JP6560261B2 - 数種の血液腫瘍、特に慢性リンパ性白血病（ｃｌｌ）に対する新規免疫療法 - Google Patents

数種の血液腫瘍、特に慢性リンパ性白血病（ｃｌｌ）に対する新規免疫療法 Download PDF

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Description

本発明は、免疫療法で使用するためのペプチド、核酸、および細胞に関する。特に、本発明は、がんの免疫療法に関する。本発明は、単独で、またはその他の腫瘍関連ペプチドとの組み合わせで、抗腫瘍免疫応答を刺激するワクチン組成物の活性医薬品成分の役割を果たす、腫瘍関連細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）ペプチドエピトープにさらに関する。本発明は、抗腫瘍免疫応答を引き起こすためのワクチン組成物で使用され得る、ヒト腫瘍細胞のＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩ分子に由来する、いくつかの新規ペプチド配列と、それらの変異型とに関する。
慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）としてもまた知られている、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）は、最も一般的な白血病型である。
白血病は、白血球細胞（白血球）のがんである。ＣＬＬは、Ｂ細胞リンパ球に影響を及ぼす。Ｂ細胞は、骨髄で発生してリンパ節で発達し、常態では抗体を生産することで感染症と戦う。ＣＬＬにおいては、Ｂ細胞が制御不能に増殖し、骨髄および血液中に蓄積して、健常血液細胞を押しのける。ＣＬＬは、主にリンパ節内に存在するＢ細胞リンパ腫の一種である、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）の一段階である。ＣＬＬおよびＳＬＬは、外観が異なるだけの同一基礎疾患と見なされる。
ＣＬＬは成人疾患であるが、稀には、それは十代の若者、時に小児（遺伝性）にも起こり得る。ＣＬＬと新規診断される大部分の（＞７５％）人々は５０才以上であり、大多数は男性で、年齢中央値は診断時点で７０才である。あまり一般的ではないが、ＣＬＬは、３０〜３９才の人々を冒すこともある。ＣＬＬの発生率は、年齢の増大と共に非常に迅速に増大する。
米国では、２０１２年中に約１６，０６０例の新規症例が診断されると予測され、４，５８０人の患者がＣＬＬにより死亡すると予測される。
ＣＬＬは、日本や中国などのアジアの国々では非常に稀であり、これらの地域における全ての白血病に占める割合は低く、１０パーセント程度かもしれない。
上記を鑑みて、重篤な副作用をもたらすこともある過剰な化学療法剤またはその他の薬剤を使用しないことで、患者の福利を改善する、がんのための、特に慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）および異なる表現型のその他の血液がんのための新しい効果的かつ安全な治療の選択肢に対する必要性がなおもある。
本発明は、非侵襲様式で患者の免疫系を刺激して抗腫瘍剤として作用する、ペプチドを用いる。
本発明の第１の態様では、本発明は、配列番号１〜配列番号２２５、配列番号２２６〜配列番号５４２または配列番号５４３〜配列番号１０１６、または配列番号１〜配列番号２２５または配列番号５４３〜配列番号１０１６と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％相同的な（好ましくは少なくとも８０％または少なくとも９０％同一の）それらの変異配列の群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるペプチドに関し、その中で前記変異体は、前記ペプチドまたはその薬学的に許容可能な塩と交差反応するＴ細胞を誘導し、その中で前記ペプチドは、基礎となる完全長ポリペプチドでない。
本発明は、配列番号１〜配列番号２２５、配列番号２２６〜配列番号５４２または配列番号５４３〜配列番号１０１６、または配列番号１〜配列番号２２５または配列番号５４３〜配列番号１０１６と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％相同的な（好ましくは少なくとも８０％または少なくとも９０％同一の）それらの変異体の群から選択される配列を含んでなる、本発明のペプチドにさらに関し、前記ペプチドまたはそれらの変異体は、配列番号１〜配列番号２２５では、８〜１００、好ましくは８〜３０、最も好ましくは８〜１４アミノ酸、配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）５４３〜配列番号１０１６では、１２〜１００、好ましくは１２〜３０、最も好ましくは１２〜１８アミノ酸の全長を有する。
続く表は、本発明によるペプチド、それらの各配列番号、およびそれらのペプチドの予期される原料（基礎）タンパク質を示す。表１ａおよび１ｂの全てのペプチドは、ＨＬＡ Ａ ＨＬＡ ＢまたはＨＬＡ Ｃ対立遺伝子に結合し、表２のペプチドはＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子（ＭＨＣクラスＩＩ）に結合する。表３のペプチドは、それぞれの基礎となるポリペプチドの過剰発現または過剰提示（ｐｒｅｓｅｎｔａｉｏｎ）を伴う、ＣＬＬ、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、およびその他の血液悪性腫瘍の診断および／または治療においてさらに有用である。
したがって、本発明は、特に、配列番号５４３〜配列番号１０１６に記載の配列を含んでなる本発明のペプチド、または配列番号５４３〜配列番号１０１６と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％相同的な（好ましくは少なくとも８０％または少なくとも９０％同一の）それらの変異型に関し、前記ペプチドまたはそれらの変異型は、１２〜１００、好ましくは１２〜３０、最も好ましくは１２〜１８アミノ酸の全長を有する。本発明は、特に、配列番号５４３〜配列番号１０１６に記載の配列からなる、本発明のペプチドに関する。
表１ａ：本発明による好ましい４９個のＨＬＡクラスＩリガンドーム由来腫瘍関連抗原（ＬｉＴＡＡ）は、ＣＬＬ患者リガンドーム（ｎ＝３０）の≧２０％で表示されることが認められ、２２５個の表示ＨＬＡリガンド（ＬｉＴＡＰ）は、それぞれのＨＬＡ拘束性によりアノテートされた。
表１ｂ：本発明によるＣＬＬ−ＭＨＣクラスＩの追加的なペプチド
表１c：本発明によるＣＬＬ−ＭＨＣクラスＩＩの追加的なペプチド
表２：本発明によるペプチドはＣＬＬおよび／またはＡＭＬの（併用）治療に適する
したがって、特に好ましいのは、本発明によって、配列番号７１０、８７８、８７９、５３３、４７６、８９２、１１１、１７８、１８１、１８４、８８２、３６３、４２、１６３、１３７、７１３、５３２、７３４、７３６、７３７、７３８、５３４、５３５、９１４、７３９、４７７、１６４、３６４、５３１、５３６、１８６、１７９、１５９、３６５、８９５、４４、および１８０からなる群から選択される、少なくとも１つのペプチドと、本明細書に記載されるようなＡＭＬおよび／またはＣＭＬの治療におけるその使用である。
本発明は、以下の表３に示されるようなＣＬＬＡＭＬの治療で使用される、本発明によるペプチドにさらに関し、本発明によるペプチドの多くはまた、その他のがん性および増殖性適応症で使用され得る。
表３：本発明によるペプチド、およびその他の増殖性疾患における、任意選択的にその他の臓器におけるそれらの特定用途。
したがって、本発明の別の態様は、好ましくは、以下の群から選択される増殖性疾患の併用治療のための、本発明によるペプチドの使用に関する：副腎皮質腺腫；非骨化性線維腫；脳腫瘍；および腎臓オンコサイトーマ、腎臓ウィルムス腫瘍、リンパ節悪性メラノーマ、および大網平滑筋肉腫から選択される増殖性疾患；神経膠芽腫；および乏突起膠腫、腎血管筋脂肪腫、肝臓肝腺腫、肝臓肝細胞がん、肺小細胞がん、耳下腺多形性腺腫、胸膜悪性中皮腫、シュワン細胞腫、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、および甲状腺乳頭がんから選択される増殖性疾患；乳がん；軟骨肉腫；結腸または直腸がん；および骨の骨巨細胞腫瘍、骨、非骨化性線維腫、乳房粘液がん、結腸腺がん、結腸腺腫、類内膜型子宮内膜腺がん、食道腺がん、腎血管筋脂肪腫、腎臓腎細胞がん、脂肪肉腫、肝臓肝細胞がん、卵巣顆粒膜細胞腫瘍、膵臓嚢胞腺腫、胸膜悪性中皮腫、前立腺良性結節性過形成、脾臓非ホジキンリンパ腫、胃粘液腺がん、胸腺腫、悪性、甲状腺結節性過形成、膀胱、移行上皮がん、および外陰部扁平上皮がんから選択される増殖性疾患；結腸腺腫；食道腺がん；腸管悪性カルチノイド腫瘍；筋肉内脂肪腫；腎臓腎明細胞がん；および副腎、副腎皮質がん、類内膜型子宮内膜腺がん、類内膜型子宮内膜腺がん、腎血管筋脂肪腫、平滑筋肉腫、脂肪腫肝臓肝細胞がん、リンパ節ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、膵臓腺がん、耳下腺多形性腺腫、前立腺がん、直腸腺がん、脾臓慢性骨髄性白血病、脾臓非ホジキンリンパ腫、および甲状腺濾胞性腺腫から選択される増殖性疾患；腎臓オンコサイトーマ；腎臓多発性嚢胞腎；腎臓腎細胞がん、脂肪腫；肝臓肝細胞がん；および副腎皮質腺腫、乳がん、肝限局性結節性過形成、がん直腸腺がん、がん甲状腺、結節性過形成、がん甲状腺、乳頭がん、結腸非ホジキンリンパ腫、子宮内膜過形成、肝腺腫、腎がん、腎臓オンコサイトーマ、脂肪腫、脂肪肉腫、肝限局性結節性過形成、肝臓肝腺腫、胸膜悪性中皮腫、神経芽細胞腫、膵臓腺がん、膵臓嚢胞腺腫、耳下腺多形性腺腫、胸膜悪性中皮腫、滑膜肉腫、甲状腺結節性過形成、および子宮頸部扁平上皮がんから選択される増殖性疾患；肺、非小細胞肺がん；および乳がん、軟骨肉腫、腎臓オンコサイトーマ、肝臓肝細胞がん、肺腺がん、リンパ節ホジキン病、リンパ節非ホジキンリンパ腫、甲状腺のリンパ節乳頭がん、大網腺がん、卵巣ミュラー管混合腫瘍、膵臓腺がん、精巣混合胚芽細胞腫瘍、良性胸線胸腺腫、および甲状腺、結節性過形成から選択される増殖性疾患；リンパ節ホジキン病；甲状腺のリンパ節乳頭がん；甲状腺転移性のリンパ節乳頭がん；子宮筋層平滑筋腫；非ホジキンリンパ腫；末梢Ｔ細胞型または小リンパ球型非ホジキンリンパ腫；膵臓腺がん；および骨の骨巨細胞腫瘍、結腸腺がん、線維腫症、筋肉内脂肪腫、腎血管筋脂肪腫、腎臓腎細胞がん、肝臓肝腺腫、肺腺がん、子宮筋層平滑筋腫、非ホジキンリンパ腫小リンパ球型、膵臓腺がん、前立腺良性結節性過形成、直腸腺がん、脾臓慢性骨髄性白血病、および胸線、胸腺腫、悪性から選択される増殖性疾患；直腸腺がん；脾臓慢性骨髄性白血病；脾臓髄外造血；胃腺がん；および副腎皮質腺腫、骨の骨巨細胞腫瘍、骨非骨化性線維腫、乳がん、結腸腺がん、結腸非ホジキンリンパ腫、子宮内膜腺がん類内膜、腎血管筋脂肪腫、腎がん、腎臓オンコサイトーマ、肝臓、限局性結節性過形成、肝臓肝細胞がん、リンパ節ホジキン病、甲状腺のリンパ節乳頭がん、甲状腺起源の髄様がん、胃の転移性腺がん、神経線維腫、卵巣莢膜腫−線維腫、膵臓腺がん、膵臓嚢胞腺腫、副甲状腺腫、直腸腺がん、皮膚扁平細胞がん、脾臓慢性骨髄性白血病、胃消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、甲状腺結節性過形成、甲状腺乳頭がん、子宮頸部扁平細胞がん、および白血球細胞慢性リンパ球性白血病から選択される増殖性疾患；胃消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）；転移性胃がん；および副腎皮質がん、甲状腺乳頭がん、皮膚、扁平細胞がん、乳がん、結腸腺がん、子宮内膜ミュラー管混合腫瘍、腎がん、平滑筋肉腫、肺神経内分泌がん（非小細胞細胞型）、リンパ節非ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、卵巣ミュラー管混合腫瘍、膵臓腺がん、直腸腺がん、皮膚基底細胞がん、胃消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、および子宮頸部腺がんから選択される増殖性疾患；精巣セミノーマ；胸線良性胸腺腫；甲状腺濾胞性腺腫；および甲状腺結節性過形成。
本発明の別の好ましい態様は、以下の表４に従った疾患の好ましい免疫療法のための本発明によるペプチドの使用、好ましくは併用に関する。
表４：本発明による好ましいペプチドおよび治療される疾患
本発明の別のより好ましい態様は、以下の表５に従った疾患のより好ましい免疫療法のための本発明によるペプチドの使用、好ましくは併用に関する。
表５：本発明によるより好ましいペプチドおよび治療される疾患
最後に、本発明の最も好ましい態様は、以下の表６に従った疾患の最も好ましい免疫療法のための本発明によるペプチドの使用、好ましくは併用に関する。
表６：本発明による最も好ましいペプチドおよび治療される疾患
Ｂ４ＧＡＬＴ１は、ドナー基質ＵＤＰ−ガラクトースに対する排他的特異性を有するようである、ＩＩ型膜結合糖タンパク質をコードする（ＲｅｆＳｅｑ）。Ｂ４ＧＡＬＴ１は、ヒト肺がんおよび卵巣がん細胞系などの高度に転移性の多様な細胞系で上方制御されることが示され、浸潤性表現型結腸直腸がんの有益な候補生物マーカーとされている（Ｐｏｅｔａ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。
ＣＰは、血漿中のほとんどの銅に結合する金属タンパク質をコードして、Ｆｅ（ＩＩ）トランスフェリンのＦｅ（ＩＩＩ）トランスフェリンへの過酸化に関与する（ＲｅｆＳｅｑ）。
ＣＳＴ３は、複数のシスタチン様配列を含有するタンパク質を包含する、シスタチンスーパーファミリーのメンバーをコードする（ＲｅｆＳｅｑ）。
ＣＴＳＨは、リソソーム内タンパク質の全体的な分解に重要である、リソソーム内システインプロテイナーゼをコードする（ＲｅｆＳｅｑ）。ＣＴＳＨ発現は、乳がん、メラノーマ、神経膠腫、結腸直腸がん、および前立腺がんをはじめとする、病的状態において増大する。タリンのＣＴＳＨ媒介プロセッシングは、インテグリン活性化および癒着強度に影響を及ぼすことで、がん細胞進行を促進すると考えられる（Ｊｅｖｎｉｋａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。
ＤＮＡＪＣ５はＪタンパク質ファミリーのメンバーをコードする。Ｊタンパク質は、７０ｋＤａ熱ショックタンパク質のＡＴＰアーゼ活性を調節することで、多くの細胞過程で機能する（ＲｅｆＳｅｑ）。
ＦＡＩＭ３は、ＩｇＭのＦｃ受容体をコードするＴＯＳＯとしてもまた知られている（ＲｅｆＳｅｑ）。ＦＡＩＭ３は、慢性リンパ球性白血病で過剰発現されて抗アポトーシス特性に関連すると特定され、それはＢ細胞受容体活性化によって調節される。これらの研究は、ＦＡＩＭ３が、高リスク慢性リンパ球性白血病の予後マーカーとして使用され得ることを示す（Ｐａｌｌａｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｙｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。
ＦＣＥＲ２は、Ｂ細胞特異的抗原およびＩｇＥの低親和性受容体をコードする。それはＢ細胞増殖および分化、そしてＩｇＥ産生の調節に不可欠な役割を有する（ＲｅｆＳｅｑ）。
ＦＭＯＤは、小型間質性プロテオグリカンファミリーのメンバーをコードする。コードされるタンパク質は、ジスルフィド結合を含有するドメインで挟まれる、４本のケラタン硫酸鎖があるロイシン富化反復を含有する、中央領域を有する（ＲｅｆＳｅｑ）。ＦＭＯＤは、慢性リンパ球性白血病細胞内で、高度に過剰発現することが示された。したがって、ＦＭＯＤは、慢性リンパ球性白血病における可能な腫瘍関連抗原の役割を果たすかもしれない（Ｍａｙｒ ｅｔ ａｌ．，２００５）。
ＧＡＬＮＴ１は、ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−α−Ｄ−ガラクトサミン：ポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（ＧａｌＮＡｃ−Ｔ）酵素ファミリーのメンバーをコードする（ＲｅｆＳｅｑ）。研究は、ＧＡＬＮＴ１発現が、ヒト乳がん、卵巣がん、および膀胱がんにおいて、増殖および再発の程度と相関することを明らかにした。後者は、ヒト膀胱がんにおける臨床予後マーカーとしてのＧＡＬＮＴ１の使用を示唆する（Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。
ＧＬＴ８Ｄ１は、グリコシルトランスフェラーゼファミリーのメンバーをコードする（ＲｅｆＳｅｑ）。研究は、脳、肝臓、乳房、肺、胃、膵臓、結腸、腎臓、膀胱、前立腺、および精巣などの大多数のヒトがんで、ＧＬＴ８Ｄ１が遍在性に上方制御されることを明らかにした。ＧＬＴ８Ｄ１誘発示差的メチル化遺伝子は、早期がんスクリーニング、診断、予後、および治療介入のためのエピジェネティックな生物マーカーとしての強い可能性を有する（Ｔｅｈ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。
ＧＰＩは、グルコースリン酸イソメラーゼタンパク質ファミリーのメンバーをコードする（ＲｅｆＳｅｑ）。ＧＰＩ遺伝子は、ヒト膵臓がんにおいて、低酸素誘導性であることが特定されている。エリスロース−４−リン酸などのＧＰＩ阻害剤の使用は、いくつかの乳がん細胞系の二次元培養物中で遊走性および侵入性能力を減少させ、ＧＰＩ阻害が、腫瘍転移を阻止する選択的ストラテジーになり得ることが示唆される（Ｙｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｇａｌｌａｒｄｏ−Ｐｅｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。
ＧＰＸ１は、グルタチオンペルオキシダーゼファミリーのメンバーをコードする（ＲｅｆＳｅｑ）。ＧＰＸ１ ｒｓ１０５０４５０ Ｃ＞Ｔ多形性は、膀胱がんのリスク増大と関連したが、前立腺がんとは関連しなかった。患者の乳がん細胞内のＧＰＸ１の高度発現は、化学療法を受けた患者のより芳しくない臨床転帰および全生存期間低下と相関し、ＧＰＸ１が、これらの患者のための予後マーカーとして使用され得ることが暗示された（Ｊａｒｄｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｍｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。
ＴＦＲＣは、トランスフェリン受容体をコードし、それは染色体３ｑ２９に位置する（ＲｅｆＳｅｑ）。口腔扁平上皮がんにおけるＴＦＲＣの発現率は、異形成におけるよりも有意に高く、口腔扁平上皮がんの疾患進行が、ＴＦＲＣ発現に関連するかもしれないことが示唆された。抗ＴＦＲＣ抗体は、トランスフェリンとＴＦＲＣの間の相互作用をブロックし、その結果、鉄の取り込みをブロックした。結果として生じた鉄欠乏は、細胞増殖を阻害してアポトーシスを誘導した（Ｎａｇａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。
ＵＧＣＧは、脂質および糖部分を含有する膜構成要素である、スフィンゴ糖脂質の生合成における第１のグリコシル化ステップを触媒する酵素をコードする（ＲｅｆＳｅｑ）。研究は、白血病、乳がん、腎細胞がん、および乳頭甲状腺がんにおいて、ＵＧＣＧが過剰発現されることを示した。ＵＧＣＧは、ｃＳｒｃおよびβカテニンシグナル伝達の活性化を通じてＭＤＲ１発現を上方制御する（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。
本発明は、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩの分子に結合する能力を有する、本発明によるペプチドにさらに関する。
本発明は、本発明によるペプチドにさらに関し、前記ペプチドは（それぞれ）、配列番号１〜配列番号２２５、配列番号２２６〜配列番号５４２または配列番号５４３〜配列番号１０１６に記載のアミノ酸配列からなり、またはそれから本質的になる。
示されるようなアミノ酸配列から本質的になるペプチドは、非修飾ペプチドと比較して、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩ分子に結合する能力が実質的に変化したり悪影響を受けたりすることなく交換される、１つまたは２つの非アンカーアミノ酸を有し得る（アンカーモチーフについては下記を参照されたい）。アミノ酸配列から本質的になる別のペプチド中では、１つまたは２つのアミノ酸が、非修飾ペプチドと比較して、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩ分子に結合する能力が実質的に変化したり悪影響を受けたりすることなく、それらの保存的交換パートナーと交換される（以下もまた参照されたい）。
本発明は、本発明によるペプチドにさらに関し、前記ペプチドは、修飾されおよび／または非ペプチド結合を含む。
本発明は、本発明によるペプチドにさらに関し、前記ペプチドは、特にＨＬＡ−ＤＲ抗原関連不変鎖（Ｉｉ）のＮ末端アミノ酸に融合した、または例えば樹状細胞に対して特異的な抗体などの抗体に（またはその配列中に）融合した、融合タンパク質の一部である。
本発明は、本発明によるペプチドをエンコードする核酸にさらに関する。
本発明は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの組み合わせである、本発明による核酸にさらに関する。
本発明は、本発明による核酸を発現および／または提示する能力がある、発現ベクターにさらに関する。
本発明は、医薬品で使用される、配列番号１〜配列番号２２５、配列番号２２６〜配列番号５４２または配列番号５４３〜配列番号１０１６に記載の本発明によるペプチド、本発明による核酸または本発明による発現ベクターにさらに関する。
本発明は、配列番号１〜配列番号２２５、配列番号２２６〜配列番号５４２または配列番号５４３〜配列番号１０１６に記載のペプチドに対して特異的な本発明による抗体、およびそれらを製造する方法にさらに関する。
本発明は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、特に、配列番号１〜配列番号２２５、配列番号２２６〜配列番号５４２または配列番号５４３〜配列番号１０１６に記載のペプチドおよび／または本発明による前記ペプチドとＭＨＣとの複合体を標的化する可溶性ＴＣＲ（ｓＴＣＲ）、およびそれらを製造する方法にさらに関する。
本発明は、前述のような本発明による核酸または発現ベクターを含んでなる宿主細胞にさらに関する。
本発明は、抗原提示細胞である、本発明による宿主細胞にさらに関する。
本発明は、抗原提示細胞が樹状細胞である、本発明による宿主細胞にさらに関する。
本発明は、本発明による宿主細胞を培養するステップと、宿主細胞またはその培養液からペプチドを単離するステップとを含んでなる、本発明によるペプチドを製造する方法にさらに関する。
本発明は、ＣＴＬを、適切な抗原提示細胞の表面に発現される抗原負荷ヒトクラスＩまたはＩＩ ＭＨＣ分子に、前記ＣＴＬを抗原特異的様式で活性化するのに十分な時間にわたり、生体外で接触させるステップを含んでなる、活性化細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を製造するインビトロ法にさらに関し、前記抗原は本発明による任意のペプチドである。
本発明は、十分な量の抗原を抗原提示細胞に接触させることで、適切な抗原提示細胞の表面に発現されるクラスＩまたはＩＩＭＨＣ分子上に、抗原が負荷される、本発明による方法にさらに関する。
本発明は、抗原提示細胞が、配列番号１〜配列番号２２５、配列番号５２７〜配列番号５５１または配列番号５５２〜配列番号１０１６を含有する前記ペプチドを発現する能力がある、発現ベクター、または前記変異アミノ酸配列を含んでなる、本発明による方法にさらに関する。
本発明は、本発明による方法によって製造される活性化細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）にさらに関し、それは、本発明によるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する細胞を選択的に認識する。
本発明は、本発明による細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の有効数を患者に投与するステップを含んでなる、患者において、本発明による任意のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する標的細胞を死滅させる方法にさらに関する。
本発明は、記載される任意のペプチド、本発明による核酸、本発明による発現ベクター、本発明による細胞、または本発明による活性化細胞傷害性Ｔリンパ球の、薬剤としての、または薬剤の製造における、使用にさらに関する。
本発明は、前記薬剤がワクチンである、本発明による使用にさらに関する。
本発明は、薬剤が、がんに対して有効である、本発明による使用にさらに関する。
本発明は、前記がん細胞が、ＣＬＬまたはＡＭＬ細胞などの血液悪性腫瘍細胞である、本発明による使用にさらに関する。
本発明は、血液学的悪性腫瘍、特に慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）細胞の診断および／または予後診断で使用され得る、本発明によるペプチドベースの特定の標識タンパク質および生物マーカーにさらに関する。
さらに、本発明は、がん治療のためのこれらの新規標的の使用に関する。
さらに、本発明は、予備選別された腫瘍関連ペプチドのデータベース（「貯蔵庫」）を使用して、個々の患者のための個別化抗がんワクチンを製造する方法に関する。
免疫応答の刺激は、宿主免疫系によって外来性として認識された抗原の存在に依存する。腫瘍関連抗原の存在の発見は、宿主の免疫系を利用して腫瘍成長に介入する可能性を高めた。免疫系の体液性および細胞性アームの双方を活用する様々な機構が、がん免疫療法のために目下探求されている。
細胞性免疫応答の特定の要素は、腫瘍細胞を特異的に認識して破壊する能力がある。腫瘍浸潤性細胞集団からの、または末梢血からの細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の単離は、がんに対する自然免疫防御において、このような細胞が重要な役割を果たすことを示唆する。特に、細胞質ゾル内に位置するタンパク質または欠陥リボソーム産物（ＤＲＩＰＳ）に由来する通常は８〜１０のアミノ酸残基の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）を保有するペプチドのクラスＩ分子を認識する、ＣＤ８陽性Ｔ細胞が、この応答において重要な役割を果たす。ヒトのＭＨＣ分子はまた、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）とも称される。
ＭＨＣ分子には、２つのクラスがある：核を有するほとんどの細胞に見られる、ＭＨＣクラスＩ分子。ＭＨＣ分子は、それぞれ、重鎖と、β−２−ミクログロブリン（ＭＨＣクラスＩ受容体）またはαおよびβ鎖（ＭＨＣクラスＩＩ受容体）とから、構成される。それらの三次元立体構造は結合溝をもたらし、それはペプチドとの非共有結合相互作用のために使用される。ＭＨＣクラスＩは、大部分が内在性タンパク質である、ＤＲＩＰおよびより大型のペプチドのタンパク質分解的切断から得られる、ペプチドを提示する。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、大部分はプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）に見られ、エンドサイトーシス過程でＡＰＣに取り込まれて引き続きプロセシングされる、外来性または膜貫通タンパク質のペプチドを主に提示する。ペプチドおよびＭＨＣクラスＩ分子複合体が、適切なＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）を有するＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔリンパ球によって認識される一方で、ペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子の複合体は、適切なＴＣＲを有するＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞によって認識される。その結果、ＴＣＲ、ペプチド、およびＭＨＣは、化学量論的に１：１：１の量で存在することが良く知られている。
ＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞は、ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞による、効果的な応答の誘導と維持において重要な役割を果たす。腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に由来するＣＤ４陽性Ｔ細胞エピトープの同定は、抗腫瘍免疫応答を始動させるための医薬品開発に非常に重要である（Ｇｎｊａｔｉｃ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ＣＤ４＋ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ＮＹ−ＥＳＯ−１ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ：ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００３ Ｊｕｌ ２２；１００（１５）：８８６２−７）。腫瘍部位では、Ｔヘルパー細胞は、ＣＴＬ親和性サイトカイン環境を支持してＭｏｒｔａｒａ Ｌ，ｅｔ ａｌ．ＣＩＩＴＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｒｙ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｌｅａｄｓ ｔｏ ａ Ｔｈ１ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，ｔｕｍｏｒ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｍｅｍｏｒｙ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００６ Ｊｕｎ １；１２（１１ Ｐｔ １）：３４３５−４３）、例えばＣＴＬ、ＮＫ細胞、マクロファージ、顆粒球などのエフェクター細胞を誘引する（Ｈｗａｎｇ ＭＬ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｇｎａｔｅ ｍｅｍｏｒｙ ＣＤ４＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ｐｒｉｍｉｎｇ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｔｈｅ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ，ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ，ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅ ｔｕｍｏｒ ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７ Ｎｏｖ １；１７９（９）：５８２９−３８）。
炎症不在下では、ＭＨＣクラスＩＩ分子の発現は、免疫系細胞、特に、例えば、単球、単球由来細胞、マクロファージ、樹状細胞などの、プロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）に主に限定される。がん患者では、腫瘍細胞が、ＭＨＣクラスＩＩ分子を発現することが驚くことに発見された（Ｄｅｎｇｊｅｌ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｕｎｅｘｐｅｃｔｅｄ ａｂｕｎｄａｎｃｅ ｏｆ ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００６ Ｊｕｌ １５；１２（１４ Ｐｔ １）：４１６３−７０）。
例えば、マウスなどの哺乳類動物モデルにおいて、ＣＴＬエフェクター細胞（すなわちＣＤ８陽性Ｔリンパ球）の不在下であっても、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）の分泌による血管新生阻害を通じて腫瘍発現を阻害するには、ＣＤ４陽性Ｔ細胞で十分であることが示された。
さらに、ＨＬＡクラスＩＩ分子によって提示される腫瘍関連抗原からのペプチドを認識するＣＤ４陽性Ｔ細胞が、抗体（Ａｂ）応答の誘導を通じて、腫瘍の進行を抑制し得ることが示された。
ＨＬＡクラスＩ分子に結合する腫瘍関連ペプチドとは対照的に、少数の瘍関連抗原（ＴＡＡ）のクラスＩＩリガンドのみが、これまでに記載されている。
ＨＬＡクラスＩＩ分子の構成的発現は、通常、免疫系細胞に限定されるので、原発性腫瘍からクラスＩＩペプチドを直接単離する可能性が、可能であるとは考えられなかった。しかしＤｅｎｇｊｅｌ ｅｔ ａｌ．は、腫瘍からいくつかのＭＨＣクラスＩＩエピトープを直接、同定することに成功した（国際公開第２００７／０２８５７４号パンフレット、ＥＰ１７６００８８Ｂ１；（Ｄｅｎｇｊｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００６）。
腫瘍特異的細胞傷害性Ｔリンパ球によって認識される抗原、すなわちそれらのエピトープは、酵素、受容体、転写因子などの全てのタンパク質クラスに由来する分子であり得て、それはそれぞれの腫瘍細胞で発現されて、同一起源の非改変細胞と比較して、上方制御される。
ＣＤ８およびＣＤ４依存性の双方のタイプの応答は、抗腫瘍効果に共同して相乗的に寄与するので、ＣＤ８＋ＣＴＬ（リガンド：ＭＨＣクラスＩ分子＋ペプチドエピトープ）、またはＣＤ４陽性Ｔヘルパー細胞（リガンド：ＭＨＣクラスＩＩ分子＋ペプチドエピトープ）のどちらかによって認識される、腫瘍関連抗原の同定および特性解析は、腫瘍ワクチンの開発に重要である。
本発明はまた、２つの新しい非常に有用なＭＨＣクラスＩＩペプチド（配列番号５４３〜配列番号１０１６に記載される）にも関する。これらのペプチドは、特に、ペプチドがそれぞれそれに由来する抗原を過剰発現および／または過剰提示する、ＡＭＬなどのＣＬＬおよびその他のがんの診断および／または治療において有用である。
本発明はまた、配列番号５４３〜配列番号１０１６に記載の、本発明のＭＨＣクラスＩＩペプチドのいわゆる鎖長変異型にも関する。
鎖長変異型は、通常Ｎおよび／またはＣ末端が延長され（１〜５個、好ましくは１〜１０個のアミノ酸）、またはＮおよび／またはＣ末端が短縮された（１〜５個のアミノ酸）ペプチドであり、それは依然としてＭＨＣに結合して、本明細書に記載されるような細胞性免疫応答を引き起こし得る。現状技術で公知のように、クラスＩＩタンパク質に対するペプチド結合はサイズに制約がなく、１１〜３０のアミノ酸長で変動し得る。ＭＨＣクラスＩＩ分子中のペプチド結合溝は両端が開いており、相対的により長いペプチドの結合を可能にする。「コア」の９残基長の断片がペプチド認識に最も寄与するが、側面に位置する領域もまた、クラスＩＩ対立遺伝子に対するペプチドの特異性に重要である（例えば、Ｍｅｙｄａｎ Ｃ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ ａｌｌｅｌｅｓ ｂｙ ｔｅｍｐｏｒａｌ ｍｏｔｉｆ ｍｉｎｉｎｇ．ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２０１３；１４ Ｓｕｐｐｌ ２：Ｓ１３）を参照されたい）。当業者は、（例えば、上述されるような）利用できる多数のソフトウェアツールを使用して結合モチーフを同定でき、ひいては鎖長変異型を作成するために、表１ｃに記載のＭＨＣクラスＩＩペプチドの伸長および／または欠失の可能性を同定できるあろう。
ペプチドが細胞性免疫応答を引き起こす（誘発する）ためには、それはＭＨＣ分子と結合しなくてはならない。この過程は、ＭＨＣ分子の対立遺伝子と、ペプチドのアミノ酸配列の特定の多形性とに依存する。ＭＨＣクラスＩ結合ペプチドは、通常は８〜１２アミノ酸残基長であり、通常は、ＭＨＣ分子の対応する結合溝と相互作用するそれらの配列中に、２つの保存残基（「アンカー」）を含有する。このようにして、各ＭＨＣ対立遺伝子は、どのペプチドが結合溝と特異的に結合し得るかを決定する、「結合モチーフ」を有する。
ＭＨＣクラスＩ依存免疫反応では、ペプチドは腫瘍細胞によって発現される特定のＭＨＣクラスＩ分子に結合できるだけでなく、それらはまた、特有のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＴ細胞によって認識されなくてはならない。
腫瘍特異的細胞傷害性Ｔリンパ球によって認識される抗原、すなわちそれらのエピトープは、酵素、受容体、転写因子などの全てのタンパク質クラスに由来する分子であり得て、それはそれぞれの腫瘍細胞で発現されて、同一起源の非改変細胞と比較して、上方制御される。
腫瘍関連抗原の現行の分類は、次の主要群を含んでなる：
ａ）がん精巣抗原：Ｔ細胞によって認識され得る、これまでに同定された最初のＴＡＡは、このクラスに属し、元々はがん精巣（ＣＴ）抗原と称されたが、それは、そのメンバーが組織学的に異なるヒト腫瘍で発現し、正常組織では、精巣の精母細胞／精原細胞のみに存在し、時として胎盤に存在するためであった。精巣の細胞は、クラスＩおよびＩＩ ＨＬＡ分子を発現しないので、これらの抗原は正常組織のＴ細胞によって認識され得ず、したがって免疫学的に腫瘍特異的と見なされる。ＣＴ抗原の周知の例は、ＭＡＧＥファミリーメンバーまたはＮＹ−ＥＳＯ−１である。
ｂ）分化抗原：これらのＴＡＡは、腫瘍と、それから腫瘍が生じる正常組織との間で共有され；ほとんどは、メラノーマおよび正常なメラノサイトに見られる。これらのメラノサイト系関連タンパク質の多くは、メラニン生合成に関与し、したがって腫瘍特異的でないが、それでもなおがん免疫療法のために広く利用されている。例としては、メラノーマに対するチロシナーゼおよびＭｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、または前立腺がんに対するＰＳＡが挙げられるが、これに限定されるものではない。
ｃ）過剰発現されるＴＡＡ：広範に発現されるＴＡＡをエンコードする遺伝子は、組織学的に異なるタイプの腫瘍で、ならびに多数の正常組織で、概してより低い発現レベルで検出されている。正常組織によってプロセシングされ潜在的に提示されるエピトープの多くは、Ｔ細胞認識閾値レベルに満たない可能性がある一方で、腫瘍細胞におけるそれらの過剰発現は、先に確立された免疫寛容を破壊することで抗がん応答を引き起こし得る。このクラスのＴＡＡの顕著な例は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、サバイビン、テロメラーゼまたはＷＴ１である。
ｄ）腫瘍特異的抗原：これらのユニークなＴＡＡは、正常な遺伝子（β−カテニン、ＣＤＫ４など）の変異から生じる。これらの分子変化のいくつかは、腫瘍性形質転換および／または進行に関連する。腫瘍特異的抗原は、通常、正常組織に対する自己免疫反応のリスクなしに、強力な免疫応答を誘導できる。他方、これらのＴＡＡは、ほとんどの場合、その上でそれらが同定されたまさにその腫瘍のみと関係があり、通常は、多くの個々の腫瘍間で共有されない。
ｅ）異常な翻訳後修飾から生じるＴＡＡ：このようなＴＡＡは、腫瘍中で特異的でなく過剰発現もされないタンパク質から生じてもよいが、それでもなお、主に腫瘍中で活性の翻訳後プロセスによって、腫瘍関連抗原になる。このクラスの例は、ＭＵＣ１のような腫瘍において新規エピトープをもたらす改変グリコシル化パターンから、または腫瘍特異的であってもなくてもよい分解中のタンパク質スプライシング事象から生じる。
ｆ）腫瘍ウイルスタンパク質：これらのＴＡＡは、発がん過程で重要な役割を果たしてもよいウイルスタンパク質であり、それらは外来性である（ヒト由来でない）ため、Ｔ細胞応答を誘起し得る。このようなタンパク質の例は、子宮頸がんで発現される、ヒト乳頭腫１６型ウイルスタンパク質Ｅ６およびＥ７である。
タンパク質が、細胞傷害性Ｔリンパ球によって腫瘍特異的または腫瘍関連抗原として認識され、治療で利用されるためには、特定の必要条件が満たされなくてはならない。抗原は、主に腫瘍細胞によって発現されるべきであり、健常組織によって発現されずまたは比較的少量発現され、または別の好ましい実施形態では、ペプチドは、腫瘍細胞によって、健常組織と比較して過剰提示されるべきである。それぞれの抗原は、ある種の腫瘍に存在するだけでなく、高密度（すなわち、細胞あたりの各ペプチドのコピー数）で存在することも、さらに望ましい。腫瘍特異的および腫瘍関連抗原は、例えば、細胞周期制御またはアポトーシス抑制における機能のために、正常細胞から腫瘍細胞への形質転換に直接関与するタンパク質に、由来することが多い。さらに、形質転換の直接原因となるタンパク質の下流標的が、上方制御されてもよく、したがって（ｕｎｄ）間接的に腫瘍関連であってもよい。このような間接的腫瘍関連抗原もまた、ワクチン接種アプローチの標的であってもよい。（Ｓｉｎｇｈ−Ｊａｓｕｊａ ｅｔ ａｌ．，２００４）。どちらの場合も、腫瘍関連抗原に由来するこのようなペプチド（「免疫原性ペプチド」）は、生体外または生体内でＴ細胞応答をもたらすべきであるので、抗原のアミノ酸配列中にエピトープが存在することが必須である。
基本的に、ＭＨＣ分子に結合できるあらゆるペプチドが、Ｔ細胞エピトープとして機能してもよい。生体外または生体内Ｔ細胞応答誘導のための必要条件は、対応するＴＣＲがあるＴ細胞の存在、およびこの特定のエピトープに対する免疫寛容の不在である。
したがって、ＴＡＡは、腫瘍ワクチン開発のための出発点である。ＴＡＡを同定し特性決定する方法は、患者または健常者から単離され得るＣＴＬの使用に基づき、またはそれらは、腫瘍および正常組織間の差次的転写プロファイル、または差次的ペプチド発現パターンの作成に基づく。
しかし、腫瘍組織またはヒト腫瘍細胞系で過剰発現され、またはこのような組織または細胞系で選択的に発現される遺伝子の同定は、免疫療法においてこれらの遺伝子から転写される抗原の使用に関する、正確な情報を提供しない。これは、これらの抗原のエピトープの個々の亜集団のみが、このような用途に適するためであり、その理由は、対応するＴＣＲがあるＴ細胞が存在しなくてはならず、この特定のエピトープに対する免疫寛容が不在または最小でなくてはならないからである。したがって本発明の非常に好ましい実施形態では、それに対する機能性および／または増殖性Ｔ細胞がある、過剰にまたは選択的に提示されるペプチドのみを選択することが、重要である。このような機能性Ｔ細胞は、特異的抗原による刺激時にクローン増殖し得てエフェクター機能を果たすことができるＴ細胞（「エフェクターＴ細胞」）と定義される。
本発明によるＴＣＲおよび抗体の場合、基礎となるペプチドの免疫原性は二次的である。本発明によるＴＣＲおよび抗体では、提示が決定的要素である。
Ｔヘルパー細胞は、抗腫瘍免疫において、ＣＴＬのエフェクター機能を統合する上で重要な役割を果たす。ＴＨ１型のＴヘルパー細胞応答を始動するＴヘルパー細胞エピトープは、ＣＤ８陽性キラーＴ細胞のエフェクター機能を支持し、それは、それらの細胞表面に腫瘍関連ペプチド／ＭＨＣ複合体を提示する腫瘍細胞に向けられた、細胞傷害機能を含む。このようにして腫瘍関連Ｔヘルパー細胞ペプチドエピトープは、単独で、またはその他の腫瘍関連ペプチドとの組み合わせで、抗腫瘍免疫応答を刺激するワクチン組成物の活性医薬品成分の役割を果たし得る。
本発明者らは、ＣＬＬ患者において頻繁かつ排他的に検出される、リガンドーム由来腫瘍関連抗原（ＬｉＴＡＡ）の新規カテゴリーを同定した。対応するＨＬＡリガンド（ＬｉＴＡＰ）の特異的免疫認識は、ＣＬＬ患者で排他的に観察され、ＨＬＡ拘束性提示の出現頻度との直接相関を顕著に示す。さらに、３３人のＣＬＬ患者の後向き生存分析は、ＣＬＬ患者におけるＬｉＴＡＰ−特異的免疫応答と、改善された全生存期間との可能な関連性を示した。
さらなるがんに対する用途は、以下の本発明によるペプチドのタンパク質の説明で開示される。
本明細書の用法では、別段の記載がない限り、全ての用語は下述のとおり定義される。
「ペプチド」という用語は、典型的に、隣接するアミノ酸のα−アミノ基とカルボニル基の間のペプチド結合によって互いに連結する、一連のアミノ酸残基を命名するために、本明細書で使用される。ペプチドは、好ましくは９アミノ酸長であるが、８アミノ酸長程度に短く、１０、１１、１２、１３または１４アミノ酸長であり得て、ＭＨＣクラスＩＩペプチドの場合、それらは１５、１６、１７、１８、１９または２０アミノ酸長であり得る。
さらに「ペプチド」という用語は、典型的に、隣接するアミノ酸のα−アミノおよびカルボニル基の間のペプチド結合によって互いに連結する、一連のアミノ酸残基の塩を含むものとする。好ましくは、塩は、例えば、塩化物または酢酸塩（トリフルオロ酢酸塩）などの、ペプチドの薬学的に許容可能な塩である。
「ペプチド」という用語は、「オリゴペプチド」を含むものとする。「オリゴペプチドペプチド」という用語は、典型的に、隣接するアミノ酸のα−アミノ基とカルボニル基の間のペプチド結合によって互いに連結する、一連のアミノ酸残基を命名するために、本明細書で使用される。オリゴペプチドの長さは、その中で正しいエピトープまたはエピトープが保持されれば、本発明には重要でない。オリゴペプチドは、典型的に、長さが約３０アミノ酸残基未満であり、長さが約１５アミノ酸を超える。
「本発明のペプチド」という用語は、上で定義されるような、配列番号１〜配列番号２２５、配列番号５２７〜配列番号５５１または配列番号５５２〜配列番号１０１６に記載のペプチドからなり、またはそれを含んでなるペプチドを含むものとする。
「ポリペプチド」という用語は、典型的に、隣接するアミノ酸のα−アミノおよびカルボニル基の間のペプチド結合によって互いに連結する、一連のアミノ酸残基を指す。正しいエピトープが保持されれば、ポリペプチドの長さは、本発明には重要でない。ペプチドまたはオリゴペプチドという用語とは対照的に、ポリペプチドという用語は、約３０を超えるアミノ酸残基を含有する分子を指すことが意図される。
このような分子をコードする、ペプチド、オリゴペプチド、タンパク質またはポリヌクレオチドは、免疫応答を誘導する能力があれば「免疫原性」である（したがって本発明内における「免疫原」である）。本発明では、免疫原性は、より具体的には、Ｔ細胞応答を誘導する能力と定義される。したがって「免疫原」は、免疫応答を誘導する能力がある分子であり、本発明では、Ｔ細胞応答を誘導する能力がある分子である。別の態様では、免疫原は、それに対する特異的抗体またはＴＣＲを生じさせるのに使用される、ペプチド、ペプチドとＭＨＣの複合体、オリゴペプチド、および／またはタンパク質であり得る。
クラスＩ Ｔ細胞「エピトープ」は、クラスＩ ＭＨＣ受容体に結合する短いペプチドを要して、三成分複合体（ＭＨＣクラスＩα鎖、β−２−ミクログロブリン、およびペプチド）を形成し、それは、適切な親和性でＭＨＣ／ペプチド複合体に結合する適合Ｔ細胞受容体を保有するＴ細胞によって、認識され得る。ＭＨＣクラスＩ分子へのペプチド結合は、典型的に８〜１４アミノ酸長であり、最も典型的には９アミノ酸長である。
ヒトには、ＭＨＣクラスＩ分子（ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）ともまた称されるヒトのＭＨＣ分子）をコードする、３つの異なる遺伝子座、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃがある。ＨＬＡ−Ａ*０１、ＨＬＡ−Ａ*０２、およびＨＬＡ−Ｂ*０７は、これらの遺伝子座から発現され得る、異なるＭＨＣクラスＩ対立遺伝子の例である。
表７：ＨＬＡ*Ａ０２の発現頻度Ｆおよび最も頻度の高いＨＬＡ−ＤＲ血清型。頻度は、ハーディ・ワインベルグ式、Ｆ＝１−（１−Ｇｆ）２を用いて、Ｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｒｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．ＨＬＡ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｈａｐｌｏｔｙｐｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ：ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍａｒｒｏｗ Ｄｏｎｏｒ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｄｏｎｏｒ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．１９９７ Ｏｃｔ １５；６４（７）：１０１７−２７）から適応された米国人母集団におけるハプロタイプ頻度Ｇｆから推定される。連鎖不均衡のために、Ａ*０２と特定のＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子との組み合わせは、それらの単一頻度から予測されるよりも、豊富でありまたは低頻度であるかもしれない。詳細については、Ｃｈａｎｏｃｋ ｅｔ ａｌ．（Ｓ．Ｊ．Ｃｈａｎｏｃｋ，ｅｔ ａｌ（２００４）ＨＬＡ−Ａ，−Ｂ，−Ｃｗ，−ＤＱＡ１ ａｎｄ ＤＲＢ１ ｉｎ ａｎ Ａｆｒｉｃａｎ Ａｍｅｒｉｃａｎ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＵＳＡ Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６５：１２２３−１２３５）を参照されたい。
したがって治療および診断目的では、いくつかの異なるＨＬＡクラスＩＩ受容体と適切な親和性で結合するペプチドが、非常に望ましい。いくつかの異なるＨＬＡクラスＩＩ分子に結合するペプチドは、乱交雑バインダーと称される。
本明細書の用法では、ＤＮＡ配列への言及は、一本鎖および二本鎖ＤＮＡの双方を含む。したがって、特異的配列は、文脈上明らかに別の意味が示唆されない限り、このような配列の一本鎖ＤＮＡ、このような配列とその補体との二本鎖（二本鎖ＤＮＡ）、およびこのような配列の補体を指す。「コード領域」という用語は、その天然ゲノム環境内で、遺伝子の発現産物を天然にまたは正常にコードする遺伝子の部分、すなわち、遺伝子の天然発現産物を生体内でコードする領域を指す。
コード領域は、非変異型（「正常」）、変異型または改変遺伝子に由来し得て、またはＤＮＡ合成技術の当業者に周知の方法を使用して実験室で完全に合成された、ＤＮＡ配列または遺伝子に由来しさえする。
「ヌクレオチド配列」という用語は、デオキシリボヌクレオチドのヘテロ重合体を指す。
特定のペプチド、オリゴペプチド、またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、天然起源であってもよく、またはそれらは合成的に構築されてもよい。一般に、本発明のペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質をエンコードするＤＮＡ断片は、ｃＤＮＡフラグメントと短いオリゴヌクレオチドリンカーから構築され、またはひと続きのオリゴヌクレオチドから構築されて、微生物またはウイルスオペロンに由来する調節因子を含んでなる、組換え転写単位で発現できる合成遺伝子を提供する。
本明細書の用法では、「ペプチドをコードする（またはエンコードする）ヌクレオチド」という用語は、それによって配列が発現される生体系と適合性の人工（人造）開始および停止コドンを含むペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を指す。
「発現産物」という用語は、遺伝子の、そして遺伝コード縮重に由来してしたがって同一アミノ酸をコードする核酸配列をコードする任意の同等物の、天然翻訳産物である、ポリペプチドまたはタンパク質を意味する。
コード配列に言及する場合、「フラグメント」という用語は、その発現産物が、完全コード領域の発現産物と本質的に同一の生物学的機能または活性を保つ、完全未満のコード領域を含んでなるＤＮＡの部分を意味する。
「ＤＮＡ断片」という用語は、別々のフラグメントの形態の、またはより大型のＤＮＡコンストラクトの構成要素としての、ＤＮＡポリマーを指し、それは、実質的に純粋な、すなわち、混入内在性物質を含まない形態で、例えばクローニングベクターを使用する標準生化学的方法によって、断片およびその構成ヌクレオチド配列を同定、操作、および回収できるようにする量または濃度で、少なくとも１回単離されたＤＮＡに由来する。このような断片は、読み取り枠の形態で提供され、それは、典型的に真核生物遺伝子内に存在する内部非翻訳配列またはイントロンによって、中断されていない。非翻訳ＤＮＡ配列は、読み取り枠下流に存在してもよく、それはそこでコード領域の操作または発現を妨げない。
「プライマー」という用語は、短い核酸配列を意味し、それはＤＮＡの１本鎖と対合し得て、ＤＮＡポリメラーゼがそこでデオキシリボヌクレオチド鎖合成を開始する、遊離３’−ＯＨ末端を提供する。
「プロモーター」という用語は、転写を開始するためのＲＮＡポリメラーゼ結合に関与する、ＤＮＡの領域を意味する。
「単離」という用語は、物質が、その元の環境（例えばそれが天然起源であれば、天然環境）から取り出されることを意味する。例えば、生きている動物に存在する天然ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、天然システムで共存する物質の一部または全部から分離された同一ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されている。このようなポリヌクレオチドは、ベクターの一部であり得ておよび／またはこのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、組成物の一部であり得て、このようなベクターまたは組成物がその天然環境の一部でないと言う意味で、なおも単離されている。
本発明によって開示されるポリヌクレオチド、および組換えまたは免疫原性ポリペプチドは、「精製」形態であってもよい。「精製」という用語は、完全に純粋である必要はなく；むしろ、それは相対的定義であることが意図されて、これらの用語が当業者によって理解されるように、高度に精製された調製物、または部分的にのみ精製された調製物を含み得る。例えば、ｃＤＮＡライブラリーから単離された個々のクローンは、電気泳動的に均一に、従来法で精製されている。少なくとも１桁、好ましくは２または３桁、より好ましくは４または５桁への、出発原料または天然物質の精製が、明示的に検討される。さらに、重量基準で、好ましくは９９．９９９％、または少なくとも９９．９９％または９９．９％；さらに望ましくは９９％以上の純度を有する、特許請求されるポリペプチドが、明示的に検討される。
本発明によって開示される核酸およびポリペプチド発現産物、ならびにこのような核酸および／またはこのようなポリペプチドを含有する発現ベクターは、「富化形態」であってもよい。本明細書の用法では、「富化」という用語は、（例えば）その天然濃度の少なくとも約２、５、１０、１００、または１０００倍の物質濃度を意味し、有利には重量基準で０．０１％、好ましくは重量基準で少なくとも約０．１％である。重量基準で約０．５％、１％、５％、１０％、および２０％の富化調製物もまた、検討される。本発明を構成する、配列、コンストラクト、ベクター、クローン、およびその他の物質は、有利には、富化または単離形態であり得る。
「活性フラグメント」という用語は、単独で、または任意選択的に適切なアジュバントと共に、例えば、ウサギまたはマウスなどのそしてまたヒトを含む哺乳類などの動物に投与されると、免疫応答を生じるフラグメント（すなわち免疫原性を有する）を意味し、このような免疫応答は、ヒトなどのレシピエント動物におけるＴ細胞応答を刺激する形態を取る。代案としては、「活性フラグメント」はまた、生体外Ｔ細胞応答を誘導するのに使用されてもよい。
本明細書の用法では、ポリペプチドとの関連で使用される場合、「部分」、「断片」、および「フラグメント」という用語は、アミノ酸残基などの連続する残基の配列を指し、その配列は、より大型の配列の部分集合を形成する。例えば、ポリペプチドが、トリプシンまたはキモトリプシンなどの一般的エンドペプチダーゼのいずれかによって処理されるのであれば、このような処理から得られるオリゴペプチドは、出発ポリペプチドの部分、断片またはフラグメントに相当するであろう。ポリヌクレオチドに関して使用される場合、これらの用語は、エンドヌクレアーゼのいずれかによる前記ポリヌクレオチドの処理によって生じる生成物を指す。
本発明によると、配列に言及する場合、「同一性百分率」または「パーセント同一」という用語は、比較される配列（「比較配列」）と、記載または特許請求される配列（「参照配列」）とのアライメント後に、配列が、特許請求または記載される配列と比較されることを意味する。次に同一性百分率は、次式に従って判定される：
同一性百分率＝１００［１−（Ｃ／Ｒ）］
式中、Ｃは、参照配列と比較される配列との間のアライメント長にわたる、参照配列と比較配列の間の差異の数であり、
（ｉ）比較配列中に対応する整列塩基またはアミノ酸を有しない、参照配列中の各塩基またはアミノ酸、および
（ｉｉ）参照配列中の各ギャップ、および
（ｉｉｉ）比較配列中の整列塩基またはアミノ酸と異なる、参照配列中の各整列塩基またはアミノ酸が、差異を構成して、
（ｉｉｉｉ）アライメントは、整合配列の１位から開始しなくてはならず；
Ｒは、比較配列とのアライメント長にわたる参照配列中の塩基またはアミノ酸の数であり、参照配列中に生じるあらゆるギャップも塩基またはアミノ酸として数えられる。
比較配列とそれに対して同一性百分率が上のように計算される参照配列との間に、特定の最小同一性百分率とほぼ同一のまたはそれ以上のアライメントが存在すれば、その中に上記のように計算された同一性百分率が特定の同一性百分率未満であるアライメントが存在したとしても、比較配列は、参照配列との特定の最小同一性百分率を有する。
本明細書で開示される元の（未修飾）ペプチドは、特に明記されない場合は、ペプチド鎖内の異なる、おそらくは選択的な部位における、１つまたは複数の残基の置換によって修飾され得る。好ましくはこれらの置換は、アミノ酸鎖の末端に位置する。このような置換は、保存的性質であってもよく、例えば、疎水性アミノ酸が別の疎水性アミノ酸によって置換されるなど、構造および特徴の類似したアミノ酸によってアミノ酸が置換される。さらにより保存的な置換は、ロイシンのイソロイシンによる置換などの、同一または類似サイズおよび化学的性質のアミノ酸の置換である。天然起源相同タンパク質ファミリーの配列多様性の研究では、特定のアミノ酸置換は、他よりも耐容されることが多く、これらは、元のアミノ酸とその置換物の間のサイズ、電荷、極性、および疎水性の類似性との相関を示すことが多く、これが「保存的置換」の定義の基礎である。
保存的置換は、本明細書では、以下の５つのグループの１つの中の交換として定義される：グループ１−小型脂肪族、非極性またはわずかに極性の残基（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ）；グループ２−極性の負に帯電した残基およびそれらのアミド（Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ）；グループ３−極性の正に帯電した残基（Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）；グループ４−大型脂肪族非極性残基（Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ）；およびグループ５−大型芳香族残基（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）。
より保存的でない置換は、アラニンのイソロイシン残基による置換などの、類似した特徴を有するがサイズがいくらか異なる別のアミノ酸による置換を伴うかもしれない。高度に非保存的な置換は、酸性アミノ酸による極性アミノ酸の置換、または塩基性でさえあるアミノ酸の置換を伴うかもしれない。しかし化学効果は完全に予測可能でなく、遊離基置換は単純な化学的原理からは予測できない偶然の効果をもたらす可能性があるので、このような「過激な」置換でも、潜在的に無効であるとして却下し得ない。
もちろんこのような置換には、通常のＬ−アミノ酸以外の構造体が関与してもよい。したがってＤ−アミノ酸が、本発明の抗原性ペプチドに通常見られるＬ−アミノ酸を置換するかもしれず、依然として本明細書の開示に包含される。さらに非標準Ｒ基（すなわち、天然タンパク質の通常の２０個のアミノ酸に見られる以外のＲ基）を保持するアミノ酸もまた置換目的で使用されて、本発明による免疫原および免疫原性ポリペプチドが製造されてもよい。
２つ以上の位置における置換が、以下に定義されるように実質的に同等またはそれ以上の抗原活性のあるペプチドをもたらすことが発見された場合、これらの置換の組み合わせを試験して、置換の組み合わせが、ペプチドの抗原性に相加または相乗効果をもたらすかどうかが判定される。最大で、ペプチド内の４つ以下の位置が同時に置換される。
本発明のペプチドは、最大４個のアミノ酸によって伸長させ得て、すなわち４：０〜０：４の間のあらゆる組み合わせで、どちらかの末端に１、２、３または４個のアミノ酸が付加され得る。
本発明による伸長の組み合わせは、表８から示され得る。
伸長のためのアミノ酸は、元のタンパク質配列のペプチドまたは任意のその他のアミノ酸であり得る。伸長を利用して、ペプチドの安定性または溶解度を高め得る。
「Ｔ細胞応答」という用語は、生体外または生体内でペプチドによって誘導される、エフェクター機能の特異的増殖および活性化を意味する。ＭＨＣクラスＩ拘束性ＣＴＬでは、エフェクター機能は、ペプチドパルス、ペプチド前駆体パルスまたは天然ペプチド提示標的細胞の溶解；好ましくはペプチドによって誘導されるインターフェロン−γ、ＴＮＦ−α、またはＩＬ−２であるサイトカインの分泌；好ましくはペプチドによって誘導されるグランザイムまたはパーフォリンであるエフェクター分子の分泌；または脱顆粒であってもよい。
好ましくは、本発明によるペプチドに特異的なＣＴＬを置換ペプチドについて試験する場合、置換ペプチドが背景に対して最大溶解増大の半分を達成するペプチド濃度は、約１ｍＭ以下、好ましくは約１μＭ以下、より好ましくは約１ｎＭ以下、さらにより好ましくは約１００ｐＭ以下、最も好ましくは約１０ｐＭ以下である。置換ペプチドが、２人以上、少なくとも２人、より好ましくは３人の個人からのＣＴＬによって認識されることもまた好ましい。
したがって本発明のエピトープは、天然起源腫瘍関連または腫瘍特異的エピトープと同一であってもよく、またはそれらが実質的に同一の抗原活性を有しさえすれば、４つ以下の残基が参照ペプチドと異なるエピトープを含んでもよい。
免疫応答の刺激は、宿主免疫系によって外来性として認識された抗原の存在に依存する。腫瘍関連抗原の存在の発見は、今や、宿主の免疫系を利用して、腫瘍成長に介入する可能性を高めた。免疫系の体液性および細胞性アームの双方を活用する様々な機構が、がん免疫療法のために目下探索されている。
細胞性免疫応答の特定の要素は、腫瘍細胞を特異的に認識して破壊する能力がある。腫瘍浸潤性細胞集団からの、または末梢血からの細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の単離は、がんに対する自然免疫防御において、このような細胞が重要な役割を果たすことを示唆する。特に、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）を保有して、細胞質ゾル内に位置するタンパク質または欠陥リボソーム産物（ＤＲＩＰＳ）に由来する、通常は８〜１２残基のペプチドのクラスＩ分子を認識するＣＤ８陽性Ｔ細胞が、この応答において重要な役割を果たす。ヒトのＭＨＣ分子はまた、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）とも称される。
ＭＨＣクラスＩ分子は、主に内在性の細胞質または核タンパク質、ＤＲＩＰＳ、およびより大型のペプチドのタンパク質分解的切断から得られる、ペプチドを提示する、核を有する大多数の細胞上に見られる。しかし、エンドソーム区画または外来性起源に由来するペプチドもまた、ＭＨＣクラスＩ分子上に頻繁に見られる。この非古典的様式のクラスＩ提示は、文献中で交差提示と称される。
ＣＤ８およびＣＤ４依存性のどちらのタイプの応答も、共同して相乗的に抗腫瘍効果に寄与するので、ＣＤ８陽性ＣＴＬ（ＭＨＣクラスＩ分子）またはＣＤ４陽性ＣＴＬ（ＭＨＣクラスＩＩ分子）のどちらかによって認識される腫瘍関連抗原の同定および特性解析は、腫瘍ワクチンの開発において重要である。したがってどちらかのクラスのＭＨＣ複合体へのペプチド結合を含有するペプチド組成物を提供することが、本発明の目的である。
がん治療に関連する重篤な副作用および費用を考慮すると、より良い予後診断法および診断法がぜひとも必要である。したがってがん全般、特にＣＬＬのための生物マーカーに相当するその他の要素を同定する必要性がある。さらにがん全般、特にＣＬＬの治療法で使用され得る要素を同定する必要性がある。
本発明は、本発明のペプチドを過剰にまたは排他的に提示する、好ましくはＣＬＬである、がん／腫瘍を治療するのに有用なペプチドを提供する。これらのペプチドは、原発性ヒトＣＬＬサンプル上で、ＨＬＡ分子によって天然に提示されることが、質量分析法によって示された。
ペプチドがそれに由来する起源遺伝子／タンパク質（「完全長タンパク質」または「基礎タンパク質」とも称される）は、正常組織と比較して、病的（例えばがん性）組織で高度に過剰発現されることが示された。本発明との関連で「正常組織」は、起源遺伝子の高度な腫瘍関連性を実証する、特に健常ドナーに由来する血液サンプル、そして血液細胞亜集団、特に白血球細胞を意味するものとする（実施例２、および図２を参照されたい）。さらに、ペプチドそれ自体は、腫瘍組織上で強く過剰提示されるが、正常組織ではそうでなく、本発明に関して「腫瘍組織」は、ＣＬＬに罹患している患者に由来する血液サンプル、および血液細胞亜集団、特に白血球細胞を意味するものとする（実施例３および図３を参照されたい）。
ＨＬＡ結合ペプチドは、免疫系、具体的にはＴリンパ球／Ｔ細胞によって、認識され得る。Ｔ細胞は、例えば、それらの基礎タンパク質に由来する、本発明のペプチドを提示する細胞などの認識されたＨＬＡ／ペプチド複合体を提示する細胞を破壊し得る。
本発明のペプチドは、Ｔ細胞応答を刺激する能力がありおよび／または過剰提示されることが示されおり、したがって本発明に従って、抗体および／またはＴＣＲ、特にｓＴＣＲの製造のために使用され得る（実施例４および図４を参照されたい）。さらに、ペプチドは、それぞれのＭＨＣと複合体化した場合、同様に、抗体および／またはＴＣＲ、特に本発明によるＴＣＲ製造のために利用され得る。それぞれの方法は、当業者に良く知られており、それぞれの参考文献にもまた見られる。したがって本発明のペプチドは、それによって腫瘍細胞を破壊し得る、患者における免疫応答を生じさせるのに有用である。患者における免疫応答は、理想的には免疫原性を増強する薬剤（すなわちアジュバント）との組み合わせで、記載されるペプチド、または適切な前駆体（例えば、伸長ペプチド、タンパク質、またはそれらのペプチドをコードする核酸）を患者に直接投与することで、誘導され得る。本発明の標的ペプチドは、正常組織上では同等のコピー数で提示されないので、このような治療的ワクチン接種から生じる免疫応答は、腫瘍細胞に対して高度に特異的であることが予測され得て、患者の正常細胞に対する望まれない自己免疫反応のリスクを防止する。
「医薬組成物」は、医学的状況においてヒトへの投与に適する組成物である。好ましくは、前記医薬組成物は無菌であり、ＧＭＰガイドラインに準拠して製造される。
医薬組成物は、遊離形態または薬学的に許容可能な塩の形態のどちらかのペプチドを含んでなる（上記もまた参照されたい）。本明細書の用法では、「薬学的に許容可能な塩」は、開示されたペプチドの誘導体を指し、ペプチドは、薬剤の酸性または塩基性塩を作成することで修飾される。例えば、酸性塩は、適切な酸との反応を伴って、遊離塩基（典型的にその中で中性形態の薬剤が中性−ＮＨ２基を有する）から調製される。酸性塩を調製するための適切な酸としては、例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸などの有機酸、ならびに例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸リン酸などの無機酸の双方が挙げられる。逆に、ペプチド上に存在してもよい酸部分の塩基性塩の調製物は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、トリメチルアミンなどの薬学的に許容可能な塩基を用いて調製される。
特に好ましい一実施形態では、医薬組成物は、酢酸（酢酸塩）、トリフルオロ酢酸または塩酸（塩化物）の塩として、ペプチドを含んでなる。
がんを治療するために有用であるのに加えて、本発明のペプチドは、診断法としてもまた有用である。ペプチドはＣＬＬ（白血病（ｌｅｕｋｉｍｅａ））から作成されたので、そしてこれらのペプチドは、（白血球のような）正常組織には存在せずまたはより低レベルで存在すると判定されたので、これらのペプチドを利用してがんの存在が診断され得る。
特許請求されるペプチドの血液サンプル中の存在は、がん診断において病理学者を補佐し得る。抗体、質量分析法またはその他の当該技術分野で公知の方法の手段による特定のペプチドの検出は、サンプルが悪性または概して病的であることを病理学者に告げ得て、またはＣＬＬの生物マーカーとして利用（ｕｓｅｓｄ）され得る。ペプチド基の存在は、病的組織の分類または下位分類を可能にし得る。
患部組織検体上のペプチドの検出は、特にＴリンパ球が作用機序に関与することが知られておりまたは予測される場合に、免疫系が関与する治療法の利点を判定できるようにする。ＭＨＣ発現の喪失は、それによって感染悪性細胞が免疫監視を逃れる、十分に説明された機序である。したがってペプチドの存在は、この機序が、分析した細胞によって活用されていないことを示す。
本発明のペプチドは、ペプチドまたはＭＨＣ分子と複合体化したペプチドに対するＴ細胞応答または抗体応答などの、これらのペプチドに対するリンパ球応答を分析するのに使用されるかもしれない。これらのリンパ球応答は、さらなる治療ステップを決定するための予後マーカーとして使用され得る。これらの応答はまた、例えば、タンパク質、核酸、自己材料のワクチン接種や、リンパ球の養子免疫伝達などの異なる手段によるリンパ球応答の誘導を目指す、免疫療法アプローチにおける代理マーカーとして使用され得る。遺伝子治療の設定では、副作用の評価において、ペプチドに対するリンパ球応答が考慮され得る。リンパ球応答のモニタリングはまた、例えば移植片対宿主病および宿主対移植片病の検出など、移植治療の経過観察検査のための有益な手段かもしれない。
本発明のペプチドを使用して、ＭＨＣ／ペプチド複合体に対する特異的抗体が作成され開発され得る。これらは、毒素または放射性物質を患部組織に標的化する治療法のために、使用され得る。これらの抗体の別の用途は、ＰＥＴなどのイメージング目的の放射性核種の患部組織への標的化であり得る。この用途は、小規模な転移の検出、または病的組織のサイズと正確な位置確認の判定を助け得る。
したがってＨＬＡ拘束性抗原と複合体化したヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩと特異的に結合する、組換え抗体を製造する方法を提供することが、本発明のさらなる態様であり、方法は、前記ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩを発現する細胞を含んでなる、遺伝子操作された非ヒト哺乳類を、前記ＨＬＡ拘束性抗原と複合体化した可溶性形態のＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子によって免疫化するステップと；前記非ヒト哺乳類の抗体産生細胞から、ｍＲＮＡ分子を単離するステップと；前記ｍＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質分子を提示するファージディスプレイライブラリーを作成するステップと；前記ファージディスプレイライブラリーから、少なくとも１つのファージを単離するステップとを含んでなり、前記少なくとも１つのファージは、前記ＨＬＡ拘束性抗原と複合体化した前記ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩと特異的に結合する、前記抗体を提示する。
ＨＬＡ拘束性抗原と複合体化したヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩと特異的に結合する抗体を提供することも、本発明のさらなる態様であり、抗体は、好ましくは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、二重特異性抗体および／またはキメラ抗体である。
本発明のさらに別の態様は、ＨＬＡ拘束性抗原と複合体化したヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩと特異的に結合する、前記抗体を製造する方法に関し、方法は、前記ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩを発現する細胞を含んでなる、遺伝子操作された非ヒト哺乳類を、前記ＨＬＡ拘束性抗原と複合体化した可溶性形態のＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子によって免疫化するステップと；前記非ヒト哺乳類の抗体産生細胞から、ｍＲＮＡ分子を単離するステップと；前記ｍＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質分子を提示するファージディスプレイライブラリーを作成するステップと；前記ファージディスプレイライブラリーから、少なくとも１つのファージを単離するステップとを含んでなり、前記少なくとも１つのファージは、前記ＨＬＡ拘束性抗原と複合化した前記ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩと特異的に結合可能な前記抗体を提示する。このような抗体および一本鎖クラスＩ主要組織適合性複合体を製造するそれぞれの方法、ならびにこれらの抗体を製造するためのその他のツールは、本発明の目的で、全てその内容全体を参照によって明示的に援用する、国際公開第号パンフレット０３／０６８２０１、国際公開第号パンフレット２００４／０８４７９８、国際公開第号パンフレット０１／７２７６８、国際公開第号パンフレット０３／０７０７５２、およびＣｏｈｅｎ ＣＪ，ｅｔ ａｌ．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｉｔｈ ＭＨＣ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ，ｐｅｐｔｉｄｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ，Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ：ｎｅｗ ｔｏｏｌｓ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ＴＣＲ−ｐｅｐｔｉｄｅ−ＭＨＣ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｊ Ｍｏｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．２００３ Ｓｅｐ−Ｏｃｔ；１６（５）：３２４−３２．；Ｄｅｎｋｂｅｒｇ Ｇ，ｅｔ ａｌ．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｍｅｌａｎｏｍａ ａｎｄ ＡＰＣｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗｉｔｈ ＴＣＲ−ｌｉｋｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｔｏｗａｒｄ ａ ｍｅｌａｎｏｍａ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３ Ｓｅｐ １；１７１（５）：２１９７−２０７；およびＣｏｈｅｎ ＣＪ，ｅｔ ａｌ．Ｄｉｒｅｃｔ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ：ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ，ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｉｎ ｓｉｔｕ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｖｉｒａｌ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｕｓｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ，ＭＨＣ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３ Ａｐｒ １５；１７０（８）：４３４９−６１で開示される。
好ましくは、抗体は、２０ナノモル濃度未満、好ましくは１０ナノモル濃度未満の結合親和性で複合体に結合し、それは本発明の文脈で「特異的」と見なされる。
特異的ペプチドＭＨＣ複合体を認識する可溶性Ｔ細胞受容体を製造する方法を提供することもまた、本発明のさらなる態様である。このような可溶性Ｔ細胞受容体は、特異的Ｔ細胞クローンから生じ得て、それらの親和性は、相補性決定領域を標的とする変異誘発によって増大させ得る。Ｔ細胞受容体の選択目的で、ファージディスプレイが利用され得る（米国特許２０１０／０１１３３００第号明細書、Ｌｉｄｄｙ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ＴＣＲ−ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｋｉｌｌｉｎｇ．Ｎａｔ Ｍｅｄ ２０１２ Ｊｕｎ；１８（６）：９８０−９８７）。ファージディスプレイにおいて、および薬剤としての実用において、Ｔ細胞受容体を安定化する目的で、例えば、非天然ジスルフィド結合、その他の共有結合（一本鎖Ｔ細胞受容体）、または二量体化ドメインによって、αとβ鎖が連結され得る（Ｂｏｕｌｔｅｒ ＪＭ，ｅｔ ａｌ．Ｓｔａｂｌｅ，ｓｏｌｕｂｌｅ Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｆｏｒ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ ２００３ Ｓｅｐ；１６（９）：７０７−７１１．；Ｃａｒｄ ＫＦ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｓｏｌｕｂｌｅ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＩＬ−２ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｔａｉｎｓ ＭＨＣ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ＩＬ−２ ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ２００４ Ａｐｒ；５３（４）：３４５−３５７；およびＷｉｌｌｃｏｘ ＢＥ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｌｕｂｌｅ ａｌｐｈａｂｅｔａ Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｓ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｌｉｇａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ １９９９ Ｎｏｖ；８（１１）：２４１８−２４２３を参照されたい）。Ｔ細胞受容体は、標的細胞上で特定機能を発揮させるために、毒素、薬剤、サイトカイン（米国特許第２０１３／０１１５１９１号明細書を参照されたい）、抗ＣＤ３ドメインのようなエフェクター細胞漸増ドメインなどに、連結させ得る。さらにそれは、養子免疫伝達のために使用されるＴ細胞内で発現させ得る。
さらなる情報は、国際公開第２００４／０３３６８５Ａ１号パンフレットおよび国際公開第２００４／０７４３２２Ａ１号パンフレットにある。ＴＣＲの組み合わせは、国際公開第２０１２／０５６４０７Ａ１号パンフレットに記載される。さらなる製造法は、国際公開第２０１３／０５７５８６Ａ１号パンフレットで開示される。
さらに、それらを使用して、生検サンプルに基づく病理学者のがん診断が確認され得る。
過剰提示ペプチドを選択するために、中央値サンプル提示ならびに反復試験変動を示す、提示プロファイルが計算される。プロファイルは、関心のある腫瘍実体のサンプルを正常なサンプルのベースラインに並置させる。次に、線形混合効果モデルのｐ値を計算して（Ｊ．Ｐｉｎｈｅｉｒｏ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｎｌｍｅ Ｐａｃｋａｇｅ：Ｌｉｎｅａｒ ａｎｄ Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ Ｍｉｘｅｄ Ｅｆｆｅｃｔｓ Ｍｏｄｅｌｓ．２００７）、誤検出率によって複数試験について補正する（Ｙ．Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ ａｎｄ Ｙ．Ｈｏｃｈｂｅｒｇ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｔｈｅ Ｆａｌｓｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｒａｔｅ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｐｏｗｅｒｆｕｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｅｓｔｉｎｇ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ．Ｓｅｒｉｅｓ Ｂ（Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｃａｌ），Ｖｏｌ．５７（Ｎｏ．１）：２８９−３００，１９９５）ことで、これらの各プロファイルは、過剰提示スコアに統合され得る。
質量分析法によるＨＬＡリガンドの同定と相対的定量化のために、衝撃凍結サンプルからのＨＬＡ分子が精製されて、ＨＬＡ関連ペプチドが単離された。単離ペプチドが分離され、オンラインナノエレクトロスプレーイオン化（ｎａｎｏＥＳＩ）液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）実験によって配列が同定された。得られたペプチド配列は、ＣＬＬサンプルから記録された天然ＴＵＭＡＰの断片化パターンを、同一配列の対応する合成参照ペプチドの断片化パターンと比較することで、確認された。ペプチドは、原発性腫瘍のＨＬＡ分子のリガンドとして直接、同定されたので、これらの結果は、ＣＬＬ患者から入手された原発性がん組織上における、同定されたペプチドの天然プロセッシングおよび提示の直接的証拠を提供する。
発見パイプラインＸＰＲＥＳＩＤＥＮＴ（登録商標）ｖ２．１（例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第２０１３−００９６０１６号明細書を参照されたい）は、いくつかの異なる非がん性組織および臓器と比較した、がん組織上のＨＬＡ拘束性ペプチドレベルの直接的相対定量化に基づく、妥当な過剰提示ペプチドワクチン候補の同定と選択を可能にする。これは、独自仕様のデータ解析パイプラインによる獲得ＬＣ−ＭＳデータ処理、配列同定のためのアルゴリズム組み合わせ、スペクトルクラスタリング、イオン計数、滞留時間アライメント、電荷状態のデコンボリューションと正規化を使用した、無標識示差定量化の開発によって、達成された。
各ペプチドおよびサンプルの誤差推定値を含む、提示レベルが確立された。非がん性の組織および臓器との比較で、腫瘍組織上で排他的に提示されるペプチド、および腫瘍内で過剰提示されるペプチドが、同定された。
ＣＬＬ組織サンプルに由来するＨＬＡペプチド複合体が精製されて、ＨＬＡ結合ペプチドが単離され、ＬＣ−ＭＳによって分析された（実施例を参照されたい）。本出願に含まれる全てのＴＵＭＡＰは、このアプローチによって原発性ＣＬＬサンプル上で同定され、原発性ＣＬＬ上におけるそれらの提示が確認された。
本出願に含まれる全てのＴＵＭＡＰは、このアプローチによって原発性ＣＬＬサンプル上で同定され、原発性ＣＬＬ上におけるそれらの提示が確認された。
複数のＣＬＬ腫瘍および正常組織上で同定されたＴＵＭＡＰは、無標識ＬＣ−ＭＳデータのイオン計数を使用して定量化された。方法は、ペプチドのＬＣ−ＭＳシグナル面積が、サンプル中のその存在量に相関すると仮定する。様々なＬＣ−ＭＳ実験におけるペプチドの全ての定量的シグナルは、中心傾向に基づいて正規化され、サンプル毎に平均化されて、提示プロファイルと称される棒グラフにマージされた。提示プロファイルは、タンパク質データベース検索、スペクトルクラスタリング、電荷状態デコンボリューション（除電）、および滞留時間アライメント、および正規化のような、異なる解析法を統合する。
したがって本発明は、配列番号１〜配列番号２２５、配列番号５２７〜配列番号５５１または配列番号５５２〜配列番号１０１６からなる群から選択される配列を含んでなるペプチド、または配列番号１〜配列番号２２５、配列番号５２７〜配列番号５５１または配列番号５５２〜配列番号１０１６またはそれらの変異体と、少なくとも９０％相同的な（好ましくは同一の）それらの変異体に関し、それは基礎完全長ポリペプチドでない前記ペプチドと交差反応するＴ細胞を誘導する。
本発明は、配列番号１〜配列番号２２５、配列番号５２７〜配列番号５５１または配列番号５５２〜配列番号１０２４、または配列番号１〜配列番号２２５、配列番号５２７〜配列番号５５１または配列番号５５２〜配列番号１０１６と少なくとも９０％相同的な（好ましくは同一の）それらの変異体からなる群から選択される配列を含んでなるペプチドにさらに関し、前記ペプチドまたは変異体は、８〜１００、好ましくは８〜３０、最も好ましくは８〜１４アミノ酸の全長を有する。
本発明は、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩの分子に結合する能力を有する、本発明によるペプチドにさらに関する。
本発明は、配列番号１〜配列番号２２５、配列番号５２７〜配列番号５５１または配列番号５５２〜配列番号１０１６に記載のアミノ酸配列からなり、またはそれから本質的になる、本発明によるペプチドにさらに関する。
本発明は、ペプチドが（化学的に）修飾されおよび／または非ペプチド結合を含む、本発明によるペプチドにさらに関する。
本発明は、本発明によるペプチドにさらに関し、ペプチドは、融合タンパク質の一部であり、特にＨＬＡ−ＤＲ抗原関連不変鎖（Ｉｉ）のＮ末端アミノ酸を含んでなり、またはペプチドは、例えば樹状細胞特異的抗体などの抗体に（またその中に）融合する。
本発明は、本発明によるペプチドをエンコードする核酸にさらに関するが、ただしペプチドは完全ヒトタンパク質でない。
本発明は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組み合わせである、本発明による核酸にさらに関する。
本発明は、本発明による核酸を発現する能力がある発現ベクターにさらに関する。
本発明は、医療で使用するための、本発明によるペプチド、本発明による核酸、または本発明による発現ベクターにさらに関する。
本発明は、本発明による核酸または本発明による発現ベクターを含んでなる、宿主細胞にさらに関する。
本発明は、抗原提示細胞である、本発明による宿主細胞にさらに関する。
本発明は、抗原提示細胞が樹状細胞である、本発明による宿主細胞にさらに関する。
本発明は、記載される宿主細胞を培養するステップと、宿主細胞またはその培養液からペプチドを単離するステップとを含んでなる、本発明によるペプチドを製造する方法にさらに関する。
本発明は、ＣＴＬを、適切な抗原細胞の表面に発現される抗原負荷ヒトクラスＩまたはＩＩ ＭＨＣ分子に、前記ＣＴＬを抗原特異的様式で活性化するのに十分な時間にわたり、生体外で接触させるステップを含んでなる、活性化細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を製造するインビトロ法にさらに関し、前記抗原は、本発明による任意のペプチドである。
本発明は、十分な量の抗原を抗原提示細胞に接触させることで、前記抗原が、適切な抗原提示細胞の表面に発現されるクラスＩまたはＩＩＭＨＣ分子上に負荷される、記載される方法にさらに関する。
本発明は、抗原提示細胞が、配列番号１〜配列番号２２５、配列番号５２７〜配列番号５５１または配列番号５５２〜配列番号１０１６を含有する前記ペプチドを発現する能力がある、発現ベクター、または前記変異アミノ酸配列を含んでなる、本発明による方法にさらに関する。
本発明は、記載されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する細胞を選択的に認識する、本発明による方法によって製造される、活性化細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）にさらに関する。
本発明は、本発明による有効数の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を患者に投与するステップを含んでなる、本発明による任意のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する標的細胞を患者において死滅させる方法にさらに関する。
本発明は、薬剤としての、または薬剤の製造における、本発明による任意のペプチド、本発明による核酸、本発明による発現ベクター、本発明による細胞、または本発明による活性化細胞傷害性Ｔリンパ球の使用にさらに関する。
本発明は、薬剤がワクチンである、本発明による使用にさらに関する。
本発明は、薬剤ががんに対して有効である、本発明による使用にさらに関する。
本発明は、前記がん細胞がＣＬＬ細胞またはその他の非固形腫瘍細胞である、本発明による使用にさらに関する。
本発明は、ＣＬＬの予後診断で使用され得る、特定のマーカータンパク質および生物マーカーにさらに関する。
さらに、本発明は、がん治療のための、本発明によって記載されるような新規標的の使用に関する。
「抗体（単数）」または「抗体（複数）」という用語は、本明細書では広義に使用され、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の双方を含む。本発明によれば、「抗体」という用語には、所望の特性（例えば、ＣＬＬマーカーポリペプチドの特異的結合、増大したレベルでＣＬＬマーカー遺伝子を発現するＣＬＬ（白血病（ｌｅｕｋｉｍｅａ））細胞への毒素送達、および／またはＣＬＬマーカーポリペプチドの活性阻害）のいずれかを示しさえすれば、未変性または「完全」免疫グロブリン分子に加えて、これらの免疫グロブリン分子のフラグメントまたはポリマー、および免疫グロブリン分子のヒト化バージョンもまた含まれる。
可能な場合は常に、本発明の抗体は、商業的供給元から購入されてもよい。また本発明の抗体は、周知の方法を使用して作成されてもよい。当業者は、本発明の抗体を作成するために、完全長ＣＬＬマーカーポリペプチドまたはその断片のどちらを使用してもよいことを理解するであろう。本発明の抗体を作成するために使用されるポリペプチドは、天然原料から部分的にまたは完全に精製されてもよく、または組換えＤＮＡ技術を使用して製造されてもよい。
例えば、配列番号１〜配列番号２２５、配列番号２２６〜配列番号５４２または配列番号５４３〜配列番号１０１６ポリペプチドに記載のペプチド、またはその変異体または断片などの本発明によるペプチドをコードするｃＤＮＡは、原核細胞（例えば、細菌）または真核細胞（例えば、酵母、昆虫、または哺乳類細胞）で発現され得て、その後、組換えタンパク質が精製され使用されて、本発明による抗体を作成するのに使用されるＣＬＬマーカーポリペプチドと特異的に結合する、モノクローナルまたはポリクローナル抗体製剤が作成され得る。
当業者は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体の２つ以上の異なるセットの作成が、その目的の用途（例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学的検査、生体内イメージング、免疫毒素療法）に必要な特異性および親和性がある抗体を入手する可能性を最大化することを理解するであろう。抗体は、それに対して抗体が使用される目的に従って、既知の方法によりそれらの所望の活性について試験された（例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学的検査、免疫療法など；抗体の作成および試験のさらなるガイダンスについては、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｎｅｗ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ ２０１３を参照されたい）。例えば、抗体は、ＥＬＩＳＡアッセイまたはウエスタンブロットで試験されてもよい。それらの最初の生体外特性解析後、治療または生体内診断用途を意図した抗体が、既知の臨床試験法によって試験される。
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書の用法では、実質的に均質な抗体集団から入手される抗体を指し；すなわち、母集団を構成する個々の抗体は、微量で存在してもよい可能な自然発生的変異を除いて同一である。本明細書では、「モノクローナル抗体」は、それらが所望の拮抗活性を示しさえすれば、その中で重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来しまたは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する、抗体中の対応する配列と同一または相同的である一方、鎖の残部が、別の種に由来しまたは別の抗体クラスまたはサブクラスに属する、抗体中の対応する配列と同一または相同的である、「キメラ」抗体、ならびにこのような抗体の断片を特に含む（その内容全体を本明細書に援用する、米国特許第４，８１６，５６７号明細書）。
本発明のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法を使用して調製されてもよい。ハイブリドーマ法では、マウスまたはその他の適切な宿主動物が免疫剤によって典型的に免疫化されて、免疫剤と特異的に結合する抗体を産生するまたは産生できるリンパ球を生じさせる。代案としては、リンパ球は、生体外で免疫化されてもよい。
モノクローナル抗体はまた、米国特許第４，８１６，５６７号明細書に記載されるものなどの組換えＤＮＡ法によって作成されてもよい。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して、容易に単離および配列決定され得る（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合できる、オリゴヌクレオチドプローブを使用して）。
インビトロ法もまた、一価の抗体を調製するのに適する。抗体フラグメント、特にＦａｂフラグメントを製造するための抗体の消化は、当該技術分野で既知の通例の技術を使用して達成され得る。例えば、消化は、パパインを使用して実施され得る。パパイン消化の例は、国際公開第号パンフレット９４／２９３４８および米国特許第４，３４２，５６６号明細書に記載される。抗体のパパイン消化は、それぞれ単一抗原結合部位があるＦａｂフラグメントと称される２つの同一の抗原結合フラグメントと、残りのＦｃフラグメントとを典型的に生成する。ペプシン処理は、Ｆ（ａｂ’） ２断片およびｐＦｃ’断片をもたらす。
抗体フラグメントは、その他の配列に付着するかどうかに関わりなく、フラグメントの活性が非修飾抗体または抗体フラグメントと比較して顕著に変化せずまたは損なわれないという条件で、特定領域または特定アミノ酸残基の挿入、欠失、置換、またはその他の選択された修飾もまた含み得る。これらの修飾は、ジスルフィド結合能力のあるアミノ酸の除去／付加、そのバイオ寿命増大、その分泌特性改変などのいくつかの追加的な特性を提供し得る。いずれにしても、抗体フラグメントは、結合活性、結合領域における結合調節などの生理活性特性を有しなくてはならない。抗体の機能性または活性領域は、タンパク質の特定領域の変異誘発と、それに続く発現と、発現したポリペプチドの試験によって同定されてもよい。このような方法は、当該技術分野の熟練した実務家には容易に分かり、抗体フラグメントをエンコードする核酸の部位特異的変異誘発を含み得る。
本発明の抗体は、ヒト化抗体またはヒト抗体をさらに含んでなってもよい。非ヒト（例えばマウス）抗体などのヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはその断片（抗体のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはその他の抗原結合部分配列など）である。ヒト化抗体としては、その中でレシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有する、マウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト生物種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基によって置換される、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）が挙げられる。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体または移入ＣＤＲまたはフレームワーク配列のどちらにも見られない、残基を含んでなってもよい。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ典型的に２つの可変領域の実質的に全てを含んでなり、その中では、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全てが、ヒト免疫グロブリン共通配列のものである。ヒト化抗体は、至適には、典型的にヒト免疫グロブリン定常領域である、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部もまた含んでなる。
非ヒト抗体をヒト化する方法は、当該技術分野で周知である。通常、ヒト化抗体は、非ヒト起源から導入された、１つまたは複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「移入」残基と称されることが多く、それは典型的に「移入」可変領域から得られる。ヒト化は、齧歯類ＣＤＲ（複数）またはＣＤＲ（単数）配列を対応するヒト抗体配列によって置換することで、基本的に実施され得る。したがって、このような「ヒト化」抗体は、キメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号明細書）であり、その中では、実質的に非損傷でないヒト可変領域が、非ヒト生物種からの対応する配列によって置換されている。実際には、ヒト化抗体は典型的にヒト抗体であり、その中では、いくつかのＣＤＲ残基と、おそらくはいくつかのＦＲ残基とが、齧歯類抗体中の類似部位に由来する残基によって置換されている。
免疫化されると、内在性免疫グロブリン産生の不在下でヒト抗体の完全レパートリーを産生できる、遺伝子組換え動物（例えばマウス）が用いられ得る。例えば、キメラおよび生殖細胞系変異マウスにおける、抗体重鎖連結領域遺伝子のホモ接合型欠失が、内在性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖細胞系変異マウスにおけるヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイの転写は、抗原チャレンジに際してヒト抗体の産生をもたらす。ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリー中でも産生され得る。
本発明の抗体は、好ましくは薬学的に許容できる担体中で、対象に投与される。典型的に、製剤を等張にするために、製剤中で適当量の薬理的に許容可能な塩が使用される。薬理的に許容可能な担体の例としては、生理食塩水、リンゲル液、およびデキストロース溶液が挙げられる。溶液のｐＨは、好ましくは約５〜約８、より好ましくは約７〜約７．５である。さらなる担体としては、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックス徐放性製剤が挙げられ、そのマトリックスは、例えば、フィルム、リポソームまたは微粒子などの造形品の形態である。当業者には、例えば、投与される抗体の投与経路および濃度次第で、特定の担体がより好ましくあってもよいことが明らかであろう。
抗体は、注射（例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内）によって、またはその有効形態での血流への送達を確実にする輸液などのその他の方法によって、対象、患者、または細胞に投与され得る。抗体はまた、腫瘍内または腫瘍周囲経路によって投与されて、局所性ならびに全身性の治療効果を発揮してもよい。局所注射または静脈注射が好ましい。
抗体を投与するための有効投与量およびスケジュールは、経験的に判定されてもよく、このような測定の実施は、当該技術分野の技術範囲内である。当業者は、投与すべき抗体用量が、例えば、抗体を投与される対象、投与経路、使用される特定の抗体型、および投与されるその他の薬剤次第で変動することを理解するであろう。単独使用される抗体の典型的な１日量は、上述の要素次第で、１日あたり約１（μｇ／ｋｇ〜最大１００ｍｇ／ｋｇ体重またはそれ以上の範囲であるかもしれない。ＣＬＬを治療するための抗体の投与に続いて、ＣＬＬに続発する治療用抗体の有効性が、熟練した実務家に良く知られている様々な様式で評価され得る（ｐｒａｃｔｉｔｉｏｎｅｒ．ｓ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｔｏ ＣＬＬ）。
本発明の上記の表で言及されるようなペプチド（特にＣＬＬに関連するもの）、ひいてはそれらの基礎ポリペプチドはＣＬＬで高度に発現され、正常細胞ではかなりから極めて低いレベルで発現されるので、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ、ＣＤＫ１４、ＲＡＳＧＲＦ１、ＣＤＣＡ７Ｌ、ＣＥＬＳＲ１、ＡＫＡＰ２、ＣＴＤＰ１、ＤＮＭＢＰ、ＴＡＧＡＰ、ＡＢＣＡ６、ＤＭＸＬ１、ＰＡＲＰ３、ＴＰ５３Ｉ１１、Ｂ４ＧＡＬＴ１、ＩＲＦ９、ＫＤＭ２Ｂ、ＴＢＣ１Ｄ２２Ａ、ＺＮＦ２９６、ＢＡＣＨ２、ＰＲＲ１２、ＺＦＡＮＤ５、ＡＴＰ５Ｇ１、ＤＭＤ、ＡＲＩＤ５Ｂ、ＺＮＦ６３８、ＤＤＸ４６、ＲＲＭ２Ｂ、ＢＬＮＫ、ＨＳＨ２Ｄ、ＥＲＰ４４、ＭＥＴＴＬ７Ａ、ＥＬＰ３、ＮＬＲＰ２、ＺＣ３Ｈ１２Ｄ、ＮＥＬＦＥ、ＡＴＰ６Ｖ１Ｃ１、ＨＬＡ−ＤＭＡ、ＴＵＦＭ、ＥＩＦ６、ＣＫＡＰ４、ＣＯＢＬＬ１、ＴＭＥＤ４、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＵＢＬ７、ＣＸｏｒｆ２１、ＡＳＵＮ、ＳＬ２４Ｄ１、およびＴＲＡＦ３ＩＰ３からなる群から選択されるタンパク質の発現またはそれらの活性の阻害が、好ましくは、ＣＬＬを治療または予防するための治療ストラテジーに組み込まれてもよい。
アンチセンス療法の原理は、（転写または翻訳を介した）遺伝子発現の配列特異的抑制が、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡと相補的アンチセンス種との間の細胞内部ハイブリダイゼーションによって、達成されてもよいという仮説に基づく。このようなハイブリッド核酸二本鎖の形成は、標的腫瘍抗原エンコードゲノムＤＮＡの転写、または標的腫瘍抗原ｍＲＮＡのプロセッシング／輸送／翻訳および／または安定性を妨害する。
アンチセンス核酸は、多様なアプローチによって送達され得る。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスＲＮＡは、腫瘍細胞への取り込みを可能にする形態で、（例えば静脈注射によって）対象に直接投与され得る。代案としては、アンチセンスＲＮＡ（またはＲＮＡフラグメント）をコードする、ウイルスまたはプラスミドベクターが、生体内で細胞に導入され得る。アンチセンス効果はまた、センス配列によって誘導され得る；しかし表現型変化の程度は、極めて変わりやすい。効果的なアンチセンス療法によって誘導される表現型変化は、例えば、標的ｍＲＮＡレベル、標的タンパク質レベル、および／または標的タンパク質活性レベルの変化によって評価される。
具体例では、アンチセンス遺伝子治療によるＣＬＬマーカー機能の阻害は、アンチセンス肺腫瘍マーカーＲＮＡの対象への直接投与によって達成されてもよい。アンチセンス腫瘍マーカーＲＮＡは、任意の標準的な技術によって製造され単離されてもよいが、高効率プロモーター（例えばＴ７プロモーター）の制御下にあるアンチセンス腫瘍マーカーｃＤＮＡを使用する生体外転写によって、最も容易に製造される。アンチセンス腫瘍マーカーＲＮＡの細胞への投与は、下に記載される直接的な核酸投与法のいずれかによって実施され得る。
抗タンパク質抗体または抗タンパク質抗体の一部の細胞内発現を伴う遺伝子治療を使用する、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ、ＣＤＫ１４、ＲＡＳＧＲＦ１、ＣＤＣＡ７Ｌ、ＣＥＬＳＲ１、ＡＫＡＰ２、ＣＴＤＰ１、ＤＮＭＢＰ、ＴＡＧＡＰ、ＡＢＣＡ６、ＤＭＸＬ１、ＰＡＲＰ３、ＴＰ５３Ｉ１１、Ｂ４ＧＡＬＴ１、ＩＲＦ９、ＫＤＭ２Ｂ、ＴＢＣ１Ｄ２２Ａ、ＺＮＦ２９６、ＢＡＣＨ２、ＰＲＲ１２、ＺＦＡＮＤ５、ＡＴＰ５Ｇ１、ＤＭＤ、ＡＲＩＤ５Ｂ、ＺＮＦ６３８、ＤＤＸ４６、ＲＲＭ２Ｂ、ＢＬＮＫ、ＨＳＨ２Ｄ、ＥＲＰ４４、ＭＥＴＴＬ７Ａ、ＥＬＰ３、ＮＬＲＰ２、ＺＣ３Ｈ１２Ｄ、ＮＥＬＦＥ、ＡＴＰ６Ｖ１Ｃ１、ＨＬＡ−ＤＭＡ、ＴＵＦＭ、ＥＩＦ６、ＣＫＡＰ４、ＣＯＢＬＬ１、ＴＭＥＤ４、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＵＢＬ７、ＣＸｏｒｆ２１、ＡＳＵＮ、ＳＬ２４Ｄ１、およびＴＲＡＦ３ＩＰ３からなる群から選択されるタンパク質機能を阻害するための代案のストラテジー。例えば、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ、ＣＤＫ１４、ＲＡＳＧＲＦ１、ＣＤＣＡ７Ｌ、ＣＥＬＳＲ１、ＡＫＡＰ２、ＣＴＤＰ１、ＤＮＭＢＰ、ＴＡＧＡＰ、ＡＢＣＡ６、ＤＭＸＬ１、ＰＡＲＰ３、ＴＰ５３Ｉ１１、Ｂ４ＧＡＬＴ１、ＩＲＦ９、ＫＤＭ２Ｂ、ＴＢＣ１Ｄ２２Ａ、ＺＮＦ２９６、ＢＡＣＨ２、ＰＲＲ１２、ＺＦＡＮＤ５、ＡＴＰ５Ｇ１、ＤＭＤ、ＡＲＩＤ５Ｂ、ＺＮＦ６３８、ＤＤＸ４６、ＲＲＭ２Ｂ、ＢＬＮＫ、ＨＳＨ２Ｄ、ＥＲＰ４４、ＭＥＴＴＬ７Ａ、ＥＬＰ３、ＮＬＲＰ２、ＺＣ３Ｈ１２Ｄ、ＮＥＬＦＥ、ＡＴＰ６Ｖ１Ｃ１、ＨＬＡ−ＤＭＡ、ＴＵＦＭ、ＥＩＦ６、ＣＫＡＰ４、ＣＯＢＬＬ１、ＴＭＥＤ４、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＵＢＬ７、ＣＸｏｒｆ２１、ＡＳＵＮ、ＳＬ２４Ｄ１、およびＴＲＡＦ３ＩＰ３からなる群から選択されるタンパク質に特異的に結合して、その生物学的活性を阻害するモノクローナル抗体をコードする遺伝子（または遺伝子フラグメント）が、核酸発現ベクター内で、特異的（例えば、組織または腫瘍特異的）遺伝子制御配列の転写制御下に置かれる。次にベクターは、ＣＬＬ細胞またはその他の細胞に取り込まれるように対象に投与され、次に細胞は、抗タンパク質抗体を分泌し、それによってそれぞれのポリペプチドの生物学的活性を妨げる。好ましくは、タンパク質は、ＣＬＬがん細胞の細胞表面に存在する。
対象細胞への外来性ＤＮＡ投与と取り込み（すなわち、遺伝子変換または形質移入）を含む上述の方法では、本発明の核酸は裸のＤＮＡの形態であり得て、または核酸はＣＬＬ腫瘍マーカータンパク質発現を阻害するために、核酸を細胞に送達するベクター内にあり得る。ベクターは、アデノウイルスベクター（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｌａｖａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）などの市販の調製物であり得る。核酸またはベクターの細胞への送達は、多様な機構を介し得る。一実施例として、送達はリポソームを介し得て、リポフェクチン、リポフェクタミン（ＧＩＢＣＯ−２５ ＢＲＬ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．），ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、およびＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．ＵＳ）などの市販のリポソーム調製物、ならびに当該技術分野で標準的な手順に従って開発されたその他のリポソームが使用される。さらに、本発明の核酸またはベクターは、そのための技術がＧｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＵＳ．）から入手できる電気穿孔によって、ならびにＳＯＮＯＰＯＲＡＴＩＯＮ装置（ＩｍａＲｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．，Ｔｕｃｓｏｎ，Ａｒｉｚｏｎａ，ＵＳ）の手段によって、生体内に送達され得る。
一実施例として、ベクター送達は、組換えレトロウイルスゲノムをパッケージし得るレトロウイルスベクター系などのウイルス系を介し得る。次に組換えレトロウイルスを使用して細胞を感染させ、それによって感染細胞に、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ、ＣＤＫ１４、ＲＡＳＧＲＦ１、ＣＤＣＡ７Ｌ、ＣＥＬＳＲ１、ＡＫＡＰ２、ＣＴＤＰ１、ＤＮＭＢＰ、ＴＡＧＡＰ、ＡＢＣＡ６、ＤＭＸＬ１、ＰＡＲＰ３、ＴＰ５３Ｉ１１、Ｂ４ＧＡＬＴ１、ＩＲＦ９、ＫＤＭ２Ｂ、ＴＢＣ１Ｄ２２Ａ、ＺＮＦ２９６、ＢＡＣＨ２、ＰＲＲ１２、ＺＦＡＮＤ５、ＡＴＰ５Ｇ１、ＤＭＤ、ＡＲＩＤ５Ｂ、ＺＮＦ６３８、ＤＤＸ４６、ＲＲＭ２Ｂ、ＢＬＮＫ、ＨＳＨ２Ｄ、ＥＲＰ４４、ＭＥＴＴＬ７Ａ、ＥＬＰ３、ＮＬＲＰ２、ＺＣ３Ｈ１２Ｄ、ＮＥＬＦＥ、ＡＴＰ６Ｖ１Ｃ１、ＨＬＡ−ＤＭＡ、ＴＵＦＭ、ＥＩＦ６、ＣＫＡＰ４、ＣＯＢＬＬ１、ＴＭＥＤ４、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＵＢＬ７、ＣＸｏｒｆ２１、ＡＳＵＮ、ＳＬ２４Ｄ１、およびＴＲＡＦ３ＩＰ３からなる群から選択されるタンパク質発現を阻害するアンチセンス核酸が送達され得る。改変核酸を哺乳類細胞に導入する正確な方法は、もちろん、レトロウイルスベクターの使用に限定されない。アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス性（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、偽型レトロウイルスベクターの使用をはじめとするその他の技術が、この手順のために一般的に利用可能である。リポソーム送達および受容体媒介およびその他のエンドサイトーシス機構などの物理的形質導入技術もまた、使用され得る。本発明は、これらのまたはその他の一般に使用される遺伝子導入方法のいずれかと併用され得る。
抗体はまた、生体内診断アッセイのために使用されてもよい。通常、抗体は、免疫シンチグラフィー（ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｏｇｒａｐｈｙ）を使用して腫瘍が位置確認され得るように、放射性ヌクレオチド（１１１Ｉｎ、９９Ｔｃ、１４Ｃ、１３１Ｉ、３Ｈ、３２Ｐまたは３５Ｓなど）で標識される。一実施形態では、抗体またはそれらの断片は、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ、ＣＤＫ１４、ＲＡＳＧＲＦ１、ＣＤＣＡ７Ｌ、ＣＥＬＳＲ１、ＡＫＡＰ２、ＣＴＤＰ１、ＤＮＭＢＰ、ＴＡＧＡＰ、ＡＢＣＡ６、ＤＭＸＬ１、ＰＡＲＰ３、ＴＰ５３Ｉ１１、Ｂ４ＧＡＬＴ１、ＩＲＦ９、ＫＤＭ２Ｂ、ＴＢＣ１Ｄ２２Ａ、ＺＮＦ２９６、ＢＡＣＨ２、ＰＲＲ１２、ＺＦＡＮＤ５、ＡＴＰ５Ｇ１、ＤＭＤ、ＡＲＩＤ５Ｂ、ＺＮＦ６３８、ＤＤＸ４６、ＲＲＭ２Ｂ、ＢＬＮＫ、ＨＳＨ２Ｄ、ＥＲＰ４４、ＭＥＴＴＬ７Ａ、ＥＬＰ３、ＮＬＲＰ２、ＺＣ３Ｈ１２Ｄ、ＮＥＬＦＥ、ＡＴＰ６Ｖ１Ｃ１、ＨＬＡ−ＤＭＡ、ＴＵＦＭ、ＥＩＦ６、ＣＫＡＰ４、ＣＯＢＬＬ１、ＴＭＥＤ４、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＵＢＬ７、ＣＸｏｒｆ２１、ＡＳＵＮ、ＳＬ２４Ｄ１、およびＴＲＡＦ３ＩＰ３からなる群から選択されるタンパク質の２つ以上の標的の細胞外ドメインに結合し、親和性価（Ｋｄ）は１×１０μＭ未満である。
診断用の抗体は、様々なイメージング法による検出に適するプローブで標識されてもよい。プローブ検出法としては、蛍光、光学、共焦点、および電子顕微鏡検査；磁気共鳴イメージングおよび分光法；蛍光透視法、コンピュータ断層撮影および陽電子放出断層撮影が挙げられるが、これに限定されるものではない。適切なプローブとしては、フルオレセイン、ローダミン、エオジン、およびその他のフルオロフォア、放射性同位体、金、ガドリニウム、およびその他のランタニド、常磁性鉄、フッ素１８、およびその他の陽電子放出放射性核種が挙げられるが、これに限定されるものではない。さらに、プローブは二官能価または多官能価であってもよく、列挙される方法の１つ以上によって検出可能である。これらの抗体は、前記プローブで直接または間接的に標識されてもよい。特に十分に技術分野で承認されている、プローブの抗体への付着としては、プローブの共有結合、プローブの抗体への組み込み、およびプローブ結合のためのキレート化合物の共有結合が挙げられる。免疫組織化学的検査では、疾患組織サンプルは、新鮮または冷凍であってもよく、またはパラフィン包埋されてホルマリンなどの保存料で固定されてもよい。サンプルを含有する固定または包埋切片は、標識一次抗体および二次抗体と接触されて、抗体を使用して原位置タンパク質発現が検出される。
本発明は、配列番号１〜配列番号２２５、配列番号２２６〜配列番号５４２または配列番号５４３〜配列番号１０１６からなる群から選択される配列を含んでなるペプチド、または配列番号１〜配列番号２２５、配列番号２２６〜配列番号５４２または配列番号５４３〜配列番号１０１６と９０％相同的なそれらの変異体、または前記ペプチドと交差反応するＴ細胞を誘導するそれらの変異体を提供する。
本発明のペプチドは、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩおよび／またはクラスＩＩの分子に結合する能力を有する。
本発明では、「相同的」という用語は、２つのアミノ酸配列、すなわちペプチドまたはポリペプチド配列の配列間の同一性の程度（上の同一性百分率を参照されたい）を指す。前述の「相同性」は、比較される配列にわたり、最適条件下でアライメントされた２つの配列を比較することで判定される。このような配列相同性は、例えばＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを使用してアライメントを作成することで、計算され得る。一般に利用できる配列解析ソフトウェア、より具体的には、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ、ＧＥＮＥＴＹＸまたはその他の分析ツールが、公共データベースによって提供される。
当業者は、特定のペプチドの変異型によって誘導されるＴ細胞が、ペプチドそれ自体と交差反応できるかどうかを評価できるであろう（Ｆｏｎｇ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ａｌｔｅｒｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｇａｎｄ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｆｌｔ３ ｌｉｇａｎｄ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００１ Ｊｕｌ １７；９８（１５）：８８０９−１４；Ｚａｒｅｍｂａ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｅｎｈａｎｃｅｒ ａｇｏｎｉｓｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９７ Ｏｃｔ １５；５７（２０）：４５７０−７；Ｃｏｌｏｍｂｅｔｔｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ ｍｅｌａｎ−Ａ ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ａｎｔｉ−ｓｅｌｆ ｍｅｌａｎ−Ａ／ＨＬＡ−Ａ２ Ｔ ｃｅｌｌ ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６ Ｊｕｎ １；１７６（１１）：６５６０−７；Ａｐｐａｙ Ｖ，ｅｔ ａｌ．Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌ ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｍｅｌａｎ−Ａ ｐｅｐｔｉｄｅ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６ Ｊｕｌ；３６（７）：１８０５−１４）。
所与のアミノ酸配列の「変異型」によって、本発明者らは、ペプチドが、配列番号１〜配列番号２２５、配列番号２２６〜配列番号５４２または配列番号５４３〜配列番号１０１６からなる（ｉｎ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）所与のアミノ酸配列からなるペプチドと実質的に同様に、ＨＬＡ分子となおも結合できるように、（例えば、それらを別の天然アミノ酸残基の側鎖で、またはその他の側鎖で、置換することにより）例えば、アミノ酸の１つまたは２つの残基の側鎖が改変されることを意味する。例えばペプチドは、それがＨＬＡ−Ａ*０２または−ＤＲなどの適切なＭＨＣ分子の結合溝と相互作用して結合する能力を改善せずとも、少なくとも維持するように修飾されてもよく、そのようにしてそれは、活性化ＣＴＬのＴＣＲに結合する能力を改善せずとも、少なくとも維持する。
これらのＣＴＬは、引き続いて細胞と交差反応して、本発明の態様で定義される同族ペプチドの天然アミノ酸配列を含有するポリペプチドを発現する細胞を殺滅し得る。学術文献（Ｇｏｄｋｉｎ Ａ，ｅｔ ａｌ． Ｕｓｅ ｏｆ ｅｌｕｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｉｎｓｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ａｌｌｅｌｅ ＨＬＡ−ＤＱ８（ＤＱ ３．２）．Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７ Ｊｕｎ；９（６）：９０５−１１）およびデータベース（Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ Ｈ．ｅｔ ａｌ．ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ：ｄａｔａｂａｓｅ ｆｏｒ ＭＨＣ ｌｉｇａｎｄｓ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｏｔｉｆｓ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．１９９９ Ｎｏｖ；５０（３−４）：２１３−９）から誘導され得るように、ＨＬＡ結合ペプチドの特定の位置は、典型的に、アンカー残基であり、結合溝を構成するポリペプチド鎖の極性、電気物理的、疎水性、および空間特性によって画定されるＨＬＡ受容体の結合モチーフと適合する、コア配列を形成する。したがって当業者は、既知のアンカー残基を維持することで、配列番号１〜配列番号２２５、配列番号２２６〜配列番号５４２または配列番号５４３〜配列番号１０１６に記載されるアミノ酸配列を修飾でき、このような変異型が、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子に結合する能力を維持するかどうかを判定できる。本発明の変異型は、活性化ＣＴＬのＴＣＲに結合する能力を維持して、それは引き続いて細胞と交差反応して、本発明の態様で定義されるような同族ペプチドの天然アミノ酸配列を含有するポリペプチドを発現する細胞を殺滅し得る。
Ｔ細胞受容体との相互作用に実質的に寄与しないアミノ酸残基は、その組み込みが、Ｔ細胞反応性に実質的に影響を及ぼさず、関連ＭＨＣとの結合を排除しない、別のアミノ酸での置換によって修飾され得る。したがって与えられた但し書きを除いて、本発明のペプチドは、与えられたようなアミノ酸配列またはそれらの部分または変異体を含む、任意のペプチド（本発明者らは、その用語にオリゴペプチドまたはポリペプチドを含める）であってもよい。
より長いペプチドもまた、適切であってもよい。ＭＨＣクラスＩエピトープは、通常は８〜１１アミノ酸長であるが、実際のエピトープを含むより長いペプチドまたはタンパク質から、ペプチドプロセッシングによって作成することも可能である。実際のエピトープ側面に位置する残基は、プロセッシング中に実際のエピトープを曝露させるのに必要なタンパク質分解切断に、実質的に影響を及ぼさない残基であることが好ましい。
したがって、本発明は、ＭＨＣクラスＩエピトープのペプチドおよび変異型もまた提供し、ペプチドまたは変異型は、８〜１００、好ましくは８〜３０、最も好ましくは８〜１４、すなわち８、９、１０、１１、１２、１３、１４アミノ酸の全長を有し、クラスＩＩ結合ペプチドの場合は、長さはまた、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２アミノ酸であり得る。
もちろん、本発明によるペプチドまたは変異型は、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩの分子に結合する能力を有する。ペプチドまたは変異体のＭＨＣ複合体への結合は、当該技術分野で既知の方法によって試験されてもよい。
本発明の特に好ましい実施形態では、ペプチドは、配列番号１〜配列番号２２５、配列番号２２６〜配列番号５４２または配列番号５４３〜配列番号１０１６に記載のアミノ酸配列からなり、またはそれから本質的になる。
「から本質的になる」は、本発明によるペプチドが、配列番号１〜配列番号２２５、配列番号２２６〜配列番号５４２または配列番号５４３〜配列番号１０１６のいずれかに記載の配列またはそれらの変異体に加えて、ＭＨＣ分子エピトープのためのエピトープとして機能するペプチドの一部を必ずしも構成しない、追加的なＮおよび／またはＣ末端に位置するアミノ酸の一続きの配列を含有することを意味するものとする。
それでもなお、これらの配列は、本発明によるペプチドの細胞への効率的な導入を提供する上で重要であり得る。本発明の一実施形態では、ペプチドは、例えば、ＮＣＢＩ、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ００４９７に由来する、ＨＬＡ−ＤＲ抗原関連不変鎖の８０個のＮ末端アミノ酸を含んでなる、融合タンパク質である（ｐ３３、以下の「Ｉｉ」）。その他の融合物中では、本発明のペプチドは、本明細書に記載されるような抗体、またはその機能的部分に、特に抗体の配列中に、前記抗体によって特異的に標的化されるように融合し得て、または例えば樹状細胞に対して特異的な抗体に、またはその中に融合し得る。
さらにペプチドまたは変異型は、より強力な免疫応答を引き起こすために、安定性および／またはＭＨＣ分子への結合を改善するようにさらに修飾されてもよい。ペプチド配列のこのような最適化方法は当該技術分野で周知であり、例えば、逆ペプチド結合または非ペプチド結合の導入が挙げられる。
逆ペプチド結合中では、アミノ酸残基はペプチド（−ＣＯ−ＮＨ−）結合によって連結せず、ペプチド結合が逆転する。このようなレトロ−インベルソペプチド模倣剤は、例えば、参照により本明細書に援用される、Ｍｅｚｉｅｒｅ ｅｔ ａｌ（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９，３２３０−３２３７に記載されるものなどの、当該技術分野で公知の方法を使用して製造されてもよい。このアプローチは、側鎖の方向でなく骨格に関与する変化を含有する、擬ペプチド生成に関与する。Ｍｅｚｉｅｒｅ ｅｔ ａｌ（１９９７）は、ＭＨＣ結合およびＴヘルパー細胞応答のために、これらの擬ペプチドが有用であることを示す。ＣＯ−ＮＨペプチド結合の代わりにＮＨ−ＣＯ結合を含有するレトロ−インバースペプチドは、タンパク質分解に対してはるかにより高い耐性がある。
非ペプチド結合は、例えば、−ＣＨ２−ＮＨ、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、および−ＣＨ２ＳＯ−である。米国特許第４，８９７，４４５号明細書は、標準手順によって合成されるポリペプチド、およびＮａＣＮＢＨ３の存在下でアミノアルデヒドとアミノ酸を反応させることで合成される非ペプチド結合が関与する、ポリペプチド鎖中で非ペプチド結合（−ＣＨ２−ＮＨ）を固相合成する方法を提供する。
上述の配列を含んでなるペプチドは、それらのアミノおよび／またはカルボキシ末端に存在する追加的な化学基と共に合成されて、ペプチドの安定性、生物学的利用能、および／または親和性が向上されてもよい。例えば、カルボベンゾキシル、ダンシル、またはｔ−ブチルオキシカルボニル基などの疎水性基が、ペプチドのアミノ末端に付加されてもよい。同様に、アセチル基または９−フルオレニルメトキシカルボニル基が、ペプチドのアミノ末端に配置されてもよい。さらに、疎水性基、ｔ−ブチルオキシカルボニル、またはアミド基が、ペプチドのカルボキシ末端に付加されてもよい。
さらに、本発明のペプチドは、それらの立体配置を改変させるように合成されてもよい。例えば、通常のＬ異性体でなく、ペプチドのアミノ酸残基の１つまたは複数のＤ異性体が使用されてもよい。なおもさらに、本発明のペプチドのアミノ酸残基の少なくとも１つは、良く知られている非天然起源アミノ酸残基の１つで置換されてもよい。これらのような変化は、本発明のペプチドの安定性、生物学的利用能および／または結合作用の増大に役立ってもよい。
同様に、本発明のペプチドまたは変異体は、ペプチド合成の前または後のどちらかに、特異的アミノ酸を反応させることで、化学的に修飾されてもよい。このような修飾の例は、当該技術分野で周知であり、例えば、参照により本明細書に援用される、Ｌｕｎｄｂｌａｄ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，３ｒｄ ｅｄ．ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，２００５に要約される。アミノ酸の化学修飾としては、これに限定されるものではないが、アシル化、アミド化、アミジン化、リジンのピリドキシル化、還元アルキル化、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）によるアミノ基のトリニトロベンジル化、カルボキシル基のアミド修飾、およびシステインからシステイン酸への過ギ酸の酸化によるスルフヒドリル修飾、水銀誘導体形成、その他のチオール化合物との混合ジスルフィド形成、マレイミドとの反応、ヨード酢酸またはヨードアセトアミドによるカルボキシメチル化、およびアルカリ性ｐＨでのシアネートによるカルバモイル化による修飾が挙げられるが、これに限定されるものではない。この点において、当業者は、タンパク質の化学修飾に関するより詳細な手順について、Ｃｈａｐｔｅｒ １５ ｏｆ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｅｄｓ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ ＮＹ １９９５−２０００）を参照されたい。
簡単に述べると、例えばタンパク質中のアルギニル残基の修飾は、付加体を形成するためのフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、および１，２−シクロヘキサンジオンなどの、隣接するジカルボニル化合物の反応に基づくことが多い。別の例は、メチルグリオキサールとアルギニン残基の反応である。システインは、リジンおよびヒスチジンなどのその他の求核性部位の同時の修飾なしに修飾され得る。その結果、多数の試薬がシステイン修飾のために利用可能である。Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈなどの会社のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ）が、特定の試薬に関する情報を提供する。
タンパク質中のジスルフィド結合の選択的還元もまた、一般的である。ジスルフィド結合は、生物医薬品の加熱処理中に形成されて酸化され得る。
ウッドワード試薬Ｋを使用して、特定のグルタミン酸残基が修飾されてもよい。Ｎ−（３−（ジメチルアミノ）プロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミドを使用して、リジン残基とグルタミン酸残基の間に分子内架橋が形成され得る。
例えばジエチルピロ炭酸は、タンパク質中のヒスチジル残基修飾のための試薬である。ヒスチジンはまた、４−ヒドロキシ−２−ノネナールを使用して修飾され得る。
リジン残基およびその他のα−アミノ基の反応物は、例えば、ペプチドの表面への結合またはタンパク質／ペプチド架橋で有用である。リジンはポリ（エチレン）グリコールの付着部位であり、タンパク質のグリコシル化の主要な修飾部位である。
タンパク質中のメチオニン残基は、例えば、ヨードアセトアミド、ブロモエチルアミン、およびクロラミンＴによって修飾され得る。
テトラニトロメタンおよびＮ−アセチルイミダゾールを使用して、チロシル残基が修飾され得る。ジチロシンの形成を通じた架橋は、過酸化水素／銅イオンによって達成され得る。
トリプトファンの修飾に関する最近の研究では、Ｎ−ブロモサクシニミド、臭化２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジルまたは３−ブロモ−３−メチル−２−（２−ニトロフェニルメルカプト）−３Ｈ−インドール（ＢＰＮＳ−スカトール）が使用された。
ＰＥＧによる治療用タンパク質およびペプチドの成功裏の修飾が、循環半減期の延長と関係することが多い一方で、タンパク質と、グルタルアルデヒド、ポリエチレングリコールジアクリレート、およびホルムアルデヒドとの架橋は、ハイドロゲル調製のために使用される。免疫療法のためのアレルゲンの化学修飾は、カリウムシアネートを用いたカルバミル化によって達成されることが多い。
ペプチドが修飾されまたは非ペプチド結合を含む、ペプチドまたは変異型は、本発明の好ましい実施形態である。通常、ペプチドおよび変異体（少なくともアミノ酸残基の間にペプチド結合を含有するもの）は、Ｌｕｋａｓ ｅｔ ａｌ．（Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｕｎｄｅｒ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ−ｆｌｏｗ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．Ｍａｙ １９８１；７８（５）：２７９１−２７９５）、およびその中の参考文献で開示されるようなＦｍｏｃ−ポリアミド型固相ペプチド合成で合成されてもよい。一時的なＮ−アミノ基保護は、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基によってもたらされる。この高度に塩基不安定性の保護基の反復性切断は、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド中の２０％ピペリジンを使用して実施される。側鎖機能性は、それらのブチルエーテル（セリン、スレオニン、およびチロシンの場合）、ブチルエステル（グルタミン酸およびアスパラギン酸の場合）、ブチルオキシカルボニル誘導体（リジンおよびヒスチジンの場合）、トリチル誘導体（システインの場合）、および４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル誘導体（アルギニンの場合）として保護されてもよい。グルタミンまたはアスパラギンがＣ末端残基である場合、側鎖アミド官能基を保護するために、４，４’−ジメトキシベンズヒドリル基が活用される。固相担体は、ジメチルアクリルアミド（骨格−単量体）、ビスアクリロイルエチレンジアミン（架橋剤）、およびアクリロイルサルコシンメチルエステル（機能化因子）の３つの単量体から構成される、ポリジメチル−アクリルアミドポリマーをベースとする。使用されるペプチド−対−樹脂の切断可能な結合因子は、酸不安定性４−ヒドロキシメチル−フェノキシ酢酸誘導体である。逆転Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシル−カルボジイミド／１ヒドロキシベンゾトリアゾール媒介性共役手順を使用して付加される、アスパラギンおよびグルタミンを除く全てのアミノ酸誘導体は、それらのあらかじめ形成された対称的な無水物誘導体として添加される。全ての共役および脱保護反応は、ニンヒドリン、トリニトロベンゼンスルホン酸またはイサチン（ｉｓｏｔｉｎ）試験手順を使用してモニターされる。合成完了時に、５０％スカベンジャー混合物を含有する９５％トリフルオロ酢酸での処理によって、ペプチドは樹脂担体から切断され、側鎖保護基が同時に除去される。一般に使用されるスカベンジャーとしては、エタンジチオール、フェノール、アニソール、および水が挙げられ、正確な選択は、合成されるペプチドの構成アミノ酸に左右される。ペプチドの合成のための固相法と溶液相法の組み合わせもまた、可能である（例えば、Ｂｒｕｃｋｄｏｒｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４およびその中で引用される参考文献を参照されたい）。
トリフルオロ酢酸は真空蒸発によって除去され、引き続くジエチルエーテルとの磨砕は、粗製ペプチドをもたらす。存在する任意のスカベンジャーは、単純な抽出処理によって除去され、それは水相の凍結乾燥時に、スカベンジャーを含まない粗製ペプチドを与える。ペプチド合成のための試薬は、例えば、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（ＵＫ）Ｌｔｄ，Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ ＮＧ７ ２ＱＪ，ＵＫから一般に入手できる。
精製は、再結晶化、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、および（通常は）例えばアセトニトリル／水勾配分離を使用した逆相高速液体クロマトグラフィーなどの技術の任意の１つまたは組み合わせによって、実施されてもよい。
ペプチドの分析は、薄層クロマトグラフィー、電気泳動法、特にキャピラリー電気泳動法、固相抽出（ＣＳＰＥ）、逆相高速液体クロマトグラフィー、酸加水分解後のアミノ酸分析、高速原子衝撃（ＦＡＢ）質量分光分析、ならびにＭＡＬＤＩおよびＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ質量分光分析を使用して実施されてもよい。
本発明のさらなる態様は、本発明のペプチドまたはペプチド変異体をエンコードする核酸（例えばポリヌクレオチド）を提供する。ポリヌクレオチドは、それがペプチドをコードしさえすれば、例えば、単鎖および／または二本鎖のいずれかのＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組み合わせであってもよく、または例えばホスホロチオエート骨格があるポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドの未変性または安定化形態であってもよく、それはイントロンを含有してもまたはしなくてもよい。もちろん、天然起源ペプチド結合によって連結する天然アミノ酸残基を含有するペプチドのみが、ポリヌクレオチドによってエンコード可能である。本発明のなおもさらなる態様は、本発明によるポリペプチドを発現する能力がある、発現ベクターを提供する。
例えば相補的付着端を通じて、ポリヌクレオチド、特にＤＮＡをベクターに連結する、多様な方法が開発されている。例えば、ベクターＤＮＡに挿入されるＤＮＡ断片に、相補的ホモポリマー配列が付加され得る。次に、相補的ホモポリマー尾部間の水素結合によって、ベクターとＤＮＡ断片が連結されて、組換えＤＮＡ分子が形成する。
１つまたは複数の制限酵素認識部位を含有する合成リンカーは、ＤＮＡ断片をベクターに連結する代替え方法を提供する。多様な制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する合成リンカーは、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，ＣＮ，ＵＳＡをはじめとするいくつかの供給元から、商業的に入手できる。
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを修飾する望ましい方法は、Ｓａｉｋｉ ＲＫ，ｅｔ ａｌ．（Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｓｉｃｋｌｅ ｃｅｌｌ ａｎｅｍｉａ ａｎｄ ｂｅｔａ−ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ｗｉｔｈ ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｌｌｙ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ＤＮＡ ａｎｄ ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｏｂｅｓ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．１９８８ Ｓｅｐ １；３１９（９）：５３７−４１）で開示されるようなポリメラーゼ連鎖反応を用いる。この方法は、例えば適切な制限酵素認識部位を改変することで、ＤＮＡを適切なベクターに導入するために使用されてもよく、またはそれは、当該技術分野で既知のその他の有用な様式でＤＮＡを修飾するために使用されてもよい。ウイルスベクターを使用するのであれば、ポックスウイルスまたはアデノウイルスベクターが好ましい。
次にＤＮＡ（またはレトロウイルスベクターの場合はＲＮＡ）を適切な宿主中で発現させて、本発明のペプチドまたは変異体を含んでなるポリペプチドが製造されてもよい。このようにして、本明細書に含まれる教示を考慮して適切に修正された既知の技術に従って、本発明のペプチドまたは変異体をコードするＤＮＡを使用して、発現ベクターが構築されてもよく、次にそれを使用して、本発明のポリペプチドの発現および製造のために、適切な宿主細胞が形質転換される。このような技術としては、米国特許第４，４４０，８５９号明細書、米国特許第４，５３０，９０１号明細書、米国特許第４，５８２，８００号明細書、米国特許第４，６７７，０６３号明細書、米国特許第４，６７８，７５１号明細書、米国特許第４，７０４，３６２号明細書、米国特許第４，７１０，４６３号明細書、米国特許第４，７５７，００６号明細書、米国特許第４，７６６，０７５号明細書、および米国特許第４，８１０，６４８号明細書で開示されるものが挙げられる。
本発明の化合物を構成するポリペプチドをエンコードするＤＮＡ（またはレトロウイルスベクターの場合はＲＮＡ）は、適切な宿主への導入のために、多種多様なその他のＤＮＡ配列に連結されてもよい。コンパニオンＤＮＡは、宿主の性質、ＤＮＡの宿主への導入様式、およびエピソームの維持または組み込みが所望されるかどうかに左右される。
一般に、ＤＮＡは、発現のための適切な方向および正しい読み枠で、プラスミドなどの発現ベクター中に挿入される。必要ならば、ＤＮＡは、所望の宿主によって認識される、適切な転写および翻訳制御調節ヌクレオチド配列に連結されてもよいが、このような調節は、一般に発現ベクター内で利用できる。次に、標準的な技術を通じて、ベクターが宿主に導入される。一般に、宿主の全てがベクターによって形質転換されるわけではない。したがって、形質転換された宿主細胞を選択することが必要になる。一選択技術は、抗生物質耐性などの形質転換細胞内で選択可能な形質をコードする、任意の必要な制御要素があるＤＮＡ配列を発現ベクター内に組み込むことを伴う。
代案としては、このような選択可能な形質の遺伝子は、所望の宿主細胞を同時形質転換するのに使用される、別のベクター上にあり得る。
次に本明細書で開示される教示を考慮して、当業者に知られている適切な条件下で十分な時間にわたり、本発明の組換えＤＮＡによって形質転換された宿主細胞を培養してポリペプチドの発現を可能にし、次にそれを回収し得る。
細菌（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、酵母（例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、糸状菌（例えばアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ））、植物細胞、動物細胞、および昆虫細胞をはじめとする多数の発現系が知られている。好ましくは、細胞系は、ＡＴＣＣ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手できるＣＨＯ細胞などの哺乳類細胞であり得る。
構成的発現のための典型的な哺乳類細胞ベクタープラスミドは、適切なポリＡ尾部と、ネオマイシンなどの耐性マーカーとがある、ＣＭＶまたはＳＶ４０プロモーターを含んでなる。一例は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡから入手できるｐＳＶＬである。誘導性哺乳類発現ベクターの一例であるｐＭＳＧもまた、Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手できる。有用な酵母プラスミドベクターは、ｐＲＳ４０３−４０６およびｐＲＳ４１３−４１６であり、通常、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ ９２０３７，ＵＳＡから入手できる。プラスミドｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５、およびｐＲＳ４０６は、酵母組み込みプラスミド（ＹＩｐｓ）であり、酵母の選択可能なマーカーＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２、およびＵＲＡ３が組み込まれている。プラスミドｐＲＳ４１３−４１６は、酵母セントロメアプラスミド（Ｙｃｐｓ）である。ＣＭＶプロモーターベースのベクター（例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）は、一過性または安定性発現、細胞質内発現または分泌、およびＦＲＡＧ、３ｘＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃまたはＭＡＴの様々な組み合わせでのＮ末端またはＣ末端標識付けを提供する。これらの融合タンパク質は、組換えタンパク質を検出、精製、および分析できるようにする。二重標識融合物は、検出に融通性を与える。
強力なヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター調節領域は、ＣＯＳ細胞内において、構成タンパク質発現レベルを１ｍｇ／Ｌ程度の高さに上昇させる。効力がより低い細胞系では、タンパク質レベルは、典型的に約０．１ｍｇ／Ｌである。ＳＶ４０複製起点の存在は、ＳＶ４０複製許容ＣＯＳ細胞内で、高レベルのＤＮＡ複製をもたらす。例えば、ＣＭＶベクターは、細菌細胞内のｐＭＢ１（ｐＢＲ３２２の誘導体）複製起点、細菌内のアンピシリン耐性選択のためのｂ−ラクタマーゼ遺伝、ｈＧＨポリＡ、およびｆ１起点を含有し得る。プレプロトリプシンリーダー（ＰＰＴ）配列を含有するベクターは、抗ＦＲＡＧ抗体、樹脂、およびプレートを使用した精製のために、培養液中へのＦＲＡＧ融合タンパク質分泌を誘導し得る。多様な宿主細胞で使用するためのその他のベクターおよび発現系が、当該技術分野で周知である。
別の実施形態では、本発明の２つ以上のペプチドまたはペプチド変異型がコードされ、したがって順次発現される（「数珠玉構造」コンストラクトに類似する）。その際に、ペプチドまたはペプチド変異型は、例えばＬＬＬＬＬＬなどの一続きのリンカーアミノ酸によって、共に連結または融合してもよく、またはそれらの間のいかなる追加的なペプチドもなしに連結してもよい。
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドベクターコンストラクトで形質転換された宿主細胞にも関する。宿主細胞は、原核または真核生物のどちらかであり得る。細菌細胞は、いくつかの状況では、好ましい原核宿主細胞であってもよく、典型的には、例えば、Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡから入手できる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５株、およびＲｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡの米国微生物系統保存機関（ＡＴＣＣ）から入手できるＲＲ１（ＡＴＣＣ番号３１３４３）などの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株である。好ましい真核宿主細胞としては、酵母、昆虫、および哺乳類細胞、好ましくはマウス、ラット、サルまたはヒト線維芽および結腸細胞系に由来するものなどの脊椎動物細胞が挙げられる。酵母宿主細胞としては、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ ９２０３７，ＵＳＡから一般に入手できる、ＹＰＨ４９９、ＹＰＨ５００、およびＹＰＨ５０１が挙げられる。好ましい哺乳類宿主細胞としては、ＡＴＣＣからＣＣＬ６１として入手できるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＡＴＣＣからＣＲＬ１６５８として入手できるＮＩＨ Ｓｗｉｓｓマウス胚細胞ＮＩＨ／３Ｔ３、ＡＴＣＣからＣＲＬ１６５０として入手できるサル腎臓由来ＣＯＳ−１細胞、およびヒト胎児由来腎臓細胞である２９３細胞が挙げられる。好ましい昆虫細胞は、バキュロウイルス発現ベクターで形質移入され得るＳｆ９細胞である。発現のための適切な宿主細胞の選択に関する概説は、例えば、Ｐａｕｌｉｎａ Ｂａｌｂａｓ ａｎｄ Ａｒｇｅｌｉａ Ｌｏｒｅｎｃｅ”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｒｅｖｉｅｗｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，”Ｐａｒｔ Ｏｎｅ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＩＳＢＮ ９７８−１−５８８２９−２６２−９による教科書、および当業者に知られているその他の文献にある。
本発明のＤＮＡコンストラクトによる適切な細胞宿主の形質転換は、典型的に使用されるベクターのタイプに左右される、周知の方法によって達成される。原核宿主細胞の形質転換に関しては、例えば、Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９，２１１０，ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照されたい。酵母細胞の形質転換は、Ｓｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ（１９８６）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹに記載される。Ｂｅｇｇｓ（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ ２７５，１０４−１０９の方法もまた有用である。脊椎動物細胞に関しては、このような細胞を形質移入するのに有用である、例えばリン酸カルシウムおよびＤＥＡＥ−デキストランまたはリポソーム製剤などの試薬は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ｏｒ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ ２０８７７，ＵＳＡから入手できる。電気穿孔もまた、細胞を形質転換および／または形質移入するのに有用であり、酵母細胞、細菌細胞、昆虫細胞、および脊椎動物細胞を形質転換する技術分野で周知である。
成功裏に形質転換された細胞、すなわち本発明のＤＮＡコンストラクトを含有する細胞は、ＰＣＲなどの周知の技術によって同定され得る。代案としては、上清タンパク質の存在は、抗体を使用して検出され得る。
例えば、細菌、酵母、および昆虫細胞などの本発明の特定の宿主細胞は、本発明のペプチドの調製において有用であることが理解されるであろう。しかしその他の宿主細胞が、特定の治療法において有用であってもよい。例えば、樹状細胞などの抗原提示細胞は、それらが適切なＭＨＣ分子内に負荷されてもよいように、本発明のペプチドを発現するために有用に使用されてもよい。したがって、本発明は、本発明による核酸または発現ベクターを含んでなる宿主細胞を提供する。
好ましい実施形態では、宿主細胞は、抗原提示細胞、特に樹状細胞または抗原提示細胞である。前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）を含有する組換え融合タンパク質が負荷されたＡＰＣは、無症候性または微小症候性転移性ＨＲＰＣを治療するために、２０１０年４月２０日に米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって認可された（シプロイセル−Ｔ）（Ｓｍａｌｌ ＥＪ，ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｈａｓｅ ＩＩＩ ｔｒｉａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ｓｉｐｕｌｅｕｃｅｌ−Ｔ（ＡＰＣ８０１５）ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ，ａｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２００６ Ｊｕｌ １；２４（１９）：３０８９−９４．Ｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ｐｒｏｓｔａｔｉｃ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｐｕｌｓｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ（ｐｒｏｖｅｎｇｅ）ｐｌｕｓ ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｅｒｏｌｏｇｉｃ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ａｆｔｅｒ ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ ｌｏｃａｌ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃａｎｃｅｒ．２００６ Ｊｕｌ １；１０７（１）：６７−７４）。
本発明のさらなる態様は、宿主細胞を培養するステップと、宿主細胞またはその培養液からペプチドを単離するステップとを含んでなる。ペプチドまたはその変異型を製造する方法を提供する。
別の実施形態では、本発明のペプチド、核酸または発現ベクターは、医療で使用される。例えば、ペプチドまたはその変異型は、静脈内（ｉ．ｖ．）注射、皮下（ｓ．ｃ．）注射、皮内（ｉ．ｄ．）注射、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射、筋肉内（ｉ．ｍ．）注射のために調合されてもよい。ペプチド注射の好ましい方法としては、ｓ．ｃ．、ｉ．ｄ．、ｉ．ｐ．、ｉ．ｍ．、およびｉ．ｖ．が挙げられる。ＤＮＡ注射の好ましい方法としては、ｉ．ｄ．、ｉ．ｍ．、ｓ．ｃ．、ｉ．ｐ．、およびｉ．ｖ．が挙げられる。例えば５０μｇ〜１．５ｍｇ、好ましくは１２５μｇ〜５００μｇのペプチドまたはＤＮＡの用量が投与されてもよく、それぞれのペプチドまたはＤＮＡに左右される。この範囲の用量は、以前の治験で成功裏に使用された（Ｗａｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １８，１２５４−１２６１（２０１２））。
本発明の別の態様は、生体外Ｔ細胞を、適切な抗原提示細胞の表面に発現される抗原負荷ヒトＭＨＣ分子に、Ｔ細胞を抗原特異的様式で活性化するのに十分な時間にわたり接触させるステップを含んでなる、活性化Ｔ細胞を製造するインビトロ法を含み、抗原は本発明によるペプチドである。好ましくは、抗原提示細胞と共に、十分な量の抗原が使用される。
好ましくは、哺乳類細胞は、ＴＡＰペプチド輸送体を欠き、またはそのレベルまたは機能が低下している。ＴＡＰペプチド輸送体を欠く適切な細胞としては、Ｔ２、ＲＭＡ−Ｓ、およびショウジョウバエ細胞が挙げられる。ＴＡＰは、抗原処理に関連する輸送体である。
ヒトペプチド負荷欠損細胞系Ｔ２は、１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０８５２，ＵＳＡの米国微生物系統保存機関からカタログ番号ＣＲＬ１９９２の下に入手でき；ショウジョウバエ細胞系Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ系統２は、カタログ番号ＣＲＬ１９８６３の下にＡＴＣＣから入手でき；マウスＲＭＡ−Ｓ細胞系は、Ｋａｒｒｅ ｅｔ ａｌ １９８５（Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎ，Ｈ．−Ｇ．，ａｎｄ Ｋ．Ｋａｒｒｅ．１９８５．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６２：１７４５）に記載される。
好ましくは、宿主細胞は、形質移入前に、ＭＨＣクラスＩ分子を実質的に発現しない。刺激因子細胞が、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＣＡＭ−１、およびＬＦＡ３のいずれかなどのＴ細胞のための共刺激シグナルを提供する上で、重要な分子を発現することもまた好ましい。多数のＭＨＣクラスＩ分子および共刺激因子分子の核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋおよびＥＭＢＬデータベースから公的に入手可能である。
ＭＨＣクラスＩエピトープが抗原として使用される場合、Ｔ細胞はＣＤ８陽性ＣＴＬである。
抗原提示細胞が形質移入されて、このようなエピトープを発現する場合、好ましくは細胞は、配列番号１〜配列番号２２５、配列番号２２６〜配列番号５４２または配列番号５４３〜配列番号１０１６またはその変異アミノ酸配列を含有するペプチドを発現する能力がある、発現ベクターを含んでなる。
生体外でＣＴＬを生成するために、その他のいくつかの方法が使用されてもよい。例えば、自己由来腫瘍浸潤性リンパ球が、ＣＴＬを生成するために使用され得る。Ｐｌｅｂａｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ（１９９５）（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９５ Ｊｕｎ；２５（６）：１７８３−７）は、ＣＴＬの調製において自己由来末梢血リンパ球（ＰＬＢ）を利用する。さらに、樹状細胞をペプチドまたはポリペプチドでパルス処理する、または組換えウイルスで感染させることによる、自己由来ＣＴＬの製造も可能である。Ｂ細胞もまた、自己由来ＣＴＬの製造で使用され得る。さらに、ペプチドまたはポリペプチドでのマクロファージパルス、または組換えウイルスによる感染が、自己ＣＴＬの調製で使用されてもよい。Ｓ．Ｗａｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．２００３（Ｃｕｔｔｉｎｇ ｅｄｇｅ：ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ａｖｉｄｉｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｏｎ ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ ＭＨＣ／ａｎｔｉ−ＣＤ２８−ｃｏａｔｅｄ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３ Ｎｏｖ １５；１７１（１０）：４９７４−８）は、これも選択されたペプチドに対するＴ細胞を生成するための適切な方法である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を使用した、Ｔ細胞の生体外プライミングを記載する。本発明では、ビオチン：ストレプトアビジン生化学によって、あらかじめ形成されたＭＨＣ：ペプチド複合体を表面ポリスチレン粒子（ミクロビーズ）に共役することで、ａＡＰＣが生成された。このシステムは、ａＡＰＣ上のＭＨＣ密度の正確な調節を可能にし、それは、血液サンプルから高効率で、高または低結合活性の抗原特異的Ｔ細胞応答を選択的に引き起こすことを可能にする。ＭＨＣ：ペプチド複合体の他に、ａＡＰＣは、それらの表面に共役する、抗ＣＤ２８抗体のような共刺激活性があるその他のタンパク質を保有すべきである。さらにこのようなａＡＰＣベースのシステムは、例えばサイトカイン様インターロイキン１２などの適切な可溶性因子の付加を要することが多い。
Ｔ細胞の調製において、同種異系細胞もまた使用されてもよく、方法は、参照によって本明細書に援用される、国際公開第９７／２６３２８号パンフレットで詳述される。例えば、ショウジョウバエ細胞およびＴ２細胞に加えて、その他の細胞を使用して、ＣＨＯ細胞、バキュロウイルス感染昆虫細胞、細菌、酵母、ワクシニア感染標的細胞などの抗原が提示されてもよい。さらに植物ウイルスが使用されてもよい（例えば、外来性ペプチド提示のための高収率系としてのササゲモザイクウイルスの開発が記載される、Ｐｏｒｔａ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｃｏｗｐｅａ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ ａｓ ａ ｈｉｇｈ−ｙｉｅｌｄｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｒｅｉｇｎ ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．１９９４ Ａｕｇ １；２０２（２）：９４９−５５を参照されたい）。
本発明のペプチドに対する活性化Ｔ細胞は、治療法において有用である。したがって、本発明のさらなる態様は、前述の本発明の方法によって入手可能な活性化Ｔ細胞を提供する。
上記方法によって製造される活性化Ｔ細胞は、配列番号１〜配列番号２２５、配列番号２２６〜配列番号５４２または配列番号５４３〜配列番号１０１６のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する細胞を選択的に認識する。
好ましくは、Ｔ細胞は、そのＴＣＲを通じた、ＨＬＡ／ペプチド複合体（例えば結合）との相互作用によって、細胞を認識する。Ｔ細胞は、その標的細胞が、本発明のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する患者において、標的細胞を死滅させる方法で有用であり、患者には、有効数の活性化Ｔ細胞が投与される。患者に投与されるＴ細胞は、患者に由来して、上述のように活性化されてもよい（すなわちそれらは自己Ｔ細胞である）。代案としては、Ｔ細胞は、患者でなく別の個人に由来する。もちろん、個人が健常人であれば、それが好ましい。「健常人」によって、本発明者らは、個人が概して健康良好であり、好ましくは有能な免疫系を有して、より好ましくは容易に検査され検出され得る任意の疾患に罹患していないことを意味する。
生体内では、本発明によるＣＤ８陽性Ｔ細胞の標的細胞は、腫瘍細胞（これは時にＭＨＣクラスＩＩを発現する）および／または腫瘍（腫瘍細胞）周囲の間質細胞であり得る（これも時にＭＨＣクラスＩＩを発現する；（Ｄｅｎｇｊｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００６））。
本発明のＴ細胞は、治療用組成物の活性成分として使用されてもよい。したがって、本発明は、上で定義されるようなＴ細胞の有効数を患者に投与するステップを含んでなる、本発明のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する標的細胞を患者において死滅させる方法もまた提供する。
「異常に発現される」によって、本発明者らは、正常な発現レベルと比較して、ポリペプチドが過剰発現されること、または腫瘍がそれに由来する組織では遺伝子がサイレントであるが、腫瘍ではそれが発現されることもまた意味する。「過剰発現」によって、本発明者らは、ポリペプチドが、正常組織に存在するレベルの少なくとも１．２倍のレベルで；好ましくは正常組織に存在するレベルの少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも５倍または１０倍のレベルで存在することを意味する。
Ｔ細胞は、例えば、上で記載されるものなどの当該技術分野で公知の方法によって得られてもよい。
Ｔ細胞のこのいわゆる養子免疫伝達のためのプロトコルは、当該技術分野で周知である。概説は、Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ａｄｏｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ：ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｏｎ ｓｕｃｃｅｓｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６ Ｍａｙ；６（５）：３８３−９３．Ｒｅｖｉｅｗ．およびＭｏｒｇａｎ ＲＡ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｆｔｅｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００６ Ｏｃｔ ６；３１４（５７９６）：１２６−９）にある。
本発明の任意の分子、すなわちペプチド、核酸、抗体、発現ベクター、細胞、活性化ＣＴＬ、Ｔ細胞受容体またはそれをエンコードする核酸は、免疫応答を逃れた細胞によって特徴付けられる障害の治療に有用である。したがって本発明の任意の分子は、薬剤として、または薬剤の製造において使用されてもよい。分子は、単独で、または本発明のその他の分子または既知の分子との組み合わせで、使用されてもよい。
好ましくは、本発明の薬剤は、ワクチンである。それは、患者に直接、罹患臓器に、または全身的に、ｉ．ｄ．、ｉ．ｍ．、ｓ．ｃ．、ｉ．ｐ．、およびｉ．ｖ．投与され、または生体外で患者またはヒト細胞系に由来する細胞に適用されて、それが引き続いて患者に投与され、または生体外で使用されて患者に由来する免疫細胞の亜集団が選択され、次にそれが患者に再投与されてもよい。核酸が、生体外で細胞に投与される場合、インターロイキン２などの免疫刺激サイトカインを同時発現させるように、細胞を形質移入することが有用なこともある。ペプチドは、実質的に純粋であり、または免疫刺激アジュバント（下記参照）と組み合わされ、または免疫賦活性サイトカインと併用され、または例えばリポソームなどの適切な送達系によって投与されてもよい。ペプチドはまた、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）またはマンナンなどの適切な担体に共役されてもよい（国際公開第９５／１８１４５号パンフレット、およびＬｏｎｇｅｎｅｃｋｅｒ，１９９３を参照されたい）。ペプチドはまた、標識されてもよく、融合タンパク質であってもよく、またはハイブリッド分子であってもよい。その配列が本発明に記載されるペプチドは、ＣＤ４またはＣＤ８ Ｔ細胞を刺激することが予測される。しかし、ＣＤ８ＣＴＬの刺激は、ＣＤ４Ｔヘルパー細胞によって提供される援助の存在下で、より効率的である。したがって、ＣＤ８ＣＴＬを刺激するＭＨＣクラスＩエピトープでは、ハイブリッド分子の融合パートナーまたはセクションは、適切にはＣＤ４陽性Ｔ細胞を刺激するエピトープを提供する。ＣＤ４およびＣＤ８刺激エピトープは、当該技術分野で周知であり、本発明で同定されたものが含まれる。
一態様では、ワクチンは、配列番号１〜配列番号１０１６に記載されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのペプチドと、少なくとも１つの追加的なペプチド、好ましくは２〜５０、より好ましくは２〜２５、なおもより好ましくは２〜２０、最も好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８個のペプチドとを含んでなる。ペプチドは、１つまたは複数の特異的ＴＡＡから誘導されてもよく、ＭＨＣクラスＩ分子に結合してもよい。
別の態様では、ワクチンは、配列番号１〜配列番号２２５、配列番号２２６〜配列番号５４２または配列番号５４３〜配列番号１０１６に記載されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのペプチドと、少なくとも１つの追加的なペプチド、好ましくは２〜５０、より好ましくは２〜２５、なおもより好ましくは２〜２０、最も好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８個のペプチドとを含んでなる。ペプチドは、１つまたは複数の特異的ＴＡＡから誘導されてもよく、ＭＨＣクラスＩ分子に結合してもよい。
ポリヌクレオチドは、実質的に純粋であり、または適切なベクターまたは送達系に含有されてもよい。核酸は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組み合わせであってもよい。このような核酸をデザインして導入する方法は、当該技術分野で周知である。概説は、例えば、（Ｐａｓｃｏｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ ｓｔｉｍｕｌａｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．２００５ Ａｕｇ；６２（１５）：１７５５−６２）によって提供される。ポリヌクレオチドワクチンは調製が容易であるが、免疫応答誘導におけるこれらのベクターの作用機序は、完全には分かっていない。適切なベクターおよび送達系としては、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルスまたは２つ以上のウイルスの構成要素を含有するハイブリッドベースのシステムなどのウイルスＤＮＡおよび／またはＲＮＡが挙げられる。非ウイルス送達系としては、カチオン性脂質およびカチオン性ポリマーが挙げられ、ＤＮＡ送達技術分野で周知である。「遺伝子銃」などを通じた物理的送達もまた、使用されてもよい。核酸によってコードされるペプチド（単数）またはペプチド（複数）は、例えば、上述のように、それぞれの逆ＣＤＲのＴ細胞を刺激する、エピトープとの融合タンパク質であってもよい。
本発明の薬剤は、１つまたは複数のアジュバントもまた含んでもよい。アジュバントは、抗原に対する免疫応答（例えば、ＣＴＬおよびヘルパーＴ（ＴＨ）細胞によって媒介される免疫応答）を非特異的に促進または増強する物質であり、したがって本発明の薬剤で有用であると考えられる。適切なアジュバントとしては、１０１８ ＩＳＳ、アルミニウム塩、ＡＭＰＬＩＶＡＸ（登録商標）、ＡＳ１５、ＢＣＧ、ＣＰ−８７０、８９３、ＣｐＧ７９０９、ＣｙａＡ、ｄＳＬＩＭ、フラジェリンまたはフラジェリンに由来するＴＬＲ５リガンド、ＦＬＴ３リガンド、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＣ３０、ＩＣ３１、イミキモド（ＡＬＤＡＲＡ（登録商標））、レシキモド、ＩｍｕＦａｃｔ ＩＭＰ３２１、ＩＬ−２やＩＬ−１３やＩＬ−２１などのインターロイキン、インターフェロンαまたはβまたはそのペグ化誘導体、ＩＳパッチ、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、ＩＳＣＯＭｓ、ＪｕｖＩｍｍｕｎｅ（登録商標）、ＬｉｐｏＶａｃ、ＭＡＬＰ２、ＭＦ５９、モノホスホリルリピドＡ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＭＳ １３１２、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ２０６、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ５０Ｖ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ−５１、油中水型および水中油型エマルション、ＯＫ−４３２、ＯＭ−１７４、ＯＭ−１９７−ＭＰ−ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、ＯｓｐＡ、ＰｅｐＴｅｌ（登録商標）ベクター系、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）［ＰＬＧ］ベースおよびデキストラン微粒子、ｔａｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ ＳＲＬ１７２、ビロソームおよびその他のウイルス様粒子、ＹＦ−１７Ｄ、ＶＥＧＦ ｔｒａｐ、Ｒ８４８、β−グルカン、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、サポニンに由来するＡｑｕｉｌａ’ｓ ＱＳ２１ ｓｔｉｍｕｌｏｎ、マイコバクテリア抽出物および合成細菌細胞壁模倣物、およびＲｉｂｉ’ｓ ＤｅｔｏｘまたはＱｕｉｌまたはＳｕｐｅｒｆｏｓなどのその他の独自仕様のアジュバントが挙げられるが、これに限定されるものではない。フロイントまたはＧＭ−ＣＳＦなどのアジュバントが好ましい。樹状細胞およびそれらの調製物に対して特異的な、いくつかの免疫学的アジュバント（例えばＭＦ５９）が、以前記載されている（Ａｌｌｉｓｏｎ ａｎｄ Ｋｒｕｍｍｅｌ，１９９５ Ｔｈｅ Ｙｉｎ ａｎｄ Ｙａｎｇ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ． １９９５ Ｎｏｖ １０；２７０（５２３８）：９３２−３．Ｒｅｖｉｅｗ）。サイトカインもまた使用されてもよい。数種のサイトカインは、樹状細胞のリンパ組織（例えばＴＮＦ−）への移動に影響を与えること、Ｔリンパ球（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、およびＩＬ−４）のための効率的な抗原提示細胞への樹状細胞の成熟を加速すること（その内容全体を参照によって本明細書に具体的に援用する米国特許第５，８４９，５８９号明細書）、および免疫増強剤（例えば、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２３、ＩＬ−７、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β）として作用することと、直接関連づけられている（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ，１９９６ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒｓ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ Ｎａｔ Ｍｅｄ．１９９６ Ｏｃｔ；２（１０）：１０９６−１０３）。
ＣｐＧ免疫賦活性オリゴヌクレオチドもまた、ワクチン環境において、アジュバント効果を促進することが報告されている。理論により拘束されることなく、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、主にＴＬＲ９を通じた、内在的（非適応性）免疫系の活性化によって作用する。ＣｐＧ誘発性ＴＬＲ９活性化は、ペプチドまたはタンパク質抗原、生または死滅ウイルス、樹状細胞ワクチン、自己細胞ワクチン、そして予防的および治療的ワクチンの双方における多糖コンジュゲートをはじめとする、多種多様な抗原に対する、抗原特異的体液性および細胞性応答を増強する。より重要なことには、それは樹状細胞の成熟と分化を促進し、ＣＤ４ Ｔ細胞援助の不在下であってさえも、ＴＨ１細胞の活性化促進、および強力な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）生成をもたらす。ＴＬＲ９刺激によって誘導されるＴＨ１バイアスは、常態ではＴＨ２バイアスを促進するミョウバンまたは不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）などのワクチンアジュバント存在下であってさえも維持される。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、その他のアジュバントと共に調合または同時投与された際に、または微粒子、ナノ粒子、脂質エマルションなどの調合物、または類似調合物中で、なおもより高いアジュバント活性を示し、それは、抗原が比較的弱い場合、強力な応答を誘導するのに特に必要である。それらは免疫応答もまた加速し、いくつかの実験では、ＣｐＧなしの総投与量のワクチンと同等の抗体応答で、抗原用量のほぼ２桁分の低減を可能にする（Ｋｒｉｅｇ，２００６）。米国特許第６，４０６，７０５Ｂ１号明細書は、抗原特異的免疫応答を誘導するためのＣｐＧオリゴヌクレオチド、非核酸アジュバント、および抗原の併用を説明する。ＣｐＧ ＴＬＲ９拮抗薬は、Ｍｏｌｏｇｅｎ（Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）製のｄＳＬＩＭ（二重ステムループ免疫修飾物質）であり、それは本発明の医薬組成物の好ましい構成要素である。ＲＮＡ結合ＴＬＲ７、ＴＬＲ８および／またはＴＬＲ９などのその他のＴＬＲ結合分子もまた、使用されてもよい。
有用なアジュバントその他の例としては、化学修飾ＣｐＧ（例えば、ＣｐＲ、Ｉｄｅｒａ）；ポリ（Ｉ：Ｃ）などのｄｓＲＮＡアナログおよびそれらの誘導体（例えばＡｍｐｌｉＧｅｎ（登録商標）、Ｈｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標）、ポリ（ＩＣＬＣ）、ポリ（ＩＣ−Ｒ）、ポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）、非ＣｐＧ細菌ＤＮＡまたはＲＮＡ；ならびにシクロホスファミド、スニチニブ、ベバシズマブ（登録商標）、セレブレックス、ＮＣＸ−４０１６、シルデナフィル、タダラフィル、バルデナフィル、ソラフェニブ、テモゾロマイド、テムシロリムス、ＸＬ−９９９、ＣＰ−５４７６３２、パゾパニブ、ＶＥＧＦＴｒａｐ、ＺＤ２１７１、ＡＺＤ２１７１、抗ＣＴＬＡ４などの免疫活性小型分子および抗体；免疫系の重要な構造体を標的にするその他の抗体（例えば、抗ＣＤ４０、抗ＴＧＦβ、抗ＴＮＦα受容体）；およびＳＣ５８１７５が挙げられるが、これに限定されるものではなく、これらは治療的におよび／またはアジュバントとして作用してもよい。本発明の文脈で有用なアジュバントおよび添加剤の量と濃度は、過度の実験を実施することなく、当業者によって容易に判定され得る。
好ましいアジュバントは、イミキモド、レシキモド、ＧＭ−ＣＳＦ、シクロホスファミド、スニチニブ、ベバシズマブ、インターフェロンα、ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび誘導体、ポリ（Ｉ：Ｃ）および誘導体、ＲＮＡ、シルデナフィル、およびＰＬＧまたはビロソーム微粒子調合物である。
本発明による薬剤組成物の好ましい実施形態では、アジュバントは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、サルグラモスチム）、シクロホスファミド、イミキモド、レシキモド、およびインターフェロンαなどのコロニー刺激因子からなる群から選択される。
本発明による医薬組成物の好ましい実施形態では、アジュバントは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、サルグラモスチム）、シクロホスファミド、イミキモド（ｉｍｍｉｑｕｉｍｏｄ）、およびレシキモドなどのコロニー刺激因子からなる群から選択される。
本発明による薬剤組成物の好ましい実施形態では、アジュバントは、シクロホスファミド、イミキモドまたはレシキモドである。
なおもより好ましいアジュバントは、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＭＳ １３１２、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ２０、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ５０Ｖ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ−５１、ポリＩＣＬＣ（Ｈｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標））、および抗ＣＤ４０ｍＡＢまたはそれらの組み合わせである。
この組成物は、皮下、皮内、筋肉内などの非経口投与、または経口投与のために使用される。このためには、ペプチドおよび任意選択的にその他の分子が、薬学的に許容可能な、好ましくは水性担体に溶解され、または懸濁される。さらに組成物は、緩衝液、結合剤、ブラスチング剤、希釈剤、フレーバー、潤滑剤などの賦形剤を含有し得る。ペプチドはまた、サイトカインなどの免疫刺激物質と共に投与され得る。このような組成物で使用され得る賦形剤の詳細な一覧は、例えば、Ａ．Ｋｉｂｂｅ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，３ｒｄ Ｅｄ．，２０００，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｐｒｅｓｓから採用され得る。組成物は、腺腫様またはがん性疾患の阻止、予防法および／または治療法のために使用され得る。代表的調合物は、例えば、欧州特許第２１１２２５３号明細書にある。
それでもなお、本発明のペプチドの数および物理化学的特性次第で、１２〜１８ヶ月を超えて安定している、ペプチドの特定の組み合わせ、特に２０個を超えるペプチドとの組み合わせのための調合物を提供するために、さらなる研究が必要である。
本発明は、がん、特にＡＭＬ、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、およびその他の血液悪性腫瘍を治療するのに有用な薬剤を提供する。
本発明は、
（ａ）溶液中のまたは凍結乾燥形態の上述の医薬組成物を含有する容器；
（ｂ）任意選択的に、凍結乾燥製剤のための希釈剤または再構成溶液を含有する第２の容器；および
（ｃ）任意選択的に、（ｉ）溶液の使用、または（ｉｉ）凍結乾燥製剤の再構成および／または使用のための取扱説明書
を含んでなるキットをさらに目的とする。
キットは、（ｉｉｉ）緩衝液、（ｉｖ）希釈剤、（Ｖ）濾過、（ｖｉ）針、または（Ｖ）シリンジの１つまたは複数をさらに含んでなってもよい。容器は、好ましくは、ボトル、バイアル、シリンジまたは試験管であり；それは、多回使用容器であってもよい。医薬組成物は、好ましくは凍結乾燥される。
本発明のキットは、好ましくは、適切な容器内の本発明の凍結乾燥製剤と、その再構成および／または使用のための取扱説明書とを含んでなる。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル（例えば二重チャンバーバイアル）、シリンジ（二重チャンバーシリンジなど）、および試験管が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの多様な材料から形成されてもよい。好ましくは、キットおよび／または容器は、容器上の、または容器に付随する、取扱説明を含み、それは再構成および／または使用上の指示を示す。例えば、ラベルは、凍結乾燥製剤が、上述されるようなペプチド濃度に再構成されることを表示してもよい。ラベルは、製剤が皮下投与のために有用であり、または皮下投与用であることをさらに表示してもよい。
製剤を収容する容器は、多回使用バイアルであってもよく、それは再構成製剤の反復投与（例えば２〜６回の投与）を可能にする。キットは、適切な希釈剤（例えば、炭酸水素ナトリウム溶液）を含んでなる、第２の容器をさらに含んでなってもよい。
希釈剤と凍結乾燥製剤の混合時に、再構成製剤中の最終ペプチド濃度は、好ましくは少なくとも０．１５ｍｇ／ｍＬ／ペプチド（＝７５μｇ）であり、好ましくは３ｍｇ／ｍＬ／ペプチド（＝１５００μｇ）以下である。キットは、その他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および取扱説明が掲載されるパッケージインサートをはじめとする、商業的および使用者観点から望ましい、その他の物質をさらに含んでもよい。
本発明のキットは、その他の構成要素（例えば、その他の化合物またはこれらのその他の化合物の医薬組成物）が添加されたまたは添加されない、本発明による医薬組成物製剤を含有する単一容器を有してもよく、または各構成要素のための別個の容器を有してもよい。
好ましくは、本発明のキットは、第２の化合物（アジュバント（例えばＧＭ−ＣＳＦ）、化学療法剤、天然産物、ホルモンまたは拮抗薬、抗血管新生因子または阻害剤、アポトーシス誘発剤またはキレート剤など）またはその医薬組成物の同時投与と合わせて使用するためにパッケージされた、本発明の製剤を含む。キットの構成要素は、あらかじめ混合されてもよく、または各構成要素は、患者への投与前に別個の異なる容器内にあってもよい。キットの構成要素は、１つまたは複数の液体溶液、好ましくは水溶液、より好ましくは無菌水溶液中で、提供されてもよい。またキットの構成要素は、固体として提供されてもよく、それは、好ましくは別の異なる容器内に提供される、適切な溶媒の添加によって液体に変換されてもよい。
治療用キットの容器は、バイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、または固体または液体を封入するその他のあらゆる手段であってもよい。通常、２つ以上の構成要素がある場合、キットは、第２のバイアルまたは別の容器を含有して、別々の投薬を可能にする。キットは、薬学的に許容可能な液体のための別の容器もまた、含有してもよい。好ましくは、治療用キットは、装置（例えば、１本または複数の針、シリンジ、点眼器、ピペットなど）を含有して、本キットの構成要素である本発明の作用物質の投与を可能にする。
本製剤は、経口（腸内）、経鼻、眼、皮下、皮内、筋肉内、静脈内または経皮などの任意の許容できる手段によるペプチド投与に適するものである。好ましくは、投与はｓ．ｃ．であり、最も好ましくはｉ．ｄである。投与は、輸液ポンプによってもよい。
本発明のペプチドは、ＣＬＬから単離されたので、本発明の薬剤は、好ましくはＣＬＬを治療するために使用される。好ましい実施形態では、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ、ＣＤＫ１４、ＲＡＳＧＲＦ１、ＣＤＣＡ７Ｌ、ＣＥＬＳＲ１、ＡＫＡＰ２、ＣＴＤＰ１、ＤＮＭＢＰ、ＴＡＧＡＰ、ＡＢＣＡ６、ＤＭＸＬ１、ＰＡＲＰ３、ＴＰ５３Ｉ１１、Ｂ４ＧＡＬＴ１、ＩＲＦ９、ＫＤＭ２Ｂ、ＴＢＣ１Ｄ２２Ａ、ＺＮＦ２９６、ＢＡＣＨ２、ＰＲＲ１２、ＺＦＡＮＤ５、ＡＴＰ５Ｇ１、ＤＭＤ、ＡＲＩＤ５Ｂ、ＺＮＦ６３８、ＤＤＸ４６、ＲＲＭ２Ｂ、ＢＬＮＫ、ＨＳＨ２Ｄ、ＥＲＰ４４、ＭＥＴＴＬ７Ａ、ＥＬＰ３、ＮＬＲＰ２、ＺＣ３Ｈ１２Ｄ、ＮＥＬＦＥ、ＡＴＰ６Ｖ１Ｃ１、ＨＬＡ−ＤＭＡ、ＴＵＦＭ、ＥＩＦ６、ＣＫＡＰ４、ＣＯＢＬＬ１、ＴＭＥＤ４、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＵＢＬ７、ＣＸｏｒｆ２１、ＡＳＵＮ、ＳＬ２４Ｄ１、およびＴＲＡＦ３ＩＰ３からなる群から選択されるタンパク質に由来する本発明のペプチドはＣＬＬから単離されたので、したがって本発明の薬剤は、好ましくはＣＬＬを治療するために使用される。
本発明は、プレスクリーニングＴＵＭＡＰの貯蔵庫から選択される少なくとも１つのペプチドを含んでなる医薬組成物を製造するステップを含んでなる、個々の患者のための個別化薬剤を製造する方法をさらに含み、医薬組成物で使用される少なくとも１つのペプチドは、個々の患者における適切さについて選択される。好ましくは、医薬組成物はワクチンである。方法はまた、ＴＣＲ単離などの下流用途のためのＴ細胞クローンを製造するように適応させ得る。
「個別化医薬品」は、能動的個別化がんワクチンおよび自己由来患者組織を使用する養子細胞療法をはじめとする、このような個々の患者の治療のためにのみ使用される、１人の個々の患者のために、特に調整された治療法を意味するものとする。
本明細書の用法では、「貯蔵庫」という用語は、特定の腫瘍型における免疫原性および過剰提示についてプレスクリーニングされている、一群のペプチドを指すものとする。「貯蔵庫」という用語は、ワクチンに含まれる特定のペプチドが、予備製造されて物理的設備内で貯蔵されることを暗示することは意図されないが、その可能性も検討される。ペプチドは、製造される各個別化ワクチンのために新規に製造されてもよく、または予備製造されて貯蔵されてもよいことが明示的に検討される。
（例えば、データベースの形態の）貯蔵庫は、分析されたいく人かのＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃ陽性ＣＬＬ患者の腫瘍組織中で、高度に過剰発現される腫瘍関連ペプチドから構成される（上記表を参照されたい）。それは、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩペプチドを含有する。いくつかのＧＢＭ組織から採取された腫瘍関連ペプチドに加えて、貯蔵庫は、ＨＬＡ−Ａ*０２およびＨＬＡ−Ａ*２４標識ペプチドを含有してもよい。これらのペプチドは、ＴＵＭＡＰＳによって誘導されるＴ細胞免疫の規模を定量様式で比較できるようにし、したがって抗腫瘍応答を引き起こすワクチンの能力について、重要な結論が導かれるようにする。第２に、それは、患者において、「自己」抗原に由来するＴＵＭＡＰに対するいかなるワクチン誘導Ｔ細胞応答も観察されない症例において、「非自己」抗原に由来する重要な陽性対照ペプチドとして機能する。第３に、それは、患者集団の免疫能力状態に関する結論が導かれるようにしてもよい。
貯蔵庫のためのＨＬＡクラスＩおよびＩＩ ＴＵＭＡＰは、遺伝子発現解析、質量分析法、およびＴ細胞免疫学と組み合わされた、完全なゲノム機能解析アプローチを使用して同定される。アプローチは、高い割合の腫瘍上に真に存在するが、正常組織では皆無または最小限にのみ発現されるＴＵＭＡＰだけが、さらなる分析のために選択されることを保証する。ペプチド選択のために、患者に由来するＣＬＬサンプルおよび健常ドナーに由来する血液は、段階的アプローチで分析された：
１．悪性物質からのＨＬＡリガンドは、質量分析法によって同定された
２．マイクロアレイによるゲノム規模メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）発現解析を使用して、一連の正常器官および組織と比較して悪性組織（ＣＬＬ）中の遺伝子過剰発現が同定された
３．同定されたＨＬＡリガンドは、遺伝子発現データと比較された。ステップ２で検出された、選択的発現または過剰発現された遺伝子によってコードされたペプチドは、多ペプチドワクチンのための適切なＴＵＭＡＰ候補と見なされた。
４．同定されたペプチドのＴＵＭＡＰとしての妥当性を支持する追加的な証拠を同定するために、文献調査が実施された
５．ｍＲＮＡレベルでの過剰発現の関連性は、ステップ３からの選択されたＴＵＭＡＰの腫瘍組織上における再検出と、健常組織における検出の欠如（またはまれな検出）によって確認された。
６．選択されたペプチドによる生体内Ｔ細胞応答の誘導が可能かどうかを評価するために、健常ドナーならびにＣＬＬ患者からのヒトＴ細胞を使用して、生体外免疫原性アッセイが実施された。
一態様では、ペプチドを貯蔵庫に含める前に、免疫原性について予備スクリーニングする。制限を意図しない一例として、貯蔵庫に包含されるペプチドの免疫原性は、ペプチド／ＭＨＣ複合体および抗ＣＤ２８抗体が負荷された人工抗原提示細胞による、健常ドナーからのＣＤ８＋Ｔ細胞の反復刺激を通じた、生体外Ｔ細胞プライミングを含んでなる方法によって判定される。
この方法は、稀ながんに、そして稀な発現プロファイルがある患者にとって、好ましい。組成が一定である多ペプチド混合物とは対照的に、現在開発されている貯蔵庫は、腫瘍中の抗原の実際の発現とワクチンとの顕著により高いマッチングを可能にする。多標的アプローチでは、各患者のために、選択された単一のまたは組み合わされた数種の「既製」ペプチドが利用される。理論上は、例えば５０個の抗原性ペプチドのライブラリーからの５つの異なる抗原性ペプチドの選択に基づくアプローチは、それだけでおよそ１７００万個の可能な医薬品（ＤＰ）組成物をもたらす。
一態様では、ペプチドは、本明細書に記載される、次のような本発明による方法に基づく、個々の患者のためのそれらの適切さに基づいて、ワクチンへの包含のために選択される。
患者の腫瘍材料および血液サンプルから、ＨＬＡ表現型、トランスクリプトミクスおよびペプチドミクスデータが収集されて、各患者に最も適切なペプチドを含有する、貯蔵庫および患者に特有の（すなわち変異）ＴＵＭＡＰが同定される。患者腫瘍中で選択的にまたは過剰発現されて、可能であれば、患者の個々のＰＢＭＣと共に試験すると、強力な生体外免疫原性を示すペプチドが選択される。
好ましくは、ワクチンに含まれるペプチドは、（ａ）個々の患者に由来する腫瘍サンプルによって提示される腫瘍関連ペプチド（ＴＵＭＡＰ）を同定するステップと；（ｂ）（ａ）で同定されたペプチドを上述のペプチド貯蔵庫と比較するステップと；（ｃ）患者において同定された腫瘍関連ペプチドと関連がある、貯蔵庫（データベース）からの少なくとも１つのペプチドを選択するステップとを含んでなる方法によって同定される。例えば、腫瘍サンプルによって提示されるＴＵＭＡＰは、（ａ１）腫瘍サンプルからの発現データを腫瘍サンプルの組織型に相当する正常組織サンプルからの発現データと比較して、腫瘍サンプル中で過剰発現または異常発現されるタンパク質を同定するステップと；（ａ２）発現データを腫瘍サンプル中のＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ分子と結合するＭＨＣリガンドの配列に相関させて、腫瘍によって過剰発現または異常発現されるタンパク質に由来するＭＨＣリガンドを同定するステップとによって同定される。好ましくは、ＭＨＣリガンドの配列は、腫瘍サンプルから単離されたＭＨＣ分子から結合ペプチドを溶出させて、溶出したリガンドを配列決定することで同定される。好ましくは、腫瘍サンプルおよび正常組織は、同一患者から入手される。
貯蔵庫（データベース）モデルを使用してペプチドを選択するのに加えて、またはその代案として、ＴＵＭＡＰを患者において新規に同定し、次に、ワクチンに含めてもよい。一実施例として、（ａ１）腫瘍サンプルからの発現データを腫瘍サンプルの組織型に相当する正常組織サンプルからの発現データと比較して、腫瘍サンプル中で過剰発現または異常発現されるタンパク質を同定する；そして（ａ２）発現データを腫瘍サンプル中のＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ分子と結合するＭＨＣリガンドの配列と相関させて、腫瘍によって過剰発現または異常発現されるタンパク質に由来するＭＨＣリガンドを同定することによって、患者において候補ＴＵＭＡＰが同定されてもよい。別の実施例として、個々の患者からの正常な対応組織と比較して、腫瘍サンプルに固有の変異を含有するタンパク質が同定されてもよく、特異的に変異を標的とするＴＵＭＡＰが同定され得る。例えば、腫瘍のゲノム、および対応する正常組織のゲノムは、全ゲノム配列決定によって配列決定され得る。遺伝子のタンパク質コード領域中の非同義の変異を発見するために、ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡが腫瘍組織から抽出され、正常な非変異ゲノム生殖細胞系ＤＮＡが末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から抽出される。適用されたＮＧＳアプローチは、タンパク質コード領域の再配列決定（エクソーム再配列決定）に限定される。この目的で、供給業者が提供する標的富化キットを使用して、ヒトサンプルからのエクソンＤＮＡが捕捉され、例えばＨｉＳｅｑ２０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）による配列決定がそれに続く。それに加えて、遺伝子発現の直接定量化のため、そして変異遺伝子が患者の腫瘍で発現されることの検証のために、腫瘍ｍＲＮＡが配列決定される。結果として得られる数百万の配列読み取りは、ソフトウェアアルゴリズムを通じて処理される。出力一覧は、変異および遺伝子発現を含有する。腫瘍特異的体細胞突然変異は、ＰＢＭＣ由来生殖細胞系変異と比較して優先順位をつけることで、判定される。次に、新規に同定されたペプチドは、貯蔵庫について上述した免疫原性について試験され、適切な免疫原性を保持する候補ＴＵＭＡＰが、ワクチンへの包含のために選択されてもよい。
例示的な一実施形態では、ワクチンに包含されるペプチドは、（ａ）上述の方法（ｍｅｔｈｄｏｓ）によって、個々の患者に由来する腫瘍サンプルによって提示される腫瘍関連ペプチド（ＴＵＭＡＰ）を同定する；ｂ）ａ）で同定されたペプチドを、対応する正常組織との比較で腫瘍中の免疫原性および過剰提示について予備選別されたペプチドの貯蔵庫と比較する；（ｃ）患者において同定された腫瘍関連ペプチドと関連がある、貯蔵庫からの少なくとも１つのペプチドを選択する；（ｄ）任意選択的に、（ａ）で新規に同定された少なくとも１つのペプチドを選択して、その免疫原を確認することによって同定される。
例示的な一実施形態では、ワクチンに包含されるペプチドは、（ａ）個々の患者に由来する腫瘍サンプルによって提示される、腫瘍関連ペプチド（ＴＵＭＡＰ）を同定する；（ｂ）（ａ）で新規に同定された少なくとも１つのペプチド選択して、その免疫原性を確認することによって同定される。
ひとたびペプチドが選択されたら、ワクチンが製造される。
ワクチンは、好ましくは、３３％ＤＭＳＯに溶解された個々のペプチドからなる液体製剤である。
製品に包含される各ペプチドは、ＤＭＳＯに溶解される。単一ペプチド溶液の濃度は、製品に包含されるペプチドの数に応じて選択されなくてはならない。単一ペプチドＤＭＳＯ溶液が等量で混合され、ペプチドあたり約２．５ｍｇ／ｍｌの濃度で、製品に包含される全てのペプチドを含有する溶液が得られる。次に混合溶液を注射用水で１：３に希釈して、３３％ＤＭＳＯ中でペプチドあたり０．８２６ｍｇ／ｍｌの濃度を得る。希釈溶液は、０．２２μｍの無菌フィルターを通して濾過される。最終バルク溶液が得られる。
最終バルク溶液はバイアルに充填されて、使用時まで−２０℃で保存される。１本のバイアルは、０．５７８ｍｇの各ペプチドを含有する７００μＬの溶液を含有する。この内、５００μＬ（ペプチドあたりおよそ４００μｇ）が、皮内注射のために適用される。
ここで好ましい実施形態を記載する以下の実施例中で本発明を説明するが、それでもなお、これらには限定されないのものとする。本発明の目的で、本明細書で引用される全ての参考文献は、その内容全体を参照によって援用する。
原発性ＣＬＬサンプルのＨＬＡ表面発現を示す。７つの原発性ＣＬＬサンプル中における、自己由来ＣＤ５−ＣＤ１９＋Ｂ細胞と比較した、ＣＤ５＋ＣＤ１９＋ＣＬＬ細胞の（ａ）ＨＬＡクラスＩおよび（ｂ）ＨＬＡクラスＩＩ発現。データは、三重反復試験の平均値±ｓ．ｄ．として表される。自己由来ＣＤ５−ＣＤ１９＋Ｂ細胞と比較した、ＣＤ５＋ＣＤ１９＋ＣＬＬ細胞の（ｃ）平均ＨＬＡクラスＩおよび（ｄ）ＨＬＡクラスＩＩ発現（ｎ＝７）。*Ｐ＜０．０１略号：ＵＰＮ、画一患者番号 ＨＬＡリガンドームプロファイリングによる、腫瘍関連抗原の新規カテゴリーの同定を示す。（ａ）原発性ＣＬＬサンプル（ｎ＝３０）およびＨＶ ＰＢＭＣのＨＬＡクラスＩリガンド起源タンパク質の重複（ｎ＝３０）。（ｂ）ＣＬＬおよびＨＶ ＰＢＭＣリガンドーム中のＨＬＡ拘束性表示の出現頻度に基づく、ＨＬＡクラスＩリガンド起源タンパク質の比較プロファイリング。それぞれの起源タンパク質のＨＬＡ拘束性提示（ｘ軸）に対して、ＣＬＬ患者／ＨＶ陽性の頻度［％］がｙ軸上に示される。左側のボックスは、＞２０％の患者においてＣＬＬ限定的表示を示す、起源タンパク質の部分集合を強調する（ＬｉＴＡＡ：リガンドーム由来腫瘍関連抗原）。（ｃ）既報のＨＬＡクラスＩリガンドーム中のＣＬＬ関連抗原の表示。バーは、ＣＬＬおよびＨＶ ＰＢＭＣ中のＨＬＡクラスＩリガンドによる、それぞれの抗原の相対表示［％］を示す。破線は、ＣＬＬ関連性の程度に従って、抗原を３群に分ける。（ｄ）異なる病期からのＣＬＬサンプルの起源タンパク質重複（ビネーＡ（ｎ＝９）、ビネーＢ（ｎ＝７）、ビネーＣ（ｎ＝１４））。（ｅ）異なる病期（ビネーＡ〜Ｃ、（ｄ）と同様）にわたるＬｉＴＡＡの表示頻度［％］の色分け地図解析。（ｆ）ｄｅｌ１７ｐあり（ｎ＝５）およびｄｅｌ１７ｐなし（ｎ＝２５）の原発性ＣＬＬサンプル上のＬｉＴＡＡ表示［％］の色分け地図解析。略号：ＣＬＬ、慢性リンパ球性白血病；ＨＶ、健常ボランティア ＬｉＴＡＡが、ＣＬＬ患者免疫応答によって特異的に認識されることを示す。（ａ）ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイで機能的に評価された、ＨＬＡクラスＩ ＬｉＴＡＡおよび対応するＬｉＴＡＰ（３ＨＬＡ−Ａ*０３、５ＨＬＡ−Ａ*０２、５ＨＬＡ−Ｂ*０７）。ＣＬＬ患者ＰＢＭＣによるペプチド特異的免疫認識の絶対数および頻度は、右側カラムに要約される。（ｂ）ＨＶ ＰＢＭＣを対照として使用して、ＥＬＩＳＰＯＴで評価された、Ａ*０３ ＬｉＴＡＰの例。４つの頻繁に認識されるペプチド（．．．．）を含有するＥＢＶエピトープ混合物が陽性対照として使用され、ＨＩＶＧＡＧ１８−２６−Ａ*０３ペプチドが陰性対照の役割を果たした。（ｃ）ＨＬＡ−Ａ*０３ ＬｉＴＡＰ（ｎ＝３）を使用した、３人の異なるＣＬＬ患者のＰＢＭＣ上におけるＥＬＩＳＰＯＴアッセイの例。結果は、免疫反応性のＬｉＴＡＰについて示される。ＥＢＶエピトープは陽性対照の役割を果たし、ＨＩＶＧＡＧ１８〜２６Ａ*０３ペプチドは陰性対照の役割を果たした。（ｄ） 標的選択ストラテジーの内部対照として、ＣＬＬ患者ＰＢＭＣ上で試験された、ＨＬＡ−Ａ*０３良性組織由来ＬｉＢＡＰ（ｎ＝３）の例。ＥＢＶエピトープは陽性対照の役割を果たし、ＨＩＶＧＡＧ１８〜２６Ａ*０３ペプチドは陰性対照の役割を果たした。（ｅ）ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴにおける、（ＭＳによって検出される）ＣＬＬリガンドーム中のＬｉＴＡＰ提示の対立遺伝子補正頻度、および対応するＣＬＬ患者ＰＢＭＣによる免疫認識の対立遺伝子補正頻度の散布図。 データ点は、免疫認識を示す１４／１５ＬｉＴＡＰについて示される。略号：ＬｉＴＡＰ、リガンドーム由来腫瘍関連ペプチド；ＨＶ、健常ボランティア；ｎｅｇ．、陰性；ｐｏｓ．、陽性；ＵＰＮ、画一患者番号ＬｉＢＡＰ、リガンドーム由来良性組織関連ペプチド；ＭＳ、質量分析法。 同上 相加的／相乗的ＨＬＡクラスＩＩ ＬｉＴＡＡおよびＬｉＴＡＰの同定を示す。（ａ）原発性ＣＬＬサンプル（ｎ＝２０）およびＨＶ ＰＢＭＣのＨＬＡクラスＩＩリガンド起源タンパク質の重複（ｎ＝１３）。（ｂ）ＣＬＬおよびＨＶ ＰＢＭＣリガンドーム中のＨＬＡ拘束性表示の出現頻度に基づく、ＨＬＡクラスＩＩリガンド起源タンパク質の比較プロファイリング。それぞれの起源タンパク質のＨＬＡ拘束性提示（ｘ軸）に対して、ＣＬＬ患者／ＨＶ陽性の頻度［％］がｙ軸上に示される。左側のボックスは、＞２０％の患者においてＣＬＬ限定的表示を示す、起源タンパク質の部分集合を強調する（ＬｉＴＡＡ：リガンドーム由来腫瘍関連抗原）。（ｃ）ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイで機能的に評価された、ＨＬＡクラスＩＩ ＬｉＴＡＡおよび対応するＬｉＴＡＰ（ｎ＝６）。ＣＬＬ患者ＰＢＭＣによるペプチド特異的免疫認識の絶対数および頻度は、右側カラムに要約される。（ｄ）ＨＶ ＰＢＭＣを対照として使用して、ＥＬＩＳＰＯＴで評価された、ＨＬＡクラスＩＩ ＬｉＴＡＰの例。ＰＨＡが陽性対照として使用された。ＦＬＮＡ１６６９−１６８３ＨＬＡ−ＤＲペプチドは、陰性対照の役割を果たした。（ｅ） ＨＬＡクラスＩＩ ＬｉＴＡＰ（ｎ＝６）を使用した、３人の異なるＣＬＬ患者のＰＢＭＣ上における、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの例。結果は、免疫反応性のＬｉＴＡＰについて示される。ＰＨＡが陽性対照として使用され、ＦＬＮＡ１６６９−１６８３ＨＬＡ−ＤＲペプチドは、陰性対照の役割を果たした。（ｆ）共通／相乗的ワクチン標的に関する、ＣＬＬ限定的ＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩリガンド起源タンパク質の重複分析。（ｇ）１３２個の共通ＨＬＡクラスＩ／ＩＩＬｉＴＡＡ（（ｄ）で同定される）の色分け地図解析。ＨＬＡクラスＩおよびＩＩ ＣＬＬ患者リガンドームの双方の≧２０％における表示を示す、２つの起源タンパク質が特定化される。 同上 同上 化学／免疫療法を受けたＣＬＬ患者の縦断的ＨＬＡクラスＩリガンドーム解析を示す。治療に先立つそれぞれの存在量と比較した、治療後の患者のＨＬＡクラスＩリガンドーム中のリガンドの相対存在量の火山型プロット（治療後／治療前比率）。破線は、有意に上方制御されたリガンドが右上に、有意に下方制御されたリガンドが左上にある、存在量の有意な変化の閾値（＞２倍の比率、ｐ＜０．０５）を示す。有意に制御されたリガンドの頻度は、それぞれの四分区間で特定化される。治療過程にわたって有意な制御を示すＬｉＴＡＰは赤色で標識されて、それらの配列が特定化される。（ａ）治療前、およびリツキシマブ／ベンダムスチン（３７５ｍｇ／ｍ２／９０ｍｇ／ｍ２）による処置の４８時間／２４時間後における、ＣＬＬ患者リガンドームの解析。検出可能なＬｉＴＡＰの１／２８（３．６％）は、存在量に有意な変化を示した。（ｂ）治療前、およびアレムツズマブによる処置の最初の７日後における、ＣＬＬ患者リガンドームの解析（１、３、および５日目の１０ｍｇ、２０ｍｇ、および３０ｍｇの３用量のアレムツズマブ；７日目のリガンドーム解析）。検出可能なＬｉＴＡＰの３／２４（１２．５％）は、存在量に有意な変化を示した。（ｃ）治療前、および３００ｍｇのオファツムマブによる処置の２４時間後における、ＣＬＬ患者リガンドームの解析。検出可能なＬｉＴＡＰの２／１０（２０．０％）は、存在量に有意な変化を示した。 ＣＬＬ患者のＬｉＴＡＰの免疫認識に対する、患者の後向き生存分析を示す。（ａ）４４人のＣＬＬ患者の全生存期間のカプラン・マイヤープロット。（ｂ）ＬｉＴＡＰ特異的免疫応答について評価された被験者の全生存期間は、次のようにグループ分けされた：黒色、＞１のＬｉＴＡＰに免疫応答を示すＣＬＬ患者（ｎ＝１０）。赤色、０〜１のＬｉＴＡＰに免疫反応を示すＣＬＬ患者（ｎ＝３４）。 ＣＬＬ患者における、ＨＬＡクラスＩリガンド起源タンパク質同定の飽和分析を示す。３０人のＣＬＬ患者における、全ＨＬＡリガンド起源タンパク質同定の関数としての ユニークなＨＬＡリガンド起源タンパク質同定の数指数回帰は、異なる起源タンパク質同定（破線）の最大達成可能数の堅固な計算（Ｒ２＝０．９９１２）を可能にした。点線は、本発明者らのＣＬＬ患者コホートにおいて得られた、起源プロテオームカバー度を描写する。 ＨＬＡ−Ａ*０２およびＢ*０７ ＬｉＴＡＰが、ＣＬＬ患者免疫応答によって特異的に認識されることを示す。標的選択ストラテジーの内部対照として、ＣＬＬ患者ＰＢＭＣ上で試験された、（ａ）ＨＬＡ−Ａ*０２（ｎ＝３）および（ｄ）ＨＬＡ−Ｂ*０７（ｎ＝３）良性組織由来ＬｉＢＡＰの例。ＥＢＶエピトープ混合物は、陽性対照の役割を果たしし、ＨＩＶＸＸｘｘ−ｘｘＡ*０２およびＨＩＶＸＸｘｘ−ｘｘＨＬＡ−Ｂ*０７ペプチドは、それぞれ陰性対照の役割を果たした。ＨＶＰＢＭＣを対照として使用して、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイで評価された、（ｂ）ＨＬＡ−Ａ*０２（ｎ＝６）および（ｅ）ＨＬＡ−Ｂ*０７（ｎ＝５）ＬｉＴＡＰの例。陽性および陰性対照は、（ａ）に記載されるようである。それぞれ（ｃ）ＨＬＡ−Ａ*０２（ｎ＝６）および（ｆ）ＨＬＡ−Ｂ*０７（ｎ＝５）ＬｉＴＡＰを使用した、３人の異なるＨＬＡマッチＣＬＬ患者のＰＢＭＣ上における、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの例。結果は、免疫反応性のＬｉＴＡＰについて示される。陽性および陰性対照は、（ａ）に記載されるようである。略称：ＬｉＢＡＰ、リガンドーム由来良性組織関連ペプチド；ＬｉＴＡＰ、リガンドーム由来腫瘍関連ペプチド；ＨＶ、健常ボランティア；ｎｅｇ．、陰性；ｐｏｓ．、陽性；ＵＰＮ、画一患者番号 同上 ＨＬＡ−Ａ*０３ ＬｉＴＡＰ特異的ＣＬＬ患者Ｔ細胞の細胞内サイトカイン、および四量体染色を示す。（ａ）ＰＡ * ０３ ３ （ＤＭＸＬ１１２７１−１２７９ＳＳＳＧＬＨＰＰＫ（配列番号７７）刺激ＣＬＬ患者ＰＢＭＣのＩＦＮγおよびＴＮＦαの細胞内染色。ＰＭＡ／イオノマイシンは陽性対照の役割を果たし、ＨＩＶＧＡＧ１８〜２６Ａ*０３ペプチドは陰性対照の役割を果たした。（ｂ）ＰＡ * ０３ ３ （ＤＭＸＬ１１２７１−１２７９ＳＳＳＧＬＨＰＰＫ（配列番号：７７））四量体による、ＣＬＬ患者ＣＤ８＋Ｔ細胞の四量体染色。対照として、同一患者における非認識ＰＡ * ０２ １ （ＡＢＣＡ６１２７０−１２７８ＩＬＤＥＫＰＶＩＩ（配列番号６３）による四量体染色が示される。 同上 化学／免疫療法を受けた患者に由来する、原発性ＣＬＬ細胞上のＨＬＡ表面発現の定量化を示す。ＣＤ５＋ＣＤ１９＋ＣＬＬ細胞上のＨＬＡ表面発現は、治療前後にフローサイトメトリーによって定量化された。データは、三重反復試験の平均値±ｓ．ｄ．として表される。治療前およびリツキシマブによる処置の２４時間後における、４人の患者の原発性ＣＬＬ細胞上（ａ）ＨＬＡクラスＩおよび（ｂ）ＨＬＡクラスＩＩ表面発現。治療前、およびアレムツズマブによる処置の７２時間（１０ｍｇ）および７日（６０ｍｇ）後における、患者の原発性ＣＬＬ細胞上の（ｃ）ＨＬＡクラスＩおよび（ｄ）ＨＬＡクラスＩＩ表面発現。*Ｐ＜０．０１略号：ＵＰＮ、画一患者番号ｈ、時間；ｄ、日。 ＣＬＬサンプルと比較した、正常組織中のペプチドＩＬＤＥＫＰＶＩＩの過剰提示を示す。示されるのは、その上でペプチドが検出されたサンプルのみである。検定パネルは、１２個のＣＬＬサンプルおよび以下の正常サンプルを含んだ：１×脂肪組織、３×副腎、６×動脈、５×骨髄、７×脳、３×乳房、５×神経、１３×結腸、７×食道、２×胆嚢、５×心臓、１２×腎臓、２０×肝臓、４４×肺、３×リンパ節、４×末梢血単核細胞、２×卵巣、６×膵臓、１×腹膜、３×下垂体の、２×胎盤、３×胸膜、３×前立腺、６×直腸、７×唾液腺、４×骨格筋、５×皮膚、３×小腸、４×脾臓、５×胃、４×精巣、３×胸線、３×甲状腺、３×気管、２×尿管、５×膀胱、２×子宮、２×静脈。
実施例１
細胞表面に提示される腫瘍関連ペプチドの同定および定量化
組織サンプル
患者の腫瘍サンプルは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｕｂｉｎｇｅｎ，Ｔｕｂｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙによって提供された。全ての患者の告知に基づく同意書が与えられた。リガンドーム解析では、ＣＬＬ患者（＞８０％ＣＬＬ細胞出現頻度）に由来するＰＢＭＣ、ならびに健常ボランティア（ＨＶ）に由来するＰＢＭＣが、密度勾配遠心分離によって単離された。告知に基づく同意は、ヘルシンキプロトコルに従って得られた。この試験は、地域倫理委員会の指針に準拠して実施された。ＨＬＡタイピングは、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｔｕｂｉｎｇｅｎによって実施された。サンプルは、さらなる使用まで−８０℃で保存された。
ＨＬＡ表面発現の定量化
健康な自己由来Ｂリンパ球との比較のために、少なくとも０．５％のＣＤ５−ＣＤ１９＋正常Ｂ細胞を含有する患者サンプル中で、ＨＬＡ表面発現の定量化が実施された。ＨＬＡ表面発現は、ＱＩＦＩＫＩＴ（登録商標）定量的フローサイトメトリーアッセイ（Ｄａｋｏ）を使用して、製造会社の使用説明書に準拠して分析された。手短に述べると、各三つ組み試験サンプルが、汎ＨＬＡクラスＩ特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）Ｗ６／３２、ＨＬＡ−ＤＲ特異的ｍＡｂＬ２４３（どちらも社内で作成）またはＩｇＧアイソタイプ対照（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で、それぞれ染色された。表面マーカー染色は、直接標識ＣＤ３（ＢＤ）、ＣＤ５（ＢＤ）、およびＣＤ１９（ＢＤ）抗体を用いて実施された。ＦＡＣＳＣａｎｔｏ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＢＤ）上のフローサイトメトリー分析の直前に、７−ＡＡＤ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）が生存マーカーとして添加された。
組織サンプルからのＨＬＡペプチドの単離
ＨＬＡクラスＩおよびＩＩ分子は、以前記載されたような標準イムノアフィニティー精製を用いて単離された。手短に述べると、スナップ凍結細胞ペレットが、１×プロテアーゼ阻害剤を含有する（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ、Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、１０ｍＭのＣＨＡＰＳ／ＰＢＳ（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ／Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）中で溶解された。ＨＬＡ分子は、それぞれＣＮＢｒ活性化セファロース（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃｈａｌｆｏｎｔ Ｓｔ Ｇｉｌｅｓ，ＵＫ）に共有結合する、汎ＨＬＡクラスＩ特異的ｍＡｂ Ｗ６／３２および汎ＨＬＡクラスＩＩ特異的ｍＡｂ Ｔｕ３９を使用して、シングルステップで精製された。ＨＬＡ：ペプチド複合体は、０．２％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、Ｍｅｒｃｋ，Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ Ｓｔａｔｉｏｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）の反復添加によって溶出された。溶出画分Ｅ１〜Ｅ８は貯留されて遠心分離濾過ユニット（Ａｍｉｃｏｎ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して、限外濾過によって遊離ＨＬＡリガンドが単離された。ＨＬＡリガンドは、ＺｉｐＴｉｐ Ｃ１８ピペット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）先端を使用して、濾液から抽出され脱塩された。抽出されたペプチドは、３５μｌの８０％アセトニトリル（ＡＣＮ、Ｍｅｒｃｋ）／０．２％ＴＦＡ中で溶出され、完全に乾燥するまで遠心分離され、２５μｌの１％ＡＣＮ／０．０５％ＴＦＡに再懸濁された。サンプルは、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる分析まで、−２０℃で保存された。
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるＨＬＡリガンド解析
ペプチドサンプルは、逆相液体クロマトグラフィー（ｎａｎｏＵＨＰＬＣ、ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００ ＲＳＬＣｎａｎｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）によって分離され、引き続いてオンライン接続されたＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＸＬハイブリッド質量分光計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｈｅｒ）中で分析された。サンプルは、５回の技術的複製中で分析された。５μｌ（サンプルの２０％に相当する）のサンプル容積が、７５μｍ×２ｃｍ捕捉カラム（Ａｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐ ＲＳＬＣ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に、４μｌ／分で５．７５分間にわたり注入された。引き続いてペプチド分離が、５０μｍ×５０ｃｍ分離カラム（Ａｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐ ＲＳＬＣ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）上で、２．４から３２．０％に及ぶＡＣＮ勾配を適用して、５０℃および１７５ｎｌ／分の流速で１４０分間にわたり実施された。溶出ペプチドは、ナノスプレーイオン化によってイオン化され、調査スキャンで最も豊富な５つの前駆イオンのフラグメントスペクトルを生じる、トップ５ＣＩＤ（衝突誘起解離）法を実装する、質量分光計内で分析された。分解能は、６０，０００に設定された。ＨＬＡクラスＩリガンドでは、質量範囲は４００〜６５０ｍ／ｚに限定され、電荷状態２および３が断片化を許された。ＨＬＡクラスＩＩでは、３００〜１，５００ｍ／ｚの質量範囲が分析されて、電荷状態≧２が断片化を許された。
データベース検索およびスペクトル注釈
データ処理のために、ソフトウェアＰｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ（ｖ１．３、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベース（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ、リリース：２０１３年９月２７日；２０，２７９個の概説されるタンパク質配列が含まれる）に含まれるヒトプロテオームに対する、Ｍａｓｃｏｔ検索エンジン（Ｍａｓｃｏｔ ２．２．０４、Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ）の検索結果が組み込まれた。検索は、技術的複製のデータを統合し、酵素特異性によって制限されなかった。前駆体質量許容差は５ｐｐｍに、フラグメント質量許容差は０．５Ｄａに設定された。酸化メチオニンは、動的修飾として許容された。偽発見率（ＦＤＲ）は、シャッフルされた標的データベースからなるデコイデータベースに対するプロセッシングに基づいて、Ｐｅｒｃｏｌａｔｏｒアルゴリズムによって判定された。ＦＤＲは、ｑ≦０．０５（５％ＦＤＲ）の目標値に設定された。ｑ≦０．０５があるペプチドスペクトラムマッチ（ＰＳＭ）は、相加的直交パラメータに従ってフィルターされ、スペクトル品質および妥当性が保証された。Ｍａｓｃｏｔスコアは、≧２０にフィルターされた。ＨＬＡクラスＩでは、ペプチド長は、８〜１２アミノ酸（ａａ）長に限定された。ＨＬＡクラスＩＩでは、ペプチドは、１２〜２５ａａ長に限定された。タンパク質分類は無効にされて、ペプチド（例えば、複数のタンパク質中への保存配列マッピング）の複数の注釈が許された。品質管理のために、サンプル当たり、≧３００のユニークなＨＬＡクラスＩリガンドおよび≧１００のユニークなＨＬＡクラスＩＩリガンドの収率閾値が適用された。ＨＬＡ注釈は、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ（ｗｗｗ．ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｄｅ）または拡張社内データベースを使用して実施された。
治療過程にわたるＣＬＬ患者リガンドームの縦断的解析
治療過程にわたる相対ＨＬＡリガンド存在量の無標識定量化（ＬＦＱ）のために、注射された対合サンプルペプチド量が正規化されて、各サンプル毎に５つの技術的複製で、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析が実施された。
手短に述べると、対合サンプルの物質の相対量は、用量設定質量分析実験で判定され希釈に応じて補正された、平均前駆体イオン強度から計算された。ＨＬＡリガンドの相対定量化は、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ １．３を使用して、対応する前駆体抽出イオンクロマトグラム（ＸＩＣ）の曲線下面積を計算することで実施された。各サンプルの５回のＬＦＱ−ＭＳ実験における個々のペプチドの平均面積の比率が計算され、社内Ｍａｔｌａｂスクリプト（ｖ８．２、Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ）を使用して、両側Ｔ検定が実施された。
ペプチド合成
自動ペプチド合成装置ＥＰＳ２２１（Ａｂｉｍｅｄ）を使用して、記載されるような９−フルオレニルメチル−オキシカルボニル／ｔｅｒｔ−ブチル（Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ）ストラテジーを使用して、ペプチドが合成された。合成ペプチドが、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ同定の検証のため、ならび機能的実験のために使用された。
ペプチド特異的Ｔ細胞の増幅
ＣＬＬ患者および健常ボランティアからのＰＢＭＣが、１０％貯留ヒト型血清（ＰＨＳ、社内製造）、１００ｍＭのβ−メルカプトエタノール（Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＧＥ）が添加されたＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）中で、培養された。ＣＤ８＋Ｔ細胞刺激では、ＰＢＭＣが解凍されて、１μｇ／ｍｌペプチドでパルス処理された。ペプチドパルス処理ＰＢＭＣ（５〜６×１０６細胞／ｍｌ）は、３７℃および５％ＣＯ２で、１２日間培養された。０日目および１．５日目に、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）および５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７（Ｐｒｏｍｏｋｉｎｅ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が、培養液に添加された。３、５、７、および９日目に、２ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）が培養液に添加された。ペプチド刺激ＰＢＭＣは、１２日目にＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって、１３日目に細胞内サイトカイン染色によって、それぞれ機能解析された。ＣＤ４＋Ｔ細胞刺激では、培養は、次の２つの修正を加えて、ＣＤ８＋Ｔ細胞について記載されたようにして実施された：パルス処理は１０μｇ／ｍｌのＨＬＡクラスＩＩペプチドを用いて実施され、ＩＬ−４およびＩＬ−７は添加されなかった。
ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、以前記載されたようにして実施された（３３）。手短に述べると、９６ウェルニトロセルロースプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）が、１ｍｇ／ｍｌのＩＦＮ−γｍＡｂ（Ｍａｂｔｅｃｈ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ，ＵＳＡ）で被覆され、４℃で一晩培養された。プレートは、１０％ＰＨＳによって３７℃で２時間ブロックされた。５×１０５個の細胞／ウェルの予備刺激ＰＢＭＣが、１μｇ／ｍｌ（ＨＬＡクラスＩ）または２．５μｇ／ｍｌ（ＨＬＡクラスＩＩ）ペプチドでパルス処理されて、２４〜２６時間培養された。読み取りは、製造会社の使用説明書に従って実施された。スポットは、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ Ｓ５分析器（ＣＴＬ，ＳｈａｋｅｒＨｅｉｇｈｔｓ，ＯＨ，ＵＳＡ）を使用して計数された。＞１５スポット／ウェルカウントされ、ウェルあたりの平均スポットカウントが、陰性対照ウェルの平均スポット数よりも少なくとも３倍高ければ、Ｔ細胞応答は陽性と見なされた（がんイムノガイディングプログラム（ＣＩＰ）ガイドラインに準拠する）。
細胞内ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α染色
ペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の発生頻度および機能性は、細胞内ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α染色によって分析された。ＰＢＭＣは、１μｇ／ｍｌの個々のペプチドでパルス処理されて、１０μｇ／ｍｌのＢｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）および１０μｇ／ｍｌのＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（ＢＤ）の存在下で６〜８時間培養された。細胞は、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（ＢＤ）、ＣＤ８−ＰＥＣｙ７（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＣＤ４−ＡＰＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＴＮＦ−α−ＰＥ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）、およびＩＦＮ−γ−ＦＩＴＣ（ＢＤ）を使用して標識された。サンプルは、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ上で分析された。
ペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の出現頻度は、抗ＣＤ８およびＨＬＡ：ペプチド−四量体−ＰＥでの染色によって評価された。
結果
原発性ＣＬＬ細胞は自己由来正常Ｂ細胞と比較してＨＬＡ発現の損失または下方制御を示さない
悪性腫瘍中のＨＬＡ損失または下方制御は、Ｔ細胞ベースの免疫療法の主要な限界を提起してもよい。したがって、最初のステップとして、本発明者らは、自己由来ＣＤ１９＋ＣＤ５−Ｂリンパ球と比較して、ＣＤ１９＋ＣＤ５＋ＣＬＬ細胞上で、ＨＬＡ発現レベルを評価した。ＨＬＡ表面レベルは、７人のＣＬＬ患者のパネルにおいて、フローサイトメトリーによって定量化された。ＨＬＡ表面発現レベルは、患者個人不均一性を明らかにし、全ＨＬＡクラスＩ分子カウントは、ＣＬＬ細胞上の約４２，５００〜２８８，５００個の分子／細胞、および正常Ｂ細胞上の約３２，０００〜２５６，５００個の分子／細胞に及ぶ。３連でのＨＬＡ表面発現の患者個人分析は、４／７の患者において、小さいが、有意な発現レベルの差を明らかにした（Ｐ＜０．０１）（図１ａ）。ＨＬＡ−ＤＲ発現は、ＣＬＬ細胞上で約２９，０００〜１００，５００、Ｂ細胞上で約１９，５００〜７９，５００に及んだ。ＨＬＡ−ＤＲレベル（Ｐ＜０．０１）の軽微な差異が、５／７の患者で検出された。正常Ｂ細胞と比較したＣＬＬ細胞上の平均ＨＬＡ表面発現の統計解析は、ＨＬＡクラスＩおよびＩＩ発現に有意な差異がないことを示した（図１ｃ、ｄ）。総合すると、これらのデータは、正常Ｂ細胞との比較してＨＬＡ損失または下方制御の形跡なしに、ＣＬＬ細胞上における高レベルのＨＬＡクラスＩおよびＩＩ発現を示す。
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳは無数の天然に提示されるＨＬＡクラスＩおよびＩＩリガンドを同定する
３０人のＣＬＬ患者のＨＬＡクラスＩリガンドームをマッピングすることで、本発明者らは、７，３７７個の起源タンパク質に相当する全部で１８，８４４個の異なるペプチドを同定し得て、最大達成可能カバー度の＞９５％を達成した（図７）。患者当たりで同定された異なるペプチド数は、３４５〜２，４９７に及んだ（平均値１，１３１）。全体として、３０を超える異なるＨＬＡ−Ａおよび−Ｂ対立遺伝子によって拘束されるペプチド（白人母集団＿ＥＮＲＥＦ＿２７の＞９９％をカバーする）が、この試験で同定された。３０人のＰＢＭＣドナーのＨＶコホートでは、７，１８０個の異なる起源タンパク質に相当する、合計１７，３２２個のユニークなペプチドが同定された（＞９０％カバー度）。ＨＶコホート中のＨＬＡ対立遺伝子分布は、ＣＬＬ患者コホート中のＨＬＡ−Ａの１００％およびＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子の＞８０％をカバーした。
ＨＬＡクラスＩＩリガンドーム解析は、２０人のＣＬＬ患者で実施された。１，４８６個の起源タンパク質に相当する合計５，０５９個のユニークなペプチドが同定された。１３人のＰＢＭＣドナーのＨＬＡクラスＩＩ ＨＶコホートは、７５６個の起源タンパク質に相当する、２，０４６個の異なるペプチドをもたらした。
ＨＬＡクラスＩリガンドームの比較プロファイリングは多数のＣＬＬ関連抗原を明らかにする
新規ＣＬＬ関連抗原を同定するために、本発明者らは、ＣＬＬおよびＨＶコホートのＨＬＡリガンド起源プロテオームを比較した。ＨＬＡ起源タンパク質重複分析は、ＣＬＬのＨＬＡリガンドーム中で、２，１４８個のタンパク質（マッピングされたＣＬＬ起源プロテオームの２９．１％）が、排他的に表示されることを明らかにした（図２ａ）。幅広く適用できる既製ペプチドワクチンを設計する目的で、本発明者らは、引き続いて、以下の基準に従って、可能な標的の選択に優先順位をつけた：
ＣＬＬ排他性は、最重要基準と定義され、ＣＬＬリガンドーム中の表示の出現頻度に従った抗原格付けがそれに続く（図２ｂ）。本発明者らのプラットフォームは、ＣＬＬ患者の≧２０％でＣＬＬ限定的表示を示す、２２５個の異なるＨＬＡリガンドによって表示される、４９個の起源タンパク質（ＣＬＬ起源プロテオームの０．７％）を強調した。同一抗原格付けストラテジーをＨＶ ＰＢＭＣ限定的抗原に適用することで、７１個のリガンドーム由来良性組織結合抗原（ＬｉＢＡＡ）と２９８個の対応するリガンド（ＬｉＢＡＰ）の組が同定され、免疫学的アッセイで内部対照として使用された。
既製ワクチンの設計に適している、広く表示されるＣＬＬ−ＬｉＴＡＡの他に、表示頻度＜２０％の２，０９９個のＣＬＬ限定的抗原の第２のパネルが、本発明者らのプラットフォームによって同定された。これらの標的は、より個別化された治療的アプローチのためのリポジトリとして役立つ。
確立されたＣＬＬ関連抗原に由来する天然に提示されるＨＬＡクラスＩリガンドのＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる検出
新規ＣＬＬ関連抗原の同定と並んで、二次的アプローチは、天然に提示されるＨＬＡリガンドの本データセット内の小数の確立されたＣＬＬ抗原の格付けに焦点を合わせた。本発明者らは、８個の記載されるＣＬＬ関連抗原に相当する、２８個の異なるＨＬＡリガンドを同定できた。注目すべきことに、フィブロモジュリン（ＦＭＯＤ−３２４−３３３、ＲＩＮＥＦＳＩＳＳＦ、ＨＬＡ−Ａ*２３（配列番号５２６）のみが、ＣＬＬ患者コホートにおける低い表示出現頻度のために、本データセット中のＣＬＬ抗原の＃４３７に格付けされるＣＬＬ限定的表示を示した。残りの７個の抗原は、ＣＬＬ上およびＨＶ ＰＢＭＣ双方の上で表示を示し、したがってＣＬＬ排他性という最重要基準を満たせなかった。しかし、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＲＨＡＭＭ、およびＰＲＡＭＥでは、様々な程度のＣＬＬ関連過剰出現が検出された（図２ｃ）。
比較リガンドームプロファイリングは異なる病期およびリスク層で共有されるＬｉＴＡＡを同定する
異なる病期にわたる新規標的の適用性を評価するために、本発明者らは、ビネーＡ（ｎ＝９）、Ｂ（ｎ＝７）、およびＣ（ｎ＝１４）の病期にある患者を比較する、部分集合特異的リガンドームプロファイリングを実施した。２，１４８個のＣＬＬ排他的起源タンパク質の重複分析からは、それらの内５５０個（２５．６％）が、少なくとも２つの病期で共有され、１３７個のタンパク質（６．１％）のコアグループが、全ての３つの病期にある患者で表示されることが分かった（図２ｄ）。注目すべきことに、共通起源タンパク質のコアグループに属するＬｉＴＡＡの４５／４９（９１．８％）は、３つの部分集合の全てで表示された。ビネー病期Ａ、Ｂ、およびＣにわたる、全ての４９個のＬｉＴＡＡの表示頻度の色分け地図解析は、図２ｅに示される。
もう一つの焦点は、この遺伝的逸脱がない患者（ｎｏ ｄｅｌ１７ｐ、ｎ＝２５）と比較して、１７ｐ１３欠失（ｄｅｌ１７ｐ、ｎ＝５）を保有する高リスク患者の部分集合におけるＬｉＴＡＡの表示を判定することに置かれた。本発明者らは、同定されたＬｉＴＡＡの７７．７％が、双方の部分集合で表示されることを発見した（図２ｆ）。総合して、これらのデータは、幅広く適用できる標的を選択するための、考案されたＨＬＡリガンドームのコホート構成解析ストラテジーを支持する。
ＨＬＡクラスＩ ＬｉＴＡＰの機能特性解析はＣＬ関連免疫反応性を明らかにする
本発明者らのＨＬＡクラスＩ ＬｉＴＡＰの免疫原性および特異性を評価するために、本発明者らは、次に、１２日間免疫復活ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施した。１５個のＬｉＴＡＰ（６Ａ*０２、４Ａ*０３、および５Ｂ*０７ ＬｉＴＡＰｓ）のパネルが、ＣＬＬ患者および健常ボランティアから得られたＨＬＡマッチＰＢＭＣの刺激のために実装された（図３ａ）。本発明者らは、ＣＬＬ患者（３／４Ａ*０３（図３ｃ）、６／６Ａ*０２および５／５Ｂ*０７ ＬｉＴＡＰ（図８ｃ、ｆ））では、試験されたＬｉＴＡＰの１４／１５（９３．３％）についてＩＦＮγ分泌を観察したが、健常対照では見られなかった（０／１０、図３ｂ、図８ｂ、ｅ）。これらの知見は、ＰＡ * ０３ ３ （ＤＭＸＬ１１２７１−１２７９ＳＳＳＧＬＨＰＰＫ）について、ＣＤ８＋Ｔ細胞の四量体染色、およびＩＦＮγとＴＮＦαの細胞内サイトカイン染色によって、例示的に確認された（図９ａ、ｂ）。ＨＬＡマッチ良性組織由来ＬｉＢＡＰを使用したＥＬＩＳＰＯＴアッセイが実施されて、ＣＬＬ患者において観察されたＬｉＴＡＰ指向免疫認識のＣＬＬ特異性が調節された。本発明者らは、９個のＬｉＢＡＰ（３個のＡ*０２、３個のＡ*０３、３個の*Ｂ*０７）のパネルを試験して、試験されたＣＬＬ患者のいずれにおいても、有意なＩＦＮγ分泌がないことを観察した（０／７Ａ*０３（図３ｄ）、０／１０Ａ*０２＋、および０／５Ｂ*０７（図８ａ、ｄ））。
１人以上の患者で免疫認識を示す１４／１５のＬｉＴＡＰについて、本発明者らは、ＣＬＬ患者における、（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって検出される）ＨＬＡ拘束性提示の対立遺伝子補正頻度、および（ＥＬＩＳＰＯＴによって検出される）免疫反応性の頻度を計算した。際だったことに、これらの２つのパラメータの線形相関が観察された（ピアソンｒ＝０．７７、Ｒ２＝０．５９、図３ｅ）。これらの知見は、２つの主要な点を示唆する：第１に、腫瘍限定的表示は、免疫認識のための必要条件である。第２に、免疫認識の出現頻度は、免疫反応性ＬｉＴＡＰのＨＬＡ拘束性提示の出現頻度から、直接、推定され得る。総合して、これらのデータは、ＣＬＬ特異的ペプチドワクチンの免疫学的に妥当な標的を同定する、本発明者らのアプローチの有効性を実証する。
ＨＬＡクラスＩＩリガンドーム解析は相乗的ワクチン設計のための追加的なＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを同定する
ＣＤ４＋Ｔ細胞が抗がん免疫応答において果たす重要な間接的および直接的役割の理由から、最適ワクチン設計は、追加的なＨＬＡクラスＩＩエピトープの組み入れを必要とする。本発明者らは、ＣＬＬおよびＨＶ ＰＢＭＣリガンドームの重複分析を実施して、ＣＬＬ患者のリガンドーム中で、９３７個のタンパク質（同定されたＣＬＬ起源タンパク質の６３．０％）が排他的に表示されることを同定した（図４ａ）。ＨＬＡクラスＩについて記載される同一抗原格付けストラテジーを適用することで、本発明者らは、４６０個の対応するＬｉＴＡＰによって表示される、７３個のＨＬＡクラスＩＩ ＬｉＴＡＡを同定した（図４ｂ）。ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおける７個のＨＬＡクラスＩＩ ＬｉＴＡＰのパネルの機能特性解析（図４ｃ）は、ＣＬＬ患者（図４ｅ）では、６／７（８５．７％）ＬｉＴＡＰについて有意なＩＦＮγ分泌を明らかにしたが、健常対照（０／１０、図４ｄ）では見られなかった。次に、本発明者らは、共通の相乗的標的を同定するために、ＨＬＡクラスＩおよびＩＩリガンドームの複合解析を実施した。ＣＬＬ限定的起源タンパク質の重複分析は、１３２個のタンパク質が、ＨＬＡクラスＩおよびＩＩリガンドームの双方で表示されることを明らかにした（図４ｆ）。色分け地図解析は、リガンドーム（Ｂ４ＧＡＬＴ１（２６．７％クラスＩ／３０．０％クラスＩＩ）、ＨＬＡ−ＤＭＡ（２０．０％クラスＩ／２０％クラスＩＩ）、図４ｇ）の双方で≧２０％の表示頻度を提示する２個のタンパク質を同定した。際だったことに、クラスＩ ＬｉＴＡＰ（ＨＬＡ−ＤＭＡ２０６−２１４、ＨＥＩＤＲＹＴＡＩ、Ｂ*１８）の１つは、対応するＨＬＡクラスＩＩ ＬｉＴＡＰ（ＶＴＨＥＩＤＲＹＴＡＩＡＹ（配列番号９２４））に完全に包埋されていることが明らかにされた。総合して、本発明者らは、Ｔ細胞エピトープとして確認し得たクラスＩＩ ＬｉＴＡＰのパネル、並びにクラスＩ ＬｉＴＡＡをカバーする一連の可能な相乗的ＨＬＡクラスＩＩリガンドを同定した。
異なる薬剤投与計画下のＣＬＬ患者リガンドームの縦断的解析
ペプチドベースの免疫療法の範囲は、ＭＲＤの維持療法および根除である。結果として、ＣＬＬにおけるペプチドワクチン接種は、標準化学／免疫療法後に行われる。したがって、本発明者らは、異なる薬剤投与計画が実施されたＣＬＬ患者の異なる時点にわたり、ＨＬＡ発現を解析して、リガンドームプロファイリングを実施した。
本発明者らは、リツキシマブ治療（Ｒｔ０ｈ、Ｒｔ２４ｈ）を受けた４人の患者、およびアレムツズマブ（Ａｔ０ｈ、Ａｔ７２ｈ、Ａｔ７ｄ、図１０ａ〜ｄ）を投与された１人の患者において、ＨＬＡクラスＩおよびＩＩ表面発現を定量化した。ＨＬＡ表面発現は、いずれの治療計画過程においても、平均ＨＬＡクラスＩ（Ｒｔ０ｈ＝５０，５００、Ｒｔ２４ｈ＝４８，０００；Ａｔ０ｈ＝４２，５００、Ａｔ７ｄ＝６１，５００）発現、およびＨＬＡクラスＩＩ（Ｒｔ０ｈ＝３６，５００、Ｒｔ２４ｈ＝２７，５００；Ａｔ０ｈ＝４７，０００、Ａｔ７ｄ＝５５，５００）発現の有意な変化を伴わない、患者個人の不均一性を示した。
リツキシマブ−ベンダムスチン、アレムツズマブまたはオファツムマブ療法をそれぞれ受けた個々の患者において、縦断的ＨＬＡクラスＩリガンドームプロファイリングが実施された（図５ａ〜ｃ）。リツキシマブ−ベンダムスチン療法下では、ＨＬＡクラスＩリガンドの１１．１％に、オファツムマブ療法下ではリガンドの２１．６％に、アレムツズマブ療法下ではリガンドの３３．６％に、差次的提示（≦２倍の変化、ｐ≧０．０５）が観察された。全体として、８／４９（１６．３％）のＬｉＴＡＡに相当するＬｉＴＡＰが、治療過程にわたって示差的に提示されることが明らかにされた。総合すると、これらのデータは、異なる治療過程にわたる、表面ＨＬＡの安定発現およびＬｉＴＡＰの堅固な提示を示す。
ＬｉＴＡＰに対する免疫応答はＣＬＬ患者の全生存期間改善と関係があるかもしれない
最終段階として、本発明者らは、＞１のＬｉＴＡＰ特異的（ｎ＝１０）Ｔ細胞応答と対比して、０〜１のＬｉＴＡＰ特異的（ｎ＝２３）Ｔ細胞応答がある症例を比較するＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって分析された（図６ｂ）、３３人のＣＬＬ患者の後向き生存分析を実施した（図６ａ）。低応答コホートでは６／２３（２６．１％）の患者、高応答コホートでは０／１１の患者が死亡した。全生存期間は、＞１免疫反応を示すコホートで長期化するようである。
実施例２
ペプチドの合成
全てのペプチドは、Ｆｍｏｃストラテジーを使用する、標準的な十分に確立された固相ペプチド合成を使用して合成された。分取ＲＰ−ＨＰＬＣによる精製後、イオン交換法を実施して、生理学的適合性カウンターイオン（例えばトリフルオロ酢酸、酢酸、アンモニウムまたは塩化物）が組み込まれた。
個々のペプチドのアイデンティティーおよび純度は、質量分析法および分析用ＲＰ−ＨＰＬＣによって判定された。ペプチドは、イオン交換法後に、純度が９０％〜９９．７％の白色から灰白色凍結乾燥物として得られた。
全てのＴＵＭＡＰは、好ましくはトリフルオロ酢酸塩または酢酸塩として投与され、その他の塩形態もまた可能である。実施例４の測定では、ペプチドのトリフルオロ酢酸塩を使用した。
実施例３
ＭＨＣ結合アッセイ
本発明によるＴ細胞ベースの治療法のための候補ペプチドは、それらのＭＨＣ結合能力（親和性）についてさらに試験された。個々のペプチドＭＨＣ複合体は、切断感受性ペプチドが切断されて、分析される関心のあるペプチドで交換される、ペプチドリガンド交換によって製造された。ペプチド受容性ＭＨＣ分子と効果的に結合して安定化し得るペプチド候補のみが、ＭＨＣ複合体の分離を防止する。交換反応の収率を判定するために、安定化ＭＨＣ複合体の軽鎖（β２ｍ）の検出に基づくＥＬＩＳＡを実施した。アッセイは、概して、Ｒｏｄｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．（Ｒｏｄｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．１（２００６）：１１２０−１１３２）に記載されるようにして実施された。
９６ウェルＭＡＸＩＳｏｒｐプレート（ＮＵＮＣ）が、ＰＢＳ中の２μｇ／ｍｌストレプトアビジンにより室温で一晩被覆されて、４回洗浄され、ブロック緩衝液を含有する２％ＢＳＡ中で３７℃で１時間ブロックされた。再折りたたみされたＨＬＡ−Ａ*０２０１／ＭＬＡ−００１単量体が、１５〜５００ｎｇ／ｍｌの範囲をカバーする標準物質の役割を果たした。ＵＶ交換反応のペプチド−ＭＨＣ単量体は、ブロック緩衝液中で１００倍に希釈された。サンプルは、３７℃で１時間インキュベートされて、４回洗浄され、２ｕｇ／ｍｌのＨＲＰ共役結合抗β２ｍと共に３７℃で１時間インキュベートされ、再度洗浄されて、ＮＨ２ＳＯ４で停止させたＴＭＢ溶液で検出された。吸光は、４５０ｎｍで測定された。抗体またはそれらのフラグメント、および／またはＴ細胞受容体またはそれらのフラグメントの作成および製造のためには、高い交換収率（好ましくは５０％よりも高い、最も好ましくは高い７５％よりも）を示す候補ペプチドが、ＭＨＣ分子に対する十分な結合活性を示してＭＨＣ複合体の分離を防止することから、一般に好ましい。
試験されたペプチドのＭＨＣクラスＩ結合スコア；＜２０％＝＋；２０％〜４９％＝＋＋；５０％〜７５％＝＋＋＋；＞＝７５％＝＋＋＋＋
実施例４
ＭＨＣクラスＩ提示ペプチドの生体外免疫原性
本発明のＴＵＭＡＰの免疫原性に関する情報を得るために、本発明者らは、ペプチド／ＭＨＣ複合体および抗ＣＤ２８抗体を負荷した人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）によるＣＤ８＋Ｔ細胞の反復刺激に基づく、生体外Ｔ細胞プライミングアッセイを用いて調査を実施した。このようにして、本発明者らは、本発明のＨＬＡ−Ａ*０２０１拘束性ＴＵＭＡＰの免疫原性を示し得て、これらのペプチドが、それに対するＣＤ８＋前駆Ｔ細胞がヒトに存在する、Ｔ細胞エピトープであることを実証した。
ＣＤ８＋Ｔ細胞の生体外プライミング
ペプチドＭＨＣ複合体（ｐＭＨＣ）および抗ＣＤ２８抗体を負荷した、人工抗原提示細胞による生体外刺激を実施するために、本発明者らは、最初に、告知に基づく同意後に、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｃｌｉｎｉｃｓ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙから得られた健常ドナーのＣＤ８ミクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ−Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した正の選択を通じて、新鮮ＨＬＡ−Ａ*０２白血球除去生成物からＣＤ８＋Ｔ細胞を単離した。
ＰＢＭＣおよび単離ＣＤ８＋リンパ球またはＰＢＭＣは、１０％熱不活性化ヒトＡＢ血清（ＰＡＮ−Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｉｄｅｎｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ），１００Ｕ／ｍｌペニシリン／１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ），１ｍＭピルビン酸ナトリウム（ＣＣ Ｐｒｏ，Ｏｂｅｒｄｏｒｌａ，Ｇｅｒｍａｎｙ），２０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（Ｃａｍｂｒｅｘ）を添加した、ＲＰＭＩ−Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）からなるＴ細胞培地（ＴＣＭ）中で、使用時まで培養された。２．５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）および１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａ，Ｎｕｒｎｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）もまた、この段階でＴＣＭに添加された。
ｐＭＨＣ／抗ＣＤ２８被覆ビーズの作成、Ｔ細胞刺激、および読み取りは、高度に定義された生体外システム内で、刺激条件あたり４種の異なるｐＭＨＣ分子と、読み取り条件あたり８種の異なるｐＭＨＣ分子を使用して実施された。
精製共刺激マウスＩｇＧ２ａ抗ヒト型ＣＤ２８ Ａｂ ９．３（Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８４（１９８７）：４６１１−４６１５）が、製造業者（Ｐｅｒｂｉｏ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって推奨されるように、スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドビオチンを使用して化学的にビオチン化された。使用されたビーズは、直径５．６μｍのストレプトアビジン被覆ポリスチレン粒子（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，ＵＳＡ）であった。
陽性および陰性対照刺激のために使用されたｐＭＨＣは、それぞれ、Ａ*０２０１／ＭＬＡ−００１（修飾Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１に由来するペプチドＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号１０１７））、およびＡ*０２０１／ＤＤＸ５−００１（ＤＤＸ５に由来するＹＬＬＰＡＩＶＨＩ、配列番号１０１８）であった。
４×１２．５ｎｇの異なるビオチンｐＭＨＣ存在下で、８００，０００個のビーズ／２００μｌが９６ウェルプレート内で被覆され、洗浄されて、引き続いて２００μｌの容量中で６００ｎｇのビオチン抗ＣＤ２８が添加された。５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１２（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）を添加した２００μｌのＴＣＭ中で、１×１０６のＣＤ８＋Ｔ細胞を２×８５の洗浄被覆ビーズと、３７℃で３日間にわたり同時インキュベートすることで、９６ウェルプレート内で刺激が開始された。次に８０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加した新鮮ＴＣＭで培地の半分を交換し、３７℃で４日間にわたり培養が継続された。この刺激サイクルが、合計３回実施された。条件あたり８種の異なるｐＭＨＣ分子を使用するｐＭＨＣ多量体読み取りでは、８９１種の異なる蛍光色素への共役を包含するわずかな修正を加えて、以前記載されたような（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．７（２０１２）：８９１−９０２）二次元コンビナトリアルコーディングアプローチが使用された。最後に、Ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ近赤外染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＣＤ８−ＦＩＴＣ抗体クローンＳＫ１（ＢＤ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、および蛍光性ｐＭＨＣ多量体による細胞の染色によって多量体解析が実施された。解析では、適切なレーザーおよびフィルターを装着したＢＤ ＬＳＲＩＩ ＳＯＲＰ血球計数器が使用された。ペプチド特異的細胞は、全ＣＤ８＋細胞の百分率として計算された。多量体解析の評価は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ，Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡ）を使用して実施された。特異的多量体＋ＣＤ８＋リンパ球の生体外初回刺激は、陰性対照刺激と比較することで（ｂｙ ｂｙ）検出された。１人の健常ドナーの少なくとも１つの評価可能生体外刺激ウェルが、生体外刺激後に、特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞系を含有することが認められれば、所与の抗原の免疫原性が検出された（すなわちこのウェルは、ＣＤ８＋Ｔ細胞内に少なくとも１％の特異的多量体＋を含有し、特異的多量体＋細胞の百分率は、陰性対照刺激の中央値の少なくとも１０倍であった）。
ＣＬＬペプチドの生体外免疫原性
試験されたＨＬＡクラスＩペプチドでは、ペプチド特異的Ｔ細胞系の生成によって、生体外免疫原性が実証され得た。代表的結果として、ペプチドＫＦＡＥＥＦＹＳＦ（配列番号２０）は、試験されたドナー５人の内２人で、生体外Ｔ細胞応答をもたらした。
実施例５
細胞表面に提示される腫瘍関連ペプチドの同定および定量化
組織サンプル
本発明のＨＬＡ−Ａ*０２結合ペプチドの分析／確認のために、ペプチド同定で使用されるサンプルの他に、正常および腫瘍（ＣＬＬ）組織の双方を含んでなる非依存性サンプルセットが使用された。全ての患者の告知に基づく同意書は、外科手術または検死解剖前に得た。組織は切除直後に衝撃凍結されて、ＴＵＭＡＰの単離まで−７０℃未満で保存された。
組織サンプルからのＨＬＡペプチドの単離
衝撃凍結組織サンプルからのＨＬＡペプチド貯留は、わずかに改変されたプロトコル（Ｆａｌｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５１（１９９１）：２９０−２９６；Ｓｅｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ４９（１９９９）：５７１−５７６）に従って、ＨＬＡ−Ａ*０２−特異的抗体ＢＢ７．２、ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ特異的抗体Ｗ６／３２、ＣＮＢｒ活性化セファロース、酸処理、および限外濾過を使用して、固形組織からの免疫沈殿によって得られた。
質量分析
得られたＨＬＡペプチド貯留は、逆相クロマトグラフィー（ｎａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬ Ｃ ｓｙｓｔｅｍ、Ｗａｔｅｒｓ）によって、それらの疎水性に従って分離され、ＥＳＩ源を装着したＬＴＱ−ｖｅｌｏｓおよびｆｕｓｉｏｎハイブリッド質量分光計（ＴｈｅｒｍｏＥｌｅｃｔｒｏｎ）内で溶出ペプチドが分析された。ペプチド貯留は、毎分４００ｎＬの流速を適用して、１．７μｍ Ｃ１８逆相材料（Ｗａｔｅｒｓ）で充填された、分析用融合シリカマイクロキャピラリーカラム（７５μｍ内径×２５０ｍｍ）上に直接、挿入された。引き続いて、毎分３００ｎＬの流速で１０％から３３％へのＢの二段階１８０分間二成分勾配を用いて、ペプチドが分離された。勾配は、溶媒Ａ（水中の０．１％ギ酸）および溶媒Ｂ（アセトニトリル中の０．１％ギ酸）から構成された。ｎａｎｏＥＳＩ源への導入には、金被覆ガラス毛管（ＰｉｃｏＴｉｐ、Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）が使用された。ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分光計は、ＴＯＰ５ストラテジーを使用してデータ依存モードで操作された。手短に述べると、スキャンサイクルは、Ｏｒｂｉｔｒａｐ（Ｒ＝３００００）内の高質量精度の完全スキャンで開始され、これもまたＯｒｂｉｔｒａｐ（Ｒ＝７５００）内の５種の最も豊富な前駆イオンのＭＳ／ＭＳスキャンがそれに続き、あらかじめ選択されたイオンは動的に除外された。タンデム質量スペクトルは、ＳＥＱＵＥＳＴおよび追加的な手動調節によって解釈された。同定されたペプチド配列は、生じた天然ペプチド断片化パターンと、配列が同一の合成参照ペプチドの断片化パターンとの比較によって確定された。
イオン計数によって、すなわちＬＣ−ＭＳ特性の抽出および解析によって、無標識相対ＬＣ−ＭＳ定量化を実施した（Ｍｕｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．７（２００７）：３４７０−３４８０）。方法は、ペプチドのＬＣ−ＭＳシグナル面積が、サンプル中のその存在量に相関すると仮定する。抽出された特性は、電荷状態デコンボリューションと滞留時間アライメントによって、さらに処理された（Ｍｕｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ．Ｒｅｓ ７（２００８）：５１−６１；Ｓｔｕｒｍ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．９（２００８）：１６３）。最終的に、全てのＬＣ−ＭＳ特性が配列同定結果と相互参照されて、異なるサンプルの定量的データと、組織からペプチドへの提示プロファイルとが組み合わされた。定量的データは、技術的および生物学的複製内の変動を考慮した中心傾向に従って、二重様式で正規化された。このようにして、それぞれの同定されたペプチドが定量的データと関連付けられ、サンプルと組織の間の相対定量化が可能になる。さらに、ペプチド候補について得られた全ての定量的データが手動で検査され、データ整合性が確実にされて、自動解析の確度が確認された。各ペプチドについて、提示プロファイルが計算され、平均サンプル提示ならびに反復試験変動が示された。プロファイルは、ＣＬＬサンプルを正常組織サンプルのベースラインに並置する。代表的過剰提示ペプチドの提示プロファイルは、図１１に示される。
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Claims (21)

  1. 配列番号１６７に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、またはその薬学的に許容可能な塩。
  2. 前記ペプチドが、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子に結合する能力を有する、請求項１に記載のペプチド。
  3. 前記ペプチドが、非ペプチド結合を含む、請求項１または２に記載のペプチド。
  4. 配列番号１６７に示されるアミノ酸配列からなるＨＬＡリガンドと、反応性のＴ細胞受容体。
  5. （ａ）配列番号１６７に示されるアミノ酸配列からなるペプチド；および
    （ｂ）ＨＬＡ−ＤＲ抗原関連不変鎖（Ｉｉ）のＮ末端アミノ酸１〜８０
    を含んでなる、融合タンパク質。
  6. （ａ）請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド；
    （ｂ）請求項４に記載のＴ細胞受容体；または
    （ｃ）請求項５に記載の融合タンパク質をエンコードする核酸。
  7. ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組み合わせである、請求項に６記載の核酸。
  8. 請求項６または７に記載の核酸を含んでなる、発現ベクター。
  9. 請求項６または７に記載の核酸、または請求項８に記載の発現ベクターを含んでなる、宿主細胞。
  10. 樹状細胞または抗原提示細胞である、請求項９に記載の宿主細胞。
  11. 請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド、請求項４に記載のＴ細胞受容体、または請求項５に記載の融合タンパク質を製造する方法であって、請求項９に記載の宿主細胞を培養するステップと、前記宿主細胞および／またはその培養液から前記ペプチド、前記Ｔ細胞受容体、または前記融合タンパク質を単離するステップとを含んでなる、方法。
  12. ＣＴＬを適切な抗原提示細胞の表面に発現される抗原負荷ヒトクラスＩ ＭＨＣ分子に、前記ＣＴＬが抗原特異的様式で活性化するのに十分な時間にわたり、生体外で接触させるステップを含んでなり、前記抗原が請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチドである、活性化細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を製造するためのインビトロ法。
  13. 前記抗原が、十分な量の前記抗原を抗原提示細胞に接触させることで、適切な抗原提示細胞の表面に発現されるクラスＩ ＭＨＣ分子上に負荷される、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記抗原提示細胞が、請求項１〜３のいずれか一項に記載の前記ペプチドを発現する能力がある発現ベクターを含んでなる、請求項１３に記載の方法。
  15. 請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法によって製造される、活性化細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）。
  16. 請求項１５に記載の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を含んでなる、患者において標的がん細胞を死滅させる薬剤。
  17. 薬剤の製造における、請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド、請求項４に記載のＴ細胞受容体、請求項５に記載の融合タンパク質、請求項６または７に記載の核酸、請求項８に記載の発現ベクター、請求項９または１０に記載の宿主細胞、または請求項１５に記載の活性化細胞傷害性Ｔリンパ球の使用。
  18. 前記薬剤がワクチンである、請求項１７に記載の使用。
  19. 前記薬剤ががんに対して有効である、請求項１７または１８に記載の使用。
  20. 前記がんが、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）および／または急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である、請求項１９に記載の使用。
  21. 請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチドからなる群から選択される少なくとも１つの活性成分、請求項４に記載のＴ細胞受容体、請求項５に記載の融合タンパク質、請求項６または７に記載の核酸、請求項８に記載の発現ベクター、請求項９または１０に記載の宿主細胞、および請求項１５に記載の活性化細胞毒性Ｔリンパ球、および薬学的に許容可能な担体を含んでなる、医薬組成物。
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