ES2340357T3 - Antigeno tumoral. - Google Patents
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Abstract
Un péptido constituido por una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ó 17 en el listado de secuencias.
Description
Antígeno tumoral
La presente invención se refiere en general a un
nuevo antígeno tumoral, y más particularmente a un péptido que está
reconocido por linfocitos T citotóxicos específicos de tumores, un
polinucleótido que codifica el péptido o una cadena complementaria
del mismo, un vector recombinante que contiene el polinucleótido, un
transformante que contiene el vector recombinante, un método para
producir el péptido, un anticuerpo contra el péptido, un compuesto
que tenga cualquier interacción con éstos, y un método para cribado
del compuesto, una composición farmacéutica que utiliza éstos, y un
medio de análisis para la diagnosis que utiliza éstos.
El sistema inmunitario, particularmente los
linfocitos T citotóxicos (que, en lo sucesivo, pueden abreviarse
como CTLs) juega(n) un papel importante en la exclusión del
cáncer in vivo. Una infiltración de linfocitos T citotóxicos
que exhiben una actividad tóxica contra una célula tumoral ha sido
detectada en el sitio del tumor de un paciente de cáncer (Arch.
Surg., 126, 200-205, 1990). Un antígeno tumoral que
es una molécula diana para los linfocitos T citotóxicos específicos
de tumores fue descubierto por primera vez en cánceres de tipo
melanoma. Una antígeno tumoral generado en una célula tumoral se
descompone en la célula en un péptido (péptido del antígeno
tumoral) que está constituido por 8 a 11 aminoácidos, que se fija a
una molécula de antígeno leucocitario humano (HLA) que es el
complejo de histocompatibilidad mayor que se presenta en la
superficie de la célula tumoral.
HLA es un antígeno de la membrana celular, y se
expresa en prácticamente la totalidad de las células eucariotas.
HLA se clasifica principalmente como un antígeno de clase I o
antígeno de clase II. El HLA reconocido junto con un péptido
antigénico por los linfocitos T citotóxicos es un antígeno de clase
I. Los antígenos de HLA de clase I se clasifican ulteriormente en
HLA-A, B, C, etcétera. Se ha informado que HLA tiene
polimorfismo genético. El alelo HLA-A24 se
encuentra aproximadamente en el 60% de la población japonesa (en una
mayoría, igual a 95%, el genotipo es A2402), 20% de los
caucasianos, y 12% de los africanos. El alelo HLA-A2
se encuentra aproximadamente en el 40% de los japoneses, 53% de los
chinos, 49% de los caucasianos del norte, 38% de los caucasianos
del sur, y 23% de los africanos negros.
Un péptido antigénico tumoral capaz de fijarse
al HLA tiene un motivo en su secuencia para cada tipo de HLA. Los
linfocitos citotóxicos T dañan una célula tumoral por reconocimiento
de un complejo constituido por el péptido antigénico del tumor y
HLA. Como se utiliza en esta memoria, un antígeno tumoral significa
una proteína o péptido contenido en una célula tumoral capaz de
inducir un linfocito T citotóxico específico del tumor. Un péptido
antigénico del tumor significa un péptido que es generado como
resultado de la degradación del antígeno tumoral en una célula
tumoral y puede inducir o activar los linfocitos T citotóxicos
específicos del tumor por expresarse en la superficie de las
células por fijación de una molécula HLA. Adicionalmente, un sitio
de la secuencia de aminoácidos capaz de inducir linfocitos T
citotóxicos específicos del tumor que existen en un antígeno
tumoral se denomina epítope del antígeno tumoral (determinante del
antígeno tumoral).
Recientemente, un gran número de genes que
codifican antígenos tumorales que pueden ser reconocidos por
linfocitos T citotóxicos han sido identificados a partir de cDNA de
células tumorales humanas (Science, 254: 1643-1647,
1991; J. Exp. Med., 183: 1185-1192, 1996). Algunos
de estos genes están implicados en proliferación celular y
transformación maligna, con inclusión de HER/neu (Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 92: 432-436, 1995), cdk mutante (Science,
269, 1281-1284, 1995), y CASP-8
mutante (J. Exp. Med., 186: 785-793, 1997). Varios
otros productos génicos tales como la familia MAGE (antígeno del
melanoma) (Cancer Res., 55: 3478-3482, 1995) y SART1
(J. Exp. Med. 187: 277-288, 1998) se expresan
preferentemente tanto en células malignas como en los testículos,
pero no en otras células normales.
Existen también un gran número de antígenos
tumorales específicos del melanoma en un melanocito normal, con
inclusión de MART-1/melanA, gp100, y tirosinasa
(Oncogene Res., 1: 357-374, 1987). Por consiguiente,
los antígenos tumorales humanos son en su mayor parte no realmente
antígenos específicos de tumor, sino más bien autoantígenos que se
expresan en algunas células o tejidos normales.
Actualmente, en Europa y en los Estados Unidos,
se ha desarrollado una terapia de vacuna contra el cáncer que
activa los linfocitos T citotóxicos en un paciente de cáncer por
administración de un péptido de antígeno tumoral, y se han
comunicado los resultados de tests clínicos con respecto al antígeno
tumoral específico del melanoma. Por ejemplo, se ha observado
regresión del tumor en el 42% de los pacientes de melanoma que
recibieron la inyección subcutánea del péptido del antígeno del
melanoma gp100 e inyección intravenosa de
interleuquina-2 (IL-2) (Nature
Medicine, 4: 321-1998). Así, por utilización de un
antígeno tumoral como vacuna, puede conseguirse un tratamiento
eficaz contra el cáncer.
Sin embargo, prácticamente la totalidad de los
antígenos tumorales identificados se derivan del melanoma, y
solamente han sido publicados unos cuantos documentos acerca de
antígenos tumorales derivados del cáncer epitelial y del
adenocarcinoma, que existen con altas tasas de incidencia.
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La tasa de supervivencia de 5 años debida a tres
métodos de tratamiento principal conocidos para el cáncer (terapia
de operación, quimioterapia, y tratamiento por irradiación) era de
41% en 1998 con respecto a todas las clases de cáncer. Sin embargo,
hasta ahora es difícil aumentar la tasa de supervivencia, por lo que
se desea el desarrollo de un nuevo método de tratamiento, distinto
de los tres métodos de tratamiento principales arriba
mencionados.
El gen lck codificante de la proteína
p56^{lck}, que es una tirosinaquinasa de membrana de la familia
src, tiene un papel esencial en el desarrollo y la función de las
células T. Se ha consignado la expresión anormal del gen lck en las
células del cáncer de colon y las células pequeñas del carcinoma de
pulmón (Oncogene Res., 1: 357-374, 1987) y la
expresión aberrante en el cáncer de colon metastásico. Sin embargo,
los papeles detallados de la proteína Lck en estas células de
cáncer se desconocen todavía, aunque se ha sugerido que la proteína
Lck juega un papel importante en el proceso de la transformación
neoplástica (Cancer Res., 58: 4660-4666, 1998).
Considerando la situación arriba mencionada, la
presente invención pretende desarrollar y proporcionar un nuevo
antígeno tumoral que es reconocido por los linfocitos T citotóxicos
y es útil para la inmunoterapia específica para pacientes que
padecen cánceres de adenocarcinoma y/o epiteliales, tales como
cáncer de colon y cáncer de pulmón.
Concretamente, el propósito de la presente
invención es desarrollar y proporcionar un péptido que tiene un
epítope antigénico que es reconocido por al menos linfocitos T
citotóxicos restringidos por HLA-A2402 o
restringidos por HLA-A2, y es codificado por el gen
lck. Más detalladamente, el propósito de la presente invención es
proporcionar un péptido que es reconocido por los linfocitos T
citotóxicos restringidos por HLA-A2402 o
restringidos por HLA-A2, un polinucleótido que
codifica el péptido o una cadena complementaria del mismo, un vector
recombinante que contiene el polinucleótido, un transformante que
contiene el vector recombinante, un método para producir el
péptido, un anticuerpo contra el péptido, un compuesto que
interacciona con estas entidades y un método para cribado en busca
de dicho compuesto, una composición farmacéutica que utiliza estas
entidades, y un medio para la diagnosis que utiliza estas
entidades.
Para resolver el problema, el inventor
identificó KE4-CTL, que es un linfocito T citotóxico
restringido por HLA-A2402 y específico de tumores,
que son activados por reconocimiento de HLA-A24 y un
péptido antigénico tumoral, y OK-CTL y
GK-CTL, que son linfocitos T citotóxicos
restringidos por HLA-A2 y específicos de tumores,
que son activados por reconocimiento de HLA-A2 y un
péptido antigénico tumoral, e identificó posteriormente un antígeno
tumoral capaz de activar los linfocitos T citotóxicos específicos de
tumores a partir de una biblioteca de cDNA de la línea de células
tumorales KE utilizando el método de expresión de genes por
clonación, y finalmente encontró un péptido que tiene un epítope
del antígeno tumoral que es reconocido por los linfocitos T
citotóxicos restringidos por HLA-A2402 y/o
restringidos por HLA-A2, completando así la presente
invención.
La presente invención comprende:
- (1)
- un péptido constituido por una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, ó 17 del listado de secuencias,
- (2)
- un inductor de linfocitos T citotóxicos constituido por un péptido (1),
- (3)
- un péptido (1) para el tratamiento del cáncer,
- (4)
- una vacuna contra el cáncer, en la cual el agente activo está constituido por un péptido (1),
- (5)
- un polinucleótido que codifica el péptido (1) o una cadena complementaria del mismo,
- (6)
- un vector recombinante que comprende el polinucleótido (6) que codifica un péptido (1) o una cadena complementaria del mismo,
- (7)
- un transformante transformado con el vector recombinante (6),
- (8)
- un método para producir un péptido, que comprende un paso que consiste en cultivar el transformante (7),
- (9)
- un anticuerpo que se obtiene a partir de suero de un animal inmunizado por un péptido (1), en donde dicho anticuerpo ha sido generado contra un péptido (1),
- (10)
- un método para cribado en busca de un compuesto que es capaz de intensificar la inducción o activación de los linfocitos T citotóxicos por los péptidos (1), en donde se utiliza al menos uno que se selecciona de un grupo constituido por el péptido (1), el polinucleótido (5), el vector recombinante (6), el transformante (7), y el anticuerpo (9),
- (11)
- una composición farmacéutica que comprende en una cantidad eficaz para el tratamiento del cáncer, al menos uno seleccionado del grupo constituido por péptido (1), polinucleótido (5), vector recombinante (6), transformante (7), y anticuerpo (9),
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- (12)
- un método para fabricar un medicamento para el tratamiento del cáncer caracterizado por utilizar el inductor (2) de los linfocitos T citotóxicos, la vacuna contra el cáncer (4), o la composición farmacéutica (11),
- (13)
- un método para ensayar un péptido (1) y/o un polinucleótido que codifica el péptido utilizando un sistema de reacción antígeno-anticuerpo, sistema de reacción enzimática o sistema de reacción PCR, en donde el método permite detectar el péptido y/o el polinucleótido en un espécimen, o determinar la cantidad de péptido y/o polinucleótido en el mismo para examen clínico,
- (14)
- un kit de reactivos que comprende uno o más seleccionados del grupo constituido por el péptido (1), el polinucleótido (5), y el anticuerpo (9), y
- (15)
- un kit de reactivos utilizado para el método (13), en donde el kit comprende uno o más seleccionados del grupo constituido por el péptido (1), el polinucleótido (5), y el anticuerpo (9).
Fig. 1 ilustra la producción de
interferón-\gamma (IFN-\gamma)
por los linfocitos T citotóxicos activados restringidos por
HLA-A24 (KE4-CTL) por el
reconocimiento del producto del gen lck.
Fig. 2 ilustra la producción de
interferón-\gamma (IFN-\gamma)
por los linfocitos T citotóxicos activados restringidos por
HLA-A2 por el reconocimiento del producto del gen
lck. (A) Se utilizó la sublínea
OK-CTL-e como los CTLs restringidos
por HLA-A2. (B) Se utilizó la sublínea
GK-CTL2-2-4 como los
CTLs restringidos por HLA-A2. (C) Se utilizó la
sublínea GK-CTL2-2-5
como los CTLs restringidos por HLA-A2.
Fig. 3 ilustra una cantidad del
interferón-\gamma (IFN-\gamma)
producido a partir de KE-CTLs estimulados por
células C1R/A2402 pulsadas con un péptido derivado de Lck.
Fig. 4 ilustra la activación dependiente de la
dosis de KE-CTLs por el péptido derivado de
Lck.
Fig. 5 ilustra el fenotipo y la restricción por
el MHC de KE-CTLs confirmada por testado del
reconocimiento del péptido por KE-CTLs en presencia
de diversos anticuerpos. (A) Se utilizó Lck208-216
como péptido derivado de Lck. (B) Se utilizó Lck486 como péptido
derivado de Lck. (C) Se utilizó Lck488-497 como
péptido derivado de Lck.
Fig. 6 ilustra la diferencia en el
reconocimiento de péptidos entre las sublíneas
KE4-CTL. (A) Se utilizó la sublínea #19. (B) Se
utilizó la sublínea #49. (C) Se utilizó la sublínea #93. (D) Se
utilizó el clon #80.
Fig. 7 ilustra que un péptido derivado de Lck
puede inducir linfocitos T citotóxicos restringidos por
HLA-A24 a partir de células mononucleares de sangre
periférica (PBMCs) de un paciente de cáncer. El
IFN-\gamma producido a partir de CTLs se
investigó como indicador de la inducción, utilizando células
tumorales tales como KE-4
(HLA-A24^{+}), SW620
(HLA-A24^{+}), y COLO201
(HLA-A24^{-}) como células diana.
Fig. 8 ilustra la actividad citotóxica de CTLs
inducida por un péptido derivado de Lck contra diversas células
tumorales. La actividad se examinó por el test de liberación de
^{51}Cr. (A) Se utilizó Lck488-497 como el
péptido. (B) Se utilizó Lck208-216 como el
péptido.
Fig. 9 ilustra la especificidad de CTLs
inducidos por un péptido procedente de células mononucleares de
sangre periférica (PBMCs) de un paciente con cáncer de colon contra
el péptido. (A) No se utilizó péptido alguno en la estimulación
preliminar de PBMCs de un paciente de cáncer. (B) Se utilizó
Lck208-216 como el péptido en la estimulación
preliminar de las PBMCs de un paciente de cáncer. (C) Se utilizó
Lck486-494 como el péptido en la estimulación
preliminar de las PBMCs de un paciente de cáncer. (D) Se utilizó
Lck488-497 como el péptido en la estimulación
preliminar de las PBMCs de un paciente de cáncer.
Fig. 10 ilustra el fenotipo y la restricción por
el MHC de CTLs inducidos confirmada por investigación la inducción
de los CTLs de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de
un paciente con cáncer de colon por un péptido en presencia de cada
uno de diversos anticuerpos.
Fig. 11 ilustra la frecuencia de las células
precursoras de CTL inducidas por un péptido en células mononucleares
de sangre periférica (PBMCs) de un paciente con cáncer de colon. La
abscisa indica el número de CTLs añadidos por pocillo. La ordenada
indica la fracción de cultivo negativo. Con respecto a la ordenada,
"1" indica que los CTLs no son inducidos, por lo que el 100%
de las células diana a lisar por los CTLs sobrevivían, "0,2"
indica que todas las células diana eran destruidas (frecuencia de
las células precursoras de CTL = 1/96).
Fig. 12 ilustra la activación de
KE4-CTLs por un péptido derivado de la familia
Src.
Fig. 13 ilustra el resultado del análisis de la
capacidad de activación de CTL restringidos por
HLA-A2 de un péptido derivado de Lck. (A) Se
utilizó la línea OK-CTL como el CTL restringido por
HLA-A2. (B) Se utilizó la sublínea
GK-CTL2-2-4 como el
CTL restringido por HLA-A2.
Fig. 14 ilustra la activación dependiente de la
dosis de CTLs restringidos por HLA-A2 de un péptido
derivado de Lck. (A) Se utilizó la sublínea
OK-CTL-e como CTLs. (B) se utilizó
la sublínea
GK-CTL2-2-4 como
CTLs. (C) Se utilizó la sublínea
GK-CTL2-2-5 como
CTLs.
Fig. 15 indica que el péptido derivado de Lck
puede inducir linfocitos T citotóxicos restringidos por
HLA-A2 a partir de células mononucleares de sangre
periférica (PBMCs) de un paciente de cáncer. (A) La inducción de
CTLs por las PBMCs derivadas del paciente con cáncer de colon (caso
1) se investigó utilizando la producción de
IFN-\gamma como indicador. (B) La inducción de
CTLs del paciente con cáncer de colon (caso 1) se confirmó por el
test de citotoxicidad. (C) La inducción de CTLs por PBMCs derivadas
del paciente con cáncer de colon (caso 2) se investigó utilizando
la producción de IFN-\gamma como indicador. (D) La
inducción de CTLs del paciente con cáncer de colon (caso 2) se
confirmó por el test de citotoxicidad.
El inventor ha venido interesándose por
HLA-A24, que es un tipo de molécula
HLA-A encontrada en muchos japoneses, y ha
identificado linfocitos T citotóxicos específicos de tumores
restringidos por HLA-A 2402
(KE4-CTL) que son activados por reconocimiento del
HLA-A24 y un péptido antigénico tumoral procedente
de un paciente de cáncer de esófago (Int. J. Cancer,
81:459-466, 1999). Utilizando los linfocitos T
citotóxicos como efector, se identificó a partir de una biblioteca
de cDNA de una línea de células tumorales KE identificó un antígeno
tumoral capaz de activar las células por el método de expresión de
genes por clonación. La activación de los linfocitos T citotóxicos
se investigó por medida del interferón-\gamma
(IFN-\gamma) producido por los linfocitos T
citotóxicos utilizando un kit de ensayo de inmunosorbente unido a
enzima (ELISA).
Como resultado, se encontró que un clon de cDNA
es reconocido por los KE4-CTLs restringidos por
HLA-A24, y activa los KE4-CTLs
(véase Fig. 1), y que la secuencia de nucleótidos del clon de cDNA
tiene una longitud de 1750 pares de bases (pb) y tiene una
homología para la posición 283-2032 de 100% en la
secuencia de nucleótidos del gen lck. La secuencia de nucleótidos
del gen lck en esta posición corresponde a la secuencia de
aminoácidos de la posición 31-506, que es
prácticamente la totalidad de la parte de la proteína Lck
constituida por 509 aminoácidos.
A saber, una célula, que se hizo que expresara
el gen lck y HLA-A2402 por la técnica de ingeniería
genética, activaba KE-CTLs, con lo que se confirmó
la proteína codificada por el gen lck es un antígeno tumoral capaz
de activar los CTLs restringidos por HLA-A2402.
Adicionalmente, la proteína Lck demostró ser un
antígeno tumoral capaz de activar no sólo los CTLs restringidos por
HLA-A24 sino también CTLs restringidos por
HLA-A2, por la investigación en que se utilizaron
tres CTLs restringidos por HLA-A2, es decir, las
líneas CTL identificadas a partir de un paciente con cáncer de colon
[sublínea OK-CTL-e
(HLA-A0207)] (J. Immunol.,
163:4999-5004, 1999) y líneas CTL identificadas a
partir de un paciente de cáncer de pulmón [sublínea
GK-CTL2-2-4 y
GK-CTL2-2-5
(HLA-A0206)] de manera similar a la arriba descrita
(véase Fig. 2).
Así pues, el gen lck demostró codificar un
epítope antigénico tumoral reconocido por los linfocitos T
citotóxicos restringidos por HLA-A24 o restringidos
por HLA-A2 y específicos de tumores.
La expresión de Lcks (56 kD y 59 kD) al nivel de
proteínas en diversas células y tejidos se examinó por el análisis
de transferencia Western utilizando un anticuerpo monoclonal
anti-Lck.
Se detectaron proteínas Lck tanto en células
mononucleares de sangre periférica (PBMCs) no estimuladas como en
PBMCs activados por fitohemaglutinina (PHA-blastos).
Adicionalmente, se detectaron proteínas Lck en las siete líneas de
células de cáncer de colon testadas, y en las líneas de células
tumorales malignas, tales como cáncer de esófago, cáncer de pulmón,
cáncer gástrico, y cáncer uterino, así como en la mayor parte de
los tejidos tumorales recientes obtenidos de diversos órganos, que
incluían cáncer de colon, cáncer de esófago, cáncer de pulmón,
cáncer de útero, y tumor cerebral primario. Se detectaron también en
la parte no tumoral de tejido de colon, tejido de esófago, y tejido
uterino (Tabla 1).
Con objeto de obtener un péptido capaz de
fijarse a la molécula HLA-A2402 derivada de la
proteína Lck, se buscó en la bibliografía un péptido que tuviera un
motivo de fijación HLA-A24, y se sintetizaron luego
13 péptidos (9-meros y 10-meros)
basándose en la secuencia constituida por 509 aminoácidos del
producto del gen lck (Nature, 319: 682-685, 1986).
Algunos aminoácidos en algunos de estos 13 péptidos se emplearon en
sustitución del producto del gen lck.
Se seleccionó un péptido antigénico tumoral
capaz de activar los linfocitos T citotóxicos a partir de 13
péptidos por ensayo del IFN-\gamma producido por
los CTLs como indicador para su acción activadora de CTL.
Entre estos péptidos, tres péptidos
[(Lck208-216 (SEQ ID NO: 3),
Lck486-494 (SEQ ID NO: 1),
Lck488-497 (SEQ ID NO: 2)] exhibían capacidad
activadora de CTL, e intensificaban la producción de
IFN-\gamma por CTLs (véase Fig. 3). La capacidad
activadora de CTL de Lck486-494 (SEQ ID NO: 1) o
Lck488-497 (SEQ ID NO: 2) demostraba una
dependencia de la dosis, que se detectaba a 1 nM poco más o menos.
Por el contrario, la actividad de Lck208-216 (SEQ
ID NO: 3) se detectaba a 100 nM o concentración mayor (véase Fig.
4).
La activación de KE4-CTLs por
estos 3 péptidos era inhibida por anti-CD3,
anti-CD8, y el anticuerpo monoclonal
anti-MHC clase I, pero no era inhibida por
anti-CD4, anti-MHC clase II y el
anticuerpo monoclonal anti-CD13. Por consiguiente,
los KE4-CTLs demostraron tener un fenotipo
CD3^{+}, CD8^{+}, y CD4^{-}.
Tres péptidos que activan
KE-CTLs restringidos por HLA-A24 de
una manera dependiente de la dosis [Lck208-216 (SEQ
ID NO: 3), Lck486-494 (SEQ ID NO: 1), o
Lck488-497 (SEQ ID NO: 2)] inducían también CTLs
restringidos por HLA-A24 contra las líneas de
células tumorales (KE4, SW620 y COLO201) que expresaban Lck de
células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) obtenidas de un
paciente con cáncer de colon.
A saber, cuando la estimulación se llevó a cabo
in vitro tres veces utilizando Lck208-216
(SEQ ID NO: 3), Lck486-494 (SEQ ID NO: 1), o
Lck488-497 (SEQ ID NO: 2), y utilizando
ulteriormente PBMCs autólogos irradiados con un péptido
correspondiente como células presentadoras de antígeno (APCs),
especialmente las PBMCs estimuladas por Lck486-494
(SEQ ID NO: 1) o Lck488-497 (SEQ ID NO: 2) producían
una mayor cantidad de IFN-\gamma en la reacción
contra la célula tumoral HLA-A24^{+} (KE4 y SW620)
que en la reacción contra la célula tumoral
HLA-A24^{-} (COLO201).
Por otra parte, partiendo de PBMCs obtenidas de
un donante sano, los CTLs restringidos por HLA-A24
no eran inducidos por estos tres péptidos, cuando la estimulación
se realizó utilizando PBMCs autólogas irradiadas pulsadas con uno
de estos tres péptidos como células presentadoras de antígeno
(APCs). (Véase la Tabla 3). Sin embargo, cuando la estimulación se
llevó a cabo utilizando células dendríticas (DCs) que se pulsaron
con un péptido como APCs, estos tres péptidos inducían CTLs
restringidos por HLA-A24 a partir de PBMCs obtenidas
de un donante sano.
Adicionalmente, la actividad de CTL inducida por
el péptido arriba mencionado se confirmó por el test de liberación
de ^{51}Cr. Las PBMCs estimuladas con estos tres péptidos
derivados de Lck lisaban las células tumorales KE
HLA-A24^{+} y las células tumorales SW620, pero no
lisaban los linfocitos T HLA-A24^{+} activados por
PHA obtenidos de un donante sano o las células tumorales
HLA-A24^{-} COLO201.
Los péptidos arriba mencionados derivados de Lck
podían inducir linfocitos T citotóxicos restringidos por
HLA-A24 y específicos de tumores en PBMCs de un
paciente con cáncer de colon. Adicionalmente, un péptido derivado
de Lck no podía inducir actividad de CTL restringidos por
HLA-A24 contra una célula tumoral con respecto a
PBMCs de un donante sano. Estos resultados sugieren que los
linfocitos T en la sangre periférica de un donante sano son
inmunológicamente tolerantes a Lck. El péptido Lck de acuerdo con la
presente invención puede inducir CTLs en las PBMCs de un paciente
con cáncer de colon.
Entre los tres péptidos arriba mencionados
capaces de inducir CTLs que reconocen la línea de células tumorales
HLA-A24^{+}, se encontraron dos péptidos que
tienen homología en las secuencias de aminoácidos, a saber
Lck486-494 (SEQ ID NO: 1) (TFDYLRSVL) y
Lck488-497 (SEQ ID NO: 2) (DYLRSVLEDF) (la secuencia
de aminoácidos se da tanto en símbolos de una sola letra como en
símbolos de tres letras más adelante). Se asume que los CTLs que
reconocen la secuencia de aminoácidos DYLRSV, que es una región
común para los dos péptidos como epítope, tienen relevancia para el
rechazo de los tumores.
La búsqueda de un péptido que tenga homología
con la secuencia de aminoácidos reveló que algunas
tirosina-quinasas pertenecientes a la familia Src
que incluye Lck (Ann. Rev. Biochem. 54: 897-930
(1985) contienen un péptido homólogo (véase Tabla 5).
Los péptidos que se sintetizaron basados en la
secuencia de aminoácidos de un péptido derivado de la familia Src,
a saber,Src511-519 (SEQ ID NO:4) (TFEYLQAFL),
Yes508-516 (SEQ ID NO:5) (TFEYIQSFL),
Fyn512-520 (SEQ ID NO:6) (TFEYLQSFL),
Lyn489-497 (SEQ ID NO:7) (TFDYLQSVL),
Hck503-511 (SEQ ID NO:8) (TFEYIQSVL), y
Blk482-490 (SEQ ID NO:9) (TFEFLQSVL) exhibían
también capacidad para activar CTLs restringidos por
HLA-A24 que es comparable a un péptido derivado de
Lck o más.
Los péptidos de acuerdo con la presente
descripción incluyen también un péptido que tiene la secuencia de
aminoácidos que se representa por la fórmula siguiente deducida por
la secuencia de aminoácidos del péptido homólogo arriba mencionado,
y es reconocida al menos por los linfocitos T citotóxicos
restringidos por HLA-A2402:
- Thr-Phe-Xaa-Xbb-Xcc-Xdd-Xee-Xff-Leu-Xgg-Asp-Xhh-Xii, en donde Xaa es Asp o Glu, Xbb es Tyr o Phe, Xcc es Leu o Ile, Xdd es Arg o Gln, Xee es Ser o Ala, Xff es Val o Phe, Xgg es Glu o Asp, Xhh es Phe o Tyr, y Xii es Phe o Tyr.
El péptido arriba mencionado derivado de la
familia Src podría inducir linfocitos T citotóxicos restringidos
por HLA-A24 a partir de PBMCs obtenidas de un
paciente con cáncer. A saber, PBMCs obtenidas de un paciente con
cáncer que se estimularon con un péptido derivado de la familia Src
reaccionaban con las células KE4 y las células WD620 para producir
IFN-\gamma. La producción de
IFN-\gamma a partir de PBMCs fue inducida por
Lck486-494 (SEQ ID NO: 1, cuatro casos entre siete
casos de pacientes con cáncer), Src511-519 (SEQ ID
NO: 4, dos casos entre tres casos), Yes508-516 (SEQ
ID NO: 5, un caso entre tres casos), Fyn512-520 (SEQ
ID NO: 6, un caso entre dos casos), Hck503-511 (SEQ
ID NO: 8, dos casos entre dos casos), y Blk482-490
(SEQ ID NO: 9, un caso entre dos
casos).
casos).
Tres péptidos Lck y péptidos derivados de la
familia Src de acuerdo con la presente invención pueden inducir
linfocitos T citotóxicos restringidos por HLA-A24 y
específicos de tumores en PBMCs de un paciente con cáncer de colon.
Por tanto, los péptidos de acuerdo con la presente invención pueden
utilizarse como agente para inducir linfocitos T citotóxicos
específicos de tumores y como método para inducir linfocitos T
citotóxicos específicos de tumores. Adicionalmente Lck se detecta
en la mayoría de los tejidos de cáncer con inclusión de colon,
pulmón y esófago. El alelo HLA-A24 se detecta en
aproximadamente el 60% de la población japonesa (en una mayoría,
igual a 95%, el genotipo es A2402), 20% de los caucasianos, y 12% de
los africanos (HLA 1991, vol. 1: 1065-1220, Oxford:
Oxford Scientific Publications, 1992). Por tanto, los péptidos de
acuerdo con la presente invención pueden utilizarse en la
inmunoterapia específica para un número relativamente grande de
paciente de cáncer.
Dado que la proteína Lck es reconocida también
por CTLs restringidos por HLA-A2, se buscó en la
bibliografía un péptido que tuviera un motivo de fijación
HLA-A2 a fin de obtener péptidos derivados de Lck
capaces de fijarse a la molécula HLA-A2, y se
sintetizaron 24 clases de péptidos (9-meros y
10-meros) basados en la secuencia constituida por
509 aminoácidos del producto del gen lck (Nature, 319:
682-685, 1986). Se investigó la capacidad de cada
péptido para la activación de CTL ensayando el
IFN-\gamma producido a partir de los CTLs como
indicador, utilizando la línea OK-CTL o
GK-CTL sublínea
2-2-4 como CTL. Entre estos
péptidos, siete péptidos [Lck61-69 (SEQ ID NO:11),
Lck246-254 (SEQ ID NO:12),
Lck294-303 (SEQ ID NO:13),
Lck340-348 (SEQ ID NO:14),
Lck347-355 (SEQ ID NO:15),
Lck422-430 (SEQ ID NO:16), o
Lck492-500 (SEQ ID NO:17)] podían activar CTLs, e
intensificaban la producción de IFN-\gamma por
los CTLs [véanse Figs. 13(A) y (B)]. Parecía existir una
dependencia de la dosis en cuanto a la capacidad de
Lck61-69 (SEQ ID NO:11), Lck246-254
(SEQ ID NO:12), o Lck422-430 (SEQ ID NO:16) para
activar los CTLs [véanse Figs. 14(A), (B) y (C)].
Adicionalmente, entre tres péptidos que activan
los CTLs restringidos por HLA-A2 con una dependencia
de la dosis [Lck61-69 (SEQ ID NO:11),
Lck246-254 (SEQ ID NO:12), y
Lck422-430 (SEQ ID NO:16)],
Lck246-254 (SEQ ID NO:12) o
Lck422-430 (SEQ ID NO:16) inducían CTLs restringidos
por HLA-A2 contra las líneas de células tumorales
Panc-1 y SW620 de las PBMCs de un paciente con
cáncer de colon metastásico.
A saber, cuando se estimularon in vitro
tres veces con uno de estos tres péptidos PBMCs de un paciente con
cáncer de colon metastásico y a continuación, utilizando PBMCs
autólogos irradiados pulsados con un péptido correspondiente como
células presentadoras de antígeno (APCs), las PBMCs del paciente con
cáncer de colon que se estimularon con Lck246-254
(SEQ ID NO: 12) o Lck422-430 (SEQ ID NO: 16) no
reaccionaban con la línea de células COLO320 del cáncer de colon
HLA-A2^{-} pero sí lo hacían con la línea de
células SW620 del cáncer de colon HLA-A2^{+} y la
línea de células Panc-1 del cáncer de páncreas
HLA-A2^{+} para producir
IFN-\gamma [véanse Figs. 15 (A) y (C)] y lisaban
las células tumorales HLA-A2^{+} [véanse Figs. 15
(B) y (D)].
Lck246-254 (SEQ ID NO: 12) y
Lck422-430 (SEQ ID NO: 16) podían inducir CTLs
restringidos por HLA-A24 no sólo a partir de PBMCs
obtenidas de un paciente con cáncer de colon sino también de PBMCs
obtenidas de un paciente con cáncer metastásico de pulmón y un
paciente con cáncer de esófago. La inducción de CTLs restringidos
por HLA-A2 se investigó utilizando la producción de
IFN-\gamma contra la línea de células SW620 del
cáncer de colon HLA-A2^{+} como indicador. Se
indujeron CTLs restringidos por HLA-A2 en PBMCs por
Lck246-254 (SEQ ID NO: 12, dos casos entre seis
casos de pacientes de cáncer) o Lck422-430 (SEQ ID
NO: 16, tres casos entre seis casos de pacientes de cáncer) (véase
la Tabla 8). Por consiguiente, estos tres péptidos pueden utilizarse
como inductores para y en un método para inducir linfocitos T
citotóxicos. Adicionalmente, el alelo HLA-A2 se
encuentra en aproximadamente el 40% de la población japonesa, el 49%
de los caucasianos del norte, el 38% de los caucasianos del sur, el
23% de los africanos, y el 53% de los chinos (HLA 1991, vol. 1:
1065-1220, Oxford Scientific Publications, 1992).
Por consiguiente, estos péptidos son aplicables para uso en la
inmunoterapia específica para un número relativamente grande
de
pacientes.
pacientes.
Un péptido de acuerdo con la presente invención
es un péptido constituido por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID
NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, ó 17 en el
listado de secuencias. El péptido de acuerdo con la presente
invención puede inducir o activar células T citotóxicas restringidas
por HLA-A24 o restringidas por
HLA-A2.
El péptido capaz de inducir o activar linfocitos
T citotóxicos restringidos por HLA-A24 puede
seleccionarse por el método descrito a continuación.
Un péptido de acuerdo con la presente invención
puede ser un péptido capaz de inducir y/o activar CTLs restringidos
tanto por HLA-24 como restringidos por
HLA-2.
Basándose en péptidos así especificados,
utilizando como índice al menos la fuerza de la propiedad de
reconocimiento por los linfocitos T citotóxicos restringidos por
HLA-A2402 y/o restringidos por
HLA-A2, los péptidos descritos en esta memoria
pueden tener también secuencias de aminoácidos con mutación o
mutación inducida por ejemplo por deleción, sustitución, y adición
de uno o más aminoácidos. La mutación o mutación inducida por
ejemplo por deleción, sustitución y adición puede introducirse por
medios bien conocidos tales como la técnica de Ulmer (Ulmer, L.M.
Science, 219, 666, 1983). Adicionalmente, puede hacerse cierta
modificación en estos péptidos disponibles, hasta el punto que ello
no cause un cambio notable en su función, por ejemplo, modificación
del grupo amino o grupo carboxilo constitutivo.
Con respecto a la proteína codificada por el gen
lck, se conocen algunas variantes que tienen una secuencia de
aminoácidos diferente en parte, que se supone están basadas en el
polimorfismo (Nature, 319: 682-685, 1986; Eur. J.
Immunol., 16: 1643-1646, 1986; J. Cell. Biochem.,
38, 117-126, 1988; Gene, 84:
105-113, 1989). Péptidos que se derivan del
producto del gen lck y que tienen una secuencia de aminoácidos
diferente pueden inducir CTLs restringidos por
HLA-A24 y/o restringidos por
HLA-A2.
Por ejemplo, Lck488-497, que es
uno de los péptidos de acuerdo con la presente invención, tiene la
secuencia de aminoácidos DYLRSVLEDF descrita en SEQ ID NO: 2 del
listado de secuencias, mientras que la secuencia de aminoácidos de
la posición 488-497 basada en la secuencia de
aminoácidos de la proteína Lck registrada en Nature, 319:
682-685, 1986 es DYLRSVLDDF, que está incluida
también en el motivo de fijación HLA-A24.
Los péptidos de acuerdo con la presente
invención son péptidos antigénicos tumorales capaces de inducir y/o
activar linfocitos T citotóxicos restringidos por
HLA-A24 y/o restringidos por HLA-A2
específicos de tumores, y pueden utilizarse para inducir y/o
activar linfocitos T citotóxicos específicos de tumores.
Especialmente, los péptidos de acuerdo con la presente invención
pueden utilizarse para la inmunoterapia específica del cáncer, por
ejemplo como una vacuna contra el cáncer.
Los polinucleótidos y cadenas complementarias de
los mismos de acuerdo con la presente invención son polinucleótidos
que codifican los aminoácidos de los péptidos de SEQ ID NO: 1, 2, 3,
4, 5, 6, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, ó 17. En el caso en que la
molécula del polinucleótido es una molécula de DNA, puede obtenerse
``una molécula de DNA que se hibrida a una molécula de DNA en
condiciones severas, por ejemplo, por el método descrito en la
referencia "Molecular Cloning" arriba mencionada. "Hibridarse
en condiciones severas" significa en esta memoria que se observa
todavía una señal de hibridación positiva incluso después, por
ejemplo, de incubación a 42ºC en una solución que contiene 6xSSC,
0,5% SDS y 50% formamida, seguido por lavado a 68ºC en una solución
que contiene 0,1xSSC y 0,5% SDS.
Los polinucleótidos de acuerdo con la presente
invención proporcionan la información genética útil para producir
péptidos de acuerdo con la presente invención, y pueden utilizarse
también como reactivos y estándares de ácido nucleico.
La presente invención puede proporcionar
péptidos de acuerdo con la presente invención por la técnica de
recombinación genética utilizando hospedadores bien conocidos tales
como Escherichia coli, levadura, Bacillus subtilis,
células de insecto, y retrovirus. Se ha confirmado que los péptidos
de acuerdo con la presente invención son reconocidos por los
linfocitos T citotóxicos como una proteína simple, y no es necesaria
la glicosilación de una proteína, por lo que puede seleccionarse
fácilmente un hospedador considerando únicamente la productividad
en la producción por la técnica de recombinación genética.
Para la transformación es aplicable un método
bien conocido, por ejemplo, la utilización de plásmidos, cromosomas,
virus, etcétera, cuando puede llevarse a cabo una transformación de
replicón de un hospedador. Como un sistema más preferible, puede
utilizarse la integración en un método cromosómico considerando la
estabilidad del gen. Sin embargo, puede utilizarse simplemente el
sistema de replicación autónoma utilizando un plásmido. Se
seleccionan vectores considerando la clase del hospedador
seleccionado, y consisten en una secuencia génica a expresar y un
gen que tiene una porción funcional de replicación y regulación.
Pueden utilizarse en combinación promotores, sitios de fijación de
ribosoma, terminadores, secuencias señal, intensificadores y
análogos, seleccionándose la combinación dependiendo de si el
hospedador es un procariota o un eucariota.
Los transformantes pueden cultivarse en
condiciones bien conocidas adecuadas para cada hospedador. El
péptido se produce por el subcultivo o cultivo de lotes utilizando
la cantidad del transformante en el medio o la actividad
fisiológica del péptido a expresar/producir, particularmente la
propiedad de reconocimiento por los linfocitos T citotóxicos como
índice.
Los péptidos de acuerdo con la presente
invención pueden producirse también por el método conocido en la
química general de los péptidos. Pueden citarse como ejemplos
"Peptide Synthesis, Maruzen, 1975" y "Peptide Synthesis",
Interscience, Nueva York 1996'', pero son aplicables en general
métodos conocidos.
Los péptidos de acuerdo con la presente
invención pueden purificarse/recogerse por una combinación de
cromatografía por filtración de gel, cromatografía iónica en
columna, cromatografía de afinidad, y métodos análogos utilizando
la propiedad de reconocimiento por los linfocitos T citotóxicos como
índice, o por el fraccionamiento basado en su solubilidad
utilizando sulfato de amonio, alcohol, y análogos. Se utiliza más
preferiblemente un método para adsorber/recoger específicamente un
péptido por un anticuerpo policlonal o anticuerpo monoclonal, que
está preparado contra el péptido.
Anticuerpos que reconocen inmunológicamente los
péptidos de acuerdo con la presente invención pueden prepararse por
métodos bien conocidos de preparación de anticuerpos, por ejemplo,
por administración de un péptido de acuerdo con la presente
invención a un animal en presencia o ausencia de un adyuvante con o
sin enlace a un portador a fin de inducir la respuesta inmunitaria
tal como respuesta humoral y/o respuesta celular. Puede utilizarse
cualquier portador con tal que el mismo no sea dañino para el
hospedador, tal como celulosa, aminoácidos polimerizados, y
albúmina. Como animal inmunizado, se utiliza preferiblemente un
ratón, rata, conejo, cabra, caballo, etcétera.
Pueden obtenerse anticuerpos policlonales a
partir del suero de un animal inmunizado por los péptidos de acuerdo
con la presente invención por métodos bien conocidos,
preferiblemente, tales como cromatografía de inmunoafinidad.
Los anticuerpos monoclonales se producen por
recogida de células productoras de anticuerpos a partir del animal
inmunizado arriba mencionado, seguido por introducción de un medio
de transformación bien conocido con células que pueden proliferar
indefinidamente.
Los anticuerpos policlonales o anticuerpos
monoclonales así obtenidos pueden utilizarse como anticuerpos para
purificación de los péptidos de acuerdo con la presente invención, o
como reactivos, marcadores de identificación, etcétera.
Los péptidos de acuerdo con la presente
invención, polinucleótidos que codifican los péptidos y cadenas
complementarias de los mismos, células transformadas basadas en la
información concerniente a estas secuencias de aminoácidos y
secuencias de nucleótidos, y anticuerpos que reconocen
inmunológicamente los péptidos de acuerdo con la presente
invención, o una combinación de éstos, proporcionan un medio
efectivo para cribado en busca de un compuesto capaz de inducir o
activar los linfocitos T citotóxicos. El método de cribado puede
construirse utilizando un sistema de cribado bien conocido para
compuestos médicos. Los compuestos obtenidos por el método de
cribado de acuerdo con la presente invención son también objetos de
la presente invención. Tales compuestos pueden ser compuestos que
mejoran las propiedades de reconocimiento de péptidos de acuerdo con
la presente invención por CTLs restringidos por
HLA-A2402 y/o restringidos por
HLA-A2, compuestos que intensifican la expresión
por la interacción con polinucleótidos de acuerdo con la presente
invención, compuestos capaces de inducir o activar linfocitos T
citotóxicos de una manera similar a los péptidos de acuerdo con la
presente invención, o compuestos que intensifican la inducción o
activación de CTLs por los péptidos de acuerdo con la presente
invención.
La presente invención proporciona composiciones
farmacéuticas que contienen uno o más de los siguientes: péptidos
de acuerdo con la presente invención, polinucleótidos que codifican
los péptidos y cadenas complementarias de los mismos, vectores
preparados basados en estas secuencias de aminoácidos y secuencias
de nucleótidos, células transformadas por los vectores, anticuerpos
generados contra los péptidos de acuerdo con la presente invención,
compuestos que intensifican las propiedades de reconocimiento de los
CTLs restringidos por HLA-A2402 y/o restringidos
por HLA-A2 de acuerdo con la presente invención.
Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con
la presente invención son útiles para el tratamiento de
cánceres.
Por ejemplo, una composición farmacéutica que
contiene uno o más péptidos de acuerdo con la presente invención
puede utilizarse, por ejemplo, como vacuna contra el cáncer. En tal
caso, a fin de activar la inmunidad mediada por las células, puede
utilizarse un péptido de acuerdo con la presente invención en
presencia o ausencia de un adyuvante apropiado con o sin enlace a
un portador. Puede utilizarse cualquier portador con tal que el
mismo no sea dañino para el cuerpo humano, tal como celulosa,
aminoácidos polimerizados, y albúmina. La composición puede
encontrarse en una forma apropiada por aplicación de un método bien
conocido para una preparación de péptidos. El nivel de dosificación
depende de la propiedad de reconocimiento por los linfocitos T
citotóxicos, y generalmente es de 0,01 mg a 100 mg/día/adulto,
preferiblemente 0,1 mg/ a 10 mg/día/adulto (como cantidad de la
sustancia que tiene la actividad). Una dosis de este tipo puede
administrarse una sola vez cada varios días o varios meses.
Alternativamente, una acción eficaz de una
vacuna contra el cáncer puede obtenerse también por recogida de una
fracción de células mononucleares de la sangre periférica de un
paciente, cultivo de la fracción con un péptido de acuerdo con la
presente invención, seguido por devolución de la fracción de células
mononucleares que contiene los CTLs inducidos a la sangre del
paciente. Las condiciones de cultivo tales como la concentración de
células mononucleares y la concentración del péptido cuando se
cultivan las mismas pueden ser determinadas fácilmente por
experimentos comunes. Adicionalmente, pueden añadirse al medio
sustancias que tienen capacidad de gobernar el crecimiento de los
linfocitos, tales como interleuquina-2.
Los polinucleótidos que codifican los péptidos
de acuerdo con la presente invención y cadenas complementarias de
los mismos son útiles para la terapia génica del cáncer. Pueden
utilizarse tanto un método en el cual estos DNAs son transportados
en un vector, y se introducen directamente in vivo, como un
método en el cual se recogen células de un donante, seguido por
introducción de DNAs que son transportados en un vector in
vitro. Entre los vectores tales como retrovirus, adenovirus, y
virus vaccinia, se recomiendan los relacionados con retrovirus. Ni
que decir tiene que estos virus tienen un defecto de replicación. La
cantidad de administración de un polinucleótido que codifica un
péptido de acuerdo con la presente invención puede depender de la
propiedad de reconocimiento por el linfocito T citotóxico, pero
generalmente es de 0,1 \mug a 100 mg/día/adulto, preferiblemente 1
\mug a 50 mg/día/adulto. Esta dosis puede administrarse una sola
vez cada varios días hasta una vez cada varios meses.
Los péptidos de acuerdo con la presente
invención son útiles como método para diagnosticar enfermedades que
están relacionadas con la expresión de los péptidos (particularmente
cáncer del sistema digestivo). La diagnosis se lleva a cabo por
ensayo de la cantidad de una secuencia de ácido nucleico
correspondiente utilizando la interacción/reactividad con la
secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido y/o determinando
la distribución tisular del péptido en un individuo y/o
determinando la presencia y cantidad del péptido en un espécimen
derivado de un individuo. Particularmente, un péptido de acuerdo
con la presente invención debe ensayarse como el marcador de
diagnosis. El método de ensayo puede estar basado en sistemas de
reacción antígeno-anticuerpo bien conocidos,
sistemas de reacción enzimática, sistemas de reacción PCR, etcétera.
La presente invención incluye también un kit de reactivos utilizado
para el método de diagnosis arriba mencionado. El kit de reactivos
de acuerdo con la presente invención puede contener uno o más de
los siguientes de acuerdo con la presente invención: péptidos,
polinucleótidos que codifican los péptidos, y/o anticuerpos
generados contra los péptidos.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención puede ilustrarse en
detalle con los ejemplos que siguen, pero sin limitarse a los
mismos.
Con objeto de obtener un antígeno tumoral capaz
de activar los linfocitos T citotóxicos, se utilizaron como
estimulante células VA13 transfectadas con un total de 10^{5}
clones de cDNA preparados a partir de una biblioteca de cDNA de
células tumorales KE4 junto con HLA-A2402, y se
co-cultivaron con CTLs para dar un clon de cDNA que
activa los CTLs. La activación de CTLs se ensayó utilizando la
producción de IFN-\gamma como indicador. Este
método permite identificar un gen que codifica un antígeno de
rechazo de tumores (J. Exp. Med. 187: 277-288,
1988).
Específicamente, los CTLs utilizados como
células efectoras eran linfocitos T citotóxicos restringidos por
HLA-A2402 (KE4-CTL) específicos de
tumores, que se identificaron a partir de un paciente con carcinoma
de esófago (Int. J. Cancer, 81: 457-466, 1999).
Adicionalmente, con objeto de obtener un antígeno tumoral, el RNA
poli(A)^{+} de las células tumorales KE4 se
convirtió en cDNA, y se ligó a un adaptador SalI para inserción en
el vector de expresión pSV-SPORT-1
(GIBCO BRL). Se obtuvo cDNA de HLA-A2402 o
HLA-A0201 (control) por PCR de transcripción
inversa (RT-PCR), y se clonó en el vector de
expresión eucariota pCR3 (Invitrogen). 200 ng de una agrupación de
DNA plasmídico o clones de la biblioteca de cDNA KE4 y 200 ng de
cDNA de HLA-A2402 se mezclaron con 1 \mul de
lipofectina en 70 \mul de OPTI-MEM (GIBCO BRL)
durante 15 min.
Se añadió luego una porción de 30 \mul de la
mixtura a células VA13 (2x10^{4}) y se incubó durante 5 h. Se
añadieron a continuación 200 \mul de medio
RPMI-1640 que contenía 100% de FCS, y la mezcla se
cultivó durante dos días seguido por la adición de
KE4-CTLs (10^{4} células/pocillo). Después de 18
horas de incubación, se recogieron 100 \mul del sobrenadante para
medir IFN-\gamma por un kit ELISA como se ha
descrito previamente (J. Exp. Med. 187: 277-288,
1998).
Como resultado, se encontró un clon (clon 21)
que activaba los KE4-CTLs restringidos por
HLA-A24 (Fig. 1). La secuencia de nucleótidos de
este clon de cDNA demostró tener una longitud de 1750 pb, y tenía
una homología de 100% con la del gen lck en posición
283-2032 que corresponde a la secuencia de
aminoácidos de la posición 31-506 de la proteína
Lck constituida por 509 aminoácidos. Específicamente, se sugirió que
la proteína codificada por el gen lac es un antígeno tumoral capaz
de activar CTLs de una manera restringida por
HLA-A2202.
Adicionalmente, se ha demostrado también que la
proteína Lck es un antígeno tumoral capaz de activar no sólo CTLs
restringidos por HLA-A24, sino también CTLs
restringidos por HLA-A2 utilizando tres CTLs
restringidos por HLA-A2, a saber, la sublínea
OK-CTL-e (HLA-A0207)
que es una sublínea de la línea CTL (OK-CTL)
identificada a partir de un paciente con cáncer de colon (J.
Immunol., 163: 4909-5004, 1999), y la sublínea
GK-CTL2-2-4
(HLA-A0206) y la sublínea
GK-CTL2-2-5
(HLA-A0206) que son dos sublíneas de la línea CTL
(GK-CTL) identificada a partir de un paciente con
cáncer de pulmón en lugar de KE-CTL restringidos por
HLA-A2402 como célula efectora, y utilizando
células VA13 transfectadas con el gen lck y
HLA-A0201, HLA-A0206,
HLA-A0207, HLA-A2402, o
HLA-A2601 como estimulador [Figs. 2 (A), (B) y
(C)].
La expresión de Lcks (56 kD y 59 kD) al nivel de
proteínas en diversas células y tejidos se investigó por análisis
mediante transferencia Western con un anticuerpo monoclonal
anti-Lck.
El examen se llevó a cabo para cáncer de colon
primario (n = 49), colon no neoplástico (n = 5), cáncer de pulmón
[adenocarcinoma: n = 8, carcinoma de células escamosas (SCC): n =
8], y células de carcinoma de esófago. Se examinaron también las
líneas de células de cáncer de colon (COLO201, COLO205, COLO320,
HCT116, y SW1620), las líneas de células de cáncer de pulmón (LK87:
célula de adenocarcinoma, y LK79: carcinoma de células pequeñas), y
la línea de células de carcinoma de esófago (KE4).
Los especímenes se lisaron con un tapón que
contenía Tris\cdotHCl 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, 0,5% Triton
X-100, PMSF 0,2 mM (Sigma Chemical Co.), y 0,03
unidades de inhibidor de tripsina/ml de aprotinina, se trataron por
ultrasonidos, y se centrifugaron a 14.000 rpm durante 20 min. El
sobrenadante obtenido se utilizó como una fracción de citosol. El
lisado se separó por SDS-PAGE al 10%.
Las proteínas obtenidas en el gel de acrilamida
se transfirieron sobre una membrana de poli(difluoruro de
vinilideno) Hybond^{TM} (Amersham) y se incubaron con el
anticuerpo monoclonal anti-Lck (Santa Cruz) durante
4 horas a la temperatura ambiente. Los otros métodos de análisis por
transferencia Western se llevaron a cabo de acuerdo con los métodos
descritos previamente (Int. J. Cancer, 54: 158-165,
1995).
Se detectaron proteínas Lck tanto en células
mononucleares de sangre periférica (PBMCs) no estimuladas como en
PBMCs activadas por fitohemaglutinina (PHA-blastos).
Adicionalmente, se detectaron proteínas Lck en las siete líneas de
células de cáncer de colon testadas, y las líneas de células de
tumores malignos, tales como cáncer de esófago, cáncer de pulmón,
cáncer gástrico, y cáncer de útero, así como en la mayoría de los
tejidos tumorales recientes obtenidos de diversos órganos, con
inclusión de cáncer de colon, cáncer de esófago, cáncer de pulmón,
cáncer de útero, y tumor cerebral primario. Se detectaron también en
la parte no tumoral de tejido de colon, tejido de esófago, y tejido
de útero (Tabla 1).
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Con objeto de especificar el péptido antigénico
tumoral capaz de fijarse a la molécula HLA-A24, que
se deriva de Lck, se sintetizaron 13 péptidos diferentes y se
cargaron en C1R/A2402 a fin de testar la capacidad de aumento de la
producción de IFN-\gamma por los
KE4-CTLs.
Con respecto a los péptidos derivados de Lck
capaces de fijarse a la molécula HLA-A2402, se
buscaron en la bibliografía péptidos para el motivo de fijación
HLA-A24, y se sintetizaron 13 péptidos basados en la
secuencia del producto del gen lck constituida por 509 aminoácidos
(Nature, 319, 682-685, 1986), aunque algunos
aminoácidos de algunos péptidos se modificaron. Los péptidos
sintetizados se resumen en la Tabla 2.
Con objeto de especificar el antígeno tumoral,
se pulsaron células C1R/A2402 (2x10^{4}) transfectadas con
HLA-A2402 con un péptido a una concentración final
de 10 \muM durante 2 h. Se añadieron luego
KE4-CTLs (1x10^{4}), y se incubaron durante 18 h.
Se recogieron 100 \mul del sobrenadante para medir
IFN-\gamma por ELISA.
Entre 13 péptidos sintetizados, 6 péptidos
[Lck71-80, Lck208-216 (SEQ ID NO:3),
Lck317-325, Lck353-361,
Lck486-494 (SEQ ID NO:1), o
Lck488-497 (SEQ ID NO:2)] tenían una actividad de
intensificación de la producción de IFN-\gamma en
CTLs (Fig. 3), y 3 péptidos [Lck208-216 (SEQ ID
NO:3), y Lck486-494 (SEQ ID NO:1),
Lck488-497 (SEQ ID NO:2)] demostraron una actividad
fuerte. La actividad de los péptidos Lck486-494
(SEQ ID NO: 1) o Lck488-497 (SEQ ID NO: 2) para
aumentar la producción de IFN-\gamma por los CTLs
resultó ser dependiente de la dosis, y se detectó a 1 nM poco más o
menos. Por el contrario, la actividad de Lck208-216
(SEQ ID NO: 3) se detectó a 100 nM o mayor (Fig. 4).
Se obtuvieron también resultados similares
cuando se utilizaron células VA13 (2x10^{4}) en lugar de células
C1R/
A2402, que se pulsaron con estos péptidos después de transfección con HLA-A2402 para uso como estimulador.
A2402, que se pulsaron con estos péptidos después de transfección con HLA-A2402 para uso como estimulador.
Cuando se utilizaronanti-CD3
(NuT3), anti-CD4 (NuTh/s), anti-CD8
(NuTc/i), anti-CD13 (MCS-2),
anti-MHC clase I (W6/32) o anti-MHC
clase II (HDR1) (Int. J. Cancer, 58: 317-323, 1994)
en el test de activación de CTL arriba mencionado, la producción de
IFN-\gamma por KE4-CTL en la
reacción contra las células C1R/A2402 pulsadas con cada uno de 3
péptidos era inhibida por los anticuerpos monoclonales
anti-CD3, anti-CD8 y
anti-MHC clase I, pero no por los anticuerpos
monoclonales anti-CD4, anti-MHC
clase II y anti-CD13 [Fig. 5 (A), (B) y (C)]. Por
consiguiente, se confirmó que el KE4-CTL tiene el
fenotipo de CD3+ CD8+ CD4-, y es un linfocito T citotóxico que
reconoce el MHC clase I.
Adicionalmente, a fin de confirmar la
especificidad de péptido en CTLs, se identificaron sublíneas de
KE4-CTL a partir del KE4-CTL
restringido por HLA-A2402 parental por cultivo de
dilución limitante (J. Exp. Med. 187:277-288,
1998). Con respecto a 20 sublíneas KE4-CTL
diferentes obtenidas que tenían el fenotipo CD3^{+} CD8^{+}
CD4^{-}, se testó la reactividad contra cada uno de los tres
péptidos arriba mencionados.
Como resultado, dos sublíneas (sublíneas #49 y
#93) reconocían Lck488-497 (SEQ ID NO: 2), y un clon
(clon #80) reconocía Lck486-494 (SEQ ID NO: 1)
[Figs. 6 (B), (C) y (D)]. La sublínea #19 reconocía tanto
Lck208-216 (SEQ ID NO: 3) como
Lck486-494 (SEQ ID NO: 1) [Fig. 6 (A)]. Otras 16
sublíneas no reconocían ninguno de estos péptidos. Estos resultados
sugieren que los CTLs pueden ser una población que comprende células
que reconocen un número plural de antígenos tumorales.
Las actividades de 3 péptidos
[Lck208-216 (SEQ ID NO: 3),
Lck486-494 (SEQ ID NO: 1), y
Lck488-497 (SEQ ID NO: 2)] se testaron con respecto
a la inducción de CTLs restringidos por HLA-A24
contra líneas de células tumorales (KE4, W620 y COLO201) que
expresan la proteína Lck, a partir de PBMCs obtenidas un paciente
con cáncer de colon.
Se incubaron PBMCs (2x10^{6}) de un paciente
de HLA-A24^{+} o un donante sano con 10 \muM de
péptido en cada pocillo de una placa de 24 pocillos que contenía 2
ml de un medio de cultivo (45% medio RPMI-1640, 45%
medio AIM-V®/GIBCO BRL, y 10% FCS con 100 U/ml de
IL-2 y solución de aminoácidos no esenciales en MEM
0,1 mM/GIBCO BRL).
Al cabo de 7 y 14 días de cultivo, se recogieron
las células, se lavaron, y se estimularon con PBMCs autólogos o
células dendríticas que se irradiaron (50 Gray) y se pulsaron con el
péptido como células presentadoras de antígeno (APCs). Las células
dendríticas se indujeron por incubación de PBMCs (2x10^{6}
células/pocillo) en RPMI 1640 (GIBCO BRL) que contenía 10% FCS y
100 U/ml de IL-4 y 100 U/ml de
GM-CSF (factor estimulante de colonias
granulocitos-macrófagos) durante 7 días.
Las células recogidas el día 21 se testaron
inmediatamente por el método ELISA en cuanto a la reactividad como
efector para diversas células diana utilizando la capacidad de
producción de IFN-\gamma como índice. Los
resultados se ilustran en Fig. 7. Las PBMCs estimuladas in
vitro 3 veces con Lck208-216 (SEQ ID NO: 3),
Lck486-494 (SEQ ID NO: 1), o
Lck488-497 (SEQ ID NO: 2), particularmente las PBMCs
estimuladas con Lck486-494 (SEQ ID NO: 1) o
Lck488-497 (SEQ ID NO: 2) producían una mayor
cantidad de IFN-\gamma en la reacción con una
célula tumoral HLA-424^{+} (KE4 y SW620) que en la
reacción con una célula tumoral HLA-A24^{-}
(COLO201). Por otra parte, las PBMCs obtenidas de un donante sano
no exhibían actividad alguna de CTL restringidos por
HLA-A24 aun cuando se estimularan con cualquiera de
los tres péptidos pulsados utilizando PBMCs irradiadas para células
presentadoras de antígeno (APCs). Las PBMCs obtenidas de un donante
sano exhibían actividad de CTL restringidos por
HLA-A24 cuando se estimularon utilizando células
dendríticas (DCs) pulsadas con el péptido como APCs (Tabla 3).
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Adicionalmente, en cuanto al test de liberación
de ^{51}Cr por las células diana, las PBMCs arriba mencionadas
que se estimularon 3 veces con un péptido se
co-cultivaron ulteriormente con células
alimentadoras constituidas por PBMCs alógenas
HLA-A24^{+} irradiadas (2x10^{5}
células/pocillo) que se habían pulsado con un péptido
correspondiente. Alrededor del día 24 del
re-cultivo, se confirmó la actividad de linfocitos T
citotóxicos de estas células por el ensayo de producción de
IFN-\gamma, y estas células se testaron
directamente respecto a su citotoxicidad por un test de liberación
de ^{51}Cr de 6 h a diversas relaciones efector/diana. Las PBMCs
estimuladas con cada uno de los tres péptidos arriba mencionados
derivados de Lck lisaban las células tumorales
HLA-A24^{+} KE y las células tumorales SW620, pero
no lisaban los linfocitos T HLA-A24^{+} activados
por PHA de un donante sano o las células tumorales COLO201
HLA-A24^{-}. Los resultados con
Lck488-497 se ilustran en Fig. 8 (A), y los
obtenidos con Lck808-816 en Fig. 8 (B). Así pues, un
péptido derivado de CK demostró ser capaz de inducir linfocitos T
citotóxicos restringidos por HLA-A24 y específicos
de tumores.
Con respecto a tres péptidos
[Lck208-216 (SEQ ID NO:3),
Lck486-494 (SEQ ID NO:1), y
Lck488-497 (SEQ ID NO:2)], se ensayó la actividad
de inducción de CTL restringidos por HLA-A24 contra
la línea de células tumorales que expresaban Lck (KE4, SW620 y
COLO201) a partir de PBMCs obtenidas de un paciente de cáncer
utilizando la cantidad de producción de
INF-\gamma como indicador. El método de inducción
de CTLs y el método para ensayo del INF-\gamma
eran similares a los utilizados en el Ejemplo 4.
Como resultado, como se muestra en la Tabla 4,
eran inducidos CTLs por Lck208-216 (SEQ ID NO: 3) y
Lck488-497 (SEQ ID NO: 2), a partir de PBMCs de un
paciente con cáncer de colon y un paciente de cáncer de esófago.
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A continuación, las PBMCs (2x10^{6}) del
paciente con cáncer de colon se estimularon previamente por adición
de tres péptidos, a saber, Lck208-216 (SEQ ID NO:3),
Lck486-494 (SEQ ID NO:1), o
Lck488-497 (SEQ ID NO:2), y se cultivaron
ulteriormente después de adición de células
HLA-A24^{+} C1R/A2402 incubadas con 10 \mug/ml
de cada péptido para presentación de antígeno, y se ensayó la
cantidad de INF-\gamma producida en el
sobrenadante de cultivo. Como se muestra en Figs. 9 (A), (B), (C) y
(D), las PBMCs de un paciente con cáncer de colon que habían sido
estimuladas previamente con Lck486-894 (SEQ ID NO:
1) o Lck488-497 (SEQ ID NO: 2) reaccionaban sólo
con los péptidos presentados por las células presentadoras de
antígeno, es decir, Lck486-494 (SEQ ID NO: 1) o
Lck488-497 (SEQ ID NO: 2), respectivamente, para
producir IFN-\gamma, es decir para inducir CTLs.
Especialmente, Lck486-494 (SEQ ID NO: 1) o
Lck488-497 (SEQ ID NO: 2) demostraron ser capaces de
inducir CTLs específicos de péptido a partir de PBMCs de un
paciente con cáncer de colon por la estimulación previa. Por otra
parte, cuando PBMCs de un paciente con cáncer de colon se
estimularon previamente por Lck208-216 (SEQ ID NO:
3), o en ausencia del péptido, no pudieron inducirse CTLs
específicos de péptido.
Posteriormente, con objeto de examinar las
propiedades de los CTLs inducidos por el paciente con cáncer de
colon, utilizando la célula SW620 como célula diana, se añadieron 10
\mug/ml of anticuerpos anti-CD4 (NuTh/s),
anti-CD-8 (NuTc/i),
anti-CD14, anti-MHC clase I (W6/32)
o anti-MHC clase II (HDR1) y 10 \mug/m1 of
Lck488-497 (SEQ ID NO:2), seguido por incubación
con CTLs inducidos del paciente con cáncer de colon, y se determinó
la cantidad de IFN-\gamma producida en el
sobrenadante (Fig. 10). Como resultado, la producción de
IFN-\gamma a partir de CTLs era inhibida por los
anticuerpos monoclonales anti-CD8 y
anti-MHC clase I. Por tanto, se confirmó que los
CTLs inducidos de un paciente con cáncer de colon eran linfocitos T
citotóxicos que tienen el fenotipo CD8^{+} CD4^{-} y reconocen
el MHC clase I.
Se examinaron células CTL precursoras en PBMCs
del paciente con cáncer de colon arriba mencionado. Se pusieron
células SW620 en una placa de 96 pocillos para incubación, y se
añadieron a cada pocillo 1-100 CTL(s) del
paciente con cáncer de colon arriba mencionado que habían sido
estimuladas previamente por Lck488-497 (SEQ ID NO:
2) para incubación ulterior, encontrándose un pocillo en el cual
sobrevivían las células SW620, que son las células diana. Como
control, se utilizaron CTLs del paciente con cáncer de colon arriba
mencionado que no se habían estimulado con el péptido. Los
resultados se ilustran en Fig. 11. La frecuencia de las células
precursoras CTL en PBMCs del paciente con cáncer de colon era 1/634
cuando no se estimuló con el péptido, pero era 1/81 cuando se
estimuló con Lck488-497 (SEQ ID NO: 2). Por tanto,
se confirmó que el número de células precursoras CTL aumenta por
estimulación con el péptido.
Así pues, se encontró que tres péptidos
derivados de Lck, a saber, Lck208-216 (SEQ ID NO:3)
(HYTNASDGL), Lck486-494 (SEQ ID NO:1) (TFDYLRSVL) y
Lck488-497 (SEQ ID NO:2) (DYLRSVLEDF) eran capaces
de inducir CTLs que reconocen la línea de células tumoral
HLA-A24^{+}. Estos resultados sugieren que la
secuencia de aminoácidos DYLRSV, que es la región solapante para
los dos péptidos Lck486-494 (SEQ ID NO: 1) y
Lck488-497 (SEQ ID NO: 2), es reconocida como un
epítope antigénico tumoral por los CTLs inducidos por el péptido, y
que esta parte incluida en el dominio de quinasa de la proteína Lck
tiene relevancia para el rechazo de tumores. Con atención a esta
secuencia de aminoácidos DYLRSV, se buscaron péptidos que sean
homólogos a esta secuencia, encontrándose que tales péptidos están
incluidos en la secuencia de aminoácidos de algunas
tirosina-quinasas (Ann. Rev. Biochem. 54:
897-930), 1985) que pertenecen a la familia Src así
como Lck, como se muestra en la Tabla 5.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Basándose en estas secuencias de aminoácidos de
los péptidos derivados de la familia Src, se sintetizaron
Src511-519 (SEQ ID NO:4) (TFEYLQAFL),
Yes508-516 (SEQ ID NO:5) (TFEYIQSFL),
Fyn512-520 (SEQ ID NO:6) (TFEYLQSFL),
Lyn489-497 (SEQ ID NO:7) (TFDYLQSVL),
Hck503-511 (SEQ ID NO:8) (TFEYIQSVL), y
Blk482-490 (SEQ ID NO:9) (TFEFLQSVL), y se
incubaron 10 \mug/ml de cada péptido con células SW620 utilizadas
como células diana, se añadieron posteriormente células
KE4-CTL utilizadas en los Ejemplos 1 y 2, y se
cultivaron luego para ensayar una actividad inductora de CTL
utilizando la cantidad de IFN-\gamma producida en
el sobrenadante de cultivo como indicador. Adicionalmente, se
utilizó KE4 como control positivo para la célula diana. Otros
métodos eran similares a los utilizados en el Ejemplo 4. Como se
muestra en Fig. 12, cada péptido derivado de la familia Src exhibía
una capacidad inductora de CTL comparable o mayor que la del péptido
derivado de Lck.
Con respecto a Lck486-494 (SEQ
ID NO:1) (TFDYLRSVL), Src511-519 (SEQ ID NO:4)
(TFEYLQAFL), Yes508-516 (SEQ ID NO:5) (TFEYIQSFL),
Fyn512-520 (SEQ ID NO:6) (TFEYLQSFL),
Lyn489-497 (SEQ ID NO:7) (TFDYLQSVL),
Hck503-511 (SEQ ID NO:8) (TFEYIQSVL), y
Blk482-490 (SEQ ID NO:9) (TFEFLQSVL), se examinó la
inducción de CTLs restringidos por HLA-A24 a partir
de PBMCs obtenidas de un paciente de cáncer metastásico. La
inducción de CTLs y el ensayo de la actividad de CTL se llevaron a
cabo de maneras similares a las utilizadas en el Ejemplo 4, y se
utilizaron células KE4(HLA-A2402/26),
células SW620 (HLA-A0201/24), células COLO201
(HLA-A0101/0201), y células VA13
(HLA-A02) como células diana. Se indujeron los CTLs
en PBMCs por Lck486-494 (SEQ ID NO: 1) en cuatro
casos entre siete casos de pacientes de cáncer, por
Src511-519 (SEQ ID NO: 4) en dos casos entre tres
casos, por Yes508-516 (SEQ ID NO: 5) en un caso
entre tres casos, por Fyn512-520 (SEQ ID NO: 6) en
un caso entre dos casos, por Hck503-511 (SEQ ID NO:
8) en dos casos entre dos casos y por Blk482-490
(SEQ ID NO: 9) en un caso entre dos casos. Sin embargo, no eran
inducidos CTLs por Lyn489-497 en ninguno de dos
casos testados.
Con objeto de especificar un péptido antigénico
tumoral de fijación de la molécula HLA-A2 derivado
de Lck, se sintetizaron 24 péptidos diferentes para introducción en
VA13 (HLA-A02), y se testó la capacidad de
intensificación de la producción de INF-\gamma
por OK-CTL o la sublínea GK-CTL
(2-2-4) de una manera similar a la
utilizada en el Ejemplo 3.
Se prepararon péptidos derivados de Lck capaces
de fijarse a la molécula HLA-A2 por búsqueda de
péptidos para el motivo de fijación HLA-A2, seguido
por síntesis de 24 péptidos diferentes basados en la secuencia del
producto del gen lck constituido por 509 aminoácidos (Nature, 319:
682-685, 1996). Los péptidos sintetizados se resumen
en las Tablas 6 y 7.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
HLA-A2 se pulsaron
con el péptido a una concentración final de 10 \muM durante 2 h.
Se añadieron luego 1x10^{4} KE4-CTLs y se
incubaron durante 18 h. Se recogieron 100 \mul del sobrenadante
para medir IFN-\gamma para medir
IFN-\gamma por
ELISA.
\vskip1.000000\baselineskip
Para especificar el péptido antigénico tumoral,
2x10^{4} células VA13 transfectadas con HLA-A2 se
pulsaron con el péptido a una concentración final de 10 \muM
durante 2 h. Se añadieron luego 1x10^{4} KE4-CTLs
y se incubaron durante 18 h. Se recogieron 100 \mul del
sobrenadante para medir IFN-\gamma por ELISA.
Entre estos péptidos, siete péptidos
[Lck61-69 (SEQ ID NO:11), Lck246-254
(SEQ ID NO:12), Lck294-303 (SEQ ID NO:13),
Lck340-348 (SEQ ID NO:14),
Lck347-355 (SEQ ID NO:15),
Lck422-430 (SEQ ID NO:16), o
Lck492-500 (SEQ ID NO:17)] aumentaban la producción
de IFN-\gamma por la sublínea
OK-CTL y la sublínea GK-CTL
(2-2-4) [Fig. 13 (A) y (B)]. Cuando
se llevó a cabo un experimento similar a diversas concentraciones
del péptido a pulsar, Lck61-69 (SEQ ID NO: 11)
activaban particularmente la sublínea OK-CTL, y
Lck246-254 (SEQ ID NO: 12) activaba particularmente
la sublínea GK-CTL
(2-2-4), y
Lck422-430 (SEQ ID NO: 16) activaba particularmente
la sublínea GK-CTL
(2-2-5) de una manera dependiente de
la dosis, aumentando la producción de IFN-\gamma
por estos CTLs [Figs. 14 (A), (B), y (C)].
\vskip1.000000\baselineskip
Con respecto a tres péptidos
[Lck61-69 (SEQ ID NO:11), Lck246-254
(SEQ ID NO:12), o Lck422-430 (SEQ ID NO:16)], se
examinó la actividad de inducción de CTLs restringidos por
HLA-A2 contra las líneas de células tumorales
Panc-1, SW620, COLO320 y VA13 procedentes de PBMCs
obtenidas de un paciente con cáncer de colon metastásico.
Utilizando PBMCs de un paciente con cáncer de
colon HLA-A2^{+} metastásico, se llevaron a cabo
la inducción de CTLs y el ensayo de IFN-\gamma de
maneras similares a las utilizadas en el Ejemplo 4 [Figs. 15 (A) y
(C)]. Adicionalmente, la actividad citotóxica de los CTLs se ensayó
directamente por el test de liberación de ^{51}Cr [Figs. 15 (B) y
(D)]. Lck246-254 (SEQ ID NO: 12) y
Lck422-430 (SEQ ID NO: 16) inducían CTLs
restringidos por HLA-A2 y específicos de tumores a
partir de las PBMCs obtenidas de un paciente con cáncer de colon
HLA-A2^{+} metastásico.
\vskip1.000000\baselineskip
Se estudió la capacidad de tres péptidos
[Lck61-69 (SEQ ID NO:11), Lck246-254
(SEQ ID NO:12), o Lck422-430 (SEQ ID NO:16)] para
inducir CTLs restringidos por HLA-A2 a partir de
PBMCs obtenidas de diversos pacientes de cáncer. La inducción de
CTLs y el ensayo de actividad de CTL se llevaron a cabo de maneras
similares a las utilizadas en el Ejemplo 4, utilizando células
SW620 (HLA-A0201/24) como células diana. Se
indujeron CTLs en PBMCs por Lck246-254 (SEQ ID NO:
12, dos casos entre seis casos) y Lck422-430 (SEQ ID
NO: 16, tres casos entre seis casos) (Tabla 8).
Los péptidos derivados de Lck y péptidos
derivados de la familia Src, de acuerdo con la presente invención,
son péptidos antigénicos tumorales, y pueden inducir linfocitos T
citotóxicos restringidos por HLA-A24 y/o
restringidos por HLA-A2, y específicos de tumores, a
partir de PBMCs de un paciente de cáncer. Las proteínas Lck se
expresan en una mayoría de tejidos de cáncer con inclusión de cáncer
del intestino grueso, de pulmón y de esófago. Es decir, los
péptidos antigénicos tumorales de acuerdo con la presente invención
pueden utilizarse para la inmunoterapia específica del cáncer.
Adicionalmente, el alelo HLA-A24 se detecta en
aproximadamente del 60% de la población japonesa (en una mayoría,
igual a 95%, el genotipo es A2402), 20% de los caucasianos, y 12%
de los africanos. El alelo HLA-A2 se detecta en
aproximadamente el 40% de los japoneses, 53% de los chinos, 49% de
los caucasianos del norte, 38% de los caucasianos del sur, y 23% de
los negros africanos. Por tanto, la inmunoterapia específica
utilizando péptidos antigénicos tumorales de acuerdo con la presente
invención puede utilizarse en muchos pacientes de cáncer. Un
péptido proporcionado por la presente invención, un polinucleótido
que codifica el péptido, y un anticuerpo que reconoce el péptido
proporcionan medios extremadamente útiles en el campo del
tratamiento y la diagnosis de los cánceres.
SEQ ID NO: 10:
<220>
<230> Péptido diseñado basado en la
secuencia de aminoácidos de tirosina-quinasas de la
familia Src, péptido que tiene capacidad de generar linfocitos T
citotóxicos restringidos por HLA-A24
<222> (3)
<230> Xaa puede ser Asp o Glu.
<222> (4)
<230> Xaa puede ser Tyr o Phe.
<222> (5)
<230> Xaa puede ser Leu o Ile.
<222> (6)
<230> Xaa puede ser Arg o Gln.
<222> (7)
<230> Xaa puede ser Ser o Ala.
<222> (8)
<230> Xaa puede ser Val o Phe.
<222> (10)
<230> Xaa puede ser Glu o Asp.
<222> (12)
<230> Xaa puede ser Phe o Tyr.
<222>(13)
<230> Xaa puede ser Phe o Tyr.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> ITOH, Kyogo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Antígeno tumoral
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> GP00-1017
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver.2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm100
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm11
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm12
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm13
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm14
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm15
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm16
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT.
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Péptido diseñado basado en la secuencia de aminoácidos
de tirosina-quinasas de la familia Src, péptido que
tiene capacidad de generar linfocitos T citotóxicos restringidos por
HLA-A24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> INSEGURO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser Asp o Glu.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> INSEGURO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser Tyr o Phe..
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> INSEGURO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser Leu o Ile.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> INSEGURO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser Arg o Gln.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> INSEGURO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser Ser o Ala.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> INSEGURO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser Val o Phe.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> INSEGURO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser Glu o Asp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> INSEGURO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser Phe o Tyr.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> INSEGURO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser Phe o Tyr.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm17
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm18
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip1cm19
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\hskip1cm20
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\hskip1cm21
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\hskip1cm22
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\hskip1cm23
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\hskip1cm24
Claims (15)
1. Un péptido constituido por una secuencia de
aminoácidos SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15,
16 ó 17 en el listado de secuencias.
2. Un inductor de linfocitos T citotóxicos, en
donde el inductor está constituido por un péptido de acuerdo con la
reivindicación 1.
3. El péptido de acuerdo con la reivindicación 1
para el tratamiento del cáncer.
4. Una vacuna contra el cáncer en la cual el
agente activo está constituido por un péptido de acuerdo con la
reivindicación 1.
5. Un polinucleótido que codifica un péptido de
acuerdo con la reivindicación 1, o su cadena complementaria.
6. Un vector recombinante que comprende un
polinucleótido que codifica un péptido de acuerdo con la
reivindicación 1, o su cadena complementaria.
7. Un transformante transformado con el vector
recombinante de acuerdo con la reivindicación 6.
8. Un método para producir un péptido, que
comprende el paso de cultivar el transformante de acuerdo con la
reivindicación 7.
9. Un anticuerpo que se obtiene a partir de un
suero de un animal no humano inmunizado por péptidos de acuerdo con
la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo ha sido generado
contra un péptido de acuerdo con la reivindicación 1.
10. Un método de cribado para un compuesto que
es capaz de aumentar la inducción o activación de linfocitos T
citotóxicos por los péptidos de acuerdo con la reivindicación 1, en
donde el método utiliza al menos uno seleccionado del grupo
constituido por un péptido de acuerdo con la reivindicación 1, el
polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 5, el vector
recombinante de acuerdo con la reivindicación 6, el transformante
de acuerdo con la reivindicación 7, y el anticuerpo de acuerdo con
la reivindicación 9.
11. Una composición farmacéutica que comprende,
en una cantidad eficaz para el tratamiento del cáncer, al menos uno
seleccionado del grupo constituido por un péptido de acuerdo con la
reivindicación 1, el polinucleótido de acuerdo con la
reivindicación 5, el vector recombinante de acuerdo con la
reivindicación 6, el transformante de acuerdo con la reivindicación
7, y el anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 9.
12. Un método para fabricar un medicamento para
el tratamiento del cáncer, caracterizado porque se utilizan
un inductor de los linfocitos T citotóxicos de acuerdo con la
reivindicación 2, la vacuna contra el cáncer de acuerdo con la
reivindicación 4, o la composición farmacéutica de acuerdo con la
reivindicación 11.
13. Un método para ensayar un péptido de acuerdo
con la reivindicación 1 y/o un polinucleótido que codifica el
péptido utilizando un sistema de reacción
antígeno-anticuerpo, sistema de reacción enzimático
o sistema de reacción PCR, en donde el método permite detectar el
péptido y/o el polinucleótido en un espécimen, o determinar la
cantidad del péptido y/o polinucleótido en el mismo para examen
clínico.
14. Un kit de reactivos que comprende uno o más
seleccionados del grupo constituido por los péptidos de acuerdo con
la reivindicación 1, los polinucleótidos de acuerdo con la
reivindicación 5, y el anticuerpo de acuerdo con la reivindicación
9.
15. Un kit de reactivos para uso en el método de
acuerdo con la reivindicación 13, en donde el kit de reactivos
comprende uno o más seleccionados del grupo constituido por los
péptidos de acuerdo con la reivindicación 1, los polinucleótidos de
acuerdo con la reivindicación 5, y el anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 9.
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