JP6884752B2 - 前立腺がんおよびその他のがんに対する免疫療法において使用するための新規ペプチドおよびペプチドの組み合わせ - Google Patents

前立腺がんおよびその他のがんに対する免疫療法において使用するための新規ペプチドおよびペプチドの組み合わせ Download PDF

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Description

本発明は、免疫療法において使用するためのペプチド、タンパク質、核酸、および細胞に関する。特に、本発明は、がんの免疫療法に関する。本発明は、単独のまたはその他の腫瘍関連ペプチドと組み合わされた、腫瘍関連Ｔ細胞ペプチドエピトープにさらに関し、それは、例えば、抗腫瘍免疫応答を刺激し、または生体外でＴ細胞を刺激して患者に移入する、ワクチン組成物の活性医薬品成分の役割を果たし得る。主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の分子と結合しているペプチド、またはペプチドそれ自体もまた、抗体、可溶性Ｔ細胞受容体、およびその他の結合分子の標的になり得る。
本発明は、ヒト腫瘍細胞のＨＬＡクラスＩ分子に由来する、いくつかの新規ペプチド配列およびそれらの変異型に関し、それらは抗腫瘍免疫応答を引き起こすためのワクチン組成物中で、または薬理的／免疫学的活性化合物および細胞の開発のための標的として、使用され得る。
前立腺がんは、世界で２番目に頻繁に診断されるがんであって、男性では５番目に頻度の高いがん死亡原因であり、２０１２年には１１０万件の新たな症例（男性における全てのがんの１５％）および３０万人のがん死亡（男性における全死亡の７％）が推定されている。同時期には、世界の８４ヶ国、主に、高いまたは非常に高い人間開発レベルに達した国々で、男性における最も頻度の高いがんのタイプであったが、中部および南部アフリカの数ヶ国でも同様であった。米国がん協会によれば、２０１５年には、２２０，８００件の前立腺がんの新規症例および２７，５４０人の前立腺がんによる死亡が推定される。前立腺がんのリスク因子は、年齢、家族歴、および人種である（Ｗｏｒｌｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｐｏｒｔ，２０１４；ＳＥＥＲ Ｓｔａｔ ｆａｃｔｓ，２０１４；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙ，２０１５）。
ほぼ全ての前立腺がんは、前立腺の腺細胞から発生する腺がんである。まれな形態の前立腺がんとしては、肉腫、小細胞がん、神経内分泌腫瘍（小細胞がんを除く）または移行上皮がんが挙げられる（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙ，２０１５）。
前立腺がんのための治療ストラテジーは、主にがん病期に左右される。局所的に限定された非転移性前立腺がんでは、治療選択肢としては、積極的サーベイランス（待機および監視）、前立腺の完全外科的切除、および近接照射療法存在下または不在下における局所高用量放射線療法が挙げられる高リスク患者では、ホルモン除去療法および術後局所放射線療法がさらなる可能性に相当する。転移前立腺がんの標準的治療法はまた、前立腺の完全外科的切除、局所高線量放射線、およびホルモン除去療法を含んでなる。ホルモン枯渇に応答しない腫瘍は、去勢抵抗性前立腺がん（ＣＲＰＣ）と称される。ＣＲＰＣ患者には、ドセタキセル、アビラテロン、および樹状細胞ベースのワクチンであるシプロイセルＴが投与される。骨転移は、ラジウム２２３単独で、あるいはラジウム２２３またはドセタキセルまたはアビラテロンのいずれかとビスホスホネートまたはデノスマブとの組み合わせで、治療される（Ｓ３−Ｌｅｉｔｌｉｎｉｅ Ｐｒｏｓｔａｔａｋａｒｚｉｎｏｍ，２０１４）。
樹状細胞ベースのワクチンであるシプロイセルＴは、ＦＤＡによって認可された最初の抗がんワクチンであった。ＣＲＰＣがある患者の生存期間に対するその好ましい効果のために、さらなる免疫療法の開発に向けた多大な努力がなされている。ワクチン接種ストラテジーについては、ペプチドワクチンである前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）−ＴＲＩＣＯＭ、個別化ペプチドワクチンであるＰＰＶ、ＤＮＡワクチンであるｐＴＶＧ−ＨＰ、およびＧＭ−ＣＳＦ発現全細胞ワクチンであるＧＶＡＸが、異なる臨床試験で有望な結果を示した。さらに、シプロイセルＴ以外の樹状細胞ベースのワクチン、すなわちＢＰＸ−１０１およびＤＣＶＡＣ／Ｐａは、前立腺がん患者において、臨床的奏効を引き起こすことが示された。イピリムマブおよびニボルマブのような免疫チェックポイント阻害物質が、単剤療法として、ならびにアンドロゲン奪取療法、局所放射線療法、ＰＳＡ−ＴＲＩＣＯＭ、およびＧＶＡＸをはじめとするその他の治療法との併用で、現在臨床試験で評価されている。第ＩＩ相試験で進行を有意に遅延させ、無憎悪生存期間を延長させた免疫調節物質タスキニモドは、現在第ＩＩＩ相試験でさらに研究されている。もう一つの免疫修飾物質であるレナリドミドは、初期臨床試験で有望な効果をもたらしたが、第ＩＩＩ相試験では生存率を改善できなかった。これらの期待外れな結果にもかかわらず、さらなるレナリドミド治験が継続されている（Ｑｕｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。
がんの治療に伴う重度の副作用および費用を考慮すると、がん全般、そして特に前立腺がんの治療に使用し得る要素を同定する必要がある。がんのより良い診断、予後の評価、および治療成功の予測につながる、がん全般、特に前立腺がんのためのバイオマーカーに相当する要素を同定する必要性もまたある。
がんの免疫療法は、がん細胞を特異的に標的化しながら副作用を最小化する選択肢に相当する。がん免疫療法は、腫瘍関連抗原の存在を利用する。
腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の現行の分類は、次の主要群を含んでなる：
ａ）がん精巣抗原：Ｔ細胞によって認識され得る初めて同定されたＴＡＡはこのクラスに属し、元々はがん精巣（ＣＴ）抗原と称されたが、それは、そのメンバーが組織学的に異なるヒト腫瘍において発現し、正常組織では精巣の精母細胞／精原細胞のみに存在し、時として胎盤に存在するためであった。精巣の細胞は、クラスＩおよびＩＩ ＨＬＡ分子を発現しないので、これらの抗原は正常組織のＴ細胞によって認識され得ず、したがって免疫学的に腫瘍特異的と見なされる。ＣＴ抗原の周知の例は、ＭＡＧＥファミリーメンバーおよびＮＹ−ＥＳＯ−１である。
ｂ）分化抗原：これらのＴＡＡは、腫瘍と、それから腫瘍が生じる正常組織との間で共有される。既知の分化抗原のほとんどは、黒色腫および正常メラノサイトに見いだされる。これらのメラノサイト系関連タンパク質の多くは、メラニン生合成に関与し、したがって腫瘍特異的でないが、それでもなおがん免疫療法のために広く利用されている。例としては、黒色腫に対するチロシナーゼとＭｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、または前立腺がんに対するＰＳＡが挙げられるが、これに限定されるものではない。
ｃ）過剰発現ＴＡＡ：広範に発現されるＴＡＡをエンコードする遺伝子は、組織学的に異なる型の腫瘍において検出され、多数の正常組織においても概してより低い発現レベルで検出されている。正常組織によってプロセスされて潜在的に提示さるエピトープの多くは、Ｔ細胞認識の閾値レベル未満であり得る一方で、腫瘍細胞におけるそれらの過剰発現は、以前確立された免疫寛容を破壊することにより、抗がん応答を始動し得る。このクラスのＴＡＡの顕著な例は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、サバイビン、テロメラーゼまたはＷＴ１である。
ｄ）腫瘍特異的抗原：これらのユニークなＴＡＡは、正常な遺伝子（β−カテニン、ＣＤＫ４など）の変異から生じる。これらの分子変化のいくつかは、腫瘍性形質転換および／または進行に関連している。腫瘍特異的抗原は、通常、正常組織に対する自己免疫反応のリスクなしに、強力な免疫応答を誘導できる。他方、これらのＴＡＡは、ほとんどの場合、その上でそれらが同定されたまさにその腫瘍のみと関係があり、通常は、多くの個々の腫瘍間で共有されない。腫瘍特異的（関連）イソ型を有するタンパク質では、ペプチドの腫瘍特異性（または関連性）はまた、ペプチドが腫瘍（関連）エクソンに由来する場合に生じてもよい。
ｅ）異常な翻訳後修飾から生じるＴＡＡ：このようなＴＡＡは、特異的でなく腫瘍において過剰発現もされないタンパク質から生じてもよいが、それでもなお、腫瘍において主に活性である翻訳後プロセスによって腫瘍関連になる。このクラスの例は、腫瘍にＭＵＣ１のような新規エピトープをもたらす改変グリコシル化パターン、または腫瘍特異的であってもなくてもよい分解中のタンパク質スプライシングのような事象から生じる。
ｆ）オンコウイルスタンパク質：これらのＴＡＡはウイルスタンパク質であり、それらは発がん過程において重要な役割を果たしてもよく、外来性である（ヒト由来でない）ため、それらはＴ細胞応答を誘起し得る。このようなタンパク質の例は、子宮頸がんにおいて発現されるヒト乳頭腫１６型ウイルスタンパク質Ｅ６およびＥ７である。
Ｔ細胞ベースの免疫療法は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の分子によって提示される、腫瘍関連または腫瘍特異的タンパク質由来ペプチドエピトープを標的とする。腫瘍特異的Ｔリンパ球によって認識される抗原、すなわちそれらのエピトープは、酵素、受容体、転写因子などの全てのタンパク質クラスに由来する分子であり得て、それはそれぞれの腫瘍細胞において発現されて、同一起源の非改変細胞と比較して、通常、上方制御される。
生命維持に必要ない臓器または組織から発達する全てのがん実体と同様に、前立腺特異的抗原は、がん免疫療法のための優れた選択肢であってもよいが、これは前立腺特異的抗原が、前立腺切除された患者における腫瘍特異的標的に相当するためである。前立腺切除術を受けていないがん患者では、前立腺が重要臓器と見なされないことから、このような抗原もまた興味深くあってもよく、黒色腫では、メラノサイト分化抗原による同様のアプローチが採用されている。例えば、腫瘍抗原として使用される前立腺酸ホスファターゼを含んでなる、ＤｅｎｄｒｅｏｎからのシプロイセルＴ（プロベンジ）など、前立腺特異抗原または高度前立腺関連抗原が安全な標的であることを示すいくつかの例がある（Ｗｅｓｔｄｏｒｐ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。この抗原は、前立腺で排他的に発現されるのではなく、その他の組織と対比して前立腺対において１〜２桁高いレベルで過剰発現される（Ｇｒａｄｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。
ＭＨＣ分子には、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩの２つのクラスがある。ＭＨＣクラスＩ分子はα重鎖およびβ２ミクログロブリンから構成され、ＭＨＣクラスＩＩ分子はαおよびβ鎖から構成される。それらの三次元立体構造は結合溝をもたらし、それはペプチドとの非共有結合相互作用のために使用される。
ＭＨＣクラスＩ分子は、ほとんどの有核細胞上に見いだされる。それらは、主に内因性タンパク質、欠陥リボソーム産物（ＤＲＩＰ）、およびより大型のペプチドのタンパク質切断から得られる、ペプチドを提示する。しかし、エンドソームコンパートメントまたは外因性起源に由来するペプチドもまた、ＭＨＣクラスＩ分子上に頻繁に見いだされる。この非古典的様式のクラスＩ提示は、文献中で交差提示と称される（Ｂｒｏｓｓａｒｔ ａｎｄ Ｂｅｖａｎ，１９９７；Ｒｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、大部分はプロフェショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）に見いだされ、例えば、エンドサイトーシス中にＡＰＣに取り込まれて引き続きプロセシングされる、外因性または膜貫通タンパク質のペプチドを主に提示する。
ペプチドとＭＨＣクラスＩの複合体が、適切なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＣＤ８陽性Ｔ細胞によって認識される一方で、ペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子の複合体は、適切なＴＣＲを有するＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞によって認識される。その結果、ＴＣＲ、ペプチド、およびＭＨＣは、化学量論的に１：１：１の量で存在することが良く知られている。
ＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞は、ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞による、効果的な応答の誘導と維持する上で重要な役割を果たす。腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に由来するＣＤ４陽性Ｔ細胞エピトープの同定は、抗腫瘍免疫応答を始動させる医薬品の開発に非常に重要である（Ｇｎｊａｔｉｃ ｅｔ ａｌ．，２００３）。腫瘍部位では、Ｔヘルパー細胞が、細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）親和的サイトカイン環境を維持して（Ｍｏｒｔａｒａ ｅｔ ａｌ．，２００６）、例えば、ＣＴＬ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、および顆粒球などのエフェクター細胞を引きつける（Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００７）。
炎症不在下では、ＭＨＣクラスＩＩ分子の発現は、免疫系細胞、特に、例えば、単球、単球由来細胞、マクロファージ、樹状細胞などのプロフェショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）に主に限定される。がん患者においては、腫瘍細胞がＭＨＣクラスＩＩ分子を発現することが判明している（Ｄｅｎｇｊｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００６）。
伸長された（より長い）本発明のペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ活性エピトープとして作用し得る。ＭＨＣクラスＩＩエピトープによって活性化されたＴヘルパー細胞は、抗腫瘍免疫におけるＣＴＬのエフェクター機能を統合するのに重要な役割を果たす。ＴＨ１型のＴヘルパー細胞応答を始動するＴヘルパー細胞エピトープは、それらの細胞表面に腫瘍関連ペプチド／ＭＨＣ複合体を提示する腫瘍細胞に向けられた細胞傷害機能をはじめとする、ＣＤ８陽性キラーＴ細胞のエフェクター機能を支持する。このようにして腫瘍関連Ｔヘルパー細胞ペプチドエピトープは、単独で、またはその他の腫瘍関連ペプチドとの組み合わせで、抗腫瘍免疫応答を刺激するワクチン組成物の活性医薬品成分の役割を果たし得る。
例えば、マウスなどの哺乳類動物モデルにおいて、ＣＤ８陽性Ｔリンパ球の不在下であっても、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）の分泌による血管新生阻害を通じて腫瘍発現を阻害するには、ＣＤ４陽性Ｔ細胞で十分であることが示された（Ｂｅａｔｔｙ ａｎｄ Ｐａｔｅｒｓｏｎ，２００１；Ｍｕｍｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。ＣＤ４ Ｔ細胞が、直接抗腫瘍エフェクターであるという証拠がある（Ｂｒａｕｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｔｒａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。
ＨＬＡクラスＩＩ分子の構成的発現は、通常、免疫細胞に限定されるので、原発性腫瘍からクラスＩＩペプチドを直接単離する可能性があり得るとは、これまで考えられなかった。しかし、Ｄｅｎｇｊｅｌ ｅｔ ａｌ．は、いくつかのＭＨＣクラスＩＩエピトープを腫瘍から直接成功裏に同定した（国際公開第２００７／０２８５７４号パンフレット、欧州特許第１７６００８８Ｂ１号明細書）。
ＣＤ８およびＣＤ４依存性の双方のタイプの応答は、抗腫瘍効果に共同して相乗的に寄与するので、ＣＤ８＋Ｔ細胞（リガンド：ＭＨＣクラスＩ分子＋ペプチドエピトープ）、またはＣＤ４陽性Ｔヘルパー細胞（リガンド：ＭＨＣクラスＩＩ分子＋ペプチドエピトープ）のどちらかによって認識される、腫瘍関連抗原の同定および特性解析は、腫瘍ワクチンの開発にとって重要である。
ＭＨＣクラスＩペプチドが、細胞性免疫応答を始動（惹起）するためには、それはまた、ＭＨＣ分子に結合しなくてはならない。この過程は、ＭＨＣ分子の対立遺伝子と、ペプチドのアミノ酸配列の特定の多型性とに依存する。ＭＨＣクラスＩ結合ペプチドは、通常は８〜１２アミノ酸残基長であり、通常は、ＭＨＣ分子の対応する結合溝と相互作用するそれらの配列中に、２つの保存残基（「アンカー」）を含有する。このようにして、各ＭＨＣ対立遺伝子は、どのペプチドが結合溝と特異的に結合し得るかを決定する、「結合モチーフ」を有する。
ＭＨＣクラスＩ依存免疫反応においては、ペプチドは腫瘍細胞によって発現される特定のＭＨＣクラスＩ分子に結合できるだけでなく、それらはまた、引き続いて特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＴ細胞によって認識されなくてはならない。
タンパク質が、Ｔリンパ球によって腫瘍特異的または腫瘍関連抗原として認識され、治療で利用されるためには、特定の必要条件が満たされなくてはならない。抗原は、主に腫瘍細胞によって発現され、健常組織によって発現されず、または比較的少量発現されるべきである。好ましい実施形態では、ペプチドは、健常組織と比較して、腫瘍細胞によって過剰提示されるべきである。それぞれの抗原は、ある種の腫瘍に存在するだけでなく、高い濃度（すなわち、それぞれのペプチド細胞当たりのコピー数）で存在することもさらに望ましい。腫瘍特異的および腫瘍関連抗原は、例えば、細胞周期調節またはアポトーシス抑制における機能のために、正常細胞から腫瘍細胞への形質転換に直接関与するタンパク質に由来することが多い。さらに、形質転換の直接原因となるタンパク質の下流標的が、上方制御されてもよく、（ｕｎｄ）したがって間接的に腫瘍関連であってもよい。このような間接的腫瘍関連抗原もまた、ワクチン接種アプローチの標的であってもよい（Ｓｉｎｇｈ−Ｊａｓｕｊａ ｅｔ ａｌ．，２００４）。このようなペプチド（「免疫原性ペプチド」）が、腫瘍関連抗原に由来して、生体外または生体内Ｔ細胞応答をもたらすことを確実にするためには、抗原のアミノ酸配列内にエピトープが存在することが必須である。
基本的に、ＭＨＣ分子に結合できるあらゆるペプチドが、Ｔ細胞エピトープとして機能してもよい。生体外または生体内Ｔ細胞応答誘導のための必要条件は、対応するＴＣＲを有するＴ細胞の存在、およびこの特定のエピトープに対する免疫寛容の不在である。
したがって、ＴＡＡは、腫瘍ワクチンをはじめとするが、これに限定されるものではない、Ｔ細胞ベースの治療法開発の出発点である。ＴＡＡを同定し特性決定する方法は、通常は、患者または健常人から単離され得るＴ細胞の使用に基づき、またはそれらは、腫瘍と正常組織との間の示差的転写プロファイル、または差次的ペプチド発現パターンの生成に基づく。しかし、腫瘍組織またはヒト腫瘍細胞株において過剰発現され、またはこのような組織または細胞株において選択的に発現される遺伝子の同定は、免疫療法においてこれらの遺伝子から転写される抗原の使用に関する、正確な情報を提供しない。これは、これらの抗原のエピトープの個々の亜集団のみが、このような用途に適するためであり、その理由は、対応するＴＣＲを有するＴ細胞が存在しなくてはならず、この特定のエピトープに対する免疫寛容が不在または最小でなくてはならないからである。したがって本発明の非常に好ましい実施形態では、それに対する機能性および／または増殖性Ｔ細胞が見いだされる、過剰にまたは選択的に提示されるペプチドのみを選択することが、重要である。このような機能性Ｔ細胞は、特異的抗原による刺激時にクローン増殖され得て、エフェクター機能を果たすことができるＴ細胞（「エフェクターＴ細胞」）と定義される。
本発明による特異的ＴＣＲ（例えば、可溶性ＴＣＲ）および抗体またはその他の結合分子（スキャフォールド）によってペプチドＭＨＣを標的化する場合、基礎となるペプチドの免疫原性は二次的である。これらの場合には、提示が決定要因である。
本発明の第１の態様では、本発明は、配列番号１〜配列番号４８、または配列番号１〜配列番号４８と少なくとも７７％、好ましくは少なくとも８８％相同的な（好ましくは少なくとも７７％または少なくとも８８％同一の）その変異配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるペプチドに関し、その中で前記変異体は、ＭＨＣと結合し、および／またはＴ細胞と前記ペプチドまたはその薬学的に許容可能な塩との交差反応を誘導し、その中で前記ペプチドは、基礎となる完全長ポリペプチドでない。
本発明は、配列番号１〜配列番号４８、または配列番号１〜配列番号４８と少なくとも７７％、好ましくは少なくとも８８％相同的な（好ましくは少なくとも７７％または少なくとも８８％同一の）その変異体からなる群から選択される配列を含んでなる、本発明のペプチドにさらに関し、前記ペプチドまたはその変異型は、８〜１００、好ましくは８〜３０、最も好ましくは８〜１４アミノ酸の全長を有する。
続く表は、本発明によるペプチド、それらの各配列番号、およびそれらのペプチドの予測される起源（基礎）遺伝子を示す。表１、表３、および表５の全てのペプチドは、ＨＬＡ−Ａ＊０２に結合する。表２、表４、および表６の全てのペプチドは、ＨＬＡ−Ａ＊２４に結合する。表３および４のペプチドは、高い誤り率があるまたはアルゴリズムを使用して計算された、ハイスループットスクリーニングの結果としての大きなリスト中で以前開示されているが、これまでがんとは全く関連付けられていなかった。表５および表６のペプチドは、本発明のその他のペプチドとの組み合わせで有用であってもよい追加的なペプチドである。表７および８のペプチドは、それぞれの基礎ポリペプチドの過剰発現または過剰提示を伴う様々なその他の悪性腫瘍の診断および／または治療においてさらに有用である。
表1: 本発明によるHLA-A*02ペプチド
Figure 0006884752
表2: 本発明によるHLA-A*24ペプチド
Figure 0006884752
表3: がん関連性が以前知られていない本発明による追加的なHLA-A*02ペプチド。J = ホスホセリン
Figure 0006884752
表4: がん関連性が以前知られていない本発明による追加的なHLA-A*24ペプチド。
Figure 0006884752
表5: 例えば個別化がん治療で有用なHLA-A*02ペプチド
Figure 0006884752
表6: 例えば個別化がん治療で有用なHLA-A*24ペプチド
Figure 0006884752
表7A: 本発明によるペプチド、およびその他の増殖性疾患、特にがん性疾患における、それらの具体的使用。表は、選択されたペプチドについて、測定された腫瘍サンプルの5%超で過剰提示されるか、または測定された腫瘍サンプルの5%超で3を超える腫瘍対正常組織の幾何学平均比で提示されるかのどちらかである、それらがその上で発見された追加的な腫瘍型を示す。過剰提示は、最大提示がある正常サンプルと比較して、より高い腫瘍サンプル上の提示と定義される。それに対する過剰提示が試験された正常（非がん性）組織は、脂肪組織、副腎、動脈、骨髄、脳、中枢神経、結腸、十二指腸、食道、眼、胆嚢、心臓、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、単核白血球細胞、膵臓、副甲状腺、末梢神経、腹膜、下垂体、胸膜、直腸、唾液腺、骨格筋、皮膚、小腸、脾臓、胃、甲状腺、気管、尿管、膀胱、および静脈から選択された。
Figure 0006884752
 NSCLC = 非小細胞肺がん、SCLC = 小細胞肺がん、RCC = 腎臓がん、CRC = 結腸または直腸がん、HCC = 肝臓がん、PC = 膵臓がん、BRCA = 乳がん、MCC = メルケル細胞がん、OC = 卵巣がん、AML= 急性骨髄性白血病、CLL= 慢性リンパ球性白血病、GC = 胃がん; J = ホスホセリン（phophoserine）
本発明は、さらに、例えば、肺がん、小細胞肺がん、黒色腫、肝臓がん、乳がん、子宮がん、メルケル細胞がん、膵臓がん、胆嚢がん、胆管がん、ＣＲＣ、膀胱がん、非小細胞肺がん、腎臓がん、白血病（例えば、ＡＭＬまたはＣＬＬ）、卵巣がん、食道がん、脳がん、および胃（胃）がんなどの増殖性疾患の治療において使用するための本発明によるペプチドに一般に関する。
特に好ましいのは、配列番号１〜配列番号４８からなる群から選択される、本発明による単独のまたは組み合わされたペプチドである。より好ましいのは、配列番号１〜配列番号６（表１を参照されたい）および配列番号２４〜配列番号２８（表２を参照されたい）または配列番号１、４、５、６、４９、および５２または配列番号２、３、および５４からなる群から選択される単独のまたは組み合わせのペプチドと、肺がん、小細胞肺がん、黒色腫、肝臓がん、乳がん、子宮がん、メルケル細胞がん、膵臓がん、胆嚢がん、胆管がん、ＣＲＣ、膀胱がん、非小細胞肺がん、腎臓がん、白血病（例えば．ＡＭＬまたはＣＬＬ）、卵巣がん、食道がん、脳がん、および胃（胃）がん、最も好ましくは前立腺がんの免疫療法におけるそれらの使用である。上の表７に示されるように、本発明によるペプチドの多くは、その他の腫瘍型上にもまた見いだされ、したがって、その他の適応症のための免疫療法においても使用され得る。図１および実施例１もまた、参照されたい。
したがって、本発明の別の態様は、好ましい一実施形態では、非小細胞肺がんの併用療法のための、配列番号配列番号１、１２、および２０のいずれか１つに記載の本発明によるペプチドの少なくとも１つの使用に関する。
したがって、本発明の別の態様は、好ましい一実施形態では、黒色腫の併用療法のための、配列番号１、２、５、８、および１９のいずれか１つに記載の本発明によるペプチドの少なくとも１つの使用に関する。
したがって、本発明の別の態様は、好ましい一実施形態では、肝臓がんの併用療法のための、配列番号２、６、１０、１７、２０、２６、２７、２８、２９、３１、３３、３４、３６、３８、４２、４４、４５、４７、および４８のいずれか１つに記載の本発明によるペプチドの少なくとも１つの使用に関する。
したがって、本発明の別の態様は、好ましい一実施形態では、乳がんの併用療法のための、配列番号２、８、１７、および２０のいずれか１つに記載の本発明によるペプチドの少なくとも１つの使用に関する。
したがって、本発明の別の態様は、好ましい一実施形態では、子宮がんの併用療法のための、配列番号２、３、７、８、１７、および２０のいずれか１つに記載の本発明によるペプチドの少なくとも１つの使用に関する。
したがって、本発明の別の態様は、ＭＣＣ治療のための、配列番号３に記載の本発明によるペプチドの少なくとも１つの使用に関する。
したがって、本発明の別の態様は、好ましい一実施形態では、ＰＣの併用療法のための、配列番号６、および１２のいずれか１つに記載の本発明によるペプチドの少なくとも１つの使用に関する。
したがって、本発明の別の態様は、好ましい一実施形態では、胆嚢がんおよび／または胆管がんの併用療法のための、配列番号配列番号７、１０、および１２のいずれか１つに記載の本発明によるペプチドの少なくとも１つの使用に関する。
したがって、本発明の別の態様は、好ましい一実施形態では、ＣＲＣの併用療法のための、配列番号配列番号８、１０、および２０のいずれか１つに記載の本発明によるペプチドの少なくとも１つの使用に関する。
したがって、本発明の別の態様は、好ましい一実施形態では、白血病の併用療法のための、配列番号１０、および２２のいずれか１つに記載の本発明によるペプチドの少なくとも１つの使用に関する。
したがって、本発明の別の態様は、ＯＣ治療のための、配列番号１０に記載の本発明によるペプチドの少なくとも１つの使用に関する。
したがって、本発明の別の態様は、好ましい一実施形態では、食道がんの併用療法のための、配列番号１０、および２０のいずれか１つに記載の本発明によるペプチドの少なくとも１つの使用に関する。
したがって、本発明の別の態様は、ＣＬＬ治療のための、配列番号１０に記載の本発明によるペプチドの少なくとも１つの使用に関する。
したがって、本発明の別の態様は、好ましい一実施形態では、ＰＣの併用療法のための、配列番号６、および１２のいずれか１つに記載の本発明によるペプチドの少なくとも１つの使用に関する。
したがって、本発明の別の態様は、好ましい一実施形態では、ＮＳＣＬＣの併用療法のための、配列番号１０、２８、２９、３３、３４、３５、３６、３７、３８、４１、４２、４４、および４８のいずれか１つに記載の本発明によるペプチドの少なくとも１つの使用に関する。
したがって、本発明の別の態様は、好ましい一実施形態では、ＲＣＣの併用療法のための、配列番号１０、３４、３７、４１、および４８のいずれか１つに記載の本発明によるペプチドの少なくとも１つの使用に関する。
したがって、本発明の別の態様は、好ましい一実施形態では、脳がんの併用療法のための、配列番号１３、１７、１８、１９、２２、３３、３４、３６、３７、３８、４１、４２、４３、４４、および４８のいずれか１つに記載の本発明によるペプチドの少なくとも１つの使用に関する。
したがって、本発明の別の態様は、ＡＭＬ治療のための、配列番号２２に記載の本発明によるペプチドの少なくとも１つの使用に関する。
したがって、本発明の別の態様は、好ましい一実施形態では、ＧＣの併用療法のための、配列番号２９、３１、３５、３８、および４２のいずれか１つに記載の本発明によるペプチドの少なくとも１つの使用に関する。
したがって、本発明の別の態様は、好ましくは肺がん、小細胞肺がん、黒色腫、肝臓がん、乳がん、子宮がん、メルケル細胞がん、膵臓がん、胆嚢がん、胆管がん、ＣＲＣ、膀胱がん、非小細胞肺がん、腎臓がん、白血病（例えば、ＡＭＬまたはＣＬＬ）、卵巣がん、食道がん、脳がん、および胃（胃）がん、最も好ましくは前立腺がんの群から選択される増殖性疾患の併用療法のための本発明によるペプチドの使用に関する
本発明は、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩの分子に結合する能力を有し、または長さ変異体などの伸長形態では、ＭＨＣクラスＩＩに結合する能力を有する、本発明によるペプチドにさらに関する。
本発明は、本発明によるペプチドにさらに関し、前記ペプチドは（それぞれ）配列番号１〜配列番号４８に記載のアミノ酸配列からなり、またはそれから本質的になる。
本発明は、本発明によるペプチドにさらに関し、前記ペプチドは、修飾され、および／または非ペプチド結合を含む。
本発明は、本発明によるペプチドにさらに関し、前記ペプチドは、特にＨＬＡ−ＤＲ抗原関連不変鎖（Ｉｉ）のＮ末端アミノ酸に融合した、または例えば樹状細胞に対して特異的な抗体などの抗体（またはその配列中）に融合した、融合タンパク質の一部である。
本発明の別の実施形態は、非天然ペプチドに関し、前記ペプチドは、配列番号１〜配列番号４８に記載のアミノ酸配列からなり、またはそれから本質的になり、薬学的に許容可能な塩として合成的に生産される（例えば、合成される）。ペプチドを合成的に生産する方法は、当該技術分野で周知である。生体内で生成されるペプチドは塩でないため、本発明によるペプチドの塩は、ペプチドの生体内での状態と実質的に異なる。ペプチドの非天然塩形態は、特に、ペプチドを含んでなる医薬組成物、例えば、本明細書で開示されるペプチドワクチンなどの文脈で、ペプチドの溶解性を媒介する。治療される対象にペプチドを効率的に提供するためには、ペプチドの十分で少なくとも実質的な溶解性が必要である。好ましくは、塩はペプチドの薬学的に許容可能な塩である。本発明によるこれらの塩としては、アニオンＰＯ４ ３−、ＳＯ４ ２−、ＣＨ３ＣＯＯ−、Ｃｌ−、Ｂｒ−、ＮＯ３ −、ＣｌＯ４ −、Ｉ−、ＳＣＮ−及びカチオンＮＨ４＋、Ｒｂ＋、Ｋ＋、Ｎａ＋、Ｃｓ＋、Ｌｉ＋、Ｚｎ２ ＋、Ｍｇ２ ＋、Ｃａ２ ＋、Ｍｎ２ ＋、Ｃｕ２ ＋、およびＢａ２ ＋としてのホフマイスター系列の塩などのアルカリ塩およびアルカリ土類塩が挙げられる。特に塩類は、（ＮＨ４）３ＰＯ４、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、（ＮＨ４）Ｈ２ＰＯ４、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＮＨ４ＣＨ３ＣＯＯ、ＮＨ４Ｃｌ、ＮＨ４Ｂｒ、ＮＨ４ＮＯ３、ＮＨ４ＣＩＯ４、ＮＨ４Ｉ、ＮＨ４ＳＣＮ、Ｒｂ３ＰＯ４、Ｒｂ２ＨＰＯ４、ＲｂＨ２ＰＯ４、Ｒｂ２ＳＯ４、Ｒｂ４ＣＨ３ＣＯＯ、Ｒｂ４Ｃｌ、Ｒｂ４Ｂｒ、Ｒｂ４ＮＯ３、Ｒｂ４ＣＩＯ４、Ｒｂ４Ｉ、Ｒｂ４ＳＣＮ、Ｋ３ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＳＯ４、ＫＣＨ３ＣＯＯ、ＫＣｌ、ＫＢｒ、ＫＮＯ３、ＫＣｌＯ４、ＫＩ、ＫＳＣＮ、Ｎａ３ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＮａＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＳＯ４、ＮａＣＨ３ＣＯＯ、ＮａＣｌ、ＮａＢｒ、ＮａＮＯ３、ＮａＣＩＯ４、ＮａＩ、ＮａＳＣＮ、ＺｎＣＩ２Ｃｓ３ＰＯ４、Ｃｓ２ＨＰＯ４、ＣｓＨ２ＰＯ４、Ｃｓ２ＳＯ４、ＣｓＣＨ３ＣＯＯ、ＣｓＣｌ、ＣｓＢｒ、ＣｓＮＯ３、ＣｓＣＩＯ４、ＣｓＩ、ＣｓＳＣＮ、Ｌｉ３ＰＯ４、Ｌｉ２ＨＰＯ４、ＬｉＨ２ＰＯ４、Ｌｉ２ＳＯ４、ＬｉＣＨ３ＣＯＯ、ＬｉＣｌ、ＬｉＢｒ、ＬｉＮＯ３、ＬｉＣｌＯ４、ＬｉＩ、ＬｉＳＣＮ、Ｃｕ２ＳＯ４、Ｍｇ３（ＰＯ４）２、Ｍｇ２ＨＰＯ４、Ｍｇ（Ｈ２ＰＯ４）２、Ｍｇ２ＳＯ４、Ｍｇ（ＣＨ３ＣＯＯ）２、ＭｇＣｌ２、ＭｇＢｒ２、Ｍｇ（ＮＯ３）２、Ｍｇ（ＣｌＯ４）２、ＭｇＩ２、Ｍｇ（ＳＣＮ）２、ＭｎＣｌ２、Ｃａ３（ＰＯ４）、Ｃａ２ＨＰＯ４、Ｃａ（Ｈ２ＰＯ４）２、ＣａＳＯ４、Ｃａ（ＣＨ３ＣＯＯ）２、ＣａＣｌ２、ＣａＢｒ２、Ｃａ（ＮＯ３）２、Ｃａ（ＣｌＯ４）２、ＣａＩ２、Ｃａ（ＳＣＮ）２、Ｂａ３（ＰＯ４）２、Ｂａ２ＨＰＯ４、Ｂａ（Ｈ２ＰＯ４）２、ＢａＳＯ４、Ｂａ（ＣＨ３ＣＯＯ）２、ＢａＣｌ２、ＢａＢｒ２、Ｂａ（ＮＯ３）２、Ｂａ（ＣｌＯ４）２、ＢａＩ２、およびＢａ（ＳＣＮ）２から選択される。特に好ましいのは、例えば、塩化物塩または酢酸塩（トリフルオロ酢酸塩）などのＮＨ酢酸塩、ＭｇＣｌ２、ＫＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＳＯ４、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、およびＣａＣｌ２である。
一般に、ペプチドおよび変異体（少なくともアミノ酸残基間にペプチド結合を含有するもの）は、Ｌｕｋａｓ ｅｔ ａｌ．（Ｌｕｋａｓ ｅｔ ａｌ．，１９８１）によって、そしてその中で引用される参考文献によって開示される、Ｆｍｏｃ−ポリアミド様式の固相ペプチド合成によって合成されてもよい。一時的なＮ−アミノ基保護は、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基によってもたらされる。この高度に塩基不安定性の保護基の反復性切断は、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中の２０％ピペリジンを使用して実施される。側鎖官能基は、それらのブチルエーテル（セリン、スレオニン、およびチロシンの場合）、ブチルエステル（グルタミン酸およびアスパラギン酸の場合）、ブチルオキシカルボニル誘導体（リジンおよびヒスチジンの場合）、トリチル誘導体（システインの場合）、および４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル誘導体（アルギニンの場合）として保護されてもよい。グルタミンまたはアスパラギンがＣ末端残基である場合、側鎖アミド官能基を保護するために、４，４'−ジメトキシベンズヒドリル基が活用される。固相担体は、ジメチルアクリルアミド（主鎖単量体）、ビスアクリロイルエチレンジアミン（架橋剤）、およびアクリロイルサルコシンメチルエステル（機能化因子）の３つの単量体から構成される、ポリジメチル−アクリルアミドポリマーをベースとする。使用されるペプチド−対−樹脂の切断可能な結合因子は、酸不安定性４−ヒドロキシメチル−フェノキシ酢酸誘導体である。逆転Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシル−カルボジイミド／１ヒドロキシベンゾトリアゾール媒介共役手順を使用して付加されるアスパラギンおよびグルタミンを除いて、全てのアミノ酸誘導体は、それらのあらかじめ形成された対称的な無水物誘導体として付加される。全ての共役および脱保護反応は、ニンヒドリン、トリニトロベンゼンスルホン酸またはイサチン（ｉｓｏｔｉｎ）試験手順を使用してモニターされる。合成完了時に、ペプチドは樹脂担体から切断され、同時に、５０％スカベンジャー混合物を含有する９５％トリフルオロ酢酸での処理によって、側鎖保護基が除去される。一般に使用されるスカベンジャーとしては、エタンジチオール、フェノール、アニソール、および水が挙げられ、正確な選択は、合成されるペプチドの構成アミノ酸に左右される。ペプチドの合成のための固相法と溶液相法の組み合わせもまた、可能である（例えば、（Ｂｒｕｃｋｄｏｒｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４）、およびその中で引用される参考文献を参照されたい）。
トリフルオロ酢酸は、真空蒸発によって除去され、引き続くジエチルエーテルを用いた磨砕は、粗製ペプチドをもたらす。存在するあらゆるスカベンジャーは、単純な抽出手順によって除去され、それは水相の凍結乾燥に際して、スカベンジャーを含まない粗製ペプチドを与える。ペプチド合成のための試薬は、通常、例えば、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）から入手できる。
精製は、再結晶化、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、および（通常は）例えばアセトニトリル／水勾配分離を使用した逆相高速液体クロマトグラフィーなどの技術の任意の１つまたは組み合わせによって、実施されてもよい。
本発明は、本発明によるペプチドをエンコードする核酸にさらに関する。本発明は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの組み合わせである、本発明による核酸にさらに関する。
本発明は、本発明による核酸を発現でき、および／または発現する、発現ベクターにさらに関する。
本発明は、疾患治療および医療において、特にがんの治療において使用するための本発明によるペプチド、本発明による核酸または本発明による発現ベクターにさらに関する。
本発明は、本発明によるペプチドに対して、または前記本発明によるペプチドとＭＨＣの複合体に対して特異的な対抗と、それらを製造する方法とにさらに関する。
本発明は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、特に、自己由来または同種異系Ｔ細胞に組み込まれた可溶性ＴＣＲ（ｓＴＣＲ）およびクローン化ＴＣＲ；これらを製造する方法；ならびに前記ＴＣＲを有するまたは前記ＴＣＲと交差反応する、ＮＫ細胞またはその他の細胞を製造する方法にさらに関する。
抗体およびＴＣＲは、本発明によるペプチドの免疫療法用途の追加的な実施形態である。
本発明は、前述のような本発明による核酸または発現ベクターを含んでなる、宿主細胞にさらに関する。本発明は、抗原提示細胞であり、好ましくは樹状細胞である、本発明による宿主細胞にさらに関する。
本発明は、本発明による宿主細胞を培養するステップと、宿主細胞またはその培養液からペプチドを単離するステップとを含んでなる、本発明によるペプチドを製造する方法にさらに関する。
本発明は、十分な量の抗原を抗原提示細胞に接触させることで、適切な抗原提示細胞または人工抗原提示細胞の表面に発現されるクラスＩまたはＩＩ ＭＨＣ分子上に抗原が負荷される、本発明による方法にさらに関する。
本発明は、抗原提示細胞が、配列番号１〜配列番号４８を含有する、好ましくは、配列番号１〜配列番号６（表１を参照されたい）および配列番号２４〜配列番号２８（表２を参照されたい）または変異アミノ酸配列を含有する、前記ペプチドを発現する能力がありまたは発現する、発現ベクターを含んでなる、本発明による方法にさらに関する。
本発明は、本発明による方法によって製造される活性化Ｔ細胞にさらに関し、前記Ｔ細胞は、本発明によるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを発現する細胞を選択的に認識する。
本発明は、本発明によって製造されるＴ細胞の有効数を患者に投与するステップを含んでなる、患者において、本発明による任意のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する標的細胞を死滅させる方法にさらに関する。
本発明は、薬剤としてのまたは薬剤の製造における、記載される任意のペプチド、本発明による核酸、本発明による発現ベクター、本発明による細胞、本発明による活性化Ｔリンパ球、Ｔ細胞受容体または抗体またはその他のペプチド−および／またはペプチド−ＭＨＣ−結合分子の使用にさらに関する。好ましくは、前記薬剤は、がんに対して有効である。
好ましくは、前記薬剤は、可溶性ＴＣＲまたは抗体ベースの、細胞療法、ワクチンまたはタンパク質である。
本発明は、本発明による使用にさらに関し、前記がん細胞は、肺がん、小細胞肺がん、黒色腫、肝臓がん、乳がん、子宮がん、メルケル細胞がん、膵臓がん、胆嚢がん、胆管がん、ＣＲＣ、膀胱がん、非小細胞肺がん、腎臓がん、白血病（例えば、ＡＭＬまたはＣＬＬ）、卵巣がん、食道がん、脳がん、および胃（胃）がん、最も好ましくは前立腺がん細胞である。
本発明は、がん、好ましくは前立腺がんの診断において使用され得る、本明細書で「標的」と称される、本発明によるペプチドをベースとするバイオマーカーにさらに関する。マーカーは、ペプチドそれ自体の過剰提示、または対応遺伝子の過剰発現であり得る。マーカーはまた、好ましくは免疫療法、最も好ましくはバイオマーカーによって同定されるのと同じ標的を標的とする免疫療法である、治療の成功確率を予測するのに使用されてもよい。例えば、抗体または可溶性ＴＣＲを使用して腫瘍切片が染色され、ＭＨＣと複合体形成した目的ペプチドの存在が検出され得る。
任意選択的に、抗体は、免疫刺激ドメインまたは毒素などのさらなるエフェクター機能を保有する。
本発明はまた、がん治療の文脈におけるこれらの新規標的の使用に関する。
追加的ながん性疾患に対する治療的および診断的使用の双方が、本発明によるペプチドの基本的発現産物（ポリペプチド）に関する、以下のより詳細な説明で開示される。
ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＣ（ＣＦＴＲ／ＭＲＰ）、メンバー４（ＡＢＣＣ４）−ＡＢＣＣ４は、多種多様な抗ウイルス、細胞分裂阻害、抗生物質、および心臓脈管薬ならびに細胞シグナル伝達に関与する分子をはじめとする、多種多様な内在性および生体異物性有機アニオン性化合物を細胞外に排出することができ、したがってＡＢＣＣ４に、細胞保護および細胞外シグナル伝達経路における重要な機能を付与する（Ｒｕｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００８）。ＡＢＣＣ４レベルは、前立腺がんにおいて上昇し、発現は生体外アンドロゲン治療によって調節されることが示されている。その結果、アンドロゲン除去治療は、前立腺がん組織におけるＡＢＣＣ４発現を低下させる。さらに、ＡＢＣＣ４レベルは、前立腺がんの進行に際して減少する（Ｈｏ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｍｏｎｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＡＢＣＣ４過剰発現は、例えば、肺がんなどのその他のがん型で実証されている（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＡＢＣＣ４発現の抑制は、ＡＢＣＣ４を過剰発現するがん細胞の増殖を生体外で阻害して（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４）、薬剤耐性細胞株における化学療法剤に対する感受性を回復させる（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４）ことが示された。
アストロタクチン２（ＡＳＴＮ２）−ＡＳＴＮ２は、神経細胞移動において機能することが示唆されている（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。
α−２−糖タンパク質１、亜鉛結合（ＡＺＧＰ１）−ＡＳＴＮ２は、脂肪細胞の脂質分解を刺激し、一部の進行したがんに伴う多大な脂肪の損失を引き起こす（ＵｎｉＰｒｏｔ，２０１５）。ＡＺＧＰ１発現は前立腺がんにおいて増加し、これは血清試サンプル中でも検出可能であり、潜在的なバイオマーカーとして示唆されている（Ｈａｌｅ ｅｔ ａｌ．，２００１）。高悪性度腫瘍ではレベルが低下し、ＡＺＧＰ１の発現は、前立腺がん患者における死亡率の低下および腫瘍再発の減少と関連している（Ｌａｐｏｉｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｓｅｖｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＡＺＧＰ１は、乳がんのバイオマーカーとして示唆されており、ＡＺＧＰ１レベルは低分化腫瘍において減少する（Ｈａｓｓａｎ ｅｔ ａｌ．，２００８）。
染色体６オープンリーディングフレーム１３２（Ｃ６ｏｒｆ１３２）−Ｃ６ｏｒｆ１３２は、染色体６ｐ２１．１上に位置する（ＲｅｆＳｅｑ，２００２）。
ＣＤＫＮ１Ａ相互作用ジンクフィンガータンパク質１（ＣＩＺ１）−ＣＩＺ１は、腫瘍抑制因子として機能するＣＤＫＮ１Ａ相互作用ジンクフィンガータンパク質をコードする（Ｎｉｓｈｉｂｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。結腸直腸がんでは、ＣＩＺ１は、細胞増殖、細胞周期、アポトーシス、およびコロニー形成を調節することによって、がん進行に関与することが示唆された（Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。Ｃ末端ドメインの一部を欠くＣＩＺ１変異体は、初期段階でさえも肺がん細胞中に見いだされ、バイオマーカーとしての可能性を有する（Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。
クリスタリン、μ（ＣＲＹＭ）−ＣＲＹＭは、イミン結合の還元を特異的に触媒する（Ｈａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。ＣＲＹＭはアンドロゲン調節遺伝子であり、その発現は前立腺がんで上昇するが、去勢療法耐性腫瘍では下方制御される（Ｍａｌｉｎｏｗｓｋａ ｅｔ ａｌ．，２００９）。ＣＲＹＭは、非小細胞肺がんにおいて、および子宮平滑筋肉腫の転移において、原発性腫瘍と比較して過剰発現された（Ｃｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＣＲＹＭ発現は乳がんサンプル中でも見いだされ、ＣＲＹＭはＳＥＲＥＸ分析で乳がん患者の血清によって認識された（Ｆｏｒｔｉ ｅｔ ａｌ．，２００２）。
システインおよびグリシンに富むタンパク質２（ＣＳＲＰ２）−ＣＳＲＰ２は、ＣＳＲＰ遺伝子のファミリーに属し、ＬＩＭドメイン含有タンパク質をコードする。ＣＳＲＰ２の過剰発現は、肝細胞がんの脱分化に関連する（Ｍｉｄｏｒｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，２００２）。
デスミン（ＤＥＳ）−ＤＥＳは、筋細胞に見いだされるクラスＩＩＩ中間体フィラメントである。それらは、筋原線維を互いに、およびＺ線構造の周辺から原形質膜に接続する繊維状ネットワークを形成する（Ｃｌｅｍｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＤＥＳ発現は前立腺がん組織で減少し、低いＤＥＳ発現はより短い無病期間に関連付けられている（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。結腸直腸がんでは、おそらく微小血管密度の増加、ひいては周皮細胞レベルの上昇のために、進行期の腫瘍においてＤＥＳ発現が上昇した（Ａｒｅｎｔｚ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。さらに、上昇したＤＥＳレベルは、結腸直腸がんにおける生存率低下に関連付けられている（Ｍａｅｔａｌ．、２００９）。
配列類似性１２９を有するファミリー、メンバーＡ（ＦＡＭ１２９Ａ）−ＦＡＭ１２９Ａは、染色体１ｑ２５上に位置する（ＲｅｆＳｅｑ，２００２）。ＦＡＭ１２９Ａの過剰発現は、頭頸部扁平上皮がん（Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１０ａ）、甲状腺腫瘍（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００６）、および腎細胞がん（Ａｄａｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００４）において実証されている。
ＦＫ５０６結合タンパク質１０（ＦＫＢＰ１０）−ＦＫＢＰ１０は、ＦＫＢＰ型ペプチジル−プロリルシス／トランスイソメラーゼファミリーに属するＦＫ５０６結合タンパク質１０をコードする。ＦＫＢＰ１０遺伝子産物は、小胞体に局在して、分子シャペロンの役割を果たす（ＲｅｆＳｅｑ，２００２）。ＦＫＢＰ１０は、白血病細胞におけるアドリアマイシン耐性表現型の獲得および維持に関与する新規遺伝子として同定される（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＦＫＢＰ１０は、その上方制御を通じて、結腸直腸がんに関連付けられている（Ｏｌｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００５）。対照的に、ＦＫＢＰ１０の低発現は上皮性卵巣がんに特徴的であった（Ｑｕｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。
ＧＡＴＡ結合タンパク質２（ＧＡＴＡ２）−ＧＡＴＡ２は造血に極めて重要であり、ＧＡＴＡ２の変異は骨髄異形成症候群および骨髄性白血病と関連している（Ｂｒｅｓｎｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。固形腫瘍では、ＧＡＴＡ２の過剰発現が乳がんにおいて記載されており、結腸直腸がんおよび神経膠芽腫における予後不良と相関した（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。対照的に、その他の報告は、むしろ新生物組織におけるＧＡＴＡ２の発現の減少を示唆し、肝細胞がん、膀胱がん、または腎細胞がんにおけるＧＡＴＡ２減少と、腫瘍侵襲性および転帰不良との関連性を報告する（Ｋａｎｄｉｍａｌｌａ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｐｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。
乳がん（ＧＲＥＢ１）におけるエストロゲンによる成長調節−ＧＲＥＢ１は、エストロゲン受容体調節経路における初期応答遺伝子である、エストロゲン応答遺伝子である。それは、ホルモン応答性組織およびがんにおいて、重要な役割を果たすと考えられる（ＲｅｆＳｅｑ，２００２）。ＧＲＥＢ１は、前立腺がんおよび良性前立腺肥大において過剰発現され、前立腺がん細胞のアンドロゲン誘導性増殖に関与する（Ｒａｅ ｅｔ ａｌ．，２００６）。ＧＲＥＢ１はまた、卵巣がんおよび乳がん細胞のエストロゲン刺激性増殖を媒介する（Ｌａｖｉｏｌｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。
インテグリンα７（ＩＴＧＡ７）−ＩＴＧＡ７は、ラミニン−１受容体二量体インテグリンα−７／β−１のα鎖である。ＩＴＧＡ７は、悪性腫瘍の増殖抑制に重要な腫瘍抑制遺伝子である。変異解析は、前立腺がん、肝細胞がん、軟部組織平滑筋肉腫、および多形性神経膠芽細胞腫中のＩＴＧＡ７変異を明らかにした。ＩＴＧＡ７は、非転移性前立腺がんおよび平滑筋肉腫中で下方制御された（Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。
カリウム電圧−ゲート型チャネル、サブファミリーＧ、メンバー１（ＫＣＮＧ１）−ＫＣＮＧ１は、骨格筋で豊富に発現される（Ｇｕｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００５）。
ＫＩＡＡ１２４４−ＫＩＡＡ１２４４は、ＡＲＦＧＥＦファミリーメンバー３をコードして、染色体６ｑ２３．３．上に位置する（ＲｅｆＳｅｑ，２００２）。ＫＩＡＡ１２４４は、大多数の乳がんにおいて過剰発現されることが判明した（Ｎｉｓｈｉｄａｔｅ ｅｔ ａｌ．，２００４）。
キネシンファミリーメンバー７（ＫＩＦ７）−ＫＩＦ７は、ジュベール症候群、Ｈｙｄｒｏｌｅｔｈａｌｕｓ症候群、および先端脳梁症候群をはじめとする様々な疾患に関与する。それはまた、一次繊毛形成にも関与する（Ｋｌｅｊｎｏｔ ａｎｄ Ｋｏｚｉｅｌｓｋｉ，２０１２）。その中でＫＩＦ７が重要な役割を果たす、ヘッジホッグシグナル伝達経路の異常な活性化は、皮膚基底細胞がん、胃がん、および膵臓がんなどの様々なヒト腫瘍において病理学的帰結をもたらす（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｋａｔｏｈ ａｎｄ Ｋａｔｏｈ，２００５）。
カリクレイン関連ペプチダーゼ４（ＫＬＫ４）−ＫＬＫ４は、その遺伝子が染色体１９上のクラスターに位置する、１５のカリクレインサブファミリーメンバーの１つである（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，２０００）。ＫＬＫ４は、乳がん、卵巣がん、および前立腺がんにおいて上昇する（Ｓｃｈｍｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。前立腺がんでは、ＫＬＫ４は、アンドロゲンおよびｍＴＯＲシグナル伝達と相互作用する（Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。
ラクトトランスフェリン（ＬＴＦ）−ＬＴＦは、ミルク中では最も高いレベルで、その他の粘液中では低濃度で見いだされる多機能性タンパク質である。ＬＴＦは、抗菌および抗炎症活性を発揮することが示されており、鉄恒常性に関与し、細胞増殖および分化において、およびがん発生および転移からの保護において、役割を果たす（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２００５）。ＬＴＦは、良性前立腺肥大と比較して、前立腺がん組織および血清において下方制御される。さらに、低下したＬＴＦレベルは、患者の生存率の低下と相関する（Ｓｈａｈｅｄｕｚｚａｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００７）。ＬＴＦは、おそらくＮＦ−κＢおよびＡｋｔシグナル伝達の阻害をはじめとするいくつかの機序を通じて、細胞周期の進行を妨げることによって細胞増殖を阻害する（Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｙｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。さらに、ＬＴＦは、カスパーゼ−３およびＪＮＫシグナル伝達の活性化をはじめとする、アポトーシス促進効果もまた発現する（Ｓａｋａｉ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。
ロイシン−ジッパー様転写調節因子１（ＬＺＴＲ１）−ＬＺＴＲ１は、Ｒａｓ／ＭＡＰＫ経路の調節において役割を果たすかもしれない（Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＬＺＴＲ１は、神経膠芽腫において頻繁に変異または欠失する（Ｆｒａｔｔｉｎｉｅｔａｌ．、２０１３）。
ＭＡＮＳＣドメイン含有１（ＭＡＮＳＣ１）−ＭＡＮＳＣ１は、染色体１２ｐ１３．２上に位置する（ＲｅｆＳｅｑ，２００２）。ＭＡＮＳＣ１は、前立腺腫瘍において有意に下方制御され；それは前立腺がんの開始または進行にとって重要であってもよい（Ｋｉｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００４）。様々な血液悪性腫瘍を有する患者において、ＭＡＮＳＣ１は発現増加を示す（Ｈａｆｅｒｌａｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。
微小関連タンパク質１Ｂ（ＭＡＰ１Ｂ）−ＭＡＰ１Ｂは、中枢神経系の発達および軸索機能において重要な役割を果たす微小管安定化タンパク質である（Ｈａｌｐａｉｎ および Ｄｅｈｍｅｌｔ，２００６）。小児小円形細胞腫瘍の免疫組織化学的分析は、ＭＡＰ１Ｂが、神経芽腫、横紋筋肉腫、およびウィルムス腫瘍において発現されるが、ユーイング肉腫では発現されないことを示唆した（Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙ ｅｔ ａｌ．，２００８）。
マイトジェン−活性化タンパク質キナーゼキナーゼキナーゼキナーゼ４（ＭＡＰ４Ｋ４）ＭＡＰ４Ｋ４は、セリン／スレオニンタンパク質キナーゼファミリーのメンバーであり、ＴＮＦ−αシグナル伝達経路を媒介する（ＲｅｆＳｅｑ，２００２）。ＭＡＰ４Ｋ４は、前立腺がんの侵襲性のバイオマーカーとして示唆されている（Ｒｉｚｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。
Ｍｉｓｓｈａｐｅｎ様キナーゼ１（ＭＩＮＫ１）−ＭＩＮＫ１は、細胞骨格の組織化および腫瘍遺伝子誘発性細胞老化を調節する。それは細胞質分裂に不可欠である（Ｈｙｏｄｏ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。ＭＩＮＫ１は、成長停止および老化中に、Ｒａｓによって活性化されてｐ３８活性化を媒介する（Ｎｉｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，２００５）。
モホークホメオボックス（ＭＫＸ）−ＭＫＸは、骨、骨格筋、および軟骨構造の発達における報告された役割を有する転写因子である（Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１０ｂ）。
ミオシン、重鎖１１、平滑筋（ＭＹＨ１１）−ＭＹＨ１１は、染色体領域１６ｑ１２に割り当てられてヒト臍帯動脈、膀胱、食道、および気管で発現される（Ｍａｔｓｕｏｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。ＭＹＨ１１染色体の遺伝子座（ｉｎｖ（１６）；ＣＢＦＢ−ＭＹＨ１１）における反転は、急性骨髄性白血病で頻繁に見いだされ、コア結合因子（ＣＢＦ−β）とＭＹＨ１１の発がん性キメラタンパク質の形成をもたらす（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。低いＭＹＨ１１発現レベルは、結腸直腸がんにおける予後不良に関連している（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。
ニューロフィラメント、重鎖ポリペプチド（ＮＥＦＨ）−ニューロフィラメントは、軽、中、および重鎖から構成されるＩＶ型中間径フィラメントヘテロ重合体である。神経フィラメントは、軸索骨格を構成し、神経細胞口径を機能的に維持する。それらはまた、軸索および樹状突起への細胞内輸送において役割を果たしてもよい。ＮＥＦＨは重いニューロフィラメントタンパク質をコードする（ＲｅｆＳｅｑ，２００２）。転移性腎細胞がんを有する患者では、ＮＥＦＨ ＣｐＧアイランドのメチル化は、腫瘍特異的増加、進行した疾患および遠隔転移との関連を示し、無増悪生存期間不良および全生存期間短縮と有意に関連した（Ｄｕｂｒｏｗｉｎｓｋａｊａ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。
嗅覚受容体、ファミリー５１、サブファミリーＥ、メンバー２（ＯＲ５１Ｅ２）−ＯＲ５１Ｅ２は、ヒト前立腺において優勢に発現され、前立腺がんにおいて頻繁に過剰発現されるＧタンパク質共役嗅覚受容体ファミリーのメンバーである（Ｗｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００５）。ＯＲ５１Ｅ２由来ペプチドは、抗がんワクチンの開発のための診断マーカーおよび免疫標的として使用されてもよい（Ｍａｔｓｕｅｄａ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。
ホスホジエステラーゼ１１Ａ（ＰＤＥ１１Ａ）−ＰＤＥ１１ＡはｃＡＭＰおよびｃＧＭＰの加水分解を触媒し、したがってそれぞれのシグナル伝達経路を下方制御する（Ｆａｗｃｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，２０００）。ＰＤＥ１１Ａの変異は、副腎皮質過形成ならびに家族性精巣胚細胞腫瘍と関連している（Ｇｒｅｅｎｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｈｏｒｖａｔｈ ａｎｄ Ｓｔｒａｔａｋｉｓ，２００８）。一研究ではまた、前立腺がん患者の３０％において、ＰＤＥ１１Ａのミスセンス変異も同定されている。変異体は、生体外ＰＤＥ１１Ａ活性の低下を示すものとして特徴付けられ、それらの生体内での発現レベルは減少した（Ｆａｕｃｚ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。
Ｐｌｅｃｔｉｎ（ＰＬＥＣ）−ＰＬＥＣは、細胞骨格および接着複合体の架橋および組織化に関与するタンパク質である、プラキンファミリーのメンバー、プレクチンをコードする（Ｂｏｕａｍｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＰＬＥＣは、結腸直腸腺がん、頭頸部扁平上皮がん、および膵臓がんにおいて過剰発現される（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｋａｔａｄａ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｂａｕｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。
ＰＲドメイン含有８（ＰＲＤＭ８）−ＰＲＤＭ８は、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を有する転写リプレッサーである。ＰＲＤＭ８は、Ｎｏｔｃｈ−Ｈｅｓ経路によって調節され、ＣＮＳ発達において役割を果たす（Ｋｉｎａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，２００８）。
ＲＡＢ３Ｂ、メンバーＲＡＳ発がん遺伝子ファミリー（ＲＡＢ３Ｂ）−ＲＡＢ３Ｂは、開口分泌の調節に関与するとされている低分子量ＧＴＰ結合タンパク質である（Ｒｏｔｏｎｄｏ ｅｔ ａｌ．，２００９）。ＲＡＢ３Ｂは前立腺がん患者において過剰発現され、ＡＲ、ＦｏｘＡ１、およびＮＫＸ３−１に加えて、ＲＡＢ３Ｂが前立腺がん進行の重要な調節因子であることが示唆される（Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。
溶質輸送体ファミリー３９（亜鉛輸送体）、メンバー６（ＳＬＣ３９Ａ６）−ＳＬＣ３９Ａ６は、可溶性増殖因子下流のエフェクター分子である、亜鉛輸送体ＺＩＰ６をコードする（Ｌｕｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。乳がんでは、ＳＬＣ３９Ａ６の過剰発現は、より短い再発時間ならびに疾患関連死亡までの時間の短縮と関連している（Ａｎｄｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。
前立腺２（ＳＴＥＡＰ２）の６回膜貫通上皮抗原−ＳＴＥＡＰ２は、細胞質ゾル中でゴルジ装置、原形質膜、および小胞管状構造に局在する、複数回貫通膜タンパク質をコードする（ＲｅｆＳｅｑ、２００２）。進行した疾患を有する前立腺がん患者では、ＳＴＥＡＰ２発現が上昇する。ＳＴＥＡＰ２の過剰発現は、生体外で細胞増殖ならびに移動性および浸潤能を増加させることが実証されている一方で、ノックダウンは細胞増殖を阻害して、アポトーシスを促進するかもしれない（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｗｈｉｔｅｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＳＴＥＡＰタンパク質ファミリーのその他のメンバーと共に、ＳＴＥＡＰ２は、その他のがん型においても過剰発現される。さらに、ＳＴＥＡＰは、がんバイオマーカーおよびがん免疫療法の潜在的標的として研究されている（Ｇｒｕｎｅｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。
Ｓｙｎｅｍｉｎ、中間フィラメントタンパク質（ＳＹＮＭ）−ＳＹＮＭはデスミンと細胞外マトリックスを連結し、筋肉において重要な構造的役割を果たす（Ｂｈｏｓｌｅ ｅｔ ａｌ．，２００６）。ＳＹＮＭ発現は、乳がんおよび肝細胞がんにおいて下方制御され、生存率低下、リンパ節転移、および進行したグレードと相関した（Ｎｏｅｔｚｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。
シナプトポドン２（ＳＹＮＰＯ２）−ＳＹＮＰＯ２はｍｙｏｐｏｄｉｎとしても知られており、走化性刺激に応答して細胞移動を調節する役割を果たす、アクチン結合タンパク質である（Ｋａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＳＹＮＰＯ２は腫瘍抑制遺伝子と考えられ、前立腺がんにおけるＳＹＮＰＯ２の非存在は、浸潤性および臨床的再発と相関している（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，２００６）。
形質転換成長因子β３（ＴＧＦＢ３）−ＴＧＦＢ３は、少なくとも３つのＴＧＦ−βイソ型の内の１つである。正常細胞では、ＴＧＦ−βシグナル伝達は、Ｇ１期において細胞周期を停止させて増殖を停止させ、分化を誘導し、またはアポトーシスを促進する（Ｈａｎａｈａｎ ａｎｄ Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，２０００）。ＮＳＣＬＣにおいて、ＴＧＦＢ３は浸潤促進因子である（Ｐｅｔｒｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。
ＴＲＡＦ２およびＮＣＫ相互作用キナーゼ（ＴＮＩＫ）−ＴＮＩＫは胚中心キナーゼであり、アクチン細胞骨格の調節に潜在的に関与する（Ｆｕ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。ＴＮＩＫは、Ｗｎｔ標的遺伝子の不可欠かつ特異的なアクチベーターである。ＴＮＩＫは、ＴＲＡＦ６依存性のＪＮＫおよびＮＦ−κＢシグナル伝達の中心的存在、およびヒトＢ細胞におけるシグナルの活性化および変換のトランスデューサとして記載されている（Ｓｈｋｏｄａ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。ホルモン受容体陰性乳がんでは、ＴＮＩＫは、成長および増殖に影響を及ぼす潜在的ながん遺伝子として同定された（Ｊｉａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。
トリプターゼα／β１（ＴＰＳＡＢ１）、トリプターゼβ２（ＴＰＳＢ２）−ＴＰＳＡＢ１およびＴＰＳＢ２は、どちらも主に肥満細胞によって発現されるセリンプロテアーゼである。腫瘍組織におけるトリプターゼ陽性肥満細胞の存在は、黒色腫、子宮内膜がん、乳がん、胃がんおよび結腸直腸がんをはじめとする、いくつかのがん型における血管新生と相関する（Ａｍｍｅｎｄｏｌａ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。
一過性受容体潜在的カチオンチャネル、サブファミリーＭ、メンバー８（ＴＲＰＭ８）−ＴＲＰＭ８は、寒冷刺激に応答して活性化されるナトリウムおよびカルシウムチャネルである。ＴＲＰＭ８は、主に前立腺上皮細胞で発現され、いくつかの感覚ニューロンにおいても発現される（Ｐｒｅｖａｒｓｋａｙａ ｅｔ ａｌ．，２００７）。ＴＲＰＭ８は、前立腺がん、そして乳がん、結腸がん、肺がん、および皮膚腫瘍などのその他のがん型において、過剰発現されることが報告されている（Ｔｓａｖａｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１）。
チオレドキシンドメイン含有１６（ＴＸＮＤＣ１６）−ＴＸＮＤＣ１６は、推定チオレドキシン２ドメインがある８５８アミノ酸のタンパク質をコードする；その機能は不明である。髄膜腫患者において、ＴＸＮＤＣ１６に対する自己抗体が検出されている（Ｃｏｍｔｅｓｓｅ ｅｔ ａｌ．，２００５）。
Ｕｎｃ−１３ホモログＢ（ＵＮＣ１３Ｂ）−ＵＮＣ１３Ｂはシナプス小胞開口分泌による神経伝達物質放出を制御するシナプス前活性領域のタンパク質複合体の構成要素である（Ｓｕｄｈｏｆ，２０１２）。
ジンクフィンガータンパク質４２６（ＺＮＦ４２６）−ＺＮＦ４２６は転写制御タンパク質である（Ｙａｎｇ ａｎｄ Ｗｏｏｄ，２００７）。
免疫応答の刺激は、宿主免疫系によって外来性として認識された抗原の存在に依存する。腫瘍関連抗原の存在の発見は、宿主の免疫系を用いて腫瘍成長に介入する可能性を高めた。免疫系の体液性および細胞性アームの双方を活用する様々な機構が、がん免疫療法のために目下探求されている。
細胞性免疫応答の特定の要素は、腫瘍細胞を特異的に認識して破壊できる。腫瘍浸潤性細胞集団からの、または末梢血からのＴ細胞の単離は、がんに対する自然免疫防御において、このような細胞が重要な役割を果たすことを示唆する。特に、細胞質ゾル内に位置するタンパク質または欠陥リボソーム産物（ＤＲＩＰＳ）に由来する、通常は８〜１０アミノ酸残基の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）保有ペプチドのクラスＩ分子を認識するＣＤ８陽性Ｔ細胞が、この応答において重要な役割を果たす。ヒトのＭＨＣ分子はまた、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）とも称される。
本明細書の用法では、別段の記載がない限り、全ての用語は下述のとおり定義される。
「Ｔ細胞応答」という用語は、生体外または生体内でペプチドによって誘導される、エフェクター機能の特異的増殖および活性化を意味する。ＭＨＣクラスＩ拘束性細胞毒性Ｔ細胞では、エフェクター機能は、ペプチドパルスされた、ペプチド前駆体パルスされたまたは天然ペプチド提示標的細胞の溶解；好ましくはペプチドによって誘導されるインターフェロン−γ、ＴＮＦ−α、またはＩＬ−２であるサイトカインの分泌；好ましくはペプチドによって誘導されるグランザイムまたはパーフォリンであるエフェクター分子の分泌；または脱顆粒であってもよい。
「ペプチド」という用語は、典型的に、隣接するアミノ酸のα−アミノ基とカルボニル基との間のペプチド結合によって互いに連結する、一連のアミノ酸残基を命名するために、本明細書で使用される。ペプチドは、好ましくは９アミノ酸長であるが、８アミノ酸長程度に短くあり得て、１０、１１、１２、１３以上に長くあり得て、ＭＨＣクラスＩＩペプチド（本発明のペプチドの伸長された変種）の場合、それらは１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０アミノ酸長以上に長くあり得る。
さらに「ペプチド」という用語は、典型的に、隣接するアミノ酸のα−アミノ基とカルボニル基との間のペプチド結合によって互いに連結する、一連のアミノ酸残基の塩を含むものとする。好ましくは、塩は、例えば、塩化物塩または酢酸塩（トリフルオロ酢酸塩）などの、ペプチドの薬学的に許容可能な塩である。ペプチドは生体内においては塩ではないので、本発明によるペプチドの塩は、それらの生体内の状態が、ペプチドと実質的に異なることに留意すべきである。
「ペプチド」という用語は、「オリゴペプチド」もまた含むものとする。「オリゴペプチド」という用語は、典型的に、隣接するアミノ酸のα−アミノ基とカルボニル基との間のペプチド結合によって互いに連結する、一連のアミノ酸残基を命名するために、本明細書で使用される。オリゴペプチドの長さは、その中で正しいエピトープまたはエピトープが保持されれば、本発明には重要でない。オリゴペプチドは、典型的に、約３０アミノ酸残基長未満であり、約１５アミノ酸長を超える。
「ポリペプチド」という用語は、典型的に、隣接するアミノ酸のα−アミノ基とカルボニル基との間のペプチド結合によって互いに連結する、一連のアミノ酸残基を指す。正しいエピトープが保持されれば、ポリペプチドの長さは本発明にとって重要でない。ペプチドまたはオリゴペプチドという用語とは対照的に、ポリペプチドという用語は、約３０を超えるアミノ酸残基を含有する分子を指すことが意図される。
ペプチド、オリゴペプチド、タンパク質またはこのような分子をコードするポリヌクレオチドは、免疫応答を誘導できれば「免疫原性」である（したがって本発明における「免疫原」である）。本発明では、免疫原性は、より具体的には、Ｔ細胞応答を誘導する能力と定義される。したがって「免疫原」は、免疫応答を誘導できる分子であり、本発明では、Ｔ細胞応答を誘導できる分子である。別の態様では、免疫原は、それに対する特異的抗体またはＴＣＲを生じさせるのに使用される、ペプチド、ペプチドとＭＨＣの複合体、オリゴペプチド、および／またはタンパク質であり得る。
クラスＩ Ｔ細胞「エピトープ」は、クラスＩ ＭＨＣ受容体に結合している短いペプチドを必要とし、三成分複合体（ＭＨＣクラスＩα鎖、β−２−ミクログロブリン、およびペプチド）を形成し、それは、適切な親和性でＭＨＣ／ペプチド複合体に結合する適合Ｔ細胞受容体を保有するＴ細胞によって、認識され得る。ＭＨＣクラスＩ分子に結合するペプチドは、典型的に８〜１４アミノ酸長であり、最も典型的には９アミノ酸長である。
ヒトにおいては、ＭＨＣクラスＩ分子（ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）ともまた称されるヒトのＭＨＣ分子）をコードする、３つの異なる遺伝子座、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃがある。ＨＬＡ−Ａ＊０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２、およびＨＬＡ−Ｂ＊０７は、これらの遺伝子座から発現され得る、異なるＭＨＣクラスＩ対立遺伝子の例である。
表8: HLA-A*02およびHLA-A*24の発現頻度F、および最も高頻度のHLA-DR血清型。頻度は、ハーディ・ワインベルグの式F = 1 - (1-Gf)2を用いて、Mori et al. (Mori et al., 1997)から適応された米国人集団内のハプロタイプ頻度Gfから推定された。連鎖不均衡のために、A*02またはA*24と特定のHLA-DR対立遺伝子との組み合わせは、それらの単一頻度から予測されるよりも、豊富でありまたは低頻度であるかもしれない。詳細については、Chanock et al. (Chanock et al., 2004)を参照されたい。
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本発明のペプチドは、好ましくは、本明細書に記載される本発明のワクチンに包含される場合、ＨＬＡ−Ａ＊０２またはＨＬＡ−Ａ＊２４に結合する。ワクチンはまた、汎結合ＭＨＣクラスＩＩペプチドを含んでもよい。したがって、本発明のワクチンを使用して、Ａ＊０２陽性の患者においてがんを治療し得る一方で、これらのペプチドの汎結合特性のために、ＭＨＣクラスＩＩアロタイプを選択する必要はない。
本発明のＡ＊０２ペプチドが、例えばＡ＊２４などの別の対立遺伝子に結合するペプチドと組み合わされた場合、ＭＨＣクラスＩ対立遺伝子のいずれか単独による対処と比較して、任意の患者集団のより高い割合を治療し得る。大多数の集団では、対立遺伝子のいずれか単独によって、５０％未満の患者が対処され得た一方で、ＨＬＡ−Ａ＊２４およびＨＬＡ−Ａ＊０２エピトープを含んでなるワクチンは、任意の妥当な集団で、少なくとも６０％の患者を治療し得る。具体的には、以下の様々な地域において、これらの対立遺伝子の少なくとも１つが、以下の百分率の患者で陽性である：米国６１％、西欧６２％、中国７５％、韓国７７％、日本８６％。（ｗｗｗ．ａｌｌｅｌｅｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ．ｎｅｔから計算された）。
好ましい実施形態では、「ヌクレオチド配列」という用語は、デオキシリボヌクレオチドのヘテロ重合体を指す。
特定のペプチド、オリゴペプチド、またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、天然起源であってもよく、またはそれらは合成的に構築されてもよい。一般に、本発明のペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質をエンコードするＤＮＡ断片は、ｃＤＮＡフラグメントと短いオリゴヌクレオチドリンカーから構築され、またはひと続きのオリゴヌクレオチドから構築されて、微生物またはウイルスオペロンに由来する調節因子を含んでなる、組換え転写単位で発現できる合成遺伝子が提供される。
本明細書の用法では「ペプチドをコーディング（またはコード）するヌクレオチド」という用語は、配列が、例えば、ＴＣＲの製造に有用な樹状細胞または別の細胞株によって発現される生体系と適合性である、人工（人造）開始および停止コドンを含むペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を指す。
本明細書の用法では、核酸配列への言及は、一本鎖および二本鎖の核酸の双方を含む。したがって、例えば、特異的配列は、文脈上明らかに別の意味が示唆されない限り、このような配列の一本鎖ＤＮＡ、このような配列とその補体との二本鎖（二本鎖ＤＮＡ）、およびこのような配列の補体を指す。
「コード領域」という用語は、その天然ゲノム環境内で、遺伝子の発現産物を天然にまたは正常にコードする遺伝子の部分、すなわち、遺伝子の天然発現産物を生体内でコードする領域を指す。
コード領域は、非変異（「正常」）、変異または改変遺伝子に由来し得て、またはＤＮＡ合成技術の当業者に周知の方法を使用して実験室で完全に合成された、ＤＮＡ配列または遺伝子にさえ由来し得る。
「発現産物」という用語は、遺伝子の、そして遺伝コード縮重に起因する同等物をコードし、したがって同一アミノ酸をコードする任意の核酸配列の天然翻訳産物である、ポリペプチドまたはタンパク質を意味する。
コード配列に言及する場合、「フラグメント」という用語は、その発現産物が、完全コード領域の発現産物と本質的に同一の生物学的機能または活性を保つ、完全未満のコード領域を含んでなるＤＮＡの部分を意味する。
「ＤＮＡ断片」という用語は、別々のフラグメントの形態の、またはより大型のＤＮＡコンストラクトの構成要素としての、ＤＮＡポリマーを指し、それは、実質的に純粋な、すなわち、混入内因性物質を含まない形態で、例えばクローニングベクターを使用した標準生化学的方法によって、断片およびその構成ヌクレオチド配列が同定、操作、および回収できる量または濃度で、少なくとも１回単離されたＤＮＡに由来する。このような断片は、典型的に真核生物遺伝子内に存在する内部非翻訳配列またはイントロンによって中断されていない、読み取り枠の形態で提供される。非翻訳ＤＮＡ配列は、それがコード領域の操作または発現を妨げない、読み取り枠下流に存在してもよい。
「プライマー」という用語は、短い核酸配列を意味し、それはＤＮＡの１本鎖と対合し得て、ＤＮＡポリメラーゼがそこでデオキシリボヌクレオチド鎖合成を開始する、遊離３'−ＯＨ末端を提供する。
「プロモーター」という用語は、転写を開始するためのＲＮＡポリメラーゼ結合に関与する、ＤＮＡの領域を意味する。
「単離」という用語は、物質が、その元の環境（例えば、それが天然起源であれば天然環境）から取り出されていることを意味する。例えば、生きている動物に存在する天然ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、天然システムで共存する物質の一部または全部から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されている。このようなポリヌクレオチドはベクターの一部であり得て、および／またはこのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の一部であり得るが、このようなベクターまたは組成物がその天然環境の一部でないと言う意味では、なおも単離されている。
本発明によって開示されるポリヌクレオチド、および組換えまたは免疫原性ポリペプチドは、「精製」形態であってもよい。「精製」という用語は、完全に純粋である必要はなく；むしろ、それは相対的定義であることが意図されて、これらの用語が当業者によって理解されるように、高度に精製された調製物、または部分的にのみ精製された調製物を含み得る。例えば、ｃＤＮＡライブラリーから単離された個々のクローンは、電気泳動的に均一に、従来法で精製されている。少なくとも１桁、好ましくは２または３桁、より好ましくは４または５桁までの、出発原料または天然物質の精製が明示的に検討される。さらに、重量基準で、好ましくは９９．９９９％、または少なくとも９９．９９％または９９．９％；さらに望ましくは９９％以上の純度を有する、特許請求されるポリペプチドが明示的に包含される。
本発明によって開示される核酸およびポリペプチド発現産物、ならびにこのような核酸および／またはこのようなポリペプチドを含有する発現ベクターは、「富化形態」であってもよい。本明細書の用法では、「濃縮」という用語は、物質濃度が、（例えば）その天然濃度の少なくとも約２、５、１０、１００、または１０００倍であることを意味し、有利には重量基準で０．０１％、好ましくは重量基準で少なくとも約０．１％である。重量基準で約０．５％、１％、５％、１０％、および２０％の富化調製物もまた、検討される。本発明を構成する、配列、コンストラクト、ベクター、クローン、およびその他の物質は、有利には、富化または単離形態であり得る。「活性フラグメント」という用語は、通常は、単独で、または任意選択的に適切なアジュバントと共に、またはベクター中で、例えば、ウサギまたはマウスのようなそしてまたヒトをはじめとする哺乳類などの動物に投与すると免疫応答を生じる（すなわち、免疫原性を有する）ペプチド、ポリペプチドまたは核酸配列のフラグメントを意味し、このような免疫応答は、ヒトなどのレシピエント動物内でＴ細胞応答を刺激する形態を取る。代案としては、「活性フラグメント」はまた、生体外Ｔ細胞応答を誘導するのに使用されてもよい。
本明細書の用法では、ポリペプチドとの関連で使用される場合、「部分」、「断片」、および「フラグメント」という用語は、アミノ酸残基などの連続する残基の配列を指し、その配列はより大型の配列の部分集合を形成する。例えば、ポリペプチドが、トリプシンまたはキモトリプシンなどの一般的エンドペプチダーゼのいずれかによって処理されれば、このような処理から得られるオリゴペプチドは、出発ポリペプチドの部分、断片またはフラグメントに相当するであろう。ポリヌクレオチドに関して使用される場合、これらの用語は、いずれかのエンドヌクレアーゼによる前記ポリヌクレオチドの処理によって生じる生成物を指す。
本発明によると、配列に言及する場合、「同一性百分率」または「パーセント同一」という用語は、比較される配列（「比較配列」）と、記載されまたは特許請求される配列（「参照配列」）とのアライメント後に、配列が、特許請求されまたは記載される配列と比較されることを意味する。次に同一性百分率は、次式に従って判定される：
同一性百分率＝１００［１−（Ｃ／Ｒ）］
式中、Ｃは、参照配列と比較される配列との間のアライメント長にわたる、参照配列と比較配列の間の差異の数であり、
（ｉ）比較配列中に対応する整列塩基またはアミノ酸を有しない、参照配列中の各塩基またはアミノ酸、および
（ｉｉ）参照配列中の各ギャップ、および
（ｉｉｉ）比較配列中の整列塩基またはアミノ酸と異なる、参照配列中の各整列塩基またはアミノ酸が差異を構成して、
（ｉｉｉｉ）アライメントは、整合配列の１位から開始しなくてはならず；
Ｒは、比較配列とのアライメント長にわたる参照配列中の塩基またはアミノ酸の数であり、参照配列中に生じる任意のギャップもまた、塩基またはアミノ酸として数えられる。
比較配列と、それに対して同一性百分率が上のように計算される参照配列との間に、特定の最小同一性百分率とほぼ同じまたはそれを上回るアライメントが存在すれば、その中に、上記のように計算された同一性百分率が特定の同一性百分率未満であるアライメントが存在したとしても、比較配列は、参照配列との特定の最小同一性百分率を有する。
したがって上述したように、本発明は、配列番号１〜配列番号４８、または配列番号１〜配列番号４８と８８％相同的であるその変異体、またはＴ細胞を前記ペプチドと交差反応させるその変異体からなる群から選択される配列を含んでなる、ペプチドを提供する。本発明のペプチドは、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子または前記ペプチドの伸長バージョンをクラスＩＩに結合する能力を有する。
本発明では、「相同的」という用語は，２つのアミノ酸配列、すなわちペプチドまたはポリペプチド配列の配列間の同一性の程度を指す（上の同一性百分率を参照されたい）。前述の「相同性」は、比較される配列にわたり、最適条件下でアライメントされた２つの配列を比較することで判定される。このような配列相同性は、例えばＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを使用してアライメントを作成することで、計算され得る。一般に利用できる配列解析ソフトウェア、より具体的には、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ、ＧＥＮＥＴＹＸまたはその他のツールが、公共データベースによって提供される。
当業者は、特定のペプチドの変異体によって誘導されるＴ細胞が、ペプチドそれ自体と交差反応できるかどうかを評価できるであろう（Ａｐｐａｙ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｃｏｌｏｍｂｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｆｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｚａｒｅｍｂａ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。
所与のアミノ酸配列の「変異型」によって、本発明者らは、ペプチドが、配列番号１〜配列番号４８からなる所与のアミノ酸配列からなるペプチドと実質的に同様に、ＨＬＡ分子となおも結合できるように、（例えば、それらを別の天然アミノ酸残基の側鎖で、またはその他の側鎖で置換することにより）例えば、アミノ酸の１つまたは２つの残基の側鎖が変化することを意味する。例えば、ペプチドは、それがＨＬＡ−Ａ＊０２または−ＤＲなどの適切なＭＨＣ分子の結合溝と相互作用して結合する能力を改善せずとも、少なくとも維持するように修飾されてもよく、このようにしてそれは、活性化ＣＴＬのＴＣＲに結合する能力を改善せずとも、少なくとも維持する。
これらのＴ細胞は、引き続いて細胞と交差反応して、本発明の態様で定義される同族ペプチドの天然アミノ酸配列を含有するポリペプチドを発現する細胞を殺滅し得る。学術文献およびデータベース（Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｇｏｄｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７）から演繹され得るように、ＨＬＡ結合ペプチドの特定の位置は、典型的に、アンカー残基であり、結合溝を構成するポリペプチド鎖の極性、電気物理的、疎水性、および空間特性によって画定されるＨＬＡ受容体の結合モチーフと適合する、コア配列を形成する。したがって、当業者は、既知のアンカー残基を保つことで、配列番号１〜配列番号４８に記載されるアミノ酸配列を修飾でき、このような変異型がＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子に結合する能力を維持するかどうかを判定できるであろう。本発明の変異型は、活性化Ｔ細胞のＴＣＲに結合する能力を維持し、それは引き続いて、本発明の態様で定義されるような同族ペプチドの天然アミノ酸配列を含有するポリペプチドを発現する細胞と交差反応して、それを殺滅し得る。
本明細書で開示される元の（未修飾）ペプチドは、特に明記されない場合は、ペプチド鎖内の異なる、おそらくは選択的な部位における、１つまたは複数の残基の置換によって修飾され得る。好ましくはこれらの置換は、アミノ酸鎖の末端に位置する。このような置換は、保存的性質であってもよく、例えば、疎水性アミノ酸が別の疎水性アミノ酸によって置換されるなど、構造および特徴の類似したアミノ酸によってアミノ酸が置換される。さらにより保存的な置換は、ロイシンのイソロイシンによる置換などの、同一または類似サイズおよび化学的性質のアミノ酸の置換である。天然起源相同タンパク質ファミリーの配列多様性の研究では、特定のアミノ酸置換は、他よりも耐容されることが多く、これらは、元のアミノ酸とその置換物との間のサイズ、電荷、極性、および疎水性の類似性との相関を示すことが多く、これが「保存的置換」の定義の基礎である。
保存的置換は、本明細書では、以下の５つのグループの１つの中の交換として定義される：グループ１−小型脂肪族、非極性またはわずかに極性の残基（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ）；グループ２−極性の負に帯電した残基およびそれらのアミド（Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ）；グループ３−極性の正に帯電した残基（Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）；グループ４−大型脂肪族非極性残基（Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ）；およびグループ５−大型芳香族残基（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）。
より保存的でない置換は、アラニンのイソロイシン残基による置換などの、類似した特徴を有するがサイズがいくらか異なる別のアミノ酸による置換を伴うかもしれない。高度に非保存的な置換は、極性アミノ酸の、または塩基性アミノ酸の酸性アミノ酸による置換を伴うかもしれない。しかし化学効果は完全に予測可能でなく、遊離基置換は単純な化学的原理からは予測できない偶然の効果を生じさせる可能性があるので、このような「遊離基」置換は、潜在的に無効であるとして却下され得ない。
もちろんこのような置換には、通常のＬ−アミノ酸以外の構造体が関与してもよい。したがってＤ−アミノ酸が、本発明の抗原性ペプチドに通常見いだされるＬ−アミノ酸を置換するかもしれず、依然として本明細書の開示に包含される。さらに、非標準アミノ酸（すなわち、一般的な天然タンパク質新生アミノ酸以外）もまた置換目的で使用して、本発明による免疫原および免疫原性ポリペプチドが製造されてもよい
２つ以上の位置における置換が、以下に定義されるように実質的に同等のまたはそれを超える抗原活性のあるペプチドをもたらすことが判明した場合、これらの置換の組み合わせを試験して、置換の組み合わせが、ペプチドの抗原性に相加または相乗効果をもたらすかどうかが判定される。最大でも、ペプチド内の４つ以上の位置を超えて同時に置換されることはない。
本明細書で示されるようなアミノ酸配列から本質的になるペプチドは、非修飾ペプチドと比較すると、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩ分子に結合する能力が、実質的に変化したり悪影響を受けたりすることなく交換される、１つまたは２つの非アンカーアミノ酸を有し得る（アンカーモチーフについては下記を参照されたい）。別の実施形態では、本明細書で示されるようなアミノ酸配列から本質的になるペプチドにおいては、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩ分子に結合する能力が非修飾ペプチドと比較して実質的に変化したり悪影響を受けることなく、１つまたは２つのアミノ酸が、それらの保存的交換パートナー（以下を参照されたい）で交換され得る。
Ｔ細胞受容体との相互作用に実質的に寄与しないアミノ酸残基は、その組み込みが、Ｔ細胞反応性に実質的に影響を及ぼさず、関連ＭＨＣとの結合を排除しない、その他のアミノ酸での置換によって修飾され得る。したがって与えられた但し書きを除いて、本発明のペプチドは、与えられたようなアミノ酸配列またはそれらの部分または変異体を含む、任意のペプチド（本発明者らは、その用語にオリゴペプチドまたはポリペプチドを含める）であってもよい。
表9：配列番号2、4、および8に記載のHLA-A*02ペプチドの好ましい変種およびモチーフ:
Figure 0006884752
Figure 0006884752
表10：配列番号25、30、および34に記載のHLA-A*24ペプチドの好ましい変種およびモチーフ:
Figure 0006884752
より長い（伸長された）ペプチドもまた、適切であってもよい。ＭＨＣクラスＩエピトープは、通常は８〜１１アミノ酸長であるが、実際のエピトープを含むより長いペプチドまたはタンパク質から、ペプチドプロセッシングによって作製することが可能である。実際のエピトープ側面に位置する残基は、プロセッシング中に実際のエピトープを曝露させるのに必要なタンパク質分解切断に、実質的に影響を及ぼさない残基であることが好ましい。
本発明のペプチドは、最大４個のアミノ酸によって伸長させ得て、すなわち４：０〜０：４の間のあらゆる組み合わせで、どちらかの末端に１，２、３または４個のアミノ酸が付加され得る。本発明による伸長の組み合わせは、表１１にある。
表11: 本発明のペプチドの伸長の組み合わせ
Figure 0006884752
伸長／延長のためのアミノ酸は、元のタンパク質配列のペプチドまたは任意のその他のアミノ酸であり得る。伸長を利用して、ペプチドの安定性または溶解度を高め得る。
したがって本発明のエピトープは、天然起源腫瘍関連または腫瘍特異的エピトープと同一であってもよく、またはそれらが実質的に同一の抗原活性を有しさえすれば、４つ以下の残基が参照ペプチドと異なるエピトープを含んでもよい。
代案の実施形態では、ペプチドは、４つを超えるアミノ酸で、好ましくは最大３０アミノ酸の全長まで、片側または両側で伸長される。これは、ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドをもたらしてもよい。ＭＨＣクラスＩＩへの結合は、当該技術分野で公知の方法によって試験される得る。
したがって、本発明は、ＭＨＣクラスＩエピトープのペプチドおよび変異型を提供し、ペプチドまたは変異型は、８〜１００、好ましくは８〜３０、最も好ましくは８〜１４、すなわち８、９、１０、１１、１２、１３、１４アミノ酸の全長を有し、伸長されたクラスＩＩ結合ペプチドの場合、長さはまた、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２アミノ酸であり得る。
もちろん、本発明によるペプチドまたは変異型は、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩの分子に結合する能力を有する。ペプチドまたは変異体のＭＨＣ複合体への結合は、当該技術分野で既知の方法によって試験されてもよい。
好ましくは、本発明によるペプチドに特異的なＴ細胞を置換ペプチドについて試験する場合、置換ペプチドが背景に対して最大溶解増加の半分を達成するペプチド濃度は、約１ｍＭ以下、好ましくは約１μＭ以下、より好ましくは約１ｎＭ以下、さらにより好ましくは約１００ｐＭ以下、最も好ましくは約１０ｐＭ以下である。置換ペプチドが、２人以上、少なくとも２人、より好ましくは３人の個人からのＴ細胞によって認識されることもまた好ましい。
本発明の特に好ましい実施形態では、ペプチドは、配列番号に１〜配列番号４８に記載のアミノ酸配列からなり、またはそれから本質的になる。
「から本質的になる」は、本発明によるペプチドが、配列番号１〜配列番号４８のいずれかに記載の配列またはその変異体に加えて、ＭＨＣ分子エピトープのエピトープとして機能するペプチドの一部を必ずしも構成しない、追加的なＮおよび／またはＣ末端に位置するアミノ酸の一連の配列を含有することを意味するものとする。
それでもなお、これらの一連の配列は、本発明によるペプチドの細胞への効率的な導入を提供するのに重要であり得る。本発明の一実施形態では、ペプチドは、例えば、ＮＣＢＩ、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ００４９７に由来する、ＨＬＡ−ＤＲ抗原関連不変鎖（ｐ３３、以下の「Ｉｉ」）の８０個のＮ末端アミノ酸を含んでなる、融合タンパク質の一部である。その他の融合物においては、本発明のペプチドは、本明細書に記載されるような抗体、またはその機能的部分に、特に抗体の配列に、前記抗体によって特異的に標的化されるように融合し得て、または例えば、本明細書に記載されるような樹状細胞に対して特異的な抗体に、またはその中に融合し得る。
さらにペプチドまたは変異型は、より強力な免疫応答を引き起こすために、安定性および／またはＭＨＣ分子への結合を改善するようにさらに修飾されてもよい。ペプチド配列のこのような最適化方法は当該技術分野で周知であり、例えば、逆ペプチド結合または非ペプチド結合の導入が挙げられる。
逆ペプチド結合においては、アミノ酸残基はペプチド（−ＣＯ−ＮＨ−）結合によって連結せず、ペプチド結合が逆転する。このようなレトロ−インベルソペプチド模倣剤は、例えば、参照により本明細書に援用される、Ｍｅｚｉｅｒｅ ｅｔ ａｌ（１９９７）（Ｍｅｚｉｅｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７）に記載されるものなどの当該技術分野で既知の方法を使用して製造されてもよい。このアプローチは、側鎖の方向でなく主鎖に関与する変化を含有する、擬ペプチドの生成を伴う。Ｍｅｚｉｅｒｅ ｅｔ ａｌ．（Ｍｅｚｉｅｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７）は、ＭＨＣ結合およびＴヘルパー細胞応答のために、これらの擬ペプチドが有用であることを示す。ＣＯ−ＮＨペプチド結合の代わりにＮＨ−ＣＯ結合を含有するレトロインバースペプチドは、タンパク質分解に対してはるかにより高い耐性がある。
非ペプチド結合は、例えば、−ＣＨ２−ＮＨ、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、および−ＣＨ２ＳＯ−である。米国特許第４，８９７，４４５号明細書は、標準手順によって合成されるポリペプチド、およびＮａＣＮＢＨ３の存在下でアミノアルデヒドとアミノ酸を反応させることで合成される非ペプチド結合が関与する、ポリペプチド鎖中の非ペプチド結合（−ＣＨ２−ＮＨ）を固相合成する方法を提供する。
上述の配列を含んでなるペプチドは、それらのアミノおよび／またはカルボキシ末端に存在する追加的な化学基と共に合成して、ペプチドの安定性、生物学的利用能、および／または親和性を高めてもよい。例えば、カルボベンゾキシル、ダンシル、またはｔ−ブチルオキシカルボニル基などの疎水性基が、ペプチドのアミノ末端に付加されてもよい。同様に、アセチル基または９−フルオレニルメトキシ−カルボニル基が、ペプチドのアミノ末端に配置されてもよい。さらに、疎水性基、ｔ−ブチルオキシカルボニル、またはアミド基が、ペプチドのカルボキシ末端に付加されてもよい。
さらに、本発明のペプチドは、それらの立体配置を改変するように合成されてもよい。例えば、通常のＬ異性体でなく、ペプチドの１つまたは複数のアミノ酸残基のＤ異性体が使用されてもよい。なおもさらに、本発明のペプチドのアミノ酸残基の少なくとも１つは、周知の非天然起源アミノ酸残基の１つで置換されてもよい。これらのような変化は、本発明のペプチドの安定性、生物学的利用能および／または結合作用の増加に役立ってもよい。
同様に、本発明のペプチドまたは変異体は、ペプチド合成の前または後のどちらかに、特定のアミノ酸を反応させることで化学的に修飾されてもよい。このような修飾の例は、当該技術分野で周知であり、例えば、参照により本明細書に援用される、Ｒ． Ｌｕｎｄｂｌａｄ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，３ｒｄ ｅｄ．ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，２００４（Ｌｕｎｄｂｌａｄ，２００４）に要約される。アミノ酸の化学修飾としては、これに限定されるものではないが（ａｌｔｈｏｕｇｈ ｗｉｔｈｏｕｔ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ ｔｈｅｒｅｔｏ）、アシル化、アミジン化、リジンのピリドキシル化、還元アルキル化、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）によるアミノ基のトリニトロベンジル化、システインのシステイン酸への過ギ酸酸化によるカルボキシル基のアミド修飾およびスルフヒドリル修飾、水銀誘導体形成、その他のチオール化合物との混合ジスルフィド形成、マレイミドとの反応、ヨード酢酸またはヨードアセトアミドによるカルボキシメチル化、およびアルカリ性ｐＨでのシアネートによるカルバモイル化による修飾が挙げられるが、これに限定されるものではない（ｉｓ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）。この点において、当業者は、タンパク質の化学修飾に関するより詳細な手順について、Ｃｈａｐｔｅｒ １５ ｏｆ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｅｄｓ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ ＮＹ １９９５−２０００）（Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５）を参照されたい。
簡単に述べると、例えばタンパク質中のアルギニル残基の修飾は、付加体を形成するためのフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、および１，２−シクロヘキサンジオンなどの隣接するジカルボニル化合物の反応に基づくことが多い。別の例は、メチルグリオキサールとアルギニン残基の反応である。システインは、リジンおよびヒスチジンなどのその他の求核性部位の同時の修飾なしに修飾され得る。その結果、システイン修飾のために多数の試薬が利用可能である。Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈなどの会社のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ）が、特定の試薬に関する情報を提供する。
タンパク質中のジスルフィド結合の選択的還元もまた、一般的である。ジスルフィド結合は、生物医薬品の加熱処理中に形成されて酸化され得る。ウッドワード試薬Ｋを使用して、特定のグルタミン酸残基が修飾されてもよい。Ｎ−（３−（ジメチルアミノ）プロピル）−Ｎ'−エチルカルボジイミドを利用して、リジン残基とグルタミン酸残基との間に分子内架橋が形成され得る。例えば、ジエチルピロ炭酸は、タンパク質中のヒスチジル残基修飾のための試薬である。ヒスチジンはまた、４−ヒドロキシ−２−ノネナールを使用して修飾され得る。リジン残基およびその他のα−アミノ基の反応物は、例えば、ペプチドの表面への結合またはタンパク質／ペプチド架橋で有用である。リジンはポリ（エチレン）グリコールの付着部位であり、タンパク質のグリコシル化の主要な修飾部位である。タンパク質中のメチオニン残基は、例えば、ヨードアセトアミド、ブロモエチルアミン、およびクロラミンＴによって修飾され得る。
テトラニトロメタンおよびＮ−アセチルイミダゾールを使用して、チロシル残基が修飾され得る。ジチロシンの形成を通じた架橋は、過酸化水素／銅イオンによって達成され得る。
トリプトファンの修飾に関する最近の研究では、Ｎ−ブロモサクシニミド、臭化２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジルまたは３−ブロモ−３−メチル−２−（２−ニトロフェニルメルカプト）−３Ｈ−インドール（ＢＰＮＳ−スカトール）が使用されている。
ＰＥＧによる治療用タンパク質およびペプチドの成功裏の修飾が、循環半減期の延長に関連することが多い一方で、タンパク質と、グルタルアルデヒド、ポリエチレングリコールジアクリレート、およびホルムアルデヒドとの架橋は、ハイドロゲル調製のために使用される。免疫療法のためのアレルゲンの化学修飾は、カリウムシアネートでのカルバミル化によって達成されることが多い。
ペプチドが修飾されまたは非ペプチド結合を含む、ペプチドまたは変異体は、本発明の好ましい実施形態である。一般に、ペプチドおよび変異体（少なくともアミノ酸残基間にペプチド結合を含有するもの）は、Ｌｕｋａｓ ｅｔ ａｌ．（Ｌｕｋａｓ ｅｔ ａｌ．，１９８１）によって、そしてその中で引用される参考文献によって開示される、Ｆｍｏｃ−ポリアミド様式の固相ペプチド合成によって合成されてもよい。一時的なＮ−アミノ基保護は、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基によってもたらされる。この高度に塩基不安定性の保護基の反復性切断は、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中の２０％ピペリジンを使用して実施される。側鎖官能基は、それらのブチルエーテル（セリン、スレオニン、およびチロシンの場合）、ブチルエステル（グルタミン酸およびアスパラギン酸の場合）、ブチルオキシカルボニル誘導体（リジンおよびヒスチジンの場合）、トリチル誘導体（システインの場合）、および４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル誘導体（アルギニンの場合）として保護されてもよい。グルタミンまたはアスパラギンがＣ末端残基である場合、側鎖アミド官能基を保護するために、４，４'−ジメトキシベンズヒドリル基が活用される。固相担体は、ジメチルアクリルアミド（主鎖単量体）、ビスアクリロイルエチレンジアミン（架橋剤）、およびアクリロイルサルコシンメチルエステル（機能化因子）の３つの単量体から構成される、ポリジメチル−アクリルアミドポリマーをベースとする。使用されるペプチド−対−樹脂の切断可能な結合因子は、酸不安定性４−ヒドロキシメチル−フェノキシ酢酸誘導体である。逆転Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシル−カルボジイミド／１ヒドロキシベンゾトリアゾール媒介共役手順を使用して付加されるアスパラギンおよびグルタミンを除いて、全てのアミノ酸誘導体は、それらのあらかじめ形成された対称的な無水物誘導体として付加される。全ての共役および脱保護反応は、ニンヒドリン、トリニトロベンゼンスルホン酸またはイサチン（ｉｓｏｔｉｎ）試験手順を使用してモニターされる。合成完了時に、ペプチドは樹脂担体から切断され、同時に、５０％スカベンジャー混合物を含有する９５％トリフルオロ酢酸での処理によって、側鎖保護基が除去される。一般に使用されるスカベンジャーとしては、エタンジチオール、フェノール、アニソール、および水が挙げられ、正確な選択は、合成されるペプチドの構成アミノ酸に左右される。ペプチドの合成のための固相法と溶液相法の組み合わせもまた、可能である（例えば、（Ｂｒｕｃｋｄｏｒｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４）、およびその中で引用される参考文献を参照されたい）。
トリフルオロ酢酸は、真空蒸発によって除去され、引き続くジエチルエーテルを用いた磨砕は、粗製ペプチドをもたらす。存在するあらゆるスカベンジャーは、単純な抽出手順によって除去され、それは水相の凍結乾燥に際して、スカベンジャーを含まない粗製ペプチドを与える。ペプチド合成のための試薬は、通常、例えば、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）から入手できる。
精製は、再結晶化、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、および（通常は）例えばアセトニトリル／水勾配分離を使用した逆相高速液体クロマトグラフィーなどの技術の任意の１つまたは組み合わせによって、実施されてもよい。
ペプチドの分析は、薄層クロマトグラフィー、電気泳動法、特にキャピラリー電気泳動法、固相抽出（ＣＳＰＥ）、逆相高速液体クロマトグラフィー、酸加水分解後のアミノ酸分析を使用して、高速原子衝撃（ＦＡＢ）質量分光分析によって、ならびにＭＡＬＤＩおよびＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ質量分光分析によって、実施されてもよい。
過剰提示ペプチドを選択するために、中央値サンプル提示ならびに反復試験変動を示す、提示プロファイルが計算される。プロファイルは、目的腫瘍実体のサンプルを正常なサンプルのベースラインに並置させる。次に、線形混合効果モデルのｐ値を計算し（Ｐｉｎｈｅｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，２０１５）、偽発見率によって複数試験について補正することで（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ ａｎｄ Ｈｏｃｈｂｅｒｇ，１９９５）、これらの各プロファイルが過剰提示スコアに統合され得る（実施例１参照）。
質量分析によるＨＬＡリガンドの同定と相対的定量化のために、衝撃凍結サンプルからのＨＬＡ分子が精製されて、ＨＬＡ関連ペプチドが単離された。前立腺特異的抗原に由来するペプチドは、その良性または悪性状態に関わりなく、任意の前立腺組織において同定され得るので、前立腺特異的抗原によってコードされるペプチドを同定する目的で、前立腺がん組織検体に加えて、良性前立腺肥大サンプルもまた分析された。単離ペプチドを分離して、オンラインナノエレクトロスプレーイオン化（ｎａｎｏＥＳＩ）液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）実験によって配列を同定した。得られたペプチド配列は、前立腺がんサンプル（Ｎ＝３４Ａ＊０２陽性サンプルおよびＮ＝３７Ａ＊２４陽性サンプル）ならびに追加的な良性前立腺肥大（Ｎ＝１０Ａ＊０２陽性サンプルおよびＮ＝３Ａ＊２４陽性サンプル）から記録された天然ＴＵＭＡＰのフラグメンテーションパターンと、同一配列の対応する合成標準ペプチドのフラグメンテーションパターンとの比較によって確認された。ペプチドは、腫瘍性組織のＨＬＡ分子のリガンドとして直接同定されたので、これらの結果は、前立腺腫瘍を有する７０人の患者から得られた腫瘍組織上で同定されたペプチドの天然プロセシングと提示の直接的証拠を提供する。
発見パイプラインＸＰＲＥＳＩＤＥＮＴ（登録商標）ｖ２．１（例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第２０１３−００９６０１６号明細書を参照されたい）は、いくつかの異なる非がん性組織および臓器と比較した、がん組織上のＨＬＡ拘束性ペプチドレベルの直接相対定量化に基づく、妥当な過剰提示ペプチドワクチン候補の同定と選択ができるようにする。これは、独自仕様のデータ解析パイプラインで処理された獲得ＬＣ−ＭＳデータを使用して、配列同定のためのアルゴリズム、スペクトルクラスタリング、イオン計数、滞留時間アライメント、電荷状態のデコンボリューション、および正規化を組み合わせる、無標識示差定量化の開発によって達成された。
各ペプチドおよびサンプルの誤差推定値を含む、提示レベルが確立された。腫瘍組織上で排他的に提示されるペプチド、および腫瘍において過剰提示されるペプチドが、非がん性の組織および臓器との比較で同定されている。
前立腺腫瘍組織サンプルからのＨＬＡペプチド複合体は精製されてＨＬＡ結合ペプチドが単離され、ＬＣ−ＭＳによって分析された（実施例を参照されたい）。本出願に含まれる全てのＴＵＭＡＰは、前立腺腫瘍サンプル上でこのアプローチを用いて同定され、前立腺腫瘍上におけるそれらの提示が確認された。
複数の前立腺がん、前立腺肥大、および正常組織上で同定されたＴＵＭＡＰは、無標識ＬＣ−ＭＳデータのイオン計数を使用して定量化された。方法は、ペプチドのＬＣ−ＭＳシグナル面積が、サンプル中のその存在量と相関すると仮定する。様々なＬＣ−ＭＳ実験におけるペプチドの全ての定量的シグナルは、中心傾向に基づいて正規化され、サンプルあたりで平均化されて、提示プロファイルと称される棒グラフにマージされた。提示プロファイルは、タンパク質データベース検索、スペクトルクラスタリング、電荷状態デコンボリューション（除電）、および滞留時間アライメントおよび正規化のような、異なる解析法を統合する。
さらに、発見パイプラインＸＰＲＥＳＩＤＥＮＴ（登録商標）ｖ２．ｘは、がんまたはその他の感染組織上で、ＭＨＣ拘束性、好ましくはＨＬＡ拘束性のペプチドレベルの直接絶対定量化ができるようにする。簡単に述べると、分析された組織サンプルの全ＤＮＡ含有量から、総細胞数が計算された。組織サンプル中のＴＵＭＡＰの全ペプチド量は、天然ＴＵＭＡＰと、既知量のＴＵＭＡＰの同位体標識バージョン、いわゆる内標準との比率として、ナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって測定された。ＴＵＭＡＰ単離の効率は、ＴＵＭＡＰ単離手順の可能な限り早い時点で、全ての選択されたＴＵＭＡＰのペプチド：ＭＨＣ複合体を組織溶解産物に添加して、ペプチド単離手順の完了に続く、ナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるそれらの検出によって判定された。総細胞数および全ペプチド量は、組織サンプル当たり三連の測定から計算された。ペプチド単離効率は、それぞれ三連で測定された、１０回の添加実験からの平均として計算された（実施例６を参照されたい）。
本発明は、本発明のペプチドを過剰にまたは排他的に提示する、好ましくは前立腺がんである、がん／腫瘍を治療するのに有用なペプチドを提供するこれらのペプチドは、ヒト前立腺腫瘍サンプル上で、ＨＬＡ分子によって天然に提示されることが、質量分析法によって示された。
それにペプチドが由来する、起源遺伝子／タンパク質の多く（「完全長タンパク質」または「基本的タンパク質」とも称される）は、正常組織と比較して、腫瘍において非常に過剰発現されることが示され、本発明との関連で「正常組織」は、起源遺伝子の高度な腫瘍関連性を示す、正常な非前立腺組織細胞を意味するものとする（実施例２を参照されたい。さらに、ペプチド自体は、腫瘍組織上では強く過剰提示されるが、正常組織上では過剰提示されず、「腫瘍組織」は、本発明との関連で、前立腺腫瘍に罹患している患者に由来するサンプルを意味するものとする（実施例１を参照されたい）。
ＨＬＡ結合ペプチドは、免疫系、特にＴリンパ球によって認識され得る。Ｔ細胞は、例えば誘導ペプチドを提示する前立腺腫瘍細胞などの、認識されたＨＬＡ／ペプチド複合体を提示する細胞を破壊し得る。
本発明のペプチドは、Ｔ細胞応答を刺激でき、および／または過剰提示されることが示されおり、したがって本発明に従って、抗体および／または可溶性ＴＣＲなどのＴＣＲの製造のために使用され得る（実施例３、実施例４を参照されたい）。さらに、ペプチドは、それぞれのＭＨＣと複合体化した場合に、本発明による抗体および／またはＴＣＲ、特にＴＣＲ製造のためにも使用され得る。それぞれの方法は当業者に良く知られており、それぞれの参考文献にもまた見られる。したがって本発明のペプチドは、それによって腫瘍細胞が破壊され得る、患者における免疫応答を生じさせるのに有用である。患者における免疫応答は、理想的には免疫原性を増強する薬剤（すなわちアジュバント）との組み合わせで、記載されるペプチド、または適切な前駆体（例えば伸長ペプチド、タンパク質、またはこれらのペプチドをコードする核酸）を患者に直接投与することで、誘導され得る。本発明の標的ペプチドは、正常非前立腺組織上では同等のコピー数で提示されないので、このような治療的ワクチン接種から生じる免疫応答は、腫瘍細胞に対して高度に特異的であることが予測され得て、患者の正常細胞に対する望まれない自己免疫反応のリスクを防止する。前立腺特異的抗原は、前立腺切除された患者における腫瘍特異的標的に相当することから、前立腺特異的抗原は、前立腺がんのがん免疫療法のための優れた選択肢であってもよい。前立腺切除術を受けていない前立腺がん患者でも、前立腺は重要臓器と見なされないため、このような抗原が興味深くあってもよい。
本明細書は、鎖およびａβ鎖（「α／βＴＣＲ」）を含んでなるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）にさらに関する。ＭＨＣ分子によって提示された際に、ＴＣＲおよび抗体に結合できる発明のペプチドもまた提供される。本明細書はまた、本明細書のＴＣＲおよびペプチドを発現するための核酸、ベクター、および宿主細胞；そしてそれを使用する方法にも関する。
「Ｔ細胞受容体」（ＴＣＲと略記される）という用語は、αポリペプチド鎖（α鎖）およびａβポリペプチド鎖（β鎖）を含んでなるヘテロ二量体分子を指し、ヘテロ二量体受容体は、ＨＬＡ分子によって提示されるペプチド抗原と結合できる。本用語は、いわゆるγ／δＴＣＲもまた含む。
一実施形態では、本明細書は、本明細書に記載されるようなＴＣＲを製造する方法を提供し、方法は、ＴＣＲの発現を促進するのに適した条件下でＴＣＲを発現できる、宿主細胞を培養するステップを含んでなる。
別の態様における説明は、十分な量の抗原を抗原提示細胞に接触させることで、適切な抗原提示細胞または人工抗原提示細胞の表面に発現されるクラスＩまたはＩＩ ＭＨＣ分子上に抗原が負荷され、または抗原／クラスＩまたはＩＩ ＭＨＣ複合体モノマーを四量体化することで、クラスＩまたはＩＩ ＭＨＣ四量体上に抗原が負荷される、本明細書に記載の方法に関する。
α／βＴＣＲのαおよびβ鎖、そしてγ／δＴＣＲのγおよびδ鎖は、一般にそれぞれ２つの「領域」、すなわち可変および定常領域を有すると見なされる。可変領域は、可変領域（Ｖ）の連結と、連結領域（Ｊ）とからなる。可変領域はまた、リーダー領域（Ｌ）を含んでもよい。βおよびδ鎖はまた、多様性領域（Ｄ）を含んでもよい。αおよびβ定常領域はまた、αおよびβ鎖を細胞膜に固着させるＣ末端膜貫通（ＴＭ）領域を含んでもよい。
γ／δＴＣＲに関して、「ＴＣＲγ可変領域」という用語は、本明細書の用法ではリーダー領域（Ｌ）のないＴＣＲγＶ（ＴＲＧＶ）領域とＴＣＲγＪ（ＴＲＧＪ）領域との連結を指し、ＴＣＲγ定常領域という用語は、細胞外ＴＲＧＣ領域を指し、またはＣ末端切断型ＴＲＧＣ配列を指す同様に「ＴＣＲδ可変領域」という用語は、リーダー領域（Ｌ）のないＴＣＲδＶ（ＴＲＤＶ）領域とＴＣＲδＤ／Ｊ（ＴＲＤＤ／ＴＲＤＪ）領域との連結を指し、「ＴＣＲδ定常領域」という用語は、細胞外ＴＲＤＣ領域を指し、またはＣ末端切断型ＴＲＤＣ配列を指す。
本明細書のＴＣＲは、好ましくは、約１μＭ以下、約００１μＭ以下、約２５μＭ以下、または約１０μＭ以下の結合親和性（ＫＤ）で、発明のペプチド−ＨＬＡ分子複合体に結合する。より好ましいのは、約１μＭ以下、約１００ｎＭ以下、約５０ｎＭ以下、約２５ｎＭ以下の結合親和性を有する、高親和性ＴＣＲである。本発明のＴＣＲの好ましい結合親和性範囲の非限定的例としては、約１ｎＭ〜約１０ｎＭ；約１０ｎＭ〜約２０ｎＭ；約２０ｎＭ〜約３０ｎＭ；約３０ｎＭ〜約４０ｎＭ；約４０ｎＭ〜約５０ｎＭ；約５０ｎＭ〜約６０ｎＭ；約６０ｎＭ〜約７０ｎＭ；約７０ｎＭ〜約８０ｎＭ；約８０ｎＭ〜約９０ｎＭ；および約９０ｎＭ〜約１００ｎＭが挙げられる。
本明細書の用法では、本明細書のＴＣＲとの関連で、「特異的結合」およびそれらの文法的変種は、発明のペプチド−ＨＬＡ分子複合体に対して、１μＭ以下の結合親和性（ＫＤ）を有するＴＣＲを意味するために使用される。
本明細書のα／βヘテロ二量体ＴＣＲは、それらの定常領域の間に導入された、ジスルフィド結合を有してもよい。このタイプの好ましいＴＣＲとしては、ＴＲＡＣ定常領域配列とＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２定常領域配列とを有するものが挙げられるが、ただし、ＴＲＡＣのＴｈｒ４８およびＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のＳｅｒ５７は、システイン残基によって置換されており、前記システインは、ＴＣＲのＴＲＡＣ定常領域配列とＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２定常領域配列との間に、ジスルフィド結合を形成する。
上述の導入された鎖間結合の存在下または不在下で、本明細書のα／βヘテロ二量体ＴＣＲは、ＴＲＡＣ定常領域配列とＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２定常領域配列とを有してもよく、ＴＣＲのＴＲＡＣ定常領域配列と、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２定常領域配列とが、ＴＲＡＣのエクソン２のＣｙｓ４と、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のエクソン２のＣｙｓ２との間の天然ジスルフィド結合によって連結されてもよい。
本明細書のＴＣＲは、放射性核種、フルオロフォア、およびビオチンからなる群から選択される、検出可能な標識を含んでなってもよい。本明細書のＴＣＲは、放射性核種、化学療法剤、または毒素などの治療的活性薬剤にコンジュゲートされてもよい。
一実施形態では、α鎖に少なくとも１つの変異を有し、および／またはβ鎖に少なくとも１つの変異を有する本明細書のＴＣＲは、非変異ＴＣＲと比較して修飾されたグリコシル化を有する。
一実施形態では、ＴＣＲα鎖および／またはＴＣＲβ鎖に少なくとも１つの変異を含んでなるＴＣＲは、発明のペプチド−ＨＬＡ分子複合体に対して、非変異ＴＣＲα鎖および／または非変異ＴＣＲβ鎖を含んでなるＴＣＲの少なくとも倍の結合親和性および／または結合半減期を有する。腫瘍特異的ＴＣＲの親和性増強とその利用は、最適ＴＣＲ親和性のウィンドウの存在に依存する。このようなウィンドウの存在は、ＨＬＡ−Ａ２拘束性病原体に対して特異的なＴＣＲが、ＨＬＡ−Ａ２拘束性腫瘍関連自己抗原に対して特異的なＴＣＲと比較して、一般に約１０分の１のＫＤ値を有するという観察に基づく。腫瘍抗原は免疫原性である可能性を有するが、腫瘍は個人自身の細胞から生じるので、改変された翻訳プロセッシングのある変異型タンパク質またはタンパク質のみが、免疫系によって異質と見なされることが今や知られている。上方制御されまたは過剰発現される抗原（いわゆる自己抗原）は、腫瘍に対する機能性免疫応答を必ずしも誘導しない。これらの抗原に対して高度に反応性のＴＣＲを発現するＴ細胞は、中枢性免疫寛容として知られている過程、すなわち自己抗原に対する低親和性ＴＣＲを有するＴ細胞のみが残留する過程によって、胸腺において負選択される。したがって、発明のペプチドに対する本明細書のＴＣＲまたは変異体の親和性は、当該技術分野で周知の方法によって増大され得る。
本明細書は、本明細書に従ってＴＣＲを同定し単離する方法にさらに関し、前記方法は、ＨＬＡ−Ａ＊０２陰性健常ドナーからのＰＢＭＣをＡ２／発明のペプチドモノマーと共にインキュベートするステップと、ＰＢＭＣを四量体フィコエリトリン（ＰＥ）と共にインキュベートするステップと、高結合活性Ｔ細胞を蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）Ｃａｌｉｂｕｒ分析によって単離するステップとを含んでなる。
本明細書は、本明細書に従ってＴＣＲを同定し単離する方法にさらに関し、前記方法は、そのＴ細胞がマウスＴＣＲ欠損を補償する多様なヒトＴＣＲレパートリーを発現する、全ヒトＴＣＲαβ遺伝子遺伝子座（１．１および０．７Ｍｂ）を有する遺伝子組換えマウスを得るステップと、マウスをＨＡＶＣＲ１−００１で免疫化するステップと、四量体フィコエリトリン（ＰＥ）を有する遺伝子組換えマウスから得られたＰＢＭＣをインキュベートするステップと、高結合活性Ｔ細胞を蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）Ｃａｌｉｂｕｒ分析によって単離するステップとを含んでなる。
一態様では、本明細書のＴＣＲを発現するＴ細胞を得るために、本明細書のＴＣＲ−αおよび／またはＴＣＲ−β鎖をコードする核酸が、γレトロウイルスまたはレンチウイルスなどの発現ベクターにクローン化される。組換えウイルスが生成され、次に、抗原特異性および機能性結合活性などの機能について試験される。次に、最終生成物のアリコートを使用して、標的Ｔ細胞集団（一般に患者のＰＢＭＣから精製される）が形質導入され、それは患者への輸液前に増殖される。
別の態様では、本明細書のＴＣＲを発現するＴ細胞を得るために、例えば、生体外転写システムなどの当該技術分野で公知の技術によって、ＴＣＲ ＲＮＡが合成される。次に生体外で合成されたＴＣＲ ＲＮＡは、健常ドナーから得られた原発性ＣＤ８＋Ｔ細胞内に電気穿孔によって導入され、腫瘍特異的ＴＣＲ−αおよび／またはＴＣＲ−β鎖が再発現される。
発現を増加させるために、本明細書のＴＣＲをコードする核酸は、レトロウイルス長末端反復（ＬＴＲ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）Ｕ３、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、β−アクチン、ユビキチン、およびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）／ＣＤ４３複合プロモーター、伸長因子（ＥＦ）−１ａ、および脾臓フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）プロモーターなどの強力なプロモーターと作動可能に連結されてもよい。好ましい実施形態では、プロモーターは、発現される核酸に対して異種である。
強力なプロモーターに加えて、本明細書のＴＣＲ発現カセットは、レンチウイルスコンストラクトの核転座を促進する、中央ポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）（Ｆｏｌｌｅｎｚｉ ｅｔ ａｌ．，２０００）、およびＲＮＡ安定性を増大させることで導入遺伝子発現のレベルを高める、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節因子（ｗＰＲＥ）（Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９）をはじめとする導入遺伝子発現を高め得る追加的な要素を含有してもよい。
本発明のＴＣＲのαおよびβ鎖は、別々のベクターにある核酸によってコードされてもよく、または同一ベクターにあるポリヌクレオチドによってコードされてもよい。
高レベルのＴＣＲ表面発現の達成には、導入されたＴＣＲのＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−β鎖の双方が、高レベルで転写される必要がある。これを行うために、本明細書のＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−β鎖は、この障害を克服できることが示されている、単一ベクター内のバイシストロニックコンストラクトにクローン化されてもよい。ＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−β鎖は、翻訳中に２つのタンパク質に分かれて等モル比のＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−β鎖の生成を確実にする単一転写物から生成されるので、ＴＣＲ−α鎖とＴＣＲ−β鎖との間のウイルス配列内リボソーム進入部位の使用は、双方の鎖の協調発現をもたらす（Ｓｃｈｍｉｔｔ ｅｔ ａｌ．２００９）。
本明細書のＴＣＲをコードする核酸はコドン最適化されて、宿主細胞からの発現が増加されてもよい。遺伝コードの重複は、いくつかのアミノ酸が２つ以上のコドンによってコードされるようにするが、特定のコドンは、適合ｔＲＮＡの相対可用性ならびにその他の要因のために、他のものよりも「最適」でない（Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００４）。各アミノ酸が、哺乳類遺伝子発現のための最適コドンによってコードされるように、ＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−β遺伝子配列を修飾すること、ならびにｍＲＮＡ不安定モチーフまたは潜在的なスプライス部位を除去することは、ＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−β遺伝子発現を有意に高めることが示されている（Ｓｃｈｏｌｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００６）。
さらに、導入ＴＣＲ鎖と内因性ＴＣＲ鎖との間の誤対合は、重大な自己免疫リスクをもたらす特異性の獲得を引き起こすこともある。例えば、混合ＴＣＲ二量体の形成は、適切に対合するＴＣＲ複合体を形成するために利用できるＣＤ３分子の数を減少させてもよく、ひいては導入ＴＣＲを発現する細胞の機能性結合活性を有意に低下させ得る（Ｋｕｂａｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００７）。
誤対合を減少させるために、本明細書の導入ＴＣＲ鎖のＣ末端領域は、鎖間親和性を高める一方で、導入鎖が内因性ＴＣＲと対形成する能力を低下させるために、修飾されてもよい。これらのストラテジーは、ヒトＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−βのＣ末端領域をそれらのマウス対応物（マウス化Ｃ末端領域）で置換する；導入ＴＣＲのＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−β鎖の双方に第２のシステイン残基を導入することで、Ｃ末端領域に第２の鎖間ジスルフィド結合を生成する（システイン修飾）；ＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−β鎖Ｃ末端領域内の相互作用残基を交換する（「ノブ・イン・ホール」）；そしてＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−β鎖の可変領域をＣＤ３ζに直接融合させる（ＣＤ３ζ融合）を含んでもよい。（Ｓｃｈｍｉｔｔ ｅｔ ａｌ．２００９）。
一実施形態では、宿主細胞は、本細書のＴＣＲを発現するように遺伝子操作される。好ましい実施形態では、宿主細胞は、ヒトＴ細胞またはＴ細胞前駆細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞は、がん患者から得られる。その他の実施形態では、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞は、健常ドナーから得られる。本明細書の宿主細胞は、治療される患者に関して、同種異系または自己由来であり得る。一実施形態では、宿主は、α／βＴＣＲを発現するように形質転換されたγ／δＴ細胞である。
「医薬組成物」は、医学的状況においてヒトへの投与に適する組成物である。好ましくは、医薬組成物は無菌であり、ＧＭＰガイドラインに準拠して製造される。
医薬組成物は、遊離形態または薬学的に許容可能な塩の形態のどちらかのペプチドを含んでなる（上記もまた参照されたい）。本明細書の用法では、「薬学的に許容可能な塩」は、開示されたペプチドの誘導体を指し、ペプチドは、薬剤の酸性または塩基性塩を生成することで修飾される。例えば、酸性塩は、適切な酸との反応を伴って、遊離塩基から調製される（典型的に、薬剤の中性形態が中性ＮＨ２基を有する）。酸性塩を調製するための適切な酸としては、例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸などの有機酸、ならびに例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸リン酸などの無機酸の双方が挙げられる。逆に、ペプチド上に存在してもよい酸部分の塩基性塩の調製物は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、トリメチルアミンなどの薬学的に許容可能な塩基を使用して調製される。
特に好ましい一実施形態では、医薬組成物は、酢酸（酢酸塩）、トリフルオロ酢酸または塩酸（塩化物）の塩としてのペプチドを含んでなる。
好ましくは、本発明の薬剤は、ワクチンなどの免疫療法剤である。それは、患者に直接、罹患臓器に、または全身的に、ｉ．ｄ．、ｉ．ｍ．、ｓ．ｃ．、ｉ．ｐ．、およびｉ．ｖ．投与され、または生体外で患者またはヒト細胞株に由来する細胞に適用されて、それが引き続いて患者に投与され、または生体外で使用されて患者に由来する免疫細胞の亜集団が選択され、次にそれが患者に再投与されてもよい。核酸が、生体外で細胞に投与される場合、インターロイキン２などの免疫刺激サイトカインを同時発現させるように、細胞を形質移入することが有用であってもよい。ペプチドは、実質的に純粋であり、または免疫刺激アジュバント（下記参照）と組み合わされ、または免疫賦活性サイトカインと組み合わせて使用され、または例えば、リポソームなどの適切な送達系によって投与されてもよい。ペプチドはまた、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）またはマンナンなどの適切な担体に共役されてもよい（国際公開第９５／１８１４５号パンフレットおよび（Ｌｏｎｇｅｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３）を参照されたい）。ペプチドはまた、標識されてもよく、融合タンパク質であってもよく、またはハイブリッド分子であってもよい。その配列が本発明に記載されるペプチドは、ＣＤ４またはＣＤ８ Ｔ細胞を刺激することが予測される。しかし、ＣＤ８ Ｔ細胞の刺激は、ＣＤ４ Ｔヘルパー細胞によって提供される援助の存在下で、より効率的である。したがって、ＣＤ８ Ｔ細胞を刺激するＭＨＣクラスＩエピトープでは、ハイブリッド分子の融合パートナーまたはセクションは、適切にはＣＤ４陽性Ｔ細胞を刺激するエピトープを提供する。ＣＤ４およびＣＤ８刺激エピトープは、当該技術分野で周知であり、本発明で同定されたものが挙げられる。
一態様では、ワクチンは、配列番号１〜配列番号４８に記載されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのペプチドと、少なくとも１つの追加的なペプチド、好ましくは２〜５０、より好ましくは２〜２５、なおもより好ましくは２〜２０、最も好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８個のペプチドとを含んでなる。ペプチドは、１つまたは複数の特異的ＴＡＡから誘導されてもよく、ＭＨＣクラスＩ分子に結合してもよい。
本発明のさらなる態様は、本発明のペプチドまたはペプチド変異体をエンコードする核酸（例えばポリヌクレオチド）を提供する。ポリヌクレオチドは、それがペプチドをコードしさえすれば、例えば、単鎖および／または二本鎖のいずれかのＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組み合わせであってもよく、または例えばホスホロチオエート主鎖を有するポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドの未変性または安定化形態であってもよく、それはイントロンを含有してもまたはしなくてもよい。もちろん、天然起源ペプチド結合によって連結する天然アミノ酸残基を含有するペプチドのみが、ポリヌクレオチドによってエンコードされ得る。本発明のなおもさらなる態様は、本発明によるポリペプチドを発現できる発現ベクターを提供する。
例えば相補的付着端を通じて、ポリヌクレオチド、特にＤＮＡをベクターに連結する、多様な方法が開発されている。例えば、ベクターＤＮＡに挿入されるＤＮＡ断片に、相補的ホモポリマー配列が付加され得る。次に、相補的ホモポリマー尾部間の水素結合によって、ベクターおよびＤＮＡ断片が連結されて組換えＤＮＡ分子が形成する。
１つまたは複数の制限酵素認識部位を含有する合成リンカーは、ＤＮＡ断片をベクターに連結する代替え方法を提供する。多様な制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する合成リンカーは、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，ＣＮ，ＵＳＡをはじめとするいくつかの供給元から商業的に入手できる。
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを修飾する望ましい方法は、Ｓａｉｋｉ ＲＫ，ｅｔ ａｌ．（Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８）で開示されるようなポリメラーゼ連鎖反応を用いる。この方法は、例えば、適切な制限酵素認識部位を改変することで、ＤＮＡを適切なベクターに導入するために使用されてもよく、またはそれは、当該技術分野で既知のその他の有用な様式でＤＮＡを修飾するために使用されてもよい。ウイルスベクターを使用するのであれば、ポックスウイルスまたはアデノウイルスベクターが好ましい。
次にＤＮＡ（またはレトロウイルスベクターの場合はＲＮＡ）を適切な宿主において発現させ、本発明のペプチドまたは変異体を含んでなるポリペプチドが製造されてもよい。このようにして、本明細書に含まれる教示を考慮して適切に修正された既知の技術に従って、本発明のペプチドまたは変異体をコードするＤＮＡを使用して、発現ベクターが構築されてもよく、次にそれを使用して、本発明のポリペプチドの発現および製造のために、適切な宿主細胞が形質転換される。このような技術としては、例えば、米国特許第４，４４０，８５９号明細書、米国特許第４，５３０，９０１号明細書、米国特許第４，５８２，８００号明細書、米国特許第４，６７７，０６３号明細書、米国特許第４，６７８，７５１号明細書、米国特許第４，７０４，３６２号明細書、米国特許第４，７１０，４６３号明細書、米国特許第４，７５７，００６号明細書、米国特許第４，７６６，０７５号明細書、および米国特許第４，８１０，６４８号明細書で開示されるものが挙げられる。
本発明の化合物を構成するポリペプチドをエンコードするＤＮＡ（またはレトロウイルスベクターの場合はＲＮＡ）は、適切な宿主への導入のために、多種多様なその他のＤＮＡ配列に連結されてもよい。コンパニオンＤＮＡは、宿主の性質、ＤＮＡの宿主への導入様式、およびエピソームの維持または組み込みが所望されるかどうかに左右される。
一般に、ＤＮＡは、発現のための適切な方向および正しい読み枠で、プラスミドなどの発現ベクターに挿入される。必要ならば、ＤＮＡは、所望の宿主によって認識される適切な転写および翻訳調節制御ヌクレオチド配列に連結されてもよいが、このような制御は、一般に発現ベクター中で利用できる。次に、標準的な技術を通じて、ベクターが宿主に導入される。一般に、全ての宿主がベクターによって形質転換されるわけではない。したがって、形質転換された宿主細胞を選択することが必要になる。一選択技術は、抗生物質耐性などの形質転換細胞内で選択可能な形質をコードする、任意の必要な制御因子を有するＤＮＡ配列を発現ベクター内に組み込むことを伴う。
代案としては、このような選択可能な形質の遺伝子は、所望の宿主細胞を同時形質転換するのに使用される、別のベクター上にあり得る。
次に、本明細書で開示される教示を考慮して、当業者に知られている適切な条件下で十分な時間にわたり、本発明の組換えＤＮＡによって形質転換された宿主細胞が培養されてポリペプチドが発現され、次にそれが回収され得る。
細菌（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、酵母（例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、糸状菌（例えばアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ））、植物細胞、動物細胞、および昆虫細胞をはじめとする多数の発現系が知られている。好ましくは、発現系は、ＡＴＣＣ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手できるＣＨＯ細胞などの哺乳類細胞であり得る。
構成的発現のための典型的な哺乳類細胞ベクタープラスミドは、適切なポリＡ尾部と、ネオマイシンなどの耐性マーカーとを有する、ＣＭＶまたはＳＶ４０プロモーターを含んでなる。一例は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡから入手できるｐＳＶＬである。誘導性哺乳類発現ベクターの一例であるｐＭＳＧもまた、Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手できる。有用な酵母プラスミドベクターは、ｐＲＳ４０３−４０６およびｐＲＳ４１３−４１６であり、通常、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ ９２０３７，ＵＳＡから入手できる。プラスミドｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５、およびｐＲＳ４０６は、酵母組み込みプラスミド（ＹＩｐｓ）であり、酵母の選択可能なマーカーＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２、およびＵＲＡ３が組み込まれている。プラスミドｐＲＳ４１３−４１６は、酵母セントロメアプラスミド（Ｙｃｐｓ）である。ＣＭＶプロモーターベースのベクター（例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）は、一過性または安定性発現、細胞質内発現または分泌、およびＦＲＡＧ、３ｘＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃまたはＭＡＴの様々な組み合わせでのＮ末端またはＣ末端標識付けを提供する。これらの融合タンパク質は、組換えタンパク質を検出、精製、および分析できるようにする。二重標識融合物は、検出に融通性を与える。
強力なヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター調節領域は、ＣＯＳ細胞において、構成タンパク質発現レベルを１ｍｇ／Ｌ程度の高さに駆動する。効力がより低い細胞株では、タンパク質レベルは、典型的に約０．１ｍｇ／Ｌである。ＳＶ４０複製起点の存在は、ＳＶ４０複製許容ＣＯＳ細胞における高レベルのＤＮＡ複製をもたらす。ＣＭＶベクターは、例えば、細菌細胞におけるｐＭＢ１（ｐＢＲ３２２の誘導体）複製起点、細菌におけるアンピシリン耐性選択のためのｂ−ラクタマーゼ遺伝子、ｈＧＨポリＡ、およびｆ１起点を含有し得る。プレプロトリプシンリーダー（ＰＰＴ）配列を含有するベクターは、抗ＦＲＡＧ抗体、樹脂、およびプレートを使用した精製のために、培養液中へのＦＲＡＧ融合タンパク質分泌を誘導し得る。多様な宿主細胞において使用するためのその他のベクターおよび発現系が、当該技術分野で周知である。
別の実施形態では、本発明の２つ以上のペプチドまたはペプチド変異型がコードされ、したがって順次発現される（「数珠玉構造」コンストラクトに類似する）。その際に、ペプチドまたはペプチド変異型は、例えばＬＬＬＬＬＬなどの一続きのリンカーアミノ酸によって、共に連結または融合されてもよく、またはそれらの間のいかなる追加的なペプチドもなしに連結されてもよい。これらのコンストラクトはまた、がん療法のために使用され得て、ＭＨＣ ＩとＭＨＣ ＩＩの双方が関与する免疫応答を誘導してもよい。
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドベクターコンストラクトで形質転換された宿主細胞にも関する。宿主細胞は、原核または真核生物のどちらかであり得る。細菌細胞は、いくつかの状況では、好ましい原核宿主細胞であってもよく、典型的には、例えば、Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡから入手できる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５株、および米国微生物系統保存機関（ＡＴＣＣ）Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡから入手できるＲＲ１（ＡＴＣＣ番号３１３４３）などの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株である。好ましい真核宿主細胞としては、酵母、昆虫、および哺乳類細胞、好ましくはマウス、ラット、サルまたはヒト線維芽および結腸細胞株に由来するものなどの脊椎動物細胞が挙げられる。酵母宿主細胞としては、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ ９２０３７，ＵＳＡから一般に入手できる、ＹＰＨ４９９、ＹＰＨ５００、およびＹＰＨ５０１が挙げられる。好ましい哺乳類宿主細胞としては、ＡＴＣＣからＣＣＬ６１として入手できるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＡＴＣＣからＣＲＬ１６５８として入手できるＮＩＨ Ｓｗｉｓｓマウス胚細胞ＮＩＨ／３Ｔ３、ＡＴＣＣからＣＲＬ１６５０として入手できるサル腎臓由来ＣＯＳ−１細胞、およびヒト胎児由来腎細胞である２９３細胞が挙げられる。好ましい昆虫細胞は、バキュロウイルス発現ベクターで形質移入され得るＳｆ９細胞である。発現のための適切な宿主細胞の選択に関する概説は、例えば、Ｐａｕｌｉｎａ Ｂａｌｂａｓ ａｎｄ Ａｒｇｅｌｉａ Ｌｏｒｅｎｃｅの教科書"Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｒｅｖｉｅｗｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，"Ｐａｒｔ Ｏｎｅ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＩＳＢＮ ９７８−１−５８８２９−２６２−９および当業者に知られているその他の文献にある。
本発明のＤＮＡコンストラクトによる適切な細胞宿主の形質転換は、典型的に使用されるベクターのタイプに左右される周知の方法によって達成される。原核宿主細胞の形質転換に関しては、例えば、Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９７２）および（Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，２０１２）を参照されたい。酵母細胞の形質転換は、Ｓｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｓｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６）に記載される。Ｂｅｇｇｓ（Ｂｅｇｇｓ，１９７８）の方法もまた有用である。脊椎動物細胞に関しては、このような細胞を形質移入するのに有用な、例えば、リン酸カルシウムおよびＤＥＡＥ−デキストランまたはリポソーム製剤などの試薬が、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ｏｒ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ ２０８７７，ＵＳＡから入手できる。電気穿孔もまた、細胞を形質転換および／または形質移入するのに有用であり、酵母細胞、細菌細胞、昆虫細胞、および脊椎動物細胞を形質転換する技術分野で周知である。
成功裏に形質転換された細胞、すなわち本発明のＤＮＡコンストラクトを含有する細胞は、ＰＣＲなどの周知の技術によって同定され得る。代案としては、抗体を使用して、上清中のタンパク質の存在が検出され得る。
例えば、細菌、酵母、および昆虫細胞などの本発明の特定の宿主細胞は、本発明のペプチドの調製において有用であることが理解されるであろう。しかしその他の宿主細胞が、特定の治療法において有用であってもよい。例えば、樹状細胞などの抗原提示細胞は、それらが適切なＭＨＣ分子中に負荷されてもよいように、本発明のペプチドを発現するために有用に使用されてもよい。したがって、本発明は、本発明による核酸または発現ベクターを含んでなる宿主細胞を提供する。
好ましい実施形態では、宿主細胞は、抗原提示細胞、特に樹状細胞または抗原提示細胞である。前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）を含有する組換え融合タンパク質が負荷されたＡＰＣは、無症候性または微小症候性転移性ＨＲＰＣを治療するために、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって２０１０年４月２０日に認可された（シプロイセルＴ）（Ｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｓｍａｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００６）。
本発明のさらなる態様は、宿主細胞を培養するステップと、宿主細胞またはその培養液からペプチドを単離するステップとを含んでなる、ペプチドまたはその変異型を製造する方法を提供する。
別の実施形態では、本発明のペプチド、核酸または発現ベクターは、医療において使用される。例えば、ペプチドまたはその変異体は、静脈内（ｉ．ｖ．）注射、皮下（ｓ．ｃ．）注射、皮内（ｉ．ｄ．）注射、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射、筋肉内（ｉ．ｍ．）注射のために調合されてもよい。ペプチド注射の好ましい方法としては、ｓ．ｃ．、ｉ．ｄ．、ｉ．ｐ．、ｉ．ｍ．、およびｉ．ｖ．が挙げられる。ＤＮＡ注射の好ましい方法としては、ｉ．ｄ．、ｉ．ｍ．、ｓ．ｃ．、ｉ．ｐ．、およびｉ．ｖ．が挙げられる。例えば、５０μｇ〜１．５ｍｇ、好ましくは１２５μｇ〜５００μｇのペプチドまたはＤＮＡの用量が投与されてもよく、それぞれのペプチドまたはＤＮＡに左右される。この範囲の用量は、以前の治験で成功裏に使用された（Ｗａｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。
活性ワクチン接種のために使用されるポリヌクレオチドは、実質的に純粋であってもよく、または適切なベクターまたは送達系に含有されてもよい。核酸は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組み合わせであってもよい。このような核酸をデザインして導入する方法は、当該技術分野で周知である。概説は、例えば、Ｔｅｕｆｅｌ ｅｔ ａｌ．（Ｔｅｕｆｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００５）によって提供される。ポリヌクレオチドワクチンは調製が容易であるが、免疫応答誘導におけるこれらのベクターの作用機序は、完全には分かっていない。適切なベクターおよび送達系としては、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス、または２つ以上のウイルスの構成要素を含有するハイブリッドベースのシステムなどのウイルスＤＮＡおよび／またはＲＮＡが挙げられる。非ウイルス送達系としては、カチオン性脂質およびカチオン性ポリマーが挙げられ、ＤＮＡ送達技術分野において周知である。「遺伝子銃」などを通じた物理的送達もまた、使用されてもよい。核酸によってコードされるペプチド（単数）またはペプチド（複数）は、例えば、上述のように、それぞれの逆ＣＤＲのＴ細胞を刺激する、エピトープとの融合タンパク質であってもよい。
本発明の薬剤は、１つまたは複数のアジュバントもまた含んでもよい。アジュバントは、免疫応答（例えば、ＣＤ８陽性Ｔ細胞およびヘルパーＴ（ＴＨ）細胞によって媒介される抗原に対する免疫応答を非特異的に促進または増強する物質であり、したがって本発明の薬剤中で有用であると見なされる。適切なアジュバントとしては、１０１８ ＩＳＳ、アルミニウム塩、ＡＭＰＬＩＶＡＸ（登録商標）、ＡＳ１５、ＢＣＧ、ＣＰ−８７０，８９３、ＣｐＧ７９０９、ＣｙａＡ、ｄＳＬＩＭ、フラジェリンまたはフラジェリン由来ＴＬＲ５リガンド、ＦＬＴ３リガンド、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＣ３０、ＩＣ３１、イミキモド（ＡＬＤＡＲＡ（登録商標））、レシキモド、ＩｍｕＦａｃｔ ＩＭＰ３２１、ＩＬ−２やＬ−１３やＩＬ−２１などのインターロイキン、インターフェロン−αまたは−βまたはそれらのＰＥＧ化誘導体、ＩＳパッチ、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、ＩＳＣＯＭ、ＪｕｖＩｍｍｕｎｅ（登録商標）、ＬｉｐｏＶａｃ、ＭＡＬＰ２、ＭＦ５９、モノホスホリルリピドＡ、モンタニドＩＭＳ１３１２、モンタニドＩＳＡ２０６、モンタニドＩＳＡ５０Ｖ、モンタニドＩＳＡ−５１、油中水型および水中油型エマルション、ＯＫ−４３２、ＯＭ−１７４、ＯＭ−１９７−ＭＰ−ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、ＯｓｐＡ、ＰｅｐＴｅｌ（登録商標）ベクター系、ポリ（ラクチドコグリコリド）［ＰＬＧ］ベースおよびデキストラン微粒子、タラクトフェリンＳＲＬ１７２、ビロソームおよびその他のウイルス様粒子、ＹＦ−１７Ｄ、ＶＥＧＦトラップ、Ｒ８４８、β−グルカン、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、サポニンに由来するＡｑｕｉｌａ'ｓ ＱＳ２１ ｓｔｉｍｕｌｏｎ、マイコバクテリア抽出物および合成細菌細胞壁模倣体、およびＲｉｂｉ'ｓ ＤｅｔｏｘまたはＱｕｉｌまたはＳｕｐｅｒｆｏｓなどのその他の独自仕様の補助剤が挙げられるが、これに限定されるものではない。フロイントまたはＧＭ−ＣＳＦなどのアジュバントが好ましい。樹状細胞およびそれらの調製物に対して特異的な、いくつかの免疫学的アジュバント（例えばＭＦ５９）が、以前記載されている（Ａｌｌｉｓｏｎ ａｎｄ Ｋｒｕｍｍｅｌ，１９９５）。サイトカインもまた使用されてもよい。数種のサイトカインは、樹状細胞のリンパ組織（例えばＴＮＦ−）への移動に影響を与えること、Ｔリンパ球（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、およびＩＬ−４）のための効率的な抗原提示細胞への樹状細胞の成熟を加速すること（その内容全体が参照により本明細書に具体的に援用される、米国特許第５，８４９，５８９号明細書）、および免疫増強剤（例えば、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２３、ＩＬ−７、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β）として作用することと、直接関連付けられている（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。
ＣｐＧ免疫賦活性オリゴヌクレオチドもまた、ワクチン環境において、アジュバント効果を増強することが報告されている。理論により拘束されることなく、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、主にＴＬＲ９を通じた、内在的（非適応性）免疫系の活性化によって作用する。ＣｐＧ誘導性ＴＬＲ９活性化は、ペプチドまたはタンパク質抗原、生きたまたは死滅ウイルス、樹状細胞ワクチン、自己細胞ワクチン、そして予防的および治療的ワクチンの双方における多糖コンジュゲートをはじめとする多種多様な抗原に対する、抗原特異的体液性および細胞性応答を増強する。より重要なことには、それは樹状細胞の成熟と分化を増強し、ＣＤ４ Ｔ細胞援助の不在下であってさえも、ＴＨ１細胞の活性化の促進、および強力な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）生成をもたらす。ＴＬＲ９刺激によって誘導されるＴＨ１バイアスは、通常はＴＨ２バイアスを促進するミョウバンまたは不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）などのワクチンアジュバント存在下であってさえも、維持される。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、その他のアジュバントと調合されまたは同時投与された際に、または微粒子、ナノ粒子、脂質エマルションなどの配合物、または類似配合物中で、なおもより高いアジュバント活性を示し、それは、抗原が比較的弱い場合、強力な応答を誘導するのに特に必要である。それらは免疫応答もまた加速し、いくつかの実験では、ＣｐＧなしのワクチン総量と同等の抗体応答で、抗原用量のほぼ２桁分の低減を可能にする（Ｋｒｉｅｇ，２００６）。米国特許第６，４０６，７０５Ｂ１号明細書は、抗原特異的免疫応答を誘導するためのＣｐＧオリゴヌクレオチド、非核酸アジュバント、および抗原の併用を記載する。ＣｐＧ ＴＬＲ９拮抗薬は、本発明の医薬組成物の好ましい構成要素である、Ｍｏｌｏｇｅｎ（Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）製のｄＳＬＩＭ（二重ステムループ免疫調節剤）である。ＲＮＡ結合ＴＬＲ７、ＴＬＲ８および／またはＴＬＲ９などのその他のＴＬＲ結合分子もまた、使用されてもよい。
有用なアジュバントその他の例としては、化学修飾ＣｐＧ（例えば、ＣｐＲ、Ｉｄｅｒａ）；ポリ（Ｉ：Ｃ）などのｄｓＲＮＡアナログおよびそれらの誘導体（例えばＡｍｐｌｉＧｅｎ（登録商標）、Ｈｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標）、ポリ（ＩＣＬＣ）、ポリ（ＩＣ−Ｒ）、ポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）、非ＣｐＧ細菌ＤＮＡまたはＲＮＡ；ならびにシクロホスファミド、スニチニブ、ベバシズマブ（登録商標）、セレブレックス、ＮＣＸ−４０１６、シルデナフィル、タダラフィル、バルデナフィル、ソラフェニブ、テモゾロマイド、テムシロリムス、ＸＬ−９９９、ＣＰ−５４７６３２、パゾパニブ、ＶＥＧＦ Ｔｒａｐ、ＺＤ２１７１、ＡＺＤ２１７１、抗ＣＴＬＡ４などの免疫活性小型分子および抗体；免疫系の重要な構造体を標的にするその他の抗体（例えば、抗ＣＤ４０、抗ＴＧＦβ、抗ＴＮＦα受容体）；ＳＣ５８１７５が挙げられるが、これに限定されるものではなく、これらは治療的におよび／またはアジュバントとして作用してもよい。本発明の文脈で有用なアジュバントおよび添加剤の量と濃度は、過度の実験を実施することなく、当業者によって容易に判定され得る。
好ましいアジュバントは、抗ＣＤ４０、イミキモド、レシキモド、ＧＭ−ＣＳＦ、シクロホスファミド、スニチニブ、ベバシズマブ、インターフェロンα、ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび誘導体、ポリ（Ｉ：Ｃ）および誘導体、ＲＮＡ、シルデナフィル、およびＰＬＧまたはビロソーム微粒子調合物である。
本発明による薬剤組成物の好ましい実施形態では、アジュバントは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、サルグラモスチム）、シクロホスファミド、イミキモド、レシキモド、およびインターフェロンαなどのコロニー刺激因子からなる群から選択される。
本発明による医薬組成物の好ましい実施形態では、アジュバントは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、サルグラモスチム）、シクロホスファミド、イミキモド、およびレシキモドなどのコロニー刺激因子からなる群から選択される。本発明による薬剤組成物の好ましい実施形態では、アジュバントは、シクロホスファミド、イミキモドまたはレシキモドである。なおもより好ましいアジュバントは、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＭＳ １３１２、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ２０、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ５０Ｖ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ−５１、ｐｏｌｙ−ＩＣＬＣ（Ｈｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標））、および抗ＣＤ４０ｍＡＢまたはそれらの組み合わせである。
この組成物は、皮下、皮内、筋肉内などの非経口投与、または経口投与のために使用される。このためには、ペプチドおよび任意選択的にその他の分子が、薬学的に許容可能な、好ましくは水性担体に溶解され、または懸濁される。さらに組成物は、緩衝液、結合剤、ブラスチング剤、希釈剤、風味、潤滑剤などの賦形剤を含有し得る。ペプチドはまた、サイトカインなどの免疫刺激物質と共に投与され得る。このような組成物中で使用され得る賦形剤の詳細な一覧は、例えば、Ａ．Ｋｉｂｂｅ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（Ｋｉｂｂｅ，２０００）から採用され得る。組成物は、腺腫様（ａｄｅｎｏｍａｔｅｏｕｓ）またはがん性疾患の阻止、予防法および／または治療法のために使用され得る。例示的調合物は、例えば、欧州特許第２１１２２５３号明細書にある。
本発明によるワクチンによって引き起こされる免疫応答は、異なる細胞分裂期および異なる発生段階のがんを攻撃することを理解することが重要である。さらに、異なるがん関連シグナル伝達経路が攻撃される。これは、１つまたは少数の標的のみに対処して、攻撃に対する腫瘍の容易な適応（腫瘍エスケープ）を引き起こすこともある、ワクチンに優る利点である。さらに個々の腫瘍の全てが、同一パターンの抗原を発現するとは限らない。したがって、いくつかの腫瘍関連ペプチドの組み合わせによって、ありとあらゆる腫瘍が標的の少なくとも一部を有することが確実になる。組成物は、それぞれの腫瘍が抗原のいくつかを発現することを予期して設計され、腫瘍の増殖と維持に必要ないくつかの独立した経路をカバーする。したがって、ワクチンは、より大きな患者集団のために、容易に「出来合」で使用され得る。これは、ワクチンで治療される患者の予備選択が、ＨＬＡタイピングに限定され得て、抗原発現に関する任意の追加的なバイオマーカーアセスメントを必要としないことを意味するが、いくつかの標的が誘導免疫応答によって同時に攻撃されることはなおも確実であり、これは有効性にとって重要である（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｗａｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。
本明細書の用法では、「スキャフォールド」という用語は、（例えば、抗原性）決定因子に特異的に結合する分子を指す。一実施形態では、スキャフォールドはまた、それが付着する実体（例えば、（第２の）抗原結合部分）を例えば、抗原決定基（例えば本出願書に記載のペプチドとＭＨＣの複合体）を有する特異的腫瘍細胞または腫瘍間質などの型標的部位に誘導できる。別の実施形態では、キャフォールドは、例えば、Ｔ細胞受容体複合体抗原などのその標的抗原を介して、シグナル伝達を活性化できる。スキャフォールドとしては、抗体およびそれらのフラグメント、抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域を含んでなる抗体の抗原結合ドメイン、少なくとも１つのアンキリンリピートモチーフと単一ドメイン抗原結合（ＳＤＡＢ）分子とを含んでなる結合タンパク質、アプタマー、（可溶性）ＴＣＲ、および同種または自己由来Ｔ細胞などの（改変）細胞が挙げられるが、これに限定されるものではない。分子が標的に結合するスキャフォールドであるかどうかを評価するために、結合アッセイが実施され得る。
「特異的」結合は、特異的標的を保有する細胞を殺滅できる活性分子を装備したスキャフォールドが、特異的標的がないがその他のペプチド−ＭＨＣ複合体を提示する別の細胞を殺滅できない程度に、スキャフォールドがその他の天然ペプチド−ＭＨＣ−複合体よりもさらに良好に、目的ペプチド−ＭＨＣ−複合体に結合することを意味する。交差反応性ペプチド−ＭＨＣのペプチドが天然に存在せず、すなわち、ヒトＨＬＡ−ペプチドームに由来しない場合、その他のペプチド−ＭＨＣ複合体への結合は無関係である。標的細胞死滅を評価する試験は、当該技術分野で周知である。それらは、非改変ペプチド−ＭＨＣ提示を有する標的細胞（初代細胞または細胞株）、または天然に存在するペプチド−ＭＨＣレベルに達するようにペプチドを負荷された細胞を使用して、実施されるべきである。
各スキャフォールドは標識を含んでなり得て、それは、標識によって提供されるシグナルの存在または不在を判定することで、結合スキャフォールドが検出され得ることを提供する。例えば、スキャフォールドは、蛍光染料または任意のその他の適用可能な細胞マーカー分子で標識され得る。このようなマーカー分子は、当該技術分野で周知である。例えば、蛍光染料によって提供される蛍光標識は、蛍光またはレーザー走査顕微鏡またはフローサイトメトリーによる、結合アプタマーの視覚化を提供し得る。
各スキャフォールドは、例えば、ＩＬ−２１、抗−ＣＤ３、抗−ＣＤ２８などの第２の活性分子にコンジュゲートされ得る。
ポリペプチドスキャフォールドに関するさらなる情報については、例えば国際公開第２０１４／０７１９７８Ａ１号パンフレットの背景セクション、およびその中で引用された参考文献を参照されたい。
本発明は、アプタマーにさらに関する。アプタマー（例えば、国際公開第２０１４／１９１３５９号パンフレット、およびその中で引用される文献を参照されたい）は、短い一本鎖核酸分子であり、それは、所定の三次元構造に折り畳まれて、特異的標的構造体を認識し得る。それらは、標的療法を開発するための適切な代案のようであった。アプタマーは、高い親和性および特異性で、多様な複合体標的と選択的に結合することが示されている。
細胞表面に位置する分子を認識するアプタマーは、過去１０年内に同定されており、診断および治療的アプローチを開発する手段を提供する。アプタマーは、毒性および免疫原性がほぼ皆無であることが示されているので、それらは生物医学的用途のための有望な候補である。確かに、例えば、前立腺特異的膜抗原認識アプタマーなどのアプタマーは、標的療法のために成功裏に用いられており、異種移植片生体内モデルにおいて機能できることが示されている。さらに、特異的腫瘍細胞株を認識するアプタマーが同定されている。
ＤＮＡアプタマーは、様々ながん細胞、特に固形腫瘍に由来するものに対して広域スペクトル認識特性を示す一方で、非腫瘍発生性および主要健常細胞を認識しないように選択され得る。同定されたアプタマーが、特異的腫瘍サブタイプを認識するだけでなく、むしろ一連の腫瘍と相互作用する場合、これは、アプタマーをいわゆる広域スペクトル診断薬および治療薬として応用可能にする。
さらに、フローサイトメトリーによる細胞結合挙動の調査は、アプタマーがナノモル濃度範囲内の非常に良好な見かけの親和性を見せたことを示した。
アプタマーは、診断および治療目的で有用である。さらに、アプタマーの一部は腫瘍細胞に取り込まれ、したがって腫瘍細胞内へのｓｉＲＮＡなどの抗がん剤の標的化送達のための分子ビヒクルとして、機能し得ることが示され得た。
アプタマーは、細胞ＳＥＬＥＸ（試験管内進化法）技術を使用して、細胞および組織などの複合体標的に対して、および本発明による配列番号１〜配列番号４８のいずれかに記載の配列とＭＨＣ分子とを含んでなり、好ましくはそれからなるペプチド複合体などに対して、選択され得る。
本発明のペプチドを使用して、ＭＨＣ／ペプチド複合体に対する特異的抗体が生成され、開発され得る。これらは、毒素または放射性物質を患部組織に標的化する治療法のために、使用され得る。これらの抗体の別の用途は、ＰＥＴなどのイメージング目的の放射性核種の患部組織への標的化であり得る。この用途は、小規模な転移の検出、または病的組織の大きさと正確な位置確認の判定を助け得る。
したがってＨＬＡ拘束性抗原と複合体化した、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩと特異的に結合する、組換え抗体を製造する方法を提供することが、本発明のさらなる態様であり、方法は、前記ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩを発現する細胞を含んでなる、遺伝子操作された非ヒト哺乳類を前記ＨＬＡ拘束性抗原と複合体化した可溶性形態のＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子によって免疫化するステップと；ｍＲＮＡ分子を前記非ヒト哺乳類の抗体産生細胞から単離するステップと；前記ｍＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質分子を提示する、ファージディスプレイライブラリーを作製するステップと；少なくとも１つのファージを前記ファージディスプレイライブラリーから単離するステップとを含んでなり、前記少なくとも１つのファージは、前記ＨＬＡ拘束性抗原と複合体化した前記ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩと特異的に結合する、前記抗体を提示する。
ＨＬＡ拘束性抗原と複合体化したヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩと特異的に結合する抗体を提供することも、本発明のさらなる態様であり、その中で抗体は、好ましくは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、二重特異性抗体および／またはキメラ抗体である。
このような抗体および一本鎖クラスＩ主要組織適合性複合体を製造するそれぞれの方法、ならびにこれらの抗体を製造するためのその他のツールは、本発明の目的で、その内容全体が参照により全て明示的に援用される、国際公開第０３／０６８２０１号パンフレット、国際公開第２００４／０８４７９８号パンフレット、国際公開第０１／７２７６８号パンフレット、国際公開第０３／０７０７５２号パンフレット、および文献（Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００３ａ；Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００３ｂ；Ｄｅｎｋｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，２００３）で開示される。
好ましくは、抗体は，２０ナノモル濃度未満、好ましくは１０ナノモル濃度未満の結合親和性で複合体に結合し、それは本発明の文脈で「特異的」とも見なされる。
本発明は、配列番号１〜配列番号４８からなる群から選択される配列、または配列番号１〜配列番号４８と少なくとも８８％相同的な（好ましくは同一の）その変異体を含んでなるペプチド、またはＴ細胞を前記ペプチドと交差反応させるその変異体に関し、前記ペプチドは、基礎となる完全長ポリペプチドでない。
本発明は、配列番号１〜配列番号４８からなる群から選択される配列、または、配列番号１〜配列番号４８と少なくとも８８％相同的な（好ましくは同一の）その変異体を含んでなるペプチドにさらに関し、前記ペプチドまたは変異体は、８〜１００、好ましくは８〜３０、最も好ましくは８〜１４アミノ酸の全長を有する。
本発明は、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩの分子に結合する能力を有する、本発明によるペプチドにさらに関する。
本発明は、ペプチドが、配列番号１〜配列番号４８に記載のアミノ酸配列からなり、またはそれから本質的になる、本発明によるペプチドにさらに関する。
本発明は、ペプチドが（化学的に）修飾された、および／または非ペプチド結合を含む、本発明によるペプチドにさらに関する。
本発明は、本発明によるペプチドにさらに関し、ペプチドは、融合タンパク質の一部であり、特にＨＬＡ−ＤＲ抗原関連不変鎖（Ｉｉ）のＮ末端アミノ酸を含んでなり、またはペプチドは、例えば樹状細胞特異的抗体などの抗体に（またその中に）融合する。
本発明は、本発明によるペプチドをエンコードする核酸にさらに関するが、ただしペプチドは完全（完全長）ヒトタンパク質でない。
本発明は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組み合わせである、本発明による核酸にさらに関する。
本発明は、本発明による核酸を発現できる、発現ベクターにさらに関する。
本発明は、医療、特に前立腺がんの治療で使用するための、本発明によるペプチド、本発明による核酸、または本発明による発現ベクターにさらに関する。
本発明は、本発明による核酸または本発明による発現ベクターを含んでなる、宿主細胞にさらに関する。
本発明は、抗原提示細胞、好ましくは樹状細胞である、本発明による宿主細胞にさらに関する。
本発明は、本発明による宿主細胞を培養するステップと、宿主細胞またはその培養液からペプチドを単離するステップとを含んでなる、本発明によるペプチドを製造する方法にさらに関する。
本発明は、十分な量の抗原を抗原提示細胞に接触させることで、適切な抗原提示細胞の表面に発現されるクラスＩまたはＩＩ ＭＨＣ分子上に、抗原が負荷される、本発明による方法にさらに関する。
本発明は、抗原提示細胞が、配列番号１〜配列番号４８または前記異アミノ酸配列を含有する、前記ペプチドを発現できる、発現ベクターを含んでなる、本発明による方法にさらに関する。
本発明は、本発明による方法によって製造される活性化Ｔ細胞にさらに関し、前記Ｔ細胞は、本発明によるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する細胞を選択的に認識する。
本発明は、本発明によるＴ細胞の有効数を患者に投与するステップを含んでなる、患者において、本発明による任意のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する標的細胞を死滅させる方法にさらに関する。
本発明は、記載される任意のペプチド、本発明による核酸、本発明による発現ベクター、本発明による細胞、または本発明による活性化細胞傷害性Ｔリンパ球の、薬剤としての、または薬剤の製造における、使用にさらに関する。本発明は、薬剤ががんに対して有効である、本発明による使用にさらに関する。
本発明は、薬剤がワクチンである、本発明による使用にさらに関する。本発明は、薬剤ががんに対して有効である、本発明による使用にさらに関する。
本発明は、発明による使用にさらに関し、前記がん細胞は、好ましくは前立腺がん細胞であり、または肺がん、小細胞肺がん、黒色腫、肝臓がん、乳がん、子宮がん、メルケル細胞がん、膵臓がん、胆嚢がん、胆管がん、ＣＲＣ、膀胱がん、非小細胞肺がん、腎臓がん、白血病（例えば、ＡＭＬまたはＣＬＬ）、卵巣がん、食道がん、脳がん、および胃（胃）がん、最も好ましくは前立腺がん細胞などのその他の固形または血液学的腫瘍細胞である。
本発明は、前立腺がんの診断および／または予後診断において使用され得る、本明細書で「標的」と称される、本発明によるペプチドベースの特定の標識タンパク質およびバイオマーカーにさらに関する。本発明はまた、がん治療のためのこれらの新規標的の使用に関する。
「抗体（単数）」または「抗体（複数）」という用語は、本明細書では広義に使用され、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の双方を含む。無処理または「完全」免疫グロブリン分子に加えて、「抗体」という用語には、本発明による所望の特性（例えば、前立腺がんマーカー（ポリ）ペプチドの特異的結合、がんマーカー遺伝子を増大レベルで発現する前立腺がん細胞への毒素の送達、および／または前立腺がんマーカーポリペプチドの活性阻害）のいずれかを示しさえすれば、フラグメント（例えば、ＣＤＲ、Ｆｖ、Ｆａｂ、およびＦｃフラグメント）、またはこれらの免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子ヒト化バージョンのポリマーもまた含まれる。
可能な場合は常に、本発明の抗体は、商業的供給元から購入されてもよい。また本発明の抗体は、周知の方法を使用して生成されてもよい。当業者は、本発明の抗体を生成するために、完全長前立腺がんマーカーポリペプチドまたはそのフラグメントのどちらを使用してもよいことを理解するであろう。本発明の抗体を製造するために使用されるポリペプチドは、天然原料から部分的にまたは完全に精製されてもよく、または組換えＤＮＡ技術を使用して製造されてもよい。
例えば、配列番号１〜配列番号４８ポリペプチドに記載のペプチドなどの本発明によるペプチドをコードするｃＤＮＡ；またはその変異体またはフラグメントが、原核細胞（例えば、細菌）または真核細胞（例えば、酵母、昆虫、または哺乳類細胞）で発現され得て、その後、組換えタンパク質が精製されて、本発明による抗体を生成するために使用される、前立腺がんマーカーポリペプチドに特異的に結合する、モノクローナルまたはポリクローナル抗体製剤を生成するために使用され得る。
当業者は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体の２つ以上の異なるセットの生成が、その目的の用途（例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学的検査、生体内イメージング、免疫毒素療法）に必要な特異性および親和性を有する抗体を得る可能性を最大化することを理解するであろう。抗体は、それに対して抗体が使用される目的に従って、既知の方法によりそれらの所望の活性について試験された（例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学的検査、免疫療法など；抗体の生成および試験のさらなるガイダンスについては、例えば、Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，２０１４（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，２０１４）を参照されたい。例えば、抗体は、ＥＬＩＳＡアッセイ、ウエスタンブロット、ホルマリン固定がんまたは冷凍組織切片の免疫組織化学染色で試験されてもよい。それらの最初の生体外特性解析後、治療または生体内診断用途を意図した抗体が、既知の臨床試験法によって試験される。
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書の用法では、実質的に均質な抗体集団から得られる抗体を指し；すなわち、集団を構成する個々の抗体は、微量で存在してもよい可能な自然発生突然変異以外は同一である。本明細書では、「モノクローナル抗体」は、それらが所望の拮抗活性を示しさえすれば、その中で重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来しまたは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同的である一方、鎖の残部は、別の種に由来しまたは別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同的である、「キメラ」抗体、ならびにこのような抗体のフラグメントを特に含む（その内容全体が本明細書に援用される、米国特許第４，８１６，５６７号明細書）。
本発明のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法を使用して調製されてもよい。ハイブリドーマ法においては、マウスまたはその他の適切な宿主動物が免疫剤によって典型的に免疫化されて、免疫剤と特異的に結合する抗体を産生するまたは産生できるリンパ球を生じさせる。代案としては、リンパ球は、生体外で免疫化されてもよい。
モノクローナル抗体はまた、米国特許第４，８１６，５６７号明細書に記載されるものなどの組換えＤＮＡ法によって製造されるものであってもよい。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して、容易に単離および配列決定され得る（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合できる、オリゴヌクレオチドプローブの使用によって）。
インビトロ法もまた、一価の抗体を調製するのに適する。抗体フラグメント、特にＦａｂフラグメントを作製するための抗体の消化は、当該技術分野で既知の通例の技術を使用して達成され得る。例えば、消化は、パパインを使用して実施され得る。パパイン消化の例は、国際公開第９４／２９３４８号パンフレットおよび米国特許第４，３４２，５６６号明細書に記載される。抗体のパパイン消化は、それぞれ単一抗原結合部位を有するＦａｂフラグメントと称される２つの同一の抗原結合フラグメントと、残りのＦｃフラグメントとを典型的に生じる。ペプシン処理は、Ｆ（ａｂ'）２フラグメントおよびｐＦｃ'フラグメントをもたらす。
抗体フラグメントは、その他の配列に付着するかどうかに関わりなく、フラグメントの活性が非修飾抗体または抗体フラグメントと比較して顕著に変化せずまたは損なわれないという条件で、特定領域または特定アミノ酸残基の挿入、欠失、置換、またはその他の選択された修飾もまた含み得る。これらの修飾は、ジスルフィド結合できるアミノ酸の除去／付加、そのバイオ寿命増大、その分泌特性改変などのいくつかの追加的な特性を提供し得る。いずれにしても、抗体フラグメントは、結合活性、結合領域における結合調節などの生理活性特性を有しなくてはならない。抗体の機能性または活性領域は、タンパク質の特定領域の変異誘発と、それに続く発現と、発現したポリペプチドの試験によって同定されてもよい。このような方法は、当該技術分野の熟練した実務家には容易に分かり、抗体フラグメントをエンコードする核酸の部位特異的変異誘発を含み得る。
本発明の抗体は、ヒト化抗体またはヒト抗体をさらに含んでなってもよい。非ヒト（例えばマウス）抗体などのヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント（抗体のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'またはその他の抗原結合部分配列など）である。ヒト化抗体としては、その中でレシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有する、マウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト生物種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基によって置換される、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）が挙げられる。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体または移入ＣＤＲまたはフレームワーク配列のどちらにも見いだされない、残基を含んでなってもよい。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つおよび典型的に２つの可変領域の実質的に全てを含んでなり、その中では、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全てが、ヒト免疫グロブリン共通配列のものである。ヒト化抗体は、至適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にヒト免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部もまた含んでなる。
非ヒト抗体をヒト化する方法は、当該技術分野で周知である。通常、ヒト化抗体は、非ヒト起源から導入された、１つまたは複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「移入」残基と称され、それは典型的に「移入」可変領域から得られる。ヒト化は、齧歯類ＣＤＲ（複数）またはＣＤＲ（単数）配列を対応するヒト抗体配列によって置換することで、基本的に実施され得る。したがって、このような「ヒト化」抗体は、キメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号明細書）であり、その中では、実質的に非損傷ヒト可変領域未満が、非ヒト生物種からの対応する配列によって置換されている。実際には、ヒト化抗体は典型的にヒト抗体であり、その中ではいくつかのＣＤＲ残基と、おそらくはいくつかのＦＲ残基とが、齧歯類抗体中の類似部位からの残基によって置換される。
免疫化に際して、内因性免疫グロブリン生成不在下で、ヒト抗体の完全レパートリーを産生できる遺伝子組換え動物（例えばマウス）を用い得る。例えば、キメラおよび生殖細胞系変異マウスにおける、抗体重鎖連結領域遺伝子のホモ接合型欠失が、内因性抗体生成の完全阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖細胞系変異マウスにおけるヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイの転写は、抗原チャレンジに際してヒト抗体の産生をもたらす。ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリー中でも産生され得る。
本発明の抗体は、好ましくは薬学的に許容できる担体中で、対象に投与される。典型的に、製剤中で適当量の薬理的に許容可能な塩が使用されて、製剤を等張にする。薬理的に許容可能な担体の例としては、生理食塩水、リンゲル液、およびデキストロース溶液が挙げられる。溶液のｐＨは、好ましくは約５〜約８、より好ましくは約７〜約７．５である。さらなる担体としては、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックス徐放性製剤が挙げられ、そのマトリックスは、例えば、フィルム、リポソームまたは微粒子などの造形品の形態である。当業者には、例えば、投与される抗体の投与経路と濃度次第で、特定の担体がより好ましくあってもよいことが明らかであろう。
抗体は、注射（例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内）によって、またはその有効形態での血流への送達を確実にする輸液などのその他の方法によって、対象、患者、または細胞に投与され得る。抗体はまた、腫瘍内または腫瘍周囲経路によって投与されて、局所性ならびに全身性の治療効果を発揮してもよい。局所注射または静脈注射が好ましい。
抗体を投与するための有効投与量およびスケジュールは、経験的に判定されてもよく、このような測定の実施は、当該技術分野の技術範囲内である。当業者は、投与しなくてはならない抗体用量が、例えば、抗体を投与される対象、投与経路、使用される特定の抗体型、および投与されるその他の薬剤次第で変動することを理解するであろう。単独使用される抗体の典型的な１日量は、上述の要素次第で、１日あたり約１（μｇ／ｋｇ〜最大１００ｍｇ／ｋｇ体重またはそれ以上の範囲に及ぶかもしれない。好ましくは前立腺がんを治療するための抗体投与に続いて、治療用抗体の効力が、熟練した実務家に良く知られている様々な方法で評価され得る。例えば、標準腫瘍イメージング技術を使用して、治療を受ける対象におけるがんの大きさ、数、および／または分布がモニターされてもよい。抗体投与不在下で起こるであろう疾患経過と比較して、腫瘍成長を停止させ、腫瘍収縮をもたらし、および／または新規腫瘍の発症を予防する、治療的に投与された抗体は、前立腺がん治療のための有効な抗体である。
特異的ペプチド−ＭＨＣ複合体を認識する可溶性Ｔ細胞受容体（ｓＴＣＲ）を製造する方法を提供することもまた、本発明のさらなる態様である。このような可溶性Ｔ細胞受容体は、特異的Ｔ細胞クローンから生成され得て、それらの親和性は、相補性決定領域を標的とする変異誘発によって増加させ得る。Ｔ細胞受容体の選択目的で、ファージディスプレイが利用され得る（米国特許第２０１０／０１１３３００号明細書、（Ｌｉｄｄｙ ｅｔ ａｌ．，２０１２））。ファージディスプレイ中に、そして薬剤として実用する際に、Ｔ細胞受容体を安定化させる目的で、例えば、非天然ジスルフィド結合、その他の共有結合（一本鎖Ｔ細胞受容体）、または二量体化ドメインによって、αおよびβ鎖を連結させ得る（Ｂｏｕｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｃａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｗｉｌｌｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。Ｔ細胞受容体は、標的細胞上で特定機能を発揮させるために、毒素、薬剤、サイトカイン（例えば、米国特許第２０１３／０１１５１９１号明細書を参照されたい）、抗ＣＤ３ドメインのようなエフェクター細胞動員ドメインなどに、連結させ得る。さらにそれは、養子免疫伝達のために使用されるＴ細胞において発現され得た。さらなる情報は、国際公開第２００４／０３３６８５Ａ１号パンフレットおよび国際公開第２００４／０７４３２２Ａ１号パンフレットにある。ＴＣＲの組み合わせは、国際公開第２０１２／０５６４０７Ａ１号パンフレットに記載される。さらなる製造法は、国際公開第２０１３／０５７５８６Ａ１号パンフレットで開示される。
さらに本発明のペプチドおよび／またはＴＣＲまたは抗体またはその他の結合分子を使用して、病理学者の生検サンプルに基づくがん診断を確認し得る。
抗体またはＴＣＲはまた、生体内診断アッセイのために使用されてもよい。通常、抗体は、腫瘍が位置確認され得るように、免疫シンチグラフィー（ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｏｇｒａｐｈｙ）を使用して、放射性ヌクレオチド（１１１Ｉｎ、９９Ｔｃ、１４Ｃ、１３１Ｉ、３Ｈ、３２Ｐまたは３５Ｓなど）で標識される。一実施形態では、抗体またはそれらのフラグメントは、上述のタンパク質からなる群から選択されるタンパク質の２つ以上の標的の細胞外ドメインに結合し、親和性（Ｋｄ）は１×１０μＭ未満である。
診断用の抗体は、様々なイメージング法による検出に適するプローブで標識されてもよい。プローブの検出方法としては、蛍光、光学、共焦点および電子顕微鏡検査；磁気共鳴画像法および分光法；蛍光透視法、コンピュータ断層撮影および陽電子放射型断層撮影法が挙げられるが、これに限定されるものではない。適切なプローブとしては、フルオレセイン、ローダミン、エオジンおよびその他のフルオロフォア、放射性同位体、金、ガドリニウムおよびその他のランタニド、常磁性鉄、フッ素１８およびその他の陽電子放出放射性核種が挙げられるが、これに限定されるものではない。さらに、プローブは二官能価または多官能価であってもよく、列挙される方法の２つ以上によって検出可能であってもよい。これらの抗体は、前記プローブで直接または間接的に標識されてもよい。特に十分に技術分野で承認されている、プローブの抗体への付着としては、プローブの共有結合、プローブの抗体への組み込み、およびプローブ結合のためのキレート化合物の共有結合が挙げられる。免疫組織化学的検査では、疾患組織サンプルは、新鮮または冷凍であってもよく、またはパラフィン包埋されてホルマリンなどの保存料で固定されてもよい。サンプルを含有する固定または包埋切片は、標識一次抗体および二次抗体と接触されて、抗体を使用して原位置タンパク質発現が検出される。
本発明の別の態様は、活性化Ｔ細胞を製造するインビトロ法を含み、方法は、生体外Ｔ細胞を、適切な抗原提示細胞の表面に発現される抗原負荷ヒトＭＨＣ分子に、Ｔ細胞を抗原特異的様式で活性化するのに十分な時間にわたり接触させるステップを含んでなり、抗原は本発明によるペプチドである。好ましくは、抗原提示細胞と共に、十分な量の抗原が使用される。
好ましくは、哺乳類細胞は、ＴＡＰペプチド輸送体のレベルまたは機能が皆無でありまたは低下している。ＴＡＰペプチド輸送体が欠如している適切な細胞としては、Ｔ２、ＲＭＡ−Ｓ、およびショウジョウバエ細胞が挙げられる。ＴＡＰは、抗原プロセシングに関連している輸送体である。
ヒトペプチド負荷欠乏細胞系Ｔ２は、カタログ番号ＣＲＬ１９９２の下に、米国微生物系統保存機関、１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０８５２，ＵＳＡから入手でき；ショウジョウバエ細胞株Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ株２は、カタログ番号ＣＲＬ１９８６３の下にＡＴＣＣから入手でき；マウスＲＭＡ−Ｓ細胞株はＬｊｕｎｇｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎ ａｎｄ Ｋａｒｒｅ，１９８５）に記載される。
好ましくは、移入前に、宿主細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子を実質的に発現しない。刺激因子細胞が、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＣＡＭ−１、およびＬＦＡ３のいずれかなどのＴ細胞のための共刺激シグナルを提供するのに重要な分子を発現することもまた好ましい。多数のＭＨＣクラスＩ分子および共刺激因子分子の核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋおよびＥＭＢＬデータベースから公的に入手可能である。
ＭＨＣクラスＩエピトープが抗原として使用される場合、Ｔ細胞はＣＤ８陽性Ｔ細胞である。
抗原提示細胞が、このようなエピトープを発現するために形質移入される場合、好ましくは、細胞は、配列番号１〜配列番号４８、またはその変異アミノ酸配列を含有するペプチドを発現できる発現ベクターを含んでなる。
生体外でＴ細胞を製造するために、その他のいくつかの方法が使用されてもよい。例えば、自己由来腫瘍浸潤性リンパ球が、ＣＴＬを生成するために使用され得る。Ｐｌｅｂａｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（Ｐｌｅｂａｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９５）は、Ｔ細胞の調製において、自己由来末梢血リンパ球（ＰＬＢ）を利用した。さらに、樹状細胞をペプチドまたはポリペプチドでパルス処理する、または組換えウイルスで感染させることによる、自己由来Ｔ細胞の製造も可能である。Ｂ細胞もまた、自己由来Ｔ細胞の製造において使用され得る。さらに、ペプチドまたはポリペプチドでパルス処理された、または組換えウイルスで感染されたマクロファージが、自己ＣＴＬの調製において使用されてもよい。Ｓ．Ｗａｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｗａｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３）は、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を使用したＴ細胞の生体外プライミングを記載し、それはまた、選択されたペプチドに対するＴ細胞を製造するための適切な方法でもある。本発明では、ビオチン：ストレプトアビジン生化学によって、あらかじめ形成されたＭＨＣ：ペプチド複合体を表面ポリスチレン粒子（ミクロビーズ）に共役することで、ａＡＰＣが生成された。このシステムは、ａＡＰＣ上のＭＨＣ密度の正確な調節を可能にし、それは、血液サンプルから高効率で、高または低結合活性の抗原特異的Ｔ細胞応答を選択的に引き起こすことを可能にする。ＭＨＣ：ペプチド複合体の他に、ａＡＰＣは、それらの表面に共役する、抗ＣＤ２８抗体のような共刺激活性を有するその他のタンパク質を保有すべきである。さらにこのようなａＡＰＣベースのシステムは、例えばサイトカイン様インターロイキン１２などの適切な可溶性因子の付加を要することが多い。
同種異系細胞はまた、Ｔ細胞の調製において使用されてもよく、方法は、参照により本明細書に援用される、国際公開第９７／２６３２８号パンフレットで詳述される。例えば、ショウジョウバエ細胞およびＴ２細胞に加えて、その他の細胞を使用して、ＣＨＯ細胞、バキュロウイルス感染昆虫細胞、細菌、酵母、ワクシニア感染標的細胞などの抗原を提示してもよい。さらに植物ウイルスが使用されてもよい（例えば、外来性ペプチド提示のための高収率システムとしてのササゲモザイクウイルス開発を記載するＰｏｒｔａ ｅｔ ａｌ．（Ｐｏｒｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９４）を参照されたい）。
本発明のペプチドに向けられた活性化Ｔ細胞は、治療法において有用である。したがって、本発明のさらなる態様は、前述の本発明の方法によって入手可能な活性化Ｔ細胞を提供する。
上記方法によって製造される活性化Ｔ細胞は、配列番号１〜配列番号４８のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する細胞を選択的に認識する。
好ましくは、Ｔ細胞は、そのＴＣＲを通じた、ＨＬＡ／ペプチド複合体（例えば結合）との相互作用によって、細胞を認識する。Ｔ細胞は、その標的細胞が、本発明のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する患者において、標的細胞を死滅させる方法で有用であり、患者には有効数の活性化Ｔ細胞が投与される。患者に投与されるＴ細胞は、患者に由来して、上述のように活性化されてもよい（すなわち、それらは自己Ｔ細胞である）。代案としては、Ｔ細胞は、患者でなく別の個人に由来する。もちろん、個人が健常人であれば、それが好ましい。「健常人」によって、本発明者らは、個人が概して健康良好であり、好ましくは有能な免疫系を有して、より好ましくは容易に検査され検出され得るいかなる疾患にも罹患していないことを意味する。
生体内で、本発明によるＣＤ８陽性Ｔ細胞の標的細胞は、（時にＭＨＣクラスＩＩを発現する）腫瘍細胞であり得て、および／または（時にＭＨＣクラスＩＩもまた発現する；（Ｄｅｎｇｊｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００６））腫瘍（腫瘍細胞）周囲の間質細胞であり得る。
本発明のＴ細胞は、治療用組成物の活性成分として使用されてもよい。したがって、本発明は、その標的細胞が、本発明のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する患者において、標的細胞を死滅させる方法もまた提供し、方法は、上で定義されるようなＴ細胞の有効数を患者に投与するステップを含んでなる。
「異常に発現される」によって、本発明者らは、正常組織における発現レベルと比較して、ポリペプチドが過剰発現されること、または腫瘍がそれに由来する組織においては遺伝子がサイレントであるが、腫瘍においてはそれが発現されることもまた意味する。「過剰発現」によって、本発明者らは、ポリペプチドが、正常組織に存在するレベルの少なくとも１．２倍のレベルで；好ましくは正常組織に存在するレベルの少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも５倍または１０倍のレベルで存在することを意味する。
Ｔ細胞は、例えば上で記載されるものなどの当該技術分野で公知の方法によって得られてもよい。
Ｔ細胞のこのいわゆる養子免疫伝達のためのプロトコルは、当該技術分野で周知である。概説は、Ｇａｔｔｉｏｎｉ ｅｔ ａｌ．ａｎｄ Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．，２００６）にある。
本発明の別の態様は、その核酸がクローン化されて、好ましくはＴ細胞である宿主細胞に導入されるＴ細胞受容体を生成するための、ＭＨＣと複合体形成するペプチドの使用を含む。次に、この遺伝子操作Ｔ細胞は、がん治療のために患者に移入され得る。
本発明の任意の分子、すなわちペプチド、核酸、抗体、発現ベクター、細胞、活性化Ｔ細胞、Ｔ細胞受容体またはそれをエンコードする核酸は、免疫応答を逃れた細胞によって特徴付けられる障害の治療に有用である。したがって本発明の任意の分子は、薬剤として、または薬剤の製造において使用されてもよい。分子は、単独で、または本発明のその他の分子または既知の分子との組み合わせで、使用されてもよい。
本発明は、
（ａ）溶液中のまたは凍結乾燥形態の上述の医薬組成物を含有する容器；
（ｂ）任意選択的に、凍結乾燥製剤のための希釈剤または再構成溶液を含有する第２の容器；および
（ｃ）任意選択的に、（ｉ）溶液の使用、または（ｉｉ）凍結乾燥製剤の再構成および／または使用のための取扱説明書
を含んでなるキットをさらに目的とする。
キットは、（ｉｉｉ）緩衝液、（ｉｖ）希釈剤、（ｖ）濾過、（ｖｉ）針、または（ｖ）シリンジの１つまたは複数をさらに含んでなってもよい。容器は、好ましくは、ボトル、バイアル、シリンジまたは試験管であり；それは、多回使用容器であってもよい。医薬組成物は、好ましくは凍結乾燥される。
本発明のキットは、好ましくは、適切な容器内の本発明の凍結乾燥製剤と、その再構成および／または使用のための取扱説明書とを含んでなる。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル（例えば二重チャンバーバイアル）、シリンジ（二重チャンバーシリンジなど）、および試験管が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの多様な材料から形成されてもよい。好ましくは、キットおよび／または容器は、容器上の、または容器に付随する、取扱説明を含み、それは再構成および／または使用上の指示を示す。例えば、ラベルは、凍結乾燥製剤が、上述されるようなペプチド濃度に再構成されることを表示してもよい。ラベルは、製剤が皮下投与に有用であり、または皮下投与用であることをさらに表示してもよい。
製剤を収容する容器は、多回使用バイアルであってもよく、それは再構成製剤の反復投与（例えば２〜６回の投与）を可能にする。キットは、適切な希釈剤（例えば、炭酸水素ナトリウム溶液）を含んでなる、第２の容器をさらに含んでなってもよい。
希釈剤と凍結乾燥製剤の混合時に、再構成製剤中の最終ペプチド濃度は、好ましくは少なくとも０．１５ｍｇ／ｍＬ／ペプチド（＝７５μｇ）であり、好ましくは３ｍｇ／ｍＬ／ペプチド（＝１５００μｇ）以下である。キットは、その他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および取扱説明が掲載されるパッケージインサートをはじめとする商業的および使用者観点から望ましい、その他の物品をさらに含んでもよい。
本発明のキットは、その他の構成要素（例えば、その他の化合物またはこれらのその他の化合物の医薬組成物）が添加されたまたは添加されない、本発明による医薬組成物製剤を含有する単回容器を有してもよく、または各構成要素のための別個の容器を有してもよい。
好ましくは、本発明のキットは、第２の化合物（アジュバント（例えばＧＭ−ＣＳＦ）、化学療法剤、天然物、ホルモンまたは拮抗薬、抗血管新生因子または阻害剤、アポトーシス誘導剤またはキレート剤など）またはその医薬組成物の同時投与と合わせて使用するためにパッケージされた、本発明の製剤を含む。キットの構成要素は、あらかじめ混合されてもよく、または各構成要素は、患者への投与前に別個の異なる容器内にあってもよい。キットの構成要素は、１つまたは複数の液体溶液、好ましくは水溶液、より好ましくは無菌水溶液中で、提供されてもよい。またキットの構成要素は、固体として提供されてもよく、それは、好ましくは別の異なる容器内に提供される、適切な溶媒の添加によって液体に変換されてもよい。
治療用キットの容器は、バイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、または固体または液体を封入するその他のあらゆる手段であってもよい。通常，２つ以上の構成要素がある場合、キットは、第２のバイアルまたはその他の容器を含有して、別々の投薬を可能にする。キットは、薬学的に許容可能な液体のための別の容器もまた、含有してもよい。好ましくは、治療用キットは、装置（例えば、１本または複数本の針、シリンジ、点眼器、ピペットなど）を含有して、本キットの構成要素である本発明の作用物質の投与を可能にする。
本製剤は、経口（腸内）、経鼻、眼、皮下、皮内、筋肉内、静脈内または経皮などの任意の許容できる手段によるペプチド投与に適するものである。好ましくは、投与はｓ．ｃ．であり、最も好ましくはｉ．ｄ．投与であり、輸液ポンプによってもよい。
本発明のペプチドは前立腺腫瘍から単離されたので、本発明の薬剤は、好ましくは前立腺腫瘍を治療するために使用される。
本発明は、予備スクリーニングＴＵＭＡＰの貯蔵庫から選択される少なくとも１つのペプチドを含んでなる、医薬組成物を製造するステップを含んでなる、個々の患者のための個別化医薬品を製造する方法にさらに関し、医薬組成物中で使用される少なくとも１つのペプチドは、個々の患者における適切さについて選択される。一実施形態では、医薬組成物はワクチンである。方法はまた、ＴＣＲ単離などの下流用途、または可溶性抗体、およびその他の治療選択肢のためのＴ細胞クローンを製造するためにも適応され得る。
「個別化医薬品」は、積極的個別化がんワクチンおよび自己由来患者組織を使用した養子細胞療法をはじめとするこのような個々の患者の治療のためにのみ使用される、一個人の患者のために特に調整された治療法を意味するものとする。
本明細書の用法では、「貯蔵庫」という用語は、特定の腫瘍型における免疫原性および／または過剰提示について予備スクリーニングされている、一群のまたは一組のペプチドを指すものとする。「貯蔵庫」という用語は、ワクチンに含まれる特定のペプチドが、予備製造されて物理的設備内で貯蔵されることを暗示することは意図されないが、その可能性も検討される。ペプチドは、製造される各個別化ワクチンのために新規に製造されてもよく、または予備製造されて貯蔵されてもよいことが、明示的に検討される。貯蔵庫（例えば、データベースの形態）は、多様なＨＬＡ−ＡＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子を有する前立腺がん患者の腫瘍組織において高度に過剰発現される、腫瘍関連ペプチドから構成される。それは、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩペプチドまたは伸長ＭＨＣクラスＩペプチドを含有してもよい。いくつかの前立腺腫瘍組織から採取された腫瘍関連ペプチドに加えて、貯蔵庫は、ＨＬＡ−Ａ＊０２およびＨＬＡ−Ａ＊２４標識ペプチドを含有してもよい。これらのペプチドは、ＴＵＭＡＰによって誘導されるＴ細胞免疫の規模を定量的に比較できるようにし、したがって抗腫瘍応答を引き起こすワクチンの能力について、重要な結論が導かれるようにする。第２に、それらは、患者において、「自己」抗原に由来するＴＵＭＡＰに対するいかなるワクチン誘導Ｔ細胞応答も観察されない症例において、「非自己」抗原に由来する重要な陽性対照ペプチドとして機能する。第３に、それは、患者の免疫能力状態に関する結論が導かれるようにしてもよい。
貯蔵庫のためのＴＵＭＡＰは、遺伝子発現解析、質量分析、およびＴ細胞免疫学を組み合わせた、統合ゲノム機能解析アプローチ（ＸＰｒｅｓｉｄｅｎｔ（登録商標））を使用して同定される。アプローチは、高い割合の腫瘍上に真に存在するが、正常組織上では発現されず、または最小限にのみ発現されるＴＵＭＡＰだけが、さらなる分析のために選択されることを保証する。最初のペプチド選択のために、患者からの前立腺がんサンプルならびに追加的な良性前立腺肥大、および健常ドナーからの血液を段階的アプローチで分析した：
１．腫瘍性物質からのＨＬＡリガンドを質量分析法によって同定した
２．ゲノム規模メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）発現解析を使用して、一連の正常器官および組織と比較して悪性組織（前立腺がん）中の遺伝子過剰発現を同定した
３．同定されたＨＬＡリガンドを遺伝子発現データと比較した。好ましくは、ステップ２で検出されたような選択的に発現されまたは過剰発現される遺伝子によってコードされる、腫瘍組織上で過剰提示されまたは選択的に提示されるペプチドが、多重ペプチドワクチンのための適切なＴＵＭＡＰ候補と見なされた。
４．同定されたペプチドのＴＵＭＡＰとしての妥当性を支持する追加的な証拠を同定するために、文献調査を実施した
５．ｍＲＮＡレベルでの過剰発現の関連性をステップ３からの選択されたＴＵＭＡＰの腫瘍組織上における再検出と、健常組織における検出の欠如（またはまれな）検出によって確認した。
６．選択されたペプチドによる生体内Ｔ細胞応答の誘導が可能かどうかを評価するために、健常ドナーならびに前立腺がん患者からのヒトＴ細胞を使用して、生体外免疫原性アッセイを実施した。
一態様では、貯蔵庫に含める前に、ペプチドが免疫原性について予備スクリーニングされる。制限を意図しない一例として、貯蔵庫に包含されるペプチドの免疫原性は、ペプチド／ＭＨＣ複合体および抗ＣＤ２８抗体が負荷された人工抗原提示細胞による、健常ドナーからのＣＤ８＋Ｔ細胞の反復刺激を通じた、生体外Ｔ細胞プライミングを含んでなる方法によって判定される。
この方法は、稀ながんに、そして稀な発現プロファイルを有する患者にとって、好ましい。一定組成を有する多重ペプチド混合物とは対照的に、現在開発されている貯蔵庫は、腫瘍における抗原の実際の発現とワクチンとの顕著により高いマッチングを可能にする。多標的アプローチでは、各患者のために、選択された単一のまたは組み合わされた数種の「既製」ペプチドが利用される。理論上は、例えば５０個の抗原性ペプチドのライブラリーからの５個の異なる抗原性ペプチドの選択に基づくアプローチは、それだけでおよそ１７００万個の可能な医薬品（ＤＰ）組成物をもたらす。
一態様では、ペプチドは、本明細書に記載される、または以下のような本発明による方法に基づく、個々の患者に対するそれらの適切さに基づいて、ワクチンへの包含のために選択される。
ＨＬＡ表現型、トランスクリプトミクスおよびペプチドミクスデータが、患者の腫瘍材料および血液サンプルから収集されて、「貯蔵庫」および患者に特有の（すなわち変異）ＴＵＭＡＰを含有する、各患者に対して最も適切なペプチドが同定される。患者の腫瘍において選択的にまたは過剰発現されて、可能であれば、患者の個々のＰＢＭＣと共に試験すると、強力な生体外免疫原性を示すペプチドが選択される。
好ましくは、ワクチンに含まれるペプチドは、（ａ）個々の患者からの腫瘍サンプルによって提示される腫瘍関連ペプチド（ＴＵＭＡＰ）を同定するステップと；（ｂ）（ａ）で同定されたペプチドを上述のペプチド貯蔵庫と比較するステップと；（ｃ）少なくとも１つのペプチドを患者において同定された腫瘍関連ペプチドに関連がある貯蔵庫（データベース）から選択するステップとを含んでなる方法によって同定される。例えば、腫瘍サンプルによって提示されるＴＵＭＡＰは、（ａ１）前記腫瘍サンプルからの発現データを前記腫瘍サンプルの組織型に対応する正常組織サンプルからの発現データと比較して、前記腫瘍サンプルにおいて過剰発現されまたは異常に発現されるタンパク質を同定するステップと；（ａ２）発現データを腫瘍サンプル中のＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ分子と結合しているＭＨＣリガンドの配列と相関させて、腫瘍によって過剰発現されまたは異常に発現されるタンパク質に由来するＭＨＣリガンドを同定するステップとによって同定される。好ましくは、ＭＨＣリガンドの配列は、腫瘍サンプルから単離されたＭＨＣ分子から結合ペプチドを溶出させて、溶出したリガンドを配列決定することで同定される。好ましくは、腫瘍サンプルおよび正常組織は、同一患者から入手される。
貯蔵庫（データベース）モデルを使用してペプチドを選択するのに加えて、またはその代案として、ＴＵＭＡＰを患者において新規に同定し、次に、ワクチンに含めてもよい。一実施例として、（ａ１）前記腫瘍サンプルからの発現データを前記腫瘍サンプルの組織型に対応する正常組織サンプルからの発現データと比較して、前記腫瘍サンプルにおいて過剰発現されまたは異常に発現されるタンパク質を同定するステップと；（ａ２）発現データを腫瘍サンプル中のＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ分子と結合しているＭＨＣリガンドの配列と相関させて、腫瘍によって過剰発現されまたは異常に発現されるタンパク質に由来するＭＨＣリガンドを同定するステップとによって、候補ＴＵＭＡＰが患者において同定されてもよい。別の実施例として、個々の患者からの正常な対応組織と比較して、腫瘍サンプルに特有の変異を含有するタンパク質が同定されてもよく、特異的に変異を標的とするＴＵＭＡＰが同定され得る。例えば、腫瘍のゲノム、および対応する正常組織のゲノムは、全ゲノム配列決定によって配列決定され得る。遺伝子のタンパク質コード領域における非同義の変異を発見するために、ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡが腫瘍組織から抽出され、正常な非変異ゲノム生殖細胞系ＤＮＡが末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から抽出される。適用されたＮＧＳアプローチは、タンパク質コード領域の再配列決定（エクソーム再配列決定）に限定される。この目的で、供給業者が提供する標的富化キットを使用して、ヒトサンプルからのエクソンＤＮＡが捕捉され、例えばＨｉＳｅｑ２０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）による配列決定がそれに続く。それに加えて、遺伝子発現の直接定量化と、変異遺伝子が患者の腫瘍において発現されることの妥当性評価とのために、腫瘍ｍＲＮＡが配列決定される。結果として得られる数百万の配列読み取りは、ソフトウェアアルゴリズムを通じて処理される。出力一覧は、変異および遺伝子発現を含有する。ＰＢＭＣ由来生殖細胞系の多様性と比較することで腫瘍特異的体細胞変異が判定され、優先順位がつけられる。次に、新規に同定されたペプチドは、貯蔵庫について上述した免疫原性について試験され得て、適切な免疫原性を保持する候補ＴＵＭＡＰが、ワクチンへの包含のために選択される。
例示的一実施形態では、ワクチンに包含されるペプチドは、（ａ）個々の患者からの腫瘍サンプルによって提示される腫瘍関連ペプチド（ＴＵＭＡＰ）を上述の方法（方法）によって同定するステップと；（ｂ）ａ）で同定されたペプチドを対応する正常組織との比較で腫瘍における免疫原性および過剰提示について予備選別されたペプチドの貯蔵庫と比較するステップと；（ｃ）少なくとも１つのペプチドを患者において同定された腫瘍関連ペプチドに関連がある貯蔵庫から選択するステップと；（ｄ）任意選択的に、（ａ）で新規に同定された少なくとも１つのペプチドを選択して、その免疫原性を確認するステップとによって同定される。
例示的一実施形態では、ワクチンに包含されるペプチドは、（ａ）個々の患者からの腫瘍サンプルによって提示される腫瘍関連ペプチド（ＴＵＭＡＰ）を同定するステップと；（ｂ）（ａ）で新規に同定された少なくとも１つのペプチドを選択して、その免疫原性を確認するステップとによって同定される。
ひとたび個別化ペプチドベースのワクチンのためのペプチドを選択したら、ワクチンを製造する。ワクチンは、好ましくは、約３３％ＤＭＳＯなどの２０〜４０％ＤＭＳＯ、好ましくは約３０〜３５％ＤＭＳＯに溶解された、個々のペプチドからなる液体製剤である。
製品に包含される各ペプチドをＤＭＳＯに溶解する。単一ペプチド溶液の濃度は、製品に包含されるペプチド数に応じて選択しなくてはならない。単一ペプチドＤＭＳＯ溶液を等量で混合し、ペプチド当たり約２．５ｍｇ／ｍｌの濃度で、製品に包含される全てのペプチドを含有する溶液を得る。次に、混合溶液を注射用水で１：３に希釈して、３３％ＤＭＳＯ中でペプチド当たり０．８２６ｍｇ／ｍｌの濃度を得る。希釈溶液を０．２２μｍの無菌フィルターを通して濾過する。最終バルク溶液を得る。
最終バルク溶液をバイアルに充填して、使用時まで−２０℃で保存する。１本のバイアルは、０．５７８ｍｇの各ペプチドを含有する７００μＬの溶液を含有する。この内、５００μＬ（ペプチド当たりおよそ４００μｇ）を皮内注射のために適用する。
がんを治療するために有用であるのに加えて、本発明のペプチドは、診断法としてもまた有用である。ペプチドは前立腺腫瘍細胞から生成されたので、そしてこれらのペプチドは正常組織には存在せずまたはより低レベルで存在すると判定されたので、これらのペプチドを利用して腫瘍の存在を診断し得る。
特許請求されるペプチドの血液サンプル中の組織生検上の存在は、がん診断において病理学者を補佐し得る。抗体、質量分析法またはその他の当該技術分野で公知の方法の手段による特定のペプチドの検出は、組織サンプルが悪性または炎症性または概して病的であることを病理学者に告げ得て、または前立腺がんのためのバイオマーカーとして利用され得る。ペプチド基の存在は、病的組織の分類または下位分類を可能にし得る。
患部組織検体上のペプチドの検出は、特にＴリンパ球が作用機序に関与することが知られておりまたは予測される場合に、免疫系が関与する治療法の利点を判定できるようにする。ＭＨＣ発現の喪失は、それによって感染悪性細胞が免疫監視を逃れる、十分に説明された機序である。したがってペプチドの存在は、この機序が、分析した細胞によって活用されていないことを示す。
本発明のペプチドは、ペプチドまたはＭＨＣ分子と複合体化したペプチドに対するＴ細胞応答または抗体応答などの、これらのペプチドに対するリンパ球応答を分析するのに使用されるかもしれない。これらのリンパ球応答は、さらなる治療段階を決定するための予後マーカーとして使用され得る。これらの応答はまた、例えば、タンパク質、核酸、自己材料のワクチン接種や、リンパ球の養子免疫伝達などの異なる手段によるリンパ球応答の誘導を目指す、免疫療法アプローチにおける代理応答マーカーとして使用され得る。遺伝子治療の設定では、副作用の評価において、ペプチドに対するリンパ球応答が考慮され得る。リンパ球応答のモニタリングはまた、例えば移植片対宿主病および宿主対移植片病の検出など、移植治療の経過観察検査のための有益な手段かもしれない。
本発明をここで、その好ましい実施形態を描写する以下の実施例において、添付図面を参照して説明するが、それでもなお、それらには限定されないものとする。本発明の目的で、本明細書で引用される全ての参考文献は、その内容全体が参照により援用される。
図１Ａ−Ｃは、正常組織（白色バー）および前立腺がん組織および良性前立腺肥大組織（黒色バー）における様々なペプチドの過剰提示を示す。 同上 同上 図１Ｄ−Ｅは、例示的ペプチド（ＳＬＬＳＨＱＶＬＬ（Ａ＊０２）（配列番号２０）およびＳＬＬＳＨＱＶＬＬ（Ａ＊２４）（配列番号２０））が検出された、全ての細胞株、正常組織およびがん組織を示す。図１Ａ）遺伝子：ＯＲ５１Ｅ２、ペプチド：ＶＴＡＱＩＧＩＶＡＶ（Ａ＊０２；配列番号１）−組織左から右：１脂肪組織、３副腎、６動脈、５骨髄、７脳、３乳房、１中枢神経、１３結腸、１十二指腸、８食道、２胆嚢、５心臓、１６腎臓、２１肝臓、４６肺、４リンパ節、４白血球サンプル、４卵巣、７膵臓、４末梢神経、１腹膜、３脳下垂体、４胎盤、３胸膜、６直筋、７唾液腺、４骨格筋、６皮膚、２小腸、４脾臓、７胃、４精巣、３胸腺、４甲状腺、１０気管、３尿管、６膀胱、２子宮、２静脈、３前立腺、４４腫瘍性前立腺。ペプチドは、小細胞肺がん上でも見いだされた（図示せず）。図１Ｂ）遺伝子：ＭＡＮＳＣ１、ペプチド：ＫＭＤＥＡＳＡＱＬＬ（Ａ＊０２；配列番号１４）−組織左から右：１脂肪組織、３副腎、６動脈、５骨髄、７脳、３乳房、１中枢神経、１３結腸、１十二指腸、８食道、２胆嚢、５心臓、１６腎臓、２１肝臓、４６肺、４リンパ節、４白血球サンプル、４卵巣、７膵臓、４末梢神経、１腹膜、３脳下垂体、４胎盤、３胸膜、６直筋、７唾液腺、４骨格筋、６皮膚、２小腸、４脾臓、７胃、４精巣、３胸腺、４甲状腺、１０気管、３尿管、６膀胱、２子宮、２静脈、３前立腺、４４腫瘍性前立腺。図１Ｃ）遺伝子：ＴＲＰＭ８、ペプチド：ＳＹＮＤＡＬＬＴＦ（Ａ＊２４；配列番号２４）−組織左から右：２副腎、１動脈、４脳、１乳房、５結腸、１心臓、１３腎臓、９肝臓、９肺、３膵臓、１脳下垂体、２直筋、３皮膚、１脾臓、１２胃、１胸腺、２子宮、４０腫瘍性前立腺。ペプチドは、非小細胞肺がん上でも見いだされた（図示せず）。図１Ｄ）遺伝子：ＫＩＡＡ１２４４、ペプチド：ＳＬＬＳＨＱＶＬＬ（Ａ＊０２；配列番号２０）−組織左から右：１膵臓細胞株、２０がん組織（１脳がん、１乳がん、２結腸がん、１食道がん、１腎臓がん、１肝臓がん、３肺がん、８前立腺がん、１胃がん、１膀胱がん）。正常組織のセットはＡ〜Ｂと同じであったが、ペプチドはいずれの正常組織でも検出されなかった。図１Ｅ）遺伝子：ＫＩＡＡ１２４４、ペプチド：ＱＹＧＫＤＦＬＴＬ（Ａ＊２４；配列番号３３）−組織左から右：３良性前立腺肥大組織、３正常組織（１肝臓、１肺、１直腸）、３１がん組織（５脳がん、４肝臓がん、１５肺がん、７前立腺がん）。正常組織のセットはＣと同じであったが、検出のなかった組織は図示されない。 同上 図１Ｆ−Ｋは、正常組織（白色バー）および前立腺がん組織および良性前立腺肥大組織（黒色バー）における様々なペプチドの過剰提示を示す。 同上 同上 同上 同上 同上 図１Ｌ−Ｓは、様々なペプチドが検出された、全ての細胞株、正常組織、およびがん組織を示す。図１Ｆ）遺伝子：ＮＥＦＨ、ペプチド：ＨＬＬＥＤＩＡＨＶ（Ａ＊０２；配列番号３）−組織左から右：１脂肪組織、３副腎、６動脈、５骨髄、７脳、３乳房、１中枢神経、１３結腸、１十二指腸、８食道、２胆嚢、５心臓、１６腎臓、４白血球サンプル、２１肝臓、４６肺、４リンパ節、３卵巣、７膵臓、４末梢神経、１腹膜、３脳下垂体、２胎盤、３胸膜、６直腸、７唾液腺、４骨格筋、５皮膚、２小腸、４脾臓、７胃、４精巣、３胸腺、４甲状腺、９気管、３尿管、６膀胱、２子宮、２静脈、３前立腺、３３前立腺がん組織、および１０良性前立腺肥大組織。図１Ｇ）遺伝子：ＰＤＥ１１Ａ、ペプチド：ＡＬＬＥＳＲＶＮＬ（Ａ＊０２；配列番号６）−組織左から右：１脂肪組織、３副腎、６動脈、５骨髄、７脳、３乳房、１中枢神経、１３結腸、１十二指腸、８食道、２胆嚢、５心臓、１６腎臓、４白血球サンプル、２１肝臓、４６肺、４リンパ節、３卵巣、７膵臓、４末梢神経、１腹膜、３脳下垂体、２胎盤、３胸膜、６直腸、７唾液腺、４骨格筋、５皮膚、２小腸、４脾臓、７胃、４精巣、３胸腺、４甲状腺、９気管、３尿管、６膀胱、２子宮、２静脈、３前立腺、３３前立腺がん組織、および１０良性前立腺肥大組織。図１Ｈ）遺伝子：ＫＬＫ４、ペプチド：ＧＹＬＱＧＬＶＳＦ（Ａ＊２４；配列番号２７）−組織左から右：２副腎、１動脈、４脳、１乳房、５結腸、１心臓、１３腎臓、９肝臓、９肺、３膵臓、１脳下垂体、２直腸、３皮膚、１脾臓、１２胃、１胸腺、２子宮、３７前立腺がん組織、および３良性前立腺肥大組織。図１Ｉ）遺伝子：ＴＧＦＢ３、ペプチド：ＹＹＡＫＥＩＨＫＦ（Ａ＊２４；配列番号２８）−組織左から右：２副腎、１動脈、４脳、１乳房、５結腸、１心臓、１３腎臓、９肝臓、９肺、３膵臓、１脳下垂体、２直腸、３皮膚、１脾臓、１２胃、１胸腺、２子宮、３７前立腺がん組織、および３良性前立腺肥大組織。図１Ｊ）遺伝子：ＫＬＫ３、ペプチド：ＳＬＦＨＰＥＤＴＧＱＶ（Ａ＊０２；配列番号４９）−組織左から右：１脂肪組織、３副腎、６動脈、５骨髄、７脳、３乳房、１中枢神経、１３結腸、１十二指腸、８食道、２胆嚢、５心臓、１６腎臓、４白血球サンプル、２１肝臓、４６肺、４リンパ節、３卵巣、７膵臓、４末梢神経、１腹膜、３脳下垂体、２胎盤、３胸膜、６直腸、７唾液腺、４骨格筋、５皮膚、２小腸、４脾臓、７胃、４精巣、３胸腺、４甲状腺、９気管、３尿管、６膀胱、２子宮、２静脈、３前立腺、３３前立腺がん組織、および１０良性前立腺肥大組織。図１Ｋ）遺伝子：ＫＬＫ２、ペプチド：ＡＹＳＥＫＶＴＥＦ（Ａ＊２４；配列番号５４）−組織左から右：２副腎、１動脈、４脳、１乳房、５結腸、１心臓、１３腎臓、９肝臓、９肺、３膵臓、１脳下垂体、２直腸、３皮膚、１脾臓、１２胃、１胸腺、２子宮、３７前立腺がん組織、および３良性前立腺肥大組織。図１Ｌ）遺伝子：ＧＲＥＢ１、ペプチド：ＳＭＬＧＥＥＩＱＬ（Ａ＊０２；配列番号２）−組織左から右：１良性前立腺肥大組織（ＢＰＨ）、３細胞株（３皮膚）、１正常組織（１子宮）、２６がん組織（２乳がん、２肝臓がん、１肺がん、１卵巣がん、１３前立腺がん、６皮膚がん、１子宮がん。図１Ｍ）遺伝子：ＴＲＰＭ８、ペプチド：ＡＬＬＴＦＶＷＫＬ（Ａ＊０２；配列番号４）−組織左から右：３良性前立腺肥大組織（ＢＰＨ）、１３がん組織（１脳がん、１２前立腺がん）。図１Ｎ）遺伝子：ＴＲＰＭ８、ペプチド：ＫＩＦＳＲＬＩＹＩ（Ａ＊０２；配列番号５）−組織左から右：４良性前立腺肥大組織（ＢＰＨ）、１０がん組織（１脳がん、８前立腺がん、１皮膚がん）。図１Ｏ）遺伝子：ＭＡＮＳＣ１、ペプチド：ＫＭＤＥＡＳＡＱＬ（Ａ＊０２；配列番号１６）−組織左から右：２１がん組織（２０前立腺がん、１膀胱がん）。図１Ｐ）遺伝子：Ｃ６ｏｒｆ１３２、ペプチド：ＲＹＧＳＰＩＮＴＦ（Ａ＊２４；配列番号２９）−組織左から右：４良性前立腺肥大組織（ＢＰＨ）、５４がん組織（１肝臓がん、２４肺がん、２６前立腺がん、３胃がん）。図１Ｑ）遺伝子：ＩＴＧＡ７、ペプチド：ＡＦＳＰＤＳＨＹＬＬＦ（Ａ＊２４；配列番号３４）−組織左から右：５良性前立腺肥大組織（ＢＰＨ）、４４がん組織（１０脳がん、１腎臓がん、４肝臓がん、１８肺がん、１１前立腺がん）。図１Ｒ）遺伝子：ＴＰＳＢ２、ＴＰＳＡＢ１、ペプチド：ＩＹＴＲＶＴＹＹＬ（Ａ＊２４；配列番号３５）−組織左から右：３良性前立腺肥大組織（ＢＰＨ）、５９がん組織（３６肺がん、１４前立腺がん、９胃がん）。図１Ｓ）遺伝子：ＳＬＣ３０Ａ４、ペプチド：ＡＬＧＤＬＶＱＳＶ（Ａ＊０２；配列番号５２）−組織左から右：１良性前立腺肥大組織（ＢＰＨ）、１１がん組織（１リンパ節がん、９前立腺がん、１皮膚がん）。 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 図２Ａ−Ｅは、正常組織および２０前立腺がんサンプルのパネルで、前立腺がんにおいて高度に過剰発現されまたは排他的に発現される本発明の起源遺伝子の例示的発現プロファイル（正常な腎臓と比較した相対発現）を示す。組織左から右：副腎、動脈、骨髄、脳（全体）、乳房、結腸、食道、心臓、腎臓（三連）、白血球、肝臓、肺、リンパ節、卵巣、膵臓、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、皮膚、小腸、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、膀胱、子宮頸部、子宮、静脈、２０前立腺がんサンプル。図２Ａ）ＮＥＦＨ；図２Ｂ）ＡＢＣＣ４；図２Ｃ）ＲＡＢ３Ｂ；図２Ｄ）ＯＲ５１Ｅ２；および図２Ｅ）ＫＬＫ２。 同上 同上 同上 同上 例示的免疫原性データを示す：ペプチド特異的多量体染色後の：フローサイトメトリー結果。Ａ）ＴＹＩＧＱＧＹＩＩ（ＦＫＢＰ１０；配列番号４２）；Ｂ）ＩＹＴＲＶＴＹＹＬ（ＴＰＳＢ２、ＴＰＳＡＢ１；配列番号３５）。 図４Ａ−Ｃは、健常ＨＬＡ−Ａ＊０２＋ドナーのペプチド特異的生体外ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の例示的結果を示す。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、それぞれ配列番号１ペプチド（Ａ、左側パネル）、配列番号３ペプチド（Ｂ、左側パネル）または配列番号５ペプチド（Ｃ、左側パネル）と複合体形成する、抗ＣＤ２８ｍＡｂおよびＨＬＡ−Ａ＊０２で被覆された、人工ＡＰＣを用いてプライミングされた。３サイクルの刺激後、Ａ＊０２／配列番号１（Ａ）、Ａ＊０２／配列番号３（Ｂ）またはＡ＊０２／配列番号５（Ｃ）を用いた２Ｄ多量体染色によって、ペプチド反応性細胞の検出を実施した。右パネル（Ａ、Ｂ、およびＣ）は、無関係のＡ＊０２／ペプチド複合体で刺激された細胞の対照染色を示す。生存一重細胞は、ＣＤ８＋リンパ球についてゲートされた。ブーリアンゲートは、異なるペプチドに対して特異的な多量体によって検出された、擬陽性事象の排除を助けた。ＣＤ８＋リンパ球の中の特異的多量体＋細胞の頻度が示される。 同上 図５Ａ−Ｂは、健常ＨＬＡ−Ａ＊２４＋ドナーのペプチド特異的生体外ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の例示的結果を示す。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、それぞれ配列番号２４ペプチド（Ａ、左側パネル）または配列番号２７ペプチド（Ｂ、左側パネル）と複合体形成する、抗ＣＤ２８ｍＡｂおよびＨＬＡ−Ａ＊２４で被覆された、人工ＡＰＣを用いてプライミングされた。３サイクルの刺激後、ペプチド反応性細胞の検出は、Ａ＊２４／配列番号２４（Ａ）、またはＡ＊２４／配列番号２７（Ｂ）を用いた、２Ｄ多量体染色によって実施された。右側パネル（ＡおよびＢ）は、無関係のＡ＊２４／ペプチド複合体で刺激された細胞の調節染色を示す。生存一重細胞は、ＣＤ８＋リンパ球についてゲートされた。ブーリアンゲートは、異なるペプチドに対して特異的な多量体によって検出された、擬陽性事象の排除を助けた。ＣＤ８＋リンパ球の中の特異的多量体＋細胞の頻度が示される。
実施例１
細胞表面に提示される腫瘍関連ペプチドの同定および定量化
組織サンプル
患者の前立腺腫瘍組織は、Ａｓｔｅｒａｎｄ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＵＳＡ ａｎｄ Ｒｏｙｓｔｏｎ，Ｈｅｒｔｓ，ＵＫ）；ＢｉｏＳｅｒｖｅ（Ｂｅｌｔｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）；Ｇｅｎｅｔｉｃｉｓｔ Ｉｎｃ．（Ｇｌｅｎｄａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）；Ｉｎｄｉｖｕｍｅｄ ＧｍｂＨ（Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）；Ｓａｉｎｔ Ｓａｖａｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ａｔｈｅｎｓ，Ｇｒｅｅｃｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｔｕｂｉｎｇｅｎから入手された。正常組織は、Ａｓｔｅｒａｎｄ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＵＳＡ ａｎｄ Ｒｏｙｓｔｏｎ，Ｈｅｒｔｓ，ＵＫ）；Ｂｉｏ−Ｏｐｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ，ＣＡ，ＵＳＡ；ＢｉｏＳｅｒｖｅ，Ｂｅｌｔｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ；Ｃａｐｉｔａｌ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ；Ｇｅｎｅｔｉｃｉｓｔ Ｉｎｃ．，Ｇｌｅｎｄａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｖａ；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；Ｋｙｏｔｏ Ｐｒｅｆｅｃｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＫＰＵＭ）；Ｏｓａｋａ Ｃｉｔｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＯＣＵ）；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｍｕｎｉｃｈ；ＰｒｏｔｅｏＧｅｎｅｘ Ｉｎｃ．，Ｃｕｌｖｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ；Ｔｉｓｓｕｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｌｔｄ．，Ｇｌａｓｇｏｗ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｔｕｂｉｎｇｅｎから入手された。全ての患者の告知に基づく同意書は、外科手術または検死解剖前に得られた。組織は切除の直後に衝撃凍結されて、ＴＵＭＡＰの単離まで−７０℃未満で保存された。
組織サンプルからのＨＬＡペプチドの単離
衝撃凍結組織サンプルからのＨＬＡペプチド貯留は、わずかに修正されたプロトコル（Ｆａｌｋ ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｓｅｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９）に従って、ＨＬＡ−Ａ＊０２−特異的抗体ＢＢ７．２、ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ特異的抗体Ｗ６／３２、ＣＮＢｒ活性化セファロース、酸処理、および限外濾過を使用して、免疫沈殿によって固形組織から得られた。
質量分析
得られたＨＬＡペプチド貯留は、逆相クロマトグラフィー（ｎａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬ Ｃ ｓｙｓｔｅｍ、Ｗａｔｅｒｓ）によってそれらの疎水性に従って分離し、ＥＳＩ源を装着したＬＴＱ−ｖｅｌｏｓおよびｆｕｓｉｏｎ ｈｙｂｒｉｄ質量分光計（ＴｈｅｒｍｏＥｌｅｃｔｒｏｎ）内で溶出ペプチドを分析した。ペプチド貯留は、毎分４００ｎＬの流速を適用して、１．７μｍ Ｃ１８逆相材料（Ｗａｔｅｒｓ）で充填された分析用融合シリカマイクロキャピラリーカラム（７５μｍ内径×２５０ｍｍ）上に直接挿入した。引き続いて、毎分３００ｎＬの流速で１０％から３３％へのＢの二段階１８０分間二成分勾配を用いて、ペプチドを分離した。勾配は、溶媒Ａ（水中の０．１％ギ酸）および溶媒Ｂ（アセトニトリル中の０．１％ギ酸）から構成された。ｎａｎｏＥＳＩ源への導入には、金被覆ガラス毛管（ＰｉｃｏＴｉｐ，Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）を使用した。ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分光計は、ＴＯＰ５ストラテジーを使用してデータ依存モードで操作した。手短に述べると、Ｏｒｂｉｔｒａｐ（Ｒ＝３００００）内の高質量精度の完全スキャンでスキャンサイクルを開始し、これもまたＯｒｂｉｔｒａｐ（Ｒ＝７５００）内の５種の最も豊富な前駆イオンのＭＳ／ＭＳスキャンがそれに続き、以前選択されたイオンは動的に排除された。タンデム質量スペクトルは、ＳＥＱＵＥＳＴおよび追加的な手動調節によって解釈した。同定されたペプチド配列は、生成された天然ペプチド断片化パターンと、配列が同一の合成参照ペプチドの断片化パターンとの比較によって確認した。
イオン計数によって、すなわちＬＣ−ＭＳ特性の抽出と解析（Ｍｕｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７）によって、無標識相対ＬＣ−ＭＳ定量化を実施した。方法は、ペプチドのＬＣ−ＭＳシグナル面積が、サンプル中のその存在量と相関すると仮定する。抽出された特性は、電荷状態デコンボリューションと滞留時間アライメント（Ｍｕｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｓｔｕｒｍ ｅｔ ａｌ．，２００８）によってさらに処理した。最終的に、全てのＬＣ−ＭＳ特性を配列同定結果と相互参照して、異なるサンプルの定量的データと、組織からペプチドへの提示プロファイルとを組み合わせた。定量的データは、技術的および生物学的反復試験内の変動を考慮した中心傾向に従って、二段法で正規化された。このようにして、それぞれの同定されたペプチドが定量的データに関連付けられ得て、サンプルと組織との間の相対定量化ができるようになる。さらに、ペプチド候補について得られた全ての定量的データを手動で検査し、データ整合性を保証して自動解析の確度を確認した。各ペプチドについて提示プロファイルを計算し、平均サンプル提示ならびに反復試験変動を示した。プロファイルは、前立腺がんサンプルおよび良性前立腺肥大サンプルを、正常組織サンプルのベースラインに並置する。例示的過剰提示ペプチドの提示プロファイルは、図１に示される。例示的ペプチドの提示スコアは、表１２および表１３に示される。
表12: 提示スコア。表は、正常組織パネルと比較して腫瘍上で非常に高度に過剰提示され(+++)、正常組織パネルと比較して腫瘍上で高度に過剰提示され(++)、正常組織パネルと比較して腫瘍上で過剰提示される(+)、HLA-A*02ペプチドを列挙する。
Figure 0006884752
表13: 提示スコア。表は、正常組織パネルと比較して腫瘍上で非常に高度に過剰提示され(+++)、正常組織パネルと比較して腫瘍上で高度に過剰提示され(++)、正常組織パネルと比較して腫瘍上で過剰提示される(+)、HLA-A*24ペプチドを列挙する。
Figure 0006884752
実施例２
本発明のペプチドをコードする遺伝子発現プロファイリング
正常細胞と比較した腫瘍細胞上のペプチドの過剰提示または特異的提示は、免疫療法におけるその有用性にとって十分であり、いくつかのペプチドは、それらの起源タンパク質が正常組織にもまた存在するにもかかわらず、腫瘍特異的である。それでもなお、ｍＲＮＡ発現プロファイリングは、免疫療法のためのペプチド標的の選択において、安全性のレベルを高めることができる。特に、アフィニティ成熟ＴＣＲなどの安全性リスクが高い治療の選択肢では、理想的な標的ペプチドは、腫瘍に特有で正常組織上には見いだされないタンパク質に由来する。
ＲＮＡ起源および調製
外科的に除去された組織標本は、告知に基づく同意書が各患者から入手された後に、上述の通り提供された（実施例１を参照されたい）。腫瘍組織標本を手術直後にスナップ凍結し、その後、液体窒素下で乳鉢と乳棒を用いて均質化した。ＴＲＩ試薬（Ａｍｂｉｏｎ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、これらのサンプルから全ＲＮＡを調製し、ＲＮｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）による精製がそれに続き；どちらの方法も製造業者のプロトコルに従って実施した。
健常ヒト組織からの全ＲＮＡは、商業的に入手された（Ａｍｂｉｏｎ，Ｈｕｎｔｉｎｇｄｏｎ，ＵＫ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ；ＢｉｏＣｈａｉｎ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）。幾人（２〜１２３人）かの個人からのＲＮＡは、各個人からのＲＮＡが等しく重み付けされるように混合した。
全てのＲＮＡサンプルの品質および量は、ＲＮＡ ６０００ Ｐｉｃｏ ＬａｂＣｈｉｐキット（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上で評価した。
マイクロアレイ実験
全ての腫瘍および正常組織ＲＮＡサンプルの遺伝子発現解析は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ（ＨＧ）Ｕ１３３ＡまたはＨＧ−Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０オリゴヌクレオチドマイクロアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）によって実施した。全てのステップは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマニュアルに従って実施した。簡単に述べると、マニュアルに記載されるようにして、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＲＴＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびオリゴｄＴ−Ｔ７プライマー（ＭＷＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、５〜８μｇの全ＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを合成した。生体外転写は、Ｕ１３３ＡアレイのためのＢｉｏＡｒｒａｙ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ ＲＮＡ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｋｉｔ（ＥＮＺＯ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ，ＵＳＡ）を用いて、またはＵ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０のためのＧｅｎｅＣｈｉｐ ＩＶＴ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いて実施し、ｃＲＮＡ断片化、ハイブリダイゼーション、そしてストレプトアビジン−フィコエリトリンとビオチン化抗ストレプトアビジン抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）とを用いた染色がそれに続いた。Ａｇｉｌｅｎｔ ２５００Ａ ＧｅｎｅＡｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒ（Ｕ１３３Ａ）またはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｇｅｎｅ−Ｃｈｉｐ Ｓｃａｎｎｅｒ ３０００（Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０）で画像をスキャンして、全てのパラメータについてデフォルト設定を使用して、ＧＣＯＳソフトウェア（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）によってデータを解析した。正規化のために、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘによって提供される１００個のハウスキーピング遺伝子を使用した。ソフトウェアによって与えられるシグナルｌｏｇ比から、相対的発現値を計算し、正常な腎臓サンプルを自由裁量で１．０に設定した。前立腺がんにおいて高度に過剰発現され、または排他的に発現される、本発明の起源遺伝子の例示的発現プロファイルが、図２Ａ〜Ｅに示される。さらなる例示的遺伝子の発現スコアは、表１４に示される。
表14: 発現スコア。表は、正常組織パネルと比較して腫瘍において非常に高度に過剰発現され(+++)、正常組織パネルと比較して腫瘍において高度に過剰発現され(++)、正常組織パネルと比較して腫瘍において過剰発現される(+)、遺伝子に由来するペプチドを列挙する。
Figure 0006884752
実施例３
ＭＨＣクラスＩ提示ペプチドの生体外免疫原性
本発明のＴＵＭＡＰの免疫原性に関する情報を得るために、本発明者らは、ペプチド／ＭＨＣ複合体および抗ＣＤ２８抗体を負荷した人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）によるＣＤ８＋Ｔ細胞の反復刺激に基づく、生体外Ｔ細胞プライミングアッセイを用いて研究を実施した。このようにして、本発明者らは、いくつかの選択されたＴＵＭＡＰについて、本発明のＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性およびＨＬＡ−Ａ＊２４拘束性ＴＵＭＡＰに対する免疫原性を示し得て、これらのペプチドが、それに対するＣＤ８前駆体Ｔ細胞がヒトに存在する、Ｔ細胞エピトープであることが実証された（表１５Ａ＋Ｂ）。
ＣＤ８＋Ｔ細胞の生体外プライミング
ペプチドＭＨＣ複合体（ｐＭＨＣ）および抗ＣＤ２８抗体を負荷した、人工抗原提示細胞による生体外刺激を実施するために、本発明者らは、最初に、告知に基づく同意後に、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｃｌｉｎｉｃｓ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙから得られた健常ドナーのＣＤ８ミクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ−Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した正の選択を通じて、新鮮ＨＬＡ−Ａ＊０２白血球除去生成物からＣＤ８＋Ｔ細胞を単離した。
ＰＢＭＣおよび単離ＣＤ８＋リンパ球またはＰＢＭＣは、１０％熱不活性化ヒトＡＢ血清（ＰＡＮ−Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｉｄｅｎｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン／１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（ＣＣ Ｐｒｏ，Ｏｂｅｒｄｏｒｌａ，Ｇｅｒｍａｎｙ），２０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（Ｃａｍｂｒｅｘ）を添加した、ＲＰＭＩ−Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）からなるＴ細胞培地（ＴＣＭ）中で、使用時まで培養した。２．５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）および１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａ，Ｎｕｒｎｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）もまた、この段階でＴＣＭに添加した。
ｐＭＨＣ／抗ＣＤ２８被覆ビーズの生成、Ｔ細胞刺激、および読み取りは、高度に定義された生体外システム内で、刺激条件当たり４種の異なるｐＭＨＣ分子と、読み取り条件当たり８種の異なるｐＭＨＣ分子を使用して実施した。
製造会社（Ｐｅｒｂｉｏ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が推奨する通りにスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドビオチンを使用して、精製共刺激マウスＩｇＧ２ａ抗ヒトＣＤ２８ Ａｂ９．３（Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８７）を化学的にビオチン化した。使用されたビーズは、直径５．６μｍのストレプトアビジン被覆ポリスチレン粒子（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，ＵＳＡ）であった。
陽性および陰性対照刺激のために使用されたｐＭＨＣは、それぞれ、Ａ＊０２０１／ＭＬＡ−００１（修飾Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１に由来するペプチドＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号６０））およびＡ＊０２０１／ＤＤＸ５−００１（ＤＤＸ５に由来するＹＬＬＰＡＩＶＨＩ、配列番号６１）であった。
４×１２．５ｎｇの異なるビオチンｐＭＨＣの存在下で、８００，０００個のビーズ／２００μｌを９６ウェルプレート内で被覆し、洗浄して、引き続いて２００μｌの容量中で６００ｎｇのビオチン抗ＣＤ２８を添加した。５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１２（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）を添加した２００μｌのＴＣＭ中で、１×１０６のＣＤ８＋Ｔ細胞を２×１０５個の洗浄被覆ビーズと、３７℃で３日間にわたり同時インキュベートすることで、９６ウェルプレート内で刺激を開始した。次に８０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加した新鮮ＴＣＭで培地の半分を交換し、３７℃で４日間にわたり培養を継続した。この刺激サイクルを合計３回実施した。条件当たり８種の異なるｐＭＨＣ分子を使用したｐＭＨＣ多量体読み取りでは、５種の異なる蛍光色素への共役を包含するわずかな修正を加えて、以前記載されたような（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２）二次元コンビナトリアルコーディングアプローチを使用した。最後に、Ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ近赤外染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＣＤ８−ＦＩＴＣ抗体クローンＳＫ１（ＢＤ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、および蛍光性ｐＭＨＣ多量体による細胞の染色によって多量体解析を実施した。解析では、適切なレーザーおよびフィルターを装着したＢＤ ＬＳＲＩＩ ＳＯＲＰ血球計数器を使用した。ペプチド特異的細胞を全ＣＤ８＋細胞の百分率として計算した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ，Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡ）を使用して、多量体解析の評価を実施した。特異的多量体＋ＣＤ８＋リンパ球の生体外初回刺激は、陰性対照刺激と比較することで（ｂｙ ｂｙ）検出された。１人の健常ドナーの少なくとも１つの評価可能生体外刺激ウェルが、生体外刺激後に、特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞株を含有することが判明したら、所与の抗原の免疫原性が検出された（すなわちこのウェルは、ＣＤ８＋Ｔ細胞内に少なくとも１％の特異的多量体＋を含有し、特異的多量体＋細胞の百分率は、陰性対照刺激の中央値の少なくとも１０倍であった）。
前立腺がんペプチドの生体外免疫原性
ＨＬＡクラスＩペプチドを試験するために、ペプチド特異的Ｔ細胞株の生成によって生体外免疫原性が実証され得た。本発明の２種のペプチドの、ＴＵＭＡＰ特異的多量体染色後の例示的フローサイトメトリー結果は、対応する陰性対照と共に図３に示される。本発明からの５種のペプチドの結果は、表１５Ａに要約される。本発明からの６種のペプチドのさらなる結果は、表１５Ｂに要約される。
表15A: 本発明のHLAクラスIペプチドの生体外免疫原性
出願人によって実施された本発明のペプチドの生体外免疫原性実験の例示的結果。<20 % = +; 20 % - 49 % = ++; 50 % - 69 %= +++; >= 70 % = ++++
Figure 0006884752
表15B: 本発明のHLAクラスIペプチドの生体外免疫原性
出願人によって実施された本発明のペプチドの生体外免疫原性実験の例示的結果。<20 % = +; 20 % - 49 % = ++; 50 % - 69 %= +++; >= 70 % = ++++
Figure 0006884752
実施例４
ペプチドの合成
Ｆｍｏｃストラテジーを使用した標準的な十分に確立された固相ペプチド合成を使用して、全てのペプチドを合成した。個々のペプチドのアイデンティティーおよび純度は、質量分析および分析用ＲＰ−ＨＰＬＣによって判定された。ペプチドは、純度＞５０％の白色から灰白色の凍結乾燥物（トリフルオロ酢酸塩）として得られた。全てのＴＵＭＡＰは、好ましくはトリフルオロ酢酸塩または酢酸塩として投与され、その他の塩形態もまた可能である。
実施例５
ＭＨＣ結合アッセイ
本発明によるＴ細胞ベースの治療法のための候補ペプチドを、それらのＭＨＣ結合能力（親和性）についてさらに試験した。個々のペプチド−ＭＨＣ複合体は、ＵＶリガンド交換によって生成され、ＵＶ感受性ペプチドはＵＶ照射に際して切断されて、分析される目的ペプチドで交換された。ペプチド受容性ＭＨＣ分子と効果的に結合して安定化し得るペプチド候補のみが、ＭＨＣ複合体の分離を防止する。交換反応の収率を判定するために、安定化ＭＨＣ複合体の軽鎖（β２ｍ）の検出に基づくＥＬＩＳＡを実施した。アッセイは、Ｒｏｄｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．（Ｒｏｄｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．，２００６）に一般的に記載されるようにして実施した。
９６ウェルＭＡＸＩＳｏｒｐプレート（ＮＵＮＣ）をＰＢＳ中の２μｇ／ｍｌストレプトアビジンにより室温で一晩被覆して４回洗浄し、ブロック緩衝液を含有する２％ＢＳＡ中で３７℃で１時間ブロックした。再折りたたみされたＨＬＡ−Ａ＊０２０１０２：０１／ＭＬＡ−００１単量体が、１５〜５００ｎｇ／ｍｌの範囲をカバーする標準物質の役割を果たした。ＵＶ交換反応のペプチド−ＭＨＣ単量体をブロック緩衝液で１００倍に希釈した。サンプルを３７℃で１時間インキュベートして４回洗浄し、２ｕｇ／ｍｌのＨＲＰ共役結合抗β２ｍと共に３７℃で１時間インキュベートして再度洗浄し、ＮＨ２ＳＯ４で停止させたＴＭＢ溶液で検出した。吸収は、４５０ｎｍで測定された。抗体またはそれらのフラグメント、および／またはＴ細胞受容体またはそれらのフラグメントの生成および製造のためには、高い交換収率（好ましくは５０％より高い、最も好ましくは７５％より高い）を示す候補ペプチドが、ＭＨＣ分子に対する十分な結合活性を示してＭＨＣ複合体の分離を防止することから、一般に好ましい。
表16A: MHCクラスI結合スコア
HLAクラスI拘束性ペプチドとHLA-A*24との結合は、ペプチド交換収率によって評価された: >10% = +; >20% = ++; >50 = +++; > 75% = ++++
Figure 0006884752
表16B: MHCクラスI結合スコア
HLAクラスI拘束性ペプチドとHLA-A*02との結合は、ペプチド交換収率によって評価された: >10% = +; >20% = ++; >50 = +++; > 75% = ++++
Figure 0006884752
実施例６
細胞表面に提示される腫瘍関連ペプチドの絶対定量化
抗体および／またはＴＣＲなどのバインダーの生成は、骨の折れる工程であり、いくつかの選択された標的に対してのみ実施されてもよい。腫瘍関連および特異的ペプチドの場合、選択基準としては、提示の排他性および細胞表面に提示されるペプチドの密度が挙げられるが、これに限定されない。本明細書に記載されるようなペプチドの単離および相対定量化に加えて、本発明者らは、記載されるように、細胞当たりの絶対ペプチドコピー数を分析した。固形腫瘍サンプル中の細胞当たりのＴＵＭＡＰコピーの定量化は、単離されたＴＵＭＡＰの絶対定量化、ＴＵＭＡＰ単離の効率、および分析される組織サンプルの細胞計数を必要とする。
ナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるペプチド定量化
質量分析によるペプチドの正確な定量化のために、内標準法を使用して各ペプチドの検量線を作成した。内標準は各ペプチドの二重同位体標識変異体であり、すなわち、２つの同位体標識アミノ酸がＴＵＭＡＰ合成に含まれた。それは、腫瘍関連ペプチドとはその質量異なるのみであるが、他の物理化学的性質に差異を示さない（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。内標準を各ＭＳサンプルに添加して、全てのＭＳシグナルを内標準のＭＳシグナルに対して正規化し、ＭＳ実験間の潜在的な技術的変動を平準化した。
少なくとも３つの異なるマトリックス中、すなわち、ルーチンのＭＳサンプルと同様の天然サンプルからのＨＬＡペプチド溶出液中で検量線を作成し、各調製物を二連のＭＳ試験で測定した。評価のために、ＭＳシグナルを内標準のシグナルに対して正規化し、検量線をロジスティック回帰によって算出した。
組織サンプルからの腫瘍関連ペプチドの定量化のためには、それぞれのサンプルにも内標準が添加され、ＭＳシグナルが、内標準に対して正規化され、ペプチド検量線を使用して定量化された。
ペプチド／ＭＨＣ単離の効率
あらゆるタンパク質精製処理と同様に、組織サンプルからのタンパク質の単離には、目的タンパク質のいくらかの損失が伴う。ＴＵＭＡＰ単離の効率を判定するために、絶対定量化のために選択された全てのＴＵＭＡＰについて、ペプチド／ＭＨＣ複合体を生成した。添加されたものを天然ペプチド／ＭＨＣ複合体から識別できるように、ＴＵＭＡＰの単一同位体標識バージョンが使用され、すなわち、１つの同位体標識アミノ酸がＴＵＭＡＰ合成に含まれた。これらの複合体は、新鮮に調製された組織溶解産物に、すなわち、ＴＵＭＡＰ単離手順の可能な限り早い時点で添加され、次に、以下の親和性精製において、天然ペプチド／ＭＨＣ複合体のように捕捉された。したがって単一標識ＴＵＭＡＰの回収率を測定することで、個々の天然ＴＵＭＡＰの単離効率に関する結論が可能になる。
少数のサンプルで単離効率が分析され、これらの組織サンプル間で同等であった。対照的に、単離効率は個々のペプチド間で異なる。これは、単離効率が、限定数の組織サンプルにおいてのみ判定されるが、任意のその他の組織標本に外挿されてもよいことを提案する。しかしながら、単離効率がペプチドからその他のペプチドに外挿されないこともあるので、各ＴＵＭＡＰは個別に分析する必要がある。
固体冷凍組織中の細胞数測定
絶対ペプチド定量化に供した組織サンプルの細胞数を測定するために、本発明者らは、ＤＮＡ含量分析を適用した。この方法は、異なる起点の幅広いサンプルに、最も重要なことには、冷凍サンプルに適用できる（Ａｌｃｏｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｆｏｒｓｅｙ ａｎｄ Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ，２００９；Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ペプチド単離プロトコル中に、組織サンプルを均質溶解産物に処理して、それから小さな溶解産物アリコートを取り出す。アリコートを３つに分割し、それからＤＮＡを単離する（ＱｉａＡｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。蛍光ベースのＤＮＡ定量化アッセイ（Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ ＨＳ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、少なくとも２つの反復試験において、各ＤＮＡ単離からの全ＤＮＡ含有量を定量化する。
細胞数を計算するために、一連の定義された細胞数がある、単一健常血液細胞のアリコートから、ＤＮＡ標準曲線を作成した。標準曲線を使用して、各ＤＮＡ単離物からの全ＤＮＡ含有量から、全細胞含有量を計算する。既知の溶解産物アリコートの容量および全溶解産物容量を考慮して、ペプチド単離のために使用された組織サンプルの平均総細胞数を外挿する。
細胞当たりペプチドコピー数
前述の実験のデータを用いて、本発明者らは、サンプルの全ペプチド量を総細胞数で除算して、それに続いて単離効率により除算することで、細胞当たりのＴＵＭＡＰコピー数を算出した。選択されたペプチドの細胞コピー数は、表１７に示される。
表17: 絶対コピー数。表は、腫瘍サンプル中の絶対ペプチド定量化の結果を列挙する。細胞当たりコピー数の中央値が、各ペプチドについて示される： <100 = +; >=100 = ++; >=1,000 +++; >=10,000 = ++++。評価可能な高品質MSデータが利用できるサンプル数が示される。
Figure 0006884752
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Claims (26)

  1. 配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるペプチドまたはその薬学的に許容可能な塩。
  2. ＭＨＣクラスＩ分子に結合する能力を有し、前記ＭＨＣに結合すると、ＣＤ８Ｔ細胞によって認識されることができる、請求項１に記載のペプチド。
  3. 請求項１に記載のペプチドが非ペプチド結合を含む、ペプチド。
  4. 請求項１に記載のペプチドとＨＬＡ−ＤＲ抗原関連不変鎖（Ｉｉ）の８０Ｎ末端アミノ酸を含んでなる融合タンパク質。
  5. 請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチドまたは請求項４に記載の融合タンパク質をエンコードする核酸。
  6. 請求項５に記載の核酸を発現する能力がある、発現ベクター。
  7. 請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド、請求項４に記載の融合タンパク質、請求項５に記載の核酸または請求項６に記載の発現ベクターを含んでなる、樹状細胞若しくは抗原提示細胞である、組換え宿主細胞。
  8. 医療において使用するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド、請求項４に記載の融合タンパク質、請求項５に記載の核酸、請求項６に記載の発現ベクター、または請求項７に記載の宿主細胞。
  9. 請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチドまたは請求項４に記載の融合タンパク質を提示する、または請求項５に記載の核酸を発現する、または請求項６に記載の発現ベクターを有する、請求項７に記載の宿主細胞を培養するステップと、前記ペプチドまたは請求項４に記載の融合タンパク質を前記宿主細胞またはその培養液から単離するステップとを含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチドまたは請求項４に記載の融合タンパク質を製造する方法。
  10. Ｔ細胞を、適切な抗原提示細胞の表面に、または抗原提示細胞を模倣する人工コンストラクトの表面に発現される抗原負荷ヒトクラスＩ ＭＨＣ分子に、前記Ｔ細胞を抗原特異的様式で活性化するのに十分な時間にわたり、生体外で接触させるステップを含んでなり、前記抗原が、請求項１または２に記載のペプチドである、活性化Ｔリンパ球を製造するインビトロ法。
  11. 請求項１または２に記載のペプチドを含んでなるポリペプチドを提示する細胞を選択的に認識する、請求項１０に記載の方法によって製造される活性化Ｔリンパ球。
  12. 請求項１または２に記載のペプチドを含んでなるポリペプチドを提示する標的細胞を有する患者の標的細胞を死滅させるための医薬であって、前記請求項１１に記載の活性化Ｔリンパ球を含む医薬。
  13. ＭＨＣ分子と結合する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチドまたは請求項４に記載の融合タンパク質、又は請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチドまたは請求項４に記載の融合タンパク質を特異的に認識する、可溶性若しくは膜結合抗体である、抗体。
  14. 請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド、請求項４に記載の融合タンパク質、請求項５に記載の核酸、請求項６に記載の発現ベクター、請求項７に記載の宿主細胞、請求項１１に記載の活性化Ｔリンパ球または請求項１３に記載の抗体を含む、がんの診断剤および／またはがんの治療剤。
  15. がんに対する薬剤の製造において使用するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド、請求項４に記載の融合タンパク質、請求項５に記載の核酸、請求項６に記載の発現ベクター、請求項７に記載の宿主細胞、請求項１１に記載の活性化Ｔリンパ球または請求項１３に記載の抗体の使用。
  16. がんが、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるペプチドに由来するタンパク質の過剰発現を示す、前立腺がん、膀胱がん、脳がん、乳がん、結腸直腸がん、食道がん、腎臓がん、肝臓がん、肺がん（ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ）、卵巣がん、子宮がん、膵臓がん、胃がん、胆嚢がん、胆管がん、黒色腫、メルケル細胞がん、白血病（ＡＭＬ、ＣＬＬ）およびその他の腫瘍の群から選択される、請求項１４に記載のがんの診断剤若しくはがんの治療剤又は請求項１５に記載のがんに対する薬剤の製造においての使用。
  17. （ａ）請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド、請求項４に記載の融合タンパク質、請求項５に記載の核酸、請求項６に記載の発現ベクター、請求項７に記載の宿主細胞、請求項１１に記載の活性化Ｔリンパ球、または請求項１３に記載の抗体を含有する医薬組成物を溶液または凍結乾燥形態で含んでなる容器を含み、
    （ｂ）凍結乾燥された医薬組成物のための希釈剤または再構成溶液を含有する第２の容器、
    （ｃ）配列番号１〜３、配列番号５〜５９からなる群から選択される少なくとももう１つのペプチド、および
    （ｄ）（ｉ）前記溶液の使用、または（ｉｉ）凍結乾燥された医薬組成物の再構成および／または使用のための取扱説明書
    の（ｂ）〜（ｄ）の少なくとも１つをさらに含んでなるキット。
  18. （ｉｉｉ）緩衝液、（ｉｖ）希釈剤、（ｖ）フィルター、（ｖｉ）針、または（ｖｉｉ）シリンジの１つまたは複数をさらに含んでなる、請求項１７に記載のキット。
  19. ＨＬＡリガンドと反応性である、Ｔ細胞受容体又は可溶性若しくは膜結合Ｔ細胞受容体であって、前記ＨＬＡリガンドが配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるペプチドである、もしくは前記ＨＬＡリガンドが前記ペプチドとＭＨＣ複合体の一部である、Ｔ細胞受容体。
  20. 前記Ｔ細胞受容体が可溶性分子として提供される、および／または、免疫刺激ドメインまたは毒素を含むさらなるエフェクター機能を保有する、請求項１９に記載のＴ細胞受容体。
  21. 請求項１９または２０に記載のＴ細胞受容体をエンコードする核酸。
  22. 請求項２１に記載の核酸を発現できる、発現ベクター。
  23. 請求項２１に記載の核酸、または請求項１３に記載の抗体をコードする核酸、または請求項２２に記載の発現ベクターを含んでなる、Ｔ細胞またはＮＫ細胞である、宿主細胞。
  24. 請求項２１に記載の核酸または請求項２２に記載の発現ベクターを含んでなる請求項２３に記載の宿主細胞を培養するステップと、前記Ｔ細胞受容体を前記宿主細胞および／またはその培養液から単離するステップとを含んでなる、請求項１９または２０に記載のＴ細胞受容体を製造する方法。
  25. 請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド、又はＭＨＣ分子と結合している請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチドを特異的に認識する、アプタマー。
  26. 請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド、請求項１９に記載のＴ細胞受容体、請求項４に記載の融合タンパク質、請求項７または請求項２３に記載の宿主細胞、請求項１１に記載の活性化Ｔリンパ球、請求項１３に記載の抗体、請求項２５に記載のアプタマーからなる群から選択される、少なくとも１つの活性成分と、薬学的に許容できる担体を含んでなる医薬組成物。
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