ES2203782T3

ES2203782T3 - Inmunoterapia que utiliza linfocitos t citotoxicos (ctl).

Info

Publication number: ES2203782T3
Application number: ES97900365T
Authority: ES
Inventors: Hans Josef Stauss
Original assignee: Imperial College Innovations Ltd
Current assignee: Ip2ipo Innovations Ltd
Priority date: 1996-01-17
Filing date: 1997-01-17
Publication date: 2004-04-16
Anticipated expiration: 2017-01-17
Also published as: US20020090362A1; DK0879282T3; EP0879282A1; PT879282E; DE69723230T2; CA2243235C; ATE244300T1; CA2243235A1; AU1394497A; JP2000503656A; WO1997026328A1; US6805861B2; EP0879282B1; DE69723230D1; JP4767371B2

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN METODO DE TRATAMIENTO DE UN PACIENTE CON UNA ENFERMEDAD, EN LA QUE EL PACIENTE CONTIENE CELULAS ENFERMAS QUE INCLUYEN O ESTAN ASOCIADAS CON UNA MOLECULA ANORMAL O UNA CANTIDAD ANORMALMENTE ELEVADA DE UNA MOLECULA, Y SIENDO DICHAS CELULAS CAPACES DE PRESENTAR AL MENOS PARTE DE DICHA MOLECULA EN SU SUPERFICIE MEDIANTE UNA MOLECULA DE TIPO I HLA (O EQUIVALENTE). DICHO METODO CONSISTE EN ADMINISTRAR AL PACIENTE UNA CANTIDAD TERAPEUTICAMENTE EFECTIVA DE LINFOCITOS T CITOTOXICOS (CTL), QUE RECONOCEN AL MENOS PARTE DE DICHA MOLECULA, CUANDO ESTA ES PRESENTADA MEDIANTE UNA MOLECULA DE TIPO I HLA (O EQUIVALENTE) SOBRE LA SUPERFICIE DE LA CELULA. EL METODO SE CARACTERIZA PORQUE LOS LINFOCITOS T CITOTOXICOS NO DERIVAN DEL PACIENTE ENFERMO, SINO DE UN INDIVIDUO QUE NO LLEVA EL TIPO DE MOLECULAS DE TIPO I HLA (O EQUIVALENTES) QUE, EN EL PACIENTE, LLEVAN DICHA MOLECULA ANORMAL O ANORMALMENTE ELEVADA, CONTENIDA EN O ASOCIADA CON LAS CELULAS ENFERMAS DE DICHO PACIENTE.

Description

Inmunoterapia que utiliza linfocitos T citotóxicos (CTL).

La presente invención se refiere a la inmunoterapia, particularmente a la inmunoterapia que utiliza linfocitos T citotóxicos (CTL) y más particularmente a la inmunoterapia adoptiva.

Existen pruebas de que los CTL antitumorales y los CTL de antivirus desempeñan un importante papel in vivo. Se ha demostrado que los CTL reactivos con el tumor median la remisión tumoral en modelos animales (1) y en el hombre (2). Igualmente, los recientes estudios sugieren que los CTL específicos para el VIH pueden limitar la cantidad de virus VIH in vivo (3).

Existe mucho interés en utilizar CTL generados in vitro para la inmunoterapia adoptiva del cáncer. La importancia potencial de los CTL generados in vitro se sugiere en experimentos con células tumorales murinas tranformadas de adenovirus (1). Se inyectaron ratones atímicos con células tumorales y se dejaron que formaran grandes tumores. Se apreció remisión tumoral cuando se trataron ratones con CTL específicos para la transformación de la proteína E1A expresada en las células tumorales. Igualmente, cuando se administraron a un paciente de melanoma CTL generados in vitro específicos para gp100 se apreció regresión tumoral (2). Por eso, se cree que la transferencia adoptiva de linfocitos T con especificidad definida representa una terapia prometedora para pacientes de cáncer. Igualmente, los CTL transferidos adoptivamente, específicos para citomegalovirus parecen suprimir la infección de CMV en pacientes que experimentaron trasplante de médula ósea (4).

El documento WO 93/17095 describe un procedimiento para producir, cargar y utilizar moléculas MHC de clase I para activar in vitro específicamente los CTL procedentes de un paciente y a continuación devolver los CTL activados al paciente en una forma de tratamiento. El documento WO 93/17095 enseña específicamente que son los propios CTL de los pacientes los que deberían utilizarse para tratar al paciente.

Chung et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 12654-12658 describe la producción de receptores funcionales de linfocitos T de una cadena y tres dominios.

Moritz et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4318-4322 describe CTL con una especificidad para reconocimiento del trasplante para las células tumorales que expresan ERBB2.

Roberts et al. (1994) Blood 84, 2878-2889 describe el direccionamiento de las células infectadas por VIH por linfocitos T de CD8^{+} provistos de receptores de linfocitos T "universales" (híbridos).

El documento US nº 5.359.046 describe receptores de linfocitos T "universales" (híbridos).

Faber et al. (1992) J. Exp. Med. 176, 1283-1289 describe la generación de clones de CTL reactivos para leucemia procedentes de donante de médula ósea genotípicamente idénticos en HLA de un paciente con leucemia. En la técnica anterior el material de los alotrasplantes de médula ósea procede directamente de un donante sano y de este modo es una población mezclada y no se clona.

El documento WO 95/22561 describe la identificación y síntesis de los péptidos reconocidos por los CTL específicos para el melanoma y su utilización para estimular CTL para la inmuniterapia adoptiva. El documento US nº 5.081.029 describe los procedimientos inmunoterapéuticos para tratar la infección por VIH. Una etapa principal limitante de la velocidad de la inmunoterapia adoptiva actual es la que es específica para el paciente y depende del aislamiento y la expansión in vitro de los CTL específicos de propio grupo de linfocitos T del paciente. Por lo tanto, para cada paciente se requiere elaborar trabajo in vitro consumidor de tiempo y costoso para generar suficiente número de CTL específicos. Además, en algunos pacientes el sistema inmunitario se puede suprimir gravemente y puede ser imposible aislar CTL específicos.

La presente invención tiene como objeto resolver estas limitaciones y proporcionar inmunoterapia adoptiva más eficaz y potencialmente más efectiva con linfocitos T citotóxicos (CTL) de pacientes, particularmente pacientes de cáncer.

Un primer aspecto de la invención proporciona la utilización tal como se define en la reivindicación 1.

Por esta razón la presente invención resuelve los problemas anteriores, por ejemplo generando CTL procedente, preferentemente, de individuos sanos contra péptidos seleccionados presentados por las moléculas HLA de clase I del paciente. Estos CTL son alo-restringidos, ya que el donante de CTL no expresa la molécula de clase I que presenta los péptidos reconocidos por CTL.

Los CTL para administrar al paciente se producen en la práctica utilizando el procedimiento del segundo aspecto de la invención descrito más adelante.

"HLA de clase I (o la molécula equivalente)" significa una proteína HLA de clase I o cualquier proteína que sea equivalente a una molécula HLA de clase I de cualquier otro animal, particularmente un vertebrado y especialmente un mamífero. Por ejemplo, es bien sabido que en el ratón las proteínas MHC de clase I son similares en estructura y llevan a cabo un papel similar a las proteínas HLA de clase I humanas. Las proteínas equivalentes a las moléculas HLA de clase I humanas pueden ser identificadas fácilmente por un experto en la materia en otras especies de mamíferos, particularmente utilizando procedimientos moleculares biológicos.

En "por lo menos parte de dicho polipéptido" se incluye cualquier fragmento de dicho polipéptido que pueda ser presentado en la superficie de una célula por una molécula HLA de clase I (o equivalente).

"Una cantidad anormalmente elevada de polipéptido" significa que en una célula enferma, comparado con una célula normal, el polipéptido está presente en > 1,2 veces la concentración; más preferentemente > 2 veces; aún más preferentemente > 5 veces y lo más preferentemente > 10 veces la concentración. Es evidente que una cantidad anormalmente elevada de un polipéptido incluye la situación en la que polipéptidos normales (es decir, naturales) se expresan en tipos de células en las que este polipéptido no se expresa habitualmente (es decir, presencia frente a ausencia). Además, es evidente que la cantidad anormalmente elevada de polipéptido puede ser debida a la activación anormal de la expresión del polipéptido que no se expresa normalmente en una célula o puede ser debida a un nivel anormal de expresión.

Es particularmente preferible que los CTL administrados al paciente sean una población clónica de CTL.

Asimismo es particularmente preferible que los CTL (preferentemente una población clónica de CTL) administrados al paciente estén practicamente exentos de otros tipos de células.

El polipéptido puede ser cualquier polipéptido, por lo menos parte del cual pueda ser presentado en la superficie de una célula por una molécula HLA de clase I (o equivalente).

La molécula es un polipéptido que incluye un polipéptido que contiene carbohidratos tal como una glucoproteína o es un carbohidrato que incluye un carbohidrato que contiene péptidos o es un lípido o glucolípido que incluye un lípido o glucolípido que contienen péptidos.

Como se trata con más detalle más adelante, los polipéptidos anormales o una cantidad anormalmente elevada de un polipéptido está relacionada con muchas enfermedades y células enfermas.

El procedimiento es particularmente ventajoso ya que es eficaz para dirigir autoproteínas (por ejemplo, las que se sobreexpresan en la célula enferma o se expresan en una célula enferma, mientras que no se sobreexpresan en una célula normal del mismo tipo).

El paciente puede o no puede estar inmunodeprimido cuando recibe los CTL. Es preferible que el paciente esté inmunodeprimido.

Es bien sabido en la técnica de la inmunología que los fragmentos de péptido procedentes de péptidos mayores o polipéptidos están presentes en moléculas HLA de clase I (o equivalentes) en la superficie de una célula, especialmente de células enfermas.

Las CTL proceden de un individuo distinto del paciente.

Desde luego, es preferible que el individuo sea un individuo sano. "Individuo sano" significa que el individuo goza generalmente de buena salud, preferentemente posee un sistema inmunitario competente y, más preferentemente, no está padeciendo ninguna enfermedad que se pueda probar y detectar fácilmente.

La palabra "tipo" se utiliza en el sentido inmunológico convencional.

Por lo tanto, los CTL proceden de un individuo cuyas moléculas HLA de clase I (o equivalentes) presentan discordancia con las del paciente. Por eso, los CTL son alo-restringidos.

Los tipos de molécula HLA de clase I (o equivalentes), distintos del tipo que presenta por lo menos parte de dicha molécula anormal o de dicha molécula anormalmente elevada, pueden ser iguales o diferentes entre el paciente y el individuo. En determinadas circunstancias se prefiere que sean iguales.

Los polipéptidos mutantes, descritos con más detalle más adelante, se asocian con frecuencia a células enfermas y a menudo sirven como marcadores moleculares para la célula enferma. Por eso, es preferible que el polipéptido sea un polipéptido mutante asociado a dichas células enfermas.

Las células enfermas, descritas con más detalle más adelante, se asocian con frecuencia a la presencia de un polipéptido a una concentración mayor en dichas células enfermas comparadas con las células no enfermas. Por ejemplo, se sabe que determinados polipéptidos se sobreexpresan en algunas células tumorales. Por lo tanto se prefiere también centrarse en autoproteínas no mutantes.

\newpage

Es preferible que los polipéptidos sean cualquiera de los siguientes:

i): proteínas celulares normales que se expresan en tumores en concentraciones anormalmente altas; p. ej.: ciclina D1 en una variedad de tumores; ciclina E en cáncer de mama; mdm 2 en una variedad de tumores; EGF-R, erb-B2, erb-B3, FGF-R, receptor del factor de crecimiento de tipo insulina, Met, myc, p53 y BCL-2 se sobreexpresan todas en varios tumores.

ii): proteínas celulares normales que son mutadas en los tumores; p. ej.: mutaciones de Ras en varios tumores; mutaciones de p53 en varios tumores; transposición de BCR/ABL en CML y ALL; mutaciones del receptor de CSF-1 en AML y MDS; mutaciones de APC en el cáncer del colon; mutaciones de RET en MEN2A, 2B y FMTC; mutaciones de EGFR en gliomas; transposición de PML/RARA en PML; transposición de E2A-PBX1 en preleucemias B y en leucemias agudas de la infancia.

iii): proteínas codificadas víricamente en tumores asociados a la infección vírica; p. ej.: proteínas del virus del papiloma humano en el cáncer cervical; proteínas del virus de Epstein-Barr en linfomas de linfocitos B y linfoma de Hodgkin; proteínas de HTLV-1 en leucemia de linfocitos T en adultos; proteínas de virus de hepatitis B y C en el carcinoma hepatocelular; proteínas de virus de tipo herpes en sarcoma de Kaposi.

iv): proteínas codificadas por VIH en pacientes infectados por el VIH.

Por lo tanto, los antígenos reconocidos por los CTL reactivos con el tumor se pueden dividir en tres categorias principales: (i) autoantígenos normales expresados en altas concentraciones en células tumorales; (ii) autoantígenos mutados expresados en células tumorales; (iii) antígenos víricos expresados en tumores asociados a la infección vírica. Se prefiere la categoria (i).

Se incluyen tres subtipos en la categoria (i):

a): proteínas celulares normales que se sobreexpresan;

b): proteínas que se expresan de un modo específico para el tejido en células normales pero también en tumores; y

c): proteínas que son antígenos embrionarios, imperceptibles en la mayoría de los tejidos de adultos pero que se expresan de forma aberrante en tumores.

Ejemplos de b) y c) son:

b): antígenos con diferenciación específica para el tejido, como objetivos para CTL reactivos con el tumor tales como GATA-1, IKAROS, SCL (expresado en el linaje hematopoyético y en leucemias); y zonas constantes en inmunoglobulina (para el tratamiento del mieloma múltiple); y

c): antígeno 1 del tumor de Wilms (WT1) para el tratamiento de leucemias y del tumor de Wilms y antígenos carcinoembrionarios (una proteína fetal CEA) para tumores de hígado e intestinales.

La sobreexpresión de proteínas codificadas por oncogenes en tumores humanos y los oncogenes expresados en tumores humanos están descritos en Stauss y Dahl (1995) Tumour Immunology, Dalgleish/Browning, cap. 7, incorporado en la presente memoria como referencia.

Por lo tanto, se prefiere que la enfermedad que se ha de tratar sea el cáncer; más preferentemente cualquiera de entre cáncer de mama; cáncer de vejiga; cáncer de pulmón; cáncer de próstata; cáncer de tiroides; leucemias y linfomas tales como CML, ALL, AML, PML; cáncer de colon; glioma; seminoma; cáncer de hígado; cáncer pancreático; cáncer de vejiga; cáncer renal; cáncer cervical; cáncer testicular; cáncer de cabeza y cuello; cáncer de ovario; neuroblastoma y melanoma.

CML es leucemia mielocítica crónica; ALL es leucemia linfoblástica aguda; AML es leucemia mielocítica aguda y PML es leucemia promielocítica.

La enfermedad que se ha de tratar puede ser cualquier enfermedad producida por un patógeno, particularmente una bacteria, levadura, virus, tripanosoma y similares. Es preferible que la enfermedad se produzca por infección crónica con un patógeno. También es preferible que el patógeno sea uno que el sistema inmunitario del huésped no elimine fácilmente.

Es preferible que la enfermedad sea una infección vírica; más preferentemente una enfermedad producida por cualquiera de entre VIH, virus del papiloma, virus de Epstein-Barr, HTLV-1, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, virus del herpes o cualquier virus que produzca infección crónica. Se prefiere particularmente que el virus sea el VIH.

La glucosilación anormal de los polipéptidos se sabe también que tiene lugar en algunas enfermedades y células enfermas.

Cantidades anormalmente elevadas de una hormona de polipéptidos producida por las células aparece en algunas enfermedades tales como determinados tipos de enfermedad tiroidea. De este modo, el medicamento preparado en la invención se emplea de forma provechosa para extirpar las células que producen cantidades elevadas de la hormona. Se debe reconocer que, incluso si la propia hormona, o por lo menos parte de ella, no es presentada por una molécula HLA de clase I (o equivalente), pueden existir polipéptidos en la célula que sean anormales o anormalmente elevados y que sean presentados por una molécula HLA de clase I (o equivalente). Por ejemplo, en determinadas enfermedades en las que una célula sobreproduce una hormona, la célula puede sobreproducir enzimas biosintéticas implicadas en la síntesis de dicha hormona.

Se pueden tratar con provecho mediante el medicamento preparado en la invención las infecciones bacterianas, particularmente las que producen infección crónica. Es preferible que la infección bacteriana sea una infección intracelular. De este modo, el medicamento preparado en la invención puede ser útil para tratar la tuberculosis.

El medicamento preparado también se puede utilizar para tratar el paludismo.

Es preferible que el tipo de molécula HLA de clase I (o equivalente) del paciente se determine antes de la administración de CTL.

Debido al estudio muy extenso de la genética del sistema HLA de clase I, se puede determinar fácilmente el tipo utilizando la tipificación del ADN. En particular es conveniente utilizar un sistema de tipificación basado en la amplificación del ADN tal como PCR. Estos procedimientos son bien conocidos en la técnica y se pueden emplear en una pequeña muestra de tejido, tal como una muestra de saliva o frotes de células epiteliales de la boca.

Se debe reconocer que la invención se puede emplear en cualquier mamífero tal como el hombre, gato, perro, caballo, vaca, oveja o cerdo.

Lo más preferible es que el paciente sea el hombre.

Aunque es preferible que el paciente y el donante de los CTL sean de la misma especie, por ejemplo ambos de la especie humana, se contempla que el procedimiento sea también útil cuando el paciente y el donante sean de especies diferentes. En otras palabras, el primer aspecto de la invención incluye que se pueda administrar CTL a un paciente humano desde un donante no humano.

Los linfocitos T citotóxicos para su utilización en la preparación de un medicamento de la invención, particularmente una población clónica de CTL, se pueden preparar en la práctica haciendo uso del segundo aspecto de la invención descrito más adelante.

Una forma de realización particularmente preferida del primer aspecto de la invención es aquella en la que el tipo de molécula HLA de clase I (o equivalente) del paciente se determina antes de la administración de los CTL, los CTL proceden de un individuo, el cual no lleva el tipo de molécula HLA de clase I (o equivalente) que en el paciente presenta por lo menos parte de dicho polipéptido anormal o polipéptido de contenido anormalmente elevado en o asociado a las células enfermas de dicho paciente y la CTL se selecciona de entre un banco de clones de CTL, comprendiendo dicho banco una diversidad de clones de CTL procedentes cada uno de un individuo con un tipo de molécula HLA de clase I (o equivalente) y cada clon de CTL reconoce dichas células enfermas.

Más preferentemente cada clon de CTL reconoce por lo menos parte del mismo polipéptido contenido en o asociado a dichas células enfermas.

Se prefiere administrar entre aproximadamente 10^{8} y 10^{11} CTL al paciente; más preferentemente entre aproximadamente 10^{9} y 10^{10} CTL. Las células se pueden administrar a pacientes que se están tratando la enfermedad por algún otro procedimiento. De este modo, aunque se puede utilizar el medicamento preparado solo es deseable utilizarlo como terapia adyuvante.

El CTL se puede administrar antes, durante o después de otra terapia.

Cuando la enfermedad que se ha de tratar es un cáncer, es preferible que el cáncer haya sido, esté siendo o se trate en el futuro con una terapia o cirugía convencional además de con el procedimiento de la invención. En la práctica, dependiendo de la terapia, el cáncer se trata por radioterapia o quimioterapia.

Cuando la enfermedad que se ha de tratar es una infección por un patógeno es preferible que la infección haya sido, esté siendo o se trate en el futuro con una terapia o cirugía convencional.

Si el paciente que se ha de tratar presenta infección por VIH es preferible que el medicamento preparado mediante la invención se utilice como adyuvante en el tratamiento con un inhibidor de transcriptasa inversa tal como AZT o 3TC.

Cuando el medicamento preparado mediante la invención se utiliza para tratar un tumor sólido es preferible que los CTL se administren como primer tratamiento después de la intervención quirúrgica.

Cuando el medicamento preparado mediante la invención se utiliza para tratar leucemia es preferible que los CTL se administren después de la radioterapia o de la quimioterapia. También es preferible que los pacientes de leucemia se traten también con CTL en combinación con el trasplante de médula ósea.

Los CTL se pueden administrar por cualquier vía adecuada. Es preferible que los CTL se administren por vía intravenosa. También es preferible que los CTL se administren por vía tópica en la zona de la enfermedad (tal como un tumor o infección vírica o bacteriana). En la práctica, los CTL se administran en una arteria que suministra a la zona de la enfermedad o al tejido en los que se localiza la enfermedad.

Un segundo aspecto de la invención proporciona un procedimiento para preparar una población clónica de linfocitos T citotóxicos (CTL) reactivos frente a un polipéptido; procedimiento que comprende la etapa de (a) cultivar conjuntamente una muestra que contiene CTL, o un precursor de los mismos, procedente de individuos sanos con células estimulantes que expresan moléculas HLA de clase I (o equivalente) en su superficie y que presenta por lo menos parte del polipéptido en una gran proporción de dichas moléculas HLA de clase I (o equivalente) ocupadas, presentes en la superficie de dicha célula estimulante y (b) seleccionar un clon de CTL reactivo frente a dicho polipéptido cuando por lo menos una parte de dicho polipéptido es presentada por la molécula HLA de clase I (o equivalente) en la superficie de la célula, en la que el individuo sano no lleva el tipo de molécula HLA de clase I (o equivalente) que, en la célula estimulante presenta, por lo menos parte del polipéptido.

Se debe reconocer que las células estimulantes del procedimiento se pueden preparar utilizando los procedimientos descritos en el documento WO 93/17095, y se debe reconocer que las etapas de metodología del procedimiento son prácticamente las mismas que las descritas en el documento WO 93/17095 con la excepción muy importante de que en el presente caso el procedimiento implica cultivar conjuntamente una muestra que contiene CTL o un precursor de los mismos procedente de un individuo sano con células estimulantes, mientras que el procedimiento del documento WO 93/17095 hace uso de una fuente de CTL procedente de un paciente que se debe tratar con las células. Además, la presente invención, en contraste con el documento WO 93/17095, aumenta los CTL contra los péptidos presentados por moléculas HLA de clase I (o equivalente) alógenas no isógenas.

En particular, las siguientes partes del documento WO 93/17095 se incorporan como referencia: la "Descripción detallada" en las páginas 23 a 52, línea 11 que describe la producción de una célula estimulante; el apartado sobre generación de péptidos con características de unión óptimas para las moléculas de la clase I en la página 90 en adelante y el banco de moléculas de clase I descrito en las páginas 123 y 124.

"Gran proporción" significa por lo menos el 50% de las moléculas HLA de clase I (o equivalente) ocupadas, más preferentemente el 70% por lo menos, aún más preferentemente el 90% por lo menos y lo más preferible el 99% por lo menos.

Una "muestra que contiene CTL o un precursor de éstos" puede ser cualquier muestra adecuada e incluye específicamente, pero no se limita a, células mononucleadas de sangre periférica (PBMC), sangre del cordón umbilical (que es una fuente natural de linfocitos T), cualquier tejido que contenga una invasión de linfocitos T y cualquier líquido corporal que contenga linfocitos T o de sus precursores e incluye timocitos.

La muestra que contiene CTL puede o no ser un cultivo de CTL que haya sido clonado in vitro.

Preferentemente, dicha muestra que contiene CTL o un precursor de éstos es PBMC.

Preferentemente, dicha molécula es un polipéptido.

Propiamente, dicha molécula seleccionada es una molécula anormal asociada a una célula enferma o una molécula asociada a una molécula enferma en la que una cantidad anormalmente elevada de dicha molécula está presente en dicha célula enferma.

En "polipéptido asociado a una célula enferma" se incluye cualquier polipéptido que se encuentre en forma anormal en la célula enferma o que se encuentre en concentraciones anormalmente elevadas en las células enfermas. Desde luego, es más conveniente que dichos polipéptidos seleccionados, y más particularmente las partes de éstos presentadas por las moléculas HLA de clase I (o equivalente) en las células estimulantes, son equivalentes sintéticos de los péptidos producidos por el tratamiento de las proteínas celulares (que pueden ser intracelulares, expresadas en superficie, segregadas, etcétera), y la presentación asociada a HLA en la célula. Se conocen los procedimientos, particularmente los procedimientos informáticos que utilizan motivos del péptido, para seleccionar una secuencia de péptidos procedente de un polipéptido mayor, en los que dicha secuencia de polipéptido es una buena candidata para unirse a un determinado tipo de molécula HLA de clase I (o equivalente). En particular, es preferible que dichas moléculas seleccionadas se sinteticen in vitro. Se prefiere particularmente que parte de la molécula seleccionada sea un péptido y éste se prepara por procedimientos estándar de síntesis de péptidos. Los péptidos se pueden sintetizar por el modo de poliamida-Fmoc de síntesis de péptidos en fase sólida descrito por Lu et al. (1981) J. Org. Chem. 46, 3433 y las referencias en la presente memoria. La protección temporal del grupo amino la proporciona el grupo q-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc). La escisión repetida de este grupo protector lábil muy básico se efectúa utilizando piperidina al 20% en N, N-dimetilformamida. Los grupos funcionales de la cadena lateral se pueden proteger en forma de sus éteres butílicos (en el caso de serina, treonina y tirosina), ésteres butílicos (en el caso del ácido glutámico y del ácido aspártico), derivado de butoxicarbonilo (en el caso de lisina e histidina), derivado de tritilo (en el caso de la cisteína) y derivado de 4-metoxi-2,3,6-trimetilbencenosulfonilo (en el caso de la arginina). Cuando la glutamina o la asparagina sean restos C-terminales, se emplea el grupo 4, 4'-dimetoxibenzhidrilo para la protección de los grupos funcionales amido de la cadena lateral. Este soporte en fase sólida se basa en un polímero de polidimetil-acrilamida constituido por tres monómeros de dimetilacrilamida (monómero del eje central), bisacriloetilendiamina (reticulador) y éster metílico de acriloilsarcosina (agente para grupos funcionales). El agente reticulado escindible péptido a resina utilizado es un derivado lábil del ácido 4-hidroximetil-fenoxiacético. Todos los derivados de aminoácidos se añaden en forma de sus derivados del anhídrido simétrico preformado con la excepción de asparagina y glutamina que se añaden utilizando un procedimiento de acoplamiento inverso mediado por N,N-diciclohexil-carbodiimida/1-hidroxibenzotriazol. Todas las reacciones de acoplamiento y desprotección se controlan utilizando procedimientos de prueba con ninhidrina, trinitrobenceno, ácido sulfónico o isotina. Al terminar la síntesis, se escinden los péptidos del soporte de resina con la eliminación correspondiente de los grupos protectores de la cadena lateral mediante tratamiento con ácido trifluoroacético al 95% que contiene un 50% de mezcla secuestrante. Los secuestrantes utilizados habitualmente son etanoditiol, fenol, anisol y agua, dependiendo la elección exacta de los aminoácidos constituyentes del péptido que se sintetice. El ácido trifluoroacético se elimina por evaporación al vacío, con disgregación posterior en éter dietílico que proporciona el péptido en bruto. Cualquiera de los secuestrantes presentes se eliminan por un sencillo procedimiento de extracción que, en la liofilización de la fase acuosa, da el péptido en bruto exento de secuestrantes. Los reactivos para la síntesis del péptido están disponibles generalmente en Calbiochem-Novabiochem (G.B.) Ltd., Nottingham NG7 2QJ, G.B. La purificación se puede efectuar por cualquiera, o una combinación de, las técnicas tales como cromatografía por exclusión de tamaño, cromatografía de intercambio iónico y (principalmente) cromatografía líquida de alto rendimiento en fase inversa. El análisis de los péptidos se puede realizar utilizando cromatografía en capa fina, cromatografía líquida de alto rendimiento en fase inversa, análisis de aminoácidos después de la hidrólisis ácida y por análisis espectrométrico de masas con bombardeo rápido del átomo (FAB) o por espectrometría de masas MALDI (ionización por desorción con láser asistido en la matriz) o espectrometría de masas por electroatomización.

En la práctica, dicho polipéptido es un polipéptido mutante asociado a una célula enferma o a un polipéptido presente en una concentración mayor en dicha célula enferma en comparación con una célula no enferma.

Preferentemente dicha célula enferma es cualquier célula cancerosa, célula infectada por virus, célula infectada por bacterias y célula que expresa una cantidad anomalmente elevada de una hormona con polipéptidos.

Más preferentemente el individuo sano es el hombre. Los CTL aumentan frente a los péptidos presentados por moléculas HLA alógenas no isógenas de clase I (o equivalente).

Es preferible que los polipéptidos sean cualquiera de los siguientes:

i): proteínas celulares normales que se expresan en tumores en concentraciones anormalmente altas; p. ej.: ciclina D1 en una variedad de tumores; ciclina E en cáncer de mama; mdm 2 en una variedad de tumores; EGF-R, erb-B2, erb-B3, FGF-R, receptor del factor de crecimiento de tipo insulina, Met, myc, p53 y BCL-2 se expresan todas en varios tumores.

ii): proteínas celulares normales que se mutan en los tumores; p. ej.: mutaciones de Ras en varios tumores; mutaciones de p53 en varios tumores; transposición de BCR/ABL en CML y ALL; mutaciones del receptor de CSF-1 en AML y MDS; mutaciones de APC en el cáncer del colon; mutaciones de RET en MEN2A, 2B y FMTC; mutaciones de EGFR en gliomas; transposición de PML/RARA en PML; transposición de E2A-PBX1 en preleucemias B y en leucemias agudas de la infancia.

iii): proteínas codificadas víricamente en tumores asociados a la infección vírica; p. ej.: proteínas del virus del papiloma humano en el cáncer cervical; proteínas del virus de Epstein-Barr en linfomas de linfocitos B y linfoma de Hodgkin; proteínas de HTLV-1 en leucemia de linfocitos T en adultos; proteínas de virus de hepatitis B y C en el carcinoma hepatocelular; proteínas de virus de tipo herpes en el sarcoma de Kaposi.

iv): proteínas codificadas por VIH en pacientes infectados por el VIH.

Se incluyen tres subtipos en la categoria (i):

a): proteínas celulares normales que son sobreexpresadas;

Ejemplos de b) y c) son:

b): los antígenos con diferenciación específica del tejido, como objetivos para CTL reactivos para el tumor tales como GATA-1, IKAROS, SCL (expresados en el linaje hematopoyético y en leucemias); y las zonas constantes en inmunoglobulina (para el tratamiento del mieloma múltiple); y

c): el antígeno 1 del tumor de Wilms (WT1) para el tratamiento de leucemias y del tumor de Wilms y los antígenos carcinoembrionarios (una proteína fetal CEA) para tumores de hígado e intestinales.

En una forma de realización particularmente preferida el procedimiento conduce al aislamiento de clones de CTL que reconocen péptidos presentados por moléculas HLA de clase I de pacientes de cáncer o de pacientes con VIH. Los CTL se aislan de individuos sanos, con HLA desiguales. El individuo sano no lleva el tipo de molécula HLA de clase I (o equivalente) que, en la célula estimulante, presenta por lo menos una parte de la molécula seleccionada. Ésta asegurará que el repertorio de CTL del paciente sano que responde al tratamiento no será tolerante para la parte de la molécula seleccionada presentada por la molécula HLA del paciente. Esto es debido al hecho de que la tolerancia de los linfocitos T está limitada por la auto-HLA. Esto significa que los CTL del individuo sano que responde al tratamiento serán tolerante únicamente para los fragmentos de péptido presentados por sus propios/as moléculas HLA, pero no para los fragmentos de péptido presentados por las moléculas HLA desiguales de un paciente. De este modo, los CTL que se preparan utilizando este aspecto de la invención están alo-restringidos y son alógenos con respecto al paciente. Una vez aislados, los CTL se pueden utilizar en inmunoterapia adoptiva de todos los pacientes que expresen moléculas HLA de clase I apropiadas, tal como se describe en el primer aspecto de la invención. En la práctica, el procedimiento de este segundo aspecto de la invención se utiliza para generar un banco o biblioteca de clones de CTL que reconocen los péptidos procedentes de tumores asociados a proteínas o proteínas de VIH presentadas por moléculas HLA diferentes de clase I. Este banco de clones de CTL está disponible para pacientes que expresen moléculas HLA apropiadas de clase I. De este modo, la inmunoterapia adoptiva no dependerá ya de la producción elaborada de los clones autólogos de CTL para cada paciente, pero se conseguirá con los clones de CTL heterólogos "hechos a medida".

El procedimiento de este aspecto de la invención es apto particularmente para la producción de CTL frente a autoproteínas que se expresan en concentraciones anomalmente altas en tumores o frente a autoproteínas que se expresan en tumores y en un número limitado de células normales (antígenos de diferenciación específica del tejido) o frente a antígenos embrionarios cuya expresión se activa en las células tumorales. Es posible que los pacientes de cáncer sean frecuentemente tolerantes a los autopéptidos procedentes de estas proteínas y no puedan organizar respuestas a los CTL. Esto es diferente en individuos con HLA desiguales. Su repertorio de linfocitos T no debe ser tolerante para los autopéptidos presentados en el contexto de las moléculas de clase I expresadas por pacientes de cáncer con HLA desiguales. Por consiguiente, utilizando individuos sanos con HLA desiguales, será posible aislar CTL que reconozcan autopéptidos presentados por moléculas de clase I de pacientes de cáncer. Por definición, dichos CTL son específicos para la molécula, generalmente específicos para el péptido y limitados por las moléculas alógenas de clase I. Es de esperar que estos CTL lisen eficazmente las células tumorales que presentan estos péptidos, mientras que las células normales no presentan estos péptidos o los niveles de presentación son demasiado bajos para estimular la lisis de los CTL.

Además de los autopéptidos expresados anormalmente, los autopéptidos mutados procedentes de oncogenes mutados o los péptidos víricos procedentes de VIH también representan objetivos para la inmunoterapia adoptiva. Por lo tanto, en una forma de realización preferida adicionalmente, se generan CTL in vitro en individuos sanos. Estos CTL son específicos para los péptidos mutados o víricos presentados por moléculas HLA de clase I de pacientes con cáncer o infectados por VIH. Los pacientes y los donantes sanos son de HLA desiguales, en cuyo caso los CTL estarán alo-restringidos. Los CTL alo-restringidos pueden presentar ventajas en situaciones en las que la frecuencia del precursor y/o la avidez de los CTL auto-restringidos es baja.

El procedimiento de este aspecto de la invención es adecuado para generar clones de CTL alo-restringidos frente a péptidos seleccionados procedentes de proteínas asociadas al tumor o proteínas de VIH. Los CTL se generan adecuadamente in vitro cultivando conjuntamente PBMC procedente de individuos sanos con células estimulantes que presenten un péptido asociado al tumor o de VIH con una gran proporción de moléculas MHC de clase I. Esto facilita el aislamiento de los clones de CTL específicos para un complejo de péptido seleccionado más la molécula MHC de clase I expresada por las células estimulantes. Dichos clones de CTL pueden ser útiles en la inmunoterapia adoptiva de todos los pacientes que expresan el alelo de MHC de clase I frente al que han aumentado los CTL.

El concepto de aumento de CTL específico para el péptido, alo-restringido, se expone a continuación.

Aunque el modelo de densidad alta del ligando propone que los CTL alo-reactivos reconocen directamente moléculas MHC alógenas, no existe actualmente ninguna prueba experimental concluyente en su apoyo. En cambio, existen buenas pruebas de que los clones de CTL alo-reactivos reconocen los péptidos específicos presentados en el péptido que se une al surco de moléculas MHC (8, 9). Por consiguiente, estos clones de CTL son específicos para la molécula, generalmente específicos para el péptido y el reconocimiento está limitado por moléculas alógenas de clase I. No obstante, se desconoce generalmente la especificidad buena de las respuestas primarias de CTL producidas contra las moléculas MHC alógenas de clase I. Esto es porque numerosos péptidos procedentes de varias proteínas celulares están presentes en el péptido que se une al surco de las moléculas MHC de clase I. De este modo, las respuestas de los CTL primarios alo-restringidos son intrínsecamente poliespecíficas y dirigidas contra numerosos péptidos unidos a MHC de secuencia desconocida. Esto ha dificultado anteriormente producir CTL alo-restringidos con la especificidad para el péptido deseada. Además de esta dificultad técnica no ha sido investigada anteriorente con seriedad la posibilidad de producir previamente CTL alo-restringidos, específicos para el péptido porque viola un concepto inmunológico fundamental. La selección del repertorio de linfocitos T tiene lugar en el timo donde tienen lugar dos casos clave (10). Durante la selección negativa se eliminan del repertorio los linfocitos T que expresan a receptores de linfocitos T (TCR) que reconocen con gran afinidad moléculas MHC que presentan autopéptidos. En cambio, los TCR que reconocen complejos MHC/péptido con baja afinidad se seleccionan de forma positiva y se liberan en la periferia como linfocitos T maduros. Se cree que como consecuencia de la selección positiva los linfocitos T maduros son auto MHC-restringidos. De este modo, las células T maduras se cree que reconocen eficazmente los péptidos inmunógenos únicamente cuando son presentados por moléculas auto MHC, pero no cuando son presentadas por moléculas de MHC alógenas.

En la presente memoria, se propone emplear CTL alo-restringidos además de auto-restringidos de individuos sanos e inmunoteapia adoptiva. Los péptidos reconocidos por CTL pueden proceder de proteínas cuya expresión se activa en tumores, de proteínas que se sobreexpresan en tumores, de proteínas específicas para tejidos que se expresan en tumores, de proteínas mutadas o de proteínas víricas. En los experimentos descritos más adelante, se observa que es posible aislar CTL alo-restringidos, específicos para péptidos. Algunos clones de CTL alo- restringidos pueden reconocer concentraciones muy bajas de péptidos (concentraciones fentomolares) que indican que por lo menos son tan sensibles (quizás incluso más sensibles) como los CTL auto-restringidos que requieren típicamente concentraciones picomolares de péptidos para su reconocimiento. Se ha observado que estos CTL se pueden inyectar tres veces en huéspedes inmunocompetentes sin producir reacciones inmunológicas (p. ej.: anafilaxis o hipersensibilidad). Los clones de CTL alo-restringidos probablemente son más eficaces en el tratamiento a corto plazo de pacientes afectados inmunológicamente. Es improbable que estos CTL tengan efectos secundarios a corto plazo porque se eliminarán finalmente mediante una respuesta inmunitaria funcional del huésped.

Los CTL alo-restringidos pueden ser particularmente útiles en el tratamiento de la leucemia. Los pacientes de leucemia, en particular los pacientes de CML, se tratan frecuentemente por trasplante de médula ósea y existen pruebas sólidas de que el pronóstico de la enfermedad se mejora cuando el CTL del donante puede organizar una respuesta inmunitaria contra las células de leucemia del receptor. Es sabido que los CTL del donante en receptores de trasplante de médula ósea puede organizar una respuesta inmunitaria contra las moléculas MHC del receptor, que conducen al cuadro clínico de la enfermedad injerto-contra-huésped (GvH). En pacientes de leucemia un bajo nivel de GvH es clínicamente favorable, ya que se correlaciona con la supervivencia prolongada exenta de leucemia (5). Este efecto del trasplante frente a leucemia (GvL) se debe más probablemente a los CTL del donante que puedan reconocer y destruir las células leucémicas de los receptores (6, 7). Si los CTL alo-reactivos que median GvH y GvL son iguales o representan poblaciones de CTL distintas continúa el asunto controvertido. Esto es debido a que se desconoce generalmente la especificidad para el péptido de los CTL implicados en GvH y GvL.

El protocolo descrito aquí puede conducir al aislamiento de los clones de CTL que median GvL sin producir GvH. Se pueden generar CTL con especificidad para las leucemias frente a péptidos que se expresan en células leucémicas pero no en células fuera del linaje hematopoyético. Dichos clones de CTL se pueden utilizar para inmunoterapia adoptiva de pacientes de leucemia, donde eliminarán células leucémicas y quizás también algunas células normales procedentes de médula ósea. La posible pérdida de células normales de médula ósea no es de esperar que produzca problemas porque estos pacientes se tratan frecuentemente por trasplante de médula ósea de donantes sanos. Las proteínas siguientes son algunos de los objetivos para los clones de CTL de anti-leucemia: GATA-1, IKAROS, SCL, WT1. GATA-1 e IKAROS son proteínas de unión a ADN que contienen reticulantes de cinc expresadas únicamente en células hematopoyéticas. SCL es un factor de transcripción hélice-bucle-hélice expresado en células hematopoyéticas pero también en células endoteliales y en el cerebro. La proteína del tumor 1 de Wilms (WT1) es un antígeno de diferenciación embrionaria no expresado normalmente en los tejidos del adulto excepto para las leucemias agudas y crónicas.

Excepto para SCL, estas proteínas se expresan en células progenitoras de leucemia pero no en células fuera del linaje hematopoyético en adultos. Los péptidos procedentes de estas proteínas que son presentados por moléculas HLA de clase I se utilizan para aumentar los CTL de donantes que expresan alelos HLA desiguales de clase I (para salvar la tolerancia a CTL). Se aislan clones de CTL y se analiza su especificidad in vitro frente a célula leucémicas y referencia no leucémica. Se utilizan clones con especificidad adecuada para el tratamiento de todos los pacientes de leucemia que expresan el alelo de HLA de clase I que es el elemento de restricción de CTL.

Igualmente, se cree que los clones de CTL alo-restringidos son útiles para el tratamiento de pacientes con mieloma múltiple. Los objetivos adecuados para los CTL específicos para el mieloma múltiple incluyen las zonas constantes de la cadena pesada y ligera de inmunoglobulina. Los péptidos se seleccionan de entre las zonas constates de la cadena pesada y ligera que se unen a las moléculas HLA de clase I. Se aislan CTL frente a estos péptidos en donantes con HLA desiguales para salvar la tolerancia a CTL. Estos CTL alo-restringidos lisan las células de mieloma pero también los linfocitos B normales en pacientes tratados mediante inmunoterapia adoptiva. Los linfocitos B eliminados serán reemplazados por nuevos linfocitos B que se desarrollan en la médula ósea del paciente, mientras que la eliminación de las células de mieloma puede ser permanente.

Una forma de realización particularmente preferida es la generación de CTL alo-restringidos frente a epítopos conocidos en las proteínas de VIH y en proteínas asociadas al tumor. Un número de péptidos reconocidos por CTL se han identificado en varias proteínas de VIH y en proteínas asociadas al tumor. En particular, se han identificado epítopos de CTL en las proteínas env, gag, pol, vif y nef de VIH (12, 13). Además, se han identificado epítopos de CTL en las proteínas tirosinasa, mart1/melanA, gp100/pmel17, mage y bage (14 a 21) de melanoma asociado al tumor. La utilización de péptidos correspondiente a estos epítopos de CTL presenta la ventaja de que se sabe que se producen mediante tratamiento del antígeno natural. Los CTL producidos de este modo reconocen a las células objetivo que expresan a proteínas endógenamente relevantes. La explotación de conocidos epítopos de CTL representa una abreviación considerable porque evita el cribado de grandes números de péptidos de prueba y la identificación de péptidos producidos de forma natural. Sin embargo, conocidos péptidos pueden representar péptidos inmunodominantes. El procedimiento del segundo aspecto de la invención se puede utilizar para identificar nuevos péptidos, que pueden ser preferidos a medida que sean adecuados para ser péptidos subdominantes. Ya que los péptidos subdominantes es menos probable que sean inmunoseleccionados por las respuestas a los CTL del paciente, pueden representar mejores objetivos para la inmunoterapia adoptiva. No obstante, los péptidos que representan conocidos epítopos de CTL se pueden explotar teóricamente para generar CTL alo-restringidos in vitro y para probar sus efectos antivíricos y antitumorales in vivo.

El procedimiento del segundo aspecto de la invención permite el aislamiento de clones de CTL restringidos por HLA de clase I específicos para los péptidos producidos en las células tumorales y para los péptidos producidos en las células infectadas por VIH. En la práctica, se utilizan modelos de ratón SCID para determinar los efectos antitumorales y anti-VIH in vivo de estos CTL. Estos clones de CTL son útiles en inmunoterapia adoptiva, especialmente en el hombre.

Es preferible que el procedimiento del segundo aspecto de la invención comprenda además la determinación del tipo de molécula HLA de clase I (o equivalente) del individuo sano. En la práctica, esto se realiza mediante análisis de ADN como se expuso anteriormente.

Se prefiere particularmente que la célula estimulante tenga un tipo de molécula HLA de clase I (o equivalente) en su superficie cuyo tipo de molécula HLA de clase I (o equivalente) no esté presente en el individuo sano.

Se prefiere particularmente que dicha célula estimulante sea una célula que sea prácticamente incapaz de cargar por sí misma dicha molécula HLA de clase I (o equivalente) en una parte, por lo menos, de dicha molécula seleccionada. Como se describe con más detalle más adelante, la molécula HLA de clase I (o equivalente) se puede cargar fácilmente en una parte, por lo menos, de dicha molécula seleccionada in vitro.

En la práctica, dicha célula es una célula de mamífero con defectos en la expresión de un péptido transportador de modo que cuando, por lo menos parte de dichas moléculas seleccionadas sea un péptido, no esté cargada en dicha molécula HLA de clase I (o equivalente).

La célula de mamífero preferentemente carece, presenta un nivel reducido o presenta una función reducida del péptido transportador TAP. Las células adecuadas que carecen del péptido transportador TAP incluyen células T2, RMA-S y de Drosophila. TAP es el transportador asociado al tratamiento del antígeno.

Por lo tanto, en la práctica la célula es una célula de insecto tal como una célula de Drosophila.

La línea celular T2 humana con defectos en la carga del péptido está disponible en American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA con el nº de catálogo CRL 1992; la línea 2 de Schneider de línea celular de Drosophila está disponible en ATCC con el nº de catálogo CRL 19863; la línea celular RMA-S está descrita en Karre y Ljunggren (1985) J. Exp. Med. 162, 1745.

En una forma de realización preferida la célula estimulante es una célula huésped (tal como una célula T2, RMA-S o de Drosophila) tranfectada con una molécula de ácido nucleico capaz de expresar dicha molécula HLA de clase I (o equivalente). Aunque las células T2 y RMA-S hacen expresar antes la transfección de las moléculas HLA de clase I no están cargadas en un péptido.

Las células de mamífero se pueden transfectar por procedimientos bien conocidos en la técnica. Las células de Drosophila se pueden transfectar, tal como se describe en Jackson et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 12117.

En la práctica dicha célula huésped antes de la transfección no expresa prácticamente moléculas HLA de clase I (o equivalente).

Es preferible además que la célula estimulante exprese una molécula importante para la estimulación conjunta de linfocitos T tal como cualquiera entre B7.1, B7.2, ICAM-1 y LFA 3.

Las secuencias de ácido nucleico de numerosas moléculas HLA de clase I (o equivalente) y las moléculas del estimulante conjunto, están a disposición del público en el GenBank y en las bases de datos EMBL.

Se prefiere particularmente que prácticamente todas las moléculas HLA de clase I (o equivalente) expresadas en la superficie de dicha célula estimulante sean del mismo tipo.

Los HLA de clase I en sistemas equivalentes y sistemas equivalentes en otros animales son genéticamente muy complejos. Por ejemplo, existen por lo menos 110 alelos del locus de HLA-B y por lo menos 90 alelos del locus de HLA-A. Aunque cualquier molécula HLA de clase I (o equivalente) es útil en este aspecto de la invención, se prefiere que la célula estimulante presente por lo menos parte de la molécula seleccionada en una molécula HLA de clase I que tiene lugar a una frecuencia razonablemente alta en la población humana. Es bien sabido que la frecuencia de los alelos HLA de clase I varía entre diferentes grupos étnicos tales como el caucásico, africano, chino, etcétera. Por lo menos, por lo que concierne a la población caucásica es preferible que la molécula HLA de clase I esté codificada por un alelo de HLA-0201, por un alelo de HLA-A1, un alelo de HLA-A3 o un alelo de HLA-B7. El HLA-A0201 es particularmente preferido.

Cuando el procedimiento del segundo aspecto de la invención se utiliza para construir un banco de CTL es conveniente que los alelos de HLA que limitan el reconocimiento por los clones de CTL se seleccionen basándose en la frecuencia en un determinado grupo étnico.

Se debe reconocer que una célula estimulante que expresa moléculas HLA de clase I (o equivalente) en su superficie y que presenta, por lo menos, una parte de una molécula seleccionada en una gran proporción de dichas moléculas HLA de clase I (o equivalente) ocupadas presentes en la superficie de dicha célula estimulante, forma un aspecto adicional de la invención.

Preferentemente la molécula seleccionada es una molécula anormal o una molécula cuya cantidad es anormalmente elevada.

Se debe reconocer que, por lo menos, para las automoléculas anormalmente elevadas, y en particular para los autopolipéptidos expresados en grandes concentraciones, el procedimiento del segundo aspecto de la invención permite la producción de CTL de mucha mayor avidez y sensibilidad que se pueda producir de otra manera. Éste es particularmente el caso en el que la célula estimulante presenta un tipo de molécula HLA de clase I (o equivalente) en su superficie cuyo tipo de moléculas HLA de clase I (o equivalente) no está presente en el individuo sano.

Por lo tanto, el procedimiento del segundo aspecto de la invención se utiliza preferentemente para producir linfocitos T citotóxicos (CTL) de individuos sanos que se pueden utilizar en inmunoterapia adoptiva para pacientes de cáncer y pacientes infectados con el virus de la inmunodeficiencia humana. Los CTL se generan completamente in vitro y se pueden administrar por vía intravenosa. Como esta forma de inmunoterapia adoptiva no depende del sistema inmunitario funcional de huésped, se cree que es particularmente seguido por pacientes que están inmunodeprimidos, por ejemplo como consecuencia de la infección por VIH o por radioterapia y quimioterapia en el caso del cáncer. Preferentemente, todos los CTL específicos para el péptido se aislan de donantes sanos y no se requieren muestras de sangre de los pacientes.

La propiedad distintiva de los clones de CTL alo-restringidos descritos en la presente memoria consiste en que se pueden reconocer péptidos procedentes de proteínas celulares normales presentadas en la superficie celular por las moléculas MHC de clase I. Lo más importante, es que el genotipo de MHC y los clones de CTL alo-restringidos y las células objetivo reconocidas (u otras células) en el paciente son diferentes. La diferencia genética no se aplica únicamente a la zona de MHC del genoma, sino también a otros genes polimorfos. Por lo tanto, es posible que pudiera existir un polimorfismo en los segmentos del gen del locus de TCR\alpha y \beta del clon CTL y de la célula objetivo. Sin embargo, los genes de TCR en estas células pueden ser idénticos incluso si CTL y la célula objetivo son de diferente origen genético.

Los CTL de la invención anteriormente citados o una formulación de los mismos se puede administrar por cualquier procedimiento convencional incluyendo por inyección parenteral (p. ej.: subcutánea o intramuscular). El tratamiento puede consistir en una única dosis o varias dosis durante un periodo de tiempo.

Mientras que sea posible administrar solo el CTL de la invención, es preferible presentarlo como una formulación farmacéutica, junto con uno o más excipientes aceptables. El/los excipiente(s) debe(n) ser "aceptable(s)" en el sentido de que sea(n) compatible(s) con el compuesto de la invención y no pejudicial(es) para sus receptores. Típicamente, los excipientes deben ser agua o solución salina que será estéril y exenta de pirógenos.

Un tercer aspecto de la invención proporciona utilización definida en la reivindicación 36.

Un cuarto aspecto de la invención proporciona un banco de clones de CTL, comprendiendo dicho banco una diversidad de clones de CTL procedentes de individuos y cada uno de dichos clones de CTL está restringido por un alelo diferente de HLA de clase I y reconoce un polipéptido relacionado con una enfermedad seleccionada, en el que la enfermedad es cualquiera de entre cáncer, una enfermedad producida por un patógeno, una enfermedad asociada a glucosilación anormal de polipéptidos y una enfermedad asociada a cantidades anormalmente elevadas de una hormona.

El banco está almacenado en la práctica de una forma en la que cada clon de CTL conserva la viabilidad. En la práctica el banco se almacena congelado.

Preferentemente, el banco contiene una selección de los CTL que se han preparado por el segundo aspecto de la invención. El banco puede ser específico para una enfermedad, para una célula enferma o puede ser específico del tipo de molécula HLA de clase I (o equivalente). Las enfermedades preferidas o los tipos de moléculas HLA de clase I (o equivalente) se describieron anteriormente.

El banco contiene CTL, de forma ventajosa, para diferentes enfermedades y/o CTL para diferentes moléculas (p. ej.: péptidos) para la misma enfermedad y los clones de cada uno de los CTL están restringidos por diferentes alelos HLA de clase I. Para un solo paciente se selecciona un clon de CTL apropiado con relación a un péptido apropiado (es decir, cualquiera que se presente en sus células enfermas) y en relación con el alelo HLA de clase I de los CTL, de modo que los CTL llevan un alelo HLA de clase I diferente de los del paciente.

Un quinto aspecto de la invención proporciona un sistema terapeútico que comprende (a) medios para determinar la clase de HLA de clase I (o equivalente) de un paciente que se ha de tratar y (b) un banco de clones de CTL, comprendiendo dicho banco diversos clones de CTL procedentes de individuos con tipos de moléculas HLA diferentes de clase I (o equivalente) y cada clon de CTL reconoce un polipéptido asociado a una enfermedad seleccionada.

El medicamento para su utilización en el tratamiento de un paciente según el primer aspecto de la invención hace uso de CTL alógenos que se siguen, particularmente para su utilización en inmunoterapia adoptiva cuando el antígeno reconocido es un autoantígeno.

Sin embargo, debido a su naturaleza alógena, es de esperar que los receptores (pacientes) organicen respuestas inmunitarias contra los CTL tranferidos en algunas circunstancias, que pueden limitar su vida media y su actividad antitumoral en el huésped receptor (paciente). Sin embargo, la inmunosupresión del receptor (paciente) es una manera de disminuir dichas respuestas inmunitarias del huésped y es útil el procedimiento del primer aspecto de la invención.

La otra posibilidad descrita en la presente memoria es utilizar CTL autólogos que sean no-immunógenos cuando se vuelven a transferir en el huésped original. Estos CTL autólogos se manipulan in vitro para expresar los TCR aislados de clones de CTL alo-restringidos.

Un sexto aspecto de la invención proporciona un procedimiento para preparar un linfocito T citotóxico (CTL) adecuado para tratar a un paciente, procedimiento que comprende (a) preparar una población clonal de CTL por el procedimiento del segundo aspecto de la invención; (b) preparar una construcción genética capaz de expresar el receptor del linfocito T (TCR) de dicha población clónica de CTL o una molécula con funcionalidad equivalente; y (c) introducir dicha construcción genética en un CTL o su precursor, cuyo CTL o precursor procede de dicho paciente.

Todas las formas de realización preferidas del segundo aspecto de la invención se prefieren en este aspecto de la invención al preparar una población clónica de CTL en la etapa (a) de este procedimiento. En particular, los CTL aislados en la etapa (a) se aislan de individuos sanos, con HLA desiguales (comparados con el paciente que se ha de tratar). De este modo, los CTL aislados en la etapa (a) son alo-restringidos y son alógenos con respecto al paciente que se ha de tratar.

La alogenicidad es la situación de dos o más formas alelas diferentes de la misma proteína en diferentes individuos de la misma especie.

Una "molécula funcionalmente equivalente a un receptor de linfocito T" significa cualquier molécula que pueda realizar la misma función que un receptor de linfocitos T. En particular, dicha molécula incluye receptores de linfocitos T de una cadena y tres dominios modificados genéticamente tal como se preparan por el procedimiento descrito por Chung et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 12654-12658.

Por "construcción genética capaz de expresar el receptor de linfocitos T o una molécula funcionalmente equivalente" se incluye cualquier construcción genética, bien ARN o ADN, que al insertarse en el CTL procedente del pacientes o un precursor de dicha célula, puede expresar el receptor de linfocitos T o una molécula funcionalmente equivalente. Se puede utilizar cualquier vector adecuado tal como un plásmido o virus, incluyendo retrovirus.

La construcción genética se puede preparar utilizando procedimientos bien conocidos en la técnica tales como los descritos en Sambrook et al. (1989) "Molecular cloning, a laboratory manual", 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York.

El ADN que codifica los TCR o la molécula funcionalmente equivalente se puede unir a una amplia variedad de otras secuencias de ADN para la introducción en un huésped apropiado (que puede ser el CTL procedente del paciente o su precursor o de otra célula húesped). El ADN compañero dependerá de la naturaleza del huésped, la manera de la introducción del ADN en el huésped y de si se desea mantenimiento episómico o integración.

Generalmente, el ADN se inserta en un vector de expresión, tal como un plásmido, virus o retrovirus, en orientación apropiada y marco de lectura correcto para la expresión. Si es necesario, el ADN se puede unir a las secuencias de nucleótido de referencia reguladoras de la transcripción y de la traducción apropiadas reconocidas por el huésped deseado, aunque tales referencias están generalmente disponibles en el vector de expresión. Se introduce a continuación el vector en el huésped mediante técnicas conocidas. Generalmente, no todos los huéspedes serán transformados por el vector. Por lo tanto, será necesario seleccionar para las células húesped tranformadas. Una selección técnica implica incorporar una secuencia de ADN en el vector de expresión, con cualquiera de los elementos de referencia necesarios, que codifica un rasgo deseable en la célula transformada, tal como resistencia a los antibióticos. Como alternativa, el gen para tal rasgo seleccionable puede estar en otro vector, que se utiliza para transformar conjuntamente la célula húesped deseada. Sin embargo, en el caso de introducir la construcción en los CTL del paciente o su precursor, es preferible que, por lo menos, el 50% de los CTL se transformen o transfecten en la construcción genética. Más preferentemente, por lo menos, el 70% se transforman o transfectan de este modo y todavía más preferentemente, por lo menos el 90% o por lo menos el 95%.

Se ha desarrollado una variedad de procedimientos para unir operativamente ADN a vectores mediante términos coherentes complementarios. Por ejemplo, se pueden añadir rasgos de homopolímero complementarios al segmento de ADN que se ha de insertar al ADN del vector. El vector y el segmento de ADN se unen a continuación mediante enlaces de hidrógeno entre las colas homopolímericas complementarias para formar moléculas de ADN recombinante.

Reticulantes sintéticos que contienen una o más zonas de restricción proporcionan un procedimiento alternativo de unión del segmento de ADN a los vectores. El segmento de ADN, generado por digestión con restricción de endonucleasa como se describió al principio, se trata con bacteriófago T4 ADN polimerasa o ADN polimerasa I de E. coli, enzimas que eliminan el término con una sola cadena en 3', saliente con sus actividades 3'-5'-exonucleolíticas y sustitución en los extremos 3' acoplados con sus actividades polimerizantes.

La combinación de estas actividades genera por lo tanto segmentos de ADN romos. Los segmentos romos se incuban a continuación con un gran exceso molar de moléculas de reticulante en presencia de un enzima que es capaz de catalizar la unión de las moléculas de ADN romas, tal como la bacteriófago T4 ADN ligasa. De este modo, los productos de la reacción son segmentos de ADN que llevan secuencias de reticulante polimérico en sus extremos. Estos segmentos de ADN se escinden a continuación con la enzima de restricción adecuada y se unen a un vector de expresión que se ha escidido con una enzima que produce términos compatibles con los del segmento de ADN.

Los reticulantes sintéticos que contienen una variedad de zonas de endonucleasa de restricción están disponibles en el comercio en numerosos proveedores incluyendo International Biotechnologies Inc, New Haven, CN, USA.

Una forma deseable de modificar el ADN es utilizar la reacción en cadena de polimerasa como expuso Saiki et al (1988) Science 239, 487-491.

En este procedimiento el ADN que se ha de amplificar enzimáticamente está flanqueado por dos cebadores de oligonucleótidos específicos que ellos mismos llegan a incorporar en el ADN amplificado. Dichos cebadores específicos pueden contener zonas de reconocimiento de endonucleasa de restricción que se pueden utilizar para la clonación en los vectores de expresion que utilizan procedimientos conocidos en la técnica.

Se describe ahora un procedimiento particularmente preferido.

Se clonan los TCR de clones de CTL alo-restringidos específicos para autopéptidos presentados en concentraciones elevadas en tumores. Se determina la utilización de TCR en clones de CTL alo-restrigidos utilizando (i) anticuerpos monoclonales específicos para la zona variable de TCR y (ii) la RT-PCR con cebadores específicos para las familias de los genes V\alpha y V\beta. Se prepara un banco de ADNc a partir de ARNm de poli-A extraido de clones de CTL alo-restringidos. Se utilizan cebadores específicos para la parte C-terminal de las cadenas \alpha y \beta de TCR y para la parte N-terminal de los segmentos V\alpha y \beta identificados. El ADNc completo para las cadenas \alpha y \beta de TCR está amplificado con una ADN polimerasa de alta fidelidad y los productos clonados se amplifican en un vector de clonación adecuado. Los genes clonados de las cadenas \alpha y \beta se montan en un TCR de una sola cadena por el procedimiento descrito por Chung et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 12654-12658. En esta construcción de una sola cadena el segmento V\alphaJ está seguido por el segmeto V\betaDJ, seguido por el segmento C\beta, seguido por la transmembrana y el segmento citoplasmático de la cadena CD3 3. Este TCR de una sola cadena se inserta a continuación en un vector retrovírico de expresión (se puede utilizar un panel de vectores) basándose en su capacidad para infectar linfocitos T CD8^{+} humanos, maduros y para mediar la expresión génica: el sistema Kat del vector retrovírico es una posibilidad preferida (véase Finer et al. (1994) Blood 83, 43). Se utilizan retrovirus anfótropos con valoración elevada para infectar linfocitos T CD8^{+} purificados aislados de la sangre periférica de pacientes con tumor, siguiendo un protocolo publicado por Roberts et al. (1994) Blood 84, 2878-2889, incorporado como referencia en la presente memoria. Se utilizan anticuerpos anti-CD3 para desencadenar la proliferación de linfocitos T CD8^{+} purificados, que facilitan la integración retrovírica y la expresión estable de los TCR de una sola cadena. La eficacia de la transducción retrovírica se determina por tinción de los linfocitos T CD8^{+} infectados para los anticuerpos específicos para los TCR de una sola cadena. El análisis in vitro de los linfocitos T CD8^{+} transducidos establece que presentan la misma destrucción específica del tumor que la observada en los clones de CTL alo-restringidos para los que se clonaron originalmente las cadenas de TCR. Se utilizarán poblaciones de linfocitos T CD8^{+} transducidos con la esperada especificidad para la inmunoterapia adoptiva de los pacientes con tumor. Los pacientes serán tratados con entre 10^{8} y 10^{11} (más probablemente 10^{9} a 10^{10}) CTL tranducidos, autólogos.

Otros sistemas adecuados para introducir genes en CTL se describen en Moritz et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4318-4322, Eshhar et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 720-724 y Hwu et al. (1993) J. Exp. Med. 178, 361-366 también describen la transfección de CTL.

El séptimo aspecto de la invención proporciona un linfocito T citotóxico adecuado para tratar pacientes, que se puede obtener por el sexto aspecto de la invención.

El octavo aspecto de la invención proporciona la utilización de linfocitos T citotóxicos para la preparación de un medicamento para tratar a un paciente con una enfermedad en la que el paciente es portador de células enfermas cuyas células contienen o están asociadas a, un polipéptido anormal o a una cantidad anormalmente elevada de un polipéptido y son capaces de presentar, por lo menos, parte de dicho polipéptido en su superficie mediante una molécula HLA de clase I (o equivalente), en la que los linfocitos T citotóxicos reconocen, por lo menos, parte de dicha molécula, cuando son presentados por una molécula HLA de clase I (o equivalente) en la superficie de una célula y en la que CTL es un CTL según el séptimo aspecto de la invención, en la que la enfermedad es cualquiera de entre cáncer, una enfermedad producida por un patógeno, una enfermedad asociada a glucosilación anormal de polipéptidos y una enfermedad asociada a cantidades anormalmente elevadas de una hormona.

La vía de administración preferida, las enfermedades preferidas y las cantidades preferidas de CTL administradas para tratar son las mismas para el octavo aspecto de la invención que para el primer aspecto de la invención.

Se ha de reconocer que se puede preparar una construcción genética y un banco de construcciones genéticas, cada una capaz de expresar un TCR específico, o una molécula funcionalmente equivalente, preparando poblaciones clónicas de CTL por el procedimiento del segundo aspecto de la invención y preparando una construcción genética capaz de expresar el receptor del linfocito T de dicha población clónica de CTL o una molécula con funcionalidad equivalente como se describió anteriormente.

Es particularmente conveniente que cada construcción genética represente un TCR (por medio de un TCR o una molécula funcionalmente equivalente) que corresponde al TCR de un CTL determinado de un individuo sano de un genotipo conocido de HLA y cuyo CTL se produjo mediante cultivo conjunto con una célula estimulante que expresa una molécula HLA de clase I (o equivalente) en su superficie, cuya molécula HLA de clase I (o equivalente) se une en su superficie, por lo menos, a una parte de una molécula dada.

De este modo es posible generar bancos de construcciones genéticas cuyas construcciones se pueden introducir en un CTL o precursor del paciente y cuya construcción genética capaz de expresar un TCR o una molécula funcionalmente equivalente se puede seleccionar basándose en el genotipo de HLA del paciente y en la enfermedad que se ha de tratar. La construcción genética particular que representa un TCR se selecciona basándose en la especificidad del clon del linfocito T (es decir, según lo que expresan las células de la enfermedad del paciente, especialmente una célula tumoral).

Preferentemente, el genotipo de HLA del paciente y el genotipo de HLA del CTL, del que procede el TCR o la molécula funcionalmente equivalente, expresada por la construcción genética, son desiguales.

En general, es fácil definir un TCR como alo-restringido mientras se expresa en el clon CTL original. Sin embargo, una vez se aislan los genes de TCR y se transfieren a los CTL de los pacientes, llega a ser muy dificil definirlos como alo-restringidos. Una comparación de la secuencia entre la secuencia del TCR transferido y de los genes TCR endógenos puede identificarlos como genes no auto-TCR en aquellos casos en los que existe un polimorfismo en los genes de TCR. Los que no son auto-TCR, sin embargo, no proceden necesariamente de clones de CTL alo-restringidos.

La invención se describirá a continuación con más detalle en relación con los siguiente ejemplos y figuras, en las que:

La figura 1 presenta los resultados de un experimento en el que se inyectaron únicamente 5x10^{5} células tumorales RMA a ratones o con células tumorales y 5x10^{5} CTL. Se midió el volumen del tumor cada día. Después de 11 días se sacrificaron los ratones que recibieron únicamente células tumorales debido a la ulceración del tumor o debido a la gran masa tumoral. Ninguno de los ratones que recibió CTL presentó tumores detectables el día 11.

La figura 2 presenta los resultados de un experimento en el que se inyectaron 5x10^{5} células RMA a ratones el día -7 (menos siete) tratados con 10^{7} CTL anti-mdm100 i.v. Se midió el volumen del tumor el día 0 y cada día posterior. Se presenta el aumento relativo de volumen del tumor. Se sacrificaron los ratones cuando los tumores ulceraron o alcanzaron más de 3 cm^{3} en volumen.

La figura 3 presenta la caracterización de clones de CTL alo-restringidos específicos para el péptido mdm100.

(A) Reconocimiento de células T2-K^{b} recubiertas de péptidos por 6 clones CTL específicos para el péptido mdm100. En total se analizaron 33 clones CTL y las curvas de valoración del péptido para 16 fueron similares a las de los clones 3F3F, 1F1H y 3F10A, mientras que 17 clones presentaron curvas de valoración similares a las de los clones 3B11C, 6A6G y 6A6D. (B) y (C) presentan lisis de células RMA (diamantes blancos) y células RMA-S recubiertas con péptidos mdm100 (círculos negros) o con péptidos de referencia que se unen a la clase I (círculos blancos) mediante un clon 6A6G de CTL con "avidez" representativa baja (B) o mediante un clon 3F3F con "avidez" representativa alta (C). (D) Lisis de células dendríticas recubiertas con péptidos mdm100 (cuadrados negros) o con péptidos de referencia que se unen a la clase I (cuadrados blancos) mediante el clon 3F11A de alta avidez.

La figura 4 presenta el reconocimiento de las células B16 de melanoma mediante CTL de alta "avidez" específicos para mdm100.

Se analizó un clon representativo (1F7E) de CTL de gran avidez en un análisis de 4 horas con liberación de ^{51}Cr frente a la variante (A) no metastásica del melanoma B16-F1 y frente a las células B16-FF1 y B16-F10 con variante metastásica se recubrieron con péptidos mdm100 (símbolos blancos) o con péptidos de referencia que se unen a MHC de clase I (símbolos negros). Los experimentos de tinción dieron a conocer que las células B16-F1 fueron negativas para H-2K^{b} y que las células B16-F10 expresaron H-2K^{b} en concentraciones bajas (no mostrado).

La figura 5 presenta el reconocimiento por CTL de péptidos producidos en la naturaleza extraidos de células RMA de linfoma.

(A) Perfil de elución de HPLC de 1 \mug del péptido sintético mdm100. (B) Perfil de reconocimiento por CTL de las fracciones de HPLC que contienen péptidos producidos por la naturaleza extraídos de células RMA. Los péptidos se prepararon a partir de células RMA de linfoma tal como se describe en Materiales y procedimientos del Ejemplo 1 y se separaron por HPLC utilizando las mismas condiciones que en (A).

La figura 6 presenta el control del crecimiento del tumor por el CTL específico para mdm100, de gran avidez. (A) Se inyectaron ocho ratones C57BL/10 por vía subcutánea con 10^{5} células RMA de linfoma (cuadrados blancos) o con 10^{5} células de linfoma junto con 10^{6} CTL (círculos blancos). (B) Se inyectaron ocho ratones C57BL/10 igualmente con 5x10^{5} células RMA de linfoma (cuadrados blancos) o con 5x10^{5} células de linfoma junto con 5x10^{5} CTL (círculos blancos). (C) Se inyectaron diez ratones C57BL/6 con 10^{5} células B16-F10 de melanoma (cuadrados blancos) o con 10^{5} células B16-F10 junto con 10^{6} CTL (círculos blancos). Se obtuvieron resultados similares cuando se utilizaron para estos experimentos clones individuales de CTL de gran avidez o una mezcla de clones. Se controlaron los ratones diariamente y se presenta el crecimiento del tumor para cada ratón individual. Las cruces indican que el ratón murió o que fue sacrificado debido a su gran masa tumoral.

La Figura 7(A) presenta la lisis por un clon de CTL específico para un péptido de ciclina D1 (101-110) que se une a HLA-A0201. El clon de CTL se obtuvo a partir de PBMC negativo para HLA-A2. La Figura 7(B) presenta la lisis por un clon de CTL específico para un péptido de ciclina D1 (228-234) que se une a HLA-A0201. El clon de CTL se obtuvo a partir de PBMC negativo para HLA-A2.

Ejemplo 1 Inmunoterapia adoptiva utilizando CTL en ratones Sumario

En un sistema de modelo murino se han generado clones de CTL alo-restringidos contra péptidos procedentes de la autoproteína normal mdm 2 que se sobreexpresa frecuentemente en tumores. Los CTL destruyen las células tumorales in vitro, mientras que las células normales no son reconocidas. Cuando se transfieren adoptivamente en ratones, estos CTL presentan efectos antitumorales in vivo.

Las dos cepas de ratones C57BL/10 (H-2^{b}) y BALB/c (H-2^{d}) son MHC desiguales y por lo tanto expresan moléculas de clase I distintas. Se seleccionó este MHC desigual porque simula el HLA desigual observado en la situación humana, es decir, la diferencia entre un paciente de cáncer y un donante sano de linfocitos T. Se utilizaron estas dos cepas de ratón para probar si se pueden detectar los CTL alo-restringidos contra la proteína mdm 2 murina. La proteína mdm 2 se puede asociar con p53 y regular su actividad biológica. Se sobreexpresa frecuentemente en los cánceres humanos y por consiguiente representa un posible objetivo para la inmunoterapia adoptiva.

En el sistema de modelo murino descrito anteriormente, se exploraron las siguientes preguntas:

(i): ¿Es posible aislar CTL restringidos de H-2K^{b}, específicos para el péptido mdm 2 de ratones BALB/c (haplotipo H-2^{d})?

(ii): ¿Pueden reconocer células tumorales que expresen moléculas K^{b} de clase I los CTL alo-restringidos, específicos para el péptido procedentes de BALB/c?

(iii): ¿Pueden ser utilizados los CTL alo-restringidos, específicos para el péptido procedentes de BALB/c en inmunoterapia tumoral adoptiva en ratones C57BL/10 (haplotipo H-2^{d})?

Se han obtenido los siguientes resultados:

(i): Se aislaron CTL que son específicos para un péptido de mdm 2 presentados por la molécula alógena H-2K^{b} de clase I.

(ii): Se probaron los clones de CTL y se demostró que destruyen las células de timoma RMA de origen H-2^{b}. Las células RMA son muy tumorígenas en ratones C57BL/10 (H-2^{b}) que permitieron probar si los CTL procedentes de BALB/c pueden tener efectos antitumorales en huéspedes de C57BL/10.

(iii): En un experimento se inyectaron por vía s.c 5x10^{5} células RMA a 8 ratones. 4 de estos ratones se inyectaron también con 5x10^{5} CTL. Después de 11 días, los 4 ratones a los que se había inyectado solo células RMA, presentaban grandes tumores y por consiguiente fueron sacrificados, mientras que los 4 ratones que habían recibido RMA y CTL estaban exentos de tumores (fig. 1). En otro experimento, se inyectaron por vía s.c. 5x10^{5} células tumorales a 8 ratones. Después de 7 días, cuando todos los ratones habían desarrollado tumores en la zona de infección, se trataton por vía i.v. 2 de ellos con 10^{7} CTL procedentes de BALB/c. En los ratones sin tratar el volumen de tumor aumentó rápidamente, mientras que en los que recibieron CTL el crecimiento del tumor se retrasó (fig. 2).

Estos resultados demuestran que este planteamiento de la inmunoterapia adoptiva utilizando linfocitos T citotóxicos es eficaz.

A continuación se proporcionan detalles adicionales:

Procedimientos Animales

Los ratones C57BL/6 (H-2^{b}) y ratones BALB/c (H-d^{d}) fueron suministrados por la colonia de cría de la Royal Postgraduate Medical School, Hammersmith Hospital, Londres, aunque este tipo de ratones está disponible fácilmente en varios proveedores comerciales. Los ratones se utilizaron con una edad de 8 a 10 semanas.

Péptidos

El péptido mdm100 corresponde a los aminoácidos 100 a 107 (YAMIYRNL; (SEQ ID nº 1) de la proteína mdm-2 murina. Se ha demostrado que este péptido se une eficazmente a moléculas H-2K^{b} de clase I. Otros péptidos procedentes de mdm-2 o ciclina-D1 que se observó que se unen a moléculas H-2K^{b} o D^{b} de clase I sirvieron como referencias. Todos los péptidos utilizados en este estudio fueron sintetizados por el laboratorio central de síntesis de péptidos de la Imperial Cancer Research Fund, Londres, utilizando la química de fmoc. Se evaluó la calidad de estos péptidos por análisis de HPLC y se observó el peso molecular utilizando espectrometría de masas MALDI. Se disolvieron los péptidos en solución salina tamponada con fosfato (pH 7,4) para dar una concentración de 2 mM y se almacenaron a -20ºC.

Líneas celulares

Células RMA (H-2^{b}) originadas a partir de un linfoma de linfocitos T de C57BL/6N producidas por virus Rauscher. Las células RMA-S procedían de células RMA después de la mutagénesis con etil-metano-sulfonato seguida de cinco rondas de selección con antisuero anti-H-2 y tratamiento de complemento de conejo para obtener células con niveles de expresión disminuidos de MHC de clase I (Ljunggren y Kärre (1985) J. Exp. Med. 162, 1745-1759). Se observó que las células RMA-S presentan una mutación puntual en el nucleótido 97 del gen TAP2, que genera un codon de terminación prematuro (Yang et al. (1992) J. Immunol. 267, 11669-11672). B16-F1 y B16-F10 son variantes de la línea celular B16 del melanoma procedente de C57BL/6, con bajo y alto potencial metastásico, respectivamente (Fidler y Nicolson (1976) J. Natl. Cancer Inst. 57, 1199-1202). La línea celular T2 humana es un híbrido de fusión de una línea celular B-linfoblastoide y de una célula T-linfoblastoide. Estas células no tienen genes transportadores de TAP y expresan concentraciones reducidas de HLA-A2 y ningún HLA-B5 endógeno detectable (Alexander et al (1989) Immunogenetics 29, 380-388). Las células T2 transfectadas con H-2k^{b} expresaron moléculas K^{b} de clase I en concentraciones que eran similares a las concentraciones de HLA-A2. Las célulasT2-K^{b} fueron una donación del Dr T. Elliott (John Radcliffe Hospital, Oxford).

Producción de CTL

Se generaron CTL alo-restringidos por estimulación in vitro de esplenocitos naturales de BALB/c con RMA-S recubiertos de péptidos y células estimulantes T2-K^{b}. Se estimularon 4x10^{6} esplenocitos de BALB/c en placas de 24 pocillos con 4x10^{5} células RMA-S recubiertas con péptido mdm100 en medio RPMI completo que contiene FCS al 10% y péptido 50 nM. Después de 5 días, se sembraron CTL en placas de 96 pocillos en 10, 100 y 1000 CTL de pacientes que respondieron al tratamiento por pocillo. Cada pocillo contenía 3x10^{5} esplenocitos de BALB/c irradiados como nutrientes y 10^{4} células estimulantes T2-K^{b} irradiadas que fueron pulsadas previamente con péptidos mdm100. El cultivo medio fue el mismo que anteriormente, excepto que se añadió IL-2 recombinante en una concentración de 10 U/ml. Después de 14 días se añadió medio reciente conteniendo nutrientes y células estimulantes y después de 5 días más se analizó cada uno de los 96 pocillos por un análisis de CTL frente a células objetivo recubiertas con mdm100 y objetivos de referencia. Los microcultivos que presentaron destrucción específica por mdm100 se extendieron y se utilizaron para limitar la clonación por dilución en placas de 96 pocillos utilizando 0,1, 1 y 10 CTL por pocillo, 10^{5} esplenocitos de BALB/c como nutrientes y 10^{4} células T2-K^{b} estimulantes. Se extendieron los clones de CTL y se utilizaron en los experimentos descritos.

Análisis de CTL

Se determinó la actividad citotóxica en 4 horas por análisis con liberación de ^{51}Cr frente a células objetivo recubiertas con péptidos mdm100 o péptidos de referencia que se unen a MHC de clase I tal como describió (Sadovnikova et al. (1993) Int. Immunol. 6, 289-296). En algunos experimentos se utilizaron células dendríticas como objetivos de CTL. Éstas se prepararon a partir de esplenocitos de C57BL/10 después de la eliminación de células plásticas adherentes y de la centrifugación en una capa de metrizamida al 14,5% (p/v) como describió (Macatonia et al. (1989) J. Exp. Med. 169, 1255-1264).

Aislamiento de péptidos naturales y separación por HPLC

Se lisaron 4x10^{8} células RMA de linfoma en 4 ml de TFA al 2% en H_{2}O. La suspensión se homogeneizó por tratamiento por ultrasonidos y el residuo celular se eliminó por centrifugación en una centrífuga (Sigma 2K15) a aproximadamente 27.000 g durante 1 h a 4ºC. El sobrenadante se transfirió a continuación a 10 unidades de filtración centricon (Amicon), que se centrifugaron a 5.000 g durante 2,5 h a 4ºC. El filtrado conteniendo péptidos con menos de 10 kDa se separó por HPLC en una columna Superpac PepS (Pharmacia) utilizando como tampón A TFA al 0,1% en H_{2}O y como tampón B TFA al 0,1% en acetonitrilo. El caudal fue de 1 ml/min y la concentración del tampón B aumentó desde 0% a 60% a razón de 1% por minuto. Se recogieron fracciones de 1 ml, se secaron en un secador Servant speedvacuum y se volvieron a poner en suspensión en 100 \mul de PBS. Se utilizaron 10 \mul de cada fracción de HPLC para recubrir células T2-K^{b} marcadas con ^{51}Cr, que sirvieron a continuación como objetivos para los CTL específicos para el péptido mdm100.

Resultados Aislamiento de CTL de gran avidez a partir del repertorio alo-restringido

Se ha identificado un péptido procedente de mdm-2 (mdm100) que se une eficazmente a moléculas H-2K^{b} de clase I. Sin embargo, en (H-2^{b}) de ratones C57BL/6 este péptido estimuló únicamente a los CTL de baja actividad que reconocieron las células objetivo recubiertas con el péptido mdm100 sintético, pero no a las células objetivo que expresan mdm-2 de forma endógena. Una posible explicación fue que los CTL de gran avidez que pueden reconocer bajas concentraciones de péptidos producidos en la naturaleza se eliminaron del repertorio de los ratones H-2^{b}. Como la tolerancia está restrigida por MHC, el repertorio de CTL de (H-2^{d}) de ratones BALB/c no es de esperar que sea tolerante con los péptidos mdm100 presentados por las moléculas H-2K^{b} de clase I y debería ser posible aislar CTL con gran avidez. De este modo, se generaron CTL alo-restringidos estimulando esplenocitos naturales de BALB/c con células RMA-(H-2^{b}) y T2-K^{b} recubiertas con péptidos. Se aislaron treinta y tres clones CTL de CD8^{+} con células RMA-S y T2-K^{b} lisadas solamente cuando se recubrieron con péptidos mdm100, pero no cuando se recubrieron con otros péptidos de unión a H-2^{b} de clase I (fig. 3B y C). Las células (H-2^{d}) de P815 isotrasplantadas eran incapaces de presentar el péptido mdm100 a los clones de CTL procedentes de H-2^{d}. Los experimentos de valoración de péptidos pusieron de manifiesto que 16 clones eran de gran "avidez" necesitando una concentración molar de péptido de 10^{-12} a 10^{-14} para la destrucción máxima media de las células objetivo (fig. 3A). En cambio, 17 clones de CTL fueron de baja "avidez", necesitando una concentración molar de péptido de 10^{-8} a 10^{-9} (fig. 3A).

Los CTL alo-restringidos lisan células tumorales pero no células normales

La avidez de los clones de CTL fue funcionalmente importante, ya que determina el nivel de destrucción de las células tumorales. Todos los clones de CTL con avidez elevada destruyeron eficazmente las células RMA del linfoma (H-2^{b}), mientras que la lisis por los clones de CTL de baja avidez fue ineficaz (fig. 3B y C). Para determinar si los CTL con avidez elevada podrían descriminar entre células transformadas y normales, se utilizaron células dendríticas (DC) como objetivos porque ellas expresan grandes concentraciones de moléculas MHC de clase I así como moléculas coestimulantes que son importantes para la activación del linfocito T (Steinman (1991) Ann. Rev. Immunol. 9, 271-296). Los niveles de expresión de mdm-2 en DC no se han determinado todavía pero pueden ser similares a los observados en tejidos que constan principalmente de células no proliferantes. Por ejemplo el cerebro, el corazón y los músculos contienen concentraciones considerables de ARN de mdm-2 (Fakharzadeh et al. (1991) EMBO J. 10, 1565-1569), aunque los niveles fueron más altos en los tejidos con un índice de proliferación alto tal como los testículos y el timo. La Figura 3D demuestra que los niveles de expresión de mdm-2 en DC fueron suficientes para desencadenar la lisis por los clones de CTL con gran avidez. De forma importante, los DC recubiertos con el péptido mdm100 se lisaron eficazmente, lo que indica que estas células no fueron resistentes intrínsecamente a la destrucción mediada por CTL (Fig. 3D). Estos experimentos in vitro indicaron que los CTL con gran avidez podían descriminar entre células RMA tumorales transformadas y células dendríticas normales. Los experimentos in vivo también sugerieron que los tejidos normales no fueron atacados por los CTL con gran avidez, ya que la inyección intravenosa de 10^{7} CTL durante tres días consecutivos fue bien tolerada por los ratones C57BL/6 positivos a H-2K^{b}.

El reconocimiento de células tumorales por CTL con gran avidez no fue limitado por las células RMA del linfoma, pero se observó además frente a las células B16 de melanoma. Sin embargo, el reconocimiento del melanoma dependía de los niveles de expresión de MHC de clase I. Se observó la destrucción de CTL frente a la variante de melanoma B16-F10 positiva para K^{b} (fig. 4B), mientras que la variante B16-F1 negativa para K^{b} fue resistente a la lisis por CTL (fig. 4A). La destrucción relativa ineficaz de C16-F10 (fig. 4B) comparada con RMA (fig. 3C) se correlacionó con niveles bajos y altos de expresión de K^{b} en estas células tumorales. El aumento de la densidad de ligandos de K^{b}/péptido por recubrimiento de células B16-F10 con péptidos mdm100 produjo un aumento de destrucción de CTL (fig. 4B).

Pruebas de que el péptido mdm100 se produce de forma natural en células tumorales

Los experimentos descritos anteriormente han demostrado que los clones aumentados de CTL frente al péptido mdm100 sintético fueron capaces de reconocer células tumorales positivas a K^{b}. Para estudiar si el reconocimiento cruzado fortuito de péptidos no relacionados de importancia para el reconocimiento de CTL de células tumorales, se aislaron péptidos de bajo peso molecular de células RMA y se separaron por HPLC en fase inversa. Se recogieron fracciones de HPLC individuales y se utilizaron para recubrir células T2-K^{b}, que se utilizaron a continuación como objetivos de CTL. Únicamente las fracciones 31 y 29 contenían péptidos reconocidos por CTL (fig. 5B). La separación por HPLC de péptidos mdm10 sintéticos puso de manifiesto un pico principal de péptido en la fracción 31 y picos menores en la fracción 29 (fig. 5A). La espectrometría de masas puso de manifiesto que la fracción 31 contenía el péptido mdm100 (YAMIYRNL; (SEQ ID nº 1) y que la fracción 29 contenía el mismo péptido con una metionina oxidada en la posición 3. La elución conjunta de péptidos producidos de forma natural sugiere firmemente que las células RMA del tumor producen el péptido mdm100 de forma natural. La versión oxidada de este péptido no se produce probablemente de forma natural, pero debe ser el producto de la oxidación de meteonina durante el procedimiento de aislamiento de TFA.

Los CTL alo-restringidos pueden retrasar el crecimiento del tumor en ratones H-2^{b}

Se probó la capacidad para controlar el crecimiento del linfoma de RMA y de tumores de melanoma de B16-F10 in vivo en CTL con elevada avidez. Se inyectaron tumores desarrollados en células RMA en ratones C57BL/6 el día 9 y perecieron por grandes masas tumorales a los 14 a 15 días (fig. 6A y B). En cambio, el desarrollo del tumor se inhibió completamente a los 15 a 17 en ratones que fueron inyectados con células RMA y CTL. El nivel de protección tumoral dependió de la dosis y fue mayor en ratones inyectados con una gran dosis de CTL (fig. 6A), en comparación con los ratones inyectados con una dosis baja de CTL (fig. 6B). Resultados similares se obtuvieron con el melanoma de B16-F10. Ratones inyectados con células B16-F10 desarrollaron únicamente tumores después de 8 días y murieron por la masa tumoral después de 11 a 13 días, mientras que los ratones inyectados con células B16-F10 y CTL estavieron exentos de tumores hasta el día 15 (fig. 6C). Las respuestas inmunitarias del ratón H-2^{b} receptor frente al inyectado con clones de CTL procedentes de H-2^{d} es de esperar que limiten su vida media in vivo y esto puede explicar porqué la protección del tumor no fue completa. Los experimentos adicionales pondrán de manifiesto en qué extensión la inmunosupresión del ratón receptor puede aumentar la protección del tumor por clones de CTL transferidos. Los experimentos descritos aquí han establecido que los clones de CTL alo-resringidos para los péptidos procedentes de la proteína mdm-2 normal pueden controlar in vivo el crecimiento de los tumores de linfoma y melanoma.

Este trabajo demuestra que es posible salvar la autotolerancia explotando las especificidades presentes en el repertorio de CTL alo-restringidos. Los clones de CTL específicos para un péptido presentado por moléculas que no son auto-H-2K^{b} de clase I se obtuvieron a partir del repertorio alo-restringido de ratones BALB/c. Aproximadamente el 50% de los clones de CTL fueron de avidez elevada y células tumorales que expresan mdm-2 reconocidas eficazmente, mientras que los CTL de baja avidez solamente reconocen objetivos recubiertos con péptidos sintéticos. Los clones de CTL de gran avidez presentaban especificidad al tumor y no lisaban las células dendríticas o los blastocitos T estimulados in vitro por Con-A. La inyección intravenosa de clones de CTL de avidez elevada fue bien tolerada por los ratones receptores H-2^{b}.

Se ha observado que el repertorio de ratones H-2^{b} fue eliminado de los CTL con avidez elevada, específicos para el péptido mdm100. Este péptido estimuló solamente los CTL con baja actividad que no reconocieron las células tumorales que expresan mdm-2. Por consiguiente, el aislamiento de los CTL capaces de reconocer células tumorales fue limitado por tolerancia a la proteína mdm-2. Igualmente, el direccionamiento de los tumores que sobreexpresan la proteína p53 normal fue también limitado por la tolerancia a CTL. En una serie de experimentos se explotó el repertorio de CTL de ratones transgénicos HLA-A0201 para salvar la tolerancia a la p53 humana (Theobald et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 11993-11997). El repertorio de CTL de estos ratones transgénicos fue tolerante solamente para los péptidos p53 murinos. Se observó que dos péptidos p53 con diferencias de secuencias entre el hombre y el ratón estimulaban los CTL con gran avidez que reconocían las células tumorales positivas HLA-A0201 pero no a las células dendríticas. Estos estudios demostraron que los ratones transgénicos HLA se pueden explotar para generar CTL murinos frente a los tumores humanos que sobreespresan proteínas celulares. Este planteamiento depende de la disponibilidad de ratones transgénicos y está limitado a péptidos con diferencias de secuencia entre el hombre y el ratón. La ventaja de este planteamiento descrita en la presente memoria es que CTL se puede generar frente a cualquier péptido expresado en niveles elevados en tumores. Además, el planteamiento de Theobald et al. depende de las diferencias entre el péptido humano y de ratón; utiliza linfocitos T de ratón que responden al tratamiento para tratar a pacientes humanos y depende de que sean proteínas con diferencias entre el hombre y el ratón como objetivos.

¿Se pueden explotar los clones de CTL alo-restringidos para inmunoterapia tumoral adoptiva? La inmunoterapia adoptiva de estos clones de CTL lo más probable es que sea eficaz en pacientes de cáncer inmunodeprimidos. Por ejemplo, los pacientes con leucemia mieloide crónica (CML) son adecuados teóricamente para la inmunoterapia con clones de CTL alo-restringidos. Los pacientes con CML reciben frecuentemente alotrasplantes de médula ósea, que requieren inmunosupresión para favorecer el trasplante de médula ósea. Se conoce desde hace algún tiempo que el pronóstico de estos pacientes mejora cuando los linfocitos T procedentes del trasplante organizan una respuesta inmunitaria contra las células leucémicas del paciente (Goldman (1989) Bone Marrow Transplant 1, 133-134). Sin embargo esta reacción de injerto-contra-leucemia se asocia con frecuencia con la enfermedad perjudicial de injerto-contra-huésped. Los experimentos murinos descritos aquí indican que es posible generar clones de CTL alo-restringidos que pueden destruir específicamente células leucémicas. Estos resultados indican que debería ser posible aislar clones de CTL humanos específicos para péptidos presentados en concentraciones elevadas en células leucémicas. Dichos clones de CTL se pueden utilizar para la inmunoterapia adoptiva de pacientes con CML y mediarían los efectos antileucémicos sin producir la enfermedad de injerto-contra-huésped.

Por lo tanto, en este ejemplo se ha investigado si se puede aumentar CTL frente a una autoproteína expresada ubicuamente, mdm-2, que se sobreexpresa frecuentemente en tumores. Se explotó la observación de que la tolerancia a los linfocitos T está autorrestringida por MHC para generar CTL específicos para un péptido procedente de mdm-2 presentado por moléculas no-auto MHC de clase I. Por lo tanto, se utilizó el repertorio de linfocitos T alo-restringidos de ratones H-2^{d} para aislar CTL específico para el péptido mdm100 presentado por las moléculas H-2K^{b} alógenas de clase I. Estos CTL discriminaron in vitro entre las células transformadas y normales, destruyendo específicamente los tumores de melanoma y linfoma positivos a K^{b} pero no las células dendríticas que expresan a K^{b}. Los CTL mostraron actividad antitumoral in vivo y retardaron el crecimiento del melanoma así como los tumores de linfoma en ratones receptores H-2^{b}. Estos experimentos demuestran que es posible salvar la tolerancia a liposoma linfocitos T para expresar ubicuamente autoantígenos y para dirigir respuestas de CTL contra tumores que expresan elevadas concentraciones de proteínas estructuralmente inalteradas.

Ejemplo 2 Identificación de epítopos de CTL en proteína de VIH y en proteínas asociadas al tumor

Para que sirvan como péptidos objetivo CTL tienen que (i) ser capaces de unirse a moléculas HLA de clase I; (ii) ser capaces de estimular a CTL; (iii) ser producidos por tratamiento del antígeno natural. Estos tres requisitos se prueban experimentalmente.

(i) Identificación de péptidos en proteínas de VIH o en proteínas asociadas a tumores que se unen a molécula HLA de clase I

Se han identificado los motivos de unión al péptido para un gran número de moléculas HLA de clase I (11). Estos motivos de unión se utilizan para identificar las secuencias de las proteínas del VIH o de las proteínas asociadas al tumor. Se sintetizan péptidos que contienen motivos y se analiza el enlace a los alelos apropiados de clase I. Para analizar el enlace del péptido, las moléculas HLA de clase I se expresan en la línea celular T2 de origen himano del mutante de carga al péptido. Las moléculas HLA-A0201 de clase I expresan de forma natural las células T2. La expresión de otras moléculas HLA de clase I (p. ej.: A1, B7, etc.) se consigue transfectando los correspondientes genes de clase I en las células T2. Como las células T2 presentan un defecto de carga al péptido, expresan solamente bajas concentraciones de moléculas de clase I que contienen el péptido o su superficie celular. Sin embargo, si los péptidos de unión a la clase I están presentes en el medio de cultivo, aumentan los niveles de expresión de MCH de clase I. El aumento de los niveles de expresión de clase I se detecta tiñendo las células T2 con anticuerpos específicos para HLA de clase I, seguido de análisis con un clasificador de moléculas activado por fluorescencia. Los experimentos de valoración del péptido ponen de manifiesto la eficacia del enlace de clase I de los péptidos individuales.

Como alternativa al ensayo de unión al péptido utilizando células T2 intactas, se realizan ensayos de unión en lisados celulares. Los lisados de células T2 marcadas metabólicamente se incuban toda la noche a 4ºC en presencia de péptidos de la prueba. Se utilizan anticuerpos específicos para moléculas de HLA de clase I conformacionalmente marcadas correctamente para inmunoprecipitación. Solamente unas pocas moléculas de clase I conformacionalmente marcadas son detectables cuando se incuban lisados celulares de T2 en ausencia de péptidos de unión de clase I. En cambio, si los péptidos de la prueba se unen a moléculas de clase I, esto estabilizará su conformación. Por consiguiente, el aumento de las concentraciones de las moléculas de clase I radiomarcadas se inmunoprecipita en los lisados de las células T2 incubadas con péptidos de unión de la clase I.

Las moléculas MHC de clase I marcadas radioactivamente no necesitan necesariamente medir el enlace del péptido. Por ejemplo, conocidos péptidos de unión de clase I se pueden marcar por yodación o por biotinilación y sirven como péptidos indicadores en experimentos de competencia. De esta forma, los lisados procedentes de células T2 que contienen moléculas HLA de clase I se incuban con péptidos indicadores marcados junto con concentraciones variables de péptidos de la prueba sin marcar. Los péptidos de la prueba que se unen a moléculas HLA de clase I inhiben con éxito el enlace con péptidos indicadores. Éste da como resultado una disminución de moléculas de HLA de clase I que contienen péptidos indicadores marcados. De este modo, disminuye la cantidad de péptidos indicadores marcados detectables por inmunoprecipitación con anticuerpos específicos para moléculas de clase I conformacionalmente duplicadas correctamente.

Las células T2 no son la única fuente de moléculas HLA de clase I para los ensayos de enlace. Las células de Drosophila representan una fuente alternativa. Las células Drosophila se transfectan con microglobuliba \beta2 humana junto con genes que codifican varios alelos HLA de clase I. Como las células de Drosophila no contienen las proteínas TAP requeridas para el transpote del péptido y la carga del péptido MHC, los alelos transfectados de clase I no se cargan de forma natural mediante el transportador y de este modo, se pueden cargar artificialmente con péptidos en la superficie. De este modo, la conformación de las moléculas de clase I en los lisados de células de Drosophila transfectadas es inestable en ausencia de péptidos unión a HLA. Los ensayos de enlace en los lisados de las células de Drosophila se realizan en las mismas condiciones que las descritas para los lisados preparados a partir de células T2.

(ii) Estimulación del CTL alo-restringido, específico para el péptido

Se utilizan péptidos de la prueba que se unen eficazmente a las moléculas HLA de clase I (véase anteriormente) para estimular las respuestas de CTL de individuos sanos no relacionados con HLA. Se evitan las respuestas de CTL alo-reactivos frente a péptidos distintos de los péptidos de la prueba. La probabilidad de estimular CTL frente a péptidos de la prueba aumenta si la mayoría de moléculas de HLA expresada por las células estimulantes presentan péptidos de la prueba en su surco de unión. De este modo, el planteamiento es para expresar mediante transfección las mismas moléculas HLA de clase I en varias células humanas y no humanas y para cargarlas en los péptidos de la prueba que se unen a la clase I. Estas células cargas de péptido se utilizan a continuación para estimular a CTL procedentes de PBMC de individuos sanos no relacionados con HLA. Los PBMC se estimulan cada 1 a 2 semanas con diferentes tipos de células humanas y no humanas que expresan la misma molécula de HLA. Esto disminuye la probabilidad de estimular a los CTL frente a péptidos irrelevantes porque los diferentes tipos de células humanas y no humanas presentan muy probablemente diferentes series de estos péptidos irrelevantes.

Los siguientes tipos de células son adecuados para la expresión de moléculas HLA de clase I y para la estimulación de CTL: las líneas celulares humanas T2 y C1R, las líneas celulares de ratón RMA, RMA-S y P1HTR y las células de Drosophila que se transfectaron para expresar no sólo las moléculas HLA de clase I sino también las moléculas que son importantes para la estimulación conjunta de linfocitos T, tales como B7.1, B7.2, ICAM1 y LFA3.

Para conseguir niveles altos de ocupación de MHC con los péptidos de la prueba son particularmente adecuadas las células T2 transfectadas por HLA, RMA-S y Drosophila. Estos tipos de células no expresan moléculas transportadoras del péptido funcional TAP y por consiguiente expresan una gran proporción de moléculas MHC deficientes del péptido que se pueden cargar en péptidos añadidos de forma exógena. De este modo, estas células se incuban toda la noche con péptidos de la prueba 100 \muM y a continuación se utilizan para estimular a CTL utilizando PBMC de donantes sanos. Para conseguir altos niveles de ocupación de MHC con los péptidos de la prueba en las líneas celulares normales C1R, RMA y P1HTR, estas células se tratan con un tampón que contiene ácido acético 0,2 M y cloruro de sodio 0,2 M a pH 3 a 4 durante aproximadamente 1 minuto para desnaturalizar el péptido que contiene moléculas MHC de clase I en la superficie de las células. Las células se incuban a continuación a pH neutro en un medio que contiene \beta2-microglobulina humana y péptidos de la prueba 100 a 200 \muM. Durante esta incubación, una gran proporción de moléculas HLA de clase I se reduplican y contienen el péptido de la prueba en su surco de unión.

Se inician cultivos de CTL en placas de 24 pocillos utilizando 5x10^{6} PBMC que responden al tratamiento obtenido de envases de sangre de capa leucocítica y 10^{6} células estimulantes cargas de péptido, irradiadas, por pocillo. El medio de cultivo consiste en RPMI, FCS al 10%, cultivo sobrenadante al 10% de anticuerpos monoclonales anti-CD4 y 10 U/ml de IL-2 recombinante. Después de una semana los CTL que responden al tratamiento se vuelven a estimular en microcultivos en placas de 96 pocillos. Cada pocillo contiene 2x10^{5} células nutrientes PBMC autólogas irradiadas y 10^{5} células estimulantes cargadas con péptido irradiadas. Se siembran números variables de CTL que responden al tratamiento partiendo de aproximadamente 5x10^{4} a 5x10^{2} por microcultivo. Se realizan cultivos por duplicado de 24 pocillos para cada número de células que responden al tratamiento. Los microcultivos se vuelven a estimular con PBMC irradiado reciente y células estimulantes cargadas con péptidos después de 10 a 14 días. 7 días después de la última estimulación, se analizan los CTL de microcultivos individuales mediante un análisis de liberación de ^{51}Cr frente a las células T2 que expresan a moléculas HLA de clase I apropiadas que presentan los péptidos de la prueba que se utilizan para generar los CTL o que presentan péptidos de referencia irrelevantes. Los microcultivos que presentan destrucción preferente de células T2 recubiertas con péptidos de la prueba en las células T2 recubiertas con péptidos irrelevantes se extienden para confirmar la especificidad de CTL. Al mismo tiempo, algunos de estos CTL se utilizan para limitar la clonación por dilución en placas de 96 pocillos utilizando el mismo número de células nutrientes y células estimulantes como para los microcultivos descritos anteriormente. Se siembran 1 a 0,5 CTL por pocillo. Se confirma la especificidad de los clones de CTL utilizando células objetivo T2 recubiertas con péptidos relevantes e irrelevantes.

(iii) Identificación de péptidos producidos por tratamiento de antígenos naturales

Se determina si los péptidos de la prueba que se unen bien a moléculas HLA de clase I ((i) anterior) y que estimulan respuestas de CTL ((ii) anterior) se producen por tratamiento de antígenos naturales. Al principio, se seleccionan péptidos identificando las secuencias de proteínas de VIH y de proteínas asociadas a tumores por la presencia de motivos de unión a MHC de clase I. El trabajo descrito en las secciones (i) a (ii) anteriores demuestra que los péptidos de la prueba seleccionados se pueden unir a moléculas de clase I y pueden estimular a CTL específicos para el péptido. Se determina si el tratamiento de antígenos naturales conduce a la presentación de MHC de clase I de estos péptidos. Se prueban las líneas y clones de CTL específicos para el péptido frente a células objetivo que expresan proteínas de VIH relevantes o proteínas asociadas al tumor endógenamente. De este modo, se transfectan doblemente células C1R humanas con los genes de HLA de clase I y con los genes que codifican proteínas de VIH o la proteína asociada al tumor. La lisis por CTL de células objetivo C1R doblemente transfectadas en ausencia de lisis de células transfectadas una vez demuestra que el tratamiento natural de proteínas expresadas endógenamente produce los péptidos reconocidos por estos clones de CTL.

Ejemplo 3 Inmunoterapia adoptiva en el hombre utilizando CTL

Condiciones de estimulación in vitro similares a las descritas en el ejemplo 2 para el ratón producen CTL humanos alo-restringidos. Se generan péptidos que reconocen CTL alo-restringidos procedentes de proteínas de VIH o de proteínas asociadas a tumores presentadas por la molécula HLA-A0201 de clase I. (Se pueden también utilizar péptidos de reconocimieto de CTL alo-restringidos presentados por HLA-A1 y HLA-B7 que serán aislados). Estos tres alelos de HLA son los más frecuentes entre las poblaciones caucásicas y existe una alta probabilidad de que cualquier individuo exprese por lo menos uno de los tres alelos. Esto significa, que los clones CTL restringidos por estos tres alelos de HLA son útiles para la inmunoterapia adoptiva de la mayoría de los individuos de la población caucásica. Los clones de CTL se utilizan como adyuvantes en quimioterapia para el tratamiento del cáncer.

Para inmunoterapia adoptiva de individuos infectados por VIH, se explotan péptidos procedentes de proteínas codificadas por VIH. La carga del virus se suprime después de la administración de CTL.

La Figura 7(A) presenta la lisis de un clon de CTL específico para un péptido de ciclina D1 (101 a 110) de unión a HLA-A0201. El clon de CTL se obtuvo a partir de PBMC negativo para HLA-A2.

La Figura 7(B) presenta la lisis de un clon de CTL específico para un péptido de ciclina D1 (228 a 234) de unión a HLA-A0201. El clon de CTL se obtuvo a partir de PBMC negativo para HLA-A2.

Los experimentos con los péptidos procedentes de ciclina D1 demuestran que es posible generar CTL específicos para el péptido a partir de donantes sanos mediante estimulación de PBMC con células que presentan antígeno desigual a MHC. Estos CTL son específicos para los péptidos de ciclina D1 presentados por moléculas HLA-A0201 de clase I que son expresadas por el antígeno que presenta las células utilizadas para la estimulación de CTL, pero no por las células del donante de CTL. Por lo tanto, es evidentemente posible aislar CTL alo-restringidos, específicos para el péptido de individuos normales. Si los péptidos seleccionados se producen en células tumorales, los CTL alo-restringidos, específicos para el péptido, presentan destrucción de la célula tumoral.

Referencias

1. Kast, W.M., R. Offringa, P.J. Peters, A.C. Voordouw, R.H. Meloen, A.J. van der Eb, y C.J. Melief (1989) "Eradication of adenovirus El-induced tumors by E1A-specific cytotoxic T lymphocytes" Cell 59, n° 4, 603-14.

2. Kawakami, Y., S. Eliyahu, C.H. Delgado, P.F. Robbins, K. Sakaguchi, E. Appella, J.R. Yannelli, G.J. Adema, T. Miki, y S.A. Rosenberg (1994) "Identification of a human melanoma antigen recognized by tumor-infiltrating lymphocytes associated with in vivo tumor rejection" Proc Nati Acad Sci USA 91, n° 14, 6458-62.

3. Nowak, M.A., R.M. May, R.E. Phillips, S. Rowland Jones, D.G. Lalloo, S. McAdam, P. Klenerman, B. Koppe, K. Sigmund, C.R. Bangham et al (1995) "Antigenic oscillations and shifting immunodominance in HIV-1 infections [see cornments]" Nature 375, n° 6532, 606-11.

4. Riddell, S.R. , K.S. Watanabe, J.M. Goodrich, vC.R. Li, M.E. Agha, y P.D. Greenberg (1992) "Restoration of viras unmunity in immunodeficient humans by the adoptive transfer of T cell clones [see comments] " Science 257, n° 5067, 238-41.

5. van Lochem, E., B. de Gast, y E. Goulmy (1992) "In vitro separation of host specific graft-versus-host and graft-versus-leukemia cytotoxic T cell activities" Bone-Marrow-Transplant 10, n° 2, 181-3.

6. Faber, L.M., S.A. van Luxemburg Heijs, R. Willemze, y J.H. Falkenburg (1992) "Generation of leukemia-reactive cytotoxic T lymphocyte clones from the HLA-identical bone marrow donor of a patient with leukemia" J-Exp-Med 176, n° 5, 1283-9.

7. Falkenburg, J.H., L.M. Faber, M. van den Elshout, S.A. van Luxemburg Heijs, A. Hoofunan den Otter, W.M. Smit, P.J. Voogt, y R. Willernze (1993) "Generation of donor-derived antileukemic cytotoxic T-lymphocyte responses for treatment of relapsed leukemia after allogeneic HLA-identical bone marrow transplantation" J-Immunother 14, n° 4, 305-9 issn. 1053-8550.

8. Heath, W.R., M.E. Hurd, F.R. Carbone, y L.A. Sherman (1989) "Peptide-dependent recognition of H-2Kb by alloreactive cytotoxic T lymphocytes" Nature 341, n° 6244, 749-52.

9. Rojo, S., y J.A. Lopez de Castro (1991) "Peptide-mediated ano- recognition of HLA-B27 by cytotoxic T lymphocytes" Ira J Cancer Suppl 6, 10-3.

10. von Boehmer, H. (1992) "Thymic selection: a matter of life and death" Immunol-Today 13, n° 11, 454-8.

\newpage

11. Rammensee, H.G., T. Friede, y S. Stevanoviic (1995) "MHC ligands and peptide motifs: first listing" Immunogenetics 41, n° 4, 178-228.

12. Walker, B.D., y F. Plata (1990) "Cytotoxic T lymphocytes against HIV" AIDS 4, n° 3, 177-84.

13. Nixon, D.F., y A.J. McMichael (1991) "Cytotoxic T-cell recognition of HIV proteins and peptides [editorial]" AIDS 5, n° 9, 1049-59.

14. Bakker, A.B.H., M.W.J. Schreursv, A.J. de Boer, Y. Kawakami, S.A. Rosenberg, G.J. Adema, y C.G. Figdor (1994) "Melanocyte lineage-specific antigen gp100 ís recognized by melanoma-derived tumor-infiltrating lymphocytes" J Exp Med 179, 1005-1009.

15. Boel, P., C. Wildmann, M.L. Sensi, R. Brasseurv, J.C. Renauld, P. Coulie, T. Boon, y P. van der Bruggen (1995) "BAGE: a new gene encoding an antigen recognized on human melanomas by cytolytic T lymphocytes" Imnutniry 2, n° 2, 167-75 pub. 1074-7613.

16. Cox, A.L., J. Skipper, Y. Chen, R.A. Henderson, T.L. Darrow, J. Shabanowitz, V.H. Engelhard, D.F. Hunt, y C.L. Slingluff Jr (1994) "Identification of a peptide recognized by five rnelanoma-specific human cytotoxic T cell fines" Science 264, 716-719.

17. Kawakami, Y., S. Eliyahu, C.H. Delgado, P.F. Robbins, L. Rivoltini, S.L. Topalian, T. Miki, y S.A. Rosenberg (1994) "Cloning of the gene coding for a shared human-melanoma antigen recognized by autologous T-cells infiltrating finto tumor" Proc Natl Acad Sci USA 91, n° 9, 3515-3519.

18. Kawakami, Y., S. Eliyahu, K. Sakaguhi, P.F. Robbins, L. Rivoltini, J.R. Yannelli, E. Appella, y S.A. Rosenberg (1994) "Identification of the immunodominant peptides of the MART-1 human melanoma antigen recognized by the majority of HLA-A2-restricted tumor infiltrating lymphocytes" J Exp Med 180, 347-352.

19. Traversari, C., P. van der Bruggen, I.F. Luescher, C. Lurquin, P. Chomez, A. Van Pel, E. de Plaen, A. Amar-Costesec, y T. Boon (1992) "A nonapeptide encoded by human gene MAGE-1 is recognized on HLA-A1 by cytolytic T lymphocytes directed against tumor antigen MZ2-E" J. Exp. Med. 176, 1453-1457.

20. van der Bruggen, P., C. Traversari, P. Chomez, C. Lurquin, E. de Plaen, B. van den Eynde, A. Knuth, y T. Boon (1991) "A gene encoding an antigen recognized by cytolytic T lymphocytes on a human melanoma" Science 254, 1643-1647.

21. Wólfel, T., A. Van Pel, V. Brichard, J. Schneider, B. Seliger, K. Meyer zum Büschenfeldev, y T. Boon (1994) "Two tyrosinase nonapeptides recognized on HLA-A2 melanomas by autologous cytolytic T lymphocytes" Eur J Immunol 24, 759-764.

Claims

1. Utilización de linfocitos T citotóxicos para la preparación de un medicamento para tratar a un paciente con una enfermedad en la que el paciente es portador de células enfermas, cuyas células contienen o están asociadas a, un polipéptido anormal o a una cantidad anormalmente elevada de un polipéptido y son capaces de presentar, por lo menos, parte de dicho polipéptido en su superficie mediante una molécula HLA de clase I (o equivalente), en la que los linfocitos T citotóxicos reconocen, por lo menos, parte de dicho polipéptido, cuando son presentados por una molécula HLA de clase I (o equivalente) en la superficie de una célula y proceden de un individuo el cual no lleva el tipo de molécula HLA de clase I (o equivalente) la cual, presenta en el paciente, por lo menos, parte de dicho polipéptido anormal o una cantidad de polipéptido anormalmente elevada, contenida en o asociada a las células enfermas de dicho paciente, en la que la enfermedad es cualquiera de entre cáncer, una enfermedad producida por un patógeno, una enfermedad asociada a glucosilación anormal de polipéptidos y una enfermedad asociada a cantidades anormalmente elevadas de una hormona.

2. Utilización según la reivindicación 1, en la que los CTL son una población clónica de CTL.

3. Utilización según la reivindicación 1 ó 2, en la que los CTL están prácticamente exentos de otros tipos de células.

4. Utilización según la reivindicación 1, en la que dicho polipéptido es un polipéptido mutante asociado a dichas células enfermas.

5. Utilización según la reivindicación 1, en la que dicho polipéptido está presente en una concentración mayor en dichas células enfermas en comparación con células no enfermas.

6. Utilización según la reivindicación 1, en la que el cáncer es cualquiera de entre el cáncer de mama; cáncer de vejiga; cáncer de pulmón; cáncer de próstata; cáncer de tiroides; leucemias y linfomas tales como CML, ALL, AML, PML; cáncer de colon; glioma; seminoma; cáncer de hígado; cáncer pancreático; cáncer de vejiga; cáncer renal; cáncer cervical; cáncer testicular; cáncer de cabeza y cuello; cáncer de ovario; neuroblastoma y melanoma.

7. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la enfermedad está producida por una infección vírica crónica.

8. Utilización según la reivindicación 7, en la que el virus es cualquiera de entre VIH, papiloma virus, virus de Epstein-Barr, HTLV-1, virus de hepatitis B, virus de hepatitis C y herpes virus.

9. Utilización según la reivindicación 8, en la que el virus es VIH.

10. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la enfermedad es una enfermedad bacteriana producida por una infección bacteriana crónica.

11. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además la etapa de determinación del tipo de molécula HLA de clase I (o equivalente) del paciente antes de la administración de los CTL.

12. Utilización según la reivindicación 11, en la que dicho tipo se determina utilizando la tipificación del ADN.

13. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el paciente es el hombre.

14. Utilización según la reivindicación 11, en la que dicho linfocito T citotóxico se selecciona de entre un banco de clones de CTL, comprendiendo dicho banco una pluralidad de clones de CTL procedente de individuos con un tipo de molécula HLA de clase I (o equivalente) distinto y cada clon de CTL reconoce dichas células enfermas.

15. Utilización según la reivindicación 14, en la que dicho clon de CTL reconoce, por lo menos, parte del mismo polipéptido contenido en, o asociado a, dichas células enfermas.

16. Procedimiento de preparación de una población clónica de linfocitos T citotóxicos (CTL) reactivos frente a un polipéptido, procedimiento que comprende la etapa de (a) cultivar conjuntamente una muestra que contiene CTL o un precursor de los mismos, procedente de un individuo sano con una célula estimulante que expresa en su superficie moléculas HLA de clase I (o equivalente) y que presenta por lo menos parte del polipéptido en una gran proporción de dichas moléculas HLA de clase I (o equivalente) ocupadas presentes en la superficie de dicha célula estimulante y (b) seleccionar un clon de CTL reactivo frente a dicho polipéptido cuando, por lo menos, una parte de dicho polipéptido es presentado por una molécula HLA de clase I (o equivalente) en la superficie de la célula, en la que el individuo sano no lleva el tipo de molécula HLA de clase I (o equivalente) que, en la célula estimulante, presenta por lo menos una parte del polipéptido.

17. Procedimiento según la reivindicación 16, en la que dicha muestra que contiene CTL o un precursor de los mismos es PBMC.

18. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 16 ó 17, en el que dicho polipéptido es una molécula anormal asociada a una célula enferma o un polipéptido asociado a una célula enferma, en el que está presente una cantidad anormalmente elevada de dicho polipéptido en dicha célula enferma.

19. Procedimiento según la reivindicación 18, en el que dicho polipéptido es un polipéptido mutante asociado a una célula enferma o un polipéptido presente en una concentración más elevada en dicha célula enferma comparada con una célula no enferma.

20. Procedimiento según la reivindicación 18 ó 19, en la que dicha célula enferma es cualquiera de entre una célula cancerosa, una célula infectada por virus, una célula infectada por bacterias y una célula que expresa una cantidad anomalmente elevada de una hormona.

21. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, en la que el individuo sano es el hombre.

22. Procedimiento según la reivindicación 19, en el que dicho polipéptido es cualquier de entre ciclina D1, ciclina E, mdm 2, EGF-R, erb-B2, erb-B3, FGF-R, receptor del factor de crecimiento de tipo insulina, Met, myc, p53 y BCL2, es decir mutante Ras, mutante p53 un polipéptido asociado con la transposición BCR/ABL en CML y ALL; receptor del mutante CSF-1, mutante APC, mutante RET, mutante EGFR, un polipéptido asociado con la transposición PML/RARA en PML, polipéptido asociado con la transposición E2A-PBX1 en preleucemias B y en leucemias agudas de la infancia, proteínas del virus de papiloma humano, proteínas del virus de Epstein-Barr, proteínas de HTLV-1 y proteínas de virus de la hepatitis B o C, proteínas de virus de tipo herpes y proteínas codificadas de VIH.

23. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 22, que comprende además la determinación del tipo de HLA de clase I (o equivalente) del individuo sano.

24. Procedimiento según la reivindicación 23, en el que dicha HLA de clase I (o equivalente) se determina mediante análisis del ADN.

25. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 24, en el que dicha célula estimulante presenta un tipo de molécula de HLA de clase I (o equivalente) en su superficie, cuyo tipo de molécula de HLA de clase I (o equivalente) no está presente en el individuo sano.

26. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 25, en el que dicha célula estimulante es una célula que es sustancialmente incapaz de cargar dicha molécula de HLA de clase I (o equivalente) con, por lo menos, una parte de dicho polipéptido.

27. Procedimiento según la reivindicación 26, en el que dicha célula es una célula de mamífero defectuosa en la expresión de un péptido transportador.

28. Procedimiento según la reivindicación 27, en el que dicha célula de mamífero carece o presenta una concentración reducida de péptido transportador TAP.

29. Procedimiento según la reivindicación 26, en el que dicha célula es una célula de insecto.

30. Procedimiento según la reivindicación 29, en el que dicha célula es una célula de Drosophila.

31. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 30, en el que dicha célula estimulante es una célula huésped transfectada con una molécula de ácido nucleico capaz de expresar dicha molécula HLA de clase I (o equivalente).

32. Procedimiento según la reivindicación 31, en el que dicha célula huésped antes de la transfección no expresa sustancialmente ninguna molécula HLA de clase I (o equivalente).

33. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 32, en el que dicha célula estimulante expresa una molécula importante para la estimulación conjunta de linfocitos T.

34. Procedimiento según la reivindicación 33, en el que la molécula importante para la estimulación conjunta de linfocitos T es cualquiera de entre B7.1, B7.2, ICAM-1 y LFA3.

35. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 34, en el que prácticamente todas las moléculas HLA de clase I (o equivalente) expresadas en la superficie de dicha célula estimulante son del mismo tipo.

36. Utilización de una población clónica de linfocitos T citotóxicos procedentes de individuos sanos y reactivos frente a un polipéptido anormal procedente de una célula enferma de un paciente con una enfermedad, o un polipéptido seleccionado procedente de una célula enferma de un paciente con una enfermedad en la que en dicha célula enferma está presente una cantidad anormalmente elevada de dicho polipéptido, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un paciente con la enfermedad, en la que dicho individuo sano presenta un tipo de HLA diferente del de dicho paciente con respecto a la presentación de dicha molécula seleccionada, en la que la enfermedad es cualquiera de entre cáncer, una enfermedad producida por un patógeno, una enfermedad asociada a la glucosilación anormal de polipéptidos y una enfermedad asociada a cantidades anormalmente elevadas de una hormona.

37. Banco de clones de CTL, comprendiendo dicho banco una pluralidad de clones de CTL procedentes de individuos y cada uno de dichos clones de CTL está limitado por un alelo diferente de HLA de clase I y reconoce un polipéptido asociado a una enfermedad seleccionada, en el que la enfermedad es cualquiera de entre cáncer, una enfermedad producida por un patógeno, una enfermedad asociada a la glucosilación anormal de polipéptidos y una enfermedad asociada a cantidades anormalmente elevadas de una hormona.

38. Sistema terapéutico que comprende (a) medios para determinar el tipo de HLA de clase I (o equivalente) de un paciente que se ha de tratar y (b) un banco de clones de CTL como el definido en la reivindicación 37.

39. Procedimiento de preparación de un linfocito T citotóxico (CTL) adecuado para tratar a un paciente, comprendiendo el procedimiento la preparación de una población clónica de CTL por el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 35; la preparación de una constucción genética capaz de expresar el receptor de linfocitos T (TCR) de dicha población clónica de CTL, o una molécula funcionalmente equivalente; y la introducción de dicha construcción genética en un CTL o un precursor del mismo, procediendo dicho CTL o precursor de dicho paciente.

40. Linfocito T citotóxico (CTL) adecuado para tratar a un paciente, en el que el CTL procede del paciente y contiene un receptor de linfocitos T (TCR) o una molécula funcionalmente equivalente capaz de reconocer, por lo menos, parte de un polipéptido anormal o una cantidad anormalmente elevada de polipéptido, cuando es presentado por una molécula HLA de clase I (o equivalente) en la superficie de una célula enferma del paciente, en el que el TCR procede de un CTL de un individuo que no lleva el tipo de molécula HLA de clase I (o equivalente) que presenta el polipéptido en el paciente.

41. Linfocito T citotóxico según la reivindicación 40, que se puede obtener por el procedimiento de la reivindicación 39.

42. Utilización de linfocitos T citotóxicos para la preparación de un medicamento para tratar a un paciente con una enfermedad en la que el paciente es portador de células enfermas conteniendo dichas células, o estando dichas células asociadas a, un polipéptido anormal o a una cantidad anormalmente elevada de un polipéptido y dichas células son capaces de presentar, por lo menos, parte de dicho polipéptido en su superficie mediante una molécula HLA de clase I (o equivalente), en la que los linfocitos T citotóxicos reconocen, por lo menos, parte de dicho polipéptido, cuando son presentados por una molécula HLA de clase I (o equivalente) en la superficie de una célula y en la que el CTL es un CTL según la reivindicación 40 ó 41, en la que la enfermedad es cualquiera de entre cáncer, una enfermedad producida por un patógeno, una enfermedad asociada a glucosilación anormal de polipéptidos y una enfermedad asociada a cantidades anormalmente elevadas de una hormona.