蛋白可使用抗體進行檢測。
應瞭解，本發明中的某些宿主細胞用於製備本發明中的肽，例如細菌細胞、酵母細胞和昆蟲細胞。但是，其他宿主細胞可能對某些治療方法有用。例如，抗原提呈細胞(如樹突狀細胞)可用于表達本發明中的肽，使他們可以加載入相應的MHC分子中。因此，本發明提出了含本發明中核酸或表達載體的一種宿主細胞。
在一個優選實施方案中，宿主細胞為抗原提呈細胞，尤其是樹突狀細胞或抗原提呈細胞。2010年4月29日，美國食品和藥物管理局(FDA)批准載有含攝護腺酸性磷酸酶(PAP)的重組融合蛋白可用於治療無症狀或症狀輕微的轉移性HRPC(Sipuleucel-T)(Small EJ,et al.Placebo-controlled phase III trial of immunologic therapy with sipuleucel-T(APC8015)in patients with metastatic,asymptomatic hormone refractory prostate cancer.J Clin Oncol.2006 Jul 1；24(19)：3089-94.Rini et al.Combination immunotherapy with prostatic acid phosphatase pulsed antigen-presenting cells (provenge)plus bevacizumab in patients with serologic progression of prostate cancer after definitive local therapy.Cancer.2006 Jul 1；107(1)：67-74)。
另一方面，本發明提出了一種配製一種肽及其變體的方法，該方法包括培養宿主細胞和從宿主細胞或其培養基中分離肽。
在另一個實施方案中，本發明中的肽、核酸或表達載體用於藥物中。例如，肽或其變體可製備為靜脈(i.v.)注射劑、皮下(s.c.)注射劑、皮內(i.d.)注射劑、腹膜內(i.p.)注射劑、肌肉(i.m.)注射劑。肽注射的優選方法包括s.c.、i.d.、i.p.、i.m.和i.v.注射。DNA注射的優選方法為i.d.、i.m.、s.c.、i.p.和i.v.注射。例如，給予50μg至1.5mg，優選為125μg至500μg的肽或DNA，這取決於具體的肽或DNA。上述劑量範圍在以前的試驗中成功使用(Walter et al Nature Medicine 18,1254-1261(2012))。
本發明的另一方面包括一種體外製備啟動的T細胞的方法，該方法包括將T細胞與載有抗原的人MHC分子進行體外連接，這些分子在合適的抗原提呈細胞表面表達足夠的一段時間從而以抗原特異性方式啟動T細胞，其中所述抗原為根據本發明所述的一種肽。優選情況是足夠量的抗原與抗原提呈細胞一同使用。
優選情況是，哺乳動物細胞的TAP肽轉運載體缺乏或水準下降或功能降低。缺乏TAP肽轉運載體的適合細胞包括T2、RMA-S和果蠅細胞。TAP是與抗原加工相關的轉運載體。
人體肽載入的缺陷細胞株T2從屬美國菌種保藏中心(ATCC,12301 Parklawn Drive,Rockville,Maryland 20852，美國)目錄號CRL1992；果蠅細胞株Schneider 2號株從屬ATCC目錄CRL 19863；小鼠RMA-S細胞株在Karre et al 1985(Ljunggren,H.-G.,and K.Karre.1985.J.Exp.Med.162：1745)中有過描述。
優選情況是，宿主細胞在轉染前基本上不表達MHC I類分子。刺激因數細胞還優選為表達對T細胞共刺激信號起到重要作用的分子，如，B7.1、B7.2、ICAM-1和LFA 3中的任一種分子。大量MHC I類分子和共刺激分子的核酸序列可從GenBank和EMBL資料庫中公開獲得。
當MHC I類表位用作一種抗原時，T細胞為CD8陽性CTL。
如果抗原提呈細胞轉染以表達這樣的表位，優選為細胞含有SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：225、SEQ ID NO：226至SEQ ID NO：542或SEQ ID NO：543至SEQ ID NO：1016所述肽的表達載體、或本文所述的氨基酸序列組成。
可使用其他一些方法來體外生成CTL。例如，自體腫瘤浸潤性淋巴細胞可用于生成CTL。Plebanski et al(1995)(Induction of peptide-specific primary cytotoxic T lymphocyte responses from human peripheral blood.Eur J Immunol.1995 Jun；25(6)：1783-7)使用自體外周血淋巴細胞(PLB)製備CTL。另外，也可能用肽或多肽脈衝處理樹突狀細胞或透過與重組病毒感染而製成自體CTL。此外，B細胞可用於製備自體CTL。此外，用肽或多肽脈衝處理或用重組病毒感染的巨噬細胞可用於配製自體CTL。Walter等人2003年在(Cutting edge：predetermined avidity of human CD8 T cells expanded on calibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres.J Immunol.2003 Nov 15；171(10)：4974-8)中描述了透過使用人工抗原提呈細胞(aAPC)體外啟動T細胞，這也是生成作用於所選肽的T細胞的一種合適方法。在本發明中，根據生物素：鏈黴素生物化學方法透過將預製的MHC：肽複合物耦合到聚苯乙烯顆粒(微球)而生成aAPC。該系統實現了對aAPC上的MHC密度進行精確調節，這使得可以在血液樣本中選擇地引發高或低親合力的高效抗原特異性T細胞反應。除了MHC：肽複合物外，aAPC還應攜運含共刺激活性的其他蛋白，如耦合至表面的抗-CD28抗體。此外，此類基於aAPC的系統往往需要加入適當的可溶性因數，例如，諸如白細胞介素-12的細胞因數。
也可用同種異體細胞制得T細胞，在WO 97/26328中詳細描述了一種方法，以參考文獻方式併 入本文。例如，除了果蠅細胞和T2細胞，也可用其他細胞來提呈肽，如CHO細胞、杆狀病毒感染的昆蟲細胞、細菌、酵母、牛痘感染的靶細胞。另外，可使用植物病毒(例如，參閱Porta et al.Development of cowpea mosaic virus as a high-yielding system for the presentation of foreign peptides.Virology.1994 Aug 1；202(2)：949-55)，其中描述了將豇豆花葉病毒開發為一種提呈外來肽的高產系統。
被啟動的T細胞直接針對本發明中的肽，有助於治療。因此，本發明的另一方面提出了用本發明前述方法制得的啟動T細胞。
按上述方法製成的啟動T細胞將會有選擇性地識別異常表達含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：225、SEQ ID NO：226至SEQ ID NO：542或SEQ ID NO：543至SEQ ID NO：1016氨基酸序列的多肽。
優選情況是，T細胞透過與其含HLA/肽複合物的TCR相互作用(如，結合)而識別該細胞。T細胞是殺傷患者靶細胞方法中有用的細胞，其靶細胞異常表達含本發明中氨基酸序列的多肽。此類患者給予有效量的啟動T細胞。給予患者的T細胞可能源自該患者，並按上述方法啟動(即，它們為自體T細胞)。或者，T細胞不是源自該患者，而是來自另一個人。當然，優選情況 是該供體為健康人。發明人使用「健康個人」系指一個人一般狀況良好，優選為免疫系統合格，更優選為無任何可很容易測試或檢測到的疾病。
根據本發明，CD8-陽性T細胞的體內靶細胞可為腫瘤細胞(有時表達MHC-II類抗原)和/或腫瘤周圍的基質細胞(腫瘤細胞)(有時也表達MHC-II類抗原；(Dengjel et al.,2006))。
本發明所述的T細胞可用作治療性組合物中的活性成分。因此，本發明也提出了一種殺傷患者靶細胞的方法，其中患者的靶細胞異常表達含本發明中氨基酸序列的多肽，該方法包括給予患者上述有效量的T細胞。
發明人所用的「異常表達」的意思還包括，與正常表達水準相比，多肽過量表達，或該基因在源自腫瘤的組織中未表達，但是在該腫瘤中卻表達。「過量表達」系指多肽水準至少為正常組織中的1.2倍；優選為至少為正常組織中的2倍，更優選為至少5或10倍。
T細胞可用本領域已知的方法制得(如，上述方法)。
T細胞繼轉移方案為本領域所熟知的方案。綜述可發現於：Gattinoni L,et al.Adoptive immunotherapy for cancer：building on success.Nat Rev Immunol.2006 May；6(5)：383-93.Review.以及Morgan RA,et al.Cancer regression in patients after transfer of genetically engineered lymphocytes.Science.2006 Oct 6；314(5796)：126-9)。
本發明的任一分子(即肽、核酸、抗體、表達載體、細胞，啟動CTL、T細胞受體或編碼核酸)都有益於治療疾病，其特點在於細胞逃避免疫反應的打擊。因此，本發明的任一分子都可用作藥劑或用於製造藥劑。這種分子可單獨使用也可與本發明中的其他分子或已知分子聯合使用。
本發明中所述的藥劑優選為一種疫苗。該疫苗可直接給到患者的受影響器官，也可i.d.、i.m.、s.c.、i.p.和i.v.注射方式全身給藥，或體外應用到來自患者或其細胞株的細胞(隨後再將這些細胞注入到患者中)，或體外用於從來自患者的免疫細胞的一個細胞亞群(然後再將細胞重新給予患者)。如果核酸體外注入細胞，可能有益於細胞轉染，以共同表達免疫刺激細胞因數(如白細胞介素-2)。肽可完全單獨給藥，也可與免疫刺激佐劑相結合(見下文)、或與免疫刺激細胞因數聯合使用、或以適當的輸送系統給藥(例如脂質體)。該肽也可共軛形成一種合適的載體(如鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)或甘露)到合適的載體(參閱WO 95/18145及Longenecker,1993)。肽也可能被標記，可能是融合蛋白，或可能是雜交分子。在本發明中給出序列的肽預計能刺激CD4或CD8 T細胞。然而，在有CD4 T-輔助細胞的幫助時，CD8 CTL刺激更加有效。因此， 對於刺激CD8 CTL的MHC I類表位而言，雜交分子的融合配偶體或融合部分適當提供刺激CD4-陽性T細胞的表位元。CD4-和CD8刺激表位為本領域所熟知、並包括本發明中確定的表位。
一方面，疫苗包括至少含有SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：1016中提出的一種肽以及至少另外一種肽，優選為2至50個、更優選為2至25個、再優選為2至20個、最優選為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18個肽。肽可能從一個或多個特定TAA中衍生，並且可能與MHC I類分子結合。
另一方面，疫苗包括至少含有SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：225、SEQ ID NO：226至SEQ ID NO：542至SEQ ID NO：543至SEQ ID NO：1016中提出的一種肽以及至少另外一種肽，優選為2至50個、更優選為2至25個、再優選為2至20個、最優選為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18個肽。肽可能從一個或多個特定TAA中衍生，並且可能與MHC I類分子結合。
多聚核苷酸可為基本純化形式，也可包被於載體或輸送系統。核酸可能為DNA、cDNA、PNA、RNA，也可能為其組合物。這種核酸的設計和引入方法為本領域所熟知。例如，文獻中有其概述(Pascolo et al.,Human peripheral blood mononuclear cells transfected with messenger RNA stimulate antigen-specific cytotoxic T-lymphocytes in vitro.Cell Mol Life Sci.2005 Aug；62(15)：1755-62)。多核苷酸疫苗很容易製備，但這些載體誘導免疫反應的作用模式尚未完全瞭解。合適的載體和輸送系統包括病毒DNA和/或RNA，如基於腺病毒、牛痘病毒、逆轉錄病毒、皰疹病毒、腺相關病毒或含一種以上病毒元素的混合病毒的系統。非病毒輸送系統包括陽離子脂質體和陽離子聚合物，是DNA輸送所屬領域內熟知的系統。也可使用物理輸送系統，如透過「基因槍」。肽或核酸編碼的肽可以是一種融合蛋白，例如，含刺激T細胞進行上述CDR的表位。
本發明的藥劑也可能包括一種或多種佐劑。佐劑是那些非特異性地增強或加強免疫反應的物質(例如，透過CTL和輔助T(TH)細胞介導的對一種抗原的免疫應答，因此被視為對本發明的藥劑有用。適合的佐劑包括(但不僅限於)1018ISS、鋁鹽、AMPLIVAX®、AS15、BCG、CP-870,893、CpG7909、CyaA、dSLIM、鞭毛蛋白或鞭毛蛋白衍生的TLR5配體、FLT3配體、GM-CSF、IC30、IC31、咪喹莫特(ALDARA®)、resiquimod、ImuFact IMP321、白細胞介素IL-2、IL-13、IL-21、干擾素α或β，或其聚乙二醇衍生物、IS Patch、ISS、ISCOMATRIX、ISCOMs、JuvImmune®、 LipoVac、MALP2、MF59、單磷醯脂A、Montanide IMS 1312、Montanide ISA 206、Montanide ISA 50V、Montanide ISA-51、水包油和油包水乳狀液、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、OspA、PepTel®載體系統、基於聚丙交酯複合乙交酯[PLG]和右旋糖苷微粒、重組人乳鐵傳遞蛋白SRL172、病毒顆粒和其他病毒樣顆粒、YF-17D、VEGF trap、R848、β-葡聚糖、Pam3Cys、源自皂角苷、分支桿菌提取物和細菌細胞壁合成模擬物的Aquila公司的QS21刺激子，以及其他專有佐劑，如：Ribi's Detox、Quil或Superfos。優選佐劑如：弗氏佐劑或GM-CSF。前人對一些樹突狀細胞特異性免疫佐劑(如MF59)及其製備方法進行了描述(Allison and Krummel,1995 The Yin and Yang of T cell costimulation.Science.1995 Nov 10；270(5238)：932-3.Review)。也可能使用細胞因數。一些細胞因數直接影響樹突狀細胞向淋巴組織遷移(如，TNF-)，加速樹突狀細胞成熟為T淋巴細胞的有效抗原提呈細胞(如，GM-CSF、IL-1和IL-4)(美國5849589號專利，特別以其完整引用形式併入本文)，並充當免疫佐劑(如IL-12、IL-15、IL-23、IL-7、IFN-α、IFN-β)(Gabrilovich,1996Production of vascular endothelial growth factor by human tumors inhibits the functional maturation of dendritic cells Nat Med.1996 Oct；2(10)：1096-103)。
據報告，CpG免疫刺激寡核苷酸可提高佐劑在疫苗中的作用。如果沒有理論的約束，CpG寡核苷酸可透過Toll樣受體(TLR)(主要為TLR9)啟動先天(非適應性)免疫系統從而起作用。CpG引發的TLR9活化作用提高了對各種抗原的抗原特異性體液和細胞反應，這些抗原包括肽或蛋白抗原、活病毒或被殺死的病毒、樹突狀細胞疫苗、自體細胞疫苗以及預防性和治療性疫苗中的多糖結合物。更重要的是，它會增強樹突狀細胞的成熟和分化，導致TH1細胞的活化增強以及細胞毒性T淋巴細胞(CTL)生成加強，甚至CD4 T細胞說明的缺失。甚至有疫苗佐劑的存在也能維持TLR9活化作用誘發的TH1偏移，這些佐劑如：正常促進TH2偏移的明礬或弗氏不完全佐劑(IFA)。CpG寡核苷酸與以下其他佐劑或配方一起製備或聯合給藥時，表現出更強的佐劑活性，如微粒、納米粒子、脂肪乳或類似製劑，當抗原相對較弱時，這些對誘發強反應尤為必要。他們還能加速免疫反應，使抗原劑量減少約兩個數量級，在有些實驗中，對不含CpG的全劑量疫苗也能產生類似的抗體反應(Krieg,2006)。美國6406705 B1號專利對CpG寡核苷酸、非核酸佐劑和抗原結合使用促使抗原特異性免疫反應進行了描述。一種CpG TLR9拮抗劑為Mologen公司(德國柏林)的dSLIM(雙幹環免疫調節劑)，這 是本發明藥物組合物的優選成分。也可使用其他如TLR結合分子，如：RNA結合TLR7、TLR8和/或TLR9。
其他有用的佐劑例子包括(但不限於)化學修飾性CpG(如CpR、Idera)、dsRNA模擬物，如，Poly(I：C)及其衍生物(如：AmpliGen、Hiltonol、多聚-(ICLC)、多聚(IC-R)、多聚(I：C12U))、非CpG細菌性DNA或RNA以及免疫活性小分子和抗體，如：環磷醯胺、舒尼替單抗、貝伐單抗®、西樂葆、NCX-4016、西地那非、他達拉非、伐地那非、索拉非尼、替莫唑胺、temsirolimus、XL-999、CP-547632、帕唑帕尼、VEGF Trap、ZD2171、AZD2171、抗-CTLA4、免疫系統的其他抗體靶向性主要結構(如：抗-CD40、抗-TGF β、抗-TNF α受體)和SC58175，這些藥物都可能有治療作用和/或充當佐劑。技術人員無需過度進行不當實驗就很容易確定本發明中有用的佐劑和添加劑的數量和濃度。
首選佐劑是咪喹莫特、瑞喹莫德、GM-CSF、環磷醯胺、舒尼替尼、貝伐單抗、干擾素α、CpG寡核苷酸及衍生物、多聚(I：C)及衍生物、RNA、西地那非和PLG或病毒顆粒的微粒製劑。
本發明藥物組合物的一個優選實施方案中，佐劑從含集落刺激因數製劑中選擇，如粒細胞巨噬細胞集落刺激因數(GM-CSF，沙格司亭)、環磷醯胺、咪喹莫特、resiquimod和干擾素-α。
本發明藥物組合物的一個優選實施方案中，佐劑從含集落刺激因數製劑中選擇，如粒細胞巨噬細胞集落刺激因數(GM-CSF，沙格司亭)、環磷醯胺、咪喹莫特和resimiquimod。
在本發明藥物組合物的一個優選實施方案中，佐劑為環磷醯胺、咪喹莫特或resiquimod。
更優選的佐劑是Montanide IMS 1312、Montanide ISA 206、Montanide ISA 50V、Montanide ISA-51、聚ICLC(Hiltonol®)和抗CD40 mAB或其組合物。
此組合藥物為非腸道注射使用，如皮下、皮內、肌肉注射，也可口服。為此，肽和其他選擇性分子在藥用載體中分解或懸浮，優選為水載體。此外，組合物可包含輔料，如：緩衝劑、結合劑、衝擊劑、稀釋劑、香料、潤滑劑等。這些肽也可與免疫刺激物質合用，如：細胞因數。可用於此類組合物的更多輔料可在從A.Kibbe所著的Handbook of Pharmaceutical Excipients(第3版，2000年，美國醫藥協會和制藥出版社)等書中獲知。此組合藥物可用於阻止、預防和/或治療腺瘤或癌性疾病。例如，EP2112253中有示例製劑。
但是，根據本發明肽的數量和物理化學特徵，需要進一步研究以提出肽特定組合的製劑，特別是穩定性超過12至18個月20種以上的肽的組合物。
本發明提出了一種藥劑，其用於治療癌症，特別是AML、慢性淋巴性白血病(CLL)和其他血液學惡性腫瘤。
本發明還涉及一種套件，其包括：(a)一個容器，包含上述溶液或凍乾粉形式的藥物組合物；(b)可選的第二個容器，其含有凍乾粉劑型的稀釋劑或重組溶液；和(c)可選的(i)溶液使用或(ii)重組和/或凍幹製劑使用的說明。
該套件還步包括一個或多個(iii)緩衝劑，(iv)稀釋劑，(v)過濾液，(vi)針，或(v)注射器。容器最好是瓶子、小瓶、注射器或試管，可以為多用途容器。藥物組合物最好是凍幹的。
本發明中的套件優選包含一種置於合適容器中的凍幹製劑以及重組和/或使用說明。適當的容器包括，例如瓶子、西林瓶(如雙室瓶)、注射器(如雙室注射器)和試管。該容器可能由多種材料製成，如玻璃或塑膠。試劑盒和/或容器最好有容器或關於容器的說明書，指明重組和/或使用的方向。例如，標籤可能表明凍幹劑型將重組為上述肽濃度。該標籤可進一步表明製劑用於皮下注射。
存放製劑的容器可使用多用途西林瓶，使得可重複給予(例如，2-6次)重組劑型。該套件可進一步包括裝有合適稀釋劑(如碳酸氫鈉溶液)的第二個容器。
稀釋液和凍幹製劑混合後，重組製劑中的肽終濃度優選為至少0.15mg/mL/肽(=75μg)，不超過3mg/mL/肽(=1500μg)。該套件還可包括商業和用戶角度來說可取的其他材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑，過濾液、針頭、注射器和帶有使用說明書的包裝插頁。
本發明中的套件可能有一個單獨的容器，其中包含本發明所述的藥物組合物製劑，該製劑可有其他成分(例如，其他化合物或及其藥物組合物)，也可無其他成分，或者每種成分都有其不同容器。
優選情況是，本發明的套件包括與本發明的一種製劑，包裝後與第二種化合物(如佐劑(例如GM-CSF)、化療藥物、天然產品、激素或拮抗劑、抗血管生成劑或抑制劑、凋亡誘導劑或螯合劑)或其藥物組合物聯合使用。該套件的成分可進行預絡合或每種成分在給予患者之前可放置於單獨的不同容器。該套件的成分可以是一種或多種溶液，優選為水溶液，更優選為無菌水溶液。該套件的成分也可為固體形式，加入合適的溶劑後轉換為液體，最好放置於另一個不同的容器中。
治療套件的容器可能為西林瓶、試管、燒瓶、瓶子、注射器、或任何其他盛裝固體或液體的工具。通常，當成分不只一種時，套件將包含第二個西林瓶或其他容 器，使之可以單獨定量。該套件還可能包含另一個裝載藥用液體的容器。優選情況是，治療套件將包含一個設備(如，一個或多個針頭、注射器、滴眼器、吸液管等)，使得可注射本發明的藥物(本套件的組合物)。
本發明的藥物配方適合以任何可接受的途徑進行肽給藥，如口服(腸道)、鼻內、眼內、皮下、皮內、肌內，靜脈或經皮給藥。優選為皮下給藥，最優選為皮內給藥，也可透過輸液泵給藥。
由於本發明的肽從CLL中分離而得，因此，本發明的藥劑優選用於治療CLL。在一個優選實施方案中，由於本發明中的肽來源於選自APOBEC3D、CDK14、RASGRF1、CDCA7L、CELSR1、AKAP2、CTDP1、DNMBP、TAGAP、ABCA6、DMXL1、PARP3、TP53I11、B4GALT1、IRF9、KDM2B、TBC1D22A、ZNF296、BACH2、PRR12、ZFAND5、ATP5G1、DMD、ARID5B、ZNF638、DDX46、RRM2B、BLNK、HSH2D、ERP44、METTL7A、ELP3、NLRP2、ZC3H12D、NELFE、ATP6V1C1、HLA-DMA、TUFM、EIF6、CKAP4、COBLL1、TMED4、TNFRSF13C、UBL7、CXorf21、ASUN、SL24D1和TRAF3IP3組成組的蛋白質是從CLL中分離而得，因此，本發明中的藥劑優選用於治療CLL。
本發明進一步包括為個體患者製備個體化藥物的一種方法，其中包括：製造含選自預篩選TUMAP存 儲庫至少一種肽的藥物組合物，其中藥物組合物中所用的至少一種肽選擇為適合於個體患者。優選情況是，藥物組合物為一種疫苗。該方法也可以改動以產生下游應用的T細胞克隆物，如：TCR隔離物。
「個體化藥物」系指專門針對個體患者的治療，將僅用於該等個體患者，包括個體化活性癌症疫苗以及使用自體組織的過繼細胞療法。
如本文所述，「存儲庫」應指已經接受免疫原性預篩查並在特定腫瘤類型中過量提呈的一組肽。「存儲庫」一詞並不暗示，疫苗中包括的特定肽已預先製造並儲存於物理設備中，雖然預期有這種可能性。明確預期所述肽可以用於新製造每種個體化疫苗，也可能被預先製造和儲存。
存儲庫(例如，資料庫形式)由腫瘤相關肽組成，其在分析的幾位HLA-A、HLA-B和HLA-C陽性CLL患者的腫瘤組織中高度過表(見以上的表格)。其含有包括MHC I類和MHC II類肽。除了從幾種GBM組織中採集的腫瘤相關肽外，存儲庫還可能包含HLA-A*02和HLA-A*24標記肽。這些肽可對TUMAP誘導的T細胞免疫進行量化比較，從而可得出疫苗抗腫瘤反應能力的重要結論。其次，在沒有觀察到來自患者「自身」抗原TUMAP的任何疫苗誘導的T細胞反應時，它可作為來自「非自身」抗原的重要陽性對照肽。第三，它還可對患者的免疫功能狀態得出結論。
存儲庫的HLA I類和II類TUMAP透過使用一種功能基因組學方法進行鑒定，該方法結合了基因表達分析、質譜法和T細胞免疫學。該方法確保了只選擇真實存在于高百分比腫瘤但在正常組織中不表達或僅很少量表達的TUMAP用於進一步分析。對於肽的選擇，患者的CLL樣本和健康供體的血液以循序漸進的方法進行分析：
1.惡性材料的HLA配體用質譜法確定
2.使用微陣列的全基因組信使核糖核酸(mRNA)表達分析法用於確定惡性腫瘤組織(CLL)與一系列正常器官和組織相比過度表達的基因。
3.確定的HLA配體與基因表達資料進行比較。第1步中檢測到的選擇性表達或過量表達基因所編碼的肽考慮為多肽疫苗的合適候選TUMAP。
4.文獻檢索以確定更多證據以支持確認為TUMP的肽的相關性
5.過度表達在mRNA水準的相關性由腫瘤組織第3步選定的TUMAP重新檢測而確定，並且在健康組織上缺乏(或不經常)檢測
6.為了評估透過選定的肽誘導體內T細胞反應是否可行，使用健康供體以及CLL患者的人T細胞進行體外免疫原性測定。
一方面，在將所述肽加入存儲庫之前，對其進行篩查以瞭解免疫原性。舉例來說(但不限於此)，納入 存儲庫的肽的免疫原性的確定方法包括體外T細胞啟動，具體為：用裝載肽/MHC複合物和抗CD28抗體的人工抗原提呈細胞反復刺激來自健康供體的CD8+ T細胞。
這種方法優選用於罕見癌症以及有罕見表達譜的患者。與含目前開發為固定組分的多肽雞尾酒相反的是，存儲庫可將腫瘤中抗原的實際表達於疫苗進行更高程度的匹配。在多目標方法中，每名患者將使用幾種「現成」肽的選定單一肽或組合。理論上來說，基於從50抗原肽庫中選擇例如5種不同抗原肽的一種方法可提供大約170萬種可能的藥物產品(DP)組分。
在一方面，選擇所述肽用於疫苗，其基於個體患者的適合性，並使用本發明此處以及後文所述的方法。
HLA表型、轉錄和肽組學資料將從患者的腫瘤材料和血液樣本中收集，以確定最合適每名患者且含有存儲庫和患者獨特(即突變)TUMAP的肽。將選擇的那些肽選擇性地或過度表達于患者腫瘤中，並且可能的情況下，如果用患者個體PBMC進行檢測，則表現出很強的體外免疫原性。
優選的情況是，疫苗所包括的肽的一種確定方法包括：(a)識別由來自個體患者腫瘤樣本提呈的腫瘤相關肽(TUMAP)；(b)將(a)中鑒定的肽與上述肽的存儲庫(資料庫)進行比對；且(c)從與患者中確定的腫瘤相關肽相關的存儲庫(資料庫)中選擇至少一種肽。例 如，腫瘤樣本提呈的TUMAP的鑒定方法有：(a1)將來自腫瘤樣本的表達資料與所述腫瘤樣本組織類型相對應的正常組織樣本的表達資料相比對，以識別腫瘤組織中過量表達或異常表達的蛋白；以及(a2)將表達資料與結合到腫瘤樣本中I類MHC和/或II類分子的MHC配體序列想關聯，以確定來源於腫瘤過量表達或異常表達的蛋白質的MHC配體。優選情況是，MHC配體的序列的確定方法是：洗脫來自腫瘤樣本分離的MHC分子結合肽，並測序洗脫配體。優選情況是，腫瘤樣本和正常組織從同一患者獲得。
除了使用存儲庫(資料庫)模型選擇肽以外，或作為一種替代方法，TUMAP可能在新患者中進行鑒定，然後列入疫苗中。作為一種實施例，患者中的候選TUMAP可透過以下方法進行鑒定：(a1)將來自腫瘤樣本的表達資料與所述腫瘤樣本組織類型相對應的正常組織樣本的表達資料相比對，以識別腫瘤組織中過量表達或異常表達的蛋白；以及(a2)將表達資料與結合到腫瘤樣本中I類MHC和/或II類分子的MHC配體序列想關聯，以確定來源於腫瘤過量表達或異常表達的蛋白質的MHC配體。作為另一實施例，蛋白的鑒定方法為可包含突變，其對於腫瘤樣本相對于個體患者的相應正常組織是獨特的，並且TUMAP可透過特異性靶向作用於變異來鑒定。例如，腫瘤以及相應正常組織的基因組可透過全基因組測序方法進行測序：為了發現基因蛋白質編碼區 域的非同義突變，從腫瘤組織中萃取基因組DNA和RNA，從外周血單核細胞(PBMC)中提取正常非突變基因組種系DNA。運用的NGS方法只限于蛋白編碼區的重測序(外顯子組重測序)。為了這一目的，使用供應商提供的靶序列富集試劑盒來捕獲來自人樣本的外顯子DNA，隨後使用HiSeq2000(Illumina公司)進行測序。此外，對腫瘤的mRNA進行測序，以直接定量基因表達，並確認突變基因在患者腫瘤中表達。得到的數以百萬計的序列讀數透過軟體演算法處理。輸出列表中包含突變和基因表達。腫瘤特異性體突變透過與PBMC衍生的種系變化比較來確定，並進行優化。然後，為了存儲庫可能測試新確定的肽瞭解如上所述的免疫原性，並且選擇具有合適免疫原性的候選TUMAP用於疫苗。
在一個示範實施方案中，疫苗中所含肽透過以下方法確定：(a)用上述方法識別由來自個體患者腫瘤樣本提呈的腫瘤相關肽(TUMAP)；(b)將(a)中鑒定的肽與進行腫瘤(與相應的正常組織相比)免疫原性和過量提呈預篩查肽的存儲庫進行比對；(c)從與患者中確定的腫瘤相關肽相關的存儲庫中選擇至少一種肽；及(d)可選地在(a)中選擇至少一種新確定的肽，確認其免疫原性。
在一個示範實施方案中，疫苗中所含肽透過以下方法確定：(a)識別由來自個體患者腫瘤樣本提呈的腫 瘤相關肽(TUMAP)；以及(b)在(a)中選擇至少一種新確定的肽，並確認其免疫原性。
一旦選擇該肽時，則製造疫苗。
該疫苗優選為一種液體製劑，包括溶解於33% DMSO中的個體肽。
列入產品的每種肽都溶於DMSO中。單個肽溶液濃度的選擇取決於要列入產品中的肽的數量。單肽-DMSO溶液均等混合，以實現一種溶液中包含所有的肽，且濃度為每肽~2.5mg/ml。然後該混合溶液按照1：3比例用注射用水進行稀釋，以達到在33% DMSO中每肽0.826mg/ml的濃度。稀釋的溶液透過0.22μm無菌篩檢程序進行過濾。從而獲得最終本體溶液。
最終本體溶液填充到小瓶中，在使用前儲存於-20℃下。一個小瓶包含700μL溶液，其中每種肽含有0.578mg。其中的500μL(每種肽約400μg)將用於皮內注射。
下列描述優選方案的實施例將對本發明進行說明(但是不僅限於此)。考慮到本發明的目的，文中引用的所有參考文獻透過引用的方式併入在本文中。
實施例
實施例1：
細胞表面提呈的腫瘤相關肽的識別和定量
組織樣本
患者的腫瘤樣本由德國蒂賓根大學提供。所有患者都提供了書面的知情同意。為了進行配體組分析，透過密度梯度離心分離來自CLL患者的PBMC(>80% CLL細胞頻率)以及來自健康志願者(HVS)的PBMC。根據赫爾辛基協定獲得知情同意書。本研究根據本地的倫理委員會指導原則實施。蒂賓根大學血液學和腫瘤學系進行了HLA分型。樣本在-80℃下保存，直至進一步使用。
HLA表面表達的量化
為了與健康自體B淋巴細胞進行比較，在含有至少0.5% CD5-CD19+正常B細胞的患者樣本中進行HLA表面表達的量化。HLA表面表達使用QIFIKIT®定量流式細胞測定法(Dako)根據製造商的說明進行分析。簡言之，一式三份的每個樣本分別用泛HLA I類特異性單克隆抗體(mAb)W6/32、HLA-DR特異性mAb L243(兩者均由內部製備)或IgG同種型對照物(BioLegend)進行染色。表面標記物用直接標記的CD3(BD)、CD5(BD)和CD19(BD)抗體進行染色。7-AAD(BioLegend)添加為活力標誌物，之後緊接著在FACSCanto分析儀(BD)上進行流式細胞儀分析。
從組織樣本中分離HLA肽
HLA I類和II類分子採用前面所述的標準免疫親和純化方法進行分離。簡言之，速凍細胞顆粒在 含1x蛋白酶抑制劑(Complete,Roche,Basel,Switzerland)的10mM CHAPS/PBS(AppliChem,St.Louis,MO,USA/Gibco,Carlsbad,CA,USA)中溶解。HLA分子分別採用共價連接到CNBr活化瓊脂糖(GE Healthcare,Chalfont St Giles,UK)的泛HLA I類特異性mAb W6/32和泛HLA II類特異性mAb Tü39進行單步純化。HLA：肽複合物透過反復加入0.2%三氟乙酸(TFA,Merck,Whitehouse Station,NJ,USA)進行洗脫。洗脫級分E1-E8進行彙集，並使用離心過濾裝置(Amicon,Millipore,Billerica,MA,USA)超濾對游離的HLA配體進行分離。使用ZipTip C18槍頭(Millipore)從濾液中提取HLA配體並進行脫鹽。提取肽在35μl的80%乙腈(ACN,Merck)/0.2% TFA中洗脫，離心完成乾燥，並再混懸於25μl的1% ACN/0.05% TFA。在進行LC-MS/MS分析之前，在-20℃下存儲樣本。
透過LC-MS/MS分析HLA配體
肽樣本透過反相液相色譜法(nanoUHPLC,UltiMate 3000 RSLCnano,ThermoFisher,Waltham,MA,USA)分析，隨後用線上耦合的LTQ Orbitrap XL混合質譜儀(ThermoFisher)進行分析。樣本用5次技術重複進行分析。將5μl(20%)樣本體積以注射到75μm x 2cm的捕獲柱(Acclaim PepMap RSLC,ThermoFisher)，速度為4μl/分，共5.75分鐘。隨後在50℃下和175nl/分的流速在50μm x 50cm的分離柱(Acclaim PepMap RSLC,ThermoFisher)上進行肽分離，在140分鐘的過程中施加2.4至-32.0% CAN的梯度。洗脫肽透過納噴霧電離進行電離，並在質譜儀中進行分析，其執行5次CID(碰撞誘導解離)方法，為調查掃描中5個最豐富的前體離子生成片段光譜。解析度設置為60000。對於HLA I類配體，品質範圍限於400-650 m/z，充電狀態2和3允許碎片化處理。對於HLA II類配體，分析了品質範圍300-1,500 m/z，充電狀態2允許碎片化處理。
資料庫搜索和光譜注釋
對於資料處理，使用軟體Proteome Discoverer(v1.3,ThermoFisher)來整合Mascot 搜索引擎(Mascot 2.2.04,Matrix Science)在Swiss-Prot資料庫中人類蛋白質組的搜索結果(www.uniprot.org，發佈：2013年9月27日；包含20,279個已審查的蛋白質序列)。搜索組合技術複製資料，且不受酶特異性限制。前體質量公差設定為5ppm，碎片質量公差設為0.5Da。氧化蛋氨酸允許做動態修改。假發現率(FDR)根據包括隨意目標資料的誘餌資料庫的處理透過過濾演算法確定。FDR的目標值設為q0.05(5% FDR)。根據額外的正交參數過濾q0.05的肽匹配譜(PSM)，以保證光譜品質和有效性。Mascot 分數過濾為20。對於HLA I類，肽長度限制為8-12個氨基酸(aa)長度。對於HLA II類，肽限制為12-25個aa長度。蛋白質分組被禁用，從而允許多次注釋肽(如，映射到多個蛋白質的保守序列)。對於品質控制，只有滿足300(HLA I類)和100(HLA II類)獨特配體識別(每樣本)閾值才會應用。使用SYFPEITHI(www.syfpeithi.de)或擴展的內部資料庫進行HLA注釋。
治療期間CLL患者配體組縱向分析
對於治療期間HLA配體相對豐度的無標記定量(LFQ)，配對樣本的注射肽量進行標準化，並且進行LC-MS/MS分析，每個樣本進行5次技術重複。
簡言之，配對樣本物質的相對量根據平均前體離子強度計算，該強度用劑量發現質譜運行確定，並相應地透過稀釋調節。使用Proteome Discoverer 1.3透過計算相應前體離子提取色譜圖(XIC)的曲線下面積來進行HLA配體的相對量化。各樣本5次LFQ-MS運行中個體肽的平均面積比例進行了計算，並使用內部Matlab腳本(v8.2,Mathworks)進行了雙尾t檢驗。
肽合成
使用所述9-芴甲基氧基羰基/叔丁基(Fmoc/tBu)策略利用自動肽合成器EPS221 (Abimed)來合成肽。合成肽用於驗證LC-MS/MS鑒定以及功能實驗。
肽特異性T細胞的擴增
來自CLL患者和健康志願者的PBMC在RPMI1640培養基(Gibco)中培養，該培養基補充有10%保存人血清(PHS，內部製備)、100mM β巰基乙醇(Roth,Karlsruhe,Germany)和1%青黴素/鏈黴素(GE)。對於CD8+T細胞刺激，將PBMC解凍並用每肽1μg/ml進行脈衝。肽脈衝PBMC(5-6 x 106個細胞/ml)在37℃和5% CO2下培養12天。在第0天與第1.5天，向培養基中加入1.5ng/ml IL-4(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)和5ng/ml IL-7(Promokine,Heidelberg,Germany)。在第3、5、7和9天，向培養基中加入2ng/ml IL-2(R&D Systems)。肽刺激的PBMC分別在第12天使用ELISPOT測定法和第13天使用細胞內細胞因數染色法進行功能特徵分析。對於CD4+ T細胞刺激，對CD8+ T細胞按所述方法進行培養，並進行2次修飾：使用10μg/ml II類HLA肽進行衝擊，不要加入IL-4和IL-7。
IFN-γ ELISPOT測定
IFN-γ ELISPOT測定按照前述方法進行(33)。簡言之，96孔硝基纖維素板(Millipore)塗覆有1mg/ml IFN-γ mAb(Mabtech,Cincinnati, OH,USA)，並在4℃下溫育過夜。培養板在37℃下用10% PHS封堵2小時。5 x 105個細胞/孔的預刺激PBMC用1μg/ml(HLA I類)或2.5μg/ml(HLA II類)肽進行衝擊，並溫育24-26小時。根據製造商的說明進行讀數。斑點用免疫斑點S5分析儀(CTL,Shaker Heights,OH,USA)進行計數。當計數為15個斑點/孔並且每孔的平均斑點數至少3倍高於陰性對照孔的平均斑點數時，則視為T細胞反應為陽性(根據癌症免疫指導計畫(CIP)的指導方針)。
細胞內IFN-γ和TNF-α染色
肽特異性CD8+ T細胞的頻率和功能透過細胞內IFN-γ和TNF-α染色進行分析。PBMC用1μg/ml的個別肽進行衝擊，並在含有10μg/ml佈雷菲德菌素A(Sigma,St.Louis,MO,USA)和10μg/ml GolgiStop(BD)的溶液中溫育6-8小時。細胞用Cytofix/Cytoperm(BD)、CD8-PECy7(Beckman Coulter,Fullerton,CA,USA)、CD4-APC(BD Bioscience)、TNF-α-PE(Beckman Coulter)和IFN-γ-FITC(BD)進行標記。樣本在FACS Canto II上分析。
肽特異性CD8+ T細胞的頻率透過抗-CD8和HLA：肽-四聚體-PE染色確定。
結果
原發性CLL細胞顯示與自體正常B細胞相比，無HLA表達的損失或表達下調
HLA在惡性腫瘤的損失或下調可能是T細胞免疫療法的主要限制。因此，第一步驟，發明人確定了與自體CD19+CD5- B淋巴細胞相比CD19+CD5+ CLL細胞的HLA表達水準。HLA表面水準在7名CLL患者組透過流式細胞儀進行了量化。HLA表面表達水準顯示，總HLA I類分子計數範圍因患者個體而不同，在CLL細胞上為~42,500-288,500個分子/細胞，在正常B細胞上為~32,000-256,500個分子/細胞。HLA表面表達的患者個體分析(一式三份)顯示，對於4/7的患者表達水準雖然有顯著差異，但是還是較小(P<0.01，圖1a)。HLA-DR的表達在CLL細胞上為~29,000-100,500，B細胞上為~19,500-79,500。5/7的患者中檢測到HLA-DR水準的微小差異(P<0.01)。CLL細胞上平均HLA表面表達的統計學分析顯示，與正常B細胞相比，HLA I類和II類表達量無顯著差異(圖1c,d)。總之，這些資料表明，與正常B細胞相比，CLL細胞上HLA I類和II類表達水準高，無HLA損失或下調的證據。
LC-MS/MS識別眾多天然提呈HLA I和II類配體
發明人對30名CLL患者的HLA I類配體組進行了製圖，從而可識別代表7,377個源蛋白的共 18,844個不同肽，達到>95%的最大可達到覆蓋範圍(圖7)。每名患者確定的不同肽的數量為345-2,497不等(平均1,131)。總體而言，本研究中確定了受限於30多個不同HLA-A和-B等位基因(覆蓋>99%白人人群ENREF 27)的肽。在30名PBMC捐獻者HV組中，確定了代表7,180個不同源肽的總共17,322個獨特肽(覆蓋>90%)。關於HLA等位基因的分佈，HV組中涵蓋了100% of HLA-A等位基因，CLL患者組中涵蓋了>80%的HLA-B等位基因。
對20名CLL患者進行了HLA II類配體組分析。識別了代表1,486源蛋白的共5,059個獨特肽。13位PBMC供體的HLA II類HV組產生了2,046個不同的肽，代表756個源蛋白。
HLA-I類配體組的比較分析顯示了大量CLL相關抗原
為了確定新型CLL相關抗原，發明人比較了CLL和HV組的HLA配體源蛋白質組。HLA源蛋白的重疊分析顯示，2,148個蛋白(29.1%的映射CLL源蛋白組)專門在CLL患者的HLA配體組中表示(圖2a)。為了設計廣泛適用的現成肽疫苗，發明人隨後按照以下標準優先選擇了潛在靶標：CLL-獨有性定義為最重要的標準，其次為根據CLL配體組中表示頻率的抗原排名(圖2b)。我們的平臺強調了225個不同的HLA配體代表的49個源蛋白(CLL 源蛋白組的0.7%)，顯示20%的CLL患者中有CLL獨有提呈。對HV PBMC獨有抗原採用相同的抗原排名策略，一組71個配體組源性良性組織相關抗原(LiBAA)和298個相應的配體(LiBAP)被確定在免疫學測定法中用作內部對照。
除了適合設計現成疫苗的廣泛提呈CLL-LiTAA，我們的平臺還確認了一組2,099個CLL獨有抗原，提呈頻率<20%。這些靶標使自身作為存儲庫，用於更具個性化的治療方法。
用LC-MS/MS檢測源自確定CLL相關抗原的天然提呈HLA-I類配體
除了識別新型CLL相關抗原，另一種方法關注于天然提呈HLA配體的目前資料集內少數確定CLL抗原的排名。發明人能夠識別28種不同的HLA配體，代表8種所述的CLL相關抗原。值得注意的是，只有纖維調節素(FMOD324-333,RINEFSISSF,HLA-A*23(SEQ ID NO：526)顯示，CLL獨有提呈、在目前資料集的CLL抗原中排名437位，這是由於在CLL患者組中出現頻率較低。其餘七個抗原均在CLL和HV PBMC上出現，因而不能滿足CLL獨有性最重要的標準。但是，對於CD19、CD20、RHAMM和PRAME，檢測到了不同程度的CLL相關過量提呈(圖2c)。
對比配體組特點可識別不同疾病階段和風險階層中共用的LiTAA
為了評估不同階段疾病新靶點的適用性，發明人進行了子集特定配體組分析，比較不同疾病階段患者(Binet A(n=9),Binet B(n=7),Binet C(n=14))。對2148個CLL獨有性源蛋白的重疊分析發現，550(25.6%)至少兩個疾病階段共有，核心組在三個疾病階段的患者中均出現了137個蛋白(6.1%)(圖2d)。需要注意的是，45/49(91.8%)LiTAA屬於在所有三個子集中均出現共有源蛋白的核心組。圖2e顯示Binet A、B和C階段所有49個LiTAA提呈頻率的熱圖分析。
另一個重點是與沒有基因畸變的患者(無del17p，n=25)相比，確定17p13缺失高危患者亞群中LiTAA的提呈(del17p,n=5)。發明人發現，在兩個子集中出現77.7%的識別LiTAA(圖2f)。總之，這些資料支持在廣泛適用靶點選擇時HLA配體組人群分析的策略。
HLA I類LiTAP功能分析表明了CML-相關免疫反應性
為了評估我們的HLA I類LiTAP的免疫原性和特異性，發明人接下來進行了為期12天回憶IFN-γ ELISPOT檢測。執行了一組15個LiTAP(6個A*02，4個A*03和5個B*07 LiTAP)以 刺激從CLL患者和健康志願者中獲得的HLA匹配PBMC(圖3a)。發明人觀察到，CLL患者中14/15(93.3%)測定的LiTAP分泌IFN γ(3/4 A*03(圖3c)，6/6 A*02和5/5 B*07 LiT AP(圖8 c,f))，但在健康對照組無IFN γ分泌(0/10，圖3b，圖8 b,e)。針對PA*03 3(DMXL11271-1279 SSSGLHPPK)，這些結果透過CD8+ T細胞四聚體染色以及IFN γ和TNF α的細胞內細胞因數染色得到示例性確認(圖9a，b)。使用HLA匹配良性組織源性LiBAP進行了ELISPOT分析，以控制CLL患者中所觀察到的LiTAP定向免疫識別的CLL特異性。發明人測試了一組9個LiBAP(3個A*02，3個A*03，3個B*07)，在任何測試的CLL患者中均未觀察到明顯的IFN γ分泌(0/7 A*03(圖3d)，0/10 A*02+和0/5 B*07(圖8 a,d))。
對於在1名或多名患者中顯示免疫識別的14/15 LiTAP，發明人計算了CLL患者中HLA有限提呈的等位基因調整頻率(用LC-MS/MS檢測)以及免疫反應的頻率(用ELISPOT檢測)。引人注目的是，發現這兩個參數存在著線性相關性(Pearson’s r=0.77,R2=0.59，圖3e)。這些結果表明主要兩點：首先，腫瘤獨有提呈是免疫識別的前提。其次，免疫識別的頻率可直接從免疫反應LiTAP的HLA限制性提呈 頻率推導。總之，這些資料表明，我們的識別CLL特異性肽疫苗免疫相關靶標的方法是有效的。
HLA II類配體組分析確定了協同疫苗設計的其他CD4+ T細胞表位
由於CD4+ T細胞在抗癌免疫反應中起著重要的間接和直接作用，因此，最佳的疫苗設計要求加入其他的HLA II類表位。發明人進行了CLL和HV PBMC配體組重疊分析，並確定了專門在CLL患者的配體組中出現的937個蛋白(63.0%的確定CLL源蛋白)(圖4a)。發明人應用HLA I類所述的相同抗原排名策略，確定了460個相應LiTAP提呈的73個HLA II類LiTAA(圖4b)。IFN γ ELISPOT檢測中7個HLA II類LiTAP的功能特徵(圖4c)顯示，CLL患者中6/7(85.7%)LiTAP明顯分泌IFNγ(圖4e)，但在健康對照組無IFNγ分泌(0/10，圖4d)。接下來，發明人對HLA I類和II類配體組進行了合併分析，以確定共同、協同的靶標。CLL獨有源蛋白的重疊分析表明，132個蛋白質在HLA I類和II類配體組中均提呈(圖4f)。熱圖分析確定了在兩個配體組中顯示提呈頻率均20%的2個蛋白(B4GALT1(26.7% I類/30.0% II類)、HLA-DMA(20.0% I類/20% II類)，圖4g)。引人注目的是，其中1個I類LiTAP(HLA-DMA206-214,HEIDRYTAI,B*18)顯示完全嵌入相應的HLA II類LiTAP(VTHEIDRYTAIAY (SEQ ID No.924))。總之，發明人確定了一組II類LiTAP，它們可能被驗證為T細胞表位，以及覆蓋I類LiTAA的潛在協同HLA II類配體的陣列。
不同治療方案下CLL患者配體組的縱向分析
基於肽的免疫治療範圍是MRD的維持治療和根除。一個結果是，將在標準化療/免疫治療後進行CLL肽疫苗接種。因此，發明人分析了HLA表達，以及在CLL患者接受不同治療方案的不同時間點進行配體組分析。
發明人對4名接受利妥昔單抗治療(Rt0h,Rt24h)和1名接受阿侖單抗治療的患者中的HLA I類和II類表面表達進行了量化(At0h,At72h,At7d，圖10 a-d)。HLA表面表達顯示，患者個體不同，在每個治療方案的療程中平均HLA I類(Rt0h=50,500,Rt24h=48,000；At0h=42,500,At7d=61,500)和HLA II類(Rt0h=36,500,Rt24h=27,500；At0h=47,000,At7d=55,500)表達量均無明顯變化。
縱向HLA I類配體組分析分別在接受利妥昔單抗-苯達莫司汀、阿侖單抗或atumumab治療的單個患者中進行(圖5a-c)。觀察到了提呈差異(2倍的變化，P0.05)，利妥昔單抗-苯達莫司汀治療下HLA-I類配體提呈11.1%，atumumab治療下配體提呈21.6%，阿侖單抗治療下配體提呈33.6%。總體而言， 提呈8/49(16.3%)LiTAA的LiTAP顯示在治療過程中存在提呈差異。總之，這些資料表明，在不同治療過程中存在著穩定的表面HLA表達和強大的LiTAP提呈。
針對LiTAP的免疫反應可能與CLL患者總體生存改善相關聯
最後一步，發明人透過ELISPOT分析法對33名CLL患者(圖6a)進行了回顧性生存分析，並將0-1 LiTAP-特異性病例(n=23)與>1 LiTAP-特異性(n=10)T細胞應答病例進行了比較(圖6b)。在低應答者組，6/23(26.1%)的患者死亡；在高應答組，0/11患者死亡。在顯示>1次免疫反應的組，總生存期似乎延長。
實施例2
肽的合成
所有的肽透過使用Fmoc策略以標準、廣為接受的固相肽合成法合成。用製備方法RP-HPLC純化之後，進行離子交換純化程序從而加入生理相容性反離子(例如，三氟乙酸鹽、乙酸鹽、銨或氯化物)。
每個肽的身份和純度已使用質譜和RP-HPLC分析法確定。離子交換程序後，用凍幹法獲得白色至類白色的肽，純度為90%至99.7%。
所有的TUMAP優選作為三氟乙酸鹽或乙酸鹽進行給藥，其他鹽形式也可以。對於實施例4的測量，使用了該肽的三氟乙酸鹽。
實施例3
MHC結合分析
用於本發明基於T細胞治療的候選肽接受其MHC結合能力(親和力)的進一步測試。單個肽-MHC複合物透過肽-配體交換產生，其中，一種裂解敏感肽被裂解，與分析的相關肽交換。只有能夠有效地結合並穩定肽接受MHC分子的候選肽才能阻止MHC複合物的解離。為了確定交換反應的產率，基於穩定MHC複合物輕鏈(β 2m)的檢測結果進行了ELISA測定。檢測總體上按照Rodenko等人描述的方法進行。(Rodenko B et al.Nat Protoc.1(2006)：1120-1132)。
96孔Maxisorp板(NUNC)在室溫下在PBS中以2μg/ml鏈黴包被過夜，洗滌四次，並在37℃下在含封閉緩衝液的2% BSA中封閉1小時。再折疊的HLA-A*0201/MLA-001單體作為標準品，涵蓋15-500ng/ml的範圍。紫外線交換反應的肽-MHC單體在封閉緩衝液中稀釋100倍。樣本在37℃下孵育1小時，洗滌四次，在37℃下以2μg/ml HRP綴合抗-β 2m溫育1小時，再次洗滌，並以NH2SO4封堵的TMB溶液進行檢測。在450nm處測量吸收。在希望生成和產生抗體或其片段時和/或T細胞受體或其片段時，通常優 選顯示為高交換產率(優選為高於50%，最優選高於75%)的候選肽，這是因為它們對MHC分子表現出足夠的親合力，並能防止MHC複合物的解離。
測試的肽MHC I類結合評分為：<20%=+；20%-49%=++；50%-75%=+++；>=75%=++++
實施例4
MHC-I類提呈肽的體外免疫原性
為了獲得關於本發明TUMAP的免疫原性資訊，發明人使用體外T細胞擴增分析方法進行了研究，其中該分析方法基於使用裝載肽/MHC複合物和抗CD28抗體的人工抗原提呈細胞(aAPC)進行反復刺激。用這種方法，發明人可顯示出本發明的HLA-A*0201限制TUMAP具有免疫原性，這表明這些肽為對抗人CD8+前體T細胞的T細胞表位。
CD8+ T細胞體外啟動
為了用載有肽-MHC複合物(pMHC)和抗CD28抗體的人工抗原提呈細胞進行體外刺激，發明人首先從University clinics Mannheim,Germany中獲取健康供體CD8微珠(Miltenyi Biotec,Bergisch-Gladbach,Germany)通過積極選擇白細 胞清除術後新鮮HLA-A*02產物而分離出CD8+ T細胞。
PBMC和分離出的CD8+淋巴細胞使用前在T細胞培養基(TCM)中培養，培養基包括RPMI-Glutamax(Invitrogen公司，Karlsruhe，德國)並補充10%熱滅活人AB血清(PAN-Biotech公司，Aidenbach，德國)、100U/ml青黴素/100μg/ml鏈黴素(Cambrex公司，Cologne，德國)，1mM丙酮酸鈉(CC Pro公司，Oberdorla，德國)和20μg/ml慶大黴素(Cambrex公司)。在此步驟，2.5ng/ml的IL-7(PromoCell公司，Heidelberg，德國)和10U/ml的IL-2(Novartis Pharma公司，Nürnberg，德國)也加入TCM。
對於pMHC/抗-CD28塗層珠的生成、T細胞的刺激和讀出，使用每刺激條件四個不同pMHC分子以及每個讀出條件8個不同的pMHC分子在高度限定的體外系統中進行。
純化的共刺激小鼠IgG2a抗人CD28抗體9.3(Jung et al.,Proc Natl Acad Sci USA 84(1987)：4611-4615)使用製造商(Perbio公司，波恩，德國)推薦的N-羥基琥珀醯亞胺生物素進行化學生物素化處理。所用珠為5.6μm的鏈黴抗生物素蛋白包裹的多聚苯乙烯顆粒(Bangs Labooratories，伊利諾州，美國)。
用於陽性和陰性對照刺激物的pMHC分別為A*0201/MLA-001(從Melan-A/MART-1中修飾制得的肽ELAGIGILTV(SEQ ID NO.1017))和A*0201/DDX5-001(從DDX5中獲得的YLLPAIVHI(SEQ ID NO.1018))。
800.000珠/200μl包裹於含有4 x 12.5ng不同生物素-pMHC的96孔板、進行洗滌，隨後加入體積為200μl的600ng生物素抗-CD28。在37℃下，在含5ng/ml IL-12(PromoCell)的200μl TCM中共培養1x106 CD8+T細胞與2x105的清洗塗層珠3天，從而啟動刺激。之後，一半培養基與補充80U/ml IL-2的新鮮TCM進行交換，並且培養在℃下持續4天。這種刺激性週期總共進行3次。對於使用每條件8種不同pMHC分子的pMHC多聚體讀出，二維組合編碼方法如前述使用(Andersen et al.,Nat.Protoc.7(2012)：891-902)，稍作修飾，涵蓋耦合至5種不同的螢光染料。最後，用Live/dead near IR染料(Invitrogen公司，Karlsruhe，德國)、CD8-FITC抗體克隆SK1(BD公司，Heidelberg，德國)和螢光pMHC多聚體而執行多聚體分析。對於分析，使用了配有合適鐳射儀和篩檢程序的BD LSRII SORP細胞儀。肽特異性細胞以占總CD8+細胞的百分比形式進行計算。多聚體分析結果使用FlowJo軟體(Tree Star公司，Oregon，美國)進行評估。特定多 聚體+ CD8+淋巴細胞的體外填裝用與陰性對照刺激組比較而進行檢測。如果健康供體中的至少一個可評價的體外刺激孔在體外刺激後發現含有特異性CD8+ T細胞株(即該孔包含至少1%特定多聚體+ CD8+ T細胞，並且特定多聚體+的百分比至少為陰性對照刺激中位數的10倍)，則檢測給定抗原的免疫原性。
CLL肽體外免疫原性
對於受到測試的HLA-I類肽，可通過肽特異性T細胞株的生成證明其體外免疫原性。作為示例性結果，肽KFAEEFYSF(SEQ ID NO.20)使2/5的受檢測供體產生體外T細胞應答。
實施例5
細胞表面提呈的腫瘤相關肽的識別和定量
組織樣本：
除了用於識別肽的樣本外，一個包含正常和腫瘤(CLL)組織的獨立樣本組用於本發明HLA-A*02相關肽的分析/確認。所有患者在手術或屍檢前都獲得了書面知情同意。切除後組織立即進行冷休克處理，在分離TUMAP前儲存於-70℃或以下。
從組織樣本中分離HLA肽
根據方案(Falk et al.,Nature 351(1991)：290-296；Seeger et al.,Immunogenetics 49(1999)：571-576)略加修改，使用HLA-A*02特異性抗體BB7.2、HLA-A、 HLA-B、HLA-C特異性抗體W6/32、CNBr活化的瓊脂糖凝膠、酸處理和超濾方法以固體組織的免疫沉澱法獲得了冷休克組織樣本的HLA肽庫。
質譜分析
獲得的HLA肽庫根據其疏水性用反相色譜(nanoAcquity UPLC system,Waters)分離，洗脫肽用裝有電噴霧源的LTQ-velos融合雜交質譜(ThermoElectron)進行了分析。肽庫被直接載入填充有1.7μm C18反相材料(Waters)的分析用熔煉石英微毛細管柱(75μm內徑x 250mm)，應用流速為400nL每分鐘。隨後，使用來自流速為300nL每分鐘、濃度為10%至33%溶劑B中的兩步180分鐘二元梯度法對肽進行分離。梯度由溶劑A(含0.1%甲酸的水)和溶劑B(含0.1%甲酸的乙腈)。金鍍膜玻璃毛細管(PicoTip,New Objective)用於引入到納升電噴霧源。使用前5(TOP5)策略在資料依賴模式下操作LTQ-Orbitrap質譜儀。簡言之，首先以高精確品質完全掃描在orbitrap開始一個掃描週期(R=30000)，之後用先前選定離子的動態排除技術在orbitrap中對5種含量最為豐富的前體離子進行MS/MS掃描(R=7500)。串聯質譜以SEQUEST和另一種手動控制器進行解讀。生成的自然肽破碎模式與合成序列相同參考肽的破碎模式進行比較後，確保了被識別的肽序列。
無標記相對LC-MS定量通過離子計數(即通過LC-MS特徵提取和分析)來進行(Mueller et al.,Proteomics.7(2007)：3470-3480)。該方法假定肽的LC-MS信號區域與樣本中其豐度相關。提取的特徵通過充電狀態去卷積和保留時間校準進行進一步處理(Mueller et al.,J Proteome.Res 7(2008)：51-61；Sturm et al.,BMC.Bioinformatics.9(2008)：163)。最後，所有的LC-MS特徵與序列鑒定結果交叉引用，以將不同樣本和組織的定量資料與肽呈遞特徵結合。定量資料根據集中資料以兩層方式進行正態化處理，以說明技術和生物學複製變異。因此，每個被識別的肽均可與定量資料相關，從而可得出樣本和組織之間的相對定量。此外，對候選肽獲得的所有定量資料進行手動檢查，以確保資料的一致性，並驗證自動化分析的準確度。對於每種肽，計算了提呈圖，其顯示樣本平均提呈量以及複製變化。這些特徵使CLL樣本與正常組織樣本的基線值並列。示範性過度提呈肽的提呈譜示於圖11中。
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Claims (33)

  1. 一種肽，其由根據SEQ ID NO：167之氨基酸序列所組成，或其一藥用鹽。
  2. 根據請求項1所述的肽，其中該肽具有與人類主要組織相容性複合物(MHC)I類分子結合的能力。
  3. 根據請求項1所述的肽，其中該肽包含非肽鍵。
  4. 一種T細胞受體，其能與一HLA配體反應，該HLA配體具有由SEQ ID NO：167所組成之一氨基酸序列。
  5. 一種融合蛋白，其包括：(a)一氨基酸序列，其由SEQ ID NO：167所組成；及(b)HLA-DR抗原相關不變鏈(Ii)的第1至80個N-端氨基酸。
  6. 一種抗體，當與人類主要組織相容性複合物(MHC)I類分子絡合時，該抗體特異性結合至根據請求項1至3中任一項所述的肽。
  7. 一種核酸，其編碼：(a)根據請求項1至3中任一項所述的肽；(b)根據請求項4所述的T細胞受體；(c)根據請求項5所述的融合蛋白；或(d)根據請求項6所述的抗體。
  8. 根據請求項7所述的核酸，其中該核酸為DNA、cDNA、PNA、RNA或其組合物。
  9. 一種表達載體，其包括根據請求項7或8所述的核酸。
  10. 一種宿主細胞，其包括根據請求項7或8所述的核酸，或根據請求項9所述的表達載體。
  11. 根據請求項10所述的宿主細胞，其中該宿主細胞為一抗原提呈細胞(antigen presenting cell)。
  12. 一種用於製備根據請求項1至3中任一項所述的肽之方法，該方法包括：培養根據請求項10或11所述的宿主細胞，以及從該宿主細胞和/或該宿主細胞的培養基分離出該肽。
  13. 一種用於製備根據請求項4所述的T細胞受體之方法，該方法包括：培養根據請求項10或11所述的宿主細胞，以及從該宿主細胞和/或該宿主細胞的培養基分離出該T細胞受體。
  14. 一種用於製備根據請求項5所述的融合蛋白之方法，該方法包括：培養根據請求項10或11所述的宿主細胞，以及從該宿主細胞和/或該宿主細胞的培養基分離出該融合蛋白。
  15. 一種用於製備根據請求項6所述的抗體之方法，該方法包括：培養根據請求項10或11所述的宿主細胞，以及從該宿主細胞和/或該宿主細胞的培養基分離出該抗體。
  16. 一種用於體外製備啟動的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的方法，該方法包括將CTL與載有抗原的人I或II類MHC分子進行體外接觸，該些人I或II類MHC分子在合適的抗原提呈細胞表面表達足夠的一段時間，從而以抗原特異性方式啟動該CTL，其中該抗原為根據請求項1或2中任一項所述的肽。
  17. 根據請求項16所述的方法，其中藉由使足夠量的該抗原與抗原提成細胞結合，而將該抗原載入表達於合適抗原提呈細胞的表面的I類MHC分子。
  18. 根據請求項16所述的方法，其中該抗原提呈細胞包括一個表達載體，該表達載體有能力表達根據請求項1至3中任一項所述的肽。
  19. 一種啟動的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)，其藉由根據請求項16至18中任一項所述的方法製備。
  20. 一種有效數量的根據請求項19所述的細胞毒性T淋巴細胞用於製造一藥劑的用途，該藥劑用來殺死在患者中的靶向癌細胞。
  21. 一種根據請求項1至3中任一項所述的肽用於製造一藥劑的用途，其中該藥劑有抗癌活性。
  22. 一種根據請求項4所述的T細胞受體用於製造一藥劑的用途，其中該藥劑有抗癌活性。
  23. 一種根據請求項5所述的融合蛋白用於製造一藥劑的用途，其中該藥劑有抗癌活性。
  24. 一種根據請求項6所述的抗體用於製造一藥劑的用途，其中該藥劑有抗癌活性。
  25. 一種根據請求項7或8所述的核酸用於製造一藥劑的用途，其中該藥劑有抗癌活性。
  26. 一種根據請求項9所述的表達載體用於製造一藥劑的用途，其中該藥劑有抗癌活性。
  27. 一種根據請求項10或11所述的宿主細胞用於製造一藥劑的用途，其中該藥劑有抗癌活性。
  28. 一種根據請求項19所述的啟動的細胞毒性T淋巴細胞用於製造一藥劑的用途，其中該藥劑有抗癌活性。
  29. 根據請求項21至28中任一項所述的用途，其中該藥劑係一疫苗。
  30. 根據請求項21至28中任一項所述的用途，其中該癌症為慢性淋巴性白血病(CLL)和/或急性骨髓性白血病(AML)。
  31. 一種藥物組合物，其包括至少一種活性成分以及一藥用載體，該活性成分選自由請求項1至3中任一項所述的肽、請求項4所述的T細胞受體、請求項5所述的融合蛋白、請求項6所述的抗體、請求項7或8所述的核酸、請求項9所述的表達載體、請求項10或11所述的宿主細胞及請求項19所述的啟動細胞毒性T淋巴細胞所組成的群組。
  32. 一種藥物組合物，其包括至少一種活性成分，該活性成分選自由以下項所組成的群組：a)根據請求項1或2所述的肽；b)與a)中所述的肽產生反應的一T細胞受體；c)包含a)中所述的肽以及HLA-DR抗原相關不變鏈(Ii)的第1至80個N-端氨基酸的融合蛋白；d)編碼a)至c)中任一項的核酸，或包含該核酸的表達載體；e)包括d)中的表達載體的宿主細胞，和f)一啟動的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)，透過一方法獲得，該方法包括將CTL與a)中所述的肽進行體外接觸，該肽在合適的抗原提呈細胞表面表達足夠的一段時間，從而以抗原特異性的方式啟動該CTL；和一藥用載體。
  33. 一種有效數量的根據請求項32所述的藥物組合物用於製造一藥劑的用途，該藥劑用來殺死在患者中的靶向細胞。
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