JP4591983B2 - ペプチド - Google Patents
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Description
【０００１】
［発明の要旨］
本発明は、ペプチドがＴ細胞免疫を惹起する、遺伝子におけるフレームシフト変異から生じるタンパク質産物のフラグメントであるペプチド、および前述のペプチドを含む抗癌治療用の癌ワクチンおよび組成物に関する。
【０００２】
さらに、本発明は、前述の変異遺伝子に関連する癌と戦うために有用なＴ細胞免疫を惹起しうる、遺伝子におけるフレームシフト変異体から生じるタンパク質産物のフラグメントであるこのようなペプチドの同定法に関する。
【０００３】
本発明はまた、少なくとも１つのフレームシフト変異体ペプチドをコードするＤＮＡ配列、および少なくとも１つのフレームシフト変異ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む少なくとも１つの挿入部位を含むベクターに関する。
【０００４】
さらに、本発明は、少なくとも１つのフレームシフト変異体ペプチドまたは少なくとも１つのフレームシフト変異体ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む少なくとも１つの挿入部位を含む組換えウイルスベクター、または少なくとも１つのフレームシフト変異体ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む単離ＤＮＡ配列の投与により、遺伝子におけるフレームシフト変異に関連する癌の治療法または予防法に関する。
【０００５】
さらに、本発明は、身体自身の免疫系のＴ細胞アームの抗癌活性を活性化および強化するためのペプチドの使用に基づく抗癌治療または予防の開発を示す。
【０００６】
［背景技術］
腫瘍抗原の記述
Ｔ細胞限定抗原は、現在広範囲のタイプの癌において特徴づけられている。これらの抗原は、その発現によっていくつかの主要な群に分類することができる。２つの主要な群は、発生分化関連抗原（腫瘍精巣抗原、ＭＡＧＥ抗原およびＣＥＡなどの腫瘍胎児抗原）および組織特異的分化抗原（チロシナーゼ、ｇｐ１００など）からなる。真性の腫瘍特異的抗原を含む群は、それらをコードする遺伝子における変異によって変化するタンパク質を含む。これらのほとんどでは、変異は独特で、１つまたは少数の腫瘍で検出されている。これらの抗原のいくつかは、腫瘍形成の役割を果たしていると思われる。
【０００７】
癌ワクチンの記述
癌ワクチン開発において、１つの形態の癌（黒色腫など）または多種類の癌で高頻度で発現される抗原が注目されている。これについての１つの理由は、患者の臨床プロトコルへの使用が増加していることである。この分野は急速に進歩しており、ＮＣＩのＰＤＱデータベースに最近登録された癌ワクチンプロトコルを列挙した添付の表によって例示される。
【０００８】
遺伝性の癌／癌遺伝子試験
遺伝形態の癌は、集団において特定の頻度で起こる。これらの癌形態のいくつかでは、潜在的な遺伝子欠損がマッピングされている。これはまた、遺伝性癌の重要な群を構成するリンチ症候群癌における場合である。この症候群に罹患した家系では、親族にＤＮＡミスマッチ修復（ＭＭＲ）酵素をコードする欠損遺伝子を遺伝で受け継ぐ。このようなＭＭＲ欠損の担体は、結腸直腸癌（ＨＮＰＣＣ）および他の形態の癌（リスト？）を頻繁に発症する。ＭＭＲ酵素における変異は、他の癌関連遺伝子を検出できる方法と同じ方法の遺伝子試験を用いて検出することができる。
【０００９】
この場合の危険群の遺伝子試験は、予防的治療についての許容可能な形態が存在しないので、倫理的ジレンマを呈す。現在、治療の選択肢は癌を発症する危険性のある器官を除去する手術のみである。これらの患者において、有効なワクチンを開発することができたならば、癌ワクチンは非常に（興味深い）予防形態となるであろう。
【００１０】
ミスマッチＤＮＡの有効な修復を欠くために、１本鎖ＤＮＡにおける欠損および挿入が起こり、またこれは、反復単位（反復配列）を含むＤＮＡの伸長に置き易い。現在まで、非コードミクロサテライト遺伝子座の形成における反復配列が注目されている。実際、ミクロサテライトの不安定性は、ＭＭＲ欠損に起因する癌の目立つ特質である。本発明者らは、別のアプローチを行い、オンコジーンプロセスに関連するタンパク質をコードするＤＮＡ配列において生じるフレームシフト変異に注目した。このようなフレームシフト変異により、新規の終止コドンの出現場所で早期に終止する、タンパク質のＣ末端部分に全く新規のアミノ酸配列が生じることになる。この結果により、以下の２つの重要な結論を得た。
【００１１】
１）フレームシフトに起因する短縮タンパク質は、一般に、非機能的であり、ほとんどの場合、重要な細胞機能の「ノックアウト」が起こる。異常なタンパク質はまた、プラークの集合および形成能力などの新規の機能を得ることができる。両方の場合で、フレームシフトにより疾患が引き起された。
【００１２】
２）読み取り枠（「フレームシフト配列」）におけるシフトに起因する短い新規のＣ末端アミノ酸配列は、身体にとって外来物である。変異前には存在せず、変異を有する細胞（つまり、腫瘍細胞およびそれらの前悪性前駆体）中にのみ存在する。タンパク質の変異部分は、完全に新規であり、したがって、キャリアの免疫系に対して外来であるので、変異部分は、キャリアのレパートリーにおけるＴ細胞によって認識されることができる。これまでは、フレームシフト変異のこの局面については注目されておらず、腫瘍抗原としてのタンパク質のコード領域由来のフレームシフトペプチドの特徴づけについての報告は存在しない。従って、この概念は新規であり、これらの配列に基づいたワクチンの開発の基本を形成する。そのため、このようなワクチンはまた、ＭＭＲ整合に属する欠陥酵素を受け継いでいる患者に予防的に使用することができる。従って、このようなワクチンは、遺伝性形態の癌に対する治療手段の空白部分を埋めることになるであろう。
【００１３】
細胞内「自己」タンパク質における１つのアミノ酸置換によって、正常なペプチド由来のアミノ酸配列とは異なるペプチドからなる腫瘍拒絶抗原を生じる場合があることが示されている。腫瘍細胞表面の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子の環境においてこれらのペプチドを認識するＴ細胞は、腫瘍細胞を死滅させ、宿主由来の腫瘍を拒絶することができる。
【００１４】
自然の立体構造における遊離の抗原を典型的に認識し、抗原表面に暴露されたほとんどの如何なる部位をも潜在的にさらに認識するＢ細胞により産生される抗体とは対照的に、Ｔ細胞は、抗原が結合し、ＭＨＣ分子によって提示された場合のみ抗原を認識する。通常、この結合は、タンパク質のタンパク質分解性断片化を含む適切な抗原プロセシング後にのみ起こり、その結果、得られたペプチドフラグメントがＭＨＣ分子の溝に適合する。それにより、Ｔ細胞はまた、細胞内タンパク質由来のペプチドも認識することができる。従って、Ｔ細胞は、腫瘍細胞表面上のＭＨＣ分子の環境において任意の場所の腫瘍細胞由来の異常なペプチドを認識することができ、その後、異常なペプチドを保有する腫瘍細胞を排除するように活性化することができる。
【００１５】
「M.Barinaga」(Science、257、880〜881、1992）には、どのようにしてＭＨＣがペプチドに結合するのかについての短い総説が示されている。本発明の技術背景のより総括的な説明は、「Advanced Immunology」（D.Male et al、1987、J.B.lippincott Company、Philadelphia）に見出すことができる。両文献は、その全体において本明細書に組み込まれる。
【００１６】
ヒトにおけるＭＨＣ分子は、通常、ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）分子という。これは、ヒト第６染色体のＨＬＡ領域によってコードされる。
ＨＬＡ分子は、コードされる染色体領域および相互作用して主に活性化されるＴ細胞亜集団に応じて、２つの異なるクラスとして出現する。クラスＩ分子は、ＨＬＡ Ａ、ＢおよびＣ亜遺伝子座（subloci）によってコードされ、主に、ＣＤ８+細胞傷害性Ｔ細胞を活性化する。ＨＬＡクラスＩＩ分子は、ＤＲ、ＤＰおよびＤＱ亜遺伝子座によってコードされ、主にＣＤ４+Ｔ細胞、両ヘルパー細胞、および細胞傷害性細胞を活性化する。
【００１７】
通常、各個体は６種類のＨＬＡクラスＩ分子を有し、通常、３つの群Ａ、ＢおよびＣそれぞれから２つずつ有している。同様に、全ての個体は、ＨＬＡクラスＩＩ分子の個体自身の選択性を有し、さらに３つの群ＤＰ、ＤＱおよびＤＲそれぞれからの２つである。Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤＰ、ＤＱおよびＤＲ群は、それぞれさらにいくつかの亜群に分類される。異なるＨＬＡクラスＩ分子またはＨＬＡクラスＩＩ分子の数は、２つのＨＬＡ亜群の重複のために、減少する場合がある。
【００１８】
全ての遺伝子産物は、高度に多形性である。従って、個体が異なれば、個別のＨＬＡ分子が発現するが、この分子は他の個体のＨＬＡ分子とは異なる。これが、移植においてＨＬＡ適合器官を有するドナーを発見することの難しさの元となる。免疫生物学におけるＨＬＡ分子の遺伝的多様性の重要性は、免疫応答遺伝子としてのそれらの役割によって影響される。それらのペプチド結合能力により、特定のＨＬＡ分子の有無がペプチドエピトープに対する応答に対する個体の能力を支配する。結果として、ＨＬＡ分子は、疾患に対する抵抗性または感受性を決定する。
【００１９】
Ｔ細胞は、種々の機構によって癌の発症および成長を調節することができる。細胞傷害性Ｔ細胞、ＨＬＡクラスＩ拘束ＣＤ８+およびＨＬＡクラスＩＩ拘束ＣＤ４+は、適切な腫瘍抗原を保有する腫瘍細胞を直接死滅させることができる。ＣＤ４+ヘルパーＴ細胞は、細胞傷害性ＣＤ８+Ｔ細胞応答ならびに抗体応答、マクロファージおよびＬＡＫ細胞死滅の誘導に必要である。
【００２０】
ＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩ結合の双方に必要な要件は、通常、ペプチドが、様々なＨＬＡ群と亜群で異なる結合モチーフを含まなければならないということである。結合モチーフは、ＨＬＡ結合溝のポケットと厳密にはめ込まれるようにペプチドの限定的な位置で、特定の型のアミノ酸（例えば、巨大で、疎水性または正電荷の側鎖を保有するアミノ酸）に対する要件により特徴づけられる。この結果、結合溝内の８〜１０アミノ酸のペプチド長に制限されることを考えあわせると、ＨＬＡクラスＩ分子の１つの型へのペプチド結合は、別の型へも結合することはほとんど起こりそうにない。従って、例えば、クラスＩの種類に属するＨＬＡ−Ａ１およびＨＬＡ−Ａ２亜群のペプチド結合モチーフはＨＬＡ−Ａ１およびＨＬＡ−Ｂ１分子のモチーフと同じ程度に異なるのであろう。
【００２１】
同じ理由で、アミノ酸の同一の配列が異なるクラスＩＩ分子の結合溝に正確に位置する可能性は少ない。ＨＬＡクラスＩＩ分子の場合、ペプチドの結合配列は、より長くても良く、それらは通常１０〜１６アミノ酸を含むことが見出されており、そのいくつかは、一方または両方の末端で、ＨＬＡ溝の結合モチーフの一部ではない。
【００２２】
しかし、いくつかのＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩ分子の異なるペプチド結合モチーフの重複が起こり得る。少なくとも２つの異なるＨＬＡ分子の結合配列における重複を有するペプチドは、「ネスト化(nested)Ｔ細胞エピトープ」を含むといわれている。「ネスト化エピトープペプチド」に含まれる種々のエピトープは、抗原提示細胞によるペプチドのプロセシングによって形成され、その後異なるＨＬＡ分子に結合したＴ細胞に対して提示され得る。ヒトにおけるＨＬＡ分子の個体ごとの多様性は、ＨＬＡ分子の１つの型にのみ結合することができるペプチドよりも一般的なワクチンとして有用なネスト化エピトープを含むペプチドを作り出す。
【００２３】
個体への有効なワクチン接種は、患者のＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスＩＩ分子の少なくとも１つの型が全長でまたは患者自身の抗原提示細胞によってプロセシングされ切断されたかのいずれかのワクチンペプチドに結合することができる場合のみ達成することができる。
【００２４】
集団の大多数のための一般的なワクチンとしてのペプチドの有用性は、全長または抗原提示細胞によるプロセシング後のいずれかで結合することができる異なるＨＬＡ分子の数と共に増加する。
抗腫瘍ＣＤ４+および／またはＣＤ８+Ｔ細胞を産生するワクチンまたは抗癌剤として変異遺伝子によってコードされるタンパク質由来のペプチドの使用のために、目的の変異タンパク質を検索し、最終的に抗原提示細胞によるより短いペプチドに対するプロセシング後にＴ細胞を刺激することができるペプチドを同定することが必要である。
【００２５】
［先行技術］
本発明者らの国際出願ＰＣＴ／ＮＯ９２／０００３２（ＷＯ９２／１４７５６として公開）において、本発明者らは、プロトオンコジーンまたは腫瘍抑制遺伝子タンパク質と比較して点変異または転座を有するオンコジーンタンパク質産物の合成ペプチドおよびフラグメントを記載している。これらのペプチドは、癌細胞または他の抗原提示細胞によって提示されるプロセシングされたオンコジーンタンパク質フラグメントまたは腫瘍抑制遺伝子フラグメントに相当するか、それらを完全にカバーしているか、または、それらのフラグメントそのものであり、そして各個体における少なくとも１つの対立遺伝子によってＨＬＡ−ペプチド複合体として提示される。これらのペプチドはまた、プロセシングされＨＬＡ分子に提示された細胞によって産生された実際のオンコジーンタンパク質フラグメントに対して特異的なＴ細胞応答を誘導することも示されてきた。特に、本発明者らは、特定のアミノ酸位置（すなわち、１２位、１３位、および６１位）に点変異を有するｐ２１ｒａｓタンパク質由来のペプチドを記載した。これらのペプチドは、in vitroにおける癌細胞の増殖調節に有効であることが示されている。さらに、本ペプチドは、ワクチン接種または癌治療スキームにおけるこのようなペプチドの投与によって、変異ｐ２１ｒａｓオンコジーンタンパク質を保有する癌細胞に対して、ＣＤ４+Ｔ細胞免疫を惹起することが示された。その後、本発明者らは、これらのペプチドもまた、上記の投与によって変異ｐ２１ ｒａｓオンコジーンタンパク質を保有する癌細胞に対して、ＣＤ８+Ｔ細胞免疫を惹起することを示した。
【００２６】
しかし、上記のペプチドは、特定の癌（すなわち、プロトオンコジーンまたは腫瘍抑制遺伝子における点変異または転座を有するオンコジーンを含む癌）においてのみ有用である。従って、より一般的な範囲の癌に対して有効である抗癌治療またはワクチンが強く必要とされている。
【００２７】
一般に、腫瘍は、腫瘍細胞に見出された遺伝的変化に関して非常に不均一である。これは、癌ワクチンの潜在的な治療効果および予防強度は、ワクチンがＴ細胞免疫に惹起することができる標的数とともに増加することを意味する。複数の標的を有するワクチンはまた、原発性腫瘍由来の治療を回避する変異形による新規の腫瘍形成の危険性を減少させる。
【００２８】
［本発明によって解決される問題の定義］
癌に関連する変異を有する遺伝子を保有する腫瘍細胞および癌細胞に対して特異的Ｔ細胞応答および傷害性を引き起こす抗原性ペプチドに基づく新規の抗がん剤が必要とされつづけている。本発明は、複数の標的を有する抗癌ワクチン成分として癌と戦い予防するために使用することができる新規のペプチド供給に大いに貢献する。
【００２９】
本発明によって解決される別の問題は、遺伝性の癌の危険性の高い家系および群に属する個体に予防または治療を付与することができることである。遺伝性癌は、多くの場合、本発明において記載されているフレームシフト変異（すなわち、ミスマッチ修復遺伝子における変異）に感受性を有する遺伝子に関連する。今日、遺伝性癌を保有する危険性を診断することは可能であるが、癌の発症に対して適用可能な医薬的予防法は存在しない。
【００３０】
［発明の定義］
本発明の主要な目的は、Ｔ細胞を刺激するために使用することができる、癌細胞によって産生される変異タンパク質のペプチドフラグメントに対応するペプチドを得ることである。
【００３１】
本発明の別の主要な目的は、本発明のペプチドを用いて、in vivoまたはex vivoのいずれかで患者のＴ細胞を刺激することによって、患者に誘導することができるＴ細胞免疫に基づいた癌の治療法を開発することである。
【００３２】
本発明の第３の主要な目的は、変異遺伝子を保有する細胞に対して、細胞傷害性Ｔ細胞免疫を生じるＴ細胞を産生し活性化するために使用することができる、本発明のペプチドに対応するペプチドの全部または一部に基づいた、癌の確立を予防し、根絶させるワクチンを開発することである。
【００３３】
本発明の第４の主要な目的は、このような治療または予防の必要性から、本発明のすくなくとも１つのペプチドの投与を含む、ヒト個体に特異的に適用される抗癌治療または予防を設計することである。
本発明のこれらおよび他の目的は、添付の請求の範囲によって達成される。
【００３４】
フレームシフト変異によって早期の終止コドンが生じ、それによりタンパク質の大部分が欠失するので、一般に、フレームシフト変異を有するタンパク質は、免疫原性であると考えられており、従って免疫治療の標的であるとは考えられていなかった。このため、今回、腫瘍関連遺伝子におけるフレームシフト変異に起因する新規のペプチドの全ての群がこのようなフレームシフト変異を有する遺伝子を保有する癌細胞に対してＴ細胞応答を惹起するのに有用であることが見出されたことは驚くべきことである。
【００３５】
少なくとも５つの残基（例えば、８つのデオキシアデノシン塩基（ＡＡＡＡＡＡＡＡ））のモノヌクレオシド塩基反復配列または少なくとも４つのジヌクレオシド塩基単位（例えば、２つのデオキシアデノシン−デオキシシトシン単位（ＡＣＡＣ））のジヌクレオシド塩基反復配列を含む遺伝子は、フレームシフト変異に感受性を示す。フレームシフト変異は、それぞれ、反復配列における１つまたは２つのモノヌクレオシド塩基残基または１つまたは２つのジヌクレオシド塩基単位の挿入か、または反復配列における１つまたは２つのモノヌクレオシド塩基残基または１つまたは２つのジヌクレオシド塩基単位の欠失によって起こる。フレームシフト変換を有する遺伝子は、正常な遺伝子産物と比較して新規で全く異なるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする点変異に由来する。カルボキシル末端で新規のアミノ酸配列を有するこの変異タンパク質は、改変遺伝子を保有する全ての細胞に特異的である。
本明細書の残りの部分および本請求項では、フレームシフト変異ペプチドという名称は、このようなタンパク質およびそのペプチドフラグメントを含意する。
【００３６】
本発明によって、今回、ＨＬＡ分子の環境においてＴ細胞によって認識される腫瘍拒絶抗原を引き起こす癌細胞における遺伝子のフレームシフト変異から生じるこのような新規のタンパク質配列を見出した。
【００３７】
さらに、本発明によって、Ｔ細胞を産生するために使用することができる癌細胞の遺伝子におけるフレームシフト変異から生じる変異体タンパク質のフラグメントに対応するペプチドの群を見出した。従って、前記ペプチドはまた、上記のフレームシフト変異を有する遺伝子を保有する癌細胞に対して、Ｔ細胞活性化を惹起するために使用することができる。
これらのペプチドは、少なくとも８アミノ酸長であり、全長または抗原提示細胞によるプロセシング後のいずれかで、癌罹患ヒト患者における癌細胞によって産生される変異遺伝子産物またはそのフラグメントに相当する。
【００３８】
本発明のペプチドは、ａ）少なくとも８アミノ酸長であり、癌細胞遺伝子におけるフレームシフト変異体から生じる変異体タンパク質のフラグメントであることと、
ｂ）前記遺伝子によってコードされるタンパク質配列の変異体部分の少なくとも１つのアミノ酸からなることと、
ｃ）変異体配列のアミノ末端の前の正常な部分のタンパク質配列のカルボキシル末端由来の０〜１０個のアミノ酸を含み、前記遺伝子のフレームシフト変異によって産生する新規の終止コドンによって決定される変異体部分のタンパク質のカルボキシル末端にさらに伸長し得ることと、
ｄ）全長または抗原提示細胞によるプロセシング後のいずれかにおいて、Ｔ細胞応答を誘導することを特徴とする。
【００３９】
本発明のペプチドには、好ましくは、８〜２５、９〜２０、９〜１６、８〜１２または２０〜２５アミノ酸長が含まれる。これらには、例えば、９、１２、１３、１６、または２１アミノ酸を含むことができる。
本発明のペプチドは少なくとも９アミノ酸長（例えば、９〜１８アミノ酸長）であることが最も好ましいが、抗原提示細胞のプロセシング能力によって、より長いペプチドも本発明に大変に適している。従って、８個を超えるアミノ酸を含む場合、全アミノ酸配列を本発明のフレームシフト変異体ペプチドとして使用することができる。
【００４０】
さらに、本発明は、本発明の少なくとも１つのペプチドを、フレームシフト変異遺伝子によってコードされる変異体タンパク質に対するＴ細胞免疫を誘導するのに十分な量で、１回または複数回投与することからなる、遺伝子のフレームシフト変異に関連する癌の傾向がある患者のワクチン接種法に関する。
【００４１】
また、本発明は、少なくとも１つの本発明のペプチドを、癌細胞の遺伝子におけるフレームシフト変異から生じる変異タンパク質に対するＴ細胞免疫を誘導するのに十分な量で、１回または複数回投与することからなる、遺伝子のフレームシフト変異に関連する癌を罹患した患者の治療法に関する。
【００４２】
さらに、本発明によって、遺伝子におけるフレームシフト変異から生じるタンパク質フラグメントに相当する新規のペプチドの同定法が見出された。この方法は、１）少なくとも５つの残基のモノヌクレオシド塩基反復配列または少なくとも４つのジヌクレオシド塩基単位のジヌクレオシド塩基反復配列を有することによって、フレームシフト変異に感受性を有する癌細胞における遺伝子を同定するステップ、および
２）前記反復配列から１つのヌクレオシド塩基の残基または１つのジヌクレオシド塩基単位をそれぞれ取り除き、新規の終止コドンを含むまで、変化した遺伝子配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を同定するステップ、および／または
３）前記反復配列から２つのヌクレオシド塩基の残基または２つのジヌクレオシド塩基単位をそれぞれ取り除き、新規の終止コドンを含むまで、変化した遺伝子配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を同定するステップ、および／または
４）前記反復配列中の１つのヌクレオシド塩基の残基または１つのジヌクレオシド塩基単位をそれぞれ挿入し、新規の終止コドンを含むまで、変化した遺伝子配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を同定するステップ、および／または
５）前記反復配列中の２つのヌクレオシド塩基の残基または２つのジヌクレオシド塩基単位をそれぞれ挿入し、新規の終止コドンを含むまで、変化した遺伝子配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を同定するステップによって特徴づけられる。
【００４３】
従って、同定したペプチドが癌の治療または予防のための本発明の組成物および方法に使用可能であるかどうかを決定するために、
６）新規のペプチドが、全長または該ペプチドのより短いフラグメントのいずれかでＴ細胞を刺激することができるかどうかを決定するステップをさらに行うべきである。
必要に応じて、さらに
７）異なる主要ＨＬＡクラスＩ分子および／またはＨＬＡクラスＩＩ分子のネスト化エピトープを含むペプチドを決定するステップ
を追加することができる。
【００４４】
［発明の詳細な説明］
本明細書および請求項において、アミノ酸を、当該分野で既知の１文字記号で示す。
本発明のペプチドは、２つの異なる実施形態によって明示的に例示されるはずであり、癌は、特定の遺伝子（すなわち、ＢＡＸ遺伝子およびＴＧＦβＲＩＩ遺伝子）におけるフレームシフト変異に基づいて発症する。
【００４５】
Ｉ）ＢＡＸ遺伝子
ＢＡＸ遺伝子はアポトーシスの促進による細胞の生存または細胞死の調節に関与することが確認されている。ヒトＢＡＸ遺伝子には、コドン３８〜４１（ＡＴＧ ＧＧＧ ＧＧＧ ＧＡＧ）にわたる第３のエクソンにおける８つのデオキシグアノシン塩基（Ｇ８）の反復配列が含まれる。
【００４６】
このＧ８反復におけるフレームシフト変異（結腸癌細胞および前立腺細胞癌におけるＧ７（ＡＴＧ ＧＧＧ ＧＧＧ ＡＧＧ）およびＧ９（ＡＴＧ ＧＧＧ ＧＧＧ ＧＧＡ）反復が観察されている。これは、試験された症例の５０％以上で発生する（Rampino,N.et al.「Somatic frameshift mutations in the BAX gene in colon cancers of the microsatellite mutator phenotype（マイクロサテライト変異誘発遺伝子表現型の結腸癌におけるＢＡＸ遺伝子の体細胞性フレームシフト変異）」（Science、Washington DC、275、967〜969、1997））。改変ＢＡＸ遺伝子産物は、アポトーシスを促進することができず、従って更なる腫瘍の進行が可能になる。さらに、改変遺伝子産物は癌細胞にのみ見出されるので、特異的免疫治療の標的となる。
【００４７】
本発明によれば、ＢＡＸ遺伝子のフレームシフト変異から生じる形質転換ＢＡＸタンパク質産物に相当するペプチドは、改変ＢＡＸ遺伝子に関連する癌を罹患した患者の癌細胞に対して、免疫系（Ｔ細胞）の細胞性の武器の引き金を引く機能を有する抗癌治療剤またはワクチンとして使用することができる。
【００４８】
ＢＡＸ遺伝子のフレームシフト変異によって、正常なＢＡＸタンパク質と比較して、４１位で変化した配列の第１のアミノ酸を有する変異体ペプチド配列が生じる（表１、配列番号１〜配列番号４）。
【００４９】
表１
アミノ酸位置 41 51 61 71
正常 bax ペプチド ; EAPELALDPV PQDASTKKLS ECLKRIGDEL
DS...
配列番号 1(bax-1G); RHPSWPWTRC LRMRPPRS
配列番号 4(bax+2G); GRHPSWPWTR CLRMRPPRS
配列番号 2(bax-2G); GTRAGPGPGA SGCVHQEAER VSQAHRGRTG Q
配列番号 3(bax+1G); GGTRAGPGPG ASGCVHQEAE RVSQAHRGRT GQ
【００５０】
表２は、本発明によるペプチドの１つの群を示す。
表２
配列番号 5: IQDRAGRMGGRHPSWPWTRCLRMRPPRS
配列番号 6: IQDRAGRMGGGRHPSWPWT
配列番号 7: IQDRAGRMGGGGTRAGPGPGASGCVHQEAERVSQAHRGRTGQ
配列番号 8: IQDRAGRMGGGTRAGPGPG
【００５１】
表３に列挙したペプチドは、変異体ＢＡＸペプチドを認識するＴ細胞のin vitro産生に使用した。
表３
配列番号 1: RHPSWPWTRCLRMRPPRS
配列番号 9: IQDRAGRMGGRHPSWPWTRCLR
配列番号 6: IQDRAGRMGGGRHPSWPWT
配列番号10: ASGCVHQEAERVSQAHRGRTGQ
配列番号11: GGTRAGPGPGASGCVHQEAERV
配列番号12: IQDRAGRMGGGGTRAGPGPGAS
配列番号 8: IQDRAGRMGGGTRAGPGPG
【００５２】
本発明のこの実施形態による最も好ましいペプチドを、表４に列挙する。
表４
配列番号 1: RHPSWPWTRCLRMRPPRS
配列番号 2: GTRAGPGPGASGCVHQEAERVSQAHRGRTGQ
配列番号 3: GGTRAGPGPGASGCVHQEAERVSQAHRGRTGQ
配列番号 4: GRHPSWPWTRCLRMRPPRS
配列番号 5: IQDRAGRMGGRHPSWPWTRCLRMRPPRS
配列番号 6: IQDRAGRMGGGRHPSWPWT
配列番号 7: IQDRAGRMGGGGTRAGPGPGASGCVHQEAERVSQAHRGRTGQ
配列番号 8: IQDRAGRMGGGTRAGPGPG
配列番号 9: IQDRAGRMGGRHPSWPWTRCLR
配列番号10: ASGCVHQEAERVSQAHRGRTGQ
配列番号11: GGTRAGPGPGASGCVHQEAERV
配列番号12: IQDRAGRMGGGGTRAGPGPGAS
【００５３】
２）ＴＧＦβＲＩＩ
ＴＧＦβＲＩＩ遺伝子は細胞増殖の調節に関与していることが確認されている。ＴＧＦβＲＩＩは、細胞増殖の下方制御するＴＧＦβのレセプターである。ＴＧＦβＲＩＩをコードするヒト遺伝子には、塩基番号７０９〜塩基番号７１８（ＧＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＧ ＣＣＴ）の１０個のデオキシアデノシン塩基（Ａ１０）の反復配列が含まれる。結腸癌および膵臓癌において、このＡ１０反復におけるフレームシフト変異（Ａ９（ＧＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＧＣ ＣＴ）およびＡ１１（ＧＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＧＣＣ）反復が見出されており、試験された症例の約８０％で発生する（Yamamoto,H.「Somatic frameshift mutations in DNA mismatch repair and proapoptosis genes in hereditary nonpolyposis colorectal cancer（ＤＮＡミスマッチ修復における体細胞性フレームシフト変異および遺伝性非ポリープ性結腸直腸癌における前アポトーシス遺伝子）」、Cancer Research、58、997〜1003、March 1、1998）。改変ＴＧＦβＲＩＩ遺伝子産物は、ＴＧＦβに結合することができず、細胞増殖の下方制御のシグナルが除去されており、従って、更なる腫瘍の進行が可能になる。さらに、改変遺伝子産物は癌細胞にのみ見出されるので、免疫治療の標的となる。
【００５４】
その結果、ＴＧＦβＲＩＩ遺伝子のフレームシフト変異から生じる形質転換ＴＧＦβＲＩＩタンパク質産物に相当するペプチドは、改変ＴＧＦβＲＩＩ遺伝子に関連する癌を罹患した患者の癌細胞に対して、免疫系（Ｔ細胞）の細胞性の武器の引き金を引く機能を有する抗癌治療剤またはワクチンとして使用することができる。
【００５５】
ＴＧＦβＲＩＩ遺伝子のフレームシフト変異によって、正常なＴＧＦβＲＩＩタンパク質と比較して、１３３位で変化した配列（１塩基および２塩基欠失）または１３４位で変化した配列（１塩基および２塩基挿入）の第１のアミノ酸を有する変異体ペプチド配列が生じる（表５、配列番号１３および配列番号２１）。
表５
アミノ酸位置 133
正常 TGFβRII ; K PGETFFMCSC SSDECNDNII FSEEYNTSNP
DLLL
配列番号13(-1A); S LVRLSSCVPV ALMSAMTTSS SQKNITPAIL TCC
配列番号13(+2A); SLVRLSSCVP VALMSAMTTS SSQKNITPAI
LTCC
TGFbRII + 1A) ; AW
TGFbRII - 2A) ; A W
【００５６】
表６は、本発明のペプチドの１つの群を示す。
表６
配列番号14:SPKCIMKEKKSLVRLSSCVPVALMSAMTTSSSQKNITPAILTCC
配列番号15:PKCIMKEKKKSLVRLSSCV
配列番号19:SPKCIMKEKKAW
配列番号20:PKCIMKEKKKAW
【００５７】
表７は、変異体ＴＧＦβＲＩＩペプチドを認識するＴ細胞のin vitro産生に使用したペプチドを示す。
表７
配列番号 15: PKCIMKEKKKSLVRLSSCV
配列番号 16: ALMSAMTTSSSQKNITPAILTCC
配列番号 17: SLVRLSSCVPVALMSAMTTSSSQ
配列番号 18: SPKCIMKEKKSLVRLSSCVPVA
配列番号 19: SPKCIMKEKKAW
配列番号 20: PKCIMKEKKKAW
配列番号 21: AMTTSSSQKNITPAILTCC
配列番号428: SLVRLSSCV
【００５８】
本発明の本実施形態の最も好ましいペプチドを、以下に示す。
表８
配列番号 13:SLVRLSSCVPVALMSAMTTSSSQKNITPAILTCC
配列番号 14:SPKCIMKEKKSLVRLSSCVPVALMSAMTTSSSQKNITPAILTCC
配列番号 15:PKCIMKEKKKSLVRLSSCV
配列番号 16:ALMSAMTTSSSQKNITPAILTCC
配列番号 17:SLVRLSSCVPVALMSAMTTSSSQ
配列番号 18:SPKCIMKEKKSLVRLSSCVPVA
配列番号 19:SPKCIMKEKKAW
配列番号 20:PKCIMKEKKKAW
配列番号 21:AMTTSSSQKNITPAILTCC
配列番号428:SLVRLSSCV
【００５９】
本発明の他のペプチドは、上記の表１〜表８に列挙したペプチドのフラグメントであり得る。このようなフラグメントは、９〜１６アミノ酸長であることが最も好ましく、タンパク質の変異体部分由来の少なくとも１つのアミノ酸を含む。
本明細書中および請求項で使用される用語「フラグメント」は、より長いペプチドまたはタンパク質のより短い部分を示すことが意図されている。
ヌクレオシド塩基の反復配列を含み、それによりフレームシフト変異に感受性を示し、その結果、本発明のペプチドの潜在的な候補である他の癌関連遺伝子（表９の配列番号は、各場合において、括弧内に示す）を以下に示す。
【００６０】
ヒトＴＧＦβ２（ｈＴＧＦβ２）遺伝子（配列番号２２〜配列番号２９）、
結腸直腸癌欠失（ＤＣＣ）遺伝子（配列番号３０〜配列番号３４）、
ヒト乳卵巣癌感受性（ＢＲＣＡ１）遺伝子（配列番号３７８〜配列番号３８７）、
ヒト乳癌感受性（ＢＲＣＡ２）遺伝子（配列番号３５〜配列番号９４）、
ヒトタンパク質チロシンホスファターゼ（ｈＰＴＰ）遺伝子（配列番号９５〜配列番号１０２）、
ヒトＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ（ｔｏｐ２）遺伝子（配列番号１０３〜配列番号１０８）
ヒトキナーゼ（ＴＴＫ）遺伝子（配列番号１０９〜配列番号１２０）
ヒト転写抑制（ＣＴＣＦ）遺伝子（配列番号１２１〜配列番号１２７）、
ヒトＦＡＤＤ−相同性ＩＣＥ／ＣＥＤ−３様プロテアーゼ遺伝子（配列番号１２８〜配列番号１３３）、
ヒト推定ミスマッチ修復／結合タンパク質（ｈＭＳＨ３）遺伝子（配列番号１３４〜配列番号１４７）、
ヒト網膜芽細胞腫結合タンパク質１アイソフォームＩ（ｈＲＢＰ１）遺伝子（配列番号１４８〜配列番号１５８）、
ヒトＦＭＲ１（ｈＦＭＲ１）遺伝子（配列番号１５７〜配列番号１６１）、
ヒトＴＩＮＵＲ遺伝子（配列番号１６２〜１６９）
ｂ−ｒａｆオンコジーン（配列番号１７０〜配列番号１７５）、
ヒトニューロフィブロミン（ＮＦ１）遺伝子（配列番号１７６〜配列番号１８１）、
【００６１】
ヒト生殖系列ｎ−ｍｙｃ遺伝子（配列番号１８２〜配列番号１８８）、
ヒトｎ−ｍｙｃ遺伝子（配列番号１８９〜配列番号１９４）、
ヒトｒａｓ抑制遺伝子（配列番号１９５〜配列番号１９９）、
ヒトｈＭＳＨ６遺伝子（配列番号２００〜配列番号２０３および配列番号２９３〜配列番号２９７）、
ヒト上咽頭癌ＥＢＶ ＢＮＬＦ−１遺伝子（配列番号２０４〜配列番号２１０）、
ヒト細胞周期調節タンパク質（Ｅ１Ａ結合タンパク質）ｐ３００遺伝子（配列番号２１１〜配列番号２１８）、
ヒトＢ細胞リンパ種３コードタンパク質（ｂｃｌ−３）遺伝子（配列番号２１９〜配列番号２２６）、
ヒト形質転換成長因子−β誘導遺伝子産物（ＢＩＧＨ３）（配列番号２２７〜配列番号２３２）、
ヒト転写因子ＥＴＶ１遺伝子（配列番号２３３〜配列番号２３９）、
ヒトインシュリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ４）遺伝子（配列番号２４０〜配列番号２４６）、
ヒトＭＵＣ１遺伝子（配列番号２４７〜配列番号２６６）、
ヒトタンパク質−チロシンキナーゼ（ＪＡＫ１）遺伝子（配列番号２６７〜配列番号２７１）、
ヒトタンパク質−チロシンキナーゼ（ＪＡＫ３）遺伝子（配列番号２７２〜配列番号２７９）、
（膜貫通チロシナーゼキナーゼの）ヒトＦｌｔ４遺伝子（配列番号２８０〜配列番号２８４）、
ヒトｐ５３関連遺伝子（配列番号２８５〜配列番号２９２）、
ヒトｃａｎ（ｈＣＡＮ）遺伝子（配列番号２９８〜配列番号３００）、
ヒトＤＢＬ（ｈＤＢＬ）プロトオンコジーン／ヒトＭＣＦ２ＰＯ（ｈＭＣＦ２ＰＯ）遺伝子（配列番号３０１〜配列番号３０６）、
ヒトｄｅｋ（ｈＤＥＫ）遺伝子（配列番号３０７〜配列番号３０９）、
ヒト網膜芽細胞腫関連タンパク質（ｐ１０７）遺伝子（配列番号３１０〜配列番号３１３）、
【００６２】
ヒトＧタンパク質結合レセプター（ｈＧＰＲ１）遺伝子（配列番号３１４〜配列番号３１９）、
ヒト推定ＲＮＡ結合タンパク質（ｈＲＢＰ５６）遺伝子（配列番号３２０〜配列番号３２５）、
ヒト転写因子（ｈＩＴＦ−２）遺伝子（配列番号３２６〜配列番号３２７）、
ヒト悪性黒色腫転移抑制（ｈＫｉＳＳ−１）遺伝子（配列番号３２８〜配列番号３３４）、
ヒトテロメラーゼ関連タンパク質ＴＰ−１（ｈＴＰ−１）遺伝子（配列番号３３５〜配列番号３４８）、
ヒトＦＤＦ−５（ｈＦＤＦ−５）遺伝子（配列番号３４９〜配列番号３５６）、
ヒト転移関連ｍｔａ１（ｈＭＴＡ１）遺伝子（配列番号３５７〜配列番号３６２）、
ヒト転写因子ＴＦＩＩＢの９０ｋＤａサブユニット（ｈＴＦＢＩＩＢ９０）遺伝子（配列番号３６３〜配列番号３６９）、
ヒト腫瘍抑制（ｈＬＵＣＡ−１）遺伝子（配列番号３７０〜配列番号３７７）、
ヒトウィルムス腫瘍（ＷＩＴ−１）関連タンパク質（配列番号３８８〜配列番号３９３）、
ヒトシステインプロテアーゼ（ＩＣＥｒｅｌ−ＩＩＩ）遺伝子（配列番号３９４〜配列番号３９８および配列番号４５９）、
ヒトＦａｓリガンド（ＦａｓＬ）遺伝子（配列番号３９９〜配列番号４０３）、
ヒトＢＲＣＡ１関連ＲＩＮＧドメインタンパク質（ＢＡＲＤ１）遺伝子（配列番号４０４〜配列番号４１７）、
ヒトｍｃｆ．２（ｈＭＣＦ．２）遺伝子（配列番号４１８〜配列番号４２２）、
ヒトＦａｓ抗原（ｆａｓ）遺伝子（配列番号４２３〜配列番号４２７）、
ヒトＤＰＣ４遺伝子（配列番号４２９〜配列番号４３７）。
【００６３】
本発明に関するこれらの遺伝子のフレームシフト変異の結果である変異体ペプチドを、表９に列挙する。
【００６４】
表９
配列番号 22; TVGRPHISC
配列番号 23; KTVGRPHISC
配列番号 24; KQWEDPTSPANVIALLQT
配列番号 25; QWEDPTSPANVIALLQT
配列番号 26; QKTIKSTRKKTVGRPHISC
配列番号 27; QKTIKSTRKKKTVGRPHISC
配列番号 28; QKTIKSTRKKKQWEDPTSPANVIALLQT
配列番号 29; QKTIKSTRKKQWEDPTSPANVIALLQT
配列番号 30; AADLQQQFVHFLDCWDVSSIPFTLHLPQAQDITT
配列番号 31; GKDAKEKSS
配列番号 32; GKDAKEKKSS
配列番号 33; GKDAKEKKAADLQQQFVHFLDCWDVSSIPFTLHLPQAQDITT
配列番号 34; GKDAKEKAADLQQQFVHFLDCWDVSSIPFTLHLPQAQDITT
配列番号 35; FSMKQTLMNVKNLKTK
配列番号 36; KFSMKQTLMNVKNLKTK
配列番号 37; VRTSKTRKKFSMKQTLMNVKNLKTK
配列番号 38; VRTSKTRKKKFSMKQTLMNVKNLKTK
配列番号 39; VRTSKTRKKNFP
配列番号 40; VRTSKTRKNFP
配列番号 41; IKKKLLQFQK
配列番号 42; KIKKKLLQFQK
配列番号 43; KSRRNYFNFKNNCQSRL
配列番号 44; SRRNYFNFKNNCQSRL
配列番号 45; TNLRVIQKIKKKLLQFQK
配列番号 46; TNLRVIQKKIKKKLLQFQK
配列番号 47; TNLRVIQKKSRRNYFNFKNNCQSRL
配列番号 48; TNLRVIQKSRRNYFNFKNNCQSRL
配列番号 49; KIMIT
配列番号 50; NIDKIPEKIMIT
配列番号 51; NIDKIPEKKIMIT
配列番号 52; IINAN
配列番号 53; KIINAN
配列番号 54; NDKTVSEKIINAN
配列番号 55; NDKTVSEKKIINAN
配列番号 56; NGLEKEYLMVNQKE
配列番号 57; SQTSLLEAKNGLEKEYLMVNQKE
配列番号 58; SQTSLLEAKKNGLEKEYLMVNQKE
配列番号 59; SQTSLLEAKKMA
配列番号 60; SQTSLLEAKMA
配列番号 61; TLVFPK
配列番号 62; KTLVFPK
配列番号 63; LKNVEDQKTLVFPK
配列番号 64; LKNVEDQKKTLVFPK
配列番号 65; LKNVEDQKKH
配列番号 66; LKNVEDQKH
配列番号 67; KKIQLY
配列番号 68; KKKIQLY
配列番号 69; RKRFSYTEYLASIIRFIFSVNRRKEIQNLSSCNFKI
配列番号 70; LRIVSYSKKKKIQLY
【００６５】
配列番号 71; LRIVSYSKKKKKIQLY
配列番号 72; LRIVSYSKKRKRFSYTEYLASIIRFIFSVNRRKEIQNLS-
-SCNFKI
配列番号 73; LRIVSYSKRKRFSYTEYLASIIRFIFSVNRRKEIQNLS-
-SCNFKI
配列番号 74; QDLPLSSICQTIVTIYWQ
配列番号 75; KQDLPLSSICQTIVTIYWQ
配列番号 76; NRTCPFRLFVRRMLQFTGNKVLDRP
配列番号 77; GFVVSVVKKQDLPLSSICQTIVTIYWQ
配列番号 78; GFVVSVVKKKQDLPLSSICQTIVTIYWQ
配列番号 79; GFVVSVVKKNRTCPFRLFVRRMLQFTGNKVLDRP
配列番号 80; GFVVSVVKNRTCPFRLFVRRMLQFTGNKVLDRP
配列番号 81; YRKTKNQN
配列番号 82; KYRKTKNQN
配列番号 83; NTERPKIRTN
配列番号 84; DETFYKGKKYRKTKNQN
配列番号 85; DETFYKGKKKYRKTKNQN
配列番号 86; DETFYKGKKNTERPKIRTN
配列番号 87; DETFYKGKNTERPKIRTN
配列番号 88; LSINNYRFQMKFYFRFTSHGSPFTSANF
配列番号 89; KLSINNYRFQMKFYFRFTSHGSPFTSANF
配列番号 90; NSVSTTTGFR
配列番号 91; NIQLAATKKLSINNYRFQMKFYFRFTSHGSPFTSANF
配列番号 92; NIQLAATKKKLSINNYRFQMKFYFRFTSHGSPFTSANF
配列番号 93; NIQLAATKKNSVSTTTGFR
配列番号 94; NIQLAATKNSVSTTTGFR
配列番号 95; MEHVAPGRMSASPQSPTQ
配列番号 96; KMEHVAPGRMSASPQSPTQ
配列番号 97; KWSTWLQAECQHLHSPQRSDKPQQAGLDQQHHCFALDS-
-SPGPRPVFLQLLGLMGQGRHD
配列番号 98; WSTWLQAECQHLHSPQRSDKPQQAGLDQQHHCFALDS-
-SPGPRPVFLQLLGLMGQGRHD
配列番号 99; TFSVWAEKMEHVAPGRMSASPQSPTQ
配列番号100; TFSVWAEKKMEHVAPGRMSASPQSPTQ
配列番号101; TFSVWAEKKWSTWLQAECQHLHSPQRSDKPQQAGLDQ-
-QHHCFALDSSPGPRPVFLQLLGLMGQGRHD
配列番号102; TFSVWAEKWSTWLQAECQHLHSPQRSDKPQQAGLDQ-
-QHHCFALDSSPGPRPVFLQLLGLMGQGRHD
配列番号103; HKWLKFCLLRLVKESFHE
配列番号104; KHKWLKFCLLRLVKESFHE
配列番号105; KGGKAKGKKHKWLKFCLLRLVKESFHE
配列番号106; KGGKAKGKKKHKWLKFCLLRLVKESFHE
配列番号107; KGGKAKGKKNTNG
配列番号108; KGGKAKGKNTNG
配列番号109; VNNFFKKL
配列番号110; KVNNFFKKL
配列番号111; LSQGNVKKVNNFFKKL
配列番号112; LSQGNVKKKVNNFFKKL
配列番号113; GEKNDLQLFVMSDRRYKIYWTVILLNPCGNLHLKTTSL
配列番号114; KGEKNDLQLFVMSDRRYKIYWTVILLNPCGNLHLKTTSL
配列番号115; KGKKMICSYS
配列番号116; GKKMICSYS
配列番号117; SSKTFEKKGEKNDLQLFVMSDRRYKIYWTVILLNPCGN-
-LHLKTTSL
配列番号118; SSKTFEKKKGEKNDLQLFVMSDRRYKIYWTVILLNPCGN-
-LHLKTTSL
配列番号119; SSKTFEKKKGKKMICSYS
配列番号120; SSKTFEKKGKKMICSYS
【００６６】
配列番号121; QRKPKRANCVIQRRAKM
配列番号122; KQRKPKRANCVIQRRAKM
配列番号123; NKENQKEQTALLYRGGQRCRCVCLRF
配列番号123; NKENQKEQTALLYRGGQRCRCVCLRF
配列番号124; PDYQPPAKKQRKPKRANCVIQRRAKM
配列番号125; PDYQPPAKKKQRKPKRANCVIQRRAKM
配列番号126; PDYQPPAKKNKENQKEQTALLYRGGQRCRCVCLRF
配列番号127; PDYQPPAKNKENQKEQTALLYRGGQRCRCVCLRF
配列番号128; NLSSLLI
配列番号129; TCLPF
配列番号130; QPTFTLRKNLSSLLI
配列番号131; QPTFTLRKKNLSSLLI
配列番号132; QPTFTLRKKTCLPF
配列番号133; QPTFTLRKTCLPF
配列番号134; RATFLLSLWECSLPQARLCLIVSRTGLLVQS
配列番号135; GQHFYWHCGSAACHRRGCV
配列番号136; KENVRDKKRATFLLSLWECSLPQARLCLIVSRTGLLVQS
配列番号137; KENVRDKKKRATFLLSLWECSLPQARLCLIVSRTGLLVQS
配列番号138; KENVRDKKKGQHFYWHCGSAACHRRGCV
配列番号139; KENVRDKKGQHFYWHCGSAACHRRGCV
配列番号140; ITHTRWGITTWDSWSVRMKANWIQAQQNKSLILSPSFTK
配列番号141; KITHTRWGITTWDSWSVRMKANWIQAQQNKSLILSPSFTK
配列番号142; KLLTPGGELPHGILGQ
配列番号143; LLTPGGELPHGILGQ
配列番号144; PPVCELEKITHTRWGITTWDSWSVRMKANWIQAQQNKS-
-LILSPSFTK
配列番号145; PPVCELEKKITHTRWGITTWDSWSVRMKANWIQAQQNKS-
-LILSPSFTK
配列番号146; PPVCELEKKLLTPGGELPHGILGQ
配列番号147; PPVCELEKLLTPGGELPHGILGQ
配列番号148; SLKDELEKMKI
配列番号149; SLKDELEKKMKI
配列番号150; LGQSSPEKKNKN
配列番号151; LGQSSPEKNKN
配列番号152; RLRRINGRGSQIRSRNAFNRSEE
配列番号153; EPKVKEEKKT
配列番号154; EPKVKEEKKKT
配列番号155; EPKVKEEKKRLRRINGRGSQIRSRNAFNRSEE
配列番号156; EPKVKEEKRLRRINGRGSQIRSRNAFNRSEE
配列番号157; TFRYKGKQHPFFST
配列番号158; GPNAPEEKNH
配列番号159; GPNAPEEKKNH
配列番号160; GPNAPEEKKTFRYKGKQHPFFST
配列番号161; GPNAPEEKTFRYKGKQHPFFST
配列番号162; MQNTCV
配列番号163; KMQNTCV
配列番号164; KCKIRVFSK
配列番号165; CKIRVFSK
配列番号166; FFKRTVQKMQNTCV
配列番号167; FFKRTVQKKMQNTCV
配列番号168; FFKRTVQKKCKIRVFSK
配列番号169; FFKRTVQKCKIRVFSK
配列番号170; LPHYLAH
【００６７】
配列番号171; CLITWLTN
配列番号172; GSTTGLSATPLPHYLAH
配列番号173; GSTTGLSATPPLPHYLAH
配列番号174; GSTTGLSATPPCLITWLTN
配列番号175; GSTTGLSATPCLITWLTN
配列番号176; RFADKPRPN
配列番号177; DLPTSPDQTRSGPVHVSVEP
配列番号178; DSAAGCSGTPRFADKPRPN
配列番号179; DSAAGCSGTPPRFADKPRPN
配列番号180; DSAAGCSGTPPDLPTSPDQTRSGPVHVSVEP
配列番号181; DSAAGCSGTPDLPTSPDQTRSGPVHVSVEP
配列番号182; AHPETPAQNRLRIPCSRREVRSRACKPPGAQGSDER-
-RGKASPGRDCDVRTGRP
配列番号183; PAHPETPAQNRLRIPCSRREVRSRACKPPGAQGSDER-
-RGKASPGRDCDVRTGRP
配列番号184; RPTRRHPRRIASGSPAVGGR
配列番号185; VAIRGHPRPPAHPETPAQNRLRIPCSRREVRSRACKP-
-PGAQGSDERRGKASPGRDCDVRTGRP
配列番号186; VAIRGHPRPPPAHPETPAQNRLRIPCSRREVRSRACKP-
-PGAQGSDERRGKASPGRDCDVRTGRP
配列番号187; VAIRGHPRPPRPTRRHPRRIASGSPAVGGR
配列番号188; VAIRGHPRPRPTRRHPRRIASGSPAVGGR
配列番号189; RGRTSGRSLSCCRRPRCRPAVASRSTAPSPRAGSR-
-RCCLRTSCGAARPRRTRSACGDWVASPPTRSS-
-SRTACGAASPPARSWSAP
配列番号190; GGGHLEEV
配列番号191; YFGGPDSTPRGRTSGRSLSCCRRPRCRPAVASR-
-STAPSPRAGSRRCCLRTSCGAARPRRTRSACGD-
-WVASPPTRSSSRTACGAASPPARSWSAP
配列番号192; YFGGPDSTPPRGRTSGRSLSCCRRPRCRPAVASR-
-STAPSPRAGSRRCCLRTSCGAARPRRTRSACGDW-
-VASPPTRSSSRTACGAASPPARSWSAP
配列番号193; YFGGPDSTPPGGGHLEEV
配列番号194; YFGGPDSTPGGGHLEEV
配列番号195; HRVADP
配列番号196; LSQSSELDPPSSR
配列番号197; LSQSSELDPPPSSR
配列番号198; LSQSSELDPPHRVADP
配列番号199; LSQSSELDPHRVADP
配列番号200; VILLPEDTPPS
配列番号201; VILLPEDTPPPS
配列番号202; VILLPEDTPPLLRA
配列番号203; VILLPELDPLLRA
配列番号204; PSPLP
配列番号205; PLLFHRPCSPSPALGATVLAVYRYE
配列番号206; LLFHRPCSPSPALGATVLAVYRYE
配列番号207; APRPPLGPPSPLP
配列番号208; APRPPLGPPPSPLP
配列番号209; APRPPLGPPPLLFHRPCSPSPALGATVLAVYRYE
配列番号210; APRPPLGPPLLFHRPCSPSPALGATVLAVYRYE
配列番号211; TQVLPQGCSLSLLHTTFPHRQVPHILDW
配列番号212; PTQVLPQGCSLSLLHTTFPHRQVPHILDW
配列番号213; PLQSFPKDAASAFSTPRFPTDKFPTSWTGSCPGQPHGT-
-RAFCQPGPEFNAFSAC
配列番号214; LQSFPKDAASAFSTPRFPTDKFPTSWTGSCPGQPHGT-
-RAFCQPGPEFNAFSAC
配列番号215; PSPRPQSQPPTQVLPQGCSLSLLHTTFPHRQVPHILDW
配列番号216; PSPRPQSQPPPTQVLPQGCSLSLLHTTFPHRQVPHILDW
配列番号217; PSPRPQSQPPPLQSFPKDAASAFSTPRFPTDKFPTS-
-WTGSCPGQPHGTRAFCQPGPEFNAFSAC
配列番号218; PSPRPQSQPPLQSFPKDAASAFSTPRFPTDKFPTS-
-WTGSCPGQPHGTRAFCQPGPEFNAFSAC
配列番号219; TAWPGRRRFTTPEPYCLCTPLGPWAPRFLW
配列番号220; PTAWPGRRRFTTPEPYCLCTPLGPWAPRFLW
【００６８】
配列番号221; PRPGPAGGALLPRSLTAFVPHSGHGLPVSSGEPAYTPIP-
-HDVPHGTPPFC
配列番号222; RPGPAGGALLPRSLTAFVPHSGHGLPVSSGEPAYTPIPH-
-DVPHGTPPFC
配列番号223; DLPAVPGPPTAWPGRRRFTTPEPYCLCTPLGPWAPRFLW
配列番号224; DLPAVPGPPPTAWPGRRRFTTPEPYCLCTPLGPWAPRFLW
配列番号225; DLPAVPGPPPRPGPAGGALLPRSLTAFVPHSGHGLPVSSG-
-EPAYTPIPHDVPHGTPPFC
配列番号226; DLPAVPGPPRPGPAGGALLPRSLTAFVPHSGHGLPVSSG-
-EPAYTPIPHDVPHGTPPFC
配列番号227; QWGLSWMS
配列番号228; NGDCHGCPEGRQSL
配列番号229; FTMDRVLTPQWGLSWMS
配列番号230; FTMDRVLTPPQWGLSWMS
配列番号231; FTMDRVLTPPNGDCHGCPEGRQSL
配列番号232; FTMDRVLTPNGDCHGCPEGRQSL
配列番号233; HHPARQCPHCIMHLQTQLIHRNLTGPSQLTSLHRS-
-PYQIAATPWTTDFAASFFLNPVTPFLLCRRCQGKDV-
-LCTNARCLSQTSPSHHKALSRTTTQCMNT-
-TPWLAVRPAKAFPLL
配列番号234; PHHPARQCPHCIMHLQTQLIHRNLTGPSQLTSLHRS-
-PYQIAATPWTTDFAASFFLNPVTPFLLCRRCQGK-
-DVLCTNARCLSQTSPSHHKALSRTTTQCMNTTP-
-WLAVRPAKAFPLL
配列番号235; HTIQHASVPTASCISKLNSYTEN
配列番号236; PQVGMRPSNPPHHPARQCPHCIMHLQTQLIHRNLT-
-GPSQLTSLHRSPYQIAATPWTTDFAASFFLNPVTPFL-
-LCRRCQGKDVLCTNARCLSQTSPSHHKALSRTTTQC-
-MNTTPWLAVRPAKAFPLL
配列番号237; PQVGMRPSNP PPHHPARQCPHCIMHLQTQLIHRNLTGPS-
-QLTSLHRSPYQIAATPWTTDFAASFFLNPVTPFLLCRRC-
-QGKDVLCTNARCLSQTSPSHHKALSRTTTQCMNTTPWLA-
-VRPAKAFPLL
配列番号238; PQVGMRPSNPPHTIQHASVPTASCISKLNSYTEN
配列番号239; PQVGMRPSNPHTIQHASVPTASCISKLNSYTEN
配列番号240; WAARSWCERRAAAVAPLAPWAWGCPAGCTPPVAARAC-
-AATRPEGWRSPCTH
配列番号241; PWAARSWCERRAAAVAPLAPWAWGCPAGCTPPVAA-
-RACAATRPEGWRSPCTH
配列番号242; RGLRGAGARGGLRLLRHLRPGLGDALRGVHPPLR-
-LGPALLPAPRGGEAPAHTDARARRVHGAGGDRGHPGPAAL
配列番号243; EEKLARCRPPWAARSWCERRAAAVAPLAPWAWGCPAGC-
-TPPVAARACAATRPEGWRSPCTH
配列番号244; EEKLARCRPPPWAARSWCERRAAAVAPLAPWAWGCPA-
-GCTPPVAARACAATRPEGWRSPCTH
配列番号245; EEKLARCRPPRGLRGAGARGGLRLLRHLRPGLGDA-
-LRGVHPPLRLGPALLPAPRGGEAPAHTDARARRVHGAGG-
-DRGHPGPAAL
配列番号246; EEKLARCRPRGLRGAGARGGLRLLRHLRPGLGDALRG-
-VHPPLRLGPALLPAPRGGEAPAHTDARARRVHGAGG-
-DRGHPGPAAL
配列番号247; QPPVSPRPRRPGRPRAPPPPQPMVSPRRRTTGPPW-
-RPPPLQSTMSPPPQALHQAQLLLWCTTAPLPGLPQPQ-
-PARALHSQFPATTLILLPPLPAIAPRLMPVALTIARYL-
-LSPPPITALLPSCLLGSLSFSCLFTFQTSSLIPLW-
-KIPAPTTTKSCRETFLKW
配列番号248; SPGCHLGPGDQAAPGLHRPPSPWCHLGAGQQARLGVHR-
-PSSPQCHLGLRLCIRLSFYSGAQRHLCQGYHNPSQQEHS-
-ILNSQPPL
配列番号249; KPAPGSTAPQPPVSPRPRRPGRPRAPPPPQPMVSPRR-
-RTTGPPWRPPPLQSTMSPPPQALHQAQLLLWCTTAP-
-LPGLPQPQPARALHSQFPATTLILLPPLPAIAPRLMPVA-
-LTIARYLLSPPPITALLPSCLLGSLSFSCLFTFQTS-
-SLIPLWKIPAPTTTKSCRETFLKW
配列番号250; KPAPGSTAPPQPPVSPRPRRPGRPRAPPPPQPMVSPR-
-RRTTGPPWRPPPLQSTMSPPPQALHQAQLLLWCT-
-TAPLPGLPQPQPARALHSQFPATTLILLPPLPAIAP-
-RLMPVALTIARYLLSPPPITALLPSCLLGSLSFSCLF-
-TFQTSSLIPLWKIPAPTTTKSCRETFLKW
配列番号251; KPAPGSTAPPSPGCHLGPGDQAAPGLHRPPSPWCHL-
-GAGQQARLGVHRPSSPQCHLGLRLCIRLSFYSGA-
-QRHLCQGYHNPSQQEHSILNSQPPL
配列番号252; KPAPGSTAPSPGCHLGPGDQAAPGLHRPPSPWCHL-
-GAGQQARLGVHRPSSPQCHLGLRLCIRLSFYSGAQ-
-RHLCQGYHNPSQQEHSILNSQPPL
配列番号253; QPMVSPRRRTTGPPWRPPPLQSTMSPPPQALHQAQL-
-LLWCTTAPLPGLPQPQPARALHSQFPATTLILLPPLP-
-AIAPRLMPVALTIARYLLSPPPITALLPSCLLGSL-
-SFSCLFTFQTSSLIPLWKIPAPTTTKSCRETFLKW
配列番号254; SPWCHLGAGQQARLGVHRPSSPQCHLGLRLCIRLSF-
-YSGAQRHLCQGYHNPSQQEHSILNSQPPL
配列番号255; RPPPGSTAPQPMVSPRRR
配列番号256; RPPPGSTAPPQPMVSPRRR
配列番号257; RPPPGSTAPPSPWCHLGA
配列番号258; RPPPGSTAPSPWCHLGA
配列番号259; RPRAPPPPSPWCHL
配列番号260; RPRAPPPPPSPWC
配列番号261; RPRAPPPPAHGVTSAP
配列番号262; RPRAPPPPPAHGV
配列番号263; APGLHRPPQPMVSP
配列番号264; AAPGLHRPQPMVSPR
配列番号265; PGLHRPPPAHGVT
配列番号266; APGLHRPPAHGVTS
配列番号267; VDRPQHTEWLSWSNLYRIRHQ
配列番号268; HYLCTDVAPR
配列番号269; HYLCTDVAPPR
配列番号270; HYLCTDVAPPVDRPQHTEWLSWSNLYRIRHQ
【００６９】
配列番号271; HYLCTDVAPVDRPQHTEWLSWSNLYRIRHQ
配列番号272; SAYLSPLGTTWLRTCACRLPRPAASCLCTTPSLLW-
-PRRTCPAGSPRATSSPWRMPAPKSCCTTGLAFTS-
-PIGLGWRSATASGYARIWPVLSLTCQSWSTSLPSTAVTW
配列番号273; PSAYLSPLGTTWLRTCACRLPRPAASCLCTTPSLLWP-
-RRTCPAGSPRATSSPWRMPAPKSCCTTGLAFTSP-
-IGLGWRSATASGYARIWPVLSLTCQSWSTSLPSTAVTW
配列番号274; PAPIFLLWGPLG
配列番号275; APIFLLWGPLG
配列番号276; LPARAPGPPSAYLSPLGTTWLRTCACRLPRPAASCL-
-CTTPSLLWPRRTCPAGSPRATSSPWRMPAPKSCC-
-TTGLAFTSPIGLGWRSATASGYARIWPVLSLT-
-CQSWSTSLPSTAVTW
配列番号277; LPARAPGPPPSAYLSPLGTTWLRTCACRLPRPAAS-
-CLCTTPSLLWPRRTCPAGSPRATSSPWRMPAPKSCC-
-TTGLAFTSPIGLGWRSATASGYARIWPVLSLTC-
-QSWSTSLPSTAVTW
配列番号278; LPARAPGPPPAPIFLLWGPLG
配列番号279; LPARAPGPPAPIFLLWGPLG
配列番号280; DLEHHGGVTRHRHR
配列番号281; LVSDYSMTPRP
配列番号282; LVSDYSMTPPRP
配列番号283; LVSDYSMTPPDLEHHGGVTRHRHR
配列番号284; LVSDYSMTPDLEHHGGVTRHRHR
配列番号285; FHHIATDVGPFVRIGFLKIKGKIKGKSLRKPNW-
-KTQHKLKRALMFLIVKKL
配列番号286; PFHHIATDVGPFVRIGFLKIKGKIKGKSLRKPNWK-
-TQHKLKRALMFLIVKKL
配列番号287; PSITLQQMLAPS
配列番号298; SITLQQMLAPS
配列番号289; TSCNEMNPPFHHIATDVGPFVRIGFLKIKGKIKGKSL-
-RKPNWKTQHKLKRALMFLIVKKL
配列番号290; TSCNEMNPPPFHHIATDVGPFVRIGFLKIKGKIKG-
-KSLRKPNWKTQHKLKRALMFLIVKKL
配列番号291; TSCNEMNPPSITLQQMLAPS
配列番号292; TSCNEMNPPPSITLQQMLAPS
配列番号293; LEMILFLMTF
配列番号294; HPCITKTFLEMILFLMTF
配列番号295; HPCITKTFFLEMILFLMTF
配列番号296; HPCITKTFFWR
配列番号297; HPCITKTFWR
配列番号298; LMFEHSQMRLNSKNAHLPIISF
配列番号299; EYGSIIAFLMFEHSQMRLNSKNAHLPIISF
配列番号300; EYGSIIAFFLMFEHSQMRLNSKNAHLPIISF
配列番号301; HLNKGRRLGDKIRAT
配列番号302; FHLNKGRRLGDKIRAT
配列番号303; VTSGTPFFHLNKGRRLGDKIRAT
配列番号304; VTSGTPFFFHLNKGRRLGDKIRAT
配列番号305; VTSGTPFFFI
配列番号306; VTSGTPFFI
配列番号307; CEIERIHFFF
配列番号308; CEIERIHFFSK
配列番号309; CEIERIHFSK
配列番号310; FRYISKSI
配列番号311; RYISKSI
配列番号312; FKKYEPIFFRYISKSI
配列番号313; FKKYEPIFRYISKSI
配列番号314; FPDSDQPGPLYPLDPSCLISSASNPQELSDCHYIH-
-LAFGFSNWRSCPVLPGHCGVQ
配列番号315; PDSDQPGPLYPLDPSCLISSASNPQELSDCHYIHL-
-AFGFSNWRSCPVLPGHCGVQ
配列番号316; LNMFASVFS
配列番号317; LNMFASVFFS
配列番号318; LNMFASVFFPDSDQPGPLYPLDPSCLISSASNPQE-
-LSDCHYIHLAFGFSNWRSCPVLPGHCGVQ
配列番号319; LNMFASVFPDSDQPGPLYPLDPSCLISSASNPQELS-
-DCHYIHLAFGFSNWRSCPVLPGHCGVQ
配列番号320; AMEETVVVAVATVETEVEAMEETGVVAAMEETEVGAT-
-EETEVAMEAKWEEETTTEMISATDHT
【００７０】
配列番号321; LWVRPWLWEWLRWRPKWRLWRRQEWWRLWRRPRWGL-
-RRRPRWLWRENGRKKRLQK
配列番号322; YGGDRSRGAMEETVVVAVATVETEVEAMEETGVVAAM-
-EETEVGATEETEVAMEAKWEEETTTEMISATDHT
配列番号323; YGGDRSRGGAMEETVVVAVATVETEVEAMEETGVVA-
-AMEETEVGATEETEVAMEAKWEEETTTEMISATDHT
配列番号324; YGGDRSRGGLWVRPWLWEWLRWEPKWRLWRRQEWW-
-RLWRRPRWGLRRRPRWLWRENGRKKRLQK
配列番号325; YGGDRSRGLWVRPWLWEWLRWEPKWRLWRRQEWWR-
-LWRRPRWGLRRRPRWLWRENGRKKRLQK
配列番号326; EFGGGRRQK
配列番号327; EFGGRRQK
配列番号328; RRAKGGGAGASNPRQ
配列番号329; GRRAKGGGAGASNPRQ
配列番号330; DVGLREGALELPTRGNKRNVA
配列番号331; MRGGGGVGGRRAKGGGAGASNPRQ
配列番号332; MRGGGGVGGGRRAKGGGAGASNPRQ
配列番号333; MRGGGGVGGDVGLREGALELPTRGNKRNVA
配列番号334; MRGGGGVGDVGLREGALELPTRGNKRNVA
配列番号335; VWQLAGPMLAGWRSLGSWFCRMYGI
配列番号336; CGSWPALCWRAGGVWAVGSAGCMEYDPEALPAAWGP-
-AAAATVHPRR
配列番号337; RRYPCEWGVWQLAGPMLAGWRSLGSWFCRMYGI
配列番号338; RRYPCEWGGVWQLAGPMLAGWRSLGSWFCRMYGI
配列番号339; RRYPCEWGGCGSWPALCWRAGGVWAVGSAGCMEYD-
-EALPAAWGPAAAATVHPRR
配列番号340; RRYPCEWGCGSWPALCWRAGGVWAVGSAGCMEYDPE-
-ALPAAWGPAAAATVHPRR
配列番号341; LWLWAGWTVWWSCGPGEKGHGWPSLPTMALLLLRFSCM-
-RVASY
配列番号342; GLWLWAGWTVWWSCGPGEKGHGWPSLPTMALLLL-
-RFSCMRVASY
配列番号343; GCGCGPAGQYGGAVGLARRGTAGCLPCPPWLCCCCAF-
-PACGLPGTDGWRGWQGSGCVRVSGSAPWAPGFPFSP-
-PCPLCGTQPRW
配列番号344; CGCGPAGQYGGAVGLARRGTAGCLPCPPWLCCCCAFPACG-
-LPGTDGWRGWQGSGCVRVSGSAPWAPGFPFSPPC-
-PLCGTQPRW
配列番号345; LAFNVPGGLWLWAGWTVWWSCGPGEKGHGWPSLPTMA-
-LLLLRFSCMRVASY
配列番号346; LAFNVPGGGLWLWAGWTVWWSCGPGEKGHGWPSLPTM-
-ALLLLRFSCMRVASY
配列番号347; LAFNVPGGGCGCGPAGQYGGAVGLARRGTAGCLPCPP-
-WLCCCCAFPACGLPGTDGWRGWQGSGCVRVSGSAPW-
-APGFPFSPPCPLCGTQPRW
配列番号348; LAFNVPGGCGCGPAGQYGGAVGLARRGTAGCLPCPPW-
-LCCCCAFPACGLPGTDGWRGWQGSGCVRVSGSAPWA-
-PGFPFSPPCPLCGTQPRW
配列番号349; PPMPMPGQREAPGRQEA
配列番号350; GPPMPMPGQREAPGRQEA
配列番号351; GHQCQCQGKGRHRADRRPDTAQEE
配列番号352; HQCQCQGKGRHRADRRPDTAQEE
配列番号353; GGHSYGGGPPMPMPGQREAPGRQEA
配列番号354; GGHSYGGGGPPMPMPGQREAPGRQEA
配列番号355; GGHSYGGGGHQCQCQGKGRHRADRRPDTAQEE
配列番号356; GGHSYGGGHQCQCQGKGRHRADRRPDTAQEE
配列番号357; APCPQSSGGG
配列番号358; LPAPSQAAADELDRRPG
配列番号359; TKVRLIRGAPCPQSSGGG
配列番号360; TKVRLIRGGAPCPQSSGGG
配列番号361; TKVRLIRGGLPAPSQAAADELDRRPG
配列番号362; TKVRLIRGLPAPSQAAADELDRRPG
配列番号363; CSLAKDGSTEDTVSSLCGEEDTEDEELEAAASHLNK-
-DLYRELLGG
配列番号364; GCSLAKDGSTEDTVSSLCGEEDTEDEELEAAASHLNK-
-DLYRELLGG
配列番号365; AAAWQKMAPPRTPRPACVARR
配列番号366; ENSRPKRGGCSLAKDGSTEDTVSSLCGEEDTEDEELE-
-AAASHLNKDLYRELLGG
配列番号367; ENSRPKRGGGCSLAKDGSTEDTVSSLCGEEDTEDE-
-ELEAAASHLNKDLYRELLGG
配列番号368; ENSRPKRGGAAAWQKMAPPRTPRPACVARR
配列番号369; ENSRPKRGAAAWQKMAPPRTPRPACVARR
配列番号370; HCVLAASGAS
【００７１】
配列番号371; GHCVLAASGAS
配列番号372; GTASSRPLGLPKPHLHRPVPIRHPSCPK
配列番号373; TASSRPLGLPKPHLHRPVPIRHPSCPK
配列番号374; AGTLQLGGHCVLAASGAS
配列番号375; AGTLQLGGGHCVLAASGAS
配列番号376; AGTLQLGGGTASSRPLGLPKPHLHRPVPIRHPSCPK
配列番号377; AGTLQLGGTASSRPLGLPKPHLHRPVPIRHPSCPK
配列番号378; RRTPSTEKR
配列番号379; RRTPSTEKKR
配列番号380; RRTPSTEKKGRSEC
配列番号381; RRTPSTEKGRSEC
配列番号382; STTKCQSGTAETYNSWKVKNLQLEPRRVTSQMNRQVK-
-DMTAILSQS
配列番号384; SSEEIKKKSTTKCQSGTAETYNSWKVKNLQLEPRRV-
-TSQMNRQVKDMTAILSQS
配列番号385; SSEEIKKKKSTTKCQSGTAETYNSWKVKNLQLEPRR-
-VTSQMNRQVKDMTAILSQS
配列番号386; SSEEIKKKKVQPNASQAQQKPTTHGR
配列番号387; SSEEIKKKVQPNASQAQQKPTTHGR
配列番号388; NRGWVGAGE
配列番号389; IEAG
配列番号390; VHNYCNMKNRGWVGAGE
配列番号391; VHNYCNMKKNRGWVGAGE
配列番号392; VHNYCNMKKIEAG
配列番号393; VHNYCNMKIEAG
配列番号394; QLRCWNTWAKMFFMVFLIIWQNTMF
配列番号395; VKKDNHKKQLRCWNTWAKMFFMVFLIIWQNTMF
配列番号396; VKKDNHKKKQLRCWNTWAKMFFMVFLIIWQNTMF
配列番号397; VKKDNHKKKNS
配列番号398; VKKDNHKKNS
配列番号399; GAEESGPFNRQVQLKVHASGMGRHLWNCPAFWSEV
配列番号400; HPSPPPEKRS
配列番号401; HPSPPPEKKRS
配列番号402; HPSPPPEKKGAEESGPFNRQVQLKVHASGMGRHLW-
-NCPAFWSEV
配列番号403; HPSPPPEKGAEESGPFNRQVQLKVHASGMGRHLWN-
-CPAFWSEV
配列番号404; MQVLSKTHMNLFPQVLLQMFLRGLKRLLQDLEKSKKRKL
配列番号405; RCKSARLI
配列番号406; VQTQPAIKKMQVLSKTHMNLFPQVLLQMFLRGLKRLLQ-
-DLEKSKKRKL
配列番号407; VQTQPAIKKKMQVLSKTHMNLFPQVLLQMFLRGLKRL-
-LQDLEKSKKRKL
配列番号408; VQTQPAIKKRCKSARLI
配列番号409; VQTQPAIKRCKSARLI
配列番号410; ARSGKKQKRKL
配列番号411; ARSGKKQKKRKL
配列番号412; ARSGKKQKKENFS
配列番号413; ARSGKKQKENFS
配列番号414; KASARSGKSKKRKL
配列番号415; KASARSGKKSKKRKL
配列番号416; KASARSGKKAKKENSF
配列番号417; KASARSGKAKKENSF
配列番号418; HLNKGRRLGDKIRAT
配列番号419; VTSGTPFFHLNKGRRLGDKIRAT
配列番号420; VTSGTPFFFHLNKGRRLGDKIRAT
【００７２】
配列番号421; VTSGTPFFFI
配列番号422; VTSGTPFFI
配列番号423; VTLLYVNTVTLAPNVNMESSRNAHSPATPSAKRK-
-DPDLTWGGFVFFFCQFH
配列番号424; KCRCKPNFFVTLLYVNTVTLAPNVNMESSRNAHSP-
-ATPSAKRKDPDLTWGGFVFFFCQFH
配列番号425; KCRCKPNFFFVTLLYVNTVTLAPNVNMESSRNAH-
-SPATPSAKRKDPDLTWGGFVFFFCQFH
配列番号426; KCRCKPNFFL
配列番号427; KCRCKPNFL
配列番号429; LVKKLKEKKMNWIL
配列番号430; LVKKLKEKKKMNWIL
配列番号431; LVKKLKEKKR
配列番号432; LVKKLKEKR
配列番号433; AAIVKDCCR
配列番号434; SQPASILGRKL
配列番号435; SQPASILGKRKL
配列番号436; SQPASILGKAAIVKDCCR
配列番号437; SQPASILGAAIVKDCCR
配列番号459; NTWAKMFFMVFLIIWQNTMF
【００７３】
本化合物の１つまたはいくつかを組み合わせて治療に特に適切な癌の例を以下に示す：結腸直腸癌、乳癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肝臓癌（原発性および続発性）、腎臓癌、黒色腫、卵巣癌、脳腫瘍、頭頸部癌、膵臓癌、胃癌、エオゾファジール(eosophageal)癌、前立腺癌ならびに白血病およびリンパ腫。
【００７４】
これらの変異によって遺伝子産物を生じ、それにより腫瘍が発症し得るいくつかの例を以下に列挙する。
【００７５】
結腸直腸癌の発症は、一連の遺伝的変化に起因すると考えられる。結腸直腸癌（ＤＣＣ）遺伝子（配列番号３０〜配列番号３４）、ヒトシステインプロテアーゼ（ＩＣＥｒｅｌ−ＩＩＩ）遺伝子（配列番号３９４〜配列番号３９８および配列番号４５９）、ヒト推定ミスマッチ修復／結合タンパク質（ｈＭＳＨ３）遺伝子（配列番号１３４〜配列番号１４７）、ヒトｈＭＳＨ６遺伝子（配列番号２００〜配列番号２０３および配列番号２９３〜配列番号２９７）、ヒトｎ−ｍｙｃ遺伝子（配列番号１８９〜配列番号１９４）、ヒトＴＧＦβ２（ｈＴＧＦβ２）遺伝子（配列番号２２〜配列番号２９）、ヒトｐ５３関連遺伝子（配列番号２８５〜配列番号２９２）の欠失が結腸直腸癌に関与し得る。
【００７６】
ヒト乳癌感受性（ＢＲＣＡ２）遺伝子（配列番号３５〜配列番号９４）およびヒトＢＲＣＡ１関連ＲＩＮＧドメインタンパク質（ＢＡＲＤ１）遺伝子（配列番号４０４〜配列番号４１７）は乳癌に関与し、卵巣癌ヒトｈＭＳＨ６遺伝子（配列番号２００〜配列番号２０３および配列番号２９３〜配列番号２９７）は、脳腫瘍に関与し得る。
【００７７】
遺伝子の変化によって多くの型の腺癌が頻発する。多くの癌において変異する遺伝子をいくつか以下に列挙する。
【００７８】
ヒト乳癌感受性（ＢＲＣＡ２）遺伝子（配列番号３５〜配列番号９４）、結腸直腸癌欠失（ＤＣＣ）遺伝子（配列番号３０〜配列番号３４）、ヒト推定ミスマッチ修復／結合タンパク質（ｈＭＳＨ３）遺伝子（配列番号１３４〜配列番号１４７）、ヒトｈＭＳＨ６遺伝子（配列番号２００〜配列番号２０３および配列番号２９３〜配列番号２９７）、ヒトＮ−ＭＹＣ遺伝子（配列番号１８９〜配列番号１９４）、ヒトＴＧＦｂ２（ｈＴＧＦｂ２）遺伝子（配列番号２２〜配列番号２９）、ヒトｐ５３関連遺伝子（配列番号２８５〜配列番号２９２）、ヒトＭＵＣ１遺伝子（配列番号２４７〜配列番号２６６）、ヒト生殖系列ｎ−ｍｙｃ遺伝子（配列番号１８２〜配列番号１８８）、ヒトウィルムス腫瘍（ＷＩＴ−１）関連タンパク質（配列番号３８８〜配列番号３９３）、ヒト上咽頭癌ＥＢＶ ＢＮＬＦ−１遺伝子（配列番号２０４〜配列番号２１０）、ヒト形質転換成長因子−β誘導遺伝子産物（ＢＩＧＨ３）（配列番号２２７〜配列番号２３２）。
【００７９】
変異遺伝子の多くにより、白血病およびリンパ腫を発症し得る。以下に例を示す：ヒトニューロフィブロミン（ＮＦ１）遺伝子（配列番号１７６〜配列番号１８１）、ｂ−ｒａｆオンコジーン（配列番号１７０〜配列番号１７５）、ヒトタンパク質−チロシンキナーゼ（ＪＡＫ１）遺伝子（配列番号２６７〜配列番号２７１）、ヒトタンパク質−チロシンキナーゼ（ＪＡＫ３）遺伝子（配列番号２７３〜配列番号２７９）。
【００８０】
悪性黒色腫に関与する遺伝子を以下に示す：ヒト悪性黒色腫転移抑制（ｈＫｉＳＳ−１）遺伝子（配列番号３２８〜配列番号３３４）。転移に関する遺伝子を以下に示す：ヒト転移関連ｍｔａ１（ｈＭＴＡ１）遺伝子（配列番号３５７〜配列番号３６２）。
【００８１】
細胞周期調節およびシグナル形質導入は厳密に制御されている。これらの遺伝子のフレームシフト変異により、細胞増殖が調節不可能になる。これに感受性を示す遺伝子を以下に示す：。ヒトタンパク質チロシンホスファターゼ（ｈＰＴＰ）遺伝子（配列番号９５〜配列番号１０２）、ヒトキナーゼ（ＴＴＫ）遺伝子（配列番号１０９〜配列番号１２０）、ヒト転写抑制（ＣＴＣＦ）遺伝子（配列番号１２１〜配列番号１２７）、ヒト細胞周期調節タンパク質（Ｅ１Ａ結合タンパク質）ｐ３００遺伝子（配列番号２１１〜配列番号２１８）、ヒト形質転換成長因子−β誘導遺伝子産物（ＢＩＧＨ３）（配列番号２２７〜配列番号２３２）、（膜貫通チロシナーゼキナーゼの）ヒトＦＬｔ４遺伝子（配列番号２８０〜配列番号２８４）、ヒトＧタンパク質結合レセプター（ｈＧＰＲ１）遺伝子（配列番号３１４〜配列番号３１９）、ヒト転写因子（ｈＩＴＦ−２）遺伝子（配列番号３２６〜配列番号３２７）、ヒトテロメラーゼ関連タンパク質ＴＰ−１（ｈＴＰ−１）遺伝子（配列番号３３５〜配列番号３４８）、ヒト転写因子ＴＦＩＩＢの９０ｋＤａサブユニット（ｈＴＦＢＩＩＢ９０）遺伝子（配列番号３６３〜配列番号３６９）、ヒトＦＡＤＤ−相同性ＩＣＥ／ＣＥＤ−３様プロテアーゼ遺伝子（配列番号１２８〜配列番号１３３）。
【００８２】
ＤＮＡ合成における変異、または修復酵素によっても細胞増殖が調節できなくなる場合がある。ヒトＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ（ｔｏｐ２）遺伝子（配列番号１０３〜配列番号１０８）およびヒト推定ミスマッチ修復／結合タンパク質（ｈＭＳＨ３）遺伝子（配列番号１３４〜１４７）、および（ｈＭＳＨ６）遺伝子（配列番号２００〜配列番号２０３および配列番号２９３〜配列番号２９７）。
【００８３】
以下に腫瘍抑制遺伝子を示す：ヒト網膜芽細胞腫結合タンパク質１アイソフォームＩ（ｈＲＢＰ１）遺伝子（配列番号１４８〜配列番号１５６）、ヒトニューロフィブロミン（ＮＦ１）遺伝子（配列番号１７６〜配列番号１８１）、ヒトｐ５３関連遺伝子（配列番号２８５〜配列番号２９２）、ヒト網膜芽細胞腫関連タンパク質（ｐ１０７）遺伝子（配列番号３１０〜配列番号３１３）、ヒト腫瘍抑制（ｈＬＵＣＡ−１）遺伝子（配列番号３７０〜配列番号３７７）。これらの遺伝子における変異により、癌が発症する場合がある。
【００８４】
以下にオンコジーン、プロトオンコジーン、または推定オンコジーンを示す：ヒト生殖系列ｎ−ｍｙｃ遺伝子（配列番号１８２〜配列番号１８８）、ヒトｎ−ｍｙｃ遺伝子（配列番号１８９〜配列番号１９４）、ヒトｃａｎ（ｈＣＡＮ）遺伝子（配列番号２９８〜配列番号３００）、ヒトｄｅｋ（ｈＤＥＫ）遺伝子（配列番号３０７〜配列番号３０９）、ｂ−ｒａｆオンコジーン（配列番号１７０〜配列番号１７５）、ヒトＤＢＬ（ｈＤＢＬ）プロトオンコジーン／ヒトＭＣＦ２ＰＯ（ｈＭＣＦ２ＰＯ）遺伝子（配列番号３０１〜配列番号３０６）。これらの遺伝子におけるフレームシフト変異によって癌の発症が誘導される場合がある。
【００８５】
生物学的実験
【００８６】
配列番号１７のペプチドを選択し、いくつかのＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩ分子の結合モチーフを含むように設計した。従って、これらのペプチドは、ＣＤ４+Ｔ細胞およびＣＤ８+Ｔ細胞のエピトープを含み、癌細胞において自然に発生する異常なＴＧＦβＲＩＩタンパク質のプロセシングが起こり、それによりペプチドの重複が起こった場合、癌患者におけるＣＤ４ＴおよびＣＤ８Ｔ細胞応答を惹起することが予想される。これは、今回、図８〜図１１の結果によってＣＤ４Ｔ細胞であると証明された。これらの結果は、以下を意味する。
【００８７】
１）図８の結果は、患者のミスマッチ修復機構を欠失した癌患者の割合が高いＴＧＦβＲＩＩレセプターの変異形態が腫瘍特異的抗原であることを証明する。
【００８８】
２）結腸直腸癌に一般に認められる浸潤性Ｔ細胞の抗原特異性は、概して知られていない。図８の結果は、この患者の腫瘍における腫瘍浸潤性リンパ球の集団を構成する１つのＴ細胞成分が、フレームシフト変異に特異的であることを示し、これは、ＴＧＦβＲＩＩフレームシフトペプチドがin vivoで免疫原性であり、時折、自発性Ｔ細胞活性化を引き起こすことを示している。
【００８９】
３）この観察から、一般的なフレームシフト変異によって形成されるＴＧＦβＲＩＩレセプターの非機能性形態のプロセシングがプロセシングされることになる。このプロセシングは、異常なタンパク質の自然な破壊の一部としての腫瘍細胞においてまたは腫瘍細胞自体もしくは放出形態のレセプターが専門的なＡＰＣまたは両方によって取り上げられた後に起こり得る。
【００９０】
４）図８の結果はまた、配列番号１７のペプチドが、ＨＬＡクラスＩＩ分子に結合することができることを示す。これは、このペプチドによるＡＰＣのパルス化により、ペプチドに対する特異的増殖応答が生じるからであり、またＣＤ４Ｔ細胞応答が、いつでもクラスＩＩ拘束であるからである。これが、図９に示した実験の結果により示された場合である。ここに、配列番号１７のペプチドに対する特異的な応答は、ＨＬＡ−ＤＲに対する抗体によって完全に阻害されたが、他の２つのＨＬＡクラスＩＩ分子、ＨＬＡ−ＤＱおよびＨＬＡ−ＤＰに対する抗体では阻害されなかったことが示される。さらに、患者自身のＡＰＣ上に存在する関連ＨＬＡクラスＩＩ分子をカバーする、標準的なホモ接合性エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）形質転換Ｂ細胞株（ＢＣＬ）のパネルの使用により、本発明者らは、ＨＬＡ−ＤＲ１４としてＴＬＣ ＩＭＴ８およびＩＭＴ９に対する配列番号１７のペプチドの提示を担うクラスＩＩ分子を同定することができた。まとめると、これらの知見は同一の腫瘍生検から得た並行切片でなされた免疫組織学的知見と極めて良く適合しており、本発明者らは、活性化ＣＤ４+Ｔ細胞がＨＬＡ−ＤＲを発現するために誘導された腫瘍細胞の近位に豊富であることを示すことができた。図１１の結果は、これらのＴ細胞クローンはペプチド用量の範囲を超えた増殖応答の増加を可能にし、応答が用量依存性であることを示す。
【００９１】
５）これらのＴ細胞クローンが腫瘍生検から単離されたＴ細胞のクローニングによって得られるので、本発明者らの知見の別の考察は、配列番号１７のペプチドに特異的な活性化Ｔ細胞が、活性化後に腫瘍組織にホーミング可能であることである。
【００９２】
６）配列番号１７のペプチドが腫瘍特異的抗原であり、一般に、このペプチドの配列の重複を起こすフレームシフト変異がミスマッチ修復機構の一部である酵素における欠失を有する癌において見出されるので、このペプチドは癌を発症する危険性の高い癌患者におけるＴ細胞応答を惹起するためのワクチンとして使用することができる。このようなＴ細胞応答は、存在する腫瘍の増殖に潜在的に影響を与えるか、手術および他の形態の治療後の腫瘍の再増殖を防止するか、欠失ミスマッチ酵素が検出されるかその疑いがある遺伝形態の癌を有し、この明らかなミスマッチ修復変異が起こる癌を発症する可能性が高い患者に与えることができる。
【００９３】
合成
ペプチドを、連続フロー固相ペプチド合成を用いて合成した。適切に側鎖が保護されたＮ−ａ−Ｆｍｏｃアミノ酸を使用した。Ｆｍｏｃアミノ酸を、ペンタフルオロフェニルエステルとしてカップリングするか、カップリング前にＴＢＴＵまたはジイソプロピルカルボジイミド活性化のいずれかを使用して活性化する。各カップリング後のＦｍｏｃの選択的除去のために、２０％ピペリジンＤＭＦ溶液を使用した。樹脂からの切断および側鎖保護の最終的な除去を、適切なスカベンジャーを含む９５％ＴＦＡによって行った。ペプチドを精製し、逆相（Ｃ１８）ＨＰＬＣによって分析した。ペプチドの同定を、エレクトロスプレー質量分光学（Finnigan mat SSQ710）を用いて確認した。
Ｔ細胞刺激のin vitro研究に使用したペプチドを、本方法によって合成した。
ペプチドを合成するために、当業者はいくつかの他の周知の方法を適用することができる。
【００９４】
新規のフレームシフト変異ペプチドを同定するための方法の実施例
本実施例では、ＢＡＸ遺伝子を使用して原理を例示する。
以下に列挙した各ステップにおいて、最初の行は遺伝子配列であり、２番目の行はアミノ酸配列である。
ステップ２〜５において、太字の配列は、タンパク質の変異体部分を示す。
【００９５】
【化１】
【００９６】
【化２】
【００９７】
次の実施例では、ＴＧＦβＲＩＩ遺伝子を使用して原理を例示する。
以下に列挙した各ステップにおいて、最初の行は遺伝子配列であり、２番目の行はアミノ酸配列である。
ステップ２〜５において、太字の配列は、タンパク質の変異体部分を示す。
【００９８】
【化３】
【００９９】
【化４】
【０１００】
従って、本発明のペプチドは、フレームシフト変異を有する遺伝子を保有する癌細胞を用いた癌の治療法に使用することができ、その治療には、このような治療が必要なヒト患者に少なくとも１つの本発明のペプチドをin vivoまたはex vivoで投与するステップが含まれる。
【０１０１】
別の実施形態では、ヒトに少なくとも１つの本発明のペプチドを投与することにより、本発明のペプチドを使用してフレームシフト変異を有する遺伝子を保有する癌細胞を有する癌の傾向のあるヒトにワクチン接種することができる。
さらに、本発明の各ペプチドは、個体の異なる型のＨＬＡクラスＩ分子および／またはクラスＩＩ分子に結合することができるので、本発明のペプチドの混合物をヒト個体に投与することは有利であると考えられる。
【０１０２】
さらに、上記のＰＣＴ／ＮＯ９２／０００３２公開において開示の抗癌ワクチンまたはペプチド薬の能力は、本発明のペプチドを含んだ場合非常に増大可能であることが予想される。従って、本発明の別の実施形態では、本発明のペプチドは、ＰＣＴ／ＮＯ９２／０００３２に開示のペプチドと共に、同時に、または任意の配列として投与される。
【０１０３】
ペプチドは、当該分野で既知の免疫応答を強化するために、サイトカインおよび／または成長因子（すなわち、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、Ｆｌｔ−３リガンドなど）などの化合物と共に、同時または別々に投与することができると考えられる。
【０１０４】
本発明のペプチドは、ワクチンまたは治療組成物において単独または他の物質（例えば、標準的なアジュバントなど）と組み合わせて、または高親和性細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導することができる当該分野で既知のリポペプチド結合物の形態で使用することができる（K.Deres、「Nature」、Vol.342、nov.1989）。
【０１０５】
本発明のペプチドは、ペプチドまたは組換えフラグメントベースのワクチンのいずれかに含めるのに有用であり得る。
本発明のペプチドは、当該分野で既知の通常の添加物、希釈剤、安定剤など共に、医薬組成物またはワクチン中に含めることができる。
【０１０６】
本発明によれば、医薬組成物またはワクチンには、ペプチドを単独かまたは少なくとも１つの医薬的に許容可能な担体または希釈剤と組み合わせて含めることができる。
さらに、ワクチンまたは治療組成物には、遺伝子の反復配列における塩基の挿入または欠失から生じる変異体タンパク質のフラグメントであるペプチドの選択を含むことができる。
【０１０７】
さらに、ワクチン組成物には、１つの癌のために選択される少なくとも１つのペプチドを含むことができ、このワクチンは、遺伝的にこの特定の癌を発症する疑いのある患者に投与される。
さらに、ワクチン組成物には、１つの癌のために選択される少なくとも１つのペプチドを含むことができ、このワクチンは、この特定の癌を発症する危険性の高い群に属する患者に投与される。
【０１０８】
さらに、本発明の癌ワクチンは、例えば、フレームシフト変異遺伝子に関連する種々の一般的な癌に対してＴ細胞免疫を起こすペプチドの混合物としてに一般的に投与することができる。
本発明のペプチドは、単一のペプチドまたはペプチドの混合物として投与することができる。あるいは、ペプチドが互いに共有結合して、より大きなポリペプチドか環状ポリペプチドを形成することができる。
【０１０９】
本発明の癌治療は、患者が罹患している癌の型に関連する変異体遺伝子産物に対して特異的なＴ細胞株またはクローンを生じることを主要な目的として、in vivoまたはex vivoで投与することができる。
【０１１０】
さらに、本発明のフレームシフト変異体ペプチドは、種々の経路（皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、静脈内などを含むがこれらに限定されない）で患者に投与することができる。１つの実施形態では、本発明のペプチドは、皮内に投与される。ペプチドは、１つまたは複数の注射部位に、治療的または予防的に有効な量を患者に投与することができる。
【０１１１】
本発明のペプチドは、１回のみあるいは複数回（例えば、反復配列後を１週間に１回、１〜２ヶ月）投与することができ、これはすべて治療される患者の要求に従う。
本発明のペプチドは、ワクチン接種される平均的なヒト患者または個体に１マイクログラム（１μｇ）〜１グラム（１ｇ）の範囲内の量を投与することができる。各投与には、１マイクログラム（１μｇ）〜１ミリグラム（１ｍｇ）の範囲内のより少ない用量を使用することが好ましい。
【０１１２】
さらに、本発明は、フレームシフト変異ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む。
さらに、本発明は、少なくとも１つのフレームシフト変異体ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む単離ＤＮＡ配列、および遺伝子におけるフレームシフト変異に関連する癌の治療用または予防用のワクチンとしてのこのような単離ＤＮＡ配列の投与が含まれる。
【０１１３】
本発明のペプチドは、ＤＮＡワクチンの形態で個体に投与することができる。これらのペプチドをコードするＤＮＡは、クローン化プラスミドＤＮＡまたは合成オリゴヌクレオチドの形態であり得る。ＤＮＡは、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１２）および／または他の同時刺激分子と共に送達させることができる。サイトカインおよび／または同時刺激分子自体をプラスミドまたはオリゴヌクレオチドＤＮＡの形態で送達させることができる。ＤＮＡワクチンに対する応答は、免疫刺激ＤＮＡ配列（ＩＳＳ）の存在によって増加することが認められた。これらは、以下の式のメチル化ＣｐＧを含む六量体モチーフの形態をとることができる：５’−プリン−プリン−ＣＧ−ピリミジン−ピリミジン−３’。従って、本発明者らのＤＮＡワクチンは、これらのＩＳＳまたは他のＩＳＳを、ペプチドをコードするＤＮＡ、サイトカインまたは他の同時刺激分子をコードするＤＮＡまたはその両方に組込むことができる。ＤＮＡワクチン接種の利点の総説が、Tighe et al（1998、「Immunology Today」、19(2)、89〜97）に記載されている。
【０１１４】
１つの実施形態では、変異体ＢＡＸペプチドをコードするＤＮＡ配列には、以下が含まれる。
【０１１５】
【化５】
【０１１６】
第２の実施形態では、変異体ＴＧＦβＲＩＩペプチドをコードするＤＮＡ配列には、以下が含まれる。
【０１１７】
【化６】
【０１１８】
さらに、本発明は、フレームシフト変異体ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むベクターおよびプラスミドを含む。ベクターには、大腸菌（E.Coli）プラスミド、リステリア（Listeria）ベクター、および組換えウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。組換えウイルスベクターには、フレームシフト変異体ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む、オルトポックスウイルス、カナリアウイルス、カプリボックスウィルス、スイポックスウィルス、ワクシニア、バキュロウイルス、ヒトアデノウイルス、ＳＶ４０、ウシ乳頭腫ウイルスなどが含まれるがこれらに限定されない。
【０１１９】
抗癌治療または予防はまた、フレームシフト変異体ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む少なくとも１つの挿入部位を含む有効量の組換えウィルスベクターまたはプラスミドを患者に投与することによって達成することができ、これにより、患者の抗原提示細胞がベクター／プラスミドの宿主細胞中に変化し、ＨＬＡ／フレームシフト変異体ペプチド複合体の提示が達成されると考えられる。
当業者は、本発明のペプチドと組み合わせて他の可能性ある用途を見出し、これらは、本発明の請求の範囲に含まれることを意味する。
【０１２０】
本発明のペプチドは、ペプチドの化学合成、組換えＤＮＡ技術もしくはタンパク質またはフレームシフト遺伝子によってコードされるペプチドのプロテアーゼ分解などの当該分野で公知の従来の方法によって作製することができる。化学合成の１つの方法は、以下の記載において説明する。
【０１２１】
有効な特異的Ｔ細胞免疫に基づく特異的癌治療用のワクチンおよび方法のために、以下の３つの条件を満たさなければならない。
１．使用したペプチドは、全長かまたは抗原提示細胞のプロセシング後に、癌細胞または他の抗原提示細胞上のＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスＩＩ分子によって提示されたプロセシングされた変異体タンパク質フラグメントに対応しなければならない。
２．使用したペプチドは、免疫原性形態でＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスＩＩ分子に結合しなければならない。
３．ＨＬＡ／ペプチド複合体を認識および応答することができるＴ細胞は、ヒトの循環に存在しなければならない。
【０１２２】
本発明のいくつかの代表的なペプチドがこれら全ての条件を満たすことが確認された。本発明のペプチドは、in vitroでの特異的Ｔ細胞免疫応答を惹起する。本発明のペプチドがプロセシングされた変異体タンパク質フラグメントに相当することが確認された。これは、形質転換変異体ＢＡＸおよびＴＧＦβＲＩＩペプチドのフラグメントに相当するペプチドを用いて例示される。
【０１２３】
本発明によって、以下の利点が達成される。
患者の遺伝子におけるフレームシフト変異から生じる癌（現在既知のほとんどの癌においていかなる良好な代替的治療法も存在しない）を罹患した患者を治療する可能性を付与する。
遺伝的に疑いがあるか他の危険性の高い群に属するヒトを予防的にワクチン接種する可能性を付与する。
【０１２４】
特異的な癌（例えば、結腸直腸癌または膵臓癌など）（一般に、この癌は遺伝子のフレームシフト変異または突然変異のいずれかに関連する）のための併用治療を作製する可能性を付与する。
記載のフレームシフト変異は広範な種々の癌に起こるので、複数標的治療を得るために確立されたワクチンと更なるワクチンとを組み合わせて、このペプチドを使用することができる。
同様に、遺伝子の複数のフレームシフト変異に関連する癌を罹患した患者を、併用治療によってより有効に治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 正常なドナー由来のＴ細胞を、変異体ＢＡＸペプチドおよび変異体ＴＧＦβＲＩＩペプチドを含むペプチドの混合物で刺激することができることを示した。６人の異なるドナー由来の血液サンプルにおけるＴ細胞増殖依存性ペプチド混合物を図１に示す。変異体ＢＡＸペプチド（配列番号１、配列番号９〜１配列番号１２）および変異体ＴＧＦβＲＩＩペプチド（配列番号１５〜配列番号２１）の混合物を用いて、各ドナー由来の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を刺激することによって結果を得た。混合物中の各個体のペプチドの濃度は、２０μＭであった。２週間後、およびその後１週間ごとに、大量培養物を、１０μＭ〜２５μＭのペプチド混合物でパルスした自系ＰＢＭＣで再刺激した。４〜５回の再刺激後、大量培養物を、ＰＢＭＣのみ、コントロール、抗原提示細胞（ＡＰＣ）として２５μＭのペプチドでパルスしたＰＢＭＣを用いた標準的な増殖アッセイによって試験した。
【図２】 さらに、Ｔ細胞クローンは、大量刺激実験で使用した混合物と別のペプチドに対して産生され得ることを見出した。図２は、Ｕ底の９６ウェルマイクロタイタープレート中、５細胞／ウェルで播種し、支持細胞として２５μＭの変異体ＢＡＸペプチド（配列番号１２）でパルスした自家系ＰＢＭＣを用いることによってドナー１（図１）由来の大量培養をクローン化することによって得られたＴ細胞クローン５２１−２の増殖を示す。自系Ｂ−リンパ芽球腫細胞を、増殖アッセイにおけるＡＰＣとして使用した。
【図３】 図３では、変異体ＢＡＸペプチドおよび変異体ＴＧＦβＲＩＩペプチドを使用して乳癌患者由来のＴ細胞（ＰＢＭＣ）を刺激することができることを示す。同一の癌患者由来の樹状細胞（ＤＣ）をＡＰＣとして使用した。Ｔ細胞刺激（図３）を、変異体ＢＡＸペプチド（配列番号１、配列番号９〜配列番号１２）の混合物および変異体ＴＧＦβＲＩＩペプチド（配列番号１５〜配列番号２１）の混合物で別々にＤＣをパルスした後、自系ＰＢＭＣおよび１０ｎｇ／ｍｌ腫瘍壊死因子を添加することによって得た。パルスに使用した混合物中の各ペプチドの濃度は２５μＭであった。ＰＢＭＣおよびＤＣを、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）治療を受けた乳癌患者から白血球搬出法によって得た。ＣＤ３４+細胞を、細胞産物から単離し、ＤＣを標準的な方法を用いて得た。
【図４】 図４は、変異体ＢＡＸ（配列番号１、配列番号９〜配列番号１２）および変異体ＴＧＦβＲＩＩ（配列番号１５、配列番号１７〜配列番号２１）由来の異なる合成ペプチドに対して認識および増殖する、膵臓癌患者の腹水から得たＴ細胞の能力を示す。Ｔ細胞株を、膵臓腺癌患者の腹水に存在するＴ細胞の増大後に得た。Ｔ細胞株を、１００Ｕ／ｍｌの組換えインターロイキン−２（ｒＩＬ−２）(Amersham、Aylesbury、UK)と共にin vitroで１週間培養することによって増やし、その後増殖アッセイにおいて試験した。
自系で、照射（３０Ｇｙ）した５×１０4のＰＢＭＣを、Ｕ底９６ウェルプレート(Costar、Cambridge、MA)に播種し、２０μＭの１種類の合成ペプチドで２時間パルスした。５×１０4／ウェルのＴ細胞を添加し、プレートを、３７℃で４日間インキュベートし、最後の１２時間に１８．５×１０4Ｂｑ／ｍＬの３Ｈ−チミジンを添加した後回収した。プレートを、液体シンチレーションカウンター（Packard Topcount）によって計数した。データは、異なる合成ペプチドに対する特異的な増殖を示し、値は、３連の培養の平均として示す。これらの結果は、膵臓癌患者から単離したＴ細胞が、変異体ＢＡＸおよびＴＧＦβＲＩＩ由来のアミノ酸配列を保有するペプチドのパネルに応答することができることを示す。
【図５】 さらに、図５は、変異体ＢＡＸおよび変異体ＴＧＦβＲＩＩ由来の異なる合成ペプチドに対して認識および増殖する、別の膵臓癌患者から得たＴ細胞の能力を示す。Ｔ細胞株を、膵臓腺癌患者の腹水に存在するＴ細胞の増大後に得た。実験を、上記と同一の方法で行った。データは、異なる合成ペプチドに対する特異的な増殖を示し、値は、３連の培養の平均として示す。
後者の膵臓癌患者由来のＴ細胞応答を調査するために、反応性Ｔ細胞をクローン化した。腹膜のマクロファージを、照射し（３０Ｇｙ）、２５μＭの各ペプチドと共に、Ｕ底の９６ウェルプレート（Costar）に１×１０4でプレートした。Ｔ細胞の芽細胞を、顕微鏡で計数し、１００Ｕ／ｍｌヒト組換えインターロイキン−２（ｒＩＬ−２）（Amersham、Aylesbury、UK）と共に、全体積２００ｍＬで５芽細胞／ウェルで添加した。１４日後、Ｔ細胞クローンを、１ｍｇ／ｍＬフィトヘムアグルチニン（PHA、Wellcome、Dartford、UK）、１００Ｕ／ｍｌのｒＩＬ−２および支持細胞としての異質遺伝型の、照射ＰＢＭＣと共に２４ウェルプレート（Costar）に移し、７日後および１４日後にペプチド特異性についてスクリーニングした。
【図６】 Ｔ細胞クローン５２０．５、５２０．７、および５２０．８を、更なる特徴づけのために選択し、これらは細胞表面表現型ＣＤ３+、ＣＤ８+、およびＴｃＲ+を発現する。図６は、配列番号１０のペプチドでパルスしたペプチドパルス化自系標的細胞に対するＴ細胞クローン５２０．５、５２０．７、および５２０．８の認識および細胞傷害性を示す。自系エプスタイン・バーウイルス形質転換Ｂ細胞（ＥＢＶ）を、３Ｈ−チミジン（９．２５×１０4Ｂｑ／ｍｌ）で一晩標識し、１回洗浄し、培地中に２５ｍＭの合成ペプチド（配列番号１０）および１％ＤＭＳＯを含むか含まない９６ウェルプレート中に２５００細胞／ウェルでプレートした。３７℃で３０分のインキュベーション後、プレートを洗浄し、Ｔ細胞を添加した。プレートを、３７℃で４時間さらにインキュベートし、回収して液体シンチレーションカウンター（Packard Topcount）で計数した。データは、１０／１のエフェクター／標的比での３Ｈチミジン標識ペプチドパルス化標的細胞の特異的溶解％を示す。値は、３連の培養物の平均として示される。これらの結果は、膵臓癌患者の腹水から得た３つの異なるＴ細胞クローンが、変異体ＢＡＸ由来の関連ペプチド（配列番号１０）でパルスした自系ＥＢＶ標的の特異的細胞傷害性が存在することを示す。
【図７】 図７は、同一の患者から得た３つの異なるＴ細胞クローンの細胞傷害特性を示す。これらのＴ細胞クローンを培養し、上記のように拡大したが、変異体ＴＧＦβＲＩＩ由来のアミノ酸配列を有する配列番号１７の合成ペプチドに対してＴ細胞を産生した。Ｔ細胞クローン５３８．１、５３８．３、および５３８．４は全て、細胞表面表現型ＣＤ３+、ＣＤ８+、およびＴｃＲ+を示した。実験条件は、上記（図６）と同一であった。データは、１０／１のエフェクター／標的比での配列番号４２８のペプチドでパルスした３Ｈチミジン標識ペプチドの特異的溶解％を示す。値は、３連の培養物の平均を示す。これらの結果は、膵臓癌患者の腹水から得た３つの異なるＴ細胞クローンが変異体ＴＧＦβＲＩＩ由来の関連ペプチド（配列番号４２８）でパルスした自系ＥＢＶ標的の特異的細胞傷害性が存在することを示す。
【図８】 図８は、近位結腸に局在した腺癌を有する患者から得た腫瘍生検から得た、２つのＣＤ４+Ｔ細胞クローン、ＩＭＴ８およびＩＭＴ９の特異性を示す。免疫組織化学により、患者は支配的なＣＤ４+Ｔ細胞が豊富に浸潤し、その多くが活性化マーカーを保有していたことが明らかになった。ＨＬＡ ＤＲ陽性腫瘍細胞のＣＤ４Ｔ細胞浸潤島領域を観察した。Ｔ細胞クローンを、１５Ｕ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−２を含む培地で１６日間培養後、生検から成長した腫瘍浸潤リンパ球の成分から得た。この培養由来のＴ細胞を、ＡＰＣでパルスした照射ペプチドおよび１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を有するTerasakiプレート中で限界希釈（１細胞／ウェル）することによってクローン化した。自系ＡＰＣのパルス化を、３μｇ／ｍｌの精製ヒトβ２ミクログロブリンおよび１０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＴＮＦαの存在下で、配列番号１５、配列番号１７、および配列番号１８のＴＧＦβＲＩＩフレームシフトペプチド（各ペプチドあたり１μｇ／ｍｌ）の混合物を用いて、３７℃で３時間行った。増大することができる１４のクローンの予備試験により、２つのクローンが、クローニング用に使用したペプチド混合物と反応することが示された。増大後、クローンを、標準的な増殖アッセイにおいて、１種類のペプチドとの反応性についてスクリーニングした。結果は、ＩＭＴ８およびＩＭＴ９は、共にＴＧＦβＲＩＩフレームシフトペプチド（配列番号１７）と特異的に反応し、試験した他の２つのフレームシフトペプチドとは反応性を示さないことを示す。
図（図８）は、従来のＴ細胞増殖アッセイの結果を示し、クローン化Ｔ細胞（５×１０4）および照射ＡＰＣ（５×１０4）を３連で３日間同時培養し、回収した。培養物の増殖能を測定するために、3Ｈ−チミジン（３．７×１０4Ｂｑ／ウェル）を培養物に添加し回収した。値は、３連の平均カウント毎分（ｃｐｍ）として示す。
【図９】 図９は、配列番号１７のペプチドに対する２つのＴ細胞クローンＩＭＴ８およびＩＭＴ９の特異的反応性は、阻害後の反応性がペプチドの非存在下でのＡＰＣを用いたクローンのバックグラウンド反応性と同一であるので、ＨＬＡ−ＤＲ分子に特異的に結合する抗体を用いた細胞の処理によって完全に阻害されることを示す。一方、ＨＬＡクラスＩＩアイソタイプＨＬＡ−ＤＱおよびＨＬＡ−ＤＰに対する抗体では、ＡＰＣでパルスしたペプチドを用いたクローンの反応性を阻害することはできなかった。この実験は、これらの２つのＴ細胞クローンに対するペプチドが存在を担う分子としてＨＬＡ−ＤＲを明解に同定する。抗体阻害実験を、ＡＰＣとしてホモ接合性ＥＢＶ形質転換細胞株９０６１（ＩＨＷＳ９命名法）を用いて行った。ＡＰＣを、１５μｇ／ｍｌの濃度のペプチドで３７℃で１時間パルスし、１０μｇ／ｍｌの阻害抗体Ｌ２４３（ｐａｎ−ＤＲ抗体）、ＳＰＶＬ３（ｐａｎ−ＤＱ抗体）、およびＢ７．２１（ｐａｎ−ＤＰ抗体）を添加した。阻害抗体の非存在下での非パルスＡＰＣおよびペプチドパルス化ＡＰＣを、それぞれネガティブコントロールおよびポジティブコントロールとして用いた。結果を、図８に示す。
【図１０】 ＩＭＴ患者をＨＬＡタイピングしたところ、ＨＬＡ：Ａ１、２；Ｂ７、８；ＤＲ３、１４；ＤＱ１、２と判明した。配列番号１７のペプチドの提示を担うＨＬＡ−ＤＲ分子を同定するために、ホモ接合性ＢＣＬ細胞株を得るＨＬＡワークショップのパネルを得て配列番号１７のペプチドでパルスした。図１０は、Ｔ細胞クローンＩＭＴ８およびＩＭＴ９に対する配列番号１７のペプチドの提示を担うＨＬＡ−ＤＲ分子としてのＨＬＡ−ＤＲ１４（ＤＲＡ*０１０２、ＤＲＢ*１４０１）の同定を示す。ペプチドが自系ＥＢＶ形質転換細胞株（自系ＡＰＣ）ならびに細胞株９０５４（ＥＫ）および９０６１（３１２２７ＡＢＯ）（両株はそれらの表面上に唯一つのＤＲ分子としてＤＲ１４を発現する）によって提示された場合、特異的な増殖応答が認められた。ホモ接合性細胞株は、より高い応答性を示すが、これは、このＤＲ分子をコードする遺伝子の二倍の用量の影響により関連クラスＩＩ／ペプチド複合体の発現レベルがより高いことを反映する。患者のＡＰＣで発現した他のＤＲ分子を示すＨＬＡ−ＤＲ３を発現する細胞株（９０１８、Ｌ００８１７８５）および関連性のないＨＬＡ−ＤＲ分子によってペプチドを提示した場合、いずれも応答は得られなかった。抗原阻害を行わなかったこと以外は図９に記載のように実験を行った。結果を図８に示す。
【図１１】 図１１は、漸増濃度の配列番号１７のペプチドを用いて細胞株９０５４のパルス化によって得た用量反応曲線を示す。ＩＭＴ８およびＩＭＴ９共に、ペプチドに対する増殖応答において用量依存の増加を示す。結果を、図（図１１）に示したペプチド濃度で図９および図１０に記載のように行った。結果を、図８に示す。
【図１２】 図１２は、健常な血液ドナー（ドナー２８９２）由来の末梢血から単離したＴ細胞の、配列番号１６、配列番号１７、および配列番号２１のペプチドでパルスした照射自系樹状細胞で毎週刺激するin vitro刺激によって得られた細胞株の反応性を示す。Ｔ細胞を配列番号２１のペプチドでパルスした自系樹状細胞で同時にインキュベートした場合の、バックグラウンド値を超える特異的応答を得た。１回目および２回目のin vitro刺激後の培養物では活性は検出できなかった。これらのデータは、正常な個体のＴ細胞レパートリーには、正常なヒトには起こりえないＴＧＦβＲＩＩにおける変異由来のこのフレームシフトペプチドを認識する能力を有するいくつかの前駆体細胞を含むことを示す。他の２つの血液ドナー（＃２７０６および＃２８９６）では、関連する特異性を有する前駆体細胞レベルは、非常に低く検出不可能であった。この結果は、従来のＩＦＮｇ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて試験したスポット数／１０4Ｔ細胞として示す。このアッセイを、規定の抗原と特異的に反応することができる細胞の混合物に存在する細胞数として列挙する。簡単に述べれば、１０7のＴ細胞（非付着細胞）を、ＡＰＣとして２〜５×１０6の照射ペプチドパルス化自系樹状細胞（ＤＣ）で毎週刺激した。文献に記載の標準的なプロトコールに従って、組換えヒトＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４中で１週間培養することによって、付着細胞集団からＤＣを産生させた。１５μｇ／ｍｌのペプチドでの一晩のペプチドパルス化後、完全に成熟したＤＣを、組換えＴＮＦαと培養することによって得た。２連の１０4培養Ｔ細胞／ウェルおよびＡＰＣとしてＤＣでパルスしたかしていない１０4ペプチドを用いて、標準的な公開されているプロトコールに従って、ＥＬＩＳＰＯＴを行った。結果を、平均スポット数／１０4Ｔ細胞で示す。
【図１３】 図１３は、配列番号１５〜配列番号２１のペプチドを用いた健常な血液ドナー（ドナー３２２）由来のＴ細胞のin vitro刺激の結果を示す。in vitro培養を、図１２に記載のように行った。配列番号１６および配列番号２１のペプチドの混合物でプライムしたＴ細胞培養物を配列番号２１のペプチドで刺激した場合、および配列番号１７のペプチドでプライムした培養物を同一のペプチドで刺激した場合に、バックグラウンド値を超える増殖応答が認められた。これらの結果は、正常な血液ドナーは、これらのフレームシフトペプチドに特異的な少数の循環Ｔ細胞を有し、フレームシフトペプチドを用いた刺激による培養においてこれらの細胞を増やすことができることを示す。これらの結果はまた、配列番号１７のペプチドはヒトにおいて免疫原性であることを示す図８〜図１１に示した結果を確認し、配列番号２１のペプチドは、ヒトにおける癌ワクチンとしても使用することができることを示す。結果を、図８に記載のように示す。
【図１４】 図１４に示した結果は、ＨＬＡクラスＩエピトープに特異的なＣＤ８+Ｔ細胞は、健常な血液ドナー（ドナー９０５）のＴ細胞レパートリー中に存在するＴ細胞から産生させることができることを示す。in vitroでの２回目の再刺激後ではいずれのペプチドを用いても、バックグラウンドを超える反応性は認められなかった。４回目の再刺激後、配列番号４２８のペプチドに特異的なＴ細胞の頻度は、検出不可能なレベルから、約２．５％の細胞レベルに増加した。これらの結果は、ＣＤ８+表現型のＣＴＬ前駆体は、健常な血液ドナーのプライムされていないＴ細胞レパートリーに存在することを示す。このようなＴ細胞を、配列番号４２８のペプチドを用いた特異的刺激によってin vitroで増やすことができる。これは、このような変異を有する癌患者のフレームシフトペプチドに特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を惹起するための癌ワクチンとしてのこのペプチドの使用の基本となる。Ｔ細胞を、末梢血から単離したＴ細胞の毎週の再刺激によって産生し、ＣＤ８表現型の細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を産生させるための標準的な手順に従って、ＩＬ−７およびＩＬ−２を培養中に添加する以外は図１２に記載のようにペプチドパルス化自系ＤＣを用いて刺激した。使用したペプチドは、配列番号４２８、配列番号４３９、配列番号４４６、および配列番号４５１のペプチドであった。細胞を、図１２に記載のようにＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて試験した。結果を、図１２に記載のように示す。
［発明の要旨］
本発明は、ペプチドがＴ細胞免疫を惹起する、遺伝子におけるフレームシフト変異から生じるタンパク質産物のフラグメントであるペプチド、および前述のペプチドを含む抗癌治療用の癌ワクチンおよび組成物に関する。
【０００２】
さらに、本発明は、前述の変異遺伝子に関連する癌と戦うために有用なＴ細胞免疫を惹起しうる、遺伝子におけるフレームシフト変異体から生じるタンパク質産物のフラグメントであるこのようなペプチドの同定法に関する。
【０００３】
本発明はまた、少なくとも１つのフレームシフト変異体ペプチドをコードするＤＮＡ配列、および少なくとも１つのフレームシフト変異ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む少なくとも１つの挿入部位を含むベクターに関する。
【０００４】
さらに、本発明は、少なくとも１つのフレームシフト変異体ペプチドまたは少なくとも１つのフレームシフト変異体ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む少なくとも１つの挿入部位を含む組換えウイルスベクター、または少なくとも１つのフレームシフト変異体ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む単離ＤＮＡ配列の投与により、遺伝子におけるフレームシフト変異に関連する癌の治療法または予防法に関する。
【０００５】
さらに、本発明は、身体自身の免疫系のＴ細胞アームの抗癌活性を活性化および強化するためのペプチドの使用に基づく抗癌治療または予防の開発を示す。
【０００６】
［背景技術］
腫瘍抗原の記述
Ｔ細胞限定抗原は、現在広範囲のタイプの癌において特徴づけられている。これらの抗原は、その発現によっていくつかの主要な群に分類することができる。２つの主要な群は、発生分化関連抗原（腫瘍精巣抗原、ＭＡＧＥ抗原およびＣＥＡなどの腫瘍胎児抗原）および組織特異的分化抗原（チロシナーゼ、ｇｐ１００など）からなる。真性の腫瘍特異的抗原を含む群は、それらをコードする遺伝子における変異によって変化するタンパク質を含む。これらのほとんどでは、変異は独特で、１つまたは少数の腫瘍で検出されている。これらの抗原のいくつかは、腫瘍形成の役割を果たしていると思われる。
【０００７】
癌ワクチンの記述
癌ワクチン開発において、１つの形態の癌（黒色腫など）または多種類の癌で高頻度で発現される抗原が注目されている。これについての１つの理由は、患者の臨床プロトコルへの使用が増加していることである。この分野は急速に進歩しており、ＮＣＩのＰＤＱデータベースに最近登録された癌ワクチンプロトコルを列挙した添付の表によって例示される。
【０００８】
遺伝性の癌／癌遺伝子試験
遺伝形態の癌は、集団において特定の頻度で起こる。これらの癌形態のいくつかでは、潜在的な遺伝子欠損がマッピングされている。これはまた、遺伝性癌の重要な群を構成するリンチ症候群癌における場合である。この症候群に罹患した家系では、親族にＤＮＡミスマッチ修復（ＭＭＲ）酵素をコードする欠損遺伝子を遺伝で受け継ぐ。このようなＭＭＲ欠損の担体は、結腸直腸癌（ＨＮＰＣＣ）および他の形態の癌（リスト？）を頻繁に発症する。ＭＭＲ酵素における変異は、他の癌関連遺伝子を検出できる方法と同じ方法の遺伝子試験を用いて検出することができる。
【０００９】
この場合の危険群の遺伝子試験は、予防的治療についての許容可能な形態が存在しないので、倫理的ジレンマを呈す。現在、治療の選択肢は癌を発症する危険性のある器官を除去する手術のみである。これらの患者において、有効なワクチンを開発することができたならば、癌ワクチンは非常に（興味深い）予防形態となるであろう。
【００１０】
ミスマッチＤＮＡの有効な修復を欠くために、１本鎖ＤＮＡにおける欠損および挿入が起こり、またこれは、反復単位（反復配列）を含むＤＮＡの伸長に置き易い。現在まで、非コードミクロサテライト遺伝子座の形成における反復配列が注目されている。実際、ミクロサテライトの不安定性は、ＭＭＲ欠損に起因する癌の目立つ特質である。本発明者らは、別のアプローチを行い、オンコジーンプロセスに関連するタンパク質をコードするＤＮＡ配列において生じるフレームシフト変異に注目した。このようなフレームシフト変異により、新規の終止コドンの出現場所で早期に終止する、タンパク質のＣ末端部分に全く新規のアミノ酸配列が生じることになる。この結果により、以下の２つの重要な結論を得た。
【００１１】
１）フレームシフトに起因する短縮タンパク質は、一般に、非機能的であり、ほとんどの場合、重要な細胞機能の「ノックアウト」が起こる。異常なタンパク質はまた、プラークの集合および形成能力などの新規の機能を得ることができる。両方の場合で、フレームシフトにより疾患が引き起された。
【００１２】
２）読み取り枠（「フレームシフト配列」）におけるシフトに起因する短い新規のＣ末端アミノ酸配列は、身体にとって外来物である。変異前には存在せず、変異を有する細胞（つまり、腫瘍細胞およびそれらの前悪性前駆体）中にのみ存在する。タンパク質の変異部分は、完全に新規であり、したがって、キャリアの免疫系に対して外来であるので、変異部分は、キャリアのレパートリーにおけるＴ細胞によって認識されることができる。これまでは、フレームシフト変異のこの局面については注目されておらず、腫瘍抗原としてのタンパク質のコード領域由来のフレームシフトペプチドの特徴づけについての報告は存在しない。従って、この概念は新規であり、これらの配列に基づいたワクチンの開発の基本を形成する。そのため、このようなワクチンはまた、ＭＭＲ整合に属する欠陥酵素を受け継いでいる患者に予防的に使用することができる。従って、このようなワクチンは、遺伝性形態の癌に対する治療手段の空白部分を埋めることになるであろう。
【００１３】
細胞内「自己」タンパク質における１つのアミノ酸置換によって、正常なペプチド由来のアミノ酸配列とは異なるペプチドからなる腫瘍拒絶抗原を生じる場合があることが示されている。腫瘍細胞表面の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子の環境においてこれらのペプチドを認識するＴ細胞は、腫瘍細胞を死滅させ、宿主由来の腫瘍を拒絶することができる。
【００１４】
自然の立体構造における遊離の抗原を典型的に認識し、抗原表面に暴露されたほとんどの如何なる部位をも潜在的にさらに認識するＢ細胞により産生される抗体とは対照的に、Ｔ細胞は、抗原が結合し、ＭＨＣ分子によって提示された場合のみ抗原を認識する。通常、この結合は、タンパク質のタンパク質分解性断片化を含む適切な抗原プロセシング後にのみ起こり、その結果、得られたペプチドフラグメントがＭＨＣ分子の溝に適合する。それにより、Ｔ細胞はまた、細胞内タンパク質由来のペプチドも認識することができる。従って、Ｔ細胞は、腫瘍細胞表面上のＭＨＣ分子の環境において任意の場所の腫瘍細胞由来の異常なペプチドを認識することができ、その後、異常なペプチドを保有する腫瘍細胞を排除するように活性化することができる。
【００１５】
「M.Barinaga」(Science、257、880〜881、1992）には、どのようにしてＭＨＣがペプチドに結合するのかについての短い総説が示されている。本発明の技術背景のより総括的な説明は、「Advanced Immunology」（D.Male et al、1987、J.B.lippincott Company、Philadelphia）に見出すことができる。両文献は、その全体において本明細書に組み込まれる。
【００１６】
ヒトにおけるＭＨＣ分子は、通常、ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）分子という。これは、ヒト第６染色体のＨＬＡ領域によってコードされる。
ＨＬＡ分子は、コードされる染色体領域および相互作用して主に活性化されるＴ細胞亜集団に応じて、２つの異なるクラスとして出現する。クラスＩ分子は、ＨＬＡ Ａ、ＢおよびＣ亜遺伝子座（subloci）によってコードされ、主に、ＣＤ８+細胞傷害性Ｔ細胞を活性化する。ＨＬＡクラスＩＩ分子は、ＤＲ、ＤＰおよびＤＱ亜遺伝子座によってコードされ、主にＣＤ４+Ｔ細胞、両ヘルパー細胞、および細胞傷害性細胞を活性化する。
【００１７】
通常、各個体は６種類のＨＬＡクラスＩ分子を有し、通常、３つの群Ａ、ＢおよびＣそれぞれから２つずつ有している。同様に、全ての個体は、ＨＬＡクラスＩＩ分子の個体自身の選択性を有し、さらに３つの群ＤＰ、ＤＱおよびＤＲそれぞれからの２つである。Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤＰ、ＤＱおよびＤＲ群は、それぞれさらにいくつかの亜群に分類される。異なるＨＬＡクラスＩ分子またはＨＬＡクラスＩＩ分子の数は、２つのＨＬＡ亜群の重複のために、減少する場合がある。
【００１８】
全ての遺伝子産物は、高度に多形性である。従って、個体が異なれば、個別のＨＬＡ分子が発現するが、この分子は他の個体のＨＬＡ分子とは異なる。これが、移植においてＨＬＡ適合器官を有するドナーを発見することの難しさの元となる。免疫生物学におけるＨＬＡ分子の遺伝的多様性の重要性は、免疫応答遺伝子としてのそれらの役割によって影響される。それらのペプチド結合能力により、特定のＨＬＡ分子の有無がペプチドエピトープに対する応答に対する個体の能力を支配する。結果として、ＨＬＡ分子は、疾患に対する抵抗性または感受性を決定する。
【００１９】
Ｔ細胞は、種々の機構によって癌の発症および成長を調節することができる。細胞傷害性Ｔ細胞、ＨＬＡクラスＩ拘束ＣＤ８+およびＨＬＡクラスＩＩ拘束ＣＤ４+は、適切な腫瘍抗原を保有する腫瘍細胞を直接死滅させることができる。ＣＤ４+ヘルパーＴ細胞は、細胞傷害性ＣＤ８+Ｔ細胞応答ならびに抗体応答、マクロファージおよびＬＡＫ細胞死滅の誘導に必要である。
【００２０】
ＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩ結合の双方に必要な要件は、通常、ペプチドが、様々なＨＬＡ群と亜群で異なる結合モチーフを含まなければならないということである。結合モチーフは、ＨＬＡ結合溝のポケットと厳密にはめ込まれるようにペプチドの限定的な位置で、特定の型のアミノ酸（例えば、巨大で、疎水性または正電荷の側鎖を保有するアミノ酸）に対する要件により特徴づけられる。この結果、結合溝内の８〜１０アミノ酸のペプチド長に制限されることを考えあわせると、ＨＬＡクラスＩ分子の１つの型へのペプチド結合は、別の型へも結合することはほとんど起こりそうにない。従って、例えば、クラスＩの種類に属するＨＬＡ−Ａ１およびＨＬＡ−Ａ２亜群のペプチド結合モチーフはＨＬＡ−Ａ１およびＨＬＡ−Ｂ１分子のモチーフと同じ程度に異なるのであろう。
【００２１】
同じ理由で、アミノ酸の同一の配列が異なるクラスＩＩ分子の結合溝に正確に位置する可能性は少ない。ＨＬＡクラスＩＩ分子の場合、ペプチドの結合配列は、より長くても良く、それらは通常１０〜１６アミノ酸を含むことが見出されており、そのいくつかは、一方または両方の末端で、ＨＬＡ溝の結合モチーフの一部ではない。
【００２２】
しかし、いくつかのＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩ分子の異なるペプチド結合モチーフの重複が起こり得る。少なくとも２つの異なるＨＬＡ分子の結合配列における重複を有するペプチドは、「ネスト化(nested)Ｔ細胞エピトープ」を含むといわれている。「ネスト化エピトープペプチド」に含まれる種々のエピトープは、抗原提示細胞によるペプチドのプロセシングによって形成され、その後異なるＨＬＡ分子に結合したＴ細胞に対して提示され得る。ヒトにおけるＨＬＡ分子の個体ごとの多様性は、ＨＬＡ分子の１つの型にのみ結合することができるペプチドよりも一般的なワクチンとして有用なネスト化エピトープを含むペプチドを作り出す。
【００２３】
個体への有効なワクチン接種は、患者のＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスＩＩ分子の少なくとも１つの型が全長でまたは患者自身の抗原提示細胞によってプロセシングされ切断されたかのいずれかのワクチンペプチドに結合することができる場合のみ達成することができる。
【００２４】
集団の大多数のための一般的なワクチンとしてのペプチドの有用性は、全長または抗原提示細胞によるプロセシング後のいずれかで結合することができる異なるＨＬＡ分子の数と共に増加する。
抗腫瘍ＣＤ４+および／またはＣＤ８+Ｔ細胞を産生するワクチンまたは抗癌剤として変異遺伝子によってコードされるタンパク質由来のペプチドの使用のために、目的の変異タンパク質を検索し、最終的に抗原提示細胞によるより短いペプチドに対するプロセシング後にＴ細胞を刺激することができるペプチドを同定することが必要である。
【００２５】
［先行技術］
本発明者らの国際出願ＰＣＴ／ＮＯ９２／０００３２（ＷＯ９２／１４７５６として公開）において、本発明者らは、プロトオンコジーンまたは腫瘍抑制遺伝子タンパク質と比較して点変異または転座を有するオンコジーンタンパク質産物の合成ペプチドおよびフラグメントを記載している。これらのペプチドは、癌細胞または他の抗原提示細胞によって提示されるプロセシングされたオンコジーンタンパク質フラグメントまたは腫瘍抑制遺伝子フラグメントに相当するか、それらを完全にカバーしているか、または、それらのフラグメントそのものであり、そして各個体における少なくとも１つの対立遺伝子によってＨＬＡ−ペプチド複合体として提示される。これらのペプチドはまた、プロセシングされＨＬＡ分子に提示された細胞によって産生された実際のオンコジーンタンパク質フラグメントに対して特異的なＴ細胞応答を誘導することも示されてきた。特に、本発明者らは、特定のアミノ酸位置（すなわち、１２位、１３位、および６１位）に点変異を有するｐ２１ｒａｓタンパク質由来のペプチドを記載した。これらのペプチドは、in vitroにおける癌細胞の増殖調節に有効であることが示されている。さらに、本ペプチドは、ワクチン接種または癌治療スキームにおけるこのようなペプチドの投与によって、変異ｐ２１ｒａｓオンコジーンタンパク質を保有する癌細胞に対して、ＣＤ４+Ｔ細胞免疫を惹起することが示された。その後、本発明者らは、これらのペプチドもまた、上記の投与によって変異ｐ２１ ｒａｓオンコジーンタンパク質を保有する癌細胞に対して、ＣＤ８+Ｔ細胞免疫を惹起することを示した。
【００２６】
しかし、上記のペプチドは、特定の癌（すなわち、プロトオンコジーンまたは腫瘍抑制遺伝子における点変異または転座を有するオンコジーンを含む癌）においてのみ有用である。従って、より一般的な範囲の癌に対して有効である抗癌治療またはワクチンが強く必要とされている。
【００２７】
一般に、腫瘍は、腫瘍細胞に見出された遺伝的変化に関して非常に不均一である。これは、癌ワクチンの潜在的な治療効果および予防強度は、ワクチンがＴ細胞免疫に惹起することができる標的数とともに増加することを意味する。複数の標的を有するワクチンはまた、原発性腫瘍由来の治療を回避する変異形による新規の腫瘍形成の危険性を減少させる。
【００２８】
［本発明によって解決される問題の定義］
癌に関連する変異を有する遺伝子を保有する腫瘍細胞および癌細胞に対して特異的Ｔ細胞応答および傷害性を引き起こす抗原性ペプチドに基づく新規の抗がん剤が必要とされつづけている。本発明は、複数の標的を有する抗癌ワクチン成分として癌と戦い予防するために使用することができる新規のペプチド供給に大いに貢献する。
【００２９】
本発明によって解決される別の問題は、遺伝性の癌の危険性の高い家系および群に属する個体に予防または治療を付与することができることである。遺伝性癌は、多くの場合、本発明において記載されているフレームシフト変異（すなわち、ミスマッチ修復遺伝子における変異）に感受性を有する遺伝子に関連する。今日、遺伝性癌を保有する危険性を診断することは可能であるが、癌の発症に対して適用可能な医薬的予防法は存在しない。
【００３０】
［発明の定義］
本発明の主要な目的は、Ｔ細胞を刺激するために使用することができる、癌細胞によって産生される変異タンパク質のペプチドフラグメントに対応するペプチドを得ることである。
【００３１】
本発明の別の主要な目的は、本発明のペプチドを用いて、in vivoまたはex vivoのいずれかで患者のＴ細胞を刺激することによって、患者に誘導することができるＴ細胞免疫に基づいた癌の治療法を開発することである。
【００３２】
本発明の第３の主要な目的は、変異遺伝子を保有する細胞に対して、細胞傷害性Ｔ細胞免疫を生じるＴ細胞を産生し活性化するために使用することができる、本発明のペプチドに対応するペプチドの全部または一部に基づいた、癌の確立を予防し、根絶させるワクチンを開発することである。
【００３３】
本発明の第４の主要な目的は、このような治療または予防の必要性から、本発明のすくなくとも１つのペプチドの投与を含む、ヒト個体に特異的に適用される抗癌治療または予防を設計することである。
本発明のこれらおよび他の目的は、添付の請求の範囲によって達成される。
【００３４】
フレームシフト変異によって早期の終止コドンが生じ、それによりタンパク質の大部分が欠失するので、一般に、フレームシフト変異を有するタンパク質は、免疫原性であると考えられており、従って免疫治療の標的であるとは考えられていなかった。このため、今回、腫瘍関連遺伝子におけるフレームシフト変異に起因する新規のペプチドの全ての群がこのようなフレームシフト変異を有する遺伝子を保有する癌細胞に対してＴ細胞応答を惹起するのに有用であることが見出されたことは驚くべきことである。
【００３５】
少なくとも５つの残基（例えば、８つのデオキシアデノシン塩基（ＡＡＡＡＡＡＡＡ））のモノヌクレオシド塩基反復配列または少なくとも４つのジヌクレオシド塩基単位（例えば、２つのデオキシアデノシン−デオキシシトシン単位（ＡＣＡＣ））のジヌクレオシド塩基反復配列を含む遺伝子は、フレームシフト変異に感受性を示す。フレームシフト変異は、それぞれ、反復配列における１つまたは２つのモノヌクレオシド塩基残基または１つまたは２つのジヌクレオシド塩基単位の挿入か、または反復配列における１つまたは２つのモノヌクレオシド塩基残基または１つまたは２つのジヌクレオシド塩基単位の欠失によって起こる。フレームシフト変換を有する遺伝子は、正常な遺伝子産物と比較して新規で全く異なるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする点変異に由来する。カルボキシル末端で新規のアミノ酸配列を有するこの変異タンパク質は、改変遺伝子を保有する全ての細胞に特異的である。
本明細書の残りの部分および本請求項では、フレームシフト変異ペプチドという名称は、このようなタンパク質およびそのペプチドフラグメントを含意する。
【００３６】
本発明によって、今回、ＨＬＡ分子の環境においてＴ細胞によって認識される腫瘍拒絶抗原を引き起こす癌細胞における遺伝子のフレームシフト変異から生じるこのような新規のタンパク質配列を見出した。
【００３７】
さらに、本発明によって、Ｔ細胞を産生するために使用することができる癌細胞の遺伝子におけるフレームシフト変異から生じる変異体タンパク質のフラグメントに対応するペプチドの群を見出した。従って、前記ペプチドはまた、上記のフレームシフト変異を有する遺伝子を保有する癌細胞に対して、Ｔ細胞活性化を惹起するために使用することができる。
これらのペプチドは、少なくとも８アミノ酸長であり、全長または抗原提示細胞によるプロセシング後のいずれかで、癌罹患ヒト患者における癌細胞によって産生される変異遺伝子産物またはそのフラグメントに相当する。
【００３８】
本発明のペプチドは、ａ）少なくとも８アミノ酸長であり、癌細胞遺伝子におけるフレームシフト変異体から生じる変異体タンパク質のフラグメントであることと、
ｂ）前記遺伝子によってコードされるタンパク質配列の変異体部分の少なくとも１つのアミノ酸からなることと、
ｃ）変異体配列のアミノ末端の前の正常な部分のタンパク質配列のカルボキシル末端由来の０〜１０個のアミノ酸を含み、前記遺伝子のフレームシフト変異によって産生する新規の終止コドンによって決定される変異体部分のタンパク質のカルボキシル末端にさらに伸長し得ることと、
ｄ）全長または抗原提示細胞によるプロセシング後のいずれかにおいて、Ｔ細胞応答を誘導することを特徴とする。
【００３９】
本発明のペプチドには、好ましくは、８〜２５、９〜２０、９〜１６、８〜１２または２０〜２５アミノ酸長が含まれる。これらには、例えば、９、１２、１３、１６、または２１アミノ酸を含むことができる。
本発明のペプチドは少なくとも９アミノ酸長（例えば、９〜１８アミノ酸長）であることが最も好ましいが、抗原提示細胞のプロセシング能力によって、より長いペプチドも本発明に大変に適している。従って、８個を超えるアミノ酸を含む場合、全アミノ酸配列を本発明のフレームシフト変異体ペプチドとして使用することができる。
【００４０】
さらに、本発明は、本発明の少なくとも１つのペプチドを、フレームシフト変異遺伝子によってコードされる変異体タンパク質に対するＴ細胞免疫を誘導するのに十分な量で、１回または複数回投与することからなる、遺伝子のフレームシフト変異に関連する癌の傾向がある患者のワクチン接種法に関する。
【００４１】
また、本発明は、少なくとも１つの本発明のペプチドを、癌細胞の遺伝子におけるフレームシフト変異から生じる変異タンパク質に対するＴ細胞免疫を誘導するのに十分な量で、１回または複数回投与することからなる、遺伝子のフレームシフト変異に関連する癌を罹患した患者の治療法に関する。
【００４２】
さらに、本発明によって、遺伝子におけるフレームシフト変異から生じるタンパク質フラグメントに相当する新規のペプチドの同定法が見出された。この方法は、１）少なくとも５つの残基のモノヌクレオシド塩基反復配列または少なくとも４つのジヌクレオシド塩基単位のジヌクレオシド塩基反復配列を有することによって、フレームシフト変異に感受性を有する癌細胞における遺伝子を同定するステップ、および
２）前記反復配列から１つのヌクレオシド塩基の残基または１つのジヌクレオシド塩基単位をそれぞれ取り除き、新規の終止コドンを含むまで、変化した遺伝子配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を同定するステップ、および／または
３）前記反復配列から２つのヌクレオシド塩基の残基または２つのジヌクレオシド塩基単位をそれぞれ取り除き、新規の終止コドンを含むまで、変化した遺伝子配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を同定するステップ、および／または
４）前記反復配列中の１つのヌクレオシド塩基の残基または１つのジヌクレオシド塩基単位をそれぞれ挿入し、新規の終止コドンを含むまで、変化した遺伝子配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を同定するステップ、および／または
５）前記反復配列中の２つのヌクレオシド塩基の残基または２つのジヌクレオシド塩基単位をそれぞれ挿入し、新規の終止コドンを含むまで、変化した遺伝子配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を同定するステップによって特徴づけられる。
【００４３】
従って、同定したペプチドが癌の治療または予防のための本発明の組成物および方法に使用可能であるかどうかを決定するために、
６）新規のペプチドが、全長または該ペプチドのより短いフラグメントのいずれかでＴ細胞を刺激することができるかどうかを決定するステップをさらに行うべきである。
必要に応じて、さらに
７）異なる主要ＨＬＡクラスＩ分子および／またはＨＬＡクラスＩＩ分子のネスト化エピトープを含むペプチドを決定するステップ
を追加することができる。
【００４４】
［発明の詳細な説明］
本明細書および請求項において、アミノ酸を、当該分野で既知の１文字記号で示す。
本発明のペプチドは、２つの異なる実施形態によって明示的に例示されるはずであり、癌は、特定の遺伝子（すなわち、ＢＡＸ遺伝子およびＴＧＦβＲＩＩ遺伝子）におけるフレームシフト変異に基づいて発症する。
【００４５】
Ｉ）ＢＡＸ遺伝子
ＢＡＸ遺伝子はアポトーシスの促進による細胞の生存または細胞死の調節に関与することが確認されている。ヒトＢＡＸ遺伝子には、コドン３８〜４１（ＡＴＧ ＧＧＧ ＧＧＧ ＧＡＧ）にわたる第３のエクソンにおける８つのデオキシグアノシン塩基（Ｇ８）の反復配列が含まれる。
【００４６】
このＧ８反復におけるフレームシフト変異（結腸癌細胞および前立腺細胞癌におけるＧ７（ＡＴＧ ＧＧＧ ＧＧＧ ＡＧＧ）およびＧ９（ＡＴＧ ＧＧＧ ＧＧＧ ＧＧＡ）反復が観察されている。これは、試験された症例の５０％以上で発生する（Rampino,N.et al.「Somatic frameshift mutations in the BAX gene in colon cancers of the microsatellite mutator phenotype（マイクロサテライト変異誘発遺伝子表現型の結腸癌におけるＢＡＸ遺伝子の体細胞性フレームシフト変異）」（Science、Washington DC、275、967〜969、1997））。改変ＢＡＸ遺伝子産物は、アポトーシスを促進することができず、従って更なる腫瘍の進行が可能になる。さらに、改変遺伝子産物は癌細胞にのみ見出されるので、特異的免疫治療の標的となる。
【００４７】
本発明によれば、ＢＡＸ遺伝子のフレームシフト変異から生じる形質転換ＢＡＸタンパク質産物に相当するペプチドは、改変ＢＡＸ遺伝子に関連する癌を罹患した患者の癌細胞に対して、免疫系（Ｔ細胞）の細胞性の武器の引き金を引く機能を有する抗癌治療剤またはワクチンとして使用することができる。
【００４８】
ＢＡＸ遺伝子のフレームシフト変異によって、正常なＢＡＸタンパク質と比較して、４１位で変化した配列の第１のアミノ酸を有する変異体ペプチド配列が生じる（表１、配列番号１〜配列番号４）。
【００４９】
表１
アミノ酸位置 41 51 61 71
正常 bax ペプチド ; EAPELALDPV PQDASTKKLS ECLKRIGDEL
DS...
配列番号 1(bax-1G); RHPSWPWTRC LRMRPPRS
配列番号 4(bax+2G); GRHPSWPWTR CLRMRPPRS
配列番号 2(bax-2G); GTRAGPGPGA SGCVHQEAER VSQAHRGRTG Q
配列番号 3(bax+1G); GGTRAGPGPG ASGCVHQEAE RVSQAHRGRT GQ
【００５０】
表２は、本発明によるペプチドの１つの群を示す。
表２
配列番号 5: IQDRAGRMGGRHPSWPWTRCLRMRPPRS
配列番号 6: IQDRAGRMGGGRHPSWPWT
配列番号 7: IQDRAGRMGGGGTRAGPGPGASGCVHQEAERVSQAHRGRTGQ
配列番号 8: IQDRAGRMGGGTRAGPGPG
【００５１】
表３に列挙したペプチドは、変異体ＢＡＸペプチドを認識するＴ細胞のin vitro産生に使用した。
表３
配列番号 1: RHPSWPWTRCLRMRPPRS
配列番号 9: IQDRAGRMGGRHPSWPWTRCLR
配列番号 6: IQDRAGRMGGGRHPSWPWT
配列番号10: ASGCVHQEAERVSQAHRGRTGQ
配列番号11: GGTRAGPGPGASGCVHQEAERV
配列番号12: IQDRAGRMGGGGTRAGPGPGAS
配列番号 8: IQDRAGRMGGGTRAGPGPG
【００５２】
本発明のこの実施形態による最も好ましいペプチドを、表４に列挙する。
表４
配列番号 1: RHPSWPWTRCLRMRPPRS
配列番号 2: GTRAGPGPGASGCVHQEAERVSQAHRGRTGQ
配列番号 3: GGTRAGPGPGASGCVHQEAERVSQAHRGRTGQ
配列番号 4: GRHPSWPWTRCLRMRPPRS
配列番号 5: IQDRAGRMGGRHPSWPWTRCLRMRPPRS
配列番号 6: IQDRAGRMGGGRHPSWPWT
配列番号 7: IQDRAGRMGGGGTRAGPGPGASGCVHQEAERVSQAHRGRTGQ
配列番号 8: IQDRAGRMGGGTRAGPGPG
配列番号 9: IQDRAGRMGGRHPSWPWTRCLR
配列番号10: ASGCVHQEAERVSQAHRGRTGQ
配列番号11: GGTRAGPGPGASGCVHQEAERV
配列番号12: IQDRAGRMGGGGTRAGPGPGAS
【００５３】
２）ＴＧＦβＲＩＩ
ＴＧＦβＲＩＩ遺伝子は細胞増殖の調節に関与していることが確認されている。ＴＧＦβＲＩＩは、細胞増殖の下方制御するＴＧＦβのレセプターである。ＴＧＦβＲＩＩをコードするヒト遺伝子には、塩基番号７０９〜塩基番号７１８（ＧＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＧ ＣＣＴ）の１０個のデオキシアデノシン塩基（Ａ１０）の反復配列が含まれる。結腸癌および膵臓癌において、このＡ１０反復におけるフレームシフト変異（Ａ９（ＧＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＧＣ ＣＴ）およびＡ１１（ＧＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＧＣＣ）反復が見出されており、試験された症例の約８０％で発生する（Yamamoto,H.「Somatic frameshift mutations in DNA mismatch repair and proapoptosis genes in hereditary nonpolyposis colorectal cancer（ＤＮＡミスマッチ修復における体細胞性フレームシフト変異および遺伝性非ポリープ性結腸直腸癌における前アポトーシス遺伝子）」、Cancer Research、58、997〜1003、March 1、1998）。改変ＴＧＦβＲＩＩ遺伝子産物は、ＴＧＦβに結合することができず、細胞増殖の下方制御のシグナルが除去されており、従って、更なる腫瘍の進行が可能になる。さらに、改変遺伝子産物は癌細胞にのみ見出されるので、免疫治療の標的となる。
【００５４】
その結果、ＴＧＦβＲＩＩ遺伝子のフレームシフト変異から生じる形質転換ＴＧＦβＲＩＩタンパク質産物に相当するペプチドは、改変ＴＧＦβＲＩＩ遺伝子に関連する癌を罹患した患者の癌細胞に対して、免疫系（Ｔ細胞）の細胞性の武器の引き金を引く機能を有する抗癌治療剤またはワクチンとして使用することができる。
【００５５】
ＴＧＦβＲＩＩ遺伝子のフレームシフト変異によって、正常なＴＧＦβＲＩＩタンパク質と比較して、１３３位で変化した配列（１塩基および２塩基欠失）または１３４位で変化した配列（１塩基および２塩基挿入）の第１のアミノ酸を有する変異体ペプチド配列が生じる（表５、配列番号１３および配列番号２１）。
表５
アミノ酸位置 133
正常 TGFβRII ; K PGETFFMCSC SSDECNDNII FSEEYNTSNP
DLLL
配列番号13(-1A); S LVRLSSCVPV ALMSAMTTSS SQKNITPAIL TCC
配列番号13(+2A); SLVRLSSCVP VALMSAMTTS SSQKNITPAI
LTCC
TGFbRII + 1A) ; AW
TGFbRII - 2A) ; A W
【００５６】
表６は、本発明のペプチドの１つの群を示す。
表６
配列番号14:SPKCIMKEKKSLVRLSSCVPVALMSAMTTSSSQKNITPAILTCC
配列番号15:PKCIMKEKKKSLVRLSSCV
配列番号19:SPKCIMKEKKAW
配列番号20:PKCIMKEKKKAW
【００５７】
表７は、変異体ＴＧＦβＲＩＩペプチドを認識するＴ細胞のin vitro産生に使用したペプチドを示す。
表７
配列番号 15: PKCIMKEKKKSLVRLSSCV
配列番号 16: ALMSAMTTSSSQKNITPAILTCC
配列番号 17: SLVRLSSCVPVALMSAMTTSSSQ
配列番号 18: SPKCIMKEKKSLVRLSSCVPVA
配列番号 19: SPKCIMKEKKAW
配列番号 20: PKCIMKEKKKAW
配列番号 21: AMTTSSSQKNITPAILTCC
配列番号428: SLVRLSSCV
【００５８】
本発明の本実施形態の最も好ましいペプチドを、以下に示す。
表８
配列番号 13:SLVRLSSCVPVALMSAMTTSSSQKNITPAILTCC
配列番号 14:SPKCIMKEKKSLVRLSSCVPVALMSAMTTSSSQKNITPAILTCC
配列番号 15:PKCIMKEKKKSLVRLSSCV
配列番号 16:ALMSAMTTSSSQKNITPAILTCC
配列番号 17:SLVRLSSCVPVALMSAMTTSSSQ
配列番号 18:SPKCIMKEKKSLVRLSSCVPVA
配列番号 19:SPKCIMKEKKAW
配列番号 20:PKCIMKEKKKAW
配列番号 21:AMTTSSSQKNITPAILTCC
配列番号428:SLVRLSSCV
【００５９】
本発明の他のペプチドは、上記の表１〜表８に列挙したペプチドのフラグメントであり得る。このようなフラグメントは、９〜１６アミノ酸長であることが最も好ましく、タンパク質の変異体部分由来の少なくとも１つのアミノ酸を含む。
本明細書中および請求項で使用される用語「フラグメント」は、より長いペプチドまたはタンパク質のより短い部分を示すことが意図されている。
ヌクレオシド塩基の反復配列を含み、それによりフレームシフト変異に感受性を示し、その結果、本発明のペプチドの潜在的な候補である他の癌関連遺伝子（表９の配列番号は、各場合において、括弧内に示す）を以下に示す。
【００６０】
ヒトＴＧＦβ２（ｈＴＧＦβ２）遺伝子（配列番号２２〜配列番号２９）、
結腸直腸癌欠失（ＤＣＣ）遺伝子（配列番号３０〜配列番号３４）、
ヒト乳卵巣癌感受性（ＢＲＣＡ１）遺伝子（配列番号３７８〜配列番号３８７）、
ヒト乳癌感受性（ＢＲＣＡ２）遺伝子（配列番号３５〜配列番号９４）、
ヒトタンパク質チロシンホスファターゼ（ｈＰＴＰ）遺伝子（配列番号９５〜配列番号１０２）、
ヒトＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ（ｔｏｐ２）遺伝子（配列番号１０３〜配列番号１０８）
ヒトキナーゼ（ＴＴＫ）遺伝子（配列番号１０９〜配列番号１２０）
ヒト転写抑制（ＣＴＣＦ）遺伝子（配列番号１２１〜配列番号１２７）、
ヒトＦＡＤＤ−相同性ＩＣＥ／ＣＥＤ−３様プロテアーゼ遺伝子（配列番号１２８〜配列番号１３３）、
ヒト推定ミスマッチ修復／結合タンパク質（ｈＭＳＨ３）遺伝子（配列番号１３４〜配列番号１４７）、
ヒト網膜芽細胞腫結合タンパク質１アイソフォームＩ（ｈＲＢＰ１）遺伝子（配列番号１４８〜配列番号１５８）、
ヒトＦＭＲ１（ｈＦＭＲ１）遺伝子（配列番号１５７〜配列番号１６１）、
ヒトＴＩＮＵＲ遺伝子（配列番号１６２〜１６９）
ｂ−ｒａｆオンコジーン（配列番号１７０〜配列番号１７５）、
ヒトニューロフィブロミン（ＮＦ１）遺伝子（配列番号１７６〜配列番号１８１）、
【００６１】
ヒト生殖系列ｎ−ｍｙｃ遺伝子（配列番号１８２〜配列番号１８８）、
ヒトｎ−ｍｙｃ遺伝子（配列番号１８９〜配列番号１９４）、
ヒトｒａｓ抑制遺伝子（配列番号１９５〜配列番号１９９）、
ヒトｈＭＳＨ６遺伝子（配列番号２００〜配列番号２０３および配列番号２９３〜配列番号２９７）、
ヒト上咽頭癌ＥＢＶ ＢＮＬＦ−１遺伝子（配列番号２０４〜配列番号２１０）、
ヒト細胞周期調節タンパク質（Ｅ１Ａ結合タンパク質）ｐ３００遺伝子（配列番号２１１〜配列番号２１８）、
ヒトＢ細胞リンパ種３コードタンパク質（ｂｃｌ−３）遺伝子（配列番号２１９〜配列番号２２６）、
ヒト形質転換成長因子−β誘導遺伝子産物（ＢＩＧＨ３）（配列番号２２７〜配列番号２３２）、
ヒト転写因子ＥＴＶ１遺伝子（配列番号２３３〜配列番号２３９）、
ヒトインシュリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ４）遺伝子（配列番号２４０〜配列番号２４６）、
ヒトＭＵＣ１遺伝子（配列番号２４７〜配列番号２６６）、
ヒトタンパク質−チロシンキナーゼ（ＪＡＫ１）遺伝子（配列番号２６７〜配列番号２７１）、
ヒトタンパク質−チロシンキナーゼ（ＪＡＫ３）遺伝子（配列番号２７２〜配列番号２７９）、
（膜貫通チロシナーゼキナーゼの）ヒトＦｌｔ４遺伝子（配列番号２８０〜配列番号２８４）、
ヒトｐ５３関連遺伝子（配列番号２８５〜配列番号２９２）、
ヒトｃａｎ（ｈＣＡＮ）遺伝子（配列番号２９８〜配列番号３００）、
ヒトＤＢＬ（ｈＤＢＬ）プロトオンコジーン／ヒトＭＣＦ２ＰＯ（ｈＭＣＦ２ＰＯ）遺伝子（配列番号３０１〜配列番号３０６）、
ヒトｄｅｋ（ｈＤＥＫ）遺伝子（配列番号３０７〜配列番号３０９）、
ヒト網膜芽細胞腫関連タンパク質（ｐ１０７）遺伝子（配列番号３１０〜配列番号３１３）、
【００６２】
ヒトＧタンパク質結合レセプター（ｈＧＰＲ１）遺伝子（配列番号３１４〜配列番号３１９）、
ヒト推定ＲＮＡ結合タンパク質（ｈＲＢＰ５６）遺伝子（配列番号３２０〜配列番号３２５）、
ヒト転写因子（ｈＩＴＦ−２）遺伝子（配列番号３２６〜配列番号３２７）、
ヒト悪性黒色腫転移抑制（ｈＫｉＳＳ−１）遺伝子（配列番号３２８〜配列番号３３４）、
ヒトテロメラーゼ関連タンパク質ＴＰ−１（ｈＴＰ−１）遺伝子（配列番号３３５〜配列番号３４８）、
ヒトＦＤＦ−５（ｈＦＤＦ−５）遺伝子（配列番号３４９〜配列番号３５６）、
ヒト転移関連ｍｔａ１（ｈＭＴＡ１）遺伝子（配列番号３５７〜配列番号３６２）、
ヒト転写因子ＴＦＩＩＢの９０ｋＤａサブユニット（ｈＴＦＢＩＩＢ９０）遺伝子（配列番号３６３〜配列番号３６９）、
ヒト腫瘍抑制（ｈＬＵＣＡ−１）遺伝子（配列番号３７０〜配列番号３７７）、
ヒトウィルムス腫瘍（ＷＩＴ−１）関連タンパク質（配列番号３８８〜配列番号３９３）、
ヒトシステインプロテアーゼ（ＩＣＥｒｅｌ−ＩＩＩ）遺伝子（配列番号３９４〜配列番号３９８および配列番号４５９）、
ヒトＦａｓリガンド（ＦａｓＬ）遺伝子（配列番号３９９〜配列番号４０３）、
ヒトＢＲＣＡ１関連ＲＩＮＧドメインタンパク質（ＢＡＲＤ１）遺伝子（配列番号４０４〜配列番号４１７）、
ヒトｍｃｆ．２（ｈＭＣＦ．２）遺伝子（配列番号４１８〜配列番号４２２）、
ヒトＦａｓ抗原（ｆａｓ）遺伝子（配列番号４２３〜配列番号４２７）、
ヒトＤＰＣ４遺伝子（配列番号４２９〜配列番号４３７）。
【００６３】
本発明に関するこれらの遺伝子のフレームシフト変異の結果である変異体ペプチドを、表９に列挙する。
【００６４】
表９
配列番号 22; TVGRPHISC
配列番号 23; KTVGRPHISC
配列番号 24; KQWEDPTSPANVIALLQT
配列番号 25; QWEDPTSPANVIALLQT
配列番号 26; QKTIKSTRKKTVGRPHISC
配列番号 27; QKTIKSTRKKKTVGRPHISC
配列番号 28; QKTIKSTRKKKQWEDPTSPANVIALLQT
配列番号 29; QKTIKSTRKKQWEDPTSPANVIALLQT
配列番号 30; AADLQQQFVHFLDCWDVSSIPFTLHLPQAQDITT
配列番号 31; GKDAKEKSS
配列番号 32; GKDAKEKKSS
配列番号 33; GKDAKEKKAADLQQQFVHFLDCWDVSSIPFTLHLPQAQDITT
配列番号 34; GKDAKEKAADLQQQFVHFLDCWDVSSIPFTLHLPQAQDITT
配列番号 35; FSMKQTLMNVKNLKTK
配列番号 36; KFSMKQTLMNVKNLKTK
配列番号 37; VRTSKTRKKFSMKQTLMNVKNLKTK
配列番号 38; VRTSKTRKKKFSMKQTLMNVKNLKTK
配列番号 39; VRTSKTRKKNFP
配列番号 40; VRTSKTRKNFP
配列番号 41; IKKKLLQFQK
配列番号 42; KIKKKLLQFQK
配列番号 43; KSRRNYFNFKNNCQSRL
配列番号 44; SRRNYFNFKNNCQSRL
配列番号 45; TNLRVIQKIKKKLLQFQK
配列番号 46; TNLRVIQKKIKKKLLQFQK
配列番号 47; TNLRVIQKKSRRNYFNFKNNCQSRL
配列番号 48; TNLRVIQKSRRNYFNFKNNCQSRL
配列番号 49; KIMIT
配列番号 50; NIDKIPEKIMIT
配列番号 51; NIDKIPEKKIMIT
配列番号 52; IINAN
配列番号 53; KIINAN
配列番号 54; NDKTVSEKIINAN
配列番号 55; NDKTVSEKKIINAN
配列番号 56; NGLEKEYLMVNQKE
配列番号 57; SQTSLLEAKNGLEKEYLMVNQKE
配列番号 58; SQTSLLEAKKNGLEKEYLMVNQKE
配列番号 59; SQTSLLEAKKMA
配列番号 60; SQTSLLEAKMA
配列番号 61; TLVFPK
配列番号 62; KTLVFPK
配列番号 63; LKNVEDQKTLVFPK
配列番号 64; LKNVEDQKKTLVFPK
配列番号 65; LKNVEDQKKH
配列番号 66; LKNVEDQKH
配列番号 67; KKIQLY
配列番号 68; KKKIQLY
配列番号 69; RKRFSYTEYLASIIRFIFSVNRRKEIQNLSSCNFKI
配列番号 70; LRIVSYSKKKKIQLY
【００６５】
配列番号 71; LRIVSYSKKKKKIQLY
配列番号 72; LRIVSYSKKRKRFSYTEYLASIIRFIFSVNRRKEIQNLS-
-SCNFKI
配列番号 73; LRIVSYSKRKRFSYTEYLASIIRFIFSVNRRKEIQNLS-
-SCNFKI
配列番号 74; QDLPLSSICQTIVTIYWQ
配列番号 75; KQDLPLSSICQTIVTIYWQ
配列番号 76; NRTCPFRLFVRRMLQFTGNKVLDRP
配列番号 77; GFVVSVVKKQDLPLSSICQTIVTIYWQ
配列番号 78; GFVVSVVKKKQDLPLSSICQTIVTIYWQ
配列番号 79; GFVVSVVKKNRTCPFRLFVRRMLQFTGNKVLDRP
配列番号 80; GFVVSVVKNRTCPFRLFVRRMLQFTGNKVLDRP
配列番号 81; YRKTKNQN
配列番号 82; KYRKTKNQN
配列番号 83; NTERPKIRTN
配列番号 84; DETFYKGKKYRKTKNQN
配列番号 85; DETFYKGKKKYRKTKNQN
配列番号 86; DETFYKGKKNTERPKIRTN
配列番号 87; DETFYKGKNTERPKIRTN
配列番号 88; LSINNYRFQMKFYFRFTSHGSPFTSANF
配列番号 89; KLSINNYRFQMKFYFRFTSHGSPFTSANF
配列番号 90; NSVSTTTGFR
配列番号 91; NIQLAATKKLSINNYRFQMKFYFRFTSHGSPFTSANF
配列番号 92; NIQLAATKKKLSINNYRFQMKFYFRFTSHGSPFTSANF
配列番号 93; NIQLAATKKNSVSTTTGFR
配列番号 94; NIQLAATKNSVSTTTGFR
配列番号 95; MEHVAPGRMSASPQSPTQ
配列番号 96; KMEHVAPGRMSASPQSPTQ
配列番号 97; KWSTWLQAECQHLHSPQRSDKPQQAGLDQQHHCFALDS-
-SPGPRPVFLQLLGLMGQGRHD
配列番号 98; WSTWLQAECQHLHSPQRSDKPQQAGLDQQHHCFALDS-
-SPGPRPVFLQLLGLMGQGRHD
配列番号 99; TFSVWAEKMEHVAPGRMSASPQSPTQ
配列番号100; TFSVWAEKKMEHVAPGRMSASPQSPTQ
配列番号101; TFSVWAEKKWSTWLQAECQHLHSPQRSDKPQQAGLDQ-
-QHHCFALDSSPGPRPVFLQLLGLMGQGRHD
配列番号102; TFSVWAEKWSTWLQAECQHLHSPQRSDKPQQAGLDQ-
-QHHCFALDSSPGPRPVFLQLLGLMGQGRHD
配列番号103; HKWLKFCLLRLVKESFHE
配列番号104; KHKWLKFCLLRLVKESFHE
配列番号105; KGGKAKGKKHKWLKFCLLRLVKESFHE
配列番号106; KGGKAKGKKKHKWLKFCLLRLVKESFHE
配列番号107; KGGKAKGKKNTNG
配列番号108; KGGKAKGKNTNG
配列番号109; VNNFFKKL
配列番号110; KVNNFFKKL
配列番号111; LSQGNVKKVNNFFKKL
配列番号112; LSQGNVKKKVNNFFKKL
配列番号113; GEKNDLQLFVMSDRRYKIYWTVILLNPCGNLHLKTTSL
配列番号114; KGEKNDLQLFVMSDRRYKIYWTVILLNPCGNLHLKTTSL
配列番号115; KGKKMICSYS
配列番号116; GKKMICSYS
配列番号117; SSKTFEKKGEKNDLQLFVMSDRRYKIYWTVILLNPCGN-
-LHLKTTSL
配列番号118; SSKTFEKKKGEKNDLQLFVMSDRRYKIYWTVILLNPCGN-
-LHLKTTSL
配列番号119; SSKTFEKKKGKKMICSYS
配列番号120; SSKTFEKKGKKMICSYS
【００６６】
配列番号121; QRKPKRANCVIQRRAKM
配列番号122; KQRKPKRANCVIQRRAKM
配列番号123; NKENQKEQTALLYRGGQRCRCVCLRF
配列番号123; NKENQKEQTALLYRGGQRCRCVCLRF
配列番号124; PDYQPPAKKQRKPKRANCVIQRRAKM
配列番号125; PDYQPPAKKKQRKPKRANCVIQRRAKM
配列番号126; PDYQPPAKKNKENQKEQTALLYRGGQRCRCVCLRF
配列番号127; PDYQPPAKNKENQKEQTALLYRGGQRCRCVCLRF
配列番号128; NLSSLLI
配列番号129; TCLPF
配列番号130; QPTFTLRKNLSSLLI
配列番号131; QPTFTLRKKNLSSLLI
配列番号132; QPTFTLRKKTCLPF
配列番号133; QPTFTLRKTCLPF
配列番号134; RATFLLSLWECSLPQARLCLIVSRTGLLVQS
配列番号135; GQHFYWHCGSAACHRRGCV
配列番号136; KENVRDKKRATFLLSLWECSLPQARLCLIVSRTGLLVQS
配列番号137; KENVRDKKKRATFLLSLWECSLPQARLCLIVSRTGLLVQS
配列番号138; KENVRDKKKGQHFYWHCGSAACHRRGCV
配列番号139; KENVRDKKGQHFYWHCGSAACHRRGCV
配列番号140; ITHTRWGITTWDSWSVRMKANWIQAQQNKSLILSPSFTK
配列番号141; KITHTRWGITTWDSWSVRMKANWIQAQQNKSLILSPSFTK
配列番号142; KLLTPGGELPHGILGQ
配列番号143; LLTPGGELPHGILGQ
配列番号144; PPVCELEKITHTRWGITTWDSWSVRMKANWIQAQQNKS-
-LILSPSFTK
配列番号145; PPVCELEKKITHTRWGITTWDSWSVRMKANWIQAQQNKS-
-LILSPSFTK
配列番号146; PPVCELEKKLLTPGGELPHGILGQ
配列番号147; PPVCELEKLLTPGGELPHGILGQ
配列番号148; SLKDELEKMKI
配列番号149; SLKDELEKKMKI
配列番号150; LGQSSPEKKNKN
配列番号151; LGQSSPEKNKN
配列番号152; RLRRINGRGSQIRSRNAFNRSEE
配列番号153; EPKVKEEKKT
配列番号154; EPKVKEEKKKT
配列番号155; EPKVKEEKKRLRRINGRGSQIRSRNAFNRSEE
配列番号156; EPKVKEEKRLRRINGRGSQIRSRNAFNRSEE
配列番号157; TFRYKGKQHPFFST
配列番号158; GPNAPEEKNH
配列番号159; GPNAPEEKKNH
配列番号160; GPNAPEEKKTFRYKGKQHPFFST
配列番号161; GPNAPEEKTFRYKGKQHPFFST
配列番号162; MQNTCV
配列番号163; KMQNTCV
配列番号164; KCKIRVFSK
配列番号165; CKIRVFSK
配列番号166; FFKRTVQKMQNTCV
配列番号167; FFKRTVQKKMQNTCV
配列番号168; FFKRTVQKKCKIRVFSK
配列番号169; FFKRTVQKCKIRVFSK
配列番号170; LPHYLAH
【００６７】
配列番号171; CLITWLTN
配列番号172; GSTTGLSATPLPHYLAH
配列番号173; GSTTGLSATPPLPHYLAH
配列番号174; GSTTGLSATPPCLITWLTN
配列番号175; GSTTGLSATPCLITWLTN
配列番号176; RFADKPRPN
配列番号177; DLPTSPDQTRSGPVHVSVEP
配列番号178; DSAAGCSGTPRFADKPRPN
配列番号179; DSAAGCSGTPPRFADKPRPN
配列番号180; DSAAGCSGTPPDLPTSPDQTRSGPVHVSVEP
配列番号181; DSAAGCSGTPDLPTSPDQTRSGPVHVSVEP
配列番号182; AHPETPAQNRLRIPCSRREVRSRACKPPGAQGSDER-
-RGKASPGRDCDVRTGRP
配列番号183; PAHPETPAQNRLRIPCSRREVRSRACKPPGAQGSDER-
-RGKASPGRDCDVRTGRP
配列番号184; RPTRRHPRRIASGSPAVGGR
配列番号185; VAIRGHPRPPAHPETPAQNRLRIPCSRREVRSRACKP-
-PGAQGSDERRGKASPGRDCDVRTGRP
配列番号186; VAIRGHPRPPPAHPETPAQNRLRIPCSRREVRSRACKP-
-PGAQGSDERRGKASPGRDCDVRTGRP
配列番号187; VAIRGHPRPPRPTRRHPRRIASGSPAVGGR
配列番号188; VAIRGHPRPRPTRRHPRRIASGSPAVGGR
配列番号189; RGRTSGRSLSCCRRPRCRPAVASRSTAPSPRAGSR-
-RCCLRTSCGAARPRRTRSACGDWVASPPTRSS-
-SRTACGAASPPARSWSAP
配列番号190; GGGHLEEV
配列番号191; YFGGPDSTPRGRTSGRSLSCCRRPRCRPAVASR-
-STAPSPRAGSRRCCLRTSCGAARPRRTRSACGD-
-WVASPPTRSSSRTACGAASPPARSWSAP
配列番号192; YFGGPDSTPPRGRTSGRSLSCCRRPRCRPAVASR-
-STAPSPRAGSRRCCLRTSCGAARPRRTRSACGDW-
-VASPPTRSSSRTACGAASPPARSWSAP
配列番号193; YFGGPDSTPPGGGHLEEV
配列番号194; YFGGPDSTPGGGHLEEV
配列番号195; HRVADP
配列番号196; LSQSSELDPPSSR
配列番号197; LSQSSELDPPPSSR
配列番号198; LSQSSELDPPHRVADP
配列番号199; LSQSSELDPHRVADP
配列番号200; VILLPEDTPPS
配列番号201; VILLPEDTPPPS
配列番号202; VILLPEDTPPLLRA
配列番号203; VILLPELDPLLRA
配列番号204; PSPLP
配列番号205; PLLFHRPCSPSPALGATVLAVYRYE
配列番号206; LLFHRPCSPSPALGATVLAVYRYE
配列番号207; APRPPLGPPSPLP
配列番号208; APRPPLGPPPSPLP
配列番号209; APRPPLGPPPLLFHRPCSPSPALGATVLAVYRYE
配列番号210; APRPPLGPPLLFHRPCSPSPALGATVLAVYRYE
配列番号211; TQVLPQGCSLSLLHTTFPHRQVPHILDW
配列番号212; PTQVLPQGCSLSLLHTTFPHRQVPHILDW
配列番号213; PLQSFPKDAASAFSTPRFPTDKFPTSWTGSCPGQPHGT-
-RAFCQPGPEFNAFSAC
配列番号214; LQSFPKDAASAFSTPRFPTDKFPTSWTGSCPGQPHGT-
-RAFCQPGPEFNAFSAC
配列番号215; PSPRPQSQPPTQVLPQGCSLSLLHTTFPHRQVPHILDW
配列番号216; PSPRPQSQPPPTQVLPQGCSLSLLHTTFPHRQVPHILDW
配列番号217; PSPRPQSQPPPLQSFPKDAASAFSTPRFPTDKFPTS-
-WTGSCPGQPHGTRAFCQPGPEFNAFSAC
配列番号218; PSPRPQSQPPLQSFPKDAASAFSTPRFPTDKFPTS-
-WTGSCPGQPHGTRAFCQPGPEFNAFSAC
配列番号219; TAWPGRRRFTTPEPYCLCTPLGPWAPRFLW
配列番号220; PTAWPGRRRFTTPEPYCLCTPLGPWAPRFLW
【００６８】
配列番号221; PRPGPAGGALLPRSLTAFVPHSGHGLPVSSGEPAYTPIP-
-HDVPHGTPPFC
配列番号222; RPGPAGGALLPRSLTAFVPHSGHGLPVSSGEPAYTPIPH-
-DVPHGTPPFC
配列番号223; DLPAVPGPPTAWPGRRRFTTPEPYCLCTPLGPWAPRFLW
配列番号224; DLPAVPGPPPTAWPGRRRFTTPEPYCLCTPLGPWAPRFLW
配列番号225; DLPAVPGPPPRPGPAGGALLPRSLTAFVPHSGHGLPVSSG-
-EPAYTPIPHDVPHGTPPFC
配列番号226; DLPAVPGPPRPGPAGGALLPRSLTAFVPHSGHGLPVSSG-
-EPAYTPIPHDVPHGTPPFC
配列番号227; QWGLSWMS
配列番号228; NGDCHGCPEGRQSL
配列番号229; FTMDRVLTPQWGLSWMS
配列番号230; FTMDRVLTPPQWGLSWMS
配列番号231; FTMDRVLTPPNGDCHGCPEGRQSL
配列番号232; FTMDRVLTPNGDCHGCPEGRQSL
配列番号233; HHPARQCPHCIMHLQTQLIHRNLTGPSQLTSLHRS-
-PYQIAATPWTTDFAASFFLNPVTPFLLCRRCQGKDV-
-LCTNARCLSQTSPSHHKALSRTTTQCMNT-
-TPWLAVRPAKAFPLL
配列番号234; PHHPARQCPHCIMHLQTQLIHRNLTGPSQLTSLHRS-
-PYQIAATPWTTDFAASFFLNPVTPFLLCRRCQGK-
-DVLCTNARCLSQTSPSHHKALSRTTTQCMNTTP-
-WLAVRPAKAFPLL
配列番号235; HTIQHASVPTASCISKLNSYTEN
配列番号236; PQVGMRPSNPPHHPARQCPHCIMHLQTQLIHRNLT-
-GPSQLTSLHRSPYQIAATPWTTDFAASFFLNPVTPFL-
-LCRRCQGKDVLCTNARCLSQTSPSHHKALSRTTTQC-
-MNTTPWLAVRPAKAFPLL
配列番号237; PQVGMRPSNP PPHHPARQCPHCIMHLQTQLIHRNLTGPS-
-QLTSLHRSPYQIAATPWTTDFAASFFLNPVTPFLLCRRC-
-QGKDVLCTNARCLSQTSPSHHKALSRTTTQCMNTTPWLA-
-VRPAKAFPLL
配列番号238; PQVGMRPSNPPHTIQHASVPTASCISKLNSYTEN
配列番号239; PQVGMRPSNPHTIQHASVPTASCISKLNSYTEN
配列番号240; WAARSWCERRAAAVAPLAPWAWGCPAGCTPPVAARAC-
-AATRPEGWRSPCTH
配列番号241; PWAARSWCERRAAAVAPLAPWAWGCPAGCTPPVAA-
-RACAATRPEGWRSPCTH
配列番号242; RGLRGAGARGGLRLLRHLRPGLGDALRGVHPPLR-
-LGPALLPAPRGGEAPAHTDARARRVHGAGGDRGHPGPAAL
配列番号243; EEKLARCRPPWAARSWCERRAAAVAPLAPWAWGCPAGC-
-TPPVAARACAATRPEGWRSPCTH
配列番号244; EEKLARCRPPPWAARSWCERRAAAVAPLAPWAWGCPA-
-GCTPPVAARACAATRPEGWRSPCTH
配列番号245; EEKLARCRPPRGLRGAGARGGLRLLRHLRPGLGDA-
-LRGVHPPLRLGPALLPAPRGGEAPAHTDARARRVHGAGG-
-DRGHPGPAAL
配列番号246; EEKLARCRPRGLRGAGARGGLRLLRHLRPGLGDALRG-
-VHPPLRLGPALLPAPRGGEAPAHTDARARRVHGAGG-
-DRGHPGPAAL
配列番号247; QPPVSPRPRRPGRPRAPPPPQPMVSPRRRTTGPPW-
-RPPPLQSTMSPPPQALHQAQLLLWCTTAPLPGLPQPQ-
-PARALHSQFPATTLILLPPLPAIAPRLMPVALTIARYL-
-LSPPPITALLPSCLLGSLSFSCLFTFQTSSLIPLW-
-KIPAPTTTKSCRETFLKW
配列番号248; SPGCHLGPGDQAAPGLHRPPSPWCHLGAGQQARLGVHR-
-PSSPQCHLGLRLCIRLSFYSGAQRHLCQGYHNPSQQEHS-
-ILNSQPPL
配列番号249; KPAPGSTAPQPPVSPRPRRPGRPRAPPPPQPMVSPRR-
-RTTGPPWRPPPLQSTMSPPPQALHQAQLLLWCTTAP-
-LPGLPQPQPARALHSQFPATTLILLPPLPAIAPRLMPVA-
-LTIARYLLSPPPITALLPSCLLGSLSFSCLFTFQTS-
-SLIPLWKIPAPTTTKSCRETFLKW
配列番号250; KPAPGSTAPPQPPVSPRPRRPGRPRAPPPPQPMVSPR-
-RRTTGPPWRPPPLQSTMSPPPQALHQAQLLLWCT-
-TAPLPGLPQPQPARALHSQFPATTLILLPPLPAIAP-
-RLMPVALTIARYLLSPPPITALLPSCLLGSLSFSCLF-
-TFQTSSLIPLWKIPAPTTTKSCRETFLKW
配列番号251; KPAPGSTAPPSPGCHLGPGDQAAPGLHRPPSPWCHL-
-GAGQQARLGVHRPSSPQCHLGLRLCIRLSFYSGA-
-QRHLCQGYHNPSQQEHSILNSQPPL
配列番号252; KPAPGSTAPSPGCHLGPGDQAAPGLHRPPSPWCHL-
-GAGQQARLGVHRPSSPQCHLGLRLCIRLSFYSGAQ-
-RHLCQGYHNPSQQEHSILNSQPPL
配列番号253; QPMVSPRRRTTGPPWRPPPLQSTMSPPPQALHQAQL-
-LLWCTTAPLPGLPQPQPARALHSQFPATTLILLPPLP-
-AIAPRLMPVALTIARYLLSPPPITALLPSCLLGSL-
-SFSCLFTFQTSSLIPLWKIPAPTTTKSCRETFLKW
配列番号254; SPWCHLGAGQQARLGVHRPSSPQCHLGLRLCIRLSF-
-YSGAQRHLCQGYHNPSQQEHSILNSQPPL
配列番号255; RPPPGSTAPQPMVSPRRR
配列番号256; RPPPGSTAPPQPMVSPRRR
配列番号257; RPPPGSTAPPSPWCHLGA
配列番号258; RPPPGSTAPSPWCHLGA
配列番号259; RPRAPPPPSPWCHL
配列番号260; RPRAPPPPPSPWC
配列番号261; RPRAPPPPAHGVTSAP
配列番号262; RPRAPPPPPAHGV
配列番号263; APGLHRPPQPMVSP
配列番号264; AAPGLHRPQPMVSPR
配列番号265; PGLHRPPPAHGVT
配列番号266; APGLHRPPAHGVTS
配列番号267; VDRPQHTEWLSWSNLYRIRHQ
配列番号268; HYLCTDVAPR
配列番号269; HYLCTDVAPPR
配列番号270; HYLCTDVAPPVDRPQHTEWLSWSNLYRIRHQ
【００６９】
配列番号271; HYLCTDVAPVDRPQHTEWLSWSNLYRIRHQ
配列番号272; SAYLSPLGTTWLRTCACRLPRPAASCLCTTPSLLW-
-PRRTCPAGSPRATSSPWRMPAPKSCCTTGLAFTS-
-PIGLGWRSATASGYARIWPVLSLTCQSWSTSLPSTAVTW
配列番号273; PSAYLSPLGTTWLRTCACRLPRPAASCLCTTPSLLWP-
-RRTCPAGSPRATSSPWRMPAPKSCCTTGLAFTSP-
-IGLGWRSATASGYARIWPVLSLTCQSWSTSLPSTAVTW
配列番号274; PAPIFLLWGPLG
配列番号275; APIFLLWGPLG
配列番号276; LPARAPGPPSAYLSPLGTTWLRTCACRLPRPAASCL-
-CTTPSLLWPRRTCPAGSPRATSSPWRMPAPKSCC-
-TTGLAFTSPIGLGWRSATASGYARIWPVLSLT-
-CQSWSTSLPSTAVTW
配列番号277; LPARAPGPPPSAYLSPLGTTWLRTCACRLPRPAAS-
-CLCTTPSLLWPRRTCPAGSPRATSSPWRMPAPKSCC-
-TTGLAFTSPIGLGWRSATASGYARIWPVLSLTC-
-QSWSTSLPSTAVTW
配列番号278; LPARAPGPPPAPIFLLWGPLG
配列番号279; LPARAPGPPAPIFLLWGPLG
配列番号280; DLEHHGGVTRHRHR
配列番号281; LVSDYSMTPRP
配列番号282; LVSDYSMTPPRP
配列番号283; LVSDYSMTPPDLEHHGGVTRHRHR
配列番号284; LVSDYSMTPDLEHHGGVTRHRHR
配列番号285; FHHIATDVGPFVRIGFLKIKGKIKGKSLRKPNW-
-KTQHKLKRALMFLIVKKL
配列番号286; PFHHIATDVGPFVRIGFLKIKGKIKGKSLRKPNWK-
-TQHKLKRALMFLIVKKL
配列番号287; PSITLQQMLAPS
配列番号298; SITLQQMLAPS
配列番号289; TSCNEMNPPFHHIATDVGPFVRIGFLKIKGKIKGKSL-
-RKPNWKTQHKLKRALMFLIVKKL
配列番号290; TSCNEMNPPPFHHIATDVGPFVRIGFLKIKGKIKG-
-KSLRKPNWKTQHKLKRALMFLIVKKL
配列番号291; TSCNEMNPPSITLQQMLAPS
配列番号292; TSCNEMNPPPSITLQQMLAPS
配列番号293; LEMILFLMTF
配列番号294; HPCITKTFLEMILFLMTF
配列番号295; HPCITKTFFLEMILFLMTF
配列番号296; HPCITKTFFWR
配列番号297; HPCITKTFWR
配列番号298; LMFEHSQMRLNSKNAHLPIISF
配列番号299; EYGSIIAFLMFEHSQMRLNSKNAHLPIISF
配列番号300; EYGSIIAFFLMFEHSQMRLNSKNAHLPIISF
配列番号301; HLNKGRRLGDKIRAT
配列番号302; FHLNKGRRLGDKIRAT
配列番号303; VTSGTPFFHLNKGRRLGDKIRAT
配列番号304; VTSGTPFFFHLNKGRRLGDKIRAT
配列番号305; VTSGTPFFFI
配列番号306; VTSGTPFFI
配列番号307; CEIERIHFFF
配列番号308; CEIERIHFFSK
配列番号309; CEIERIHFSK
配列番号310; FRYISKSI
配列番号311; RYISKSI
配列番号312; FKKYEPIFFRYISKSI
配列番号313; FKKYEPIFRYISKSI
配列番号314; FPDSDQPGPLYPLDPSCLISSASNPQELSDCHYIH-
-LAFGFSNWRSCPVLPGHCGVQ
配列番号315; PDSDQPGPLYPLDPSCLISSASNPQELSDCHYIHL-
-AFGFSNWRSCPVLPGHCGVQ
配列番号316; LNMFASVFS
配列番号317; LNMFASVFFS
配列番号318; LNMFASVFFPDSDQPGPLYPLDPSCLISSASNPQE-
-LSDCHYIHLAFGFSNWRSCPVLPGHCGVQ
配列番号319; LNMFASVFPDSDQPGPLYPLDPSCLISSASNPQELS-
-DCHYIHLAFGFSNWRSCPVLPGHCGVQ
配列番号320; AMEETVVVAVATVETEVEAMEETGVVAAMEETEVGAT-
-EETEVAMEAKWEEETTTEMISATDHT
【００７０】
配列番号321; LWVRPWLWEWLRWRPKWRLWRRQEWWRLWRRPRWGL-
-RRRPRWLWRENGRKKRLQK
配列番号322; YGGDRSRGAMEETVVVAVATVETEVEAMEETGVVAAM-
-EETEVGATEETEVAMEAKWEEETTTEMISATDHT
配列番号323; YGGDRSRGGAMEETVVVAVATVETEVEAMEETGVVA-
-AMEETEVGATEETEVAMEAKWEEETTTEMISATDHT
配列番号324; YGGDRSRGGLWVRPWLWEWLRWEPKWRLWRRQEWW-
-RLWRRPRWGLRRRPRWLWRENGRKKRLQK
配列番号325; YGGDRSRGLWVRPWLWEWLRWEPKWRLWRRQEWWR-
-LWRRPRWGLRRRPRWLWRENGRKKRLQK
配列番号326; EFGGGRRQK
配列番号327; EFGGRRQK
配列番号328; RRAKGGGAGASNPRQ
配列番号329; GRRAKGGGAGASNPRQ
配列番号330; DVGLREGALELPTRGNKRNVA
配列番号331; MRGGGGVGGRRAKGGGAGASNPRQ
配列番号332; MRGGGGVGGGRRAKGGGAGASNPRQ
配列番号333; MRGGGGVGGDVGLREGALELPTRGNKRNVA
配列番号334; MRGGGGVGDVGLREGALELPTRGNKRNVA
配列番号335; VWQLAGPMLAGWRSLGSWFCRMYGI
配列番号336; CGSWPALCWRAGGVWAVGSAGCMEYDPEALPAAWGP-
-AAAATVHPRR
配列番号337; RRYPCEWGVWQLAGPMLAGWRSLGSWFCRMYGI
配列番号338; RRYPCEWGGVWQLAGPMLAGWRSLGSWFCRMYGI
配列番号339; RRYPCEWGGCGSWPALCWRAGGVWAVGSAGCMEYD-
-EALPAAWGPAAAATVHPRR
配列番号340; RRYPCEWGCGSWPALCWRAGGVWAVGSAGCMEYDPE-
-ALPAAWGPAAAATVHPRR
配列番号341; LWLWAGWTVWWSCGPGEKGHGWPSLPTMALLLLRFSCM-
-RVASY
配列番号342; GLWLWAGWTVWWSCGPGEKGHGWPSLPTMALLLL-
-RFSCMRVASY
配列番号343; GCGCGPAGQYGGAVGLARRGTAGCLPCPPWLCCCCAF-
-PACGLPGTDGWRGWQGSGCVRVSGSAPWAPGFPFSP-
-PCPLCGTQPRW
配列番号344; CGCGPAGQYGGAVGLARRGTAGCLPCPPWLCCCCAFPACG-
-LPGTDGWRGWQGSGCVRVSGSAPWAPGFPFSPPC-
-PLCGTQPRW
配列番号345; LAFNVPGGLWLWAGWTVWWSCGPGEKGHGWPSLPTMA-
-LLLLRFSCMRVASY
配列番号346; LAFNVPGGGLWLWAGWTVWWSCGPGEKGHGWPSLPTM-
-ALLLLRFSCMRVASY
配列番号347; LAFNVPGGGCGCGPAGQYGGAVGLARRGTAGCLPCPP-
-WLCCCCAFPACGLPGTDGWRGWQGSGCVRVSGSAPW-
-APGFPFSPPCPLCGTQPRW
配列番号348; LAFNVPGGCGCGPAGQYGGAVGLARRGTAGCLPCPPW-
-LCCCCAFPACGLPGTDGWRGWQGSGCVRVSGSAPWA-
-PGFPFSPPCPLCGTQPRW
配列番号349; PPMPMPGQREAPGRQEA
配列番号350; GPPMPMPGQREAPGRQEA
配列番号351; GHQCQCQGKGRHRADRRPDTAQEE
配列番号352; HQCQCQGKGRHRADRRPDTAQEE
配列番号353; GGHSYGGGPPMPMPGQREAPGRQEA
配列番号354; GGHSYGGGGPPMPMPGQREAPGRQEA
配列番号355; GGHSYGGGGHQCQCQGKGRHRADRRPDTAQEE
配列番号356; GGHSYGGGHQCQCQGKGRHRADRRPDTAQEE
配列番号357; APCPQSSGGG
配列番号358; LPAPSQAAADELDRRPG
配列番号359; TKVRLIRGAPCPQSSGGG
配列番号360; TKVRLIRGGAPCPQSSGGG
配列番号361; TKVRLIRGGLPAPSQAAADELDRRPG
配列番号362; TKVRLIRGLPAPSQAAADELDRRPG
配列番号363; CSLAKDGSTEDTVSSLCGEEDTEDEELEAAASHLNK-
-DLYRELLGG
配列番号364; GCSLAKDGSTEDTVSSLCGEEDTEDEELEAAASHLNK-
-DLYRELLGG
配列番号365; AAAWQKMAPPRTPRPACVARR
配列番号366; ENSRPKRGGCSLAKDGSTEDTVSSLCGEEDTEDEELE-
-AAASHLNKDLYRELLGG
配列番号367; ENSRPKRGGGCSLAKDGSTEDTVSSLCGEEDTEDE-
-ELEAAASHLNKDLYRELLGG
配列番号368; ENSRPKRGGAAAWQKMAPPRTPRPACVARR
配列番号369; ENSRPKRGAAAWQKMAPPRTPRPACVARR
配列番号370; HCVLAASGAS
【００７１】
配列番号371; GHCVLAASGAS
配列番号372; GTASSRPLGLPKPHLHRPVPIRHPSCPK
配列番号373; TASSRPLGLPKPHLHRPVPIRHPSCPK
配列番号374; AGTLQLGGHCVLAASGAS
配列番号375; AGTLQLGGGHCVLAASGAS
配列番号376; AGTLQLGGGTASSRPLGLPKPHLHRPVPIRHPSCPK
配列番号377; AGTLQLGGTASSRPLGLPKPHLHRPVPIRHPSCPK
配列番号378; RRTPSTEKR
配列番号379; RRTPSTEKKR
配列番号380; RRTPSTEKKGRSEC
配列番号381; RRTPSTEKGRSEC
配列番号382; STTKCQSGTAETYNSWKVKNLQLEPRRVTSQMNRQVK-
-DMTAILSQS
配列番号384; SSEEIKKKSTTKCQSGTAETYNSWKVKNLQLEPRRV-
-TSQMNRQVKDMTAILSQS
配列番号385; SSEEIKKKKSTTKCQSGTAETYNSWKVKNLQLEPRR-
-VTSQMNRQVKDMTAILSQS
配列番号386; SSEEIKKKKVQPNASQAQQKPTTHGR
配列番号387; SSEEIKKKVQPNASQAQQKPTTHGR
配列番号388; NRGWVGAGE
配列番号389; IEAG
配列番号390; VHNYCNMKNRGWVGAGE
配列番号391; VHNYCNMKKNRGWVGAGE
配列番号392; VHNYCNMKKIEAG
配列番号393; VHNYCNMKIEAG
配列番号394; QLRCWNTWAKMFFMVFLIIWQNTMF
配列番号395; VKKDNHKKQLRCWNTWAKMFFMVFLIIWQNTMF
配列番号396; VKKDNHKKKQLRCWNTWAKMFFMVFLIIWQNTMF
配列番号397; VKKDNHKKKNS
配列番号398; VKKDNHKKNS
配列番号399; GAEESGPFNRQVQLKVHASGMGRHLWNCPAFWSEV
配列番号400; HPSPPPEKRS
配列番号401; HPSPPPEKKRS
配列番号402; HPSPPPEKKGAEESGPFNRQVQLKVHASGMGRHLW-
-NCPAFWSEV
配列番号403; HPSPPPEKGAEESGPFNRQVQLKVHASGMGRHLWN-
-CPAFWSEV
配列番号404; MQVLSKTHMNLFPQVLLQMFLRGLKRLLQDLEKSKKRKL
配列番号405; RCKSARLI
配列番号406; VQTQPAIKKMQVLSKTHMNLFPQVLLQMFLRGLKRLLQ-
-DLEKSKKRKL
配列番号407; VQTQPAIKKKMQVLSKTHMNLFPQVLLQMFLRGLKRL-
-LQDLEKSKKRKL
配列番号408; VQTQPAIKKRCKSARLI
配列番号409; VQTQPAIKRCKSARLI
配列番号410; ARSGKKQKRKL
配列番号411; ARSGKKQKKRKL
配列番号412; ARSGKKQKKENFS
配列番号413; ARSGKKQKENFS
配列番号414; KASARSGKSKKRKL
配列番号415; KASARSGKKSKKRKL
配列番号416; KASARSGKKAKKENSF
配列番号417; KASARSGKAKKENSF
配列番号418; HLNKGRRLGDKIRAT
配列番号419; VTSGTPFFHLNKGRRLGDKIRAT
配列番号420; VTSGTPFFFHLNKGRRLGDKIRAT
【００７２】
配列番号421; VTSGTPFFFI
配列番号422; VTSGTPFFI
配列番号423; VTLLYVNTVTLAPNVNMESSRNAHSPATPSAKRK-
-DPDLTWGGFVFFFCQFH
配列番号424; KCRCKPNFFVTLLYVNTVTLAPNVNMESSRNAHSP-
-ATPSAKRKDPDLTWGGFVFFFCQFH
配列番号425; KCRCKPNFFFVTLLYVNTVTLAPNVNMESSRNAH-
-SPATPSAKRKDPDLTWGGFVFFFCQFH
配列番号426; KCRCKPNFFL
配列番号427; KCRCKPNFL
配列番号429; LVKKLKEKKMNWIL
配列番号430; LVKKLKEKKKMNWIL
配列番号431; LVKKLKEKKR
配列番号432; LVKKLKEKR
配列番号433; AAIVKDCCR
配列番号434; SQPASILGRKL
配列番号435; SQPASILGKRKL
配列番号436; SQPASILGKAAIVKDCCR
配列番号437; SQPASILGAAIVKDCCR
配列番号459; NTWAKMFFMVFLIIWQNTMF
【００７３】
本化合物の１つまたはいくつかを組み合わせて治療に特に適切な癌の例を以下に示す：結腸直腸癌、乳癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肝臓癌（原発性および続発性）、腎臓癌、黒色腫、卵巣癌、脳腫瘍、頭頸部癌、膵臓癌、胃癌、エオゾファジール(eosophageal)癌、前立腺癌ならびに白血病およびリンパ腫。
【００７４】
これらの変異によって遺伝子産物を生じ、それにより腫瘍が発症し得るいくつかの例を以下に列挙する。
【００７５】
結腸直腸癌の発症は、一連の遺伝的変化に起因すると考えられる。結腸直腸癌（ＤＣＣ）遺伝子（配列番号３０〜配列番号３４）、ヒトシステインプロテアーゼ（ＩＣＥｒｅｌ−ＩＩＩ）遺伝子（配列番号３９４〜配列番号３９８および配列番号４５９）、ヒト推定ミスマッチ修復／結合タンパク質（ｈＭＳＨ３）遺伝子（配列番号１３４〜配列番号１４７）、ヒトｈＭＳＨ６遺伝子（配列番号２００〜配列番号２０３および配列番号２９３〜配列番号２９７）、ヒトｎ−ｍｙｃ遺伝子（配列番号１８９〜配列番号１９４）、ヒトＴＧＦβ２（ｈＴＧＦβ２）遺伝子（配列番号２２〜配列番号２９）、ヒトｐ５３関連遺伝子（配列番号２８５〜配列番号２９２）の欠失が結腸直腸癌に関与し得る。
【００７６】
ヒト乳癌感受性（ＢＲＣＡ２）遺伝子（配列番号３５〜配列番号９４）およびヒトＢＲＣＡ１関連ＲＩＮＧドメインタンパク質（ＢＡＲＤ１）遺伝子（配列番号４０４〜配列番号４１７）は乳癌に関与し、卵巣癌ヒトｈＭＳＨ６遺伝子（配列番号２００〜配列番号２０３および配列番号２９３〜配列番号２９７）は、脳腫瘍に関与し得る。
【００７７】
遺伝子の変化によって多くの型の腺癌が頻発する。多くの癌において変異する遺伝子をいくつか以下に列挙する。
【００７８】
ヒト乳癌感受性（ＢＲＣＡ２）遺伝子（配列番号３５〜配列番号９４）、結腸直腸癌欠失（ＤＣＣ）遺伝子（配列番号３０〜配列番号３４）、ヒト推定ミスマッチ修復／結合タンパク質（ｈＭＳＨ３）遺伝子（配列番号１３４〜配列番号１４７）、ヒトｈＭＳＨ６遺伝子（配列番号２００〜配列番号２０３および配列番号２９３〜配列番号２９７）、ヒトＮ−ＭＹＣ遺伝子（配列番号１８９〜配列番号１９４）、ヒトＴＧＦｂ２（ｈＴＧＦｂ２）遺伝子（配列番号２２〜配列番号２９）、ヒトｐ５３関連遺伝子（配列番号２８５〜配列番号２９２）、ヒトＭＵＣ１遺伝子（配列番号２４７〜配列番号２６６）、ヒト生殖系列ｎ−ｍｙｃ遺伝子（配列番号１８２〜配列番号１８８）、ヒトウィルムス腫瘍（ＷＩＴ−１）関連タンパク質（配列番号３８８〜配列番号３９３）、ヒト上咽頭癌ＥＢＶ ＢＮＬＦ−１遺伝子（配列番号２０４〜配列番号２１０）、ヒト形質転換成長因子−β誘導遺伝子産物（ＢＩＧＨ３）（配列番号２２７〜配列番号２３２）。
【００７９】
変異遺伝子の多くにより、白血病およびリンパ腫を発症し得る。以下に例を示す：ヒトニューロフィブロミン（ＮＦ１）遺伝子（配列番号１７６〜配列番号１８１）、ｂ−ｒａｆオンコジーン（配列番号１７０〜配列番号１７５）、ヒトタンパク質−チロシンキナーゼ（ＪＡＫ１）遺伝子（配列番号２６７〜配列番号２７１）、ヒトタンパク質−チロシンキナーゼ（ＪＡＫ３）遺伝子（配列番号２７３〜配列番号２７９）。
【００８０】
悪性黒色腫に関与する遺伝子を以下に示す：ヒト悪性黒色腫転移抑制（ｈＫｉＳＳ−１）遺伝子（配列番号３２８〜配列番号３３４）。転移に関する遺伝子を以下に示す：ヒト転移関連ｍｔａ１（ｈＭＴＡ１）遺伝子（配列番号３５７〜配列番号３６２）。
【００８１】
細胞周期調節およびシグナル形質導入は厳密に制御されている。これらの遺伝子のフレームシフト変異により、細胞増殖が調節不可能になる。これに感受性を示す遺伝子を以下に示す：。ヒトタンパク質チロシンホスファターゼ（ｈＰＴＰ）遺伝子（配列番号９５〜配列番号１０２）、ヒトキナーゼ（ＴＴＫ）遺伝子（配列番号１０９〜配列番号１２０）、ヒト転写抑制（ＣＴＣＦ）遺伝子（配列番号１２１〜配列番号１２７）、ヒト細胞周期調節タンパク質（Ｅ１Ａ結合タンパク質）ｐ３００遺伝子（配列番号２１１〜配列番号２１８）、ヒト形質転換成長因子−β誘導遺伝子産物（ＢＩＧＨ３）（配列番号２２７〜配列番号２３２）、（膜貫通チロシナーゼキナーゼの）ヒトＦＬｔ４遺伝子（配列番号２８０〜配列番号２８４）、ヒトＧタンパク質結合レセプター（ｈＧＰＲ１）遺伝子（配列番号３１４〜配列番号３１９）、ヒト転写因子（ｈＩＴＦ−２）遺伝子（配列番号３２６〜配列番号３２７）、ヒトテロメラーゼ関連タンパク質ＴＰ−１（ｈＴＰ−１）遺伝子（配列番号３３５〜配列番号３４８）、ヒト転写因子ＴＦＩＩＢの９０ｋＤａサブユニット（ｈＴＦＢＩＩＢ９０）遺伝子（配列番号３６３〜配列番号３６９）、ヒトＦＡＤＤ−相同性ＩＣＥ／ＣＥＤ−３様プロテアーゼ遺伝子（配列番号１２８〜配列番号１３３）。
【００８２】
ＤＮＡ合成における変異、または修復酵素によっても細胞増殖が調節できなくなる場合がある。ヒトＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ（ｔｏｐ２）遺伝子（配列番号１０３〜配列番号１０８）およびヒト推定ミスマッチ修復／結合タンパク質（ｈＭＳＨ３）遺伝子（配列番号１３４〜１４７）、および（ｈＭＳＨ６）遺伝子（配列番号２００〜配列番号２０３および配列番号２９３〜配列番号２９７）。
【００８３】
以下に腫瘍抑制遺伝子を示す：ヒト網膜芽細胞腫結合タンパク質１アイソフォームＩ（ｈＲＢＰ１）遺伝子（配列番号１４８〜配列番号１５６）、ヒトニューロフィブロミン（ＮＦ１）遺伝子（配列番号１７６〜配列番号１８１）、ヒトｐ５３関連遺伝子（配列番号２８５〜配列番号２９２）、ヒト網膜芽細胞腫関連タンパク質（ｐ１０７）遺伝子（配列番号３１０〜配列番号３１３）、ヒト腫瘍抑制（ｈＬＵＣＡ−１）遺伝子（配列番号３７０〜配列番号３７７）。これらの遺伝子における変異により、癌が発症する場合がある。
【００８４】
以下にオンコジーン、プロトオンコジーン、または推定オンコジーンを示す：ヒト生殖系列ｎ−ｍｙｃ遺伝子（配列番号１８２〜配列番号１８８）、ヒトｎ−ｍｙｃ遺伝子（配列番号１８９〜配列番号１９４）、ヒトｃａｎ（ｈＣＡＮ）遺伝子（配列番号２９８〜配列番号３００）、ヒトｄｅｋ（ｈＤＥＫ）遺伝子（配列番号３０７〜配列番号３０９）、ｂ−ｒａｆオンコジーン（配列番号１７０〜配列番号１７５）、ヒトＤＢＬ（ｈＤＢＬ）プロトオンコジーン／ヒトＭＣＦ２ＰＯ（ｈＭＣＦ２ＰＯ）遺伝子（配列番号３０１〜配列番号３０６）。これらの遺伝子におけるフレームシフト変異によって癌の発症が誘導される場合がある。
【００８５】
生物学的実験
【００８６】
配列番号１７のペプチドを選択し、いくつかのＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩ分子の結合モチーフを含むように設計した。従って、これらのペプチドは、ＣＤ４+Ｔ細胞およびＣＤ８+Ｔ細胞のエピトープを含み、癌細胞において自然に発生する異常なＴＧＦβＲＩＩタンパク質のプロセシングが起こり、それによりペプチドの重複が起こった場合、癌患者におけるＣＤ４ＴおよびＣＤ８Ｔ細胞応答を惹起することが予想される。これは、今回、図８〜図１１の結果によってＣＤ４Ｔ細胞であると証明された。これらの結果は、以下を意味する。
【００８７】
１）図８の結果は、患者のミスマッチ修復機構を欠失した癌患者の割合が高いＴＧＦβＲＩＩレセプターの変異形態が腫瘍特異的抗原であることを証明する。
【００８８】
２）結腸直腸癌に一般に認められる浸潤性Ｔ細胞の抗原特異性は、概して知られていない。図８の結果は、この患者の腫瘍における腫瘍浸潤性リンパ球の集団を構成する１つのＴ細胞成分が、フレームシフト変異に特異的であることを示し、これは、ＴＧＦβＲＩＩフレームシフトペプチドがin vivoで免疫原性であり、時折、自発性Ｔ細胞活性化を引き起こすことを示している。
【００８９】
３）この観察から、一般的なフレームシフト変異によって形成されるＴＧＦβＲＩＩレセプターの非機能性形態のプロセシングがプロセシングされることになる。このプロセシングは、異常なタンパク質の自然な破壊の一部としての腫瘍細胞においてまたは腫瘍細胞自体もしくは放出形態のレセプターが専門的なＡＰＣまたは両方によって取り上げられた後に起こり得る。
【００９０】
４）図８の結果はまた、配列番号１７のペプチドが、ＨＬＡクラスＩＩ分子に結合することができることを示す。これは、このペプチドによるＡＰＣのパルス化により、ペプチドに対する特異的増殖応答が生じるからであり、またＣＤ４Ｔ細胞応答が、いつでもクラスＩＩ拘束であるからである。これが、図９に示した実験の結果により示された場合である。ここに、配列番号１７のペプチドに対する特異的な応答は、ＨＬＡ−ＤＲに対する抗体によって完全に阻害されたが、他の２つのＨＬＡクラスＩＩ分子、ＨＬＡ−ＤＱおよびＨＬＡ−ＤＰに対する抗体では阻害されなかったことが示される。さらに、患者自身のＡＰＣ上に存在する関連ＨＬＡクラスＩＩ分子をカバーする、標準的なホモ接合性エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）形質転換Ｂ細胞株（ＢＣＬ）のパネルの使用により、本発明者らは、ＨＬＡ−ＤＲ１４としてＴＬＣ ＩＭＴ８およびＩＭＴ９に対する配列番号１７のペプチドの提示を担うクラスＩＩ分子を同定することができた。まとめると、これらの知見は同一の腫瘍生検から得た並行切片でなされた免疫組織学的知見と極めて良く適合しており、本発明者らは、活性化ＣＤ４+Ｔ細胞がＨＬＡ−ＤＲを発現するために誘導された腫瘍細胞の近位に豊富であることを示すことができた。図１１の結果は、これらのＴ細胞クローンはペプチド用量の範囲を超えた増殖応答の増加を可能にし、応答が用量依存性であることを示す。
【００９１】
５）これらのＴ細胞クローンが腫瘍生検から単離されたＴ細胞のクローニングによって得られるので、本発明者らの知見の別の考察は、配列番号１７のペプチドに特異的な活性化Ｔ細胞が、活性化後に腫瘍組織にホーミング可能であることである。
【００９２】
６）配列番号１７のペプチドが腫瘍特異的抗原であり、一般に、このペプチドの配列の重複を起こすフレームシフト変異がミスマッチ修復機構の一部である酵素における欠失を有する癌において見出されるので、このペプチドは癌を発症する危険性の高い癌患者におけるＴ細胞応答を惹起するためのワクチンとして使用することができる。このようなＴ細胞応答は、存在する腫瘍の増殖に潜在的に影響を与えるか、手術および他の形態の治療後の腫瘍の再増殖を防止するか、欠失ミスマッチ酵素が検出されるかその疑いがある遺伝形態の癌を有し、この明らかなミスマッチ修復変異が起こる癌を発症する可能性が高い患者に与えることができる。
【００９３】
合成
ペプチドを、連続フロー固相ペプチド合成を用いて合成した。適切に側鎖が保護されたＮ−ａ−Ｆｍｏｃアミノ酸を使用した。Ｆｍｏｃアミノ酸を、ペンタフルオロフェニルエステルとしてカップリングするか、カップリング前にＴＢＴＵまたはジイソプロピルカルボジイミド活性化のいずれかを使用して活性化する。各カップリング後のＦｍｏｃの選択的除去のために、２０％ピペリジンＤＭＦ溶液を使用した。樹脂からの切断および側鎖保護の最終的な除去を、適切なスカベンジャーを含む９５％ＴＦＡによって行った。ペプチドを精製し、逆相（Ｃ１８）ＨＰＬＣによって分析した。ペプチドの同定を、エレクトロスプレー質量分光学（Finnigan mat SSQ710）を用いて確認した。
Ｔ細胞刺激のin vitro研究に使用したペプチドを、本方法によって合成した。
ペプチドを合成するために、当業者はいくつかの他の周知の方法を適用することができる。
【００９４】
新規のフレームシフト変異ペプチドを同定するための方法の実施例
本実施例では、ＢＡＸ遺伝子を使用して原理を例示する。
以下に列挙した各ステップにおいて、最初の行は遺伝子配列であり、２番目の行はアミノ酸配列である。
ステップ２〜５において、太字の配列は、タンパク質の変異体部分を示す。
【００９５】
【化１】
【化２】
次の実施例では、ＴＧＦβＲＩＩ遺伝子を使用して原理を例示する。
以下に列挙した各ステップにおいて、最初の行は遺伝子配列であり、２番目の行はアミノ酸配列である。
ステップ２〜５において、太字の配列は、タンパク質の変異体部分を示す。
【００９８】
【化３】
【化４】
従って、本発明のペプチドは、フレームシフト変異を有する遺伝子を保有する癌細胞を用いた癌の治療法に使用することができ、その治療には、このような治療が必要なヒト患者に少なくとも１つの本発明のペプチドをin vivoまたはex vivoで投与するステップが含まれる。
【０１０１】
別の実施形態では、ヒトに少なくとも１つの本発明のペプチドを投与することにより、本発明のペプチドを使用してフレームシフト変異を有する遺伝子を保有する癌細胞を有する癌の傾向のあるヒトにワクチン接種することができる。
さらに、本発明の各ペプチドは、個体の異なる型のＨＬＡクラスＩ分子および／またはクラスＩＩ分子に結合することができるので、本発明のペプチドの混合物をヒト個体に投与することは有利であると考えられる。
【０１０２】
さらに、上記のＰＣＴ／ＮＯ９２／０００３２公開において開示の抗癌ワクチンまたはペプチド薬の能力は、本発明のペプチドを含んだ場合非常に増大可能であることが予想される。従って、本発明の別の実施形態では、本発明のペプチドは、ＰＣＴ／ＮＯ９２／０００３２に開示のペプチドと共に、同時に、または任意の配列として投与される。
【０１０３】
ペプチドは、当該分野で既知の免疫応答を強化するために、サイトカインおよび／または成長因子（すなわち、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、Ｆｌｔ−３リガンドなど）などの化合物と共に、同時または別々に投与することができると考えられる。
【０１０４】
本発明のペプチドは、ワクチンまたは治療組成物において単独または他の物質（例えば、標準的なアジュバントなど）と組み合わせて、または高親和性細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導することができる当該分野で既知のリポペプチド結合物の形態で使用することができる（K.Deres、「Nature」、Vol.342、nov.1989）。
【０１０５】
本発明のペプチドは、ペプチドまたは組換えフラグメントベースのワクチンのいずれかに含めるのに有用であり得る。
本発明のペプチドは、当該分野で既知の通常の添加物、希釈剤、安定剤など共に、医薬組成物またはワクチン中に含めることができる。
【０１０６】
本発明によれば、医薬組成物またはワクチンには、ペプチドを単独かまたは少なくとも１つの医薬的に許容可能な担体または希釈剤と組み合わせて含めることができる。
さらに、ワクチンまたは治療組成物には、遺伝子の反復配列における塩基の挿入または欠失から生じる変異体タンパク質のフラグメントであるペプチドの選択を含むことができる。
【０１０７】
さらに、ワクチン組成物には、１つの癌のために選択される少なくとも１つのペプチドを含むことができ、このワクチンは、遺伝的にこの特定の癌を発症する疑いのある患者に投与される。
さらに、ワクチン組成物には、１つの癌のために選択される少なくとも１つのペプチドを含むことができ、このワクチンは、この特定の癌を発症する危険性の高い群に属する患者に投与される。
【０１０８】
さらに、本発明の癌ワクチンは、例えば、フレームシフト変異遺伝子に関連する種々の一般的な癌に対してＴ細胞免疫を起こすペプチドの混合物としてに一般的に投与することができる。
本発明のペプチドは、単一のペプチドまたはペプチドの混合物として投与することができる。あるいは、ペプチドが互いに共有結合して、より大きなポリペプチドか環状ポリペプチドを形成することができる。
【０１０９】
本発明の癌治療は、患者が罹患している癌の型に関連する変異体遺伝子産物に対して特異的なＴ細胞株またはクローンを生じることを主要な目的として、in vivoまたはex vivoで投与することができる。
【０１１０】
さらに、本発明のフレームシフト変異体ペプチドは、種々の経路（皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、静脈内などを含むがこれらに限定されない）で患者に投与することができる。１つの実施形態では、本発明のペプチドは、皮内に投与される。ペプチドは、１つまたは複数の注射部位に、治療的または予防的に有効な量を患者に投与することができる。
【０１１１】
本発明のペプチドは、１回のみあるいは複数回（例えば、反復配列後を１週間に１回、１〜２ヶ月）投与することができ、これはすべて治療される患者の要求に従う。
本発明のペプチドは、ワクチン接種される平均的なヒト患者または個体に１マイクログラム（１μｇ）〜１グラム（１ｇ）の範囲内の量を投与することができる。各投与には、１マイクログラム（１μｇ）〜１ミリグラム（１ｍｇ）の範囲内のより少ない用量を使用することが好ましい。
【０１１２】
さらに、本発明は、フレームシフト変異ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む。
さらに、本発明は、少なくとも１つのフレームシフト変異体ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む単離ＤＮＡ配列、および遺伝子におけるフレームシフト変異に関連する癌の治療用または予防用のワクチンとしてのこのような単離ＤＮＡ配列の投与が含まれる。
【０１１３】
本発明のペプチドは、ＤＮＡワクチンの形態で個体に投与することができる。これらのペプチドをコードするＤＮＡは、クローン化プラスミドＤＮＡまたは合成オリゴヌクレオチドの形態であり得る。ＤＮＡは、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１２）および／または他の同時刺激分子と共に送達させることができる。サイトカインおよび／または同時刺激分子自体をプラスミドまたはオリゴヌクレオチドＤＮＡの形態で送達させることができる。ＤＮＡワクチンに対する応答は、免疫刺激ＤＮＡ配列（ＩＳＳ）の存在によって増加することが認められた。これらは、以下の式のメチル化ＣｐＧを含む六量体モチーフの形態をとることができる：５’−プリン−プリン−ＣＧ−ピリミジン−ピリミジン−３’。従って、本発明者らのＤＮＡワクチンは、これらのＩＳＳまたは他のＩＳＳを、ペプチドをコードするＤＮＡ、サイトカインまたは他の同時刺激分子をコードするＤＮＡまたはその両方に組込むことができる。ＤＮＡワクチン接種の利点の総説が、Tighe et al（1998、「Immunology Today」、19(2)、89〜97）に記載されている。
【０１１４】
１つの実施形態では、変異体ＢＡＸペプチドをコードするＤＮＡ配列には、以下が含まれる。
【０１１５】
【化５】
第２の実施形態では、変異体ＴＧＦβＲＩＩペプチドをコードするＤＮＡ配列には、以下が含まれる。
【０１１７】
【化６】
さらに、本発明は、フレームシフト変異体ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むベクターおよびプラスミドを含む。ベクターには、大腸菌（E.Coli）プラスミド、リステリア（Listeria）ベクター、および組換えウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。組換えウイルスベクターには、フレームシフト変異体ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む、オルトポックスウイルス、カナリアウイルス、カプリボックスウィルス、スイポックスウィルス、ワクシニア、バキュロウイルス、ヒトアデノウイルス、ＳＶ４０、ウシ乳頭腫ウイルスなどが含まれるがこれらに限定されない。
【０１１９】
抗癌治療または予防はまた、フレームシフト変異体ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む少なくとも１つの挿入部位を含む有効量の組換えウィルスベクターまたはプラスミドを患者に投与することによって達成することができ、これにより、患者の抗原提示細胞がベクター／プラスミドの宿主細胞中に変化し、ＨＬＡ／フレームシフト変異体ペプチド複合体の提示が達成されると考えられる。
当業者は、本発明のペプチドと組み合わせて他の可能性ある用途を見出し、これらは、本発明の請求の範囲に含まれることを意味する。
【０１２０】
本発明のペプチドは、ペプチドの化学合成、組換えＤＮＡ技術もしくはタンパク質またはフレームシフト遺伝子によってコードされるペプチドのプロテアーゼ分解などの当該分野で公知の従来の方法によって作製することができる。化学合成の１つの方法は、以下の記載において説明する。
【０１２１】
有効な特異的Ｔ細胞免疫に基づく特異的癌治療用のワクチンおよび方法のために、以下の３つの条件を満たさなければならない。
１．使用したペプチドは、全長かまたは抗原提示細胞のプロセシング後に、癌細胞または他の抗原提示細胞上のＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスＩＩ分子によって提示されたプロセシングされた変異体タンパク質フラグメントに対応しなければならない。
２．使用したペプチドは、免疫原性形態でＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスＩＩ分子に結合しなければならない。
３．ＨＬＡ／ペプチド複合体を認識および応答することができるＴ細胞は、ヒトの循環に存在しなければならない。
【０１２２】
本発明のいくつかの代表的なペプチドがこれら全ての条件を満たすことが確認された。本発明のペプチドは、in vitroでの特異的Ｔ細胞免疫応答を惹起する。本発明のペプチドがプロセシングされた変異体タンパク質フラグメントに相当することが確認された。これは、形質転換変異体ＢＡＸおよびＴＧＦβＲＩＩペプチドのフラグメントに相当するペプチドを用いて例示される。
【０１２３】
本発明によって、以下の利点が達成される。
患者の遺伝子におけるフレームシフト変異から生じる癌（現在既知のほとんどの癌においていかなる良好な代替的治療法も存在しない）を罹患した患者を治療する可能性を付与する。
遺伝的に疑いがあるか他の危険性の高い群に属するヒトを予防的にワクチン接種する可能性を付与する。
【０１２４】
特異的な癌（例えば、結腸直腸癌または膵臓癌など）（一般に、この癌は遺伝子のフレームシフト変異または突然変異のいずれかに関連する）のための併用治療を作製する可能性を付与する。
記載のフレームシフト変異は広範な種々の癌に起こるので、複数標的治療を得るために確立されたワクチンと更なるワクチンとを組み合わせて、このペプチドを使用することができる。
同様に、遺伝子の複数のフレームシフト変異に関連する癌を罹患した患者を、併用治療によってより有効に治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 正常なドナー由来のＴ細胞を、変異体ＢＡＸペプチドおよび変異体ＴＧＦβＲＩＩペプチドを含むペプチドの混合物で刺激することができることを示した。６人の異なるドナー由来の血液サンプルにおけるＴ細胞増殖依存性ペプチド混合物を図１に示す。変異体ＢＡＸペプチド（配列番号１、配列番号９〜１配列番号１２）および変異体ＴＧＦβＲＩＩペプチド（配列番号１５〜配列番号２１）の混合物を用いて、各ドナー由来の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を刺激することによって結果を得た。混合物中の各個体のペプチドの濃度は、２０μＭであった。２週間後、およびその後１週間ごとに、大量培養物を、１０μＭ〜２５μＭのペプチド混合物でパルスした自系ＰＢＭＣで再刺激した。４〜５回の再刺激後、大量培養物を、ＰＢＭＣのみ、コントロール、抗原提示細胞（ＡＰＣ）として２５μＭのペプチドでパルスしたＰＢＭＣを用いた標準的な増殖アッセイによって試験した。
【図２】 さらに、Ｔ細胞クローンは、大量刺激実験で使用した混合物と別のペプチドに対して産生され得ることを見出した。図２は、Ｕ底の９６ウェルマイクロタイタープレート中、５細胞／ウェルで播種し、支持細胞として２５μＭの変異体ＢＡＸペプチド（配列番号１２）でパルスした自家系ＰＢＭＣを用いることによってドナー１（図１）由来の大量培養をクローン化することによって得られたＴ細胞クローン５２１−２の増殖を示す。自系Ｂ−リンパ芽球腫細胞を、増殖アッセイにおけるＡＰＣとして使用した。
【図３】 図３では、変異体ＢＡＸペプチドおよび変異体ＴＧＦβＲＩＩペプチドを使用して乳癌患者由来のＴ細胞（ＰＢＭＣ）を刺激することができることを示す。同一の癌患者由来の樹状細胞（ＤＣ）をＡＰＣとして使用した。Ｔ細胞刺激（図３）を、変異体ＢＡＸペプチド（配列番号１、配列番号９〜配列番号１２）の混合物および変異体ＴＧＦβＲＩＩペプチド（配列番号１５〜配列番号２１）の混合物で別々にＤＣをパルスした後、自系ＰＢＭＣおよび１０ｎｇ／ｍｌ腫瘍壊死因子を添加することによって得た。パルスに使用した混合物中の各ペプチドの濃度は２５μＭであった。ＰＢＭＣおよびＤＣを、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）治療を受けた乳癌患者から白血球搬出法によって得た。ＣＤ３４+細胞を、細胞産物から単離し、ＤＣを標準的な方法を用いて得た。
【図４】 図４は、変異体ＢＡＸ（配列番号１、配列番号９〜配列番号１２）および変異体ＴＧＦβＲＩＩ（配列番号１５、配列番号１７〜配列番号２１）由来の異なる合成ペプチドに対して認識および増殖する、膵臓癌患者の腹水から得たＴ細胞の能力を示す。Ｔ細胞株を、膵臓腺癌患者の腹水に存在するＴ細胞の増大後に得た。Ｔ細胞株を、１００Ｕ／ｍｌの組換えインターロイキン−２（ｒＩＬ−２）(Amersham、Aylesbury、UK)と共にin vitroで１週間培養することによって増やし、その後増殖アッセイにおいて試験した。
自系で、照射（３０Ｇｙ）した５×１０4のＰＢＭＣを、Ｕ底９６ウェルプレート(Costar、Cambridge、MA)に播種し、２０μＭの１種類の合成ペプチドで２時間パルスした。５×１０4／ウェルのＴ細胞を添加し、プレートを、３７℃で４日間インキュベートし、最後の１２時間に１８．５×１０4Ｂｑ／ｍＬの３Ｈ−チミジンを添加した後回収した。プレートを、液体シンチレーションカウンター（Packard Topcount）によって計数した。データは、異なる合成ペプチドに対する特異的な増殖を示し、値は、３連の培養の平均として示す。これらの結果は、膵臓癌患者から単離したＴ細胞が、変異体ＢＡＸおよびＴＧＦβＲＩＩ由来のアミノ酸配列を保有するペプチドのパネルに応答することができることを示す。
【図５】 さらに、図５は、変異体ＢＡＸおよび変異体ＴＧＦβＲＩＩ由来の異なる合成ペプチドに対して認識および増殖する、別の膵臓癌患者から得たＴ細胞の能力を示す。Ｔ細胞株を、膵臓腺癌患者の腹水に存在するＴ細胞の増大後に得た。実験を、上記と同一の方法で行った。データは、異なる合成ペプチドに対する特異的な増殖を示し、値は、３連の培養の平均として示す。
後者の膵臓癌患者由来のＴ細胞応答を調査するために、反応性Ｔ細胞をクローン化した。腹膜のマクロファージを、照射し（３０Ｇｙ）、２５μＭの各ペプチドと共に、Ｕ底の９６ウェルプレート（Costar）に１×１０4でプレートした。Ｔ細胞の芽細胞を、顕微鏡で計数し、１００Ｕ／ｍｌヒト組換えインターロイキン−２（ｒＩＬ−２）（Amersham、Aylesbury、UK）と共に、全体積２００ｍＬで５芽細胞／ウェルで添加した。１４日後、Ｔ細胞クローンを、１ｍｇ／ｍＬフィトヘムアグルチニン（PHA、Wellcome、Dartford、UK）、１００Ｕ／ｍｌのｒＩＬ−２および支持細胞としての異質遺伝型の、照射ＰＢＭＣと共に２４ウェルプレート（Costar）に移し、７日後および１４日後にペプチド特異性についてスクリーニングした。
【図６】 Ｔ細胞クローン５２０．５、５２０．７、および５２０．８を、更なる特徴づけのために選択し、これらは細胞表面表現型ＣＤ３+、ＣＤ８+、およびＴｃＲ+を発現する。図６は、配列番号１０のペプチドでパルスしたペプチドパルス化自系標的細胞に対するＴ細胞クローン５２０．５、５２０．７、および５２０．８の認識および細胞傷害性を示す。自系エプスタイン・バーウイルス形質転換Ｂ細胞（ＥＢＶ）を、３Ｈ−チミジン（９．２５×１０4Ｂｑ／ｍｌ）で一晩標識し、１回洗浄し、培地中に２５ｍＭの合成ペプチド（配列番号１０）および１％ＤＭＳＯを含むか含まない９６ウェルプレート中に２５００細胞／ウェルでプレートした。３７℃で３０分のインキュベーション後、プレートを洗浄し、Ｔ細胞を添加した。プレートを、３７℃で４時間さらにインキュベートし、回収して液体シンチレーションカウンター（Packard Topcount）で計数した。データは、１０／１のエフェクター／標的比での３Ｈチミジン標識ペプチドパルス化標的細胞の特異的溶解％を示す。値は、３連の培養物の平均として示される。これらの結果は、膵臓癌患者の腹水から得た３つの異なるＴ細胞クローンが、変異体ＢＡＸ由来の関連ペプチド（配列番号１０）でパルスした自系ＥＢＶ標的の特異的細胞傷害性が存在することを示す。
【図７】 図７は、同一の患者から得た３つの異なるＴ細胞クローンの細胞傷害特性を示す。これらのＴ細胞クローンを培養し、上記のように拡大したが、変異体ＴＧＦβＲＩＩ由来のアミノ酸配列を有する配列番号１７の合成ペプチドに対してＴ細胞を産生した。Ｔ細胞クローン５３８．１、５３８．３、および５３８．４は全て、細胞表面表現型ＣＤ３+、ＣＤ８+、およびＴｃＲ+を示した。実験条件は、上記（図６）と同一であった。データは、１０／１のエフェクター／標的比での配列番号４２８のペプチドでパルスした３Ｈチミジン標識ペプチドの特異的溶解％を示す。値は、３連の培養物の平均を示す。これらの結果は、膵臓癌患者の腹水から得た３つの異なるＴ細胞クローンが変異体ＴＧＦβＲＩＩ由来の関連ペプチド（配列番号４２８）でパルスした自系ＥＢＶ標的の特異的細胞傷害性が存在することを示す。
【図８】 図８は、近位結腸に局在した腺癌を有する患者から得た腫瘍生検から得た、２つのＣＤ４+Ｔ細胞クローン、ＩＭＴ８およびＩＭＴ９の特異性を示す。免疫組織化学により、患者は支配的なＣＤ４+Ｔ細胞が豊富に浸潤し、その多くが活性化マーカーを保有していたことが明らかになった。ＨＬＡ ＤＲ陽性腫瘍細胞のＣＤ４Ｔ細胞浸潤島領域を観察した。Ｔ細胞クローンを、１５Ｕ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−２を含む培地で１６日間培養後、生検から成長した腫瘍浸潤リンパ球の成分から得た。この培養由来のＴ細胞を、ＡＰＣでパルスした照射ペプチドおよび１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を有するTerasakiプレート中で限界希釈（１細胞／ウェル）することによってクローン化した。自系ＡＰＣのパルス化を、３μｇ／ｍｌの精製ヒトβ２ミクログロブリンおよび１０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＴＮＦαの存在下で、配列番号１５、配列番号１７、および配列番号１８のＴＧＦβＲＩＩフレームシフトペプチド（各ペプチドあたり１μｇ／ｍｌ）の混合物を用いて、３７℃で３時間行った。増大することができる１４のクローンの予備試験により、２つのクローンが、クローニング用に使用したペプチド混合物と反応することが示された。増大後、クローンを、標準的な増殖アッセイにおいて、１種類のペプチドとの反応性についてスクリーニングした。結果は、ＩＭＴ８およびＩＭＴ９は、共にＴＧＦβＲＩＩフレームシフトペプチド（配列番号１７）と特異的に反応し、試験した他の２つのフレームシフトペプチドとは反応性を示さないことを示す。
図（図８）は、従来のＴ細胞増殖アッセイの結果を示し、クローン化Ｔ細胞（５×１０4）および照射ＡＰＣ（５×１０4）を３連で３日間同時培養し、回収した。培養物の増殖能を測定するために、3Ｈ−チミジン（３．７×１０4Ｂｑ／ウェル）を培養物に添加し回収した。値は、３連の平均カウント毎分（ｃｐｍ）として示す。
【図９】 図９は、配列番号１７のペプチドに対する２つのＴ細胞クローンＩＭＴ８およびＩＭＴ９の特異的反応性は、阻害後の反応性がペプチドの非存在下でのＡＰＣを用いたクローンのバックグラウンド反応性と同一であるので、ＨＬＡ−ＤＲ分子に特異的に結合する抗体を用いた細胞の処理によって完全に阻害されることを示す。一方、ＨＬＡクラスＩＩアイソタイプＨＬＡ−ＤＱおよびＨＬＡ−ＤＰに対する抗体では、ＡＰＣでパルスしたペプチドを用いたクローンの反応性を阻害することはできなかった。この実験は、これらの２つのＴ細胞クローンに対するペプチドが存在を担う分子としてＨＬＡ−ＤＲを明解に同定する。抗体阻害実験を、ＡＰＣとしてホモ接合性ＥＢＶ形質転換細胞株９０６１（ＩＨＷＳ９命名法）を用いて行った。ＡＰＣを、１５μｇ／ｍｌの濃度のペプチドで３７℃で１時間パルスし、１０μｇ／ｍｌの阻害抗体Ｌ２４３（ｐａｎ−ＤＲ抗体）、ＳＰＶＬ３（ｐａｎ−ＤＱ抗体）、およびＢ７．２１（ｐａｎ−ＤＰ抗体）を添加した。阻害抗体の非存在下での非パルスＡＰＣおよびペプチドパルス化ＡＰＣを、それぞれネガティブコントロールおよびポジティブコントロールとして用いた。結果を、図８に示す。
【図１０】 ＩＭＴ患者をＨＬＡタイピングしたところ、ＨＬＡ：Ａ１、２；Ｂ７、８；ＤＲ３、１４；ＤＱ１、２と判明した。配列番号１７のペプチドの提示を担うＨＬＡ−ＤＲ分子を同定するために、ホモ接合性ＢＣＬ細胞株を得るＨＬＡワークショップのパネルを得て配列番号１７のペプチドでパルスした。図１０は、Ｔ細胞クローンＩＭＴ８およびＩＭＴ９に対する配列番号１７のペプチドの提示を担うＨＬＡ−ＤＲ分子としてのＨＬＡ−ＤＲ１４（ＤＲＡ*０１０２、ＤＲＢ*１４０１）の同定を示す。ペプチドが自系ＥＢＶ形質転換細胞株（自系ＡＰＣ）ならびに細胞株９０５４（ＥＫ）および９０６１（３１２２７ＡＢＯ）（両株はそれらの表面上に唯一つのＤＲ分子としてＤＲ１４を発現する）によって提示された場合、特異的な増殖応答が認められた。ホモ接合性細胞株は、より高い応答性を示すが、これは、このＤＲ分子をコードする遺伝子の二倍の用量の影響により関連クラスＩＩ／ペプチド複合体の発現レベルがより高いことを反映する。患者のＡＰＣで発現した他のＤＲ分子を示すＨＬＡ−ＤＲ３を発現する細胞株（９０１８、Ｌ００８１７８５）および関連性のないＨＬＡ−ＤＲ分子によってペプチドを提示した場合、いずれも応答は得られなかった。抗原阻害を行わなかったこと以外は図９に記載のように実験を行った。結果を図８に示す。
【図１１】 図１１は、漸増濃度の配列番号１７のペプチドを用いて細胞株９０５４のパルス化によって得た用量反応曲線を示す。ＩＭＴ８およびＩＭＴ９共に、ペプチドに対する増殖応答において用量依存の増加を示す。結果を、図（図１１）に示したペプチド濃度で図９および図１０に記載のように行った。結果を、図８に示す。
【図１２】 図１２は、健常な血液ドナー（ドナー２８９２）由来の末梢血から単離したＴ細胞の、配列番号１６、配列番号１７、および配列番号２１のペプチドでパルスした照射自系樹状細胞で毎週刺激するin vitro刺激によって得られた細胞株の反応性を示す。Ｔ細胞を配列番号２１のペプチドでパルスした自系樹状細胞で同時にインキュベートした場合の、バックグラウンド値を超える特異的応答を得た。１回目および２回目のin vitro刺激後の培養物では活性は検出できなかった。これらのデータは、正常な個体のＴ細胞レパートリーには、正常なヒトには起こりえないＴＧＦβＲＩＩにおける変異由来のこのフレームシフトペプチドを認識する能力を有するいくつかの前駆体細胞を含むことを示す。他の２つの血液ドナー（＃２７０６および＃２８９６）では、関連する特異性を有する前駆体細胞レベルは、非常に低く検出不可能であった。この結果は、従来のＩＦＮｇ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて試験したスポット数／１０4Ｔ細胞として示す。このアッセイを、規定の抗原と特異的に反応することができる細胞の混合物に存在する細胞数として列挙する。簡単に述べれば、１０7のＴ細胞（非付着細胞）を、ＡＰＣとして２〜５×１０6の照射ペプチドパルス化自系樹状細胞（ＤＣ）で毎週刺激した。文献に記載の標準的なプロトコールに従って、組換えヒトＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４中で１週間培養することによって、付着細胞集団からＤＣを産生させた。１５μｇ／ｍｌのペプチドでの一晩のペプチドパルス化後、完全に成熟したＤＣを、組換えＴＮＦαと培養することによって得た。２連の１０4培養Ｔ細胞／ウェルおよびＡＰＣとしてＤＣでパルスしたかしていない１０4ペプチドを用いて、標準的な公開されているプロトコールに従って、ＥＬＩＳＰＯＴを行った。結果を、平均スポット数／１０4Ｔ細胞で示す。
【図１３】 図１３は、配列番号１５〜配列番号２１のペプチドを用いた健常な血液ドナー（ドナー３２２）由来のＴ細胞のin vitro刺激の結果を示す。in vitro培養を、図１２に記載のように行った。配列番号１６および配列番号２１のペプチドの混合物でプライムしたＴ細胞培養物を配列番号２１のペプチドで刺激した場合、および配列番号１７のペプチドでプライムした培養物を同一のペプチドで刺激した場合に、バックグラウンド値を超える増殖応答が認められた。これらの結果は、正常な血液ドナーは、これらのフレームシフトペプチドに特異的な少数の循環Ｔ細胞を有し、フレームシフトペプチドを用いた刺激による培養においてこれらの細胞を増やすことができることを示す。これらの結果はまた、配列番号１７のペプチドはヒトにおいて免疫原性であることを示す図８〜図１１に示した結果を確認し、配列番号２１のペプチドは、ヒトにおける癌ワクチンとしても使用することができることを示す。結果を、図８に記載のように示す。
【図１４】 図１４に示した結果は、ＨＬＡクラスＩエピトープに特異的なＣＤ８+Ｔ細胞は、健常な血液ドナー（ドナー９０５）のＴ細胞レパートリー中に存在するＴ細胞から産生させることができることを示す。in vitroでの２回目の再刺激後ではいずれのペプチドを用いても、バックグラウンドを超える反応性は認められなかった。４回目の再刺激後、配列番号４２８のペプチドに特異的なＴ細胞の頻度は、検出不可能なレベルから、約２．５％の細胞レベルに増加した。これらの結果は、ＣＤ８+表現型のＣＴＬ前駆体は、健常な血液ドナーのプライムされていないＴ細胞レパートリーに存在することを示す。このようなＴ細胞を、配列番号４２８のペプチドを用いた特異的刺激によってin vitroで増やすことができる。これは、このような変異を有する癌患者のフレームシフトペプチドに特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を惹起するための癌ワクチンとしてのこのペプチドの使用の基本となる。Ｔ細胞を、末梢血から単離したＴ細胞の毎週の再刺激によって産生し、ＣＤ８表現型の細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を産生させるための標準的な手順に従って、ＩＬ−７およびＩＬ−２を培養中に添加する以外は図１２に記載のようにペプチドパルス化自系ＤＣを用いて刺激した。使用したペプチドは、配列番号４２８、配列番号４３９、配列番号４４６、および配列番号４５１のペプチドであった。細胞を、図１２に記載のようにＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて試験した。結果を、図１２に記載のように示す。
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- 配列番号１、配列番号９〜１２からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドを含む、癌治療用医薬組成物。
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