CN115916251A - 肽混合物 - Google Patents

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Abstract

公开了能够诱导针对以下项的免疫应答的肽:ASTE1‑1a移码突变蛋白，其中所述肽包含SEQ ID NO:26的至少10个连续氨基酸；TAF1β‑1a移码突变蛋白，其中所述肽包含SEQ ID NO:27的至少10个连续氨基酸；KIAA2018‑1a移码突变蛋白，其中所述肽包含SEQ ID NO:9‑12之一的免疫原性片段，其中所述片段包含SEQ ID NO:9‑12之一的至少8个连续氨基酸；或SLC22A9‑1a移码突变蛋白，其中所述肽包含SEQ ID NO:14‑18之一的至少8个连续氨基酸。还公开了肽混合物，其包含各自独立地选自上述肽之一的第一和第二肽，以及能够诱导针对TGFβR2‑1a移码突变蛋白的免疫应答的肽。

Description

肽混合物
技术领域
本发明提供了能够引发免疫应答的具有移码突变的ASTE1、具有移码突变的TAF1β、具有移码突变的KIAA2018和具有移码突变的SLC22A9的肽。本发明还提供了肽混合物，所述肽混合物包括第一肽和第二肽，所述第一肽和所述第二肽各自独立地选自本发明的肽和能够引发免疫应答的具有移码突变的TGBβR2的肽。本发明还提供了对这些肽具有特异性的T细胞受体和T细胞，以及包含对这些肽和肽混合物具有特异性的T细胞的T细胞混合物和T细胞制剂，编码一种或多种肽的核酸分子，包含核酸分子的载体和包含载体的宿主细胞。本发明还提供了包括这些肽、肽混合物、T细胞和T细胞混合物和制剂的药物制剂，这些肽、肽混合物、T细胞受体、T细胞及T细胞混合物和制剂的药物组合物用于预防和/或治疗癌症的用途，以及选择肽、肽混合物、T细胞受体、T细胞、T细胞混合物和T细胞制剂用于治疗癌症的方法。
背景技术
DNA微卫星是一串重复的DNA，其中某些DNA基序(核苷酸序列模式)重复，通常大约5到50次。微卫星不稳定性(MSI)是微卫星重复次数的变化，可由DNA错配修复(MMR)酶活性受损引起。
MMR可纠正DNA复制过程中自发发生的错误，例如单碱基错配或短插入或缺失。当MMR活性受损时，这些自发性错误无法修复，这会导致微卫星不稳定(即重复次数的变化)和DNA微卫星序列中的移码突变。
移码突变是从基因中添加或删除一个或两个碱基对，导致不同的密码子，因此，从突变点开始编码不同的蛋白质。移码通常会导致截短的蛋白质序列，因为终止密码子过早出现，并且编码的蛋白质通常有缺陷或无活性。
近年来，免疫肿瘤学一直是发展中的领域，其工作重点是利用患者自身的免疫系统来对抗癌症。然而，一个问题是抗体只能与暴露在肿瘤细胞表面的肿瘤抗原结合。出于这个原因，基于人体免疫系统的癌症治疗方法没有预期的那么成功。
在MSI-H癌症中，数种蛋白质被鉴定为频繁发生移码突变。例如，TGFβR2(SEQ IDNO:1)是一种生长因子，其与TGFβ的相互作用介导细胞生长的控制。TGFβR2中的移码突变使其失去生物学功能，从而导致不受控制的细胞生长和癌症进展。在ASTE1(SEQ ID NO:4)、TAF1β(SEQ ID NO:6)、KIAA2018(SEQ ID NO:8)和SLC22A9(SEQ ID NO:13)中也发现了移码突变，编码这些蛋白质的基因中的单核苷酸缺失是这些蛋白质中迄今为止最主要的移码突变，尽管可能发生单核苷酸添加。特别是，已经发现95％以上的微卫星突变是缺失(Maby等人，Cancer Res，75(17)，2015年9月1日)。由单核苷酸缺失(-1a)移码突变导致的TGFβR2、ASTE1、TAF1β、KIAA2018和SLCC22A中的每一个的氨基酸序列如SEQ ID NO:2(TGFβ2)、SEQID NO:5(ASTE1)、SEQ ID NO:7(TAF1β)、SEQ ID NO:9-12(KIAA2018，其实际上可以在四个位置中的任一位置上具有核苷酸缺失)，和SEQ ID NO:14-16(SLC22A9，其实际上在三个位置中的任一位置具有核苷酸缺失)所示。
癌症(例如结直肠癌(CRC))中MSI的检测是通过分析Bethesda面板进行的，Bethesda面板是包含五个微卫星基因组(locus)的参考面板(panel)：两个单核苷酸(BAT25和BAT26)和三个二核苷酸(D5S346、D2S123和D17S250)(Cortes-Ciriano等人,NatureCommunications,2017,vol.8,文章编号15180；Vilar&Gruber,Nat Rev Clin Oncol,2010,vol.7(3),p.153-162)。当两个或更多基因座存在不稳定时，MSI被归类为高(MSI-H)，当一个基因座存在不稳定时，MSI被归类为低(MSI-L)(Vilar&Gruber,Nat Rev Clin Oncol,2010,vol.7(3),p.153-162)。当没有不稳定的基因座时，微卫星可以归类为稳定的(MSS)(Vilar&Gruber，Nat Rev Clin Oncol，2010，vol.7(3)，p.153-162)。
所有CRC中约15％为MSI-H，并且在胶质母细胞瘤、淋巴瘤、胃、泌尿道、卵巢和子宫内膜肿瘤中也报道了MSI(Cortes Ciriano等人，Nature Communications，2017，vol.8,文章编号15180)。据报道，TAF1β、ASTE1和TGFβR2各自在75％以上的MSI CRC中独立地突变(Maby等人，Cancer Res，75(17)，2015年9月1日)。
此外，99％的遗传性CRC(遗传性非息肉性结直肠癌(HNPCC))是MSI-H(Pinheiro等人，British Journal of Cancer,2015,vol.113,p.686-692)。在MSI-H HNPCC患者中，大约90％在蛋白质TGFβR2中具有移码突变(Pinheiro等人,British Journal of Cancer,2015,vol.113,p.686-692)。HNPCC患者具有体细胞突变，预计会发展为移码突变。CRC之前通常会出现息肉，但与没有遗传性CRC的患者不同，从遗传性CRC患者身上去除息肉对于预防癌症无效。
此外，大约22％的胃癌(胃癌)是MSI-H(Cortes-Ciriano等人,NatureCommunications,2017,vol.8,文章编号15180)。
此外，据报道，在所有CRC的约15％、所有MSI-H癌症的约44％，特别是约58％的MSI-H结肠癌和约80％的MSI-H胃癌中发现了TGFβR2的移码突变(Cortes-Ciriano等人,Nature Communications,2017,vol.8，文章编号15180)。在所有MSI-H癌症中，发现KIAA2018、SLC22A9和ASTE1中的移码突变分别约51％、50％和45％(Cortes Ciriano等人，Nature Communications，2017，vol.8，文章编号15180)。
已报道具有移码突变的TGFβR2肽具有免疫原性，尽管报道的结果存在不一致，如下文讨论的。
EP1078000公开了使用源自BAX和TGFβR2基因中的移码突变的蛋白质片段通过引发T细胞免疫来治疗癌症。
Linnebacher等人(Int J Cancer,2001,93,p.6-11)报道，源自具有移码突变的蛋白质的三种肽能够在体外激活特定的CTL(HLA-A2.1限制性)，包括具有-1a移码突变的TGFβR2的肽(其中称为FSP02：RLSSCVPVA；SEQ ID NO:33)。该肽还能够裂解带有相应移码突变的结直肠癌细胞系HCT116。然而，-1a移码的TGFβR2的另外两种肽没有激活CTL。
Saeterdal等人(Cancer Immunol Immunother,2001Nov,50(9),469-476)报道了具有移码突变的TGFβR2的肽(RLSSCVPVA(在Saeterdal等人，Cancer Immunol Immunother中标记为p573)；本文中的SEQ ID NO:33)能够产生CTL系和数个CTL克隆。一个CTL克隆能够杀死携带移码TGFβR2的HLA-A2+结肠癌细胞系。
Saeterdal等人(PNAS,2001Nov 6,98(23),13255-13260)报道了源自具有移码突变的TGFβR2的高免疫原性肽(标记为p538；SLVRLSSCVPVALMSAMTSSSQ(本文中SEQ ID NO:34))作为MSI+肿瘤中肿瘤浸润Th细胞的靶标。该肽通过三名患有自发性MSI+结肠癌的患者中的两人以及所有三名患有HNPCC的患者被识别出来。对应于相同移码突变的数种其他肽(p540:SPKCIMKEKKSLVRLSSCVPVA(在本文中为SEQ ID NO:35)，和p541:PKCIMKEKKKSLVRLSSCV(在本文中为SEQ ID NO:36))也能够在一些患者中诱导T细胞应答。
然而，上述研究结果相互矛盾，因此尚不清楚具有移码突变的TGFβR2肽是否确实具有免疫原性。例如，Linnebacher等人的肽FSP01(SLVRLSSCV；本文中的SEQ ID NO:37)与EP1078000的肽SEQ ID NO:428相同，但Linnebacher等人报道该肽不具有免疫原性(Linnebacher等人的图1)，而EP1078000报道该肽具有免疫原性(EP1078000的图14)，尽管仅在四轮T细胞刺激之后。Linnebacher等人的肽FSP02(RLSSCVPVA；本文中的SEQ ID NO:33)与EP1078000的肽SEQ ID NO:439和Saeterdal等人(2001,Cancer ImmunolImmunother)的肽p573相同，但Linnebacher等人和Saeterdal等人(2001，Cancer ImmunolImmunother)报道该肽具有免疫原性(Linnebacher等人的图1；Saeterdal等人的摘要，和第472页第1栏第3段)，而EP1078000报道即使在四轮T细胞刺激后，该肽也没有免疫原性(EP1078000的图14)。此外，Saeterdal(2001,PNAS)公开了肽p537和p621不具有免疫原性，但肽p538、p540和p4541具有免疫原性；然而，p538和p621都包含肽p523和p573的序列，一些研究表明肽p523和p573具有免疫原性(如上所述)。因此，不清楚为什么p621不具有免疫原性而p538具有免疫原性。此外，EP1078000公开其肽SEQ ID NO:17能够刺激源自腺癌患者的培养的T细胞克隆(EP1078000的图8和图9)，但其肽SEQ ID NO:17不诱导高于健康献血者T细胞的背景值的T细胞应答(EP1078000的图12)。EP1078000的图8和图9中显示的结果表明，癌症患者中可能已诱导自发性T细胞免疫应答，并且这些T细胞在用肽SEQ ID NO:17培养后可以识别肽SEQ ID NO:17。然而，这些结果并未表明肽SEQ ID NO:17是足够强的抗原以诱导保护性免疫应答。
还发现，使用工程化抗原呈递细胞，可以用源自患者肿瘤中发现的移码突变的肽刺激从结直肠癌患者获得的外周细胞毒性T细胞(Maby等人，cancer Res，75(17)，2015年9月1日)。特别是，这些肽源自TGFβR2、TAF1β和ASTE1的移码突变。然而，没有移码突变的癌症患者的T细胞和健康受试者的T细胞不能被刺激到可检测的水平，这表明如果用于疫苗接种，肽的免疫原性不足以诱导可检测的免疫应答。
US 8053552公开了源自-1a移码的TGFβR2、TAF1β和ASTE1的肽能够在体外使用来自健康HLA-A2.1+供体的T细胞来诱导免疫应答。然而，这些结果仅限于HLA-A2.1+表位，并没有表明其他HLA I类限制性T细胞或任何HLA II类限制性T细胞被诱导。历史上，仅由HLAI类表位组成的疫苗在治疗癌症方面没有成功，因此，US 8053552没有表明其中测试的肽是有效的癌症的疫苗或治疗。
WO2014/090265和EP2572725公开了一种用于治疗或预防癌症的疫苗，其包含MSI特异性移码肽或这些肽的混合物。移码肽源自TAF1β、HT001(也称为ASTE1)、TGFβR2或AIM2。WO2014/090265和EP2572725公开了源自TAF1β、HT001、TGFβR2和AIM2的每一种的一种特异性移码肽分别能够在体外诱导T细胞应答。
WO96/31605公开了一种具有-1a移码突变的TGFβR2突变蛋白，以及一种治疗癌症的方法，包括向患者施用包含非功能性TGFβR2的组合物。
WO2018/223093公开了一种通过向患者施用至少一种肽来治疗或预防癌症的方法，所述肽包括表达基因的微卫星编码区中的移码变体，其可以是缺失或添加。该文献公开了数种特异性的TAF1β、ASTE1和TGFβR2移码肽，但均未对其进行人体免疫原性测试。
WO2020/239937公开了移码的TGFβR2的肽及其在治疗或预防癌症中的用途。
因此，需要为癌症，特别是与MSI和移码突变相关的癌症提供有效的疫苗和/或治疗。特别地，需要为这些癌症提供具有成本效益并且可以用于治疗或接种尽可能多的MSI-H相关癌症的疫苗和/或治疗。
发明内容
本发明缓解了上述问题中的至少一些问题，因为现已发现包含具有移码突变的ASTE1、TAF1β、KIAA2018或SLC22A9片段的肽可用于诱导针对癌细胞的免疫应答，因此可用于治疗和/或预防与具有移码突变的ASTE1、TAF1β、KIAA2018和/或SLC22A9相关的癌症。此外，已经发现，包含第一肽和第二肽的肽混合物可用于诱导针对癌细胞的免疫应答，所述第一肽和所述第二肽各自独立地选自这些肽以及包含具有移码突变的TGFβR2片段的肽。因此，肽混合物可用于治疗和/或预防与TGFβR2、ASTE1、TAF1β、KIAA2018和SLC22A9中的一个或多个移码突变相关的癌症。本发明的肽和肽混合物特别适用于治疗和/或预防与TGFβR2、ASTE1、TAF1β、KIAA2018和SLC22A9中的一个或多个中的-1a移码突变相关的癌症。已经发现，特别有用的肽包含对应于由相关蛋白质中的移码突变产生的突变氨基酸序列的至少一部分的片段。此外，特别有用的肽源自在所讨论的患者体内具有移码突变的蛋白质。特别地，肽和肽混合物可用于治疗所有MSI-H结直肠癌，以及大部分的MSI-H癌症。本发明的肽包含多个嵌套表位，使得肽包含一个以上HLA等位基因的表位。这提供了肽能够在具有不同HLA等位基因的患者中诱导免疫应答的优势，使得肽可用作通用治疗和/或疫苗。此外，本发明的每种肽都含有很少或不含有每种肽所源自的蛋白质的野生型氨基酸序列的氨基酸残基，从而降低了本发明的肽诱导自身免疫应答的风险。此外，本发明的肽混合物提供了一种有效且具有成本效益的疫苗和/或治疗，因为它为所有MSI-H癌症的很大一部分提供了治疗和/或疫苗，更特别地，可以为所有MSI-H结直肠癌提供治疗。
在本发明的第一方面，提供了一种肽混合物，其包含第一肽和第二肽，所述第一肽和第二肽各自独立地选自：
能够诱导针对TGFβR2-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽，其中所述肽包含i)SEQID NO:3的免疫原性片段，其中所述片段包括SEQ ID NO:3的至少8个连续氨基酸且包括SEQID NO:3的第121和135位中的至少一个，或ii)SEQ ID NO:2的免疫原性片段，其中所述片段包含SEQ ID NO:19的至少8个连续氨基酸；
能够诱导针对ASTE1-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽，其中所述肽包括SEQ IDNO:5的免疫原性片段，其中所述片段包含SEQ ID NO:26的至少8个连续氨基酸；
能够诱导针对TAF1β-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽，其中所述肽包括SEQ IDNO:7的免疫原性片段，其中所述片段包含SEQ ID NO:27的至少8个连续氨基酸；
能够诱导针对KIAA2018-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽，其中所述肽包含SEQID NO:9-12之一的免疫原性片段，其中所述片段分别包含SEQ ID NO:9-12之一的至少8个连续氨基酸，且分别包括SEQ ID NO:9的第13至37位、SEQ ID NO:10的第91至109位、SEQ IDNO:11的第147至167位和SEQ ID NO:12的第1016至1037位的至少一个氨基酸；和
能够诱导针对SLC22A9-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽，其中所述肽包含SEQ IDNO:14-18之一的免疫原性片段，其中所述片段分别包含SEQ ID NO:14-18之一的至少8个连续氨基酸，且分别包括SEQ ID NO:14的第327至400位、SEQ ID NO:15的第335至400位、SEQID NO:16的第533至549位、SEQ ID NO:17的第327至400位和SEQ ID NO:18的第335到400位的至少一个氨基酸；
其中所述第一肽能够诱导针对与所述第二肽不同的移码突变蛋白的免疫应答。
优选地，所述包含SEQ ID NO:3的免疫原性片段的肽包含SEQ ID NO:3的至少9个连续氨基酸，或者包含SEQ ID NO:2的免疫原片段的肽包括SEQ ID NO:19的至少9个连续氨基酸。
有利地，包含SEQ ID NO:3的免疫原性片段的肽包括SEQ ID NO:3的至少10个连续氨基酸。
方便地，包含SEQ ID NO:2的免疫原性片段的肽包括SEQ ID NO:19的至少10个连续氨基酸。
有利地，能够诱导针对TGFβR2-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽包括SEQ ID NO:3的第121至132位、SEQ ID NO:3的第129至137位、SEQ ID NO:3的第135至146位或SEQ IDNO:19的第2至17位、SEQ ID NO:19的第10至18位或SEQ ID NO:19的第16至33位。
方便地，对应于SEQ ID NO:3的第121或135位的氨基酸是甘氨酸。
优选地，能够诱导针对TGFβR2-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽包括SEQ ID NO:19至25、124和125之一的氨基酸序列。
方便地，能够诱导针对TGFβR2-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽由SEQ ID NO:19至25、124和125中的一个组成。
有利地，SEQ ID NO:5的免疫原性片段包含SEQ ID NO:26的至少10个连续氨基酸。
方便地，SEQ ID NO:5的免疫原性片段包含SEQ ID NO:26的至少15个连续氨基酸。
优选地，能够诱导针对ASTE1-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽包括SEQ ID NO:26的序列。
有利地，能够诱导针对ASTE1-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽由SEQ ID NO:26组成。
方便地，SEQ ID NO:7的免疫原性片段包含SEQ ID NO:27的至少10个连续氨基酸。
有利地，SEQ ID NO:7的免疫原性片段包含SEQ ID NO:27的至少13个连续氨基酸。
优选地，能够诱导针对TAF1β-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽包括SEQ ID NO:27的序列。
方便地，能够诱导针对TAF1β-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽由SEQ ID NO:27组成。
有利地，SEQ ID NO:9-12之一的免疫原性片段包含SEQ ID NO:9-12之一的至少10个连续氨基酸。
方便地，SEQ ID NO:9-12之一的免疫原性片段包含SEQ ID NO:9-12之一的至少15个连续氨基酸。
优选地，能够诱导针对KIAA2018-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽包括SEQ IDNO:28的序列。
有利地，能够诱导针对KIAA2018-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽由SEQ ID NO:28组成。
优选地，SEQ ID NO:14-18之一的免疫原性片段分别包含SEQ ID NO:14-18之一的至少10个连续氨基酸，分别包括来自SEQ ID NO:14的第327至400位、SEQ ID NO:15的第335至400位、SEQ ID NO:16的第533至549位、SEQ ID NO:17的第327至400位和SEQ ID NO:18的第335至400位的至少一个氨基酸。
方便地，SEQ ID NO:14-18之一的免疫原性片段分别包含SEQ ID NO:14-18之一的至少15个连续氨基酸，分别包括来自SEQ ID NO:14的第327至400位、SEQ ID NO:15的第335至400位、SEQ ID NO:16的第533至549位、SEQ ID NO:17的第327至400位和SEQ ID NO:18的第335至400位的至少一个氨基酸。
有利地，能够诱导针对SLC22A9-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽包括SEQ ID NO:29-32之一的序列。
方便地，能够诱导针对SLC22A9-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽由SEQ ID NO:29-32之一组成。
优选地，第一肽是能够诱导针对TGFβR2-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽，第二肽是能够诱导针对ASTE1-1a移码突变蛋白或TAF1β-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽。
有利地，肽混合物包含至少一种另外的肽，所述至少一种另外的肽选自第一方面中定义的肽，其中所述至少一种另外的肽能够诱导针对与第一和第二肽中每一种的不同的移码突变蛋白的免疫应答。
方便地，第一肽是能够诱导针对TGFβR2-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽，第二肽是能够诱导针对ASTE1-1a移码突变体蛋白的免疫应答的肽，并且至少一种另外的肽是能够诱导针对TAF1β-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽。
优选地，肽混合物进一步包含能够诱导针对KIAA2018-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽和/或能够诱导针对SLC22A9-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽。
有利地，肽混合物中的至少一种肽在其C末端包含甘氨酸残基。甘氨酸残基可以用作肽与其他分子缀合的接头。因此，在本申请的一些实施方案中设想本发明的肽与另一分子连接或缀合(无论是通过这种甘氨酸残基还是通过其他方式)。
在本发明的第二方面中，提供了能够诱导针对以下各项的免疫应答的肽：
ASTE1-1a移码突变蛋白，其中所述肽包含SEQ ID NO:5的免疫原性片段，其中所述片段包含SEQ ID NO:26的至少10个连续氨基酸；
TAF1β-1a移码突变蛋白，其中所述肽包含SEQ ID NO:7的免疫原性片段，其中所述片段包含SEQ ID NO:27的至少10个连续氨基酸；
KIAA2018-1a移码突变蛋白，其中所述肽包含SEQ ID NO:9-12之一的免疫原性片段，其中所述片段包含SEQ ID NO:9-12之一的至少8个连续氨基酸，包括SEQ ID NO:9的第13至37位、SEQ ID NO:10的第91至109位、SEQ ID NO:11的第147至167位和SEQ ID NO:12的第1016至1037位的至少一个氨基酸；或
SLC22A9-1a移码突变蛋白，其中所述肽包含SEQ ID NO:14-18之一的免疫原性片段，其中所述片段包含SEQ ID NO:14-18之一的至少8个连续氨基酸，包括SEQ ID NO:14的第327至400位、SEQ ID NO:15的第335至400位、SEQ ID NO:16的第533至549位、SEQ ID NO:17的第327至400位和SEQ ID NO:18的第335至400位的至少一个氨基酸。
优选地，能够诱导针对TAF1β-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽包含来自SEQ IDNO:27的至少12个连续氨基酸。
有利地，能够诱导针对TAF1β-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽包含不超过27个氨基酸。
优选地，能够诱导免疫应答的肽包含来自相应蛋白的野生型氨基酸序列的不超过八个氨基酸。
方便地，肽在其C末端包含甘氨酸残基。
在本发明的第三方面，提供了T细胞混合物，其包括第一和第二T细胞，所述第一和第二T细胞各自独立地选自：
对如上述第一方面所定义的能够诱导针对TGFβR2-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽具有特异性的T细胞，其中所述T细胞是未转染的T细胞；
对如上述第一方面所定义的能够诱导针对-1a ASTE1移码突变蛋白的免疫应答的肽具有特异性的T细胞；
对如上述第一方面所定义的能够诱导针对TAF1β-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽具有特异性的T细胞；
对如上述第一方面所定义的能够诱导针对KIAA2018-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽具有特异性的T细胞；和对如上述第一方面所定义的能够诱导针对SLC22A9-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽具有特异性的T细胞，
其中所述第一T细胞对能够诱导针对与所述第二T细胞所特异的肽不同的移码突变蛋白的免疫应答的肽具有特异性。
在本发明的第四方面中，提供了对根据上述第二方面的肽具有特异性的T细胞。
在本发明的第五方面，提供了T细胞制剂，其包含一种或多种根据上述第四方面的T细胞。
在本发明的第六方面，提供了对根据上述第二方面的肽具有特异性的T细胞受体或其抗原结合片段。
在本发明的第七方面中，提供了至少一种核酸分子，其中所述核酸分子或多个核酸分子单独或共同包含编码上述第一方面中定义的至少两种肽的核苷酸序列，或者所述或每种核酸分子包含编码根据上述第二方面的至少一种肽的核苷酸序列。
在本发明的第八方面，提供了载体，其包含根据上述第七方面的核酸分子。
在本发明的第九方面，提供了宿主细胞，其包含根据上述第八方面的载体。
在本发明的第十方面中，提供了药物组合物，其包含根据上述第一方面的肽混合物、根据上述第二方面的肽、根据上述第三方面的T细胞混合物、根据上述第四方面的T细胞、根据上述第五方面的T细胞制剂、根据上述第七方面的核酸分子、根据上述第八方面的载体或根据上述第九方面的宿主细胞、以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在本发明的第十一方面中，提供了根据上述第一方面的肽混合物、根据上述第二方面的肽、根据上述第三方面的T细胞混合物、根据上述第四方面的T细胞、根据上述第五方面的T细胞制剂、根据上述第六方面的T细胞受体或其抗原结合片段、根据上述第七方面的核酸分子、根据上述第八方面的载体、根据上述第九方面的宿主细胞或根据上述第十方面的药物组合物，其用于治疗和/或预防癌症。
优选地，所述癌症是结直肠癌。
在本发明的第十二方面中，提供了选择用于施用至患者的肽混合物、肽、核酸分子、载体、宿主细胞、T细胞混合物、T细胞、T-细胞受体或药物组合物的方法，其包括：
i)确定癌症患者是否在TGFβR2蛋白、ASTE1蛋白、TAF1β蛋白、KIAA2018蛋白和SLC22A9蛋白中的一种或多种中存在移码突变，如果存在，
ii)选择根据上述第一方面的肽混合物、根据上述第二方面的肽、根据上述第三方面的T细胞混合物、根据上述第四方面的T细胞、根据上述第五方面的T细胞制剂、根据上述第六方面的T细胞受体或其抗原结合片段、根据上述第七方面的核酸分子、根据上述第八方面的载体、根据上述第九方面的宿主细胞或根据上述第十方面的药物组合物。
在本发明的第十三方面中，提供了治疗癌症的方法，其包括向有需要的患者施用根据上述第一方面的肽混合物、根据上述第二方面的肽、根据上述三方面的T细胞混合物、根据上述第四方面的T细胞，根据上述第五方面的T细胞制剂、根据上述第六方面的T细胞受体或其抗原结合片段、根据上述第七方面的核酸分子、根据上述第八方面的载体、根据上述第九方面的宿主细胞或根据上述第十方面的药物组合物。
如本文所用，术语“肽”是指氨基酸残基的聚合物，其是(或具有对应于较长蛋白质的序列)较长蛋白质的片段。该术语还适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是修饰的残基或非天然存在的残基，例如相应天然存在氨基酸的人工化学模拟物，以及还适用于天然存在的氨基酸聚合物。肽可以连接到另一个试剂或部分。
如本文所用，术语“片段”是指来自较长多肽或蛋白质的一系列连续氨基酸。
两个序列之间的“同一性”百分比可以使用BLASTP算法版本2.2.2 Altschul、Stephen F.、Thomas L.Madden、Alejandro A.
Figure BDA0003964058800000131
Jinghui Zhang、Zheng Zhang、Webb Miller和David J.Lipman(1997)，“Gapped BLAST和PSI-BLAST：新一代蛋白质数据库搜索程序”，Nucleic Acids Res.25:3389-3402)，使用默认参数确定。特别是，可以使用URLhttps://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi在互联网上访问BLAST算法。
如本文所用，术语“免疫应答”在一些实施方案中是指在识别肽时T细胞介导的免疫应答(即T细胞活化)。T细胞应答可以是HLA-I介导的T细胞应答和/或HLA-II介导的T细胞应答。免疫应答可以是任何αβ(αβ)T细胞和/或γδ(γδ)T细胞的应答，使得肽可能会或可能不会通过抗原呈递细胞表面的主要组织相容性(MHC)分子呈递给T细胞。
如本文所用，术语“移码突变体”是指由与核酸的野生型序列相比具有一个或两个核苷酸的添加或缺失的核酸序列编码的多肽，从而自突变点起产生不同的密码子。
如本文所用，术语“-1a移码突变体”是指从野生型核酸序列中缺失单个核苷酸产生的多肽。
术语“-1a移码突变”是指与多肽的野生型氨基酸序列相比，多肽的氨基酸序列发生变化，这是由于从编码该多肽的核酸序列中缺失单个核苷酸所致。
如本文所用，术语“mutTGFβR2”是指具有-1a移码突变的TGFβR2蛋白。mutTGFβR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
如本文所用，术语“mutASTE1”是指具有-1a移码突变的ASTE1蛋白。mutASTE1的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
如本文所用，术语“mutTAF1B”是指具有-1a移码突变的TAF1B蛋白。mutTAF1B的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
如本文所用，术语“mutKIAA2018”是指具有-1a移码突变的KIAA2018蛋白。
本文使用的术语“mutKIAA2018(pos13)”是指在其氨基酸序列的第13位具有-1a移码突变的KIAA2018蛋白。换句话说，与野生型蛋白相比，mutKIAA2018(pos13)蛋白具有突变的氨基酸序列，起始于其氨基酸序列的第13位。mutKIAA2018(pos13)的氨基酸序列如SEQID NO:9所示。
本文使用的术语“mutKIAA2018(pos91)”是指在其氨基酸序列的第91位具有-1a移码突变的KIAA2018蛋白。换句话说，与野生型蛋白相比，mutKIAA2018(pos91)蛋白具有突变的氨基酸序列，起始于其氨基酸序列的第91位。mutKIaa2018(pos91)的氨基酸序列如SEQID NO:10所示。
本文使用的术语“mutKIAA2018(pos147)”是指在其氨基酸序列的第147位具有移码突变的KIAA2018蛋白。换句话说，与野生型蛋白相比，mutKIAA2018(pos147)蛋白具有突变的氨基酸序列，起始于其氨基酸序列的第147位。mutKIAA2018(pos147)的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。
本文使用的术语“mutKIAA2018(pos1016)”是指在其氨基酸序列的第1016位具有移码突变的KIAA2018蛋白。换句话说，与野生型蛋白相比，mutKIAA2018(pos1016)蛋白具有突变的氨基酸序列，起始于其氨基酸序列的第1016位。mutKIAA2018(pos1016)的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。
如本文所用，术语“mutSLC22A9”是指具有-1a移码突变的SLC22A9蛋白。
本文使用的术语“mutSLC22A9(pos327)”是指在其氨基酸序列的第327位具有移码突变的SLC22A9蛋白。换句话说，与野生型序列相比，mutSLCC22A9(pos327)蛋白具有突变的氨基酸序列，起始于其第327位。mutSLCC22A(pos327)的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。
本文使用的术语“mutSLC22A9(pos335)”是指在其氨基酸序列的第335位具有移码突变的SLC22A9蛋白。换句话说，与野生型序列相比，mutSLCC22A9(pos335)蛋白具有突变的氨基酸序列，起始于其第335位。mutSLCC22A9(pos335)的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示。
本文使用的术语“mutSLC22A9(pos533)”是指在其氨基酸序列的第533位具有移码突变的SLC22A9蛋白。换句话说，与野生型序列相比，mutSLCC22A9(pos533)蛋白具有突变的氨基酸序列，起始于其第533位。mutSLCC22A9(pos533)的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。
如本文所用，术语“氨基酸取代”是指与多肽的野生型氨基酸序列相比，用不同的氨基酸替换多肽中的氨基酸。
如本文所用，术语“肽混合物”是指混合但未化学结合的两种或更多种肽。混合物可以作为干粉、溶液、悬浮液或胶体存在，并且可以是均质的或异质的。
如本文所用，术语“核酸”或“核酸分子”是指多个核苷酸的聚合物。核酸可包含天然存在的核苷酸或可包含人工核苷酸，例如肽核苷酸、吗啉代和锁定核苷酸以及乙二醇核苷酸和苏糖核苷酸。
如本文所用，术语“核苷酸”是指被细胞酶识别的天然存在的核苷酸和合成的核苷酸类似物。
如本文所用，术语“药物组合物”是指适合于出于治疗目的施用于预期的人或动物受试者的药物制剂。
附图说明
图1显示了TGFβR2共有序列和肽的开发。
图2是新制备的粗fsp5(SEQ ID NO:19)的UPLC迹线(trace)。
图3是冻干前溶液中纯化的fsp5(SEQ ID NO:19)的UPLC迹线。
图4是冻干后纯化的fsp5(SEQ ID NO:19)的UPLC迹线。
图5是粗fsp5(SEQ ID NO:19)在室温下储存三天，然后重构和冻干后的HPLC迹线。
图6是纯化的fsp1(SEQ ID NO:20)的UPLC迹线。
图7是纯化的fsp2(SEQ ID NO:21)的UPLC迹线。
图8是纯化的fsp3(SEQ ID NO:22)的UPLC迹线。
图9是纯化的fsp4(SEQ ID NO:23)的UPLC迹线。
图10是示出用含有fsp2(SEQ ID NO:21)和fsp4(SEQ ID NO:23)的肽混合物进行一轮刺激后T细胞增殖的图。
图11是示出用含有fsp2(SEQ ID NO:21)和fsp4(SEQ ID NO:23)的肽混合物进行两轮刺激后T细胞增殖的图。
图12是示出图3所示的来自供体2、3和4样品中T细胞增殖的另一种表现形式的图。
图13是示出在用含有fsp2(SEQ ID NO:21)、fsp8(SEQ ID NO:26)和fsp9(SEQ IDNO:27)的肽混合物刺激后由fsp2(SEQ ID NO:21)、fsp6(SEQ ID NO:24)或fsp7(SEQ IDNO:123)诱导的T细胞增殖的图。
图14是示出用含有fsp2(SEQ ID NO:21)、fsp8(SEQ ID NO:26)和fsp9(SEQ IDNO:27)的肽混合物对来自健康供体的PMBC进行两轮体外刺激后的T细胞增殖的图。
图15是示出用含有fsp2(SEQ ID NO:21)、fsp8(SEQ ID NO:26)和fsp9(SEQ IDNO:27)的肽混合物对来自健康供体的PMBC进行两和三轮体外刺激后的T细胞增殖的图。
图16是示出在用含有fsp2(SEQ ID NO:21)、fsp8(SEQ ID NO:26)和fsp9(SEQ IDNO:27)的肽混合物体外刺激来自健康供体的PMBC后，分别由fsp2(SEQ ID NO:21)、fsp8(SEQ ID NO:26)或fsp9(SEQ ID NO:27)单独地，或由含有fsp2(SEQ ID NO:21)、fsp8(SEQID NO:26)和fsp9(SEQ ID NO:27)的肽混合物诱导的T细胞增殖的图。
图17是示出在用含有fsp2(SEQ ID NO:21)、fsp8(SEQ ID NO:26)和fsp9(SEQ IDNO:27)的肽混合物体外刺激来自健康供体的PMBC后，分别由fsp2(SEQ ID NO:21)、fsp8(SEQ ID NO:26)或fsp9(SEQ ID NO:27)单独地，或由含有fsp2(SEQ ID NO:21)、fsp8(SEQID NO:26)和fsp9(SEQ ID NO:27)的肽混合物诱导的T细胞增殖的图。
图18是示出在用含有fsp2(SEQ ID NO:21)、fsp8(SEQ ID NO:26)和fsp9(SEQ IDNO:27)的肽混合物体外刺激来自健康供体的PMBC后，分别由fsp2(SEQ ID NO:21)、fsp8(SEQ ID NO:26)或fsp9(SEQ ID NO:27)单独地，或由含有fsp2(SEQ ID NO:21)、fsp8(SEQID NO:26)和fsp9(SEQ ID NO:27)的肽混合物诱导的T细胞增殖的图。
图19是示出在用含有fsp10(SEQ ID NO:28)、fsp11(SEQ ID NO:29)和fsp13(SEQID NO:31)的肽混合物体外刺激来自健康供体的PBMC后，分别由fsp11(SEQ ID NO:29)或fsp13(SEQ ID NO:31)单独地或含有fsp11(SEQ ID NO:29)和fsp13(SEQ ID NO:31)的肽混合物诱导的肽特异性T细胞增殖的图。
图20是示出在用含有fsp10(SEQ ID NO:28)、fsp11(SEQ ID NO:29)和fsp13(SEQID NO:31)的肽混合物对来自健康供体的PMBC进行两轮体外刺激后，由以每种肽的高浓度(10μM)或低浓度(3.3μM)的含有fsp10(SEQ ID NO:28)、fsp11(SEQ ID NO:29)和fsp13(SEQID NO:31)的肽混合物诱导的T细胞增殖的图。
图21是显示在用含有fsp17(SEQ ID NO:126)、fsp15(SEQ ID NO:127)和fsp16(SEQ ID NO:128)的肽混合物体外刺激来自健康供体的PMBC后，fsp15(SEQ ID NO:127)诱导的T细胞增殖的图。
图22是显示在用含有fsp17(SEQ ID NO:126)、fsp15(SEQ ID NO:127)和fsp16(SEQ ID NO:128)的肽混合物对来自健康供体的PMBC进行两轮体外刺激后，分别由fsp17(SEQ ID NO:126)、fsp15(SEQ ID NO:127)或fsp16(SEQ ID NO:128)单独地或由含有fsp17(SEQ ID NO:126)、fsp15(SEQ ID NO:127)和fsp16(SEQ ID NO:128)的肽混合物诱导的T细胞增殖的图。
序列表简述
SEQ ID NO:1是全长野生型TGFβR2蛋白。
SEQ ID NO:2是全长-1a移码的TGFβR2蛋白。
SEQ ID NO:3是全长-1a移码的TGFβR2蛋白，在第121和135位具有氨基酸取代。序列表中的自由文本：修饰的肽。
SEQ ID NO:4是全长野生型ASTE1蛋白。
SEQ ID NO:5是全长-1a移码的ASTE1蛋白。
SEQ ID NO:6是全长野生型TAF1β蛋白。
SEQ ID NO:7是全长-1a移码的TAF1β蛋白。
SEQ ID NO:8是全长野生型KIAA2018蛋白。
SEQ ID NO:9是全长-1a移码的KIAA2018蛋白，在第13位具有移码突变。
SEQ ID NO:10是全长-1a移码的KIAA2018蛋白，在第91位具有移码突变。
SEQ ID NO:11是全长-1a移码的KIAA2018蛋白，在第147位具有移码突变。
SEQ ID NO:12是全长-1a移码的KIAA2018蛋白，在第1016位具有移码突变。
SEQ ID NO:13是全长野生型SLC22A9蛋白。
SEQ ID NO:14是全长-1a移码的SLC22A9蛋白，在第327位具有移码突变。
SEQ ID NO:15是全长-1a移码的SLC22A9蛋白，在第335位具有移码突变。
SEQ ID NO:16是全长-1a移码的SLC22A9蛋白，在第533位具有移码突变。
SEQ ID NO:17是全长-1a移码的SLC22A9蛋白，在第327位具有移码突变和在第354位具有氨基酸取代。序列表中的自由文本：修饰的肽。
SEQ ID NO:18是全长-1a移码的SLC22A9蛋白，在第335位具有移码突变和在第344位具有氨基酸取代。序列表中的自由文本：修饰的肽。
SEQ ID NO:19是SEQ ID NO:2的33个氨基酸的肽，在本文中称为fsp5。
SEQ ID NO:20是肽-1a移码的TGFβR2，在本文中称为fsp1。
SEQ ID NO:21是-1a移码的TGFβR2的肽，在本文中称为fsp2。序列表中的自由文本：修饰的肽。
SEQ ID NO:22是-1a移码的TGFβR2的肽，在本文中称为fsp3。
SEQ ID NO:23是-1a移码的TGFβR2的肽，在本文中称为fsp4。序列表中的自由文本：修饰的肽。
SEQ ID NO:24是-1a移码的TGFβR2的肽，在本文中称为fsp6。
SEQ ID NO:25是-1a移码的TGFβR2的肽，在本文中称为fsp6a。序列表中的自由文本：修饰的肽。
SEQ ID NO:26是-1a移码的ASTE1的肽，在本文中称为fsp8。
SEQ ID NO:27是-1a移码的TAF1β的肽，在本文中称为fsp9。
SEQ ID NO:28是-1a移码的KIAA2018的肽，在本文中称为fsp10。
SEQ ID NO:29是-1a移码的SLC22A9的肽，在本文中称为fsp11。
SEQ ID NO:30是-1a移码的SLC22A9的肽，在本文中称为fsp12。序列表中的自由文本：修饰的肽。
SEQ ID NO:31是-1a移码的SLC22A9的肽，在本文中称为fsp13。
SEQ ID NO:32是-1a移码的SLC22A9的肽，在本文中称为fsp14。序列表中的自由文本：修饰的肽。
SEQ ID NO:33是mutTGFβR2的现有技术肽。
SEQ ID NO:34是mutTGFβR2的现有技术肽。
SEQ ID NO:35是mutTGFβR2的现有技术肽。
SEQ ID NO:36是mutTGFβR2的现有技术肽。
SEQ ID NO:37是mutTGFβR2的现有技术肽。
SEQ ID NO:38是mutTGFβR2的现有技术肽。
SEQ ID NO:39是mutTGFβR2的现有技术肽。
SEQ ID NO:40是mutTGFβR2的手动预测的共有序列。
SEQ ID NO:41是SYFPEITHI预测的mutTGFβR2的表位。
SEQ ID NO:42是SYFPEITHI预测的mutTGFβR2的表位。
SEQ ID NO:43是SYFPEITHI预测的mutTGFβR2的表位。
SEQ ID NO:44是SYFPEITHI预测的mutTGFβR2的表位。
SEQ ID NO:45是SYFPEITHI预测的mutTGFβR2的表位。
SEQ ID NO:46是SYFPEITHI预测的mutTGFβR2的表位。
SEQ ID NO:47是SYFPEITHI预测的mutTGFβR2的表位。
SEQ ID NO:48是SYFPEITHI预测的mutTGFβR2的表位。
SEQ ID NO:49是SYFPEITHI预测的mutTGFβR2的表位。
SEQ ID NO:50是用于搜索预测的表位的mutASTE1的序列。
SEQ ID NO:51是SYFPEITHI预测的mutASTE1的表位。
SEQ ID NO:52是SYFPEITHI预测的mutASTE1的表位。
SEQ ID NO:53是SYFPEITHI预测的mutASTE1的表位。
SEQ ID NO:54是SYFPEITHI预测的mutASTE1的表位。
SEQ ID NO:55是mutASTE1的预测的嵌套表位。
SEQ ID NO:56是SYFPEITHI预测的mutASTE1的表位。
SEQ ID NO:57是SYFPEITHI预测的mutASTE1的表位。
SEQ ID NO:58是SYFPEITHI预测的mutASTE1的表位。
SEQ ID NO:59是用于搜索预测的表位的mutTAF1β的序列。
SEQ ID NO:60是SYFPEITHI预测的mutTAF1β的表位。
SEQ ID NO:61是SYFPEITHI预测的mutTAF1β的表位。
SEQ ID NO:62是SYFPEITHI预测的mutTAF1β的表位。
SEQ ID NO:63是SYFPEITHI预测的mutTAF1β的表位。
SEQ ID NO:64是SYFPEITHI预测的mutTAF1β的表位。
SEQ ID NO:65是SYFPEITHI预测的mutTAF1β的表位。
SEQ ID NO:66是SYFPEITHI预测的mutTAF1β的表位。
SEQ ID NO:67是SYFPEITHI预测的mutTAF1β的表位。
SEQ ID NO:68是SYFPEITHI预测的mutTAF1β的表位。
SEQ ID NO:69是mutTAF1β的预测的嵌套表位。
SEQ ID NO:70是SYFPEITHI预测的mutTAF1β的表位。
SEQ ID NO:71是SYFPEITHI预测的mutTAF1β的表位。
SEQ ID NO:72是SYFPEITHI预测的mutTAF1β的表位。
SEQ ID NO:73是SYFPEITHI预测的mutTAF1β的表位。
SEQ ID NO:74是SYFPEITHI预测的mutTAF1β的表位。
SEQ ID NO:75是SYFPEITHI预测的mutTAF1β的表位。
SEQ ID NO:76是用于搜索预测的表位的mutKIAA2018的序列。
SEQ ID NO:77是SYFPEITHI预测的mutKIAA2018的表位。
SEQ ID NO:78是SYFPEITHI预测的mutKIAA2018的表位。
SEQ ID NO:79是SYFPEITHI预测的mutKIAA2018的表位。
SEQ ID NO:80是SYFPEITHI预测的mutKIAA2018的表位。
SEQ ID NO:81是SYFPEITHI预测的mutKIAA2018的表位。
SEQ ID NO:82是mutKIAA2018的预测的嵌套表位。
SEQ ID NO:83是SYFPEITHI预测的mutKIAA2018的表位。
SEQ ID NO:84是SYFPEITHI预测的mutKIAA2018的表位。
SEQ ID NO:85是SYFPEITHI预测的mutKIAA2018的表位。
SEQ ID NO:86是SYFPEITHI预测的mutKIAA2018的表位。
SEQ ID NO:87是SYFPEITHI预测的mutKIAA2018的表位。
SEQ ID NO:88是SYFPEITHI预测的mutKIAA2018的表位。
SEQ ID NO:89是SYFPEITHI预测的mutKIAA2018的表位。
SEQ ID NO:90是SYFPEITHI预测的mutKIAA2018的表位。
SEQ ID NO:91是SYFPEITHI预测的mutKIAA2018的表位。
SEQ ID NO:92是SYFPEITHI预测的mutKIAA2018的表位。
SEQ ID NO:93是SYFPEITHI预测的mutKIAA2018的表位。
SEQ ID NO:94是SYFPEITHI预测的mutKIAA2018的表位。
SEQ ID NO:95是SYFPEITHI预测的mutKIAA2018的表位。
SEQ ID NO:96是用于搜索预测的表位的mutSLC22A9的序列。
SEQ ID NO:97是SYFPEITHI预测的mutSLC22A9的表位。
SEQ ID NO:98是SYFPEITHI预测的mutSLC22A9的表位。
SEQ ID NO:99是SYFPEITHI预测的mutSLC22A9的表位。
SEQ ID NO:100是SYFPEITHI预测的mutSLC22A9的表位。
SEQ ID NO:101是SYFPEITHI预测的mutSLC22A9的表位。
SEQ ID NO:102是SYFPEITHI预测的mutSLC22A9的表位。
SEQ ID NO:103是SYFPEITHI预测的mutSLC22A9的表位。
SEQ ID NO:104是SYFPEITHI预测的mutSLC22A9的表位。
SEQ ID NO:105是SYFPEITHI预测的mutSLC22A9的表位。
SEQ ID NO:106是SYFPEITHI预测的mutSLC22A9的表位。
SEQ ID NO:107是SYFPEITHI预测的mutSLC22A9的表位。
SEQ ID NO:108是SYFPEITHI预测的mutSLC22A9的表位。
SEQ ID NO:109是SYFPEITHI预测的mutSLC22A9的表位。
SEQ ID NO:110是SYFPEITHI预测的mutSLC22A9的表位。
SEQ ID NO:111是mutSLC22A9的预测的嵌套表位。
SEQ ID NO:112是mutSLC22A9的预测的嵌套表位。
SEQ ID NO:113是SYFPEITHI预测的mutSLC22A9的表位。
SEQ ID NO:114是SYFPEITHI预测的mutSLC22A9的表位。
SEQ ID NO:115是SYFPEITHI预测的mutSLC22A9的表位。
SEQ ID NO:116是SYFPEITHI预测的mutSLC22A9的表位。
SEQ ID NO:117是SYFPEITHI预测的mutSLC22A9的表位。
SEQ ID NO:118是SYFPEITHI预测的mutSLC22A9的表位。
SEQ ID NO:119是SYFPEITHI预测的mutSLC22A9的表位。
SEQ ID NO:120是SYFPEITHI预测的mutSLC22A9的表位。
SEQ ID NO:121是SYFPEITHI预测的mutSLC22A9的表位。
SEQ ID NO:122是SYFPEITHI预测的mutSLC22A9的表位。
SEQ ID NO:123是-1a移码的TGFβR2的肽，在本文中称为fsp7。
SEQ ID NO:124是-1a移码的TGFβR2的肽，在本文中称为fsp1a。
SEQ ID NO:125是-1a移码的TGFβR2的肽，在本文中称为fsp1b。序列表中的自由文本：修饰的肽。
SEQ ID NO:126是-1a移码的TGFβR2的肽，在本文中称为fsp17。序列表中的自由文本：修饰的肽。
SEQ ID NO:127是-1a移码的ASTE1的肽，在本文中称为fsp15。
SEQ ID NO:128是-1a移码的TAF1β的肽，在本文中称为fsp16。
SEQ ID NO:129是-1a移码的TGFβR2的肽，在本文中称为fsp17a。
详细说明
总的来说，本发明涉及肽混合物，其包含两种或多种源自TGFβR2、ASTE1、TAF1β、KIAA2018和SLC22A9的肽，每一种都具有移码突变，并且涉及源自ASTE1、TAF1β、KIAA2018以及SLC22A2的肽，其中每一种均具有移码突变。每种肽都包括相关移码突变蛋白的片段，并且能够诱导针对相关移码突变蛋白的免疫应答。肽混合物包括至少两种能够诱导针对不同移码突变蛋白的免疫应答的肽。在一些实施方案中，每种移码突变蛋白是-1a移码突变体(本文分别称为“mutTGFβR2”、“mutASTE1”、“mutTAF1β”、“mutKIAA2018”和“mutSLC22A9”)。TGFβR2、ASTE1、TAF1β、KIAA2018和SLC22A9-1a移码突变蛋白各自的氨基酸序列如SEQ IDNO:2、5、7、9-12和14-16所示。
每种肽都包含这样的序列：其对应于由HLAI或HLA-II分子展示在细胞表面上的所述肽所源自的-1a移码突变蛋白(即mutTGFβR2(SEQ ID NO:2)、ASTE1(SEQ ID NO:5)、TAF1β(SEQ ID NO:7)、KIAA2018(SEQ ID NO:9-12)和SLC22A9(SEQ ID NO:14-16)之一)的免疫原性片段，和/或个体通常在所述个体的T细胞库中具有对其具有反应性的T细胞。每种肽，无论是以单一肽制剂还是肽混合物的形式存在，都能够诱导针对所述研究的肽所源自的-1a移码突变蛋白的免疫应答。优选地，免疫应答是T细胞应答，包括HLA-I限制性T细胞，如CD8+T细胞和HLA-II限制性T细胞，如CD4+T细胞。特别地，本发明的肽和本发明的肽混合物中的肽可包含多个嵌套表位，使得每种肽可包含一个以上HLA等位基因的表位。这提供了肽能够在具有不同HLA等位基因的患者中诱导免疫应答的优势，使得肽可用作通用治疗和/或疫苗。此外，本发明的肽很少或不含有它们所源自的蛋白的野生型氨基酸序列的氨基酸。换言之，本发明的肽大部分或全部源自由于移码突变而改变的相应蛋白的氨基酸序列。这提供了将肽诱导自身免疫应答的风险最小化的优点。此外，本发明的肽可在其C末端含有甘氨酸残基，其用作将肽缀合到其他分子(例如其他肽、载体、佐剂等)的接头。
一般应用于本发明的任何和所有肽以及本发明的肽混合物的肽的特征在下面立即列出，而更具体地应用于特定移码突变蛋白的肽的特征在后面描述。
一般适用特征
在一些实施方案中，所述肽或每种肽的免疫原性片段独立地包含至少8个、至少9个、至少10个、至少12个、至少14个、至少16个、至少18个、至少20个、至少22个、至少24个、至少26个、至少28个、至少30个或至少32个氨基酸。
在一些实施方案中，所述肽或每种肽的免疫原性片段独立地包含不超过100个、50个或40个氨基酸。例如，免疫原性片段包含不超过35个、33个、31个、29个、27个、25个、23个、21个、19个、17个、15个、13个、11个或9个氨基酸。
在一些实施方案中，所述肽或每种肽独立地包含至少9个、至少10个、至少12个、至少14个、至少16个、至少18个、至少20个、至少22个、至少24个、至少26个、至少28个、至少30个或至少32个氨基酸。
在一些实施方案中，所述肽或每种肽包含不超过100个、50个或40个氨基酸。例如，肽包含不超过35个、33个、31个、29个、27个、25个、23个、21个、19个、17个、15个、13个、11个或9个氨基酸。
因此，在一些实施方案中，所述肽或每种肽包含相关移码蛋白的免疫原性片段之外的其他氨基酸。然而，在其他实施方案中，所述肽或每种肽与免疫原性片段的长度相同，使得所述肽是相关移码突变蛋白的免疫原性片段。
在一些实施方案中，所述肽或每种肽包含来自相应蛋白的野生型氨基酸序列的不超过8个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽或每种肽包含来自相应蛋白的野生型氨基酸序列的不超过7个、不超过6个、不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个或不超过1个氨基酸。
当肽包含来自相应蛋白质的野生型氨基酸序列的一个或多个氨基酸时，这些氨基酸优选位于蛋白质的N末端。
在一些实施方案中，所述肽或每种肽不包含来自相应蛋白质的野生型氨基酸序列的氨基酸。因此，在这些实施方案中，所述肽或每种肽仅由来自由相应蛋白质中的移码突变产生的氨基酸序列的氨基酸组成。
在一些实施方案中，所述肽或每种肽在其C末端具有甘氨酸残基(即，C末端是甘氨酸残基)。
与免疫原性片段外的移码蛋白的序列同一性
所述肽或每种肽与免疫原性片段外的相关移码突变蛋白具有至少70％的序列同一性。在一些实施方案中，所述肽或每种肽与免疫原性片段外的相关移码突变蛋白独立地具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％或至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，所述肽或每种肽独立地与免疫原性片段外的相关移码突变蛋白具有100％的序列同一性。
片段在肽中的位置
在一些实施方案中，免疫原性片段从肽N末端的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11位开始。在一些实施方案中，免疫原性片段终止于从肽C末端的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11位。在其他实施方案中，免疫原性片段是肽的C末端或N末端。
ASTE1肽
在一些实施方案中，在能够诱导针对ASTE1-1a移码突变蛋白(mutASTE1；SEQ IDNO:5)的免疫应答的肽中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:26的至少8个连续氨基酸。在一些实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:26的至少9个连续氨基酸。在一些实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:26的至少10个连续氨基酸。在一些实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:26的至少12个连续氨基酸。在一些实施方案中，免疫原性片段包含SEQID NO:26的至少15个连续氨基酸。在一些实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:26的至少20个连续氨基酸。在其它实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:26的至少25个连续氨基酸。
在一些实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:26的不超过25个连续氨基酸。在一些实施方案中，所述肽包含SEQ ID NO:127的不超过31个连续氨基酸。
在一些实施方案中，所述肽包含至少10个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽包含至少12个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽包含至少15个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽包含20个氨基酸。在其他实施方案中，所述肽包含至少25个氨基酸。
在一些实施方案中，所述肽包含不超过40个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽包含不超过31个氨基酸。在其它实施方案中，所述肽包含不超过25个氨基酸。
在一些实施方案中，mutASTE1(SEQ ID NO:5)的免疫原性片段包含来自ASTE1的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:4)的不超过8个氨基酸。在一些实施方案中，mutASTE1(SEQ IDNO:5)的免疫原性片段包含来自ASTE1的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:4)的不超过5个氨基酸。在一些实施方案中，mutASTE1(SEQ ID NO:5)的免疫原性片段包含来自ASTE1的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:4)的不超过3个氨基酸。在一些实施方案中，mutASTE1(SEQ IDNO:5)的免疫原性片段不包含来自ASTE1的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:4)的任何氨基酸。在一些实施方案中，免疫原性片段仅具有来自ASTE1的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:4)的三个氨基酸。
在一些实施方案中，能够诱导针对mutASTE1(SEQ ID NO:5)的免疫应答的肽包含来自ASTE1的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:4)的不超过8个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽包含来自ASTE1的野生型序列(SEQ ID NO:4)的不超过5个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽包含来自ASTE1的野生型序列(SEQ ID NO:4)的不超过3个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽仅包含来自ASTE1的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:4)的3个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽不包含来自ASTE1的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:4)的任何氨基酸。
在一些实施方案中，mutASTE1(SEQ ID NO:5)的免疫原性片段或能够诱导针对mutASTE1(SEQ ID NO:5)的免疫应答的肽包含SEQ ID NO:5的第631和632位，其中SEQ IDNO:5的第631位氨基酸对应于野生型ASTE1(SEQ ID NO:4)的第631位，且SEQ ID NO:5的第632位氨基酸是由mutASTE1(SEQ ID NO:5)中的移码突变产生的氨基酸序列的第一个氨基酸。在一些实施方案中，免疫原性片段或肽包括SEQ ID NO:5的第630位至第632位、第629位至第632位、第628位至632位或第627位至第632位。在一些实施方案中，免疫原性片段或肽仅具有来自ASTE1的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:4)的3个氨基酸，它们是SEQ ID NO:4的第629、630和631位(即SEQ ID NO:5的第629、630和631位)。特别是，图21和22显示，仅具有来自ASTE1的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:4)的3个氨基酸的肽(fsp15；SEQ ID NO:127)能够诱导T细胞应答，因此当单独或以肽混合物施用时具有免疫原性。
当免疫原性片段或肽包含来自ASTE1的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:4)的一个或多个氨基酸时，这些氨基酸优选位于免疫原性片段或肽的N末端。在一些实施方案中，免疫原性片段仅具有来自ASTE1的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:4)的3个氨基酸，并且这些氨基酸位于免疫原性片段的N末端。在一些实施方案中，该肽仅具有来自ASTE1的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:4)的3个氨基酸，并且这些氨基酸位于肽的N末端。
在一些实施方案中，mutASTE1(SEQ ID NO:5)的免疫原性片段包括SEQ ID NO:26的第1位至第8位、第2位至第9位、第3位至第10位、第4位至第11位、第5位至第12位、第6位至第13位、第7位至第14位、第8位至第15位、第9位至第16位、第10位至第17位、第11位至第18位、第12位至第19位、第13位至第20位、第14位至第21位、第15位至第22位、第16位至第23位、第17位至第24位或第18位至第25位。
在一些实施方案中，mutASTE1(SEQ ID NO:5)的免疫原性片段包含SEQ ID NO:26的第1位至第9位或第8位至第16位。
在一些实施方案中，mutASTE1(SEQ ID NO:5)的免疫原性片段包括SEQ ID NO:26的第1位至第10位、第2位至第11位、第3位至第12位、第4位至第13位、第5位至第14位、第6位至第15位、第7位至第16位、第8位至第17位、第9位至第18位、第10位至第19位、第11位至第20位、第12位至第21位、第13位至第22位、第14位至第23位、第15位至第24位或第16位至第25位。
在一些实施方案中，mutASTE1(SEQ ID NO:5)的免疫原性片段包括SEQ ID NO:26的第1位至第15位、第2位至第16位、第3位至第17位、第4位至第18位、第5位至第19位、第6位至第20位、第7位至第21位、第8位至第22位、第9位至第23位、第9位至第24位或第10位至第25位。
在一些实施方案中，mutASTE1(SEQ ID NO:5)的免疫原性片段包含SEQ ID NO:26的第1位至第8位、第1位至第9位或第1位至第15位，并且免疫原性片段是肽的N末端。在一些实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:26的第4至11位或第4位至第18位，并且免疫原性片段从肽的N末端的第4位开始。在一些实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:26的第8至15位或第8位至第16位，并且免疫原性片段从肽的N末端的第8位开始。在一些实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:26的第9至16位或第9位至第23位，并且片段从肽的N末端的第9位开始。在一些实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:26的第11至18位或第11位至第25位，并且免疫原性片段终止于肽C末端的第8位。
在一些实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫原性片段由SEQ ID NO:26的氨基酸序列组成。在其他实施方案中，能够诱导针对mutASTE1(SEQ ID NO:5)的免疫应答的肽由SEQ ID NO:26的氨基酸序列组成。由SEQ IDNO:26序列组成的肽在本文中称为“fsp8”。特别是，图14显示含有fsp8的肽混合物具有免疫原性，因为该肽混合物在四分之三的供体中诱导T细胞应答。此外，图16-18显示，即使在用含有fsp8的肽混合物仅刺激一轮后，fsp8单独诱导了T细胞应答。因此，fsp8具有免疫原性。
在一些实施方案中，mutASTE1(SEQ ID NO:5)的免疫原性片段在其C末端包含甘氨酸残基。在一些实施方案中，能够诱导针对mutASTE1(SEQ ID NO:5)的免疫应答的肽在其C末端包含甘氨酸残基。图21和22显示，mutASTE1(SEQ ID NO:5)的肽(其C末端具有甘氨酸残基)能够诱导T细胞应答，无论是作为单个肽组合物还是作为肽混合物的一部分施用。
在一些实施方案中，mutASTE1(SEQ ID NO:5)的免疫原性片段或能够诱导针对mutASTE1(SEQ ID NO:5)的免疫应答的肽在其N末端包含来自ASTE1的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:4)的3个氨基酸，在其C末端包含甘氨酸残基。在一些实施方案中，免疫原性片段或肽具有来自ASTE1的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:4)的仅3个氨基酸，它们位于免疫原性片段或肽的N末端，并且免疫原性片段或肽在其C末端具有甘氨酸残基。在一些实施方案中，免疫原性片段或肽不包含来自ASTE1的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:4)的任何氨基酸，并且免疫原性片段或肽在其C末端具有甘氨酸残基。
在一些实施方案中，mutASTE1(SEQ ID NO:5)的免疫原性片段由SEQ ID NO:127的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，能够诱导针对mutASTE1(SEQ ID NO:5)的免疫应答的肽由SEQ ID NO:127的氨基酸序列组成。由SEQ ID NO:127的氨基酸序列组成的肽在本文中称为“fsp15”。特别是，如上所述，图21和22显示，含有fsp15的肽混合物和单独fsp15具有免疫原性，因为肽混合物和单独的肽诱导T细胞应答。因此，fsp15具有免疫原性。
TAF1β肽
在一些实施方案中，在能够诱导针对TAF1β-1a移码突变蛋白(mutTAF1β；SEQ IDNO:7)的免疫应答的肽中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:27的至少8个连续氨基酸。在一些实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:27的至少9个连续氨基酸。在一些实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:27的至少10个连续氨基酸。在一些实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:27的至少12个连续氨基酸。在一些实施方案中，免疫原性片段包含SEQID NO:27的至少15个连续氨基酸。在一些实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:27的至少20个。在其它实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:27的至少25个氨基酸。
在一些实施方案中，免疫原性片段包含不超过25个氨基酸。
在一些实施方案中，所述肽包含至少10个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽包含至少12个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽包含至少15个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽包含20个氨基酸。在其他实施方案中，所述肽包含至少25个氨基酸。
在一些实施方案中，所述肽包含不超过25个氨基酸。
在一些实施方案中，mutTAF1β(SEQ ID NO:7)的免疫原性片段包含来自TAF1β的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:6)的至少一个氨基酸(即，SEQ ID NO:7的第1位至第65位)，其与来自移码突变产生的氨基酸序列(SEQ ID NO:7的第66位至第90位)的至少1个氨基酸连续。因此，免疫原性片段可以是mutTAF1β(SEQ ID NO:7)的片段，其与不受移码突变影响的氨基酸序列和由移码突变产生的氨基酸序列重叠。在一些实施方案中，免疫原性片段包含来自TAF1β的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:6)的两个、三个、四个、五个、六个或七个连续氨基酸。在一些实施方案中，来自TAF1β野生型序列(SEQ ID NO:6)的至少一个氨基酸与来自移码突变产生的氨基酸序列的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个氨基酸连续。
在一些实施方案中，mutTAF1β(SEQ ID NO:7)的免疫原性片段包含来自TAF1β的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:6)的不超过8个氨基酸。在一些实施方案中，mutTAF1β(SEQ IDNO:7)的免疫原性片段包含来自TAF1β(SEQ ID NO:6)的野生型氨基酸序列的不超过7个、不超过5个、不超过3个、不超过2个或不超过1个氨基酸。在一些实施方案中，免疫原性片段具有来自TAF1β的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:6)的仅5个氨基酸。在一些实施方案中，免疫原性片段具有来自TAF1β的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:6)的仅1个氨基酸。
在一些实施方案中，所述肽包含来自TAF1β的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:6)的不超过8个氨基酸。在一些实施方案中，肽包含来自TAF1β的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:6)的不超过7个、不超过5个、不超过3个、不超过2个或不超过1个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽仅具有来自TAF1β的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:6)的5个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽仅具有来自TAF1β的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:6)的1个氨基酸。
当免疫原性片段或肽包含来自TAF1β的野生型序列(SEQ ID NO:6)的一个或多个氨基酸时，这些氨基酸优选位于免疫原性片段或肽的N末端。在一些实施方案中，免疫原性片段仅具有来自TAF1β的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:6)的5个氨基酸，并且这些氨基酸位于免疫原性片段的N末端。在一些实施方案中，所述肽仅具有来自TAF1β的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:6)的5个氨基酸，并且这些氨基酸位于肽的N末端。在一些实施方案中，免疫原性片段仅具有来自TAF1β的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:6)的1个氨基酸，并且该氨基酸位于免疫原性片段的N末端。在一些实施方案中，该肽仅具有来自TAF1β的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:6)的1个氨基酸，并且该氨基酸位于肽的N末端。
在一些实施方案中，mutTAF1β(SEQ ID NO:7)的免疫原性片段包含SEQ ID NO:7的第65位和第66位，其中SEQ ID NO:7的第65位的氨基酸对应于野生型TAF1β(SEQ ID NO:6)的第65位氨基酸，且SEQ ID NO:7的第66位的氨基酸是由mutTAF1β(SEQ ID NO:7)中的移码突变产生的氨基酸序列的第一个氨基酸。在一些实施方案中，免疫原性片段包含SEQ IDNO:7的第64位至第66位、第63位至第66位、第62位至第66位、第61位至第66位、第60位至第66位或第59位至第66位。在一些实施方案中，免疫原性片段或肽仅具有来自TAF1β的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:6)的1个氨基酸。在一些实施方案中，来自TAF1β的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:6)的一个氨基酸是SEQ ID NO:6的第65位(即SEQ ID NO:7的第65位)。特别是，图14显示了包含这种肽或免疫原性片段(即fsp9；SEQ ID NO:27)的肽混合物诱导T细胞应答，图16显示了这种肽或免疫原性片段(即，fsp9，SEQ ID NO:27)单独诱导T细胞应答。因此，仅具有来自TAF1β的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:6)的一个氨基酸(优选为SEQ IDNO:6的第65位)的免疫原性片段或肽具有免疫原性。
在一些实施方案中，免疫原性片段或肽仅具有来自TAF1β的野生型序列(SEQ IDNO:6)的5个氨基酸，这些氨基酸是SEQ ID NO:6的第61位至第65位(即SEQ ID NO:7的第61位至第65位)。图22显示，含有这种免疫原性片段或肽的肽混合物诱导T细胞应答，因此具有免疫原性。
特别地，由实施例6中使用的SYFPEITHI算法发现的预测的嵌套表位鉴定的预测的嵌套的表位(参见表11)包含来自TAF1β的野生型序列(SEQ ID NO:6)的七个氨基酸以及自TAF1β(SEQ ID NO:6)的移码突变产生的氨基酸序列的氨基酸。此外，表11中所示的几个HLAII类预测表位包含来自TAF1β野生型序列(SEQ ID NO:6)的一个或多个氨基酸。因此，预计桥接TAF1β野生型序列(SEQ ID NO:6)和移码突变产生的氨基酸序列的氨基酸残基对于mutTAF1β(SEQ ID NO:7)的某些免疫原性表位是重要的。
在一些实施方案中，mutTAF1β(SEQ ID NO:7)的免疫原性片段包括SEQ ID NO:27的第1位至第8位、第2位至第9位、第3位至第10位、第4位至第11位、第5位至第12位、第6位至第13位、第7位至第14位、第8位至第15位、第9位至第16位、第10位至第17位、第11位至第18位、第12位至第19位、第13位至第20位、第14位至第21位、第15位至第22位、第16位至第23位、第17位至第24位或第18位至第25位。
在一些实施方案中，mutTAF1β(SEQ ID NO:7)的免疫原性片段包含SEQ ID NO:27的第1位至第9位、第6位至第14位、第15位至第23位或第17位至第25位。
在一些实施方案中，mutTAF1β(SEQ ID NO:7)的免疫原性片段包括SEQ ID NO:27的第1位至第10位、第2位至第11位、第3位至第12位、第4位至第13位、第5位至第14位、第6位至第15位、第7位至第16位、第8位至第17位、第9位至第18位、第10位至第19位、第11位至第20位、第12位至第21位、第13位至第22位、第14位至第23位、第15位至第24位或第16至25位。
在一些实施方案中，mutTAF1β(SEQ ID NO:7)的免疫原性片段包括SEQ ID NO:27的第1位至第13位、第2位至第14位、第3位至第15位、第4位至第16位、第5位至第17位、第6位至第18位、第6位至第19位、第7位至第20位、第8位至第21位、第9位至第22位、第10位至第23位、第11位至第24位或第12至25位。
在一些实施方案中，mutTAF1β(SEQ ID NO:7)的免疫原性片段包含SEQ ID NO:27的第6位至第20位、第8位至第22位、第9位至第23位或第10位至第24位。
在一些实施方案中，mutTAF1β(SEQ ID NO:7)的免疫原性片段包含SEQ ID NO:27的第1位至第8位或第1位至第9位，并且免疫原性片段起始于肽的第1位。在一些实施方案中，mutTAF1β(SEQ ID NO:7)的免疫原性片段包含SEQ ID NO:27的第2位至第9位或第2位至第14位，并且免疫原性片段从肽的N末端的第2位开始。在一些实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:27的第6位至第13位、第6位至第14位或第6位至第20位，并且免疫原性片段从肽的N末端的第6位开始。在一些实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:27的第8位至第15位或第8位至第22位，并且免疫原性片段从肽的N末端的第8位开始。在一些实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:27的第9位至第16位或第9位至第23位，并且免疫原性片段从肽的N末端的第9位开始。在一些实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:27的第10位至18位或第10位至24位，并且免疫原性片段终止于肽C末端的第9位。在一些实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:27的第15位至第22位，并且免疫原性片段终止于肽C末端的第3位。在一些实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:27的第15位至第23位，并且免疫原性片段终止于肽C末端的第2位。在一些实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:27的第17位至第24位，并且免疫原性片段终止于肽C末端的第2位。在其它实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:27的第17位至第25位，并且免疫原性片段是肽的C末端。
在一些实施方案中，mutTAF1β(SEQ ID NO:7)的免疫原性片段包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫原性片段由SEQ ID NO:27的氨基酸序列组成。在其他实施方案中，能够诱导针对mutTAF1β(SEQ ID NO:7)的免疫应答的肽由SEQ ID NO:27的氨基酸序列组成。由SEQ ID NO:27序列组成的肽在本文中称为“fsp9”。特别地，图14显示含有fsp9的肽混合物具有免疫原性，因为该肽混合物在四分之三的供体中诱导T细胞应答。此外，图16-18显示，即使在用含有fsp9的肽混合物仅刺激一轮后，fsp9单独诱导T细胞应答。因此，fsp9具有免疫原性。
在一些实施方案中，mutTAF1β(SEQ ID NO:7)的免疫原性片段在其C末端包含甘氨酸残基。在一些实施方案中，能够诱导针对mutTAF1β(SEQ ID NO:7)的免疫应答的肽在其C末端包含甘氨酸残基。图22显示其C末端具有甘氨酸残基的mutTAF1β(SEQ ID NO:7)的肽，无论是否作为肽混合物的一部分施用，都能够诱导T细胞应答。
在一些实施方案中，mutTAF1β(SEQ ID NO:7)的免疫原性片段或能够诱导针对mutTAF1β(SEQ ID NO:7)的免疫应答的肽在其N端包含来自TAF1β的野生型氨基酸序列(SEQID NO:6)的5个氨基酸，在其C末端包含甘氨酸残基。在一些实施方案中，免疫原性片段或肽包含来自TAF1β的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:6)的1个氨基酸，并且在其C末端包含甘氨酸残基。在一些实施方案中，免疫原性片段或肽仅具有5个或仅具有1个来自TAF1β野生型序列(SEQ ID NO:6)的氨基酸，并且所述5个或1个氨基酸位于免疫原性片段或肽的N末端，并且免疫原性片段或肽在其C末端具有甘氨酸残基。
在一些实施方案中，mutTAF1β(SEQ ID NO:7)的免疫原性片段由SEQ ID NO:128的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，能够诱导针对mutTAF1β(SEQ ID NO:7)的免疫应答的肽由SEQ ID NO:128的氨基酸序列组成。由SEQ ID NO:128的氨基酸序列组成的肽在本文中称为“fsp16”。特别地，图22显示含有fsp16的肽混合物具有免疫原性，因为肽混合物诱导T细胞应答。
KIAA2018肽
在一些实施方案中，在能够诱导针对KIAA2018-1a移码突变蛋白(mutKIAA2018；SEQ ID NO:9-12)的免疫应答的肽中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:9-12之一的至少8个连续氨基酸，其中所述免疫原性片段包含分别来自SEQ ID NO:9的第13至37位、SEQ ID NO:10的第91至109位、SEQ ID NO:11的第147至167位和SEQ ID NO:12的第1016至1037位的至少一个氨基酸。在一些实施方案中，所述免疫原性片段包含SEQ ID NO:9-12之一的至少9个连续氨基酸，其中所述免疫源性片段包含来自SEQ ID NO:9的第13至37位、SEQ ID NO:10的第91至109位、SEQ ID NO:11的第147至167位和SEQ ID NO:12的第1016至1037位的至少一个氨基酸。在一些实施方案中，所述免疫原性片段包含SEQ ID NO:9-12之一的至少10个连续氨基酸，其中所述免疫原性片段包含来自SEQ ID NO:9的第13至37位、SEQ ID NO:10的第91至109位、SEQ ID NO:11的第147至167位和SEQ ID NO:12的第1016至1037位的至少一个氨基酸。在一些实施方案中，所述免疫原性片段包含SEQ ID NO:9-12之一的至少12个连续氨基酸，其中所述免疫原性片段包含来自SEQ ID NO:9的第13至37位、SEQ ID NO:10的第91至109位、SEQ ID NO:11的第147至167位和SEQ ID NO:12的第1016至1037位的至少一个氨基酸。在一些实施方案中，所述免疫原性片段包含SEQ ID NO:9-12之一的至少15个连续氨基酸，其中所述免疫原性片段包含来自SEQ ID NO:9的第13至37位、SEQ ID NO:10的第91至109位、SEQ ID NO:11的第147至167位和SEQ ID NO:12的第1016至1037位的至少一个氨基酸。在一些实施方案中，所述免疫原性片段包含SEQ ID NO:9-12之一的至少20个连续氨基酸，其中所述免疫原性片段包含来自SEQ ID NO:9的第13至37位、SEQ ID NO:10的第91至109位、SEQ ID NO:11的第147至167位和SEQ ID NO:12的第1016至1037位的至少一个氨基酸。在其它实施方案中，所述免疫原性片段包含SEQ ID NO:9-12之一的至少24个氨基酸，其中所述免疫原性片段包含来自SEQ ID NO:9的第13至37位、SEQ ID NO:10的第91至109位、SEQ ID NO:11的第147至167位和SEQ ID NO:12的第1016至1037位的至少一个氨基酸。
在一些实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:9-12之一的不超过24个连续氨基酸。
在一些实施方案中，mutKIAA2018(SEQ ID NO:9-12)的免疫原性片段包含来自KIAA2018的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:8)的至少一种肽(即SEQ ID NO:9的第1位至第12位、SEQ ID NO:10的第1位至第90位、SEQ ID NO:11的第1位至第146位或SEQ ID NO:12的第1位至第1015位)，其与来自移码突变产生的氨基酸序列(SEQ ID NO:9的第13位至第37位、SEQ ID NO:10的第91位至第109位、SEQ ID NO:11的第127位至第167位或SEQ ID NO:12的第1017位至第1037位)的至少一个氨基酸连续。因此，免疫原性片段可以是mutKIAA2018(SEQ ID NO:9-12)的片段，其与不受移码突变影响的氨基酸序列和由移码突变产生的氨基酸序列重叠。在一些实施方案中，免疫原性片段包含来自KIAA2018的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:8)的2个连续氨基酸。在一些实施方案中，来自KIAA2018野生型序列(SEQ IDNO:8)的至少一个氨基酸与来自移码突变产生的氨基酸序列的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个或22个氨基酸连续。
在一些实施方案中，mutKIAA2018的免疫原性片段(SEQ ID NO:9-12)或能够诱导针对mutKIAA18(SEQ ID NO:：9-12)的免疫应答的肽包含来自KIAA2018野生型序列(SEQ IDNO:8)的不超过8个氨基酸。在一些实施方案中，免疫原性片段或肽包含来自KIAA2018的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:8)的不超过3个、不超过2个或不超过1个氨基酸。在一些实施方案中，免疫原性片段或肽仅具有来自KIAA2018的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:8)的2个氨基酸。
在一些实施方案中，mutKIAA2018(SEQ ID NO:9-12)的免疫原性片段包含SEQ IDNO:12的第1015位和第1016位，其中SEQ ID NO:12的第1015位氨基酸对应于野生型KIAA2018(SEQ ID NO:8)的第1015位氨基酸，且SEQ ID NO:12的第1016位氨基酸是由mutKIAA2018(pos1016)中的移码突变产生的氨基酸序列的第一个氨基酸。在一些实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:12的第1014位至第1016位。在一些实施方案中，免疫原性片段或肽仅具有来自KIAA2018的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:8)的2个氨基酸，并且这些氨基酸是SEQ ID NO:8的第1014和1015位(对应于SEQ ID NO:12的第1014位和1015)。
特别地，由实施例6中使用的SYFPEITHI算法发现的预测的嵌套表位鉴定的预测的嵌套的表位(参见表12)包含来自KIAA2018的野生型序列(SEQ ID NO:8)的两个氨基酸以及来自KIAA2018中的移码突变产生的氨基酸序列的氨基酸。此外，表12中所示的HLA II类预测表位之一包含来自KIAA2018野生型序列(SEQ ID NO:8)的两个氨基酸。因此，预计桥接KIAA2018野生型序列(SEQ ID NO:8)和移码突变产生的氨基酸序列的氨基酸残基对于mutKIAA2018(SEQ ID NO:9-12)的某些免疫原性表位，特别是对于mutKIAA 2018(pos1016)(SEQ ID NO:12)的某些免疫源性表位是重要的。
当mutKIAA2018(SEQ ID NO:9-12)的免疫原性片段或能够诱导针对mutKIAA2018(SEQ ID NO:9-12)的免疫应答的肽包含来自KIAA2018的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:8)的一个或多个氨基酸时，这些氨基酸优选位于免疫原性片段或肽的N末端。在一些实施方案中，免疫原性片段或肽仅具有来自KIAA2018的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:8)的2个氨基酸，并且它们分别位于免疫原性片段或肽的N末端。
在一些实施方案中，能够诱导针对KIAA2018-1a移码突变蛋白(mutKIAA2018；SEQID NO:9-12)的免疫应答的肽包含至少9个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽包含至少10个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽包含至少12个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽包含至少15个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽包含20个氨基酸。在其他实施方案中，所述肽包含至少24个氨基酸。
在一些实施方案中，能够诱导针对KIAA2018-1a移码突变蛋白(mutKIAA2018；SEQID NO:9-12)的免疫应答的肽包含不超过40个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽包含不超过24个氨基酸。
在一些实施方案中，mutKIAA2018(SEQ ID NO:9-12)的免疫原性片段包括SEQ IDNO:28的第1位至第8位、第2位至第9位、第3位至第10位、第4位至第11位、第5位至第12位、第6位至第13位、第7位至第14位、第8位至第15位、第9位至第16位、第10位至第17位、第11位至第18位、第12位至第19位、第13位至第20位、第14位至第21位、第15位至第22位、第16位至第23位或第17位至第24位。
在一些实施方案中，mutKIAA2018(SEQ ID NO:9-12)的免疫原性片段包含SEQ IDNO:28的第3位至第11位、第9位至第17位、第13位至第21位、第14位至第22位或第16位至第24位。
在一些实施方案中，mutKIAA2018(SEQ ID NO:9-12)的免疫原性片段包括SEQ IDNO:28的第1位至第10位、第2位至第11位、第3位至第12位、第4位至第13位、第5位至第14位、第6位至第15位、第7位至第16位、第8位至第17位、第9位至第18位、第10位至第19位、第11位至第20位、第12位至第21位、第13位至第22位、第14位至第23位或第15位至第24位。
在一些实施方案中，mutKIAA2018(SEQ ID NO:9-12)的免疫原性片段包括SEQ IDNO:28的第1位至第15位、第2位至第16位、第3位至第17位、第4位至第18位、第5位至第19位、第6位至第20位、第7位至第21位、第8位至第22位、第9位至第23位、第9位至第24位。
在一些实施方案中，mutKIAA2018(SEQ ID NO:9-12)的免疫原性片段包含SEQ IDNO:28的第1位至第8位或第1位至第15位，并且免疫原性片段是肽的N末端。在一些实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:28的第3位至第10位或第3位至第11位，并且免疫原性片段从肽的N末端的第3位开始。在一些实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:28的第5位至第12位或第5位至第19位，并且免疫原性片段从肽的N末端的第5位开始。在一些实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:28的第7位至第14位或第7位至第21位，并且免疫原性片段从肽的N末端的第7位开始。在一些实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:28的第8至15位或第8位至第22位，并且免疫原性片段从肽的N末端的第8位开始。在一些实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:28的第9位至第16位或第9位至第17位，并且免疫原性片段从肽的N末端的第9位开始。在一些实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:28的第10位至第17位，并且免疫原性片段终止于肽的C末端的第8位。在一些实施方案中，免疫原性片段包括第16位至第24位或第10位至第24位，并且免疫原性片段是肽的C末端。在一些实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:28的第13位至第20位，并且免疫原性片段终止于肽的C末端的第5位。在一些实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:28的第14至21位或第13位至第21位，并且免疫原性片段终止于肽的C末端的第4位。在一些实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:28的第14位至第22位，并且免疫原性片段终止于肽的C末端的第3位。在其它实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:28的第16位至第23位，并且免疫原性片段终止于肽的C末端的第2位。
在一些实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫原性片段由SEQ ID NO:28的氨基酸序列组成。在其他实施方案中，能够诱导针对mutKIAA2018(SEQ ID NO:9-12)的免疫应答的肽由SEQ ID NO:28的氨基酸序列组成。由SEQ ID NO:28序列组成的肽在本文中称为“fsp10”。图20显示含有fsp10(SEQ ID NO:28)的肽混合物在低剂量(每种肽3.3μM)和高剂量(每种肽10μM)下都具有免疫原性。
在一些实施方案中，mutKIAA2018(SEQ ID NO:9-12)的免疫原性片段或能够诱导针对mutKIAA18(SEQ ID NO:9-12)的免疫应答的肽在其C末端包含甘氨酸残基。
SLC22A9肽
在一些实施方案中，在能够诱导针对SCL22A9-1a移码突变蛋白(SEQ ID NO:14-16)的免疫应答的肽中，所述免疫原性片段包含SEQ ID NO:14-18之一的至少8个连续氨基酸，其中所述免疫原性片段包含分别来自SEQ ID NO:14的第327至400位、SEQ ID NO:15的第335至400位，SEQ ID NO:16的第533至549位、SEQ ID NO:17的第327至400位和SEQ IDNO:18的第335至400位的至少一个氨基酸。在一些实施方案中，所述免疫原性片段包含SEQID NO:14-18之一的至少9个连续氨基酸，其中所述免疫原性片段包含SEQ ID NO:14的第327至400位、SEQ ID NO:15的第335至400位，SEQ ID NO:16的第533至549位、SEQ ID NO:17的第327至400位和SEQ ID NO:18的第335至400位的至少一个氨基酸。在一些实施方案中，所述免疫原性片段包含SEQ ID NO:14-18之一的至少10个连续氨基酸，其中所述免疫原性片段包含SEQ ID NO:14的第327至400位、SEQ ID NO:15的第335至400位，SEQ ID NO:16的第533至549位、SEQ ID NO:17的第327至400位和SEQ ID NO:18的第335至400位的至少一个氨基酸。在一些实施方案中，所述免疫原性片段包含SEQ ID NO:14-18之一的至少12个氨基酸，其中所述免疫原性片段包含SEQ ID NO:14的第327至400位、SEQ ID NO:15的第335至400位，SEQ ID NO:16的第533至549位、SEQ ID NO:17的第327至400位和SEQ ID NO:18的第335至400位的至少一个氨基酸。在一些实施方案中，所述免疫原性片段包含SEQ ID NO:14-18之一的至少15个连续氨基酸，其中所述免疫原性片段包含SEQ ID NO:14的第327至400位、SEQ ID NO:15的第335至400位，SEQ ID NO:16的第533至549位、SEQ ID NO:17的第327至400位和SEQ ID NO:18的第335至400位的至少一个氨基酸。在一些实施方案中，所述免疫原性片段包含SEQ ID NO:14-18之一的至少20个连续氨基酸，其中所述免疫原性片段包含SEQ ID NO:14的第327至400位、SEQ ID NO:15的第335至400位，SEQ ID NO:16的第533至549位、SEQ ID NO:17的第327至400位和SEQ ID NO:18的第335至400位的至少一个氨基酸。在一些实施方案中，所述免疫原性片段包含SEQ ID NO:14-18之一的至少25个连续氨基酸，其中所述免疫原性片段包含SEQ ID NO:14的第327至400位、SEQ ID NO:15的第335至400位，SEQ ID NO:16的第533至549位、SEQ ID NO:17的第327至400位和SEQ ID NO:18的第335至400位的至少一个氨基酸。在其它实施方案中，所述免疫原性片段包含SEQ ID NO:14-18之一的至少28个连续氨基酸，其中所述免疫原性片段包含SEQ ID NO:14的第327至400位、SEQ ID NO:15的第335至400位，SEQ ID NO:16的第533至549位、SEQ ID NO:17的第327至400位和SEQ ID NO:18的第335至400位的至少一个氨基酸。
在一些实施方案中，mutSLC22A9(SEQ ID NO:14-16)的免疫原性片段包含不超过28个氨基酸。
在一些实施方案中，能够诱导针对mutSLC22A9(SEQ ID NO:14-16)的免疫应答的肽包含至少8个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽包含至少9个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽包含至少10个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽包含至少12个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽包含至少15个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽包含至少20个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽包含至少25个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽包含至少28个氨基酸。
在一些实施方案中，能够诱导针对mutSLC22A9(SEQ ID NO:14-16)的免疫应答的肽包含不超过40个氨基酸。在其它实施方案中，所述肽包含不超过28个氨基酸。
在一些实施方案中，mutSLC22A9(SEQ ID NO:14-16)的免疫原性片段或能够诱导针对mutSLC22A9(SEQ ID NO:14-16)的免疫应答的肽包含来自SLC22A9的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:13)的不超过8个氨基酸。在一些实施方案中，免疫原性片段或肽包含来自SLC22A9的野生型序列(SEQ ID NO:13)的不超过3个、不超过2个或不超过1个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽的免疫原性片段或所述肽不包含来自SLC22A9的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:13)的任何氨基酸。
在一些实施方案中，mutSLC22A9(SEQ ID NO:14-16)的免疫原性片段或能够诱导针对mutSLC22A9(SEQ ID NO:：14-16)的免疫应答的肽在其C末端包含甘氨酸残基。
fsp11和fsp13
在一些实施方案中，mutSLC22A9(SEQ ID NO:14-16)的免疫原性片段包括SEQ IDNO:29的第1位至第8位、第4位至第11位、第7位至第14位、第8位至第15位、第9位至第16位、第10位至第17位、第11位至第18位或第14位至第21位、或SEQ ID NO:31的第1位至第8位、第3位至第10位、第4位至第11位或第10至18位。
在一些实施方案中，mutSLC22A9(SEQ ID NO:14-16)的免疫原性片段包含SEQ IDNO:29的第8位至第16位、第9位至第17位或第14位至第22位，或SEQ ID NO:31的第10位至第18位。
在一些实施方案中，mutSLC22A9(SEQ ID NO:14-16)的免疫原性片段包括SEQ IDNO:29的第1位至第10位、第4位至第13位、第7位至第16位、第8位至第17位、第10位至第19位或第11位至第20位、或SEQ ID NO:31的第1位至第10位、第3位至第12位或第4位至第13位。
在一些实施方案中，mutSLC22A9(SEQ ID NO:14-16)的免疫原性片段包括SEQ IDNO:29的第1位至第15位、第4位至第19位、第7位至第21位、第8位至第22位、第10位至第24位或第11位至第25位、或SEQ ID NO:31的第1位至第15位、第3位至第17位或第4位至第18位。
在一些实施方案中，mutSLC22A9(SEQ ID NO:14-16)的免疫原性片段包含SEQ IDNO:29的第1位至第8位或第1位至第15位，并且免疫原性片段是肽的N末端。在一些实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:29的第4位至第11位或第4位至第19位，并且片段从肽的N末端的第4位开始。在一些实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:29的第7位至第14位或第7位至第21位，并且免疫原性片段从肽的N末端的第7位开始。在一些实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:29的第8位至第15位、第8位至第16位或第8位至第22位，并且免疫原性片段从肽的N末端的第8位开始。在一些实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:29的第9位至第16位或第9位至第17位，并且免疫原性片段从肽的N末端的第9位开始。在一些实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:29的第10位至第18位或第10位至第24位，并且免疫原性片段从肽的第10位开始。在一些实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:29的第11位至第18位或第11位至第25位，并且免疫原性片段从肽的N末端的第11位开始。在一些实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:29的第14位至第21位，并且免疫原性片段终止于肽的C末端的第8位。在一些实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:29的第14位至第22位，并且免疫原性片段终止于肽的C末端的第7位。
在一些实施方案中，mutSLC22A9(SEQ ID NO:14-16)的免疫原性片段包含SEQ IDNO:31的第1位至第8位或第1位至第15位，并且免疫原性片段是肽的N末端。在一些实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:31的第3位至第10位或第3位至第17位，并且免疫原性片段从肽的N末端的第3位开始。在一些实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:31的第4位至第11位或第4位至第18位，并且免疫原性片段从肽的第4位开始。在一些实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:31的第10位至第18位，并且免疫原性片段从肽的N末端的第10位开始。
在一些实施方案中，mutSLC22A9(SEQ ID NO:14-16)的免疫原性片段不包含来自SLC22A9的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:13)的任何氨基酸。
在一些实施方案中，mutSLC22A9(SEQ ID NO:14-16)的免疫原性片段包含SEQ IDNO:29或SEQ ID NO:31的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫原性片段由SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:31的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，能够诱导针对mutSLC22A9(SEQ IDNO:14-16)的免疫应答的肽由SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:31的氨基酸序列组成。当肽由SEQID NO:29的氨基酸序列组成时，所述肽在本文中称为“fsp11”。当肽由SEQ ID NO:31的氨基酸序列组成时，所述肽在本文中称为“fsp13”。图19显示fsp11(SEQ ID NO:29)单独或作为肽混合物的一部分具有免疫原性，因为仅在一轮刺激后两者都诱导了T细胞应答。图19还显示含有fsp13(SEQ ID NO:31)的肽混合物具有免疫原性。此外，图20显示，含有fsp11和fsp13两者的肽混合物在高剂量(每种肽10μM)和低剂量(每种肽3.3μM)下都具有免疫原性，因为两轮刺激后，两者都会诱导T细胞应答。
Fsp12和fsp14
在一些实施方案中，mutSLC22A9(SEQ ID NO:14-16)的免疫原性片段与mutSLC22A9(SEQ ID NO:14-16)的天然存在的氨基酸序列相比具有氨基酸取代。在一些实施方案中，免疫原性片段是mutSLC22A9(pos327)(SEQ ID NO:14)或mutSLC22A9(pos335)(SEQ ID NO:15)的片段，并且与-1a移码突变蛋白的天然存在的氨基酸序列相比具有氨基酸取代。在一些实施方案中，免疫原性片段是SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18的片段，并且分别包含SEQ ID NO:17的第354位或SEQ ID NO:18的第344位。在一些实施方案中，免疫原性片段包含来自SEQ ID NO:17和18之一的至少8个连续氨基酸，分别包括SEQ ID NO:17的第354位或SEQ ID NO:18的第344位。在一些实施方案中，免疫原性片段包含来自SEQ ID NO:17和18之一的至少9个连续氨基酸，分别包括SEQ ID NO:17的第354位或SEQ ID NO:18的第344位。特别地，SEQ ID NO:17的第354位对应于mutSLC22A9(pos327)(SEQ ID NO:14)的第354位，而SEQ ID NO:18的第344位对应于mutSL C22A((pos335)(SEQ ID NO:15)的第344位，两者都是半胱氨酸残基。在SEQ ID NO:17的第354位和SEQ ID NO:18的第344位的氨基酸取代是从半胱氨酸到任何其他氨基酸。因此，SEQ ID NO:17的第354位和SEQ ID NO:18的第344位的氨基酸独立地是丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸中的一种。优选地，氨基酸取代为甘氨酸。在下文中提及具有从半胱氨酸到任何其他氨基酸的氨基酸取代的mutSLC22A9(SEQ ID NO:14-16)的免疫原性片段时，应理解优选的氨基酸取代是从半胱氨酸到甘氨酸。
从半胱氨酸到任何其他氨基酸，特别是到甘氨酸的这种氨基酸取代的优点与下文关于能够诱导针对mutTGFβR2(SEQ ID NO:2)的免疫应答的肽的解释相同。
在一些实施方案中，具有氨基酸取代的mutSLC22A9(SEQ ID NO:14-16)的免疫原性片段包含不超过28个氨基酸。
在一些实施方案中，具有氨基酸取代的mutSLC22A9(SEQ ID NO:14-16)的免疫原性片段包括SEQ ID NO:17的第348位至第355位、第349位至第356位、第350位至第357位、第351位至第358位、第352位至第359位、第353位至第360位、第354位至第361位、或SEQ IDNO:18的第338位至第345位、第339位至第346位、第340位至第347位、第341位至第348位、第342位至第349位、第343位至第350位或第344位至第351位。
在一些实施方案中，具有氨基酸取代的mutSLC22A9(SEQ ID NO:14-16)的免疫原性片段包括SEQ ID NO:17的第348位至第357位、第349位至第358位、第350位至第359位、第351位至第360位、第352位至第361位、第353位至第362位、第354位至第363位、或SEQ IDNO:18的第338位至第347位、第339位至第348位、第340位至第349位、第341位至第350位、第342位至第351位、第343位至第352位或第344位至第353位。
在一些实施方案中，具有氨基酸取代的mutSLC22A9(SEQ ID NO:14-16)的免疫原性片段包括SEQ ID NO:17的第348位至第362位、第349位至第363位、第350位至第364位、第351位至第365位、第352位至第366位、第353位至第367位、第354位至第368位、或SEQ IDNO:18的第338位至第352位、第339位至第353位、第340位至第354位、第341位至第355位、第342位至第356位、第343位至第357位或第344位至第358位。
在一些实施方案中，所述免疫原性片段不包含来自SLC22A9的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:13)的任何氨基酸。
在一些实施方案中，具有氨基酸取代的mutSLC22A9(SEQ ID NO:14-16)的免疫原性片段包括SEQ ID NO:30的第1位至第8位、第1位至第10位、第1位至第15位、第2位至第9位、第2位至第11位或第2位至第16位。在一些实施方案中，具有氨基酸取代的mutSLC22A9(SEQ ID NO:14-16)的免疫原性片段包含SEQ ID NO:30的第1位至第8位、第1位至第10位或第1位至第15位，并且免疫原性片段是肽的N末端。在其它实施方案中，具有氨基酸取代的mutSLC22A9(SEQ ID NO:14-16)的免疫原性片段包含SEQ ID NO:30的第2位至第9位、第2位至第11位或第2位至第16位，并且免疫原性片段从肽的N末端的第2位开始。在一些实施方案中，具有氨基酸取代的mutSLC22A9(SEQ ID NO:14-16)的免疫原性片段包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有氨基酸取代的mutSLC22A9(SEQ ID NO:14-16)的免疫原性片段由SEQ ID NO:30的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，能够诱导针对mutSLC229(SEQ ID NO:14-16)的免疫应答的肽由SEQ ID NO:30的氨基酸序列组成。当肽由SEQ ID NO:30序列组成时，在本文中称为“fsp12”。
在一些实施方案中，具有氨基酸取代的mutSLC22A9(SEQ ID NO:14-16)的免疫原性片段包括SEQ ID NO:32的第1位至第8位、第1位至第10位、第1位至第15位、第2位至第9位、第2位至第11位、第2位至第16位、第3位至第10位、第3位至第12位或第3位至第17位。在一些实施方案中，具有氨基酸取代的mutSLC22A9(SEQ ID NO:14-16)的免疫原性片段包含SEQ ID NO:32的第1位至第8位、第1位至第10位、第1位至第15位，并且免疫原性片段是肽的N末端。在一些实施方案中，具有氨基酸取代的mutSLC22A9(SEQ ID NO:14-16)的免疫原性片段包含SEQ ID NO:32的第2位至第9位、第2位至第11位或第2位至第16位，并且免疫原性片段从肽的N末端的第2位开始。在一些实施方案中，具有氨基酸取代的mutSLC22A9(SEQ IDNO:14-16)的免疫原性片段包含SEQ ID NO:32的第3位至第12位或第3位至第17位，并且免疫原性片段从肽的N末端的第3位开始。在一些实施方案中，具有氨基酸取代的mutSLC22A9(SEQ ID NO:14-16)的免疫原性片段包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有氨基酸取代的mutSLC22A9(SEQ ID NO:14-16)的免疫原性片段由SEQ ID NO:32的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，能够诱导针对mutSLC229(SEQ ID NO:14-16)的免疫应答的肽由SEQ ID NO:32的氨基酸序列组成。当肽由SEQ ID NO:32序列组成时，在本文中称为“fsp14”。
肽混合物
本发明还提供包含至少两种选自上述肽和如下所述能够诱导针对TGFβR2-1a移码突变蛋白(mutTGFβR2；SEQ ID NO:2)的免疫应答的肽的不同肽的混合物。肽混合物包含第一肽和第二肽，其中所述第一肽和所述第二肽中的每一个独立地是能够诱导针对TGFβR2-1a移码突变蛋白(mutTGFβR2；SEQ ID NO:2)、ASTE1-1a移码突变蛋白(mutASTE1；SEQ IDNO:5)、TAF1β-1a移码突变蛋白(mutTAFβ1b；SEQ ID NO:7)、KIAA2018-1a移码突变蛋白(mutKIAA2018；SEQ ID NO:9-12)或SLC22A9-1a移码突变蛋白(SEQ ID NO:14-16)的免疫应答的肽，如本文所述，其中所述第一肽不同于所述第二肽。优选地，第一肽能够诱导针对与第二肽不同的移码突变蛋白的免疫应答。
TGFβR2肽
在一些实施方案中，在能够诱导针对TGFβR2-1a移码突变蛋白(mutTGFβR2；SEQ IDNO:2)的免疫应答的肽中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:3的至少8个连续氨基酸，包括第121和135位中的至少一个，或SEQ ID NO:19的至少8个连续氨基酸。在一些实施方案中，免疫原性片段包含至少9个连续氨基酸。在一些实施方案中，免疫原性片段包含至少10个连续氨基酸。在一些实施方案中，免疫原性片段包含至少12个连续氨基酸。在一些实施方案中，免疫原性片段包含至少15个连续氨基酸。在一些实施方案中，免疫原性片段包含至少17个连续氨基酸。在一些实施方案中，免疫原性片段包含至少20个连续氨基酸。在其它实施方案中，免疫原性片段包含至少24个连续氨基酸。在进一步的实施方案中，该片段包含至少33个连续氨基酸。
在一些实施方案中，免疫原性片段包含不超过50个氨基酸。在一些实施方案中，免疫原性片段包含不超过33个氨基酸。在其他实施方案中，该片段包含不超过27、24、20、17或9个氨基酸。
在一些实施方案中，能够诱导针对mutTGFβR2(SEQ ID NO:2)的免疫应答的肽包含至少9个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽包含至少17个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽包含至少20个氨基酸。在其他实施方案中，所述肽包含至少24个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽包含至少27个氨基酸。在进一步的实施方案中，所述肽包含至少33个氨基酸。
在一些实施方案中，所述肽包含不超过33个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽包含不超过27个氨基酸。在其它实施方案中，所述肽包含不超过24个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽包含不超过20个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽包含不超过17个氨基酸。在进一步的实施方案中，所述肽包含不超过9个氨基酸。
在一些实施方案中，免疫原性片段或肽在其C末端包含甘氨酸残基。
桥接区
在一些实施方案中，mutTGFβR2(SEQ ID NO:2)的免疫原性片段或肽包含来自TGFβR2的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:1)的至少一个氨基酸(即，SEQ ID NO:2的第1位至第127位)，其与来自移码突变产生的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的第128位至第161位)的至少1个氨基酸连续。因此，免疫原性片段或肽可以是mutTGFβR2(SEQ ID NO:2)的片段，其与不受移码突变影响的氨基酸序列和由移码突变产生的氨基酸序列重叠。在一些实施方案中，免疫原性片段或肽包含来自TGFβR2的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:1)的2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个连续氨基酸。在一些实施方案中，来自TGFβR2野生型序列(SEQ ID NO:1)的至少一个氨基酸与来自移码突变产生的氨基酸序列的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个氨基酸连续。在一些实施方案中，免疫原性片段或肽仅具有来自TGFβR2的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:1)的8个氨基酸。在一些实施方案中，免疫原性片段或肽不含有来自TGFβR2的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:1)的氨基酸。
在一些实施方案中，mutTGFβR2(SEQ ID NO:2)的免疫原性片段包含SEQ ID NO:2的第127位和第128位，其中SEQ ID NO:2中第127位的氨基酸对应于野生型TGFβR2(SEQ IDNO:1)的第127位的氨基酸。这对应于SEQ ID NO:19的第8和9位以及SEQ ID NO:3的第127和128位。在一些实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的第126位至第128位、第125位至第128位、第124位至第128位、第123位至第128位、第122位至第128位、第121位至第128位或第120位至第128位(分别对应于SEQ ID NO:19的第7位至第9位、第6位至第9位、第5位至第9位、第4位至第9位、第3位至第9位、第2位至第9位或第1位至9位)。
特别地，预计桥接TGFβR2的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:1)和移码突变产生的氨基酸序列的至少两个氨基酸残基有助于提供有效的表位，并有助于肽具有特别良好的免疫原性。特别地，图10和11示出包含来自TGFβR2野生型序列(SEQ ID NO:1)的氨基酸的肽(即fsp1(SEQ ID NO:20)、fsp2(SEQ ID NO:21)和fsp5(SEQ ID NO:19))比不包含来自TGFβR2(SEQ ID NO:1)野生型序列的氨基酸的肽(即fsp3(SEQ ID NO:22)和fsp4(SEQ ID NO:23))更具有免疫原性。还预期存在来自TGFβR2野生型序列(SEQ ID NO:1)的一个以上氨基酸，与来自移码突变产生的氨基酸序列的至少一个氨基酸连续，可能会改善肽的免疫原性。特别地，预期来自TGFβR2的野生型序列(SEQ ID NO:1)的五个、六个、七个或八个氨基酸与来自移码突变产生的氨基酸序列的至少一个氨基酸连续，将特别有助于肽的免疫原性。然而，优选所述肽含有来自TGFβR2野生型序列的不超过8个氨基酸，以平衡改善的免疫原性和降低肽诱导自身免疫应答的风险的要求。
Fsp1、fsp3、fsp5和fsp6
在一些实施方案中，mutTGFβR2(SEQ ID NO:2)的免疫原性片段包含SEQ ID NO:19的第6至13位、SEQ ID NO:19的第10至18位或SEQ ID NO:19的第18至33位。在这种情况下，所述肽包含不超过40个氨基酸。在一些实施方案中，肽包含不超过27个氨基酸。在一些实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:19的第6至17位、第7位至第22位或第16位至第33位。在一些实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:19的第2至22位。在一些实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:19的第6至17位，并且免疫原性片段从肽的N末端的第6位开始。在一些实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:19的第2位至第22位，并且免疫原性片段从肽的N末端的第2位开始。在其他实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:19的第1位至第17位、第1位至第24位或第1位至第27位，并且免疫原性片段是肽的N末端。在一些实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:19的第16位至第33位，并且免疫原性片段从肽的N末端的第3位开始。在一些实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:19的第14位至第33位。在一些实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:19的第14位至第33位，并且所述片段是肽的N末端。
在一些实施方案中，所述肽包含其C末端的甘氨酸残基。
在一些实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:129的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫原性片段由SEQID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:129的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，能够诱导针对mutTGFβR2的免疫应答的肽由SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:129的氨基酸序列组成。当肽由SEQ IDNO:20的氨基酸序列组成时，该肽在本文中称为“fsp1”。当肽由SEQ ID NO:22的氨基酸序列组成时，该肽在本文中称为“fsp3”。当肽由SEQ ID NO:19的氨基酸序列组成时，该肽在本文中称为“fsp5”。当肽由SEQ ID NO:24的氨基酸序列组成时，该肽在本文中称为fsp6。当肽由SEQ ID NO:129的氨基酸序列组成时，该肽在本文中称为“fsp17a”。
Fsp2、fsp4和fsp6a
在一些实施方案中，mutTGFβR2(SEQ ID NO:2)的免疫原性片段与mutTGFβR2(SEQID NO:2)的天然存在的氨基酸序列相比具有氨基酸取代。因此，mutTGFβR2(SEQ ID NO:2)的免疫原性片段包含SEQ ID NO:3的至少8个连续氨基酸，并且包括SEQ ID NO:3的第121和135位中的至少一个。在一些实施方案中，肽仅包含SEQ ID NO:3的第121和135位之一。特别地，SEQ ID NO:3的第121和135位分别对应于mutTGFβR2(SEQ ID NO:2)的第121和135位，它们都是半胱氨酸残基。SEQ ID NO:3的第121和135位的氨基酸取代是从半胱氨酸到任何其他氨基酸。因此，SEQ ID NO:3的第121和135位的氨基酸独立地是丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸之一。优选地，氨基酸取代为甘氨酸。
SEQ ID NO:3的第121和/或135位氨基酸从半胱氨酸置换为任何其他氨基酸，可用于预防关于肽的生产、稳定性、质量和免疫学的问题。特别地，能够诱导针对TGFβR2的免疫应答的肽来源于优化的共有序列(SEQ ID NO:19)，如实施例中所讨论的和图1所示，并且已经发现，由于其长度，优化的共有的序列可能难以合成。此外，优化的共有序列(SEQ ID NO:19)的溶解度、稳定性和免疫原性可能不足。特别地，由于分子间和/或分子内二硫键的形成，肽中一个或多个半胱氨酸残基的存在可导致肽的分子重排和/或聚合。这种重排和/或聚合可能降低肽的免疫效力，并且可能通过例如抗体形成和过敏反应诱发不想要的炎症副作用。肽中一个或多个半胱氨酸残基的取代降低了这些潜在问题的风险。因此，在一些实施方案中，优化的共有序列的一个或多个半胱氨酸残基的取代提高了肽的生产容易度、稳定性、质量和免疫学，但此类取代对于本发明不是必需的。图1示出了具有氨基酸取代的肽如何与优化的共有序列相关。
fsp2、fsp4和fsp6a的位置范围
在一些实施方案中，具有氨基酸取代的mutTGFβR2(SEQ ID NO:2)的免疫原性片段包含SEQ ID NO:3的第115位至第122位、第116位至第123位、第117位至第124位、第118位至第125位、第119位至第126位、第120位至第127位、第121位至第128位、第128位至第135位、第129位至第136位、第130位至第137位、第131位至第138位、第132位至第139位、第133位至第140位、第134位至第141位或第135位至第142位。
在一些实施方案中，具有氨基酸取代的mutTGFβR2(SEQ ID NO:2)的免疫原性片段包含SEQ ID NO:3的第129位至第137位。
在一些实施方案中，具有氨基酸取代的mutTGFβR2(SEQ ID NO:2)的免疫原性片段包含SEQ ID NO:3的第115位至第126位、第116位至第127位、第117位至第128位、第118位至第129位、第119位至第130位、第120位至第131位、第121位至第132位、第124位至第135位、第125位至第136位、第126位至第137位、第127位至第138位、第128位至第139位、第129位至第140位、第130位至第141位、第131位至第142位、第132位至第143位、第133位至第144位、第134位至第145位或第135位至第146位。在一些实施方案中，具有氨基酸取代的SEQ IDNO:3的免疫原性片段包含SEQ ID NO:3的第115位至第129位、第116位至第130位、第117位至第131位、第118位至第132位、第119位至第133位、第120位至第134位、第121位至第135位、第122位至第136位、第123位至第137位、第124位至第138位、第125位至第139位、第126位至第140位、第127位至第141位、第128位至第142位、第129位至第143位、第130位至第144位、第131位至第145位、第132位至第146位、第133位至第147位、第134位至第148位或第135位至第149位。在一些实施方案中，SEQ ID NO:3的免疫原性片段包括SEQ ID NO:3的第119位至第130位、第119位至第133位、第120位至第131位、第120位至第134位、第121位至第132位、第121位至第135位、第133位至第144位、第133位至第147位、第134位至第145位、第134位至第148位、第135位至第146位、或第135至149位。
在一些实施方案中，具有氨基酸取代的mutTGFβR2(SEQ ID NO:2)的免疫原性片段由SEQ ID NO:3的第115位至第122位、第116位至第123位、第117位至第124位、第118位至第125位、第119位至第126位、第120位至第127位、第121位至第128位、第128位至第135位、第129位至第136位、第130位至第137位、第131位至第138位、第132位至第139位、第133位至第140位、第134位至第141位或第135位至第142位组成。
在一些实施方案中，具有氨基酸取代的mutTGFβR2(SEQ ID NO:2)的免疫原性片段由SEQ ID NO:3的第129位至第137位组成。
在一些实施方案中，具有氨基酸取代的mutTGFβR2(SEQ ID NO:2)的免疫原性片段由SEQ ID NO:3的第115位至第126位、第115位至第129位、第116位至第127位、第116位至第130位、第117位至第128位、第117位至第131位、第118位至第129位、第118位至132位、第119位至第130位、第119位至第133位、第120位至第131位、第120位至第134位、第121位至第132位、第121位至第135位、第122位至第136位、第123位至第137位、第124位至第135位、第124位至第138位、第125位至第136位、第125位至第139位、第126位至第137位、第126位至第140位、第127位至第138位、第127位至第141位、第128位至第139位、第128位至第142位、第129位至第140位、第129位至第143位、第130位至第141位、第130位至第144位、第131位至第142位、第131位至第145位、第132为至第143位、第132位至第146位、第133位至第144位、第133位至第147位、第134位至第145位、第134位至第148位、第135位至第146位或第135位至第149位组成。
Fsp2、fsp6a(以及带有G到C取代的fsp5)和fsp17
在一些实施方案中，具有氨基酸取代的mutTGFβR2(SEQ ID NO:2)的免疫原性片段包含SEQ ID NO:3的第121位，但不包含第135位。在一些实施方案中，肽在免疫原性片段之外包含与SEQ ID NO:2的至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或具有100％的序列同一性。在一些这样的实施方案中，肽在片段之外包含与SEQ ID NO:2的100％的序列同一性。在一些实施方案中，所述肽包含不超过33个氨基酸、不超过27个氨基酸、不超过24个氨基酸或不超过17个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽由33个氨基酸组成。在一些实施方案中，所述肽由27个氨基酸组成。在其他实施方案中，所述肽由24个氨基酸组成。在其他实施方案中，所述肽由17个氨基酸组成。在一些实施方案中，SEQ ID NO:3的免疫原性片段包括SEQ ID NO:3的第119位至第126位、第120位至第127位或第121位至第128位。在一些实施方案中，SEQ ID NO:3的免疫原性片段包括SEQ ID NO:3的第119位至第130位、第120位至第131位或第121位至第132位。在其他实施方案中，该片段包含SEQ IDNO:3的第119位至第133位、第120位至第134位、第121位至第135位。在一些实施方案中，免疫原性片段或肽在其C末端具有甘氨酸残基。
在一些实施方案中，具有氨基酸取代的mutTGFβR2(SEQ ID NO:2)的免疫原性片段由SEQ ID NO:3的第119位至第126位、第120位至第127位或第121位至128位组成。在一些实施方案中，免疫原性片段由SEQ ID NO:3的第119位至第130位、第119位至第133位、第120位至第131位、第120位至第134位、第121位至第132位或第121位至第135位组成。在一些实施方案中，免疫原性片段从肽的N末端的第1位、第2位或第3位开始。在一些实施方案中，免疫原性片段是肽的N末端。在一些实施方案中，SEQ ID NO:3的第121位是甘氨酸。
在一些实施方案中，所述肽包含具有氨基酸取代的mutTGFβR2(SEQ ID NO:2)的免疫原性片段，其中所述免疫原性片段由SEQ ID NO:3的第119位至第126位、第119位至第130位、第119位至第133位、第120位至第127位、第120位至第131位、第120位至第134位、第121位至第128位、第121位至第132位或第121位至第135位组成，其中SEQ ID NO:3的第121位为甘氨酸，且其中所述肽在免疫原性片段之外与SEQ ID NO:2具有至少94％的序列同一性且包含不超过33个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽包含具有氨基酸取代的mutTGFβR2(SEQID NO:2)的免疫原性片段，其中所述免疫原性片段由SEQ ID NO:3的第119位至第126位、第119位至第130位、第119位至第133位、第120位至第127位、第120位至第131位、第120位至第134位、第121位至第128位、第121位至第132位或第121位至第135位组成，其中SEQ ID NO:3的第121位为甘氨酸，且其中所述肽在免疫原性片段之外与SEQ ID NO:2具有100％的序列同一性且包含不超过33个氨基酸。在一些实施方案中，免疫原性片段是肽的N末端。在一些这样的实施方案中，肽由33个氨基酸组成。在一些实施方案中，肽由27个氨基酸组成，并且肽由SEQ ID NO:128的氨基酸序列组成。由SEQ ID NO:128的氨基酸序列组成的肽在本文中称为“fsp17”。在其它实施方案中，肽由24个氨基酸组成，并且肽由SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成。由SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成的肽在本文中称为“fsp2”。在其它实施方案中，肽由17个氨基酸组成，并且肽由SEQ ID NO:25的氨基酸序列组成。由SEQ ID NO:25的氨基酸序列组成的肽在本文中称为“fsp6a”。
在一些实施方案中，肽包含由SEQ ID NO:25组成的免疫原性片段，并且肽包含在该片段的C末端的一个或多个另外的氨基酸。例如，所述肽包含在片段的C末端一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或10个另外的氨基酸。在一些实施方案中，由SEQID NO:25组成的免疫原性片段是肽的N末端。在一些实施方案中，由SEQ ID NO:25组成的片段是肽的N末端，并且肽包含在片段的C末端的七个另外的氨基酸。在一些实施方案中，由SEQ ID NO:25组成的片段是肽的N末端，并且肽包含在片段的C末端的10个另外的氨基酸。在其他实施方案中，由SEQ ID NO:25组成的片段是肽的N末端并且所述肽由在该片段的C末端的七个另外的氨基酸组成。在一些实施方案中，由SEQ ID NO:25组成的片段是肽的N末端，并且肽由在片段的C末端的10个另外的氨基酸组成。在一些实施方案中，所述一个或多个另外的氨基酸与SEQ ID NO:2的相应氨基酸具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或具有100％的序列同一性，并且优选地，与SEQ ID NO:2的相应氨基酸具有至少95％或100％的序列同一性。
Fsp4
在一些实施方案中，具有氨基酸取代的mutTGFβR2(SEQ ID NO:2)的免疫原性片段包含SEQ ID NO:3的第135位，但不包含第121位。在一些实施方案中，肽在免疫原性片段之外包含与SEQ ID NO:2至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或具有100％的序列同一性。在一些实施方案中，肽包含不超过20个氨基酸，而在其它实施方案中，肽由20个氨基酸组成。在一些实施方案中，具有氨基酸取代的mutTGFβR2(SEQ ID NO:2)的免疫原性片段包含SEQ ID NO:3的第133位至第144位、第134位至第145位或第135位至146位。在一些实施方案中，具有氨基酸取代的mutTGFβR2(SEQ ID NO:2)的免疫原性片段包含SEQ ID NO:3的第133位至第147位、第134位至第148位或第135位至149位。在一些实施方案中，具有氨基酸取代的mutTGFβR2(SEQ ID NO:2)的免疫原性片段由SEQ ID NO:3的第133位至第144位、第133位至第147位、第134位至第145位、第134位至第148位、第135位至第146位或第135位至第149位组成。在一些实施方案中，具有氨基酸取代的mutTGFβR2(SEQ IDNO:2)的免疫原性片段从肽的N末端的第1、2或3位开始。在一些实施方案中，具有氨基酸取代的mutTGFβR2(SEQ ID NO:2)的免疫原性片段是肽的N末端。在一些实施方案中，SEQ IDNO:3的第135位是甘氨酸。在一些实施方案中，免疫原性片段或肽在其C末端具有甘氨酸残基。
在一些实施方案中，所述肽包含具有氨基酸取代的mutTGFβR2(SEQ ID NO:2)的免疫原性片段，其中该片段由SEQ ID NO:3的第133位至第144位、第133位至第147位、第134位至第145位、第134位至第148位、第135位至第146位或第135位至第149位组成，其中SEQ IDNO:3的第135位为甘氨酸，且其中所述肽在片段之外与SEQ ID NO:2具有100％序列同一性且包含不超过20个氨基酸。在一些实施方案中，免疫原性片段是肽的N末端。在一些实施方案中，所述肽由20个氨基酸组成。在一些实施方案中，所述肽由SEQ ID NO:23的氨基酸序列组成，并且这些肽在本文中称为“fsp4”。
Fsp1a&fsp1b
在一些实施方案中，mutTGFβR2(SEQ ID NO:2)的免疫原性片段包含SEQ ID NO:19的至少8个连续氨基酸，或包含SEQ ID NO:3的至少8个连续氨基酸，包括SEQ ID NO:3的至少第135位。在一些实施方案中，所述免疫原性片段包含SEQ ID NO:19的至少9个连续氨基酸或包含SEQ ID NO:3的至少9个连续氨基酸，包括SEQ ID NO:3的第135位。在一些实施方案中，所述肽包含在免疫原性片段外的与SEQ ID NO:2的至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或具有100％的序列同一性。在一些实施方案中，免疫原性片段或肽在其C-末端具有甘氨酸残基。
在一些实施方案中，能够诱导针对mutTGFβR2(SEQ ID NO:2)的免疫应答的肽包含SEQ ID NO:19的至少8个连续氨基酸或包含SEQ ID NO:3的至少8个连续氨基酸，包括SEQID NO:3的至少第135位。在一些实施方案中，所述肽包含SEQ ID NO:19的9个连续氨基酸或包含SEQ ID NO:3的9个氨基酸，包括SEQ ID NO:3的第135位。在一些实施方案中，所述免疫原性片段由SEQ ID NO:19的9个连续氨基酸或包含SEQ ID NO:3的至少9个连续氨基酸组成，包括SEQ ID NO:3的第135位。
在一些实施方案中，mutTGFβR2(SEQ ID NO:2)的免疫原性片段包含SEQ ID NO:19的第10至17位或第11至18位。在一些实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:19的第10至18位。在一些实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:124的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫原性片段由SEQ ID NO:19的第10至18位组成，并且具有SEQ ID NO:124的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述肽由SEQ ID NO:124的氨基酸序列组成，这些肽在本文中称为“fsp1a”。
在一些实施方案中，mutTGFβR2(SEQ ID NO:2)的免疫原性片段包含SEQ ID NO:3的至少8个氨基酸，包括SEQ ID NO:3的第135位，因此，与mutTGFβR2(SEQ ID NO:2)的天然存在的氨基酸序列相比，包含氨基酸取代。在一些实施方案中，mutTGFβR2(SEQ ID NO:2)的免疫原性片段包含SEQ ID NO:3的第129至136位或第130至137位。在一些实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:3的第129至137位。在一些实施方案中，SEQ ID NO:3的第135位的氨基酸是甘氨酸。在一些实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述肽由SEQ ID NO:125的氨基酸序列组成，这些肽在本文中称为“fsp1b”。
如实施例5中所解释的，鉴于fsp6(SEQ ID NO:24)和fsp7(SEQ ID NO:123)的免疫原性的差异以及这些氨基酸序列之间的相似性和差异，预测SEQ ID NO:124或SEQ ID NO:125的氨基酸序列具有免疫原性。
肽混合物
本发明的肽混合物可以包含任何数量和任何组合的本文公开的肽，只要肽混合物包含诱导针对不同-1a移码突变蛋白的免疫应答的第一肽和第二肽。
在一些实施方案中，所述第一肽是能够诱导针对TGFβR2-1a移码突变蛋白(SEQ IDNO:2)的免疫应答的肽，并且所述第二肽是能够诱导针对ASTE1-1a移码突变蛋白(SEQ IDNO:5)、TAF1β-1a移码突变蛋白(SEQ ID NO:7)、KIAA2018-1a移码突变蛋白(SEQ ID NO:9-12)或SLC22A9-1a移码突变蛋白(SEQ ID NO:14-16)的免疫应答的肽。在一些实施方案中，所述第一肽是能够诱导针对TGFβR2-1a移码突变蛋白(SEQ ID NO:2)的免疫应答的肽，所述第二肽是能够诱导针对ASTE1-1a移码突变蛋白(SEQ ID NO:5)或TAF1β-1a移码突变蛋白(SEQ ID NO:7)的免疫应答的肽。在一些实施方案中，所述第一肽是能够诱导针对ASTE1-1a移码突变蛋白(SEQ ID NO:5)的免疫应答的肽，所述第二肽是能够诱导针对TGFβR2-1a移码突变蛋白(SEQ ID NO:2)或TAF1β-1a移码突变蛋白(SEQ ID NO:7)的免疫应答的肽。特别地，图14、15和22显示，包含源自mutTGFβR2、mutASTE1和mutTAF1β的肽的肽混合物能够诱导T细胞应答。图16-18显示肽混合物中的单个肽具有免疫原性，因为即使仅用包含这些肽的肽混合物刺激一轮后，单个肽能够诱导免疫应答。图21还显示，mutASTE1的单个肽能够在仅用包含该肽的肽混合物刺激一轮后诱导免疫应答。
在一些实施方案中，第一肽包含SEQ ID NO:19-25、124、125或126之一的氨基酸序列，第二肽包含SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:127或SEQ ID NO:128的氨基酸序列。在这些实施方案中，第一肽可包含不超过33个、27个、24个、20个、17个或9个氨基酸，第二肽可包含不超过31个、30个或25个氨基酸。在一些实施方案中，第一肽由SEQ ID NO:19-25、124、125或126之一的氨基酸序列组成，第二肽由SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:127或SEQ ID NO:128的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，肽混合物包含至少一种另外的肽，所述至少一种另外的肽选自能够诱导针对TGFβR2-1a移码突变蛋白(mutTGFβR2；SEQ ID NO:2)、ASTE1-1a移码突变蛋白(mutASTE1；SEQ ID NO:5)、TAF1β-1a移码突变蛋白(mutTAFβ1b；SEQ ID NO:7)、KIAA2018-1a移码突变蛋白(mutKIAA2018；SEQ ID NO:9-12)或SLC22A9-1a移码突变蛋白(SEQ ID NO:14-16)的免疫应答的肽，如本文所述，其中所述至少一种另外的肽不同于所述第一和第二肽中的每一种。在一些实施方案中，至少一种另外的肽能够诱导针对不同于所述第一和第二肽中的每一种的移码突变蛋白的免疫应答。
包含至少一种另外的肽的肽混合物可以是下面表1中列出的任何肽混合物，其中肽如本文所述。因此，本文所述的所有肽可根据表1组合以形成本发明的肽混合物。
表1：
Figure BDA0003964058800000571
Figure BDA0003964058800000581
如果表1中所示的肽混合物包含一种以上源自相同蛋白质的肽，则这些肽彼此不同，并且可以源自相同的-1a移码突变蛋白，或者，如果存在一种以上的蛋白质-1a移变突变体，则肽可以源自相同蛋白质的不同-1a移突变体。
在一些实施方案中，所述第一肽是能够诱导针对TGFβR2-1a移码突变蛋白(SEQ IDNO:2)的免疫应答的肽，所述第二肽是能够诱导针对ASTE1-1a移码突变蛋白(SEQ ID NO:5)的肽，并且所述至少一种另外的肽是能够诱导针对TAF1β-1a移码突变蛋白(mutTAFβ1b；SEQID NO:7)、KIAA2018-1a移码突变蛋白(mutKIAA2018；SEQ ID NO:9-12)或SLC22A9-1a移码突变蛋白(SEQ ID NO:14-16)的免疫应答的肽。在一些实施方案中，所述第一肽是能够诱导针对TGFβR2-1a移码突变蛋白(SEQ ID NO:2)的免疫应答的肽，所述第二肽是能够诱导针对TAF1β-1a移码突变蛋白(mutTAFβ1b；SEQ ID NO:7)的肽，并且所述至少一种另外的肽是能够诱导针对ASTE1 -1a移码突变蛋白(SEQ ID NO:5)、KIAA2018-1a移码突变蛋白(mutKIAA2018；SEQ ID NO:9-12)或SLC22A9-1a移码突变蛋白(SEQ ID NO:14-16)的免疫应答的肽。在一些实施方案中，所述第一肽是能够诱导针对TGFβR2-1a移码突变蛋白(SEQ IDNO:2)的免疫应答的肽，所述第二肽是能够诱导针对ASTE1-1a移码突变蛋白(SEQ ID NO:5)的肽，并且所述至少一种另外的肽是能够诱导针对TAF1β-1a移码突变蛋白(mutTAFβ1b；SEQID NO:7)的免疫应答的肽。图14-18显示，含有这三种肽的肽混合物诱导免疫应答，并且在仅用肽混合物刺激一轮后，混合物中的每种肽都具有免疫原性。
在一些实施方案中，所述第一肽是能够诱导针对TGFβR2-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽，其中所述肽包含i)SEQ ID NO:3的免疫原性片段，其中所述片段包含SEQ ID NO:3的至少8个连续氨基酸，包括SEQ ID NO:3的第121和135位中的至少一个，或ii)SEQ IDNO:2的免疫原性片段，其中所述片段包含SEQ ID NO:19的至少8个连续氨基酸，所述第二肽是能够诱导针对ASTE1-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽，其中所述肽包含SEQ ID NO:5的免疫原性片段，其中所述片段包含SEQ ID NO:26的至少8个连续氨基酸，并且所述至少一种另外的肽是能够诱导针对TAF1β-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽，其中所述肽包含SEQ IDNO:7的免疫原性片段，其中所述片段包含SEQ ID NO:27的至少8个连续氨基酸。
在一些实施方案中，肽混合物包括第一、第二、第三和第四肽。在一些这样的实施方案中，所述第一肽是能够诱导针对TGFβR2-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽，其中所述肽包含i)SEQ ID NO:3的免疫原性片段，其中所述片段包含SEQ ID NO:3的至少8个连续氨基酸，包括SEQ ID NO:3的第121和135位中的至少一个，或ii)SEQ ID NO:2的免疫原性片段，其中所述片段包含SEQ ID NO:19的至少8个连续氨基酸，所述第二肽是能够诱导针对ASTE1-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽，其中所述肽包含SEQ ID NO:5的免疫原性片段，其中所述片段包含SEQ ID NO:26的至少8个连续氨基酸，并且所述第三肽是能够诱导针对TAF1β-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽，其中所述肽包含SEQ ID NO:7的免疫原性片段，其中所述片段包含SEQ ID NO:27的至少8个连续氨基酸，并且所述第四肽是能够诱导针对KIAA2018-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽，其中所述肽包含SEQ ID NO:9-12之一的免疫原性片段，其中所述片段分别包含SEQ ID NO:9-12之一的至少8个连续氨基酸，包括分别来自SEQ ID NO:9的第13至37位、SEQ ID NO:10的第91至109位、SEQ ID NO:11的第147至167位和SEQ ID NO:12的第1016至1037位的至少一个氨基酸，或能够诱导针对SLC22A9-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽，其中所述肽包含SEQ ID NO:14-18之一的免疫原性片段，其中所述片段分别包含SEQ ID NO:14-18之一的至少8个连续氨基酸，包括分别来自SEQ ID NO:14的第327至400位、SEQ ID NO:15的第335至400位，SEQ ID NO:16的第533至549位、SEQ IDNO:17的第327至400位和SEQ ID NO:18的第335至400位的至少一个氨基酸。
在一些实施方案中，肽混合物包括第一、第二、第三、第四和第五肽。在一些这样的实施方案中，所述第一肽是能够诱导针对TGFβR2-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽，其中所述肽包含i)SEQ ID NO:3的免疫原性片段，其中所述片段包含SEQ ID NO:3的至少8个连续氨基酸，包括SEQ ID NO:3的第121和135位中的至少一个，或ii)SEQ ID NO:2的免疫原性片段，其中所述片段包含SEQ ID NO:19的至少8个连续氨基酸，所述第二肽是能够诱导针对ASTE1-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽，其中所述肽包含SEQ ID NO:5的免疫原性片段，其中所述片段包含SEQ ID NO:26的至少8个连续氨基酸，并且所述第三肽是能够诱导针对TAF1β-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽，其中所述肽包含SEQ ID NO:7的免疫原性片段，其中所述片段包含SEQ ID NO:27的至少8个连续氨基酸，并且所述第四肽是能够诱导针对KIAA2018-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽，其中所述肽包含SEQ ID NO:9-12之一的免疫原性片段，其中所述片段分别包含SEQ ID NO:9-12之一的至少8个连续氨基酸，包括分别来自SEQ ID NO:9的第13至37位、SEQ ID NO:10的第91至109位、SEQ ID NO:11的第147至167位和SEQ ID NO:12的第1016至1037位的至少一个氨基酸，并且所述第五肽是能够诱导针对SLC22A9-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽，其中所述肽包含SEQ ID NO:14-18之一的免疫原性片段，其中所述片段分别包含SEQ ID NO:14-18之一的至少8个连续氨基酸，分别包括SEQ ID NO:14的第327至400位、SEQ ID NO:15的第335至400位、SEQ ID NO:16的第533至549位、SEQ ID NO:17的第327至400位和SEQ ID NO:18的第335到400位的至少一个氨基酸。
在一些实施方案中，所述第一肽包含SEQ ID NO:19-25、124、125和126之一的氨基酸序列，所述第二肽包含SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:127的氨基酸序列，并且至少一种另外的肽包含SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:128的氨基酸序列。在这些实施方案中，所述第一肽包含不超过33个、27个、24个、20个、17个或9个氨基酸，所述第二肽包含不超过31个或25个氨基酸，并且所述至少一种另外的肽包含不超过30个或25个氨基酸。在一些实施方案中，所述第一肽由SEQ ID NO:19-25、124、125和126之一的氨基酸序列组成，所述第二肽由SEQ IDNO:26或SEQ ID NO:127的氨基酸序列组成，并且所述至少一种另外的肽由SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:128的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，所述第一肽由SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成，所述第二肽由SEQ ID NO:26的氨基酸序列构成，并且所述至少一种另外的肽由SEQ ID NO:27的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，肽混合物由这三种肽组成。
在一些实施方案中，所述第一肽由SEQ ID NO:126的氨基酸序列组成，所述第二肽由SEQ ID NO:127的氨基酸序列构成，并且所述至少一种另外的肽由SEQ ID NO:128的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，肽混合物由这三种肽组成。在一些实施方案中，所述至少一种另外的肽是与所述第一肽和第二肽中的每一种不同的肽，但诱导针对与所述第一肽和所述第二肽之一相同的-1a移码突变蛋白的免疫应答。因此，例如，所述第一或第二肽之一可以是能够诱导针对mutTGFβR2(SEQ ID NO:2)的免疫应答的肽，并且所述至少一种另外的肽也可以是能够诱导针对mutTGFβR2(SEQ ID NO:2)的免疫应答的肽，并且其是与第一肽或第二肽不同的肽，所述第一或第二肽之一是能够诱导针对mutTGFβR2(SEQ ID NO:2)的免疫应答的肽。在另一个实施例中，第一和第二肽之一可以是能够诱导针对mutSLC22A9(SEQ IDNO:14-16)的免疫应答的肽，并且所述至少一种另外的肽也可以是诱导针对mutSLC22A9(SEQ ID NO:14-16)的免疫应答的肽，但其是与能够诱导针对mutSL C22A9(SEQ ID NO:14-16)的免疫应答的第一肽或第二肽不同的肽。类似地，当肽混合物包含一种以上的另外的肽时，至少一种另外的肽可以包含至少两种彼此不同但能够诱导针对相同-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽。
在一些实施方案中，第一和第二肽之一以及至少一种另外的肽诱导针对同一蛋白质的不同-1a移码突变体的免疫应答。因此，例如，第一或第二肽可以是诱导针对mutKIAA2018(pos13)(SEQ ID NO:9)的免疫应答的肽，并且至少一种另外的肽可以是诱导针对mutKIAA 2018(pos91)(SEQ ID NO:10)、mutKIAA18(pos147)(SEQ ID NO:11)或mutKIAA2018(pos1016)(SEQ ID NO:12)的免疫应答的肽。在另一个实施例中，第一或第二肽可以是诱导针对mutSLC22A9(pos327)(SEQ ID NO:14)的免疫应答的肽，并且至少一种另外的肽可以是诱导针对mutSLC22A9(pos335)(SEQ ID NO:15)或mutSLC22A9(pos553)(SEQID NO:16)的免疫应答的肽。类似地，当肽混合物包含一种以上的另外的肽时，所述至少一种另外的肽可以包含至少两种能够诱导针对同一蛋白质的不同-1a移码突变体的免疫应答的肽。
在一些实施方案中，所述第一肽包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列，所述第二肽包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列并且至少一种另外的肽包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述第一肽由SEQ ID NO:28的氨基酸序列组成，所述第二肽由SEQ IDNO:29的氨基酸序列组成，并且所述至少一种另外的肽由SEQ ID NO:31的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，肽混合物由这三种肽组成。
在一些实施方案中，肽混合物包含至少2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种或16种不同的肽。在一些实施方案中，肽混合物包含不超过2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种或16种不同的肽。在一些实施方案中，肽混合物包含3种不同的肽。在一些实施方案中，肽混合物包含5种不同的肽。在一些实施方案中，肽混合物包含10种不同的肽。在一些实施方案中，肽混合物包含不超过10种不同的肽。在一些实施方案中，肽混合物由3种不同的肽组成。在一些实施方案中，肽混合物由5种不同的肽组成。在其它实施方案中，肽混合物由10种不同的肽组成。
肽混合物可以包含相等或不同比例的肽。在一些实施方案中，第一肽和第二肽以相等的比例存在于混合物中，即每种肽包含肽混合物的肽组分的50％。在其他实施方案中，肽混合物中第一肽的比例大于第二肽。例如，第一肽可包含肽混合物的肽组分的至少55％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。在替代实施方案中，肽混合物中第二肽的比例大于第一肽。例如，第二肽可包含肽混合物的肽组分的至少55％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。在包含至少一种另外的肽的实施方案中，肽以相等的比例存在于肽混合物的肽组分中。在其他实施方案中，第一、第二和至少一种另外的肽以彼此不同的比例存在。例如，第一、第二和至少一种另外的肽中的每一个可以独立地包含至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的肽混合物的肽组分。
核酸
在本发明的另一方面，提供了至少一种或多种核酸分子，其单独或共同包含编码上述公开的肽混合物中的至少两种肽的核苷酸序列，或所述或每种核酸编码编码上述公开的至少一种肽的核苷酸序列。因此，在一些实施方案中，每个核酸分子编码上述公开的一种或多种肽，或编码上述公开肽混合物中的两种或多种肽。在一些实施方案中，每个核酸分子仅编码上述公开的肽之一。在一些实施方案中，每个核酸分子编码上述公开的2种、3种、4种、5种、6种或7种肽。在一些实施方案中，每个核酸分子编码上述肽混合物的2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种或16种肽。
还提供了核酸分子的混合物，其中该混合物的每个核酸分子包含编码根据上述公开的肽混合物的不同肽的核苷酸序列。因此，核酸分子的混合物共同编码上述公开的肽混合物。
在一些实施方案中，核酸分子和核酸分子混合物用于合成上述公开的肽和肽混合物。例如，可以通过以下合成一种或多种上述肽，或上述肽混合物的一种或多种肽：向受试者施用一种或多种核酸分子，由此每个核酸分子由受试者表达，从而原位产生一种或多种肽。然后产生的肽在受试者体内引发免疫应答。在另一个实施例中，通过用核酸分子转化或转染宿主细胞，核酸分子可用于体外合成一种或多种上述肽，或上述肽混合物的一种或多种肽，从而宿主细胞表达核酸分子以产生肽。然后回收并纯化肽。在一些实施方案中，使用本领域公知的方法通过化学合成而制备上述肽和上述肽混合物的肽。
T细胞受体
在本发明的另一方面，提供了T细胞受体或其抗原结合片段，当呈递在MHC分子上时，其对根据上述公开的肽具有特异性。
在一些实施方案中，T细胞受体是αβT细胞受体，或T细胞受体的抗原结合片段是αβT-细胞受体的抗原结合片段。在这些实施方案中，当呈递在MHC分子上时，T细胞受体或其抗原结合片段对本文公开的肽具有特异性。
在一些实施方案中，T细胞受体是γδT细胞受体，或T细胞受体的抗原结合片段是γδT细胞受体的抗体结合片段。在这些实施方案中，T细胞受体不一定需要在MHC分子上呈递肽以识别肽。
T细胞和T细胞混合物
在本发明的另一个方面，提供了T细胞和包含一种或多种T细胞的T细胞制剂，其对根据上述公开的肽具有特异性。
还提供了T细胞混合物，其包含对上述公开的肽混合物之一中的每种肽具有特异性的T细胞。当T细胞混合物中的T细胞对mutTGFβR2肽具有特异性时，T细胞是未转染的T细胞。因此，T细胞混合物包括分别对第一肽和第二肽具有特异性的第一和第二T细胞，其中所述第一和第二肽独立地选自根据上述公开的mutTGFβR2肽、根据上述公开的mutASTE1肽、根据上述公开的mutTAF1β肽、根据上述公开的mutKIAA2018肽和根据上述公开的mutSLC22A9肽，其中，当T细胞对mutTGFβR2肽具有特异性时，所述T细胞是未转染的T细胞，并且其中所述第一肽能够诱导针对与所述第二肽不同的移码突变蛋白的免疫应答。
T细胞、T细胞制剂和T细胞混合物可以是离体的，并且可以通过用根据上述公开的肽或肽混合物离体刺激至少一种反应性T细胞来产生。例如，在一个实施方案中，T细胞对能够诱导针对ASTE1-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽具有特异性，其中该肽包含SEQ ID NO:5的免疫原性片段，其中该片段包含SEQ ID NO:26的至少10个连续氨基酸。在另一个实施方案中，所述T细胞对能够诱导针对TAF1β-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽具有特异性，其中所述肽包含SEQ ID NO:7的免疫原性片段，其中该片段包含SEQ ID NO:27的至少10个连续氨基酸。在另一个实施方案中，所述T细胞对能够诱导针对KIAA2018-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽具有特异性，其中所述肽包含SEQ ID NO:9-12之一的免疫原性片段，其中所述片段分别包含SEQ ID NO:9-12之一的至少8个连续氨基酸，包括分别来自SEQ ID NO:9的第13至37位、SEQ ID NO:10的第91至109位、SEQ ID NO:11的第147至167位和SEQ ID NO:12的第1016至1037位的至少一个氨基酸。在其他实施方案中，所述T细胞对能够诱导针对SLC22A9-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽具有特异性，其中所述肽包含SEQ ID NO:14-18之一的免疫原性片段，其中该片段包含SEQ ID NO:14-18之一的至少8个连续氨基酸，分别包括SEQ ID NO:14的第327至400位、SEQ ID NO:15的第335至400位、SEQ ID NO:16的第533至549位、SEQ ID NO:17的第327至400位和SEQ ID NO:18的第335到400位的至少一个氨基酸。
在另一个实施方案中，所述T细胞制剂包含一种或多种对能够诱导针对ASTE1-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽具有特异性的T细胞，其中所述肽包含SEQ ID NO:5的免疫原性片段，其中所述片段包含SEQ ID NO:26的至少10个连续氨基酸；对能够诱导针对TAF1β-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽具有特异性的T细胞，其中所述肽包含SEQ ID NO:7的免疫原性片段，其中所述片段包含SEQ ID NO:27的至少10个连续氨基酸；对能够诱导针对KIAA2018-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽具有特异性的T细胞，其中所述肽包含SEQ IDNO:9-12之一的免疫原性片段，其中所述片段包含SEQ ID NO:9-12之一的至少8个连续氨基酸，包括SEQ ID NO:9的第13至37位、SEQ ID NO:10的第91至109位、SEQ ID NO:11的第147至167位和SEQ ID NO:12的第1016至1037位的至少一个氨基酸；对能够诱导针对SLC22A9-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽具有特异性的T细胞，其中所述肽包含SEQ ID NO:14-18之一的免疫原性片段，其中所述片段包含SEQ ID NO:14-18之一的至少8个连续氨基酸，包括SEQ ID NO:14的第327至400位、SEQ ID NO:15的第335至400位、SEQ ID NO:16的第533至549位、SEQ ID NO:17的第327至400位和SEQ ID NO:18的第335至400位的至少一个氨基酸。
当本文公开的任何T细胞的T细胞受体是αβT细胞受体时，T细胞受体在MHC分子上呈递时对肽具有特异性。当本文公开的任何T细胞的T细胞受体是γδT细胞受体时，T细胞受体不一定需要在MHC分子上呈递肽以识别肽。
载体&宿主细胞
在本发明的另一方面，提供了包含核酸分子的载体，所述核酸分子包含根据上述公开的核苷酸序列。因此，核苷酸序列编码如上所公开的至少一种肽，或如上所公开的肽混合物中的至少一种肽。在一些实施方案中，所述载体包含核酸分子，所述核酸分子包含编码根据上述公开的肽混合物的所有肽的核苷酸序列。
在一些实施方案中，载体是DNA载体或RNA载体。
在另一方面，提供了包含如上所述载体的宿主细胞。用载体转染或转化宿主细胞，使得宿主细胞表达由载体编码的核酸分子。宿主细胞可以是能够用载体转染并表达载体的任何细胞类型。在一些实施方案中，宿主细胞是植物细胞、动物细胞、微生物或酵母细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是树突细胞。
在一些实施方案中，宿主细胞包含对于一个载体，其中每个载体包含核酸分子，所述核酸分子包含编码如上所述不同肽的核苷酸序列。因此，宿主细胞包括多个载体，每个载体编码不同的肽，使得宿主细胞表达一种以上类型的核酸分子，因此表达一种以上的肽。
药物组合物
还提供了包含上述肽、肽混合物、T细胞受体或其抗原结合片段、T细胞、T细胞混合物、T细胞制剂、核酸分子、载体或宿主细胞的药物组合物。此类药物组合物还可包含至少一种药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。例如，药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂可以是盐水或灭菌水。在一些实施方案中，药物组合物进一步包含一种或多种额外的活性成分和/或佐剂。在某些实施方案中，药物组合物还可包含对相同疾病适应症治疗有效的一种或多种成分。在一个实施方案中，本发明的药物组合物还可包含一种或多种其他化学治疗剂、一种或多种癌症疫苗、一种或多种抗体、一种或多种小分子和/或一种或多种免疫刺激剂(例如，细胞因子)。在一些实施方案中，肽、肽混合物、T细胞受体或其抗原结合片段、T细胞、T细胞制剂、T细胞混合物、核酸分子、载体、宿主细胞或药物组合物可与其他形式的免疫治疗(包括其他癌症疫苗)组合使用。在一些实施方案中，肽、肽混合物、T细胞受体或其抗原结合片段、T细胞、T细胞制剂、T细胞混合物、核酸、载体、宿主细胞或药物组合物与衍生自不同癌症抗原的一种或多种癌症疫苗组合使用。
用途
上述公开的肽、肽混合物、T细胞受体、T细胞、T细胞制剂、T细胞混合物、核酸分子、载体、宿主细胞和药物组合物用于治疗和/或预防癌症，特别是与TGFβR2、ASTE1、TAF1β、KIAA2018和SLC22A9中的一种或多种中的移码突变优选-1a移码突变相关的癌症。特别地，具有移码突变的癌症患者通常具有一种以上的移码突变，因为这些癌症的根本原因是DNA错配修复(MMR)失败。优选地，癌症的治疗和/或预防在人类中进行。特别是，大约15％的所有CRC和大约44％的所有MSI-H癌症在TGFβR2中具有移码突变。此外，TAF1β、ASTE1和TGFβR2是MSI CRC中四个最常见突变基因中的三个，并且在75％的MSI-H CRC中独立发现了这些基因中的每一个中的移码突变。此外，KIAA2018、SLC22A9和ASTE1中的移码突变分别在所有MSI-H癌症的51％、50％和45％中发现。癌症可以是结直肠癌或胃癌。结直肠癌可以是结肠癌或直肠癌。肽、肽混合物、T细胞受体、T细胞、T细胞制剂、T细胞混合物、核酸分子、载体和宿主细胞可用于治疗和/或预防这些类型的癌症中的一种以上。特别地，上述公开的肽、肽混合物、T细胞受体、T细胞、T细胞制剂、T细胞混合物、核酸分子、载体和宿主细胞可用于治疗所有MSI结直肠癌和大部分的MSI-H癌症。因此，本发明提供了对大部分癌症，特别是结直肠癌和胃癌，更特别是遗传性结直肠癌的有效治疗。
在一些实施方案中，能够诱导针对ASTE1-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽，其中所述肽包含SEQ ID NO:5的免疫原性片段，其中所述片段包含SEQ ID NO:26的至少10个连续氨基酸，特别可用作针对癌症的疫苗或治疗。在一些实施方案中，所述肽包含不超过31个氨基酸，并且所述肽在免疫原性片段之外与SEQ ID NO:5具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，所述肽包含不超过25个氨基酸，并且所述肽在免疫原性片段之外与SEQ IDNO:5具有100％序列同一性。在一些实施方案中，肽由25个氨基酸组成，免疫原性片段由SEQID NO:26的12或15个连续氨基酸组成。在一些实施方案中，肽由31个氨基酸组成，免疫原性片段由SEQ ID NO:26的12或15个连续氨基酸组成。在一些实施方案中，所述肽仅具有来自ASTE1的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:4)的3个氨基酸或不具有来自ASTE1的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:4)的氨基酸。在一些实施方案中，肽在其C末端具有甘氨酸残基。在一些实施方案中，肽由SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:127的氨基酸序列组成。特别地，已经发现，由SEQ ID NO:26的氨基酸序列组成的肽(即fsp8)作为针对癌症的疫苗或治疗特别有用，因为它能够诱导免疫应答，如图16-18、21和22所示。特别地，T细胞增殖高于对照(即T细胞+APC)的任何增加都表明T细胞对肽的应答。图16-18显示了在用含有SEQ ID NO:21(fsp2)、SEQID NO:26(fsp8)和SEQ ID NO:27(fsp9)这三种肽的肽混合物刺激供体后，由这三种肽中的每一种诱导的T细胞增殖应答，并且这三个图显示了响应于由SEQ ID NO:26(fsp 8)诱导的T细胞增殖的增加。图21显示了在用含有SEQ ID NO:126(fsp17)、SEQ ID NO:127(fsp15)和SEQ ID NO:128(fsp16)的肽混合物刺激供体后，由SEQ ID NO:127(fsp15)诱导的T细胞增殖应答，图21显示响应于由SEQ ID NO:127(fsp15)诱导的T细胞增殖增加。图22显示了在用含有SEQ ID NO:126(fsp17)、SEQ ID NO:127(fsp15)和SEQ ID NO:128(fsp16)的肽混合物刺激供体后，由单独的SEQ ID NO:127(fsp15)和含有SEQ ID NO:126(fsp17)、SEQ ID NO:127(fsp15)和SEQ ID NO:128(fsp16)的肽混合物诱导的T细胞增殖应答，图22显示了响应于肽混合物和SEQ ID NO:127(fsp15)的诱导而增加的T细胞增殖。
在一些实施方案中，能够诱导针对TAF1β-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽，其中所述肽包含SEQ ID NO:7的免疫原性片段，其中所述片段包含SEQ ID NO:27的至少10个连续氨基酸，特别可用作针对癌症的疫苗或治疗。在一些实施方案中，所述肽包含不超过25个氨基酸，并且在免疫原性片段之外与SEQ ID NO:7具有100％序列同一性。在一些实施方案中，肽由25个氨基酸组成，免疫原性片段由SEQ ID NO:27的12或15个连续氨基酸组成。在一些实施方案中，肽由SEQ ID NO:27的氨基酸序列组成。特别地，已经发现，由SEQ ID NO:27(即fsp9)的氨基酸序列组成的肽作为针对癌症的疫苗或治疗特别有用，因为它能够诱导免疫应答，如图16-18和22所示。特别地，T细胞增殖高于对照(即T细胞+APC)的任何增加都表明T细胞对肽的应答。图16-18显示了在用含有SEQ ID NO:21(fsp2)、SEQ ID NO:26(fsp8)和SEQ ID NO:27(fsp9)这三种肽的肽混合物刺激供体后，对这三种肽中的每一种的T细胞增殖应答，并且这三个图显示了响应于SEQ ID NO:27(fsp9)诱导的T细胞增殖的增加。图22显示了在用含有SEQ ID NO:126(fsp17)、SEQ ID NO:127(fsp15)和SEQ ID NO:128(fsp16)的肽混合物刺激供体后，由含有SEQ ID NO:126(fsp17)、SEQ ID NO:127(fsp15)和SEQ IDNO:128(fsp16)的肽混合物诱导的T细胞增殖应答，图22显示了响应于肽混合物的诱导而增加的T细胞增殖。
在一些实施方案中，肽混合物包含能够诱导针对TGFβR2-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽、能够诱导针对ASTE1-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽和能够诱导针对TAF1β-1a移变突变蛋白的免疫应答的肽。在一些实施方案中，能够诱导针对ASTE1-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽包含SEQ ID NO:5的免疫原性片段，其中该片段包含SEQ ID NO:26的至少8个连续氨基酸。在一些实施方案中，所述肽包含不超过31个氨基酸，并且所述肽在免疫原性片段之外与SEQ ID NO:5具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，能够诱导针对ASTE1-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽包含不超过25个氨基酸，并且该肽在免疫原性片段之外与SEQ ID NO:5具有100％的序列同一性。在一些实施方案中，能够诱导针对ASTE1-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽由25个氨基酸组成，而免疫原性片段由SEQ ID NO:26的12或15个连续氨基酸组成。在一些实施方案中，能够诱导针对ASTE1-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽由31个氨基酸组成，而免疫原性片段由SEQ ID NO:26的12或15个连续氨基酸组成。在一些实施方案中，能够诱导针对ASTE1-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽仅具有来自ASTE1的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:4)的3个氨基酸，或者不具有来自ASTE1的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:4)的氨基酸。在一些实施方案中，能够诱导针对ASTE1-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽在其C末端具有甘氨酸残基。在一些实施方案中，能够诱导针对ASTE1-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽由SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:127的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，能够诱导针对TAF1β-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽包含SEQ ID NO:7的免疫原性片段，其中该片段包含SEQ ID NO:27的至少8个连续氨基酸。在一些实施方案中，能够诱导针对-1a TAF1β移码突变肽的免疫应答的肽包含不超过30个氨基酸，并且在免疫原性片段外与SEQ ID NO:7具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，能够诱导针对TAF1β-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽包含不超过25个氨基酸，并且在免疫原性片段之外与SEQ ID NO:7具有100％的序列同一性。在一些实施方案中，能够诱导针对TAF1β-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽由25个氨基酸组成，并且免疫原性片段由SEQ ID NO:27的12或15个连续氨基酸组成。在一些实施方案中，能够诱导针对-1a TAF1β移码突变肽的免疫应答的肽由30个氨基酸组成，并且免疫原性片段由SEQ ID NO:27的12或15个连续氨基酸组成。在一些实施方案中，能够诱导针对-1a TAF1β移码突变肽的免疫应答的肽具有来自TAF1β的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:6)的仅5个氨基酸或仅2个氨基酸。在一些实施方案中，能够诱导针对-1a TAF1β移码突变肽的免疫应答的肽在其C末端具有甘氨酸残基。在一些实施方案中，能够诱导针对TAF1β-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽由SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:128的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，能够诱导针对TGFβR2-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽包含SEQ ID NO:3的免疫原性片段，其中所述片段包含SEQ ID NO:3的至少8个连续氨基酸，包括SEQ ID NO:3的第121位。在一些实施方案中，能够诱导针对TGFβR2-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽包含不超过33个氨基酸。在一些实施方案中，能够诱导针对TGFβR2-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽包含SEQ ID NO:3的至少12个或15个连续氨基酸，包括SEQ ID NO:3的第121位，但不包括第135位，其中SEQ ID NO:3的第121位的氨基酸是甘氨酸，并且所述肽在免疫原性片段外与SEQ ID NO:2具有至少90％的序列同一性。在一些实施方案中，能够诱导针对TGFβR2-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽包含SEQ ID NO:3的至少12个或15个连续氨基酸，包括SEQ ID NO:3的第121位，但不包括第135位，其中SEQ ID NO:3的第121位的氨基酸是甘氨酸，并且所述肽在免疫原性片段外与SEQ ID NO:2具有100％的序列同一性。在一些实施方案中，能够诱导针对TGFβR2-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽由17个、24个、27个或33个氨基酸组成，并且SEQ ID NO:3的片段由SEQ ID NO:3的12或15个连续氨基酸组成。在一些实施方案中，能够诱导针对TGFβR2-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽由SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:126的氨基酸序列组成。特别地，图14和15示出了含有由SEQ IDNO:21(即fsp2)的氨基酸序列组成的肽，由SEQ ID NO:26(即fsp8)的氨基酸序列组成的肽和由SEQ ID NO:27(即fsp9)的氨基酸序列组成的肽的肽混合物在用该肽混合物刺激两轮或三轮后诱导T细胞增殖。此外，图16-18显示，在用肽混合物刺激一轮或两轮后，该肽混合物(包括fsp2、fsp8和fsp9)中的每种单独的肽诱导T细胞。因此，即使作为肽混合物施用，单个肽也具有免疫原性。图22显示，含有由SEQ ID NO:126(即fsp17)的氨基酸序列组成的肽、由SEQ ID NO:127(即fsp15)的氨基酸序列组成的肽和由SEQ ID NO:128(fsp16)的氨基酸序列组成的肽的肽混合物在用该肽混合物刺激两轮后诱导T细胞增殖。图22还示出由SEQID NO:126(即fsp17)组成的肽在用该肽混合物刺激两轮后诱导T细胞。
在一些实施方案中，向受试者施用一种以上根据上述公开的肽。在一些实施方案中，将每种肽分别施用至受试者。
用于治疗和/或预防癌症的T细胞或T细胞制剂或T细胞混合物中的T细胞可以是自体的或同种异体的。例如，异源T细胞可以施用于患者，其中T细胞来自与患者具有相同或相似HLA库的供体。
本发明的肽、肽混合物、载体、宿主细胞或药物组合物可以通过本领域技术人员已知的任何合适的递送技术施用于受试者。例如，在其他技术中，肽、肽混合物或药物组合物可以通过注射、以溶液形式、脂质体形式或干燥形式(例如，以包衣颗粒的形式等)施用于受试者。宿主细胞可以例如通过输注来施用。例如，可以通过皮下注射或注射到肿瘤中来施用载体。在一些实施方案中，肽、肽混合物或药物组合物可以例如每三天一次、每周一次、每月一次、每三个月一次、每四个月或每六个月一次施用例如1μg至1g的每种肽。在一些实施方案中，每剂量每种肽的净含量为60nM。例如，对于皮内注射，每种肽可以0.1ml的体积0.6mM的浓度存在。
在一些实施方案中，肽或肽混合物与佐剂或免疫刺激剂例如GM-CSF一起施用。在使用GM-CSF的实施方案中，这可以是任何GM-CSF，例如糖基化的GM-CSF或非糖基化的GM-CSF。GM-CSF可以0.5至120μg/m2、1至120μg/m2、2至115μg/m2、3至110μg/m2、4至105μg/m2、5至100μg/m2、6至95μg/m2，7至90μg/m2、48至85μg/m2、9至80μg/m2、10至75μg/m2、11至70μg/m2、12至65μg/m2、13至60μg/m2、14至55μg/m2、15至50μg/m2、16至45μg/m2、17至40μg/m2、或18至40μg/m2的体表面积的量施用。在一些实施方案中，GM-CSF以每剂量1μg至200μg、5μg至175μg、5μg至150μg、5μg至125μg、5μg至100μg、10μg至100μg、20μg至90μg、25μg至80μg、25μg至70μg、25μg至65μg或30μg至60μg的剂量施用。在一些实施方案中，非糖基化GM-CSF以每剂30μg的剂量施用。在其他实施方案中，糖基化GM-CSF以60μg的剂量施用。在通过皮内注射施用GM-CSF的实施方案中，剂量可以是含有浓度为0.3mg/ml或0.6mg/ml的GM-CSF的0.1ml溶液。在一些实施方案中，肽、肽混合物或药物组合物可以例如每三天一次、每周一次、每月一次、每三个月一次、每四个月或每六个月一次施用例如1μg至1g的每种肽。
可以使用本领域已知的方法将本发明的T细胞受体转染到具有与T细胞受体所特异的HLA等位基因匹配的HLA等位基因的患者的T细胞。特别地，从患者获得T细胞，用编码T细胞受体的载体转染T细胞，并将转染的T细胞重新导入患者。
本发明的T细胞、T细胞混合物和T细胞制剂可以通过静脉内注射和/或输注来施用，并且可以以例如对肽混合物的肽或肽具有特异性的106至1012个每种T细胞的量施用，每个月一次、每两个月一次，每三个月一次、每六个月一次或一年一次。优选地，该剂量每月施用一次，持续2至5个月，随后降低施用频率。
本发明的核酸和核酸混合物可以通过肌内注射和/或皮下注射施用。
向受试者施用本发明的肽、或肽混合物，或通过受试者表达肽或肽混合物，引发对肽或肽混合物的免疫应答，特别是T细胞介导的免疫应答。肽或肽混合物的每种肽可以由抗原呈递细胞(APC)处理并且可以在MHC分子上呈递。αβT细胞通过T细胞受体与通过APC呈递在MHC分子上的肽结合而被激活，从而导致针对具有与所施用肽中存在的突变相对应的突变的肿瘤细胞的免疫应答。γδT细胞不一定需要抗原处理或由MHC分子呈递抗原。
在本发明的另一方面，提供了肽、肽混合物、T细胞受体、T细胞、T细胞制剂、T细胞混合物、核酸分子或药物组合物，其用于包括癌症的诊断和选择适当的治疗的方法中。该方法包括以下步骤：(i)鉴定癌症患者是否为MSI-H，如果是，(ii)选择根据上述公开的肽、肽混合物、T细胞受体、T细胞、T细胞制剂、T细胞混合物、核酸分子或药物组合物。在一些实施方案中，该方法还包括，在步骤(i)中，测试患者是否在TGFβR2、ASTE1、TAF1β、KIAA2018和SLC22A9蛋白中的一种或多种中具有移码突变，如果是，则选择根据上述公开的肽、肽混合物、T细胞受体、T细胞、T细胞制剂、T细胞混合物、核酸分子或药物组合物。在一些实施方案中，移码突变是-1a移码突变。在一些实施方案中，该方法还包括(iii)向患者施用所选择的肽、肽混合物、T细胞受体、T细胞、T细胞制剂、T细胞混合物、核酸分子或药物组合物。
在本发明的另一方面，提供了治疗和/或预防癌症的方法，包括向有需要的患者施用根据上述公开的肽、肽混合物、未转染的T细胞、未转染的T细胞制剂、未转染的T细胞混合物、核酸分子或药物组合物。该方法可以包括以下步骤(i)将癌症患者鉴定为MSI-H，和(ii)向患者施用根据上述公开的肽、肽混合物、未转染的T细胞、未转染的T细胞制剂、未转染的T细胞混合物、核酸分子或药物组合物。该方法还可包括，在步骤(i)中，鉴定患者在TGFβR2蛋白中具有移码突变的步骤。在一些实施方案中，移码突变是-1a移码突变。
在本发明的另一方面，提供了试剂盒，其包括根据上述公开的肽、肽混合物、T细胞受体、T细胞、T细胞混合物、T细胞制剂、核酸分子、核酸分子混合物、载体和/或宿主细胞。肽、肽混合物、T细胞受体、T细胞、T细胞混合物、T细胞制剂、核酸、核酸混合物、载体和/或宿主细胞等可以存在于试剂盒中，或者肽、肽混合物、T细胞受体、T细胞、T细胞混合物、T细胞制剂、核酸分子、核酸混合物，载体和/或者宿主细胞可以作为药物制剂存在。在一些实施方案中，肽、肽混合物、T细胞受体、T细胞、T细胞制剂、T细胞混合物、核酸分子混合物、载体和/或宿主细胞可以例如包装在小瓶、瓶子、烧瓶中，其可以例如进一步包装在盒、封袋或袋中。在一些实施方案中，所述试剂盒包括肽混合物、T细胞混合物和/或核酸分子混合物，其中所述肽、T细胞和/或核酸分子在单独的容器中提供，从而由用户混合所述肽、T细胞和/或核酸分子。
实施例
实施例1–TGFβR2肽
先前关于肽用作针对与具有移码突变的TGFβR2相关的癌症的疫苗的研究表明，至少一些肽可能具有免疫原性，但存在矛盾的结果。因此，基于早期研究中测试的肽手动预测了共有肽。
表2：先前测试的mutTGFβR2肽及其T细胞活化结果
先前测试的肽序列 T细胞活化 肽标记
SPKCIMKEKKSLVRLSSCVPVA(SEQ ID NO:35) + P540
SLVRLSSCVPVALMSAMTTSSSQ(SEQ ID NO:34) + p538
SLVRLSSCV(SEQ ID NO:37) + p523
RLSSCVPVA(SEQ ID NO:33) + p573
ALMSAMTTSSSQKNITPAILTCC(SEQ ID NO:38) - p539
AMTTSSSQKNITPAILTCC(SEQ ID NO:39) - p537
手动预测的共有序列：
SPKCIMKEKKSLVRLSSCVPVALMSAMTTSSSQ(SEQ ID NO:40)。
然后使用在线算法(即SYFPEITHI)预测HLA II类等位基因的mutTGFβR2的表位。搜索中包含的HLA II类等位基因是：HLA-DRB1*0101、HLA-DRB1*0301(DR17)、HLA-DRB1*0401(DR4Dw4)、HLA-DRB1*0701、HLA-DRB1*1101、HLA-DRB1*1501(DR2b)。
使用了截止预测分数20，其中HLA结合强度随着预测分数而增加。SYFPEITHI产生了以下预测的表位：
表3：SYFPEITHI搜索结果
Figure BDA0003964058800000751
Figure BDA0003964058800000761
结果，SYFPEITHI预测了共有序列：
KCIMKEKKSLVRLSSCVPVALMSAMTTSSSQKN(SEQ ID NO:19)。
比较了手动预测的共有序列(SEQ ID NO:40)和SYFPEITHI预测的共有序列(SEQID NO:19)，并产生了优化的共有序列。
表4：预测的共有序列的比较
Figure BDA0003964058800000762
对TGFβR2(SEQ ID NO:19)的优化的共有肽进行修饰，以克服合成生产和用作疫苗的预测的困难。特别地，优化的共有序列(SEQ ID NO:19)长度为33个氨基酸，这种长度的肽很难合成生产到合适的质量和产量。由于通过形成分子内和分子间二硫键进行肽环化，相同肽中的两个半胱氨酸残基产生了肽的稳定性和质量问题。这种肽环化也可能降低肽的免疫效力，例如通过削弱有效的抗原处理。这可能会导致处理无关的T细胞表位。此外，肽环化可能会引起不需要的炎症副作用，例如抗体形成或过敏反应。此外，优化的共有序列(SEQID NO:19)N末端的八个氨基酸对应于野生型TGFβR2，因此存在激活野生型交叉反应性T细胞的风险。因此，进一步修饰优化的共有序列(SEQ ID NO:19)以克服这些问题，并设计了表5中所示的肽。图1显示了设计的肽如何相互关联以及如何与优化的共有序列关联。
表5：修饰的优化的肽
肽名称 序列
Fsp1(SEQ ID NO:20) KCIMKEKKSLVRLSSCVPVALMSA
Fsp2(SEQ ID NO:21) KGIMKEKKSLVRLSSCVPVALMSA
Fsp3(SEQ ID NO:22) SSCVPVALMSAMTTSSSQKN
Fsp4(SEQ ID NO:23) SSGVPVALMSAMTTSSSQKN
Fsp5(SEQ ID NO:19) KCIMKEKKSLVRLSSCVPVALMSAMTTSSSQKN
Fsp6(SEQ ID NO:24) KCIMKEKKSLVRLSSCV
Fsp6a(SEQ ID NO:25) KGIMKEKKSLVRLSSCV
实施例2–TGFβR2肽合成
i)肽合成
使用FMOC化学和Prelude合成仪(Gyros Protein Technologies Inc.，USA)通过固相肽合成(SPPS)制备了一批fsp5(SEQ ID NO:19)。通过UPLC和MS分析粗肽。通过MS观察所需的肽，UPLC显示纯度约为75％，如图2所示。UPLC系统：柱子；Acquity UPLC BEH C181.7mm，21x150mm，检测；PDA 210-500nm，溶剂A)；0.1％TFA水溶液，溶剂B；0.1％ TFA的MeCN溶液，梯度：20-70％ B(2-10分钟，线性)。
ii)肽溶解度和纯化
该肽难以溶解，并试图在温和加热下将粗fsp5(SEQ ID NO:19)(～150mg)溶解在大约4ml 50％ MeCN的水溶液中。然而，无法得到澄清的溶液。然而，在过滤粗悬浮液后尝试通过制备型HPLC(15-40％ MeCN水溶液)纯化粗溶液，这导致大量物质损失。仅获得了非常少量的所需肽，UPLC分析发现该肽不纯。
制备另一批fsp5(SEQ ID NO:19)，在温和加热下溶解在纯DMSO中并通过制备型HPLC纯化。肽的纯度通过UPLC测量，发现约为90％，如图3所示。同样，仅获得了非常少量的纯化的fsp5(SEQ ID NO:19)。注意到即使加入少量水也会导致粗DMSO溶液中的肽沉淀，因此在HPLC纯化过程中fsp5(SEQ ID NO:19)很可能在柱上沉淀。
iii)肽纯度和稳定性
当冻干后通过UPLC重新评估少量纯化的fsp5(SEQ ID NO:19)的纯度时，纯度已从约90％降至50％以下，如图4所示。如图5所示，在室温下短暂储存(3天)后然后冻干之后重新评估粗fsp5(SEQ ID NO:19)的纯度，观察到相同的趋势。
总之，实施例2表明fsp5(SEQ ID NO:19)可以合成，但很难以足够用于任何实际目的的量和用于医学所需的质量来生产，例如，作为潜在癌症疫苗的成分。
实施例3–TGFβR2肽合成
肽fsp1(SEQ ID NO:20)、fsp2(SEQ ID NO:21)、fsp3(SEQ ID NO:22)和fsp4(SEQID NO:23)通过使用SPPS合成并通过HPLC纯化，如上所述。纯化后将肽冻干。每种肽的纯度通过UPLC测量，UPLC迹线如图6-9所示。UPLC系统：柱子；Acquity UPLC BEH C18 1.7mm，21x150mm，检测；PDA 210-500nm，溶剂A)；0.1％ TFA水溶液，溶剂B；0.1％ TFA的MeCN溶液，fsp1和fsp2的梯度：5-50％ B(0-10分钟，线性)，fsp3和fsp4的梯度：20-70％ B(2-10分钟，线性)。
·图6显示纯化和冻干的fsp1(SEQ ID NO:20)获得的纯度为96％。
·图7显示纯化和冻干的fsp2(SEQ ID NO:21)获得的纯度为97％。
·图8显示纯化和冻干的fsp3(SEQ ID NO:22)获得的纯度为94.8％。
·图9显示纯化和冻干的fsp4(SEQ ID NO:23)获得的纯度为91.9％。
通过ESI-QTOF-MS确认所有四种肽的正确分子量(MW)(表6，实施例4)。
总之，实施例3证明可以产生肽fsp1(SEQ ID NO:20)、fsp2(SEQ ID NO:21)、fsp3(SEQ ID NO:22)和fsp4(SEQ ID NO:23)而没有fsp5(SEQ ID NO:19)所见的化学问题。因此，生产这些可能用作疫苗的较短的肽来诱导肽特异性T细胞是可行的。
实施例4–TGFβR2肽的免疫原性
i)材料
表6：材料
Figure BDA0003964058800000781
Figure BDA0003964058800000791
从血库获得了四名健康供体的新鲜的血沉棕黄层。
ii)第一次体外刺激PBMC和T细胞增殖
第一天：
PBMC：
对从四名健康供体的新鲜血沉棕黄层分离出的外周血单个核细胞(PBMC)进行计数并悬浮在DC培养基中至15*106个细胞/ml，随后用DC-培养基稀释至4*106个细胞/ml(表6)。
表7：细胞悬液和稀释
Figure BDA0003964058800000792
DC培养基：500ml CellGro DC培养基(CellGenix)+0.63ml 40mg/ml Gensumycin+5ml 1M HEPES缓冲液+4ml 200mg/ml Mucomyst/NAC
体外刺激：
每个供体使用4个24孔板，每孔4*106个细胞(每孔体积为1ml)。
多肽混合物：肽fsp2+fsp4的溶液，含有每种肽10μM。每孔加入40μl肽溶液。
将板在细胞培养箱中培养14天(37℃，5％ CO2)。在第3天加入IL-2和IL-7。每天检查细胞。
第14天-T细胞增殖：
测试肽：fsp2+fsp4(SEQ ID NO:21和23)、fsp1(SEQ ID NO:20)、fsp2(SEQ ID NO:21)、fsp3(SEQ ID NO:22)、fsp4(SEQ ID NO:23)、fsp5(SEQ ID NO:19)。
阳性对照：SEC3
阴性对照：T细胞、T细胞+APC(不添加测试肽)
模拟(Mock)：DMSO的PBS溶液
用于T细胞增殖的平板设置：
如下表8和9所述，将细胞和试剂加入板孔中(一式三份)。加入每孔的总体积为0.20ml。
·T细胞(PBMC)：50 000个细胞/孔(0.25*106个细胞/ml)
·APC：辐照的(30Gy，8分钟)自体饲养细胞：50 000个细胞/孔
·肽(fspx)：0.2nmol肽/孔(每种肽)，浓度：10μM肽。(fsp在稀释到正确浓度之前溶解在DMSO中)
表8：板1(96孔)设置：
Figure BDA0003964058800000801
表9：板2(96孔)设置：
Figure BDA0003964058800000811
将板在细胞培养箱中培养48小时(37℃，5％ CO2)。
第16天。
孵育48小时后，将20μl3H-t胸苷溶液(5μCi/ml)添加到每个孔中，并将板孵育约17小时(37℃，5％ CO2)。
第17天。
17小时后收获细胞(Unifilters)并在45℃下在过滤器上干燥直至完全干燥。在用粘合剂盖(与Unifilter一起递送)覆盖Unifilter底部后，将25μl微量闪烁液添加到每个孔中，用TopSeal覆盖板并使用微孔板闪烁计数器以每分钟计数(CPM)测量3H-胸苷摄取。
增殖结果：
在用fsp2和fsp4肽的混合物进行第一轮体外刺激后的T细胞增殖结果在图10中显示为刺激指数(SI)。SI＝(T细胞+APC+测试肽)的平均CPM(一式三份)除以(T细胞+APC)的平均CPM(一式三份)。SI>1表明T细胞增殖的增加和SI≥2是免疫原性的明显标志。
iii)PBMC的体外再刺激和T细胞增殖
第一次体外刺激后收获的PBMC根据上述方案在体外重新刺激，每孔2x106个细胞。根据上述方案测试T细胞增殖。
增殖结果：
用fsp2和fsp4肽的混合物进行第二轮体外刺激后的T细胞增殖结果在图11中显示为刺激指数(SI)。
因此，图10和11显示具有氨基酸取代的肽fsp2和fsp4具有免疫原性并且可以激活T细胞，并且激活的T细胞对天然存在的-1a移码突变的TGFβ2蛋白质的肽具有交叉反应性。此外，图10-12显示fsp1和fsp5(它们是天然存在的-1a移码的TGFβ2蛋白的肽)刺激由PMBC诱导的T细胞，因此具有免疫原性。因此，修饰的肽fsp2(SEQ ID NO:21)和fsp4(SEQ ID NO:23)，以及未修饰的肽fsp1(SEQ ID NO:20)和fsp5(SEQ ID NO:19)，可用于刺激TGFβR2移码突变体特异性T细胞的诱导。
实施例5–fsp6和fsp6a的免疫原性
使用与实施例4中所述类似的方案来测试fsp6(SEQ ID NO:24)和fsp7(SEQ IDNO:123)的免疫原性。使用Fsp2(SEQ ID NO:21；10μM)从从四名健康供体的新鲜血沉棕黄层分离的PMBC中诱导T细胞。在诱导后第14天，使用fsp2(SEQ ID NO:21)、fsp6(SEQ ID NO:24)和fsp7(SEQ ID NO:123)作为测试肽，如实施例4中那样进行T细胞增殖测定。一轮体外刺激后的T细胞增殖结果显示为图13中的刺激指数(SI)。特别地，图13显示fsp6能够激活T细胞，使得fsp6具有免疫原性并且可以用作针对癌症的疫苗或治疗。图13还显示，fsp2(SEQID NO:21)诱导的T细胞对短于fsp2(SEQ ID NO:21)的天然存在的TGFβR2-1a移码蛋白的肽具有交叉反应性。鉴于图11和图12所示的结果，还预期具有fsp6(SEQ ID NO:26)序列但具有与fsp2中的序列相对应的C至G氨基酸取代的肽也具有免疫原性，并且可用作针对癌症的疫苗或治疗。特别地，如实施例4中所述，图12显示由具有C到G氨基酸取代的fsp2(SEQ IDNO:21)诱导的T细胞对天然存在的TGFβR2-1a移码蛋白的肽具有交叉反应性，使得C到G的氨基酸取代在免疫学上是可接受的。因此，预计除了与fsp2(SEQ ID NO:21)相同的C至G氨基酸取代之外，与fsp6(SEQ ID NO:24)相同的fsp6a(SEQ ID NO:25)也具有免疫原性。
此外，图13显示fsp6(SEQ ID NO:24)的免疫原性低于fsp2(SEQ ID NO:21)，但fsp6和fsp2的免疫原性都远高于fsp7(SEQ ID NO:123)。Fsp6具有与fsp2相同的氨基酸序列，不同之处在于fsp6与fsp2相比在C末端被截短，并且没有C到G的氨基酸取代。Fsp7具有与fsp2相同的氨基酸序列，但与fsp2相比在N末端被截短。鉴于这三种肽之间的免疫原性差异，如图13所示，预期fsp6的C末端需要至少一个额外的氨基酸，以保留fsp2的免疫原性。此外，预期需要在fsp7的N末端的至少一个额外的氨基酸，以增加其免疫原性并使肽包含免疫有效的表位。因此，预计fsp1a(LVRLSSCVP；SEQ ID NO:124)具有免疫原性，或是免疫原性肽的重要成分，因为该肽包含fsp6和fsp7共享的序列，与fsp6相比，在C末端添加了一个氨基酸，与fsp7相比，在N末端添加了1个氨基酸。此外，由于C到G的氨基酸取代已被证明是免疫可接受的，因此预期具有C到G的氨基酸取代的fsp1a(即fsp1b；SEQ ID NO:125)也将具有免疫原性。
实施例6–ASTE1、TAF1β、KIAA2018和SLC22A9肽
使用在线算法SYFPEITHI鉴定潜在HLA II类T细胞表位(15聚体)的簇(嵌套表位)，使用SYFPEITHI截止分数≥20。定义了预测的嵌套表位肽，并使用SYFPEITHI预测了潜在的HLA I类表位(9聚体)，SYFPEITHI截止分数≥20。SYFPEITHI提供的所有HLA I类和HLA II类等位基因都包含在搜索中。候选fsp肽的设计基于以下总体考虑：
·HLA总覆盖率，主要关注HLA II类
·普通人群中各种HLA等位基因的患病率
·定义了用于体外测试的每种蛋白质的代表性肽
·化学考虑：努力避免多个半胱氨酸残基，潜在候选肽的合成、溶解度和稳定性的潜在问题
每种-1a移码突变蛋白的预测的HLA II类表位、预测的嵌套表位肽和HLA I类表位以及候选fsp肽如下表10-13所示。关于表12和13，其中所示的搜索序列(即SEQ ID NO:76和96)被认为与预测的表位的鉴定最相关。
Figure BDA0003964058800000841
Figure BDA0003964058800000851
Figure BDA0003964058800000861
Figure BDA0003964058800000871
Figure BDA0003964058800000881
Figure BDA0003964058800000891
Figure BDA0003964058800000901
Figure BDA0003964058800000911
出于与上述实施例1中讨论的fsp2和fsp4相同的原因，Fsp12和fsp14被设计为具有C至G的氨基酸取代(在表13中以下划线显示)。最接近肽N末端的半胱氨酸残基被取代，因为认为最接近N末端的氨基酸可能不是T细胞特异性识别所必需的。
实施例7–肽和肽混合物的免疫原性
i)设备
·Heraeus megafuge 2.0
·KOJAIR层流净化罩KR-210K-安全性
·CO2培养箱,Forma Scientific型号3111
·FACSCanto
ii)试剂
·CellGro DC培养基(货号0020801-0500,CellGenix GmbH,弗莱堡,德国)
·HEPES 1M(Fischer scientific)
·Mucomyst/NAC(Meda AS，阿斯克，挪威)
·Gensumycin(Gibco，Life Technologies)
·IL-2
·rhIL-7
·SEC-3超抗原10mg/ml原液(Toxin Technology Inc,USA)
·微孔板96孔，圆底(VWR International AS，挪威奥斯陆)
·Topseal-A(货号6005185,Nerliens Meszansky，挪威奥斯陆)
·Microscient-0闪烁液(Nerliens Meszansky，挪威奥斯陆)
·3H胸腺嘧啶(Motebello Diagnostics，挪威奥斯陆)
·具有L-gutamin的RPMI-1640(Gibco，Life Technologies)
·Albunorm 200g/l(20％)(Octapharma)
·二甲基亚砜(DMSO)(Sigma-Aldrich)
·用于细胞培养的完全CellGro DC培养基
将以下物质加入500ml CellGro Dc培养基中：
1.Gensumycin；630μL 40mg/ml原液(终浓度0.05mg/ml)
2.HEPES缓冲液；5ml 1M原液(终浓度0.01M)
3.Mucomyst/NAC；4ml 200mg/ml原液(终浓度1.6ml/ml)
iii)PBMC批量培养物的肽刺激
将从四名健康供体(从血库获得)的血沉棕黄层分离的PBMC悬浮在完全CellGroDC培养基中至15*106细胞/ml，并稀释至4*106细胞/ml(表14)。
表14：
Figure BDA0003964058800000931
*向孔中加入166.67μM/每种肽(fsp2、fsp8和fsp9)的原液，最终浓度为≈10μM/每种肽
在第1天，将来自每个供体的1ml PBMC悬浮液(4x106个细胞/ml)转移到24孔板的孔中(每个孔4*106个细胞)，并向每个孔中加入6μl肽混合物(fsp2+fsp8+fsp9)原液(166.67μM/每种肽)。将平板在细胞培养箱中培养14天。在第3天加入IL-2和IL-7(含有60U/ml IL-2和15ng/ml IL-7的0.50ml DC培养基)。每天检查细胞，并根据室内实验室常规更新含有细胞因子(IL-2、IL7)的DC培养基。
使用前一轮体外刺激后收获的PBMC，再重复两次(即总共三次刺激)批量培养物的体外刺激。在每一轮刺激后的第14天测试肽特异性T细胞增殖，从而在第一轮刺激后第14、28和42天测试T细胞增殖。
iv)三天T细胞增殖测定
收获来自批量培养物的细胞(300xg离心5分钟)并重新悬浮在DC培养基(5ml)中。将5ml重悬液的等分试样稀释5倍，并计数T细胞，以计算每孔提供5x104个细胞用于增殖测定所需的体积。将来自每个供体的T细胞(一式三份)以及自体、照射(30Gy，8分钟)的PBMC(每个孔5x104个细胞)和测试肽(终浓度10μM/每种肽)转移到96孔板的孔中(每个孔5x104个细胞)。阴性对照是不含测试肽的孔，阳性对照是含有SEC-3(0.1μg/ml)而不含测试肽的孔。将细胞(平板)孵育48小时(37C/5％CO2)。48小时后，向细胞中加入20μL 3H胸腺嘧啶(3.7x104Bq)，并持续培养17小时。收获细胞(使用Filtermate 196收获机的Unifilter)，并在45℃下在过滤器上干燥约4.5小时。使用标准内部实验室方案(TopCount Packard微板闪烁β计数器和运行程序)对细胞进行计数(CPM)。
v)肽特异性T细胞增殖
一次刺激：
用含有fsp2、fsp8和fsp9(每种肽10μM)的肽混合物刺激PBMC批量培养物14天后，测量肽特异性T细胞增殖。在10μM(每种肽)的浓度下测试由每种单个肽和肽混合物诱导的增殖。
两次刺激：
用含有fsp2、fsp8和fsp9(每种肽10μM)的肽混合物重新刺激PBMC14天后，测量肽特异性T细胞增殖。测试由每种单个肽和肽混合物诱导的T细胞增殖。在10μM的浓度下测试单个肽。使用混合物中两种不同量的每种肽测试肽混合物，即含10μM每种肽的肽混合物和含有3.33μM每种肽的肽混合物。
三次刺激:
用含有fsp2、fsp8和fsp9(每种肽10M)的肽混合物进一步重新刺激PBMC 14天后，测量肽特异性T细胞增殖。测试由每种单个肽和肽混合物诱导的T细胞增殖。在10μM的浓度下测试单个肽。使用混合物中两种不同量的每种肽测试肽混合物，即含10μM每种肽的肽混合物和含有3.33μM每种肽的肽混合物。
肽特异性T细胞增殖测定结果如图14-18所示。特别地，与对照相比，SI值的增加表明肽混合物或特定肽能够诱导T细胞应答，而SI≥2是免疫原性的明确信号。图14显示，在用肽混合物进行两轮刺激后，四分之三的供体中诱导了针对肽混合物的T细胞。图15显示，三轮刺激后，T细胞对肽混合物的应答比两轮刺激后更强。图16-18显示了三个供体中对肽混合物fsp2、fsp8和fsp9中每一种的T细胞应答，并显示所有这些肽和肽混合物都能够诱导T细胞应答。更具体地，fsp2在所有三个供体中具有大于2的SI，fsp8和fsp9在三个供体的两个中各自具有大于2的SI，并且肽混合物在所有三个供体中具有大于2的SI。这表明每一种肽都具有免疫原性，即使作为肽混合物施用。此外，由于fsp2、fsp8和fsp9中的每一个都比HLA I类表位(9聚体)和HLA II类表位(15聚体)长，并且被设计为包括一个以上的表位，因此肽包含预期具有免疫原性的片段。
实施例8
使用与上述实施例4和7中使用的程序类似的程序，用含有等摩尔量(10uM)的fsp10(SEQ ID NO:28)、fsp11(SEQ ID NO:29)和fsp13(SEQ ID NO:31)的肽混合物体外刺激来自四个健康供体的PMBC。
在一轮刺激(14天)后，收获T细胞并使用10μM的单肽浓度测试其对肽混合物的识别。在标准T细胞增殖测定中，以摄取3H胸苷后的每分钟计数(CPM)测量T细胞增殖。
增殖试验结果表明，能够识别肽混合物的T细胞已经在供体1中被诱导。对收获的T细胞的新样本的重新测试证实了第一次增殖测试的结果。此外，结果表明，在一轮体外刺激后，fsp11(SEQ ID NO:29)以及fsp11(SEQ ID NO:29)和fsp13(SEQ ID NO:31)的混合物诱导了T细胞应答(图19)。Fsp10(SEQ ID NO:28)和fsp13(SEQ ID NO:31)作为单独的肽，在一轮体外刺激后不刺激供体1中的T细胞。与fsp11(SEQ ID NO:29)和fsp13(SEQ ID NO:31；图19)的混合物相比，单独的fsp11(SEQ ID NO:29)显示了更大的T细胞诱导，一种可能的解释是，fsp13(SEQ ID NO:31)在抗原呈递细胞(APC)表面占据HLA分子，从而减少了可用于结合fsp11(SEQ ID NO:29)并呈递至T细胞的HLA分子的数量。
来自四名健康供体的PMBC接受第二轮体外刺激，再次收获T细胞并测试其针对肽混合物和单个肽的增殖。增殖结果表明，T细胞从供体4获得，其以浓度依赖性方式对肽混合物作出应答(图20)。特别是，图20显示，与对照(TC+APC)相比，肽混合物的SI值增加，表明对肽混合物的T细胞应答。虽然过去认为SI值大于2是在T细胞增殖测定中指示T细胞应答的标准，但这仅适用于在T细胞增殖测定之前接种过疫苗的受试者的情况。如果健康受试者在T细胞增殖测定之前未接种疫苗(如在本T细胞增殖测定中)，则不会预计达到2或更大的SI值。因此，在未接种疫苗的健康受试者中，SI值高于1的增加表示T细胞应答。
实施例9
使用与上述实施例4和7中使用的程序类似的程序，用含有等摩尔量(10uM)fsp17(SEQ ID NO:126)、fsp15(SEQ ID NO:127)和fsp16(SEQ ID NO:128)的肽混合物体外刺激来自四个健康供体的PMBC，这在下表15示出。这些肽在其C端具有非手性氨基酸甘氨酸，它可以作为肽与其他分子缀合的接头。预计这种C末端甘氨酸不会产生将改变诱导的T细胞的特异性的任何新的T细胞表位。
表15
Fsp15(ASTE1) KKKGRRNRIPAVLRTEGEPLHTPSVGMRETG(SEQ ID NO:127)
Fsp16(TAF1β) GLKKKTILKKAGIGMCVKVSSIFFINKQKG(SEQ ID NO:128)
Fsp17(TGFβR2) KGIMKEKKSLVRLSSCVPVALMSAMTG(SEQ ID NO:126)
在一轮(14天)体外刺激后，收获T细胞，并使用每种肽10μM的浓度测试其对肽混合物或单个肽的识别。在标准T细胞增殖测定中，以摄取3H胸苷后的每分钟计数(CPM)测量T细胞增殖。
增殖试验结果显示，fsp15(SEQ ID NO:127；图21)诱导T细胞。
来自四名健康供体的PMBC经受第二轮体外刺激，再次收获T细胞并测试其针对肽混合物和单个肽的增殖。结果表明，肽混合物(fsp17(SEQ ID NO:126)、fsp15(SEQ ID NO:127)和fsp16(SEQ ID NO:128)，以及fsp15(SEQ ID NO:127)和fsp17(SEQ ID NO:126)单独地，均诱导T细胞(图22)。
序列表
<110> 休博治疗有限公司
<120> 肽混合物
<130> PN837253WO
<150> EP20177183.9
<151> 2020-05-28
<160> 129
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 567
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
Met Gly Arg Gly Leu Leu Arg Gly Leu Trp Pro Leu His Ile Val Leu
1 5 10 15
Trp Thr Arg Ile Ala Ser Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val
20 25 30
Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro
35 40 45
Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln
50 55 60
Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro
65 70 75 80
Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr
85 90 95
Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile
100 105 110
Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys
115 120 125
Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn
130 135 140
Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Leu
145 150 155 160
Leu Leu Val Ile Phe Gln Val Thr Gly Ile Ser Leu Leu Pro Pro Leu
165 170 175
Gly Val Ala Ile Ser Val Ile Ile Ile Phe Tyr Cys Tyr Arg Val Asn
180 185 190
Arg Gln Gln Lys Leu Ser Ser Thr Trp Glu Thr Gly Lys Thr Arg Lys
195 200 205
Leu Met Glu Phe Ser Glu His Cys Ala Ile Ile Leu Glu Asp Asp Arg
210 215 220
Ser Asp Ile Ser Ser Thr Cys Ala Asn Asn Ile Asn His Asn Thr Glu
225 230 235 240
Leu Leu Pro Ile Glu Leu Asp Thr Leu Val Gly Lys Gly Arg Phe Ala
245 250 255
Glu Val Tyr Lys Ala Lys Leu Lys Gln Asn Thr Ser Glu Gln Phe Glu
260 265 270
Thr Val Ala Val Lys Ile Phe Pro Tyr Glu Glu Tyr Ala Ser Trp Lys
275 280 285
Thr Glu Lys Asp Ile Phe Ser Asp Ile Asn Leu Lys His Glu Asn Ile
290 295 300
Leu Gln Phe Leu Thr Ala Glu Glu Arg Lys Thr Glu Leu Gly Lys Gln
305 310 315 320
Tyr Trp Leu Ile Thr Ala Phe His Ala Lys Gly Asn Leu Gln Glu Tyr
325 330 335
Leu Thr Arg His Val Ile Ser Trp Glu Asp Leu Arg Lys Leu Gly Ser
340 345 350
Ser Leu Ala Arg Gly Ile Ala His Leu His Ser Asp His Thr Pro Cys
355 360 365
Gly Arg Pro Lys Met Pro Ile Val His Arg Asp Leu Lys Ser Ser Asn
370 375 380
Ile Leu Val Lys Asn Asp Leu Thr Cys Cys Leu Cys Asp Phe Gly Leu
385 390 395 400
Ser Leu Arg Leu Asp Pro Thr Leu Ser Val Asp Asp Leu Ala Asn Ser
405 410 415
Gly Gln Val Gly Thr Ala Arg Tyr Met Ala Pro Glu Val Leu Glu Ser
420 425 430
Arg Met Asn Leu Glu Asn Val Glu Ser Phe Lys Gln Thr Asp Val Tyr
435 440 445
Ser Met Ala Leu Val Leu Trp Glu Met Thr Ser Arg Cys Asn Ala Val
450 455 460
Gly Glu Val Lys Asp Tyr Glu Pro Pro Phe Gly Ser Lys Val Arg Glu
465 470 475 480
His Pro Cys Val Glu Ser Met Lys Asp Asn Val Leu Arg Asp Arg Gly
485 490 495
Arg Pro Glu Ile Pro Ser Phe Trp Leu Asn His Gln Gly Ile Gln Met
500 505 510
Val Cys Glu Thr Leu Thr Glu Cys Trp Asp His Asp Pro Glu Ala Arg
515 520 525
Leu Thr Ala Gln Cys Val Ala Glu Arg Phe Ser Glu Leu Glu His Leu
530 535 540
Asp Arg Leu Ser Gly Arg Ser Cys Ser Glu Glu Lys Ile Pro Glu Asp
545 550 555 560
Gly Ser Leu Asn Thr Thr Lys
565
<210> 2
<211> 161
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 2
Met Gly Arg Gly Leu Leu Arg Gly Leu Trp Pro Leu His Ile Val Leu
1 5 10 15
Trp Thr Arg Ile Ala Ser Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val
20 25 30
Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro
35 40 45
Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln
50 55 60
Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro
65 70 75 80
Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr
85 90 95
Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile
100 105 110
Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Ser
115 120 125
Leu Val Arg Leu Ser Ser Cys Val Pro Val Ala Leu Met Ser Ala Met
130 135 140
Thr Thr Ser Ser Ser Gln Lys Asn Ile Thr Pro Ala Ile Leu Thr Cys
145 150 155 160
Cys
<210> 3
<211> 161
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的肽
<220>
<221> 变体
<222> 121
<223> 任何氨基酸，除了半胱氨酸
<220>
<221> 变体
<222> 135
<223> 任何氨基酸，除了半胱氨酸
<400> 3
Met Gly Arg Gly Leu Leu Arg Gly Leu Trp Pro Leu His Ile Val Leu
1 5 10 15
Trp Thr Arg Ile Ala Ser Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val
20 25 30
Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro
35 40 45
Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln
50 55 60
Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro
65 70 75 80
Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr
85 90 95
Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile
100 105 110
Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Xaa Ile Met Lys Glu Lys Lys Ser
115 120 125
Leu Val Arg Leu Ser Ser Xaa Val Pro Val Ala Leu Met Ser Ala Met
130 135 140
Thr Thr Ser Ser Ser Gln Lys Asn Ile Thr Pro Ala Ile Leu Thr Cys
145 150 155 160
Cys
<210> 4
<211> 679
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 4
Met Gly Ile Arg Gly Leu Met Ser Phe Val Glu Asp His Ser Asn Glu
1 5 10 15
Phe Phe Thr Asp Leu Lys Leu Arg Asp Thr Lys Ile Val Ile Asp Gly
20 25 30
Tyr Ala Leu Phe His Arg Leu Cys Phe Ser Ser Asn Leu Asp Leu Arg
35 40 45
Tyr Gly Gly Asp Tyr Asp Ser Phe Ala Asp Val Val Gln Lys Phe Phe
50 55 60
Glu Ser Leu Phe Ala Cys Asn Ile Cys Pro Tyr Val Val Leu Asp Gly
65 70 75 80
Gly Cys Asp Ile Ser Asp Lys Lys Leu Thr Thr Leu Lys Asp Arg Ala
85 90 95
Arg Glu Lys Ile Gln Met Ala His Ser Leu Ser Val Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Tyr Val Cys Pro Leu Leu Ile Arg Glu Val Phe Ile Gln Val Leu Ile
115 120 125
Lys Leu Arg Val Cys Phe Val Gln Cys Phe Ser Glu Ala Asp Arg Asp
130 135 140
Ile Met Thr Leu Ala Asn His Trp Asn Cys Pro Val Leu Ser Ser Asp
145 150 155 160
Ser Asp Phe Cys Ile Phe Asp Leu Lys Thr Gly Phe Cys Pro Leu Asn
165 170 175
Ser Phe Gln Trp Arg Asn Met Asn Thr Ile Lys Gly Thr Gln Asn Tyr
180 185 190
Ile Pro Ala Lys Cys Phe Ser Leu Asp Ala Phe Cys His His Phe Ser
195 200 205
Asn Met Asn Lys Ala Leu Leu Pro Leu Phe Ala Val Leu Cys Gly Asn
210 215 220
Asp His Val Asn Leu Pro Ile Met Glu Thr Phe Leu Ser Lys Ala Arg
225 230 235 240
Leu Pro Leu Gly Ala Thr Ser Ser Lys Gly Arg Arg His His Arg Ile
245 250 255
Leu Gly Leu Leu Asn Trp Leu Ser His Phe Ala Asn Pro Thr Glu Ala
260 265 270
Leu Asp Asn Val Leu Lys Tyr Leu Pro Lys Lys Asp Arg Glu Asn Val
275 280 285
Lys Glu Leu Leu Cys Cys Ser Met Glu Glu Tyr Gln Gln Ser Gln Val
290 295 300
Lys Leu Gln Asp Phe Phe Gln Cys Gly Thr Tyr Val Cys Pro Asp Ala
305 310 315 320
Leu Asn Leu Gly Leu Pro Glu Trp Val Leu Val Ala Leu Ala Lys Gly
325 330 335
Gln Leu Ser Pro Phe Ile Ser Asp Ala Leu Val Leu Arg Arg Thr Ile
340 345 350
Leu Pro Thr Gln Val Glu Asn Met Gln Gln Pro Asn Ala His Arg Ile
355 360 365
Ser Gln Pro Ile Arg Gln Ile Ile Tyr Gly Leu Leu Leu Asn Ala Ser
370 375 380
Pro His Leu Asp Lys Thr Ser Trp Asn Ala Leu Pro Pro Gln Pro Leu
385 390 395 400
Ala Phe Ser Glu Val Glu Arg Ile Asn Lys Asn Ile Arg Thr Ser Ile
405 410 415
Ile Asp Ala Val Glu Leu Ala Lys Asp His Ser Asp Leu Ser Arg Leu
420 425 430
Thr Glu Leu Ser Leu Arg Arg Arg Gln Met Leu Leu Leu Glu Thr Leu
435 440 445
Lys Val Lys Gln Thr Ile Leu Glu Pro Ile Pro Thr Ser Leu Lys Leu
450 455 460
Pro Ile Ala Val Ser Cys Tyr Trp Leu Gln His Thr Glu Thr Lys Ala
465 470 475 480
Lys Leu His His Leu Gln Ser Leu Leu Leu Thr Met Leu Val Gly Pro
485 490 495
Leu Ile Ala Ile Ile Asn Ser Pro Gly Lys Glu Glu Leu Gln Glu Asp
500 505 510
Gly Ala Lys Met Leu Tyr Ala Glu Phe Gln Arg Val Lys Ala Gln Thr
515 520 525
Arg Leu Gly Thr Arg Leu Asp Leu Asp Thr Ala His Ile Phe Cys Gln
530 535 540
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545 550 555 560
Thr Pro Leu Pro Glu Pro Asp Leu Thr Arg Leu Tyr Ser Gly Ser Leu
565 570 575
Val His Gly Leu Cys Gln Gln Leu Leu Ala Ser Thr Ser Val Glu Ser
580 585 590
Leu Leu Ser Ile Cys Pro Glu Ala Lys Gln Leu Tyr Glu Tyr Leu Phe
595 600 605
Asn Ala Thr Arg Ser Tyr Ala Pro Ala Glu Ile Phe Leu Pro Lys Gly
610 615 620
Arg Ser Asn Ser Lys Lys Lys Arg Gln Lys Lys Gln Asn Thr Ser Cys
625 630 635 640
Ser Lys Asn Arg Gly Arg Thr Thr Ala His Thr Lys Cys Trp Tyr Glu
645 650 655
Gly Asn Asn Arg Phe Gly Leu Leu Met Val Glu Asn Leu Glu Glu His
660 665 670
Ser Glu Ala Ser Asn Ile Glu
675
<210> 5
<211> 663
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 5
Met Gly Ile Arg Gly Leu Met Ser Phe Val Glu Asp His Ser Asn Glu
1 5 10 15
Phe Phe Thr Asp Leu Lys Leu Arg Asp Thr Lys Ile Val Ile Asp Gly
20 25 30
Tyr Ala Leu Phe His Arg Leu Cys Phe Ser Ser Asn Leu Asp Leu Arg
35 40 45
Tyr Gly Gly Asp Tyr Asp Ser Phe Ala Asp Val Val Gln Lys Phe Phe
50 55 60
Glu Ser Leu Phe Ala Cys Asn Ile Cys Pro Tyr Val Val Leu Asp Gly
65 70 75 80
Gly Cys Asp Ile Ser Asp Lys Lys Leu Thr Thr Leu Lys Asp Arg Ala
85 90 95
Arg Glu Lys Ile Gln Met Ala His Ser Leu Ser Val Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Tyr Val Cys Pro Leu Leu Ile Arg Glu Val Phe Ile Gln Val Leu Ile
115 120 125
Lys Leu Arg Val Cys Phe Val Gln Cys Phe Ser Glu Ala Asp Arg Asp
130 135 140
Ile Met Thr Leu Ala Asn His Trp Asn Cys Pro Val Leu Ser Ser Asp
145 150 155 160
Ser Asp Phe Cys Ile Phe Asp Leu Lys Thr Gly Phe Cys Pro Leu Asn
165 170 175
Ser Phe Gln Trp Arg Asn Met Asn Thr Ile Lys Gly Thr Gln Asn Tyr
180 185 190
Ile Pro Ala Lys Cys Phe Ser Leu Asp Ala Phe Cys His His Phe Ser
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Leu Pro Leu Gly Ala Thr Ser Ser Lys Gly Arg Arg His His Arg Ile
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Leu Gly Leu Leu Asn Trp Leu Ser His Phe Ala Asn Pro Thr Glu Ala
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Leu Asp Asn Val Leu Lys Tyr Leu Pro Lys Lys Asp Arg Glu Asn Val
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Lys Glu Leu Leu Cys Cys Ser Met Glu Glu Tyr Gln Gln Ser Gln Val
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340 345 350
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355 360 365
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385 390 395 400
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435 440 445
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465 470 475 480
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625 630 635 640
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645 650 655
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660
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<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 6
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130 135 140
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Ser Gly Ala Glu Ser Gln Ser Asp Ile His Thr Arg Lys Pro Phe Pro
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180 185 190
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Leu Tyr Gly Arg Asp Arg Gly Ile Phe Gly Ile Glu Ser Trp Pro Asp
260 265 270
Tyr Glu Asp Ile Tyr Lys Lys Thr Val Glu Val Gly Thr Phe Leu Asp
275 280 285
Leu Pro Arg Phe Pro Asp Ile Thr Glu Asp Cys Tyr Leu His Pro Asn
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Ile Leu Cys Met Lys Tyr Leu Met Glu Val Asn Leu Pro Asp Glu Met
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Lys His Asn Glu Lys Asn Lys Lys Asp Lys Pro Trp Phe Asp Phe Arg
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Lys Trp Tyr Gln Ile Met Lys Lys Ala Phe Asp Glu Lys Lys Gln Lys
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<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 7
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<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 8
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Leu Cys Leu Pro Ala Ala Ile Ser Ala Gln Ser Ile Leu Glu Leu Pro
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Thr Ser Glu Ser Glu Ser Asn Val Leu Gly Ala Thr Ser Gly Ser Leu
245 250 255
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275 280 285
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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Pro Ile Ser Thr Leu Ser Gly Asn Pro Leu Asp Asn Gly Trp Thr Leu
385 390 395 400
Ser Cys Ser Leu Pro Ser Ser Ser Val Ser Thr Ser Asp Leu Lys Asn
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435 440 445
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450 455 460
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Asn Asn Ser Phe Pro Ala Asp Gly Gln Pro Val Glu Gln Val Val Val
485 490 495
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500 505 510
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545 550 555 560
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565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
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645 650 655
Ser Asn Gln Gln Pro Gln Thr Ile Ser Leu Asn Gly Gln Leu Phe Ala
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885 890 895
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915 920 925
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930 935 940
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945 950 955 960
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1010 1015 1020
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1985 1990 1995 2000
Gln Arg Gln Ser Thr Val Phe Asp Pro Ser Leu Pro His Leu Pro Leu
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2245
<210> 9
<211> 37
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 9
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35
<210> 10
<211> 109
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 10
Met Pro Glu Met Thr Glu Asn Glu Thr Pro Thr Lys Lys Gln His Arg
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Lys Lys Ser Lys Lys Lys Met Ala Asp Ile Leu Asn Tyr
100 105
<210> 11
<211> 167
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 11
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1 5 10 15
Lys Lys Asn Arg Glu Thr His Asn Ala Val Glu Arg His Arg Lys Lys
20 25 30
Lys Ile Asn Ala Gly Ile Asn Arg Ile Gly Glu Leu Ile Pro Cys Ser
35 40 45
Pro Ala Leu Lys Gln Ser Lys Asn Met Ile Leu Asp Gln Ala Phe Lys
50 55 60
Tyr Ile Thr Glu Leu Lys Arg Gln Asn Asp Glu Leu Leu Leu Asn Gly
65 70 75 80
Gly Asn Asn Glu Gln Ala Glu Glu Ile Lys Lys Leu Arg Lys Gln Leu
85 90 95
Glu Glu Ile Gln Lys Glu Asn Gly Arg Tyr Ile Glu Leu Leu Lys Ala
100 105 110
Asn Asp Ile Cys Leu Tyr Asp Asp Pro Thr Ile His Trp Lys Gly Asn
115 120 125
Leu Lys Asn Ser Lys Val Ser Val Val Ile Pro Ser Asp Gln Val Gln
130 135 140
Lys Lys Leu Leu Phe Ile Pro Thr Gly Ile Ser Leu Val Glu Thr Ala
145 150 155 160
Arg Glu Gln Leu Phe Arg Gly
165
<210> 12
<211> 1037
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 12
Met Pro Glu Met Thr Glu Asn Glu Thr Pro Thr Lys Lys Gln His Arg
1 5 10 15
Lys Lys Asn Arg Glu Thr His Asn Ala Val Glu Arg His Arg Lys Lys
20 25 30
Lys Ile Asn Ala Gly Ile Asn Arg Ile Gly Glu Leu Ile Pro Cys Ser
35 40 45
Pro Ala Leu Lys Gln Ser Lys Asn Met Ile Leu Asp Gln Ala Phe Lys
50 55 60
Tyr Ile Thr Glu Leu Lys Arg Gln Asn Asp Glu Leu Leu Leu Asn Gly
65 70 75 80
Gly Asn Asn Glu Gln Ala Glu Glu Ile Lys Lys Leu Arg Lys Gln Leu
85 90 95
Glu Glu Ile Gln Lys Glu Asn Gly Arg Tyr Ile Glu Leu Leu Lys Ala
100 105 110
Asn Asp Ile Cys Leu Tyr Asp Asp Pro Thr Ile His Trp Lys Gly Asn
115 120 125
Leu Lys Asn Ser Lys Val Ser Val Val Ile Pro Ser Asp Gln Val Gln
130 135 140
Lys Lys Ile Ile Val Tyr Ser Asn Gly Asn Gln Pro Gly Gly Asn Ser
145 150 155 160
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165 170 175
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210 215 220
Leu Cys Leu Pro Ala Ala Ile Ser Ala Gln Ser Ile Leu Glu Leu Pro
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
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500 505 510
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515 520 525
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610 615 620
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645 650 655
Ser Asn Gln Gln Pro Gln Thr Ile Ser Leu Asn Gly Gln Leu Phe Ala
660 665 670
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675 680 685
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690 695 700
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<210> 13
<211> 553
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 13
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1 5 10 15
Gln Ile Leu Gln Thr Val Phe Leu Ser Ile Phe Ala Val Ala Thr Tyr
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245 250 255
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275 280 285
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Lys Ser Thr Met Lys Lys Glu Leu Glu Ala Ala Gln Lys Lys Lys Pro
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
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500 505 510
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515 520 525
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Asp Pro Arg Val Glu Val Thr Gln Phe
545 550
<210> 14
<211> 400
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 14
Met Ala Phe Gln Asp Leu Leu Gly His Ala Gly Asp Leu Trp Arg Phe
1 5 10 15
Gln Ile Leu Gln Thr Val Phe Leu Ser Ile Phe Ala Val Ala Thr Tyr
20 25 30
Leu His Phe Met Leu Glu Asn Phe Thr Ala Phe Ile Pro Gly His Arg
35 40 45
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65 70 75 80
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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195 200 205
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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355 360 365
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370 375 380
Ser Leu Val Gln Ser Ser Ser Trp Pro Thr Val Leu His Leu Gly His
385 390 395 400
<210> 15
<211> 400
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 15
Met Ala Phe Gln Asp Leu Leu Gly His Ala Gly Asp Leu Trp Arg Phe
1 5 10 15
Gln Ile Leu Gln Thr Val Phe Leu Ser Ile Phe Ala Val Ala Thr Tyr
20 25 30
Leu His Phe Met Leu Glu Asn Phe Thr Ala Phe Ile Pro Gly His Arg
35 40 45
Cys Trp Val His Ile Leu Asp Asn Asp Thr Val Ser Asp Asn Asp Thr
50 55 60
Gly Ala Leu Ser Gln Asp Ala Leu Leu Arg Ile Ser Ile Pro Leu Asp
65 70 75 80
Ser Asn Met Arg Pro Glu Lys Cys Arg Arg Phe Val His Pro Gln Trp
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100 105 110
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115 120 125
Ser Thr Ile Val Thr Glu Trp Asp Leu Val Cys Asp Ser Gln Ser Leu
130 135 140
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145 150 155 160
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180 185 190
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210 215 220
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225 230 235 240
Ser Gly Ile Ala Phe Met Thr Leu Ala Gly Leu Ala Phe Ala Ile Arg
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
Lys Ser Thr Met Lys Lys Glu Leu Glu Ala Ala Gln Lys Lys Asn Leu
325 330 335
Leu Cys Val Lys Cys Ser Thr Cys Pro Thr Tyr Val Lys Gly Ser Pro
340 345 350
Ser Cys Pro Leu Arg Asp Leu Gln Thr Leu Trp Pro Ile Leu Ala Leu
355 360 365
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370 375 380
Ser Leu Val Gln Ser Ser Ser Trp Pro Thr Val Leu His Leu Gly His
385 390 395 400
<210> 16
<211> 549
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 16
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1 5 10 15
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Leu His Phe Met Leu Glu Asn Phe Thr Ala Phe Ile Pro Gly His Arg
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65 70 75 80
Ser Asn Met Arg Pro Glu Lys Cys Arg Arg Phe Val His Pro Gln Trp
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Gln Leu Leu His Leu Asn Gly Thr Phe Pro Asn Thr Ser Asp Ala Asp
100 105 110
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115 120 125
Ser Thr Ile Val Thr Glu Trp Asp Leu Val Cys Asp Ser Gln Ser Leu
130 135 140
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Ile Leu Gly Gly His Leu Ser Asp Arg Phe Gly Arg Arg Phe Val Leu
165 170 175
Arg Trp Cys Tyr Leu Gln Val Ala Ile Val Gly Thr Cys Ala Ala Leu
180 185 190
Ala Pro Thr Phe Leu Ile Tyr Cys Ser Leu Arg Phe Leu Ser Gly Ile
195 200 205
Ala Ala Met Ser Leu Ile Thr Asn Thr Ile Met Leu Ile Ala Glu Trp
210 215 220
Ala Thr His Arg Phe Gln Ala Met Gly Ile Thr Leu Gly Met Cys Pro
225 230 235 240
Ser Gly Ile Ala Phe Met Thr Leu Ala Gly Leu Ala Phe Ala Ile Arg
245 250 255
Asp Trp His Ile Leu Gln Leu Val Val Ser Val Pro Tyr Phe Val Ile
260 265 270
Phe Leu Thr Ser Ser Trp Leu Leu Glu Ser Ala Arg Trp Leu Ile Ile
275 280 285
Asn Asn Lys Pro Glu Glu Gly Leu Lys Glu Leu Arg Lys Ala Ala His
290 295 300
Arg Ser Gly Met Lys Asn Ala Arg Asp Thr Leu Thr Leu Glu Ile Leu
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Lys Ser Thr Met Lys Lys Glu Leu Glu Ala Ala Gln Lys Lys Lys Pro
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
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515 520 525
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530 535 540
Ile Arg Glu Trp Lys
545
<210> 17
<211> 400
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的肽
<220>
<221> 变体
<222> 354
<223> 任何氨基酸，除了半胱氨酸
<400> 17
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65 70 75 80
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165 170 175
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195 200 205
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210 215 220
Ala Thr His Arg Phe Gln Ala Met Gly Ile Thr Leu Gly Met Cys Pro
225 230 235 240
Ser Gly Ile Ala Phe Met Thr Leu Ala Gly Leu Ala Phe Ala Ile Arg
245 250 255
Asp Trp His Ile Leu Gln Leu Val Val Ser Val Pro Tyr Phe Val Ile
260 265 270
Phe Leu Thr Ser Ser Trp Leu Leu Glu Ser Ala Arg Trp Leu Ile Ile
275 280 285
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290 295 300
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355 360 365
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370 375 380
Ser Leu Val Gln Ser Ser Ser Trp Pro Thr Val Leu His Leu Gly His
385 390 395 400
<210> 18
<211> 400
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的肽
<220>
<221> 变体
<222> 344
<223> 任何氨基酸，除了半胱氨酸
<400> 18
Met Ala Phe Gln Asp Leu Leu Gly His Ala Gly Asp Leu Trp Arg Phe
1 5 10 15
Gln Ile Leu Gln Thr Val Phe Leu Ser Ile Phe Ala Val Ala Thr Tyr
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35 40 45
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100 105 110
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
Arg Trp Cys Tyr Leu Gln Val Ala Ile Val Gly Thr Cys Ala Ala Leu
180 185 190
Ala Pro Thr Phe Leu Ile Tyr Cys Ser Leu Arg Phe Leu Ser Gly Ile
195 200 205
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210 215 220
Ala Thr His Arg Phe Gln Ala Met Gly Ile Thr Leu Gly Met Cys Pro
225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
Phe Leu Thr Ser Ser Trp Leu Leu Glu Ser Ala Arg Trp Leu Ile Ile
275 280 285
Asn Asn Lys Pro Glu Glu Gly Leu Lys Glu Leu Arg Lys Ala Ala His
290 295 300
Arg Ser Gly Met Lys Asn Ala Arg Asp Thr Leu Thr Leu Glu Ile Leu
305 310 315 320
Lys Ser Thr Met Lys Lys Glu Leu Glu Ala Ala Gln Lys Lys Asn Leu
325 330 335
Leu Cys Val Lys Cys Ser Thr Xaa Pro Thr Tyr Val Lys Gly Ser Pro
340 345 350
Ser Cys Pro Leu Arg Asp Leu Gln Thr Leu Trp Pro Ile Leu Ala Leu
355 360 365
Ile Ser Met Ser Ser Ile Trp Gly Thr Met Phe Ser Cys Cys Arg Leu
370 375 380
Ser Leu Val Gln Ser Ser Ser Trp Pro Thr Val Leu His Leu Gly His
385 390 395 400
<210> 19
<211> 33
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 19
Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Ser Leu Val Arg Leu Ser Ser Cys
1 5 10 15
Val Pro Val Ala Leu Met Ser Ala Met Thr Thr Ser Ser Ser Gln Lys
20 25 30
Asn
<210> 20
<211> 24
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 20
Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Ser Leu Val Arg Leu Ser Ser Cys
1 5 10 15
Val Pro Val Ala Leu Met Ser Ala
20
<210> 21
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的肽
<400> 21
Lys Gly Ile Met Lys Glu Lys Lys Ser Leu Val Arg Leu Ser Ser Cys
1 5 10 15
Val Pro Val Ala Leu Met Ser Ala
20
<210> 22
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 22
Ser Ser Cys Val Pro Val Ala Leu Met Ser Ala Met Thr Thr Ser Ser
1 5 10 15
Ser Gln Lys Asn
20
<210> 23
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的肽
<400> 23
Ser Ser Gly Val Pro Val Ala Leu Met Ser Ala Met Thr Thr Ser Ser
1 5 10 15
Ser Gln Lys Asn
20
<210> 24
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 24
Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Ser Leu Val Arg Leu Ser Ser Cys
1 5 10 15
Val
<210> 25
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的肽
<400> 25
Lys Gly Ile Met Lys Glu Lys Lys Ser Leu Val Arg Leu Ser Ser Cys
1 5 10 15
Val
<210> 26
<211> 25
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 26
Arg Asn Arg Ile Pro Ala Val Leu Arg Thr Glu Gly Glu Pro Leu His
1 5 10 15
Thr Pro Ser Val Gly Met Arg Glu Thr
20 25
<210> 27
<211> 25
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 27
Lys Thr Ile Leu Lys Lys Ala Gly Ile Gly Met Cys Val Lys Val Ser
1 5 10 15
Ser Ile Phe Phe Ile Asn Lys Gln Lys
20 25
<210> 28
<211> 24
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 28
Lys Lys Thr Leu Arg Asn His Leu Phe Leu Ile Arg Trp Ile Ile Leu
1 5 10 15
Thr Phe Leu Gln Lys Ile Leu Lys
20
<210> 29
<211> 28
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 29
Ser Cys Pro Leu Arg Asp Leu Gln Thr Leu Trp Pro Ile Leu Ala Leu
1 5 10 15
Ile Ser Met Ser Ser Ile Trp Gly Thr Met Phe Ser
20 25
<210> 30
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的肽
<400> 30
Ser Gly Pro Leu Arg Asp Leu Gln Thr Leu Trp Pro Ile Leu Ala Leu
1 5 10 15
Ile Ser Met Ser Ser Ile Trp Gly Thr Met Phe Ser
20 25
<210> 31
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 31
Ser Thr Cys Pro Thr Tyr Val Lys Gly Ser Pro Ser Cys Pro Leu Arg
1 5 10 15
Asp Leu Gln
<210> 32
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的肽
<400> 32
Ser Thr Gly Pro Thr Tyr Val Lys Gly Ser Pro Ser Cys Pro Leu Arg
1 5 10 15
Asp Leu Gln
<210> 33
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 33
Arg Leu Ser Ser Cys Val Pro Val Ala
1 5
<210> 34
<211> 23
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 34
Ser Leu Val Arg Leu Ser Ser Cys Val Pro Val Ala Leu Met Ser Ala
1 5 10 15
Met Thr Thr Ser Ser Ser Gln
20
<210> 35
<211> 22
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 35
Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Ser Leu Val Arg Leu Ser
1 5 10 15
Ser Cys Val Pro Val Ala
20
<210> 36
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 36
Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Ser Leu Val Arg Leu Ser
1 5 10 15
Ser Cys Val
<210> 37
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 37
Ser Leu Val Arg Leu Ser Ser Cys Val
1 5
<210> 38
<211> 23
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 38
Ala Leu Met Ser Ala Met Thr Thr Ser Ser Ser Gln Lys Asn Ile Thr
1 5 10 15
Pro Ala Ile Leu Thr Cys Cys
20
<210> 39
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 39
Ala Met Thr Thr Ser Ser Ser Gln Lys Asn Ile Thr Pro Ala Ile Leu
1 5 10 15
Thr Cys Cys
<210> 40
<211> 33
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 40
Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Ser Leu Val Arg Leu Ser
1 5 10 15
Ser Cys Val Pro Val Ala Leu Met Ser Ala Met Thr Thr Ser Ser Ser
20 25 30
Gln
<210> 41
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 41
Lys Lys Ser Leu Val Arg Leu Ser Ser Cys Val Pro Val Ala Leu
1 5 10 15
<210> 42
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 42
Val Ala Leu Met Ser Ala Met Thr Thr Ser Ser Ser Gln Lys Asn
1 5 10 15
<210> 43
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 43
Pro Val Ala Leu Met Ser Ala Met Thr Thr Ser Ser Ser Gln Lys
1 5 10 15
<210> 44
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 44
Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Ser Leu Val Arg Leu Ser Ser
1 5 10 15
<210> 45
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 45
Cys Val Pro Val Ala Leu Met Ser Ala Met Thr Thr Ser Ser Ser
1 5 10 15
<210> 46
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 46
Leu Val Arg Leu Ser Ser Cys Val Pro Val Ala Leu Met Ser Ala
1 5 10 15
<210> 47
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 47
Met Lys Glu Lys Lys Ser Leu Val Arg Leu Ser Ser Cys Val Pro
1 5 10 15
<210> 48
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 48
Lys Ser Leu Val Arg Leu Ser Ser Cys Val Pro Val Ala Leu Met
1 5 10 15
<210> 49
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 49
Ser Ser Cys Val Pro Val Ala Leu Met Ser Ala Met Thr Thr Ser
1 5 10 15
<210> 50
<211> 40
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 50
Gly Arg Ser Asn Ser Lys Lys Lys Gly Arg Arg Asn Arg Ile Pro Ala
1 5 10 15
Val Leu Arg Thr Glu Gly Glu Pro Leu His Thr Pro Ser Val Gly Met
20 25 30
Arg Glu Thr Thr Gly Leu Gly Cys
35 40
<210> 51
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 51
Glu Gly Glu Pro Leu His Thr Pro Ser Val Gly Met Arg Glu Thr
1 5 10 15
<210> 52
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 52
Arg Thr Glu Gly Glu Pro Leu His Thr Pro Ser Val Gly Met Arg
1 5 10 15
<210> 53
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 53
Ile Pro Ala Val Leu Arg Thr Glu Gly Glu Pro Leu His Thr Pro
1 5 10 15
<210> 54
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 54
Arg Asn Arg Ile Pro Ala Val Leu Arg Thr Glu Gly Glu Pro Leu
1 5 10 15
<210> 55
<211> 25
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 55
Arg Asn Arg Ile Pro Ala Val Leu Arg Thr Glu Gly Glu Pro Leu His
1 5 10 15
Thr Pro Ser Val Gly Met Arg Glu Thr
20 25
<210> 56
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 56
Thr Glu Gly Glu Pro Leu His Thr
1 5
<210> 57
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 57
Leu Arg Thr Glu Gly Glu Pro Leu His
1 5
<210> 58
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 58
Val Leu Arg Thr Glu Gly Glu Pro Leu
1 5
<210> 59
<211> 37
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 59
Gln Ile Lys Ala Leu Asn Arg Gly Leu Lys Lys Lys Thr Ile Leu Lys
1 5 10 15
Lys Ala Gly Ile Gly Met Cys Val Lys Val Ser Ser Ile Phe Phe Ile
20 25 30
Asn Lys Gln Lys Pro
35
<210> 60
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 60
Cys Val Lys Val Ser Ser Ile Phe Phe Ile Asn Lys Gln Lys Pro
1 5 10 15
<210> 61
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 61
Gly Met Cys Val Lys Val Ser Ser Ile Phe Phe Ile Asn Lys Gln
1 5 10 15
<210> 62
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 62
Ile Gly Met Cys Val Lys Val Ser Ser Ile Phe Phe Ile Asn Lys
1 5 10 15
<210> 63
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 63
Gly Ile Gly Met Cys Val Lys Val Ser Ser Ile Phe Phe Ile Asn
1 5 10 15
<210> 64
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 64
Lys Ala Gly Ile Gly Met Cys Val Lys Val Ser Ser Ile Phe Phe
1 5 10 15
<210> 65
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 65
Lys Lys Thr Ile Leu Lys Lys Ala Gly Ile Gly Met Cys Val Lys
1 5 10 15
<210> 66
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 66
Leu Lys Lys Lys Thr Ile Leu Lys Lys Ala Gly Ile Gly Met Cys
1 5 10 15
<210> 67
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 67
Gly Leu Lys Lys Lys Thr Ile Leu Lys Lys Ala Gly Ile Gly Met
1 5 10 15
<210> 68
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 68
Asn Arg Gly Leu Lys Lys Lys Thr Ile Leu Lys Lys Ala Gly Ile
1 5 10 15
<210> 69
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 69
Asn Arg Gly Leu Lys Lys Lys Thr Ile Leu Lys Lys Ala Gly Ile Gly
1 5 10 15
Met Cys Val Lys Val Ser Ser Ile Phe Phe Ile Asn Lys Gln Lys Pro
20 25 30
<210> 70
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 70
Ser Ile Phe Phe Ile Asn Lys Gln Lys
1 5
<210> 71
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 71
Val Ser Ser Ile Phe Phe Ile Asn Lys
1 5
<210> 72
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 72
Gly Met Cys Val Lys Val Ser Ser Ile
1 5
<210> 73
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 73
Ala Gly Ile Gly Met Cys Val Lys Val
1 5
<210> 74
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 74
Lys Ala Gly Ile Gly Met Cys Val Lys
1 5
<210> 75
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 75
Lys Thr Ile Leu Lys Lys Ala Gly Ile
1 5
<210> 76
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 76
Thr Leu Leu Ser Asp Leu Ala Lys Lys Lys Thr Leu Arg Asn His Leu
1 5 10 15
Phe Leu Ile Arg Trp Ile Ile Leu Thr Phe Leu Gln Lys Ile Leu Lys
20 25 30
<210> 77
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 77
Leu Ile Arg Trp Ile Ile Leu Thr Phe Leu Gln Lys Ile Leu Lys
1 5 10 15
<210> 78
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 78
Leu Phe Leu Ile Arg Trp Ile Ile Leu Thr Phe Leu Gln Lys Ile
1 5 10 15
<210> 79
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 79
His Leu Phe Leu Ile Arg Trp Ile Ile Leu Thr Phe Leu Gln
1 5 10
<210> 80
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 80
Arg Asn His Leu Phe Leu Ile Arg Trp Ile Ile Leu Thr Phe Leu
1 5 10 15
<210> 81
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 81
Lys Lys Thr Leu Arg Asn His Leu Phe Leu Ile Arg Trp Ile Ile
1 5 10 15
<210> 82
<211> 24
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 82
Lys Lys Thr Leu Arg Asn His Leu Phe Leu Ile Arg Trp Ile Ile Leu
1 5 10 15
Thr Phe Leu Gln Lys Ile Leu Lys
20
<210> 83
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 83
Leu Thr Phe Leu Gln Lys Ile Leu Lys
1 5
<210> 84
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 84
Ile Leu Thr Phe Leu Gln Lys Ile Leu
1 5
<210> 85
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 85
Ile Ile Leu Thr Phe Leu Gln Lys Ile
1 5
<210> 86
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 86
Trp Ile Ile Leu Thr Phe Leu Gln Lys
1 5
<210> 87
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 87
Ile Arg Trp Ile Ile Leu Thr Phe Leu
1 5
<210> 88
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 88
Leu Ile Arg Trp Ile Ile Leu Thr Phe
1 5
<210> 89
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 89
Phe Leu Ile Arg Trp Ile Ile Leu Thr
1 5
<210> 90
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 90
Leu Phe Leu Ile Arg Trp Ile Ile Leu
1 5
<210> 91
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 91
Asn His Leu Phe Leu Ile Arg Trp Ile
1 5
<210> 92
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 92
Leu Arg Asn His Leu Phe Leu Ile Arg
1 5
<210> 93
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 93
Thr Leu Arg Asn His Leu Phe Leu Ile
1 5
<210> 94
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 94
Lys Thr Leu Arg Asn His Leu Phe Leu
1 5
<210> 95
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 95
Lys Lys Thr Leu Arg Asn His Leu Phe
1 5
<210> 96
<211> 68
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 96
Lys Lys Asn Leu Leu Cys Val Lys Cys Ser Thr Cys Pro Thr Tyr Val
1 5 10 15
Lys Gly Ser Pro Ser Cys Pro Leu Arg Asp Leu Gln Thr Leu Trp Pro
20 25 30
Ile Leu Ala Leu Ile Ser Met Ser Ser Ile Trp Gly Thr Met Phe Ser
35 40 45
Cys Cys Arg Leu Ser Leu Val Gln Ser Ser Ser Trp Pro Thr Val Leu
50 55 60
His Leu Gly His
65
<210> 97
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 97
Trp Gly Thr Met Phe Ser Cys Cys Arg Leu Ser Leu Val Gln Ser
1 5 10 15
<210> 98
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 98
Ile Ser Met Ser Ser Ile Trp Gly Thr Met Phe Ser Cys Cys Arg
1 5 10 15
<210> 99
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 99
Leu Ile Ser Met Ser Ser Ile Trp Gly Thr Met Phe Ser Cys Cys
1 5 10 15
<210> 100
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 100
Ile Leu Ala Leu Ile Ser Met Ser Ser Ile Trp Gly Thr Met Phe
1 5 10 15
<210> 101
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 101
Trp Pro Ile Leu Ala Leu Ile Ser Met Ser Ser Ile Trp Gly Thr
1 5 10 15
<210> 102
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 102
Leu Trp Pro Ile Leu Ala Leu Ile Ser Met Ser Ser Ile Trp Gly
1 5 10 15
<210> 103
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 103
Gln Thr Leu Trp Pro Ile Leu Ala Leu Ile Ser Met Ser Ser Ile
1 5 10 15
<210> 104
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 104
Leu Gln Thr Leu Trp Pro Ile Leu Ala Leu Ile Ser Met Ser Ser
1 5 10 15
<210> 105
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 105
Leu Arg Asp Leu Gln Thr Leu Trp Pro Ile Leu Ala Leu Ile Ser
1 5 10 15
<210> 106
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 106
Ser Cys Pro Leu Arg Asp Leu Gln Thr Leu Trp Pro Ile Leu Ala
1 5 10 15
<210> 107
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 107
Pro Thr Tyr Val Lys Gly Ser Pro Ser Cys Pro Leu Arg Asp Leu
1 5 10 15
<210> 108
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 108
Cys Pro Thr Tyr Val Lys Gly Ser Pro Ser Cys Pro Leu Arg Asp
1 5 10 15
<210> 109
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 109
Ser Thr Cys Pro Thr Tyr Val Lys Gly Ser Pro Ser Cys Pro Leu
1 5 10 15
<210> 110
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 110
Lys Asn Leu Leu Cys Val Lys Cys Ser Thr Cys Pro Thr Tyr Val
1 5 10 15
<210> 111
<211> 28
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 111
Ser Cys Pro Leu Arg Asp Leu Gln Thr Leu Trp Pro Ile Leu Ala Leu
1 5 10 15
Ile Ser Met Ser Ser Ile Trp Gly Thr Met Phe Ser
20 25
<210> 112
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 112
Ser Thr Cys Pro Thr Tyr Val Lys Gly Ser Pro Ser Cys Pro Leu Arg
1 5 10 15
Asp Leu Gln
<210> 113
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 113
Leu Ala Leu Ile Ser Met Ser Ser Ile
1 5
<210> 114
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 114
Thr Leu Trp Pro Ile Leu Ala Leu Ile
1 5
<210> 115
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 115
Gln Thr Leu Trp Pro Ile Leu Ala Leu
1 5
<210> 116
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 116
Cys Pro Leu Arg Asp Leu Gln Thr Leu
1 5
<210> 117
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 117
Ser Pro Ser Cys Pro Leu Arg Asp Leu
1 5
<210> 118
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 118
Cys Ser Thr Cys Pro Thr Tyr Val Lys
1 5
<210> 119
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 119
Ser Ser Trp Pro Thr Val Leu His Leu
1 5
<210> 120
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 120
Leu Ser Leu Val Gln Ser Ser Ser Trp
1 5
<210> 121
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 121
Arg Leu Ser Leu Val Gln Ser Ser Ser
1 5
<210> 122
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 122
Phe Ser Cys Cys Arg Leu Ser Leu Val
1 5
<210> 123
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 123
Val Arg Leu Ser Ser Cys Val Pro Val Ala Leu Met Ser Ala
1 5 10
<210> 124
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 124
Leu Val Arg Leu Ser Ser Cys Val Pro
1 5
<210> 125
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的肽
<400> 125
Leu Val Arg Leu Ser Ser Gly Val Pro
1 5
<210> 126
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的肽
<400> 126
Lys Gly Ile Met Lys Glu Lys Lys Ser Leu Val Arg Leu Ser Ser Cys
1 5 10 15
Val Pro Val Ala Leu Met Ser Ala Met Thr Gly
20 25
<210> 127
<211> 31
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 127
Lys Lys Lys Gly Arg Arg Asn Arg Ile Pro Ala Val Leu Arg Thr Glu
1 5 10 15
Gly Glu Pro Leu His Thr Pro Ser Val Gly Met Arg Glu Thr Gly
20 25 30
<210> 128
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 128
Gly Leu Lys Lys Lys Thr Ile Leu Lys Lys Ala Gly Ile Gly Met Cys
1 5 10 15
Val Lys Val Ser Ser Ile Phe Phe Ile Asn Lys Gln Lys Gly
20 25 30
<210> 129
<211> 27
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 129
Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Ser Leu Val Arg Leu Ser Ser Cys
1 5 10 15
Val Pro Val Ala Leu Met Ser Ala Met Thr Gly
20 25

Claims (23)

1.肽混合物，其包含第一肽和第二肽，所述第一肽和第二肽各自独立地选自：
能够诱导针对TGFβR2-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽，其中所述肽包含i)SEQ IDNO:3的免疫原性片段，其中所述片段包括SEQ ID NO:3的至少8个连续氨基酸且包括SEQ IDNO:3的第121和135位中的至少一个，或ii)SEQ ID NO:2的免疫原性片段，其中所述片段包含SEQ ID NO:19的至少10个连续氨基酸；
能够诱导针对ASTE1-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽，其中所述肽包括SEQ ID NO:5的免疫原性片段，其中所述片段包含SEQ ID NO:26的至少10个连续氨基酸；
能够诱导针对TAF1β-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽，其中所述肽包括SEQ ID NO:7的免疫原性片段，其中所述片段包含SEQ ID NO:27的至少8个连续氨基酸；
能够诱导针对KIAA2018-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽，其中所述肽包含SEQ IDNO:9-12之一的免疫原性片段，其中所述片段分别包含SEQ ID NO:9-12之一的至少8个连续氨基酸，分别包括SEQ ID NO:9的第13至37位、SEQ ID NO:10的第91至109位、SEQ ID NO:11的第147至167位和SEQ ID NO:12的第1016至1037位的至少一个氨基酸；和
能够诱导针对SLC22A9-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽，其中所述肽包含SEQ ID NO:14-18之一的免疫原性片段，其中所述片段分别包含SEQ ID NO:14-18之一的至少8个连续氨基酸，分别包括SEQ ID NO:14的第327至400位、SEQ ID NO:15的第335至400位、SEQ IDNO:16的第533至549位、SEQ ID NO:17的第327至400位和SEQ ID NO:18的第335至400位的至少一个氨基酸；
其中所述第一肽能够诱导针对与所述第二肽不同的移码突变蛋白的免疫应答。
2.根据权利要求1所述的肽混合物，其中所述包含SEQ ID NO:3的免疫原性片段的肽包含SEQ ID NO:3的至少9个，优选至少10个连续氨基酸，或者所述包含SEQ ID NO:2的免疫原片段的肽包括SEQ ID NO:19的至少9个，优选至少10个连续氨基酸。
3.根据权利要求1或2所述的肽混合物，其中所述能够诱导针对TGFβR2-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽包括SEQ ID NO:3的第121至132位、SEQ ID NO:3的第129至137位、SEQID NO:3的第135至146位或SEQ ID NO:19的第2至17位、SEQ ID NO:19的第10至18位或SEQID NO:19的第16至33位，优选其中对应于SEQ ID NO:3的第121或135位的氨基酸是甘氨酸。
4.根据前述权利要求中任一项所述的肽混合物，其中所述能够诱导针对TGFβR2-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽包含SEQ ID NO:19至25、124和125之一的氨基酸序列，优选其中所述肽由SEQ ID NO:19至25、124和125之一组成。
5.根据前述权利要求中任一项所述的肽混合物，其中所述SEQ ID NO:5的免疫原性片段包含SEQ ID NO:26的至少10个连续氨基酸，优选至少15个连续氨基酸，优选其中所述能够诱导针对ASTE1-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽包含SEQ ID NO:26的序列，优选其中所述能够诱导针对ASTE1-1 a移码突变体蛋白的免疫应答的肽由SEQ ID NO:26组成。
6.根据前述权利要求中任一项所述的肽混合物，其中所述SEQ ID NO:7的免疫原性片段包含SEQ ID NO:27的至少10个连续氨基酸，优选至少13个连续氨基酸，优选其中所述能够诱导针对TAF1β-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽包含SEQ ID NO:27的序列，优选其中所述能够诱导针对TAF1β-1a移码突变体蛋白的免疫应答的肽由SEQ ID NO:27组成。
7.根据前述权利要求中任一项所述的肽混合物，其中所述SEQ ID NO:9-12之一的免疫原性片段包含SEQ ID NO:9-12之一的至少10个连续氨基酸，优选至少15个连续氨基酸，优选其中所述肽包含SEQ ID NO:28的序列，优选其中所述肽由SEQ ID NO:28组成。
8.根据前述权利要求中任一项所述的肽混合物，其中所述SEQ ID NO:14-18之一的免疫原性片段分别包含SEQ ID NO:14-18之一的至少10个连续氨基酸，优选至少15个连续的氨基酸，分别包括SEQ ID NO:14的第327至400位、SEQ ID NO:15的第335至400位、SEQ IDNO:16的第533至549位、SEQ ID NO:17的第327至400位和SEQ ID NO:18的第335至400位的至少一个氨基酸，优选地，其中所述能够诱导针对SLC22A9-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽包含SEQ ID NO:29-32之一的序列，优选地，其中所述肽由SEQ ID NO:29-32之一组成。
9.根据前述权利要求中任一项所述的肽混合物，其中所述第一肽是能够诱导针对TGFβR2-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽，并且所述第二肽是能够诱导针对ASTE1-1a移码突变蛋白或TAF1β-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽。
10.根据前述权利要求中任一项所述的肽混合物，其中所述肽混合物包含选自权利要求1中定义的肽的至少一种另外的肽，其中所述至少一种另外的肽能够诱导针对与所述第一和第二肽中的每一种不同的移码突变蛋白的免疫应答，优选地，其中所述第一肽是能够诱导针对TGFβR2-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽，所述第二肽是能够诱导针对ASTE1-1a移变突变蛋白的免疫应答的肽，并且所述至少一种另外的肽是能够诱导针对TAF1β-1a移突变蛋白的免疫应答的肽，并且优选其中所述肽混合物进一步包含能够诱导针对KIAA2018-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽和/或能够诱导针对SLC22A9-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽。
11.根据前述权利要求中任一项所述的肽混合物，其中所述肽混合物中的至少一种肽在其C末端包含甘氨酸残基。
12.肽，其中所述肽能够诱导针对以下项的免疫应答：
ASTE1-1a移码突变蛋白，其中所述肽包含SEQ ID NO:5的免疫原性片段，其中所述片段包含SEQ ID NO:26的至少10个连续氨基酸；
TAF1β-1a移码突变蛋白，其中所述肽包含SEQ ID NO:7的免疫原性片段，其中所述片段包含SEQ ID NO:27的至少12个连续氨基酸，和其中所述肽包含不超过27个氨基酸；
KIAA2018-1a移码突变蛋白，其中所述肽包含SEQ ID NO:9-12之一的免疫原性片段，其中所述片段包含SEQ ID NO:9-12之一的至少8个连续氨基酸，包括SEQ ID NO:9的第13至37位、SEQ ID NO:10的第91至109位、SEQ ID NO:11的第147至167位和SEQ ID NO:12的第1016至1037位的至少一个氨基酸；或
SLC22A9-1a移码突变蛋白，其中所述肽包含SEQ ID NO:14-18之一的免疫原性片段，其中所述片段包含SEQ ID NO:14-18之一的至少8个连续氨基酸，包括SEQ ID NO:14的第327至400位、SEQ ID NO:15的第335至400位、SEQ ID NO:16的第533至549位、SEQ ID NO:17的第327至400位和SEQ ID NO:18的第335至400位的至少一个氨基酸。
13.根据权利要求12所述的肽，其中所述肽在其C末端包含甘氨酸残基。
14.T细胞混合物，其包含第一和第二T细胞，所述第一和第二T细胞各自独立地选自：
对权利要求1所定义的能够诱导针对TGFβR2-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽具有特异性的T细胞，其中所述T细胞是未转染的T细胞；
对权利要求1所定义的能够诱导针对-1a ASTE1移码突变蛋白的免疫应答的肽具有特异性的T细胞；
对权利要求1所定义的能够诱导针对TAF1β-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽具有特异性的T细胞；
对权利要求1所定义的能够诱导针对KIAA2018-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽具有特异性的T细胞；和
对权利要求1所定义的能够诱导针对SLC22A9-1a移码突变蛋白的免疫应答的肽具有特异性的T细胞，
其中所述第一T细胞对能够诱导针对与所述第二T细胞特异的肽不同的移码突变蛋白的免疫应答的肽具有特异性。
15.T细胞，其对能够诱导针对以下项的免疫应答的肽具有特异性：
ASTE1-1a移码突变蛋白，其中所述肽包含SEQ ID NO:5的免疫原性片段，其中所述片段包含SEQ ID NO:26的至少10个连续氨基酸；
TAF1β-1a移码突变蛋白，其中所述肽包含SEQ ID NO:7的免疫原性片段，其中所述片段包含SEQ ID NO:27的至少10个连续氨基酸，和其中所述肽包含不超过35个氨基酸；
KIAA2018-1a移码突变蛋白，其中所述肽包含SEQ ID NO:9-12之一的免疫原性片段，其中所述片段包含SEQ ID NO:9-12之一的至少8个连续氨基酸，包括SEQ ID NO:9的第13至37位、SEQ ID NO:10的第91至109位、SEQ ID NO:11的第147至167位和SEQ ID NO:12的第1016至1037位的至少一个氨基酸；或
SLC22A9-1a移码突变蛋白，其中所述肽包含SEQ ID NO:14-18之一的免疫原性片段，其中所述片段包含SEQ ID NO:14-18之一的至少8个连续氨基酸，包括SEQ ID NO:14的第327至400位、SEQ ID NO:15的第335至400位、SEQ ID NO:16的第533至549位、SEQ ID NO:17的第327至400位和SEQ ID NO:18的第335至400位的至少一个氨基酸,
其用于治疗和/或预防癌症，优选其中所述癌症是结直肠癌。
16.T细胞受体或其抗原结合片段，其对能够诱导针对以下项的免疫应答的肽具有特异性：
ASTE1-1a移码突变蛋白，其中所述肽包含SEQ ID NO:5的免疫原性片段，其中所述片段包含SEQ ID NO:26的至少10个连续氨基酸；
TAF1β-1a移码突变蛋白，其中所述肽包含SEQ ID NO:7的免疫原性片段，其中所述片段包含SEQ ID NO:27的至少10个连续氨基酸，和其中所述肽包含不超过35个氨基酸；
KIAA2018-1a移码突变蛋白，其中所述肽包含SEQ ID NO:9-12之一的免疫原性片段，其中所述片段包含SEQ ID NO:9-12之一的至少8个连续氨基酸，包括SEQ ID NO:9的第13至37位、SEQ ID NO:10的第91至109位、SEQ ID NO:11的第147至167位和SEQ ID NO:12的第1016至1037位的至少一个氨基酸；或
SLC22A9-1a移码突变蛋白，其中所述肽包含SEQ ID NO:14-18之一的免疫原性片段，其中所述片段包含SEQ ID NO:14-18之一的至少8个连续氨基酸，包括SEQ ID NO:14的第327至400位、SEQ ID NO:15的第335至400位、SEQ ID NO:16的第533至549位、SEQ ID NO:17的第327至400位和SEQ ID NO:18的第335至400位的至少一个氨基酸,
其用于治疗和/或预防癌症，优选其中所述癌症是结直肠癌。
17.至少一种核酸分子，其中所述一种或多种核酸分子单独或共同包含编码权利要求1至11中定义的至少两种肽的核苷酸序列，或者所述核酸分子或每种核酸分子包含编码权利权利要求12或13中定义的至少一种肽的核苷酸序列。
18.载体，其包含权利要求17中定义的核酸分子。
19.宿主细胞，其包含如权利要求18中定义的载体。
20.药物组合物，其包含权利要求1-11中任一项定义的肽混合物、权利要求12或13中定义的肽、权利要求14中定义的T细胞混合物、权利权利要求15中定义的T细胞、权利要求17中定义的核酸分子、权利要求18中定义的载体或权利要求19中定义的宿主细胞以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
21.权利要求1至11中任一项所定义的肽混合物、权利要求14所定义的T细胞混合物、权利要求15所定义的T细胞、权利要求16所定义的T细胞受体或其抗原结合片段、权利要求17所定义的核酸分子、权利要求18所定义的载体、权利要求19所定义的宿主细胞或权利要求20所定义的药物组合物，其用于治疗和/或预防癌症，优选其中所述癌症是结直肠癌。
22.肽，其能够诱导针对以下项的免疫应答：
ASTE1-1a移码突变蛋白，其中所述肽包含SEQ ID NO:5的免疫原性片段，其中所述片段包含SEQ ID NO:26的至少10个连续氨基酸；
TAF1β-1a移码突变蛋白，其中所述肽包含SEQ ID NO:7的免疫原性片段，其中所述片段包含SEQ ID NO:27的至少10个连续氨基酸，和其中所述肽包含不超过35个氨基酸；
KIAA2018-1a移码突变蛋白，其中所述肽包含SEQ ID NO:9-12之一的免疫原性片段，其中所述片段包含SEQ ID NO:9-12之一的至少8个连续氨基酸，包括SEQ ID NO:9的第13至37位、SEQ ID NO:10的第91至109位、SEQ ID NO:11的第147至167位和SEQ ID NO:12的第1016至1037位的至少一个氨基酸；或
SLC22A9-1a移码突变蛋白，其中所述肽包含SEQ ID NO:14-18之一的免疫原性片段，其中所述片段包含SEQ ID NO:14-18之一的至少8个连续氨基酸，包括SEQ ID NO:14的第327至400位、SEQ ID NO:15的第335至400位、SEQ ID NO:16的第533至549位、SEQ ID NO:17的第327至400位和SEQ ID NO:18的第335至400位的至少一个氨基酸，
其用于治疗和/或预防癌症，优选其中所述癌症是结直肠癌。
23.选择用于施用至患者的肽混合物、肽、核酸分子、载体、宿主细胞、T细胞混合物、T细胞、T细胞受体或药物组合物的方法，其包括：
i)确定癌症患者是否在TGFβR2蛋白、ASTE1蛋白、TAF1β蛋白、KIAA2018蛋白和SLC22A9蛋白中的一种或多种中存在移码突变，如果存在，
ii)选择权利要求1至11中任一项所定义的肽混合物、权利要求12或13所定义的多肽、权利要求14所定义的T细胞混合物、权利权利要求15所定义的T细胞、权利要求16所定义的T细胞受体或其抗原结合片段、权利要求17所定义的核酸分子、权利要求18所定义的载体、权利要求19所定义的宿主细胞，权利要求20所定义的药物组合物或权利要求21所定义的应用的肽。
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