JP5890769B2

JP5890769B2 - がんの予防及び治療のためのｍｓｉ特異的なフレームシフトペプチド（ｆｓｐ）

Info

Publication number: JP5890769B2
Application number: JP2012272828A
Authority: JP
Inventors: クロール、マティーアス; ロイシェンバッハ、ミリアム; フォン・クネベル−デベリッツ、マグヌス
Original assignee: Universitaet Heidelberg
Current assignee: Universitaet Heidelberg
Priority date: 2012-12-13
Filing date: 2012-12-13
Publication date: 2016-03-22
Anticipated expiration: 2032-12-13
Also published as: JP2014118361A

Description

本発明はマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）を特徴とするがんの予防及び治療用のワクチンを提供する。上記ワクチンは腫瘍細胞に対する体液性応答及び細胞性応答を生じさせるＭＳＩ特異的なフレームシフトペプチド（ＦＳＰ）又は該ＦＳＰをコードする核酸を含有する。

ヒト腫瘍はゲノム不安定性の２つの主要経路、染色体不安定性及びＤＮＡミスマッチ修復システムの欠損に起因するマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）を通じて発生する。ＭＳＩは、結腸直腸がんの１５％、並びに子宮内膜がん、胃がん、小腸がん及び他の臓器の腫瘍を含む、欠損したＤＮＡミスマッチ修復システムを示す多様な結腸外の悪性腫瘍で起こる。ＭＳＩがんは散発的に又は遺伝性腫瘍症候群、遺伝性非ポリープ性結腸直腸がん（ＨＮＰＣＣ）又はリンチ症候群との関連で発生し得る。

ＭＳＩ結腸直腸がんは、遺伝子コード領域のマイクロサテライトが突然変異による影響を受ける場合に、翻訳リーディングフレームの変更をもたらすミスマッチ修復の欠損の直接的な結果としての、ＭＳＩ腫瘍の発生中での多くのフレームシフトペプチド（ＦＳＰ）の生成に起因する高い免疫原性を特徴とする（図１）。

予測可能なＭＳＩ特異的なＦＳＰ抗原が豊富にあること、及びこれらの抗原が悪性の形質転換プロセスに直接起因するという事実から、ＦＳＰは免疫療法において非常に有望な標的となる。ヒト免疫系は腫瘍細胞を根絶する可能性を秘めた手段であり、免疫系の要素が適切に刺激され、がん細胞を認識し、排除する場合に、効果的な治療法を開発することができると考えられている。このため、免疫療法（これは直接的に又は間接的に身体の免疫系を活性化させ、がんを縮小させるか又は根絶させるための組成物及び方法を含む）が、従来のがん療法の補助として長年研究されてきた。

腫瘍の成長及び転移は宿主の免疫監視機構（immune surveillance）を回避する腫瘍の能力に大きく依存することが一般的に認められている。ほとんどの腫瘍は、宿主免疫系が様々な程度で認識することができる抗原を発現するが、多くの場合で、免疫応答は不十分である。エフェクターＴ細胞の強い活性化を誘起することができないのは、腫瘍抗原の弱い免疫原性又は腫瘍細胞による共刺激分子の不適切な若しくは欠失した発現によるものである可能性がある。ほとんどのＴ細胞において、ＩＬ−２の産生及び増殖には、ＴＣＲ係合と同時の共刺激シグナルが要求され、そうでなければＴ細胞はクローンアネルギーとして知られる機能的に不応答な状態に入る可能性がある。

これらの治療法が研究されてきた時間の長さにもかかわらず、腫瘍抗原に対する免疫応答を高める改善された戦略が依然として必要とされている。

また、がん免疫療法として免疫系を刺激することができる安全かつ効果的な組成物が当該技術分野で必要とされている。

本発明によれば、がん免疫療法としての免疫系の安全かつ効果的な刺激は、特許請求の範囲で規定される主題によって達成される。ｉｎｖｉｔｒｏデータにより、ＦＳＰが高い免疫原性を有し、ｉｎｖｉｔｒｏにおいて顕著なＦＳＰ特異的なＴ細胞応答を誘起することができることが示された（Linnebacher et al. 2001、Ripberger et al. 2003、Schwitalle et al. 2004）。ＭＳＩ結腸がんを有する患者から採取した末梢血を検査する更なる研究において、高頻度のＦＳＰ特異的なＴ細胞応答が実証された（Schwitalle et al. 2008）。腫瘍及び末梢血に多くのＦＳＰ特異的なＴ細胞があるにもかかわらず、これらの患者は自己免疫の兆候を示さず、このことはＦＳＰワクチン接種アプローチが自己免疫の観点から副作用を有しないことが期待されることを示唆した。

ＤＮＡミスマッチ修復遺伝子において遺伝性非ポリープ性結腸直腸がん（ＨＮＰＣＣ）の素因となる生殖系列の突然変異を保有する個体での免疫学的分析によって、臨床的に検出可能な腫瘍の非存在下でもＦＳＰに対する細胞性の免疫応答を示すことも見出された。このことは、ＦＳＰ特異的な免疫応答がＨＮＰＣＣ個体で保護的であり得ることを示唆し、これによりＦＳＰワクチン接種は遺伝性がん状態における最初の特定の予防アプローチとして予防的状況でも使用することができることが示唆される。

要約すると、
（ａ）フレームシフトペプチド（ＦＳＰ）はＭＳＩ特異的であり、ＭＳＩ腫瘍の病因に直接起因し、
（ｂ）臨床的に関連する副作用がないことが期待され、
（ｃ）ＦＳＰの組合せ（複数）がＭＳＩを有する全ての腫瘍を標的とすることが予測され、
（ｄ）ＦＳＰワクチン接種が、結腸がんの１５％、並びに子宮内膜、胃、小腸及び他の臓器の腫瘍の治療のために設計されており、
（ｅ）分子腫瘍分析により、ＦＳＰワクチン接種（標的療法）の恩恵を受けることができる患者を特定することができ、
（ｆ）ＦＳＰワクチン接種を高リスク群における予防ワクチン接種として使用することができる。

ＤＮＡミスマッチ修復欠損に起因するコーディングマイクロサテライト不安定性の概略図である（Kloor et al., 2010）。コーディングマイクロサテライトの突然変異が翻訳リーディングフレームの変化をもたらす場合、ＦＳＰ配列（赤色）を包含する短縮タンパク質が生成される（例えばＴＧＦＢＲ２タンパク質）。ＭＳＩ結腸がんの３人の患者由来の末梢血における新たに設計されたＦＳＰに対する例示的なＴ細胞応答を示す図である。ＡＩＭ２（−１）、ＨＴ００１（−１）、ＴＡＦ１Ｂ（−１）、及びＴＧＦＢＲ２（−１）から誘導されるＦＳＰに対する体液性免疫応答を示す図である。ＥＬＩＳＡにより、ＡＩＭ２（−１）、ＨＴ００１（−１）、ＴＡＦ１Ｂ（−１）、及びＴＧＦＢＲ２（−１）から誘導されるネオペプチド（neopeptides）に指向性を有するＦＳＰ特異的な抗体応答が明らかになった。ペプチドの特異性は、これまでに記載されたように各血清抗体の前吸収（preabsorption）により実証された（Reuschenbach et al., 2008）。ＣＤ１０７ａの表面発現により決定される細胞傷害性応答を示す図である。４週間、抗原でＴ細胞を刺激した後、様々な健常ドナーにおいて有意なＦＳＰ特異的な応答が観察された。応答は抗原提示Ｂ細胞及びＦＳＰ抗原の存在下でのみ生じた。代表的な応答を棒グラフで示す。ＣＤ１０７ａの表面発現により決定される細胞傷害性応答を示す図である。ＦＳＰ抗原ＨＴ００１（−１）の非存在下（左パネル）又は存在下（右パネル）での抗原提示細胞としてのＢ細胞とインキュベートしたＴ細胞に関するＣＤ１０７ａアッセイの代表的なＦＡＣＳ分析を示す。

このため、本発明は、ＭＳＩ腫瘍特異的なフレームシフトペプチド（ＦＳＰ）、例えばＴＡＦ１Ｂ（アクセッション番号Ｌ３９０６１）、ＨＴ００１（アクセッション番号ＡＦ１１３５３９）、ＡＩＭ２（アクセッション番号ＡＦ０２４７１４）、又はＴＧＦＢＲ２（アクセッション番号ＮＭ＿００３２４２）から誘導されるＦＳＰ、又は該ＦＳＰをコードする核酸を含有するワクチンであって、該ＦＳＰがＭＳＩを示すがんに対する免疫応答を誘起することが可能である、ワクチンを提供する。

好ましい実施形態では、本発明のワクチンは、
（ａ）以下のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＦＳＰ：
ＮＴＱＩＫＡＬＮＲＧＬＫＫＫＴＩＬＫＫＡＧＩＧＭＣＶＫＶＳＳＩＦＦＩＮＫＱＫＰ（ＴＡＦ１Ｂ（−１））、
ＥＩＦＬＰＫＧＲＳＮＳＫＫＫＧＲＲＮＲＩＰＡＶＬＲＴＥＧＥＰＬＨＴＰＳＶＧＭＲＥＴＴＧＬＧＣ（ＨＴ００１（−１））、
ＨＳＴＩＫＶＩＫＡＫＫＫＨＲＥＶＫＲＴＮＳＳＱＬＶ（ＡＩＭ２（−１））、若しくは
ＡＳＰＫＣＩＭＫＥＫＫＳＬＶＲＬＳＳＣＶＰＶＡＬＭＳＡＭＴＴＳＳＳＱＫＮＩＴＰＡＩＬＴＣＣ（ＴＧＦＢＲ２（−１））、
（ｂ）（ａ）のＦＳＰの機能的等価物、又は
（ｃ）（ａ）及び／若しくは（ｂ）のＦＳＰの組合せ、
を含有する。

「機能的等価物」という用語は、本明細書で使用される場合、例えばがんに対する免疫応答を誘起することが依然として可能である、すなわち有効なワクチンとして依然として有用である、ＦＳＰの変異体又は断片に関する。免疫応答は以下の基準の少なくとも１つを満たす状態として定義される：１．ＥＬＩＳｐｏｔ、又は細胞内サイトカイン染色、又はサイトカインＥＬＩＳＡ、又は同等の方法によってバックグラウンドを超えるものとして（as above background）測定可能な、細胞傷害性アッセイ、若しくはＩＦＮ−γ分泌、若しくはパーフォリン発現、若しくはグランザイムＢ発現、若しくはＣＤ８陽性Ｔ細胞によって産生され得る他のサイトカインによって検出可能なＣＤ８陽性Ｔ細胞の誘導。２．ＥＬＩＳｐｏｔ、又は細胞内サイトカイン染色、又はサイトカインＥＬＩＳＡ、又は同等の方法によってバックグラウンドを超えるものとしてとして測定可能な、サイトカイン分泌によって検出可能なＣＤ４陽性Ｔ細胞の誘導。サイトカインはＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β、又はＣＤ４陽性Ｔ細胞によって産生され得る他のサイトカインを含み得る。３．ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ及び同等又は関連の方法によって検出可能な抗体の誘導。４．１及び２に記載のＣＤ８陽性Ｔ細胞又はＣＤ４陽性Ｔ細胞によって媒介されない任意の種類の細胞性免疫応答の誘導。

変異体は、アミノ酸の欠失、置換、及び／又は付加を特徴とする。好ましくは、アミノ酸差異は１つ又は複数の保存的なアミノ酸置換によるものである。「保存的なアミノ酸置換」という用語は、脂肪族又は疎水性のアミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅの置き換え、ヒドロキシル残基Ｓｅｒ及びＴｈｒの置き換え、酸性残基Ａｓｐ及びＧｌｕの置き換え、アミド残基Ａｓｎ及びＧｌｎの置き換え、塩基性残基Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓの置き換え、芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの置き換え、並びに小さいサイズのアミノ酸Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ及びＧｌｙの置き換えを包含する。

ＦＳＰに対して特定の程度の同一性を示すペプチドの生成については、ペプチド機能に重要な領域を同定するために、例えば遺伝子操作を用いてクローン化ＤＮＡ配列の特定の位置にアミノ酸変化を導入することができる。例えば、部位特異的突然変異誘発又はアラニンスキャニング突然変異誘発（分子内の残基毎の単一のアラニン突然変異の導入）を用いることができる（Cunningham and Wells, 1989）。次いで、得られる突然変異分子を、実施例１のアッセイを用いて免疫原性について試験することができる。

好ましくは、変異体は、８個以下のａａ、より好ましくは６個以下のａａ、及び更により好ましくは４個以下のａａの置換、欠失及び／又は付加を特徴とする。

ＦＳＰの断片において、特定のアミノ酸配列の少なくとも５個の連続したａａ、好ましくは少なくとも１０個の連続したａａ、より好ましくは少なくとも１５個の連続したａａ、及び更により好ましくは少なくとも２０個の連続したａａが残存する。その断片は依然として、免疫応答を誘起することが可能である。

より好ましい実施形態では、本発明のワクチンは、アジュバント、及び／又は免疫賦活性のサイトカイン若しくはケモカインを更に含む。

好適なアジュバントは、水酸化アルミニウムゲル（アラム）又はリン酸アルミニウム等のアルミニウム塩を含むが、カルシウム、鉄若しくは亜鉛の塩であっても、又はアシル化チロシン若しくはアシル化糖の不溶性懸濁液、カチオン的に若しくはアニオン的に誘導体化した多糖、又はポリホスファゼンであってもよい。他の既知のアジュバントとしては、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが挙げられる。このオリゴヌクレオチドは、ＣｐＧジヌクレオチドがメチル化されていないことを特徴とする。かかるオリゴヌクレオチドは既知であり、例えば国際公開第９６／０２５５５号に記載されている。

免疫賦活性サイトカインの使用は、がん免疫療法においてますます有望なアプローチとなってきている。その主な目的は、腫瘍組織量が低い患者由来の腫瘍細胞を拒絶することが可能である腫瘍特異的なＴリンパ球の活性化、又は疾患の再発から患者を守ることである。高いレベルの免疫賦活性サイトカインを抗原の部位に局所的に提供する戦略は前臨床的有効性及び臨床的有効性が実証されている。好ましい免疫賦活性サイトカインはＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＦＮ、ＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦ−αを含む。

ケモカインは、白血球及び樹状細胞の走化性、ＰＭＮ脱顆粒、及び血管形成にかかわる、小さく（７ｋＤ〜１６ｋＤ）分泌型の構造的に関連した可溶性タンパク質である。ケモカインは傷害、アレルゲン、抗原、又は侵入微生物に対する宿主応答の初期段階の間に産生される。ケモカインは白血球を炎症性の病巣（foci）へと選択的に引き付け、細胞の移動及び活性化の両方を誘導する。ケモカインは腫瘍に対する先天性又は特異的な宿主免疫を高めることができ、このためＦＳＰとの併用にも有用であり得る。

本発明のワクチンは、タンパク質抗原に対する体液性免疫応答及び細胞性免疫応答を効果的に刺激するのに使用される技法であるＤＮＡ免疫付与のために、ＦＳＰをコードする核酸を含有していてもよい。生きた宿主への遺伝物質の直接注射によって、その細胞の少量が導入遺伝子産物を産生する。宿主内でのこの不適切な遺伝子発現は、重要な免疫学的重要性を有し、遺伝子送達抗原に対する宿主の特異的な免疫の活性化をもたらす。裸のプラスミドＤＮＡの直接注射は、遺伝子ワクチンによりコードされる抗原に対する強い免疫応答を誘導する。プラスミドＤＮＡ構築物を注射すると、宿主細胞は、外来ＤＮＡを取り込み、ウイルス遺伝子を発現し、ＦＳＰが細胞内で産生される。このような形の抗原提示及びプロセシングは、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩの両方によって制限される細胞性及び体液性の免疫応答を誘導する。ＤＮＡワクチンは、通常、プロモーター／エンハンサー配列、その後に続く抗原（ＦＳＰ）コード配列及びポリアデニル化配列から構成される抗原発現単位、並びにベクターの増幅及び選択に必要な配列から構成される産生単位という２つの単位を含有するベクターから構成される。ワクチンインサート（inserts）を含むベクターの構築は、組換えＤＮＡ技術を用いて達成され、また当業者はこのアプローチに用いることができるベクターを認識している。ＤＮＡ免疫付与の効率は、ＤＮＡを分解に対して安定化させること、及び抗原提示細胞へのＤＮＡの送達の効率を増大させることにより改善することができる。これは、生分解性のカチオン性微粒子（例えば臭化セチルトリメチルアンモニウムを配合したポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド））にＤＮＡをコーティングすることによって実証されている。かかるＤＮＡコーティング微粒子は、とりわけアラムと混合した場合に、ＣＴＬを惹起する点で組換えワクシニアウイルスと同程度に効果的であり得る。直径３００ｎｍの粒子が、抗原提示細胞による取り込みに最も有効であると考えられる。

様々な発現ベクター、例えばプラスミド又はウイルスベクターを利用して、本発明のＦＳＰをコードする核酸配列を含有させ、発現することができる。

好ましいウイルスベクターは、ポックスウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。特に好ましいポックスウイルスは、ワクシニアウイルス、ＮＹＶＡＣ、アビポックスウイルス、カナリア痘ウイルス、ＡＬＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ（２）、鶏痘ウイルス又はＴＲＯＶＡＣである。

ＤＮＡワクチン接種の効率を改善するのに、組換えアルファウイルスベースのベクターも使用されている。ＦＳＰをコードする遺伝子をアルファウイルスレプリコンに挿入して、構造遺伝子を置き換えるが、非構造性レプリカーゼ遺伝子は無傷のままにする。シンドビスウイルス及びセムリキ森林熱ウイルスが、組換えアルファウイルスレプリコンを構築するのに使用されている。しかしながら、従来のＤＮＡワクチン接種とは異なり、アルファウイルスベクターは一時的にしか発現されない。アルファウイルスレプリコンは、このベクターによって発現される高レベルのタンパク質に起因した免疫応答、レプリコン誘導性のサイトカイン応答、又はレプリコン誘導性のアポトーシスを惹起し、樹状細胞による抗原の取り込みの向上がもたらされる。

更に好ましい実施形態では、ＦＳＰはＴａｇ配列を、好ましくはＣ末端に含有し、このことは組換えにより作製されたＦＳＰの精製に有用であり得る。好ましいＴａｇ配列はＨｉｓ−Ｔａｇである。特に好ましいＨｉｓ−Ｔａｇは６個のＨｉｓ残基からなる。

本発明のワクチンは、個体の免疫付与に好適な量で投与され、好ましくは１つ又は複数の一般的な助剤を更に含有する。用いられる「個体の免疫付与に好適な量」という用語は個体に免疫を付与することができるＦＳＰの任意量を含む。その量は、免疫付与が予防的処置を目的とするか、又は治療的処置を目的とするかに応じて異なる。加えて、個体の年齢、性別及び体重も量の決定に影響を与える。このため、個体の免疫付与に好適な量は、腫瘍の経過及び重症度に影響を与えるのに十分であり、かかる病状の低減又は寛解をもたらす、活性成分の量を表す。「個体の免疫付与に好適な量」は当業者にとって既知の方法を用いて決定することができる（例えばFingl et al., 1975を参照されたい）。「個体」という用語は、本明細書で使用される場合、癌に罹患する可能性のある任意の種の個体を含む。かかる個体の例はヒト及び動物、並びにそれらの細胞である。

注射によるワクチンの投与は、個体の様々な部位で筋肉内、皮下、皮内に、又は任意の他の適用形態で行うことができる。ほぼ等量の１回又は複数回の「ブースター注射」を行うことも好都合であり得る。

用いられる「一般的な助剤」という用語は、ワクチンにより個体に免疫を付与するのに好適な任意の助剤を含む。かかる助剤は、例えば緩衝食塩溶液、水、エマルション、例えば油／水エマルション、湿潤剤、滅菌溶液等である。

本発明のＦＳＰ、核酸配列又はベクターは、ワクチン自体に又は担体と組み合わせて存在していてもよい。個体内の担体は免疫原性ではないことが好都合である。かかる担体は個体自身のタンパク質若しくは外来タンパク質、又はそれらの断片であり得る。担体、例えば血清アルブミン、フィブリノゲン若しくはトランスフェリン、又はそれらの断片が好ましい。

本発明のワクチンは治療的なものであってもよく、すなわちこの化合物が存在しているがんを治療するのに若しくはがんの再発を予防するのに投与されるか、又は予防的なものであってもよく、すなわちこの化合物ががんの発生を抑える若しくは遅延させるのに投与される。組成物が治療的に使用される場合、この組成物は、がん患者に投与され、免疫応答を誘起し、存在するがんの成長を抑える若しくは遅らせることにより腫瘍を安定化させるように、腫瘍若しくは転移の拡散を抑えるように、腫瘍の大きさを低減するように、治療済みのがんの再発を予防するように、又は先の治療では死滅されないがん細胞を排除するように設計される。予防的処置として用いられるワクチンは、がんを有しない個体に投与され、免疫応答を誘起し、潜在的ながん細胞を標的とするように設計される。

本発明は、癌の予防、例えば高リスク群の予防ワクチン接種、又は癌の治療用のワクチンの作製のための上で規定されるＦＳＰ若しくは機能的等価物、核酸配列、又はベクターの使用にも関する。例えば、これらは結腸直腸がん、好ましくは遺伝性非ポリープ性結腸直腸がん（ＨＮＰＣＣ）、子宮内膜がん、胃がん又は小腸がんであり得る。

本発明では、個体、特にヒト及び動物に免疫を付与することが可能である。免疫付与は抗体の誘導及びＣＤ８^＋Ｔ細胞の刺激の両方によって行われる。これにより、癌に対する予防的及び治療的な措置を講じることが可能である。

以下の実施例は本発明をより詳細に説明する。

実施例１
ＭＳＩ結腸がんを有する患者及び健常なＨＮＰＣＣ突然変異保因者由来の末梢血中のＦＳＰ特異的なＴ細胞の検出
（Ａ）方法（ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ）
ＦＳＰ特異的な末梢Ｔ細胞（ｐＴｃ）の頻度を、ＥＬＩＳｐｏｔ分析を用いて、３ｃＭＳ含有候補遺伝子から誘導される新たに設計されたＦＳＰに対して特異的なＩＦＮ−γ分泌型のＴｃの数を決定することにより定量した。ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを、マウス抗ヒトＩＦＮ−γモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（Mabtech, Nacka, Sweden）で一晩コーティングし、血清含有培地を用いてブロッキングした９６ウェルニトロセルロースプレート（Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ；Millipore, Bedford, MA）を用いて実施した。ｐＴｃ（０日、１×１０^５／ウェル）を、１０％ヒトＡＢ血清を有する２００μｌのＩＭＤＭ中で抗原提示細胞である自己ＣＤ４０活性化Ｂ細胞（それぞれ、４×１０^４／ウェル、ＴｉＢｃ又はｐＢｃ）とともに、６重で（6-fold）プレーティングした。ペプチドを最終濃度が１０μｇ／ｍＬとなるように添加した。陽性対照として、ｐＴｃを、３５０ｎｍｏｌ／Ｌのイオノマイシンと組み合わせて２０ｎｍｏｌ／Ｌのホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテートで処理した。３７℃で２４時間のインキュベーション後、プレートを十分に洗浄して、ビオチン化ウサギ抗ヒトＩＦＮ−γ ｍＡｂと４時間インキュベートして、再び洗浄し、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼと２時間インキュベートした後、最後の洗浄工程を行った。スポットを１時間のＮＢＴ／ＢＣＩＰ（Sigma-Aldrich）とのインキュベーションにより検出し、水を用いて反応を停止させ、乾燥後に顕微鏡によってスポットをカウントした。方法はSchwitalle et al., 2008において詳細に記載されている。

（Ｂ）結果
ＦＳＰ特異的なＴ細胞応答がＭＳＩ−ＨＣＲＣ患者の末梢血中で検出可能であるかどうかを調べるために、ＥＬＩＳｐｏｔ分析を実施した。ＭＨＣクラスＩ及びＩＩの高い発現を示す自己ｐＢｃと、共刺激因子（ＣＤ４０、ＣＤ８０及びＣＤ８６）と、Ｂ細胞特異的抗原（ＣＤ１９及びＣＤ２３）とを抗原提示細胞として使用した。

ＡＩＭ２（−１）、ＨＴ００１（−１）、ＴＡＦ１Ｂ（−１）及びＴＧＦＢＲ２（−１）から誘導された新たに設計されたＦＳＰに対して顕著な反応性が観察された：
ＴＡＦ１Ｂ（−１）ＮＴＱＩＫＡＬＮＲＧＬＫＫＫＴＩＬＫＫＡＧＩＧＭＣＶＫＶＳＳＩＦＦＩＮＫＱＫＰ
ＨＴ００１（−１）ＥＩＦＬＰＫＧＲＳＮＳＫＫＫＧＲＲＮＲＩＰＡＶＬＲＴＥＧＥＰＬＨＴＰＳＶＧＭＲＥＴＴＧＬＧＣ
ＡＩＭ２（−１）ＨＳＴＩＫＶＩＫＡＫＫＫＨＲＥＶＫＲＴＮＳＳＱＬＶ
ＴＧＦＢＲ２（−１）ＡＳＰＫＣＩＭＫＥＫＫＳＬＶＲＬＳＳＣＶＰＶＡＬＭＳＡＭＴＴＳＳＳＱＫＮＩＴＰＡＩＬＴＣＣ
（ネオペプチド配列は下線処理している）

患者（ｎ＝８）から得られた結果を表１にまとめる。代表的なＥＬＩＳｐｏｔ結果を図２に示している。

反復分析による平均スポット数をそれぞれのペプチド及び試験個体に対して与える。ＭＳＩ０１〜ＭＳＩ０７−ＭＳＩ−ＨＣＲＣを有する患者、ＭＣ０１〜ＭＣ０６−健常なＨＮＰＣＣ生殖系列突然変異保因者。

実施例２
ＭＳＩ結腸がんを有する患者及び健常なＨＮＰＣＣ突然変異保因者由来の末梢血中でのＦＳＰ特異的な体液性免疫応答の検出
（Ａ）方法（ＥＬＩＳＡ）
酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）のために、ペプチドをＰＢＳ中、４℃で４０μｇ／ｍｌの濃度で９６ウェルポリスチロールマイクロタイタープレート「Ｍａｘｉｓｏｒｐ」（Nunc, Roskilde, Denmark）に一晩コーティングした。コーティング後、プレートをＰＢＳ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ）で４回洗浄し、ＰＢＳ中の０．５％カゼインを用いて１時間ブロッキングした。マイクロタイタープレートへのペプチド結合及び最適な飽和ペプチド濃度を、アルカリホスファターゼ−ペプチド競合アッセイを用いて評価した。それぞれの血清の個々のバックグラウンド反応性をモニタリングするために、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}タンパク質（ｐ１６＿７６〜１０５）から誘導される対照ペプチドを使用したが、これに対する抗体反応性は大きな個体集団（cohort）においては見出されなかった（Reuschenbach et al., 2008）。それぞれの血清をブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中、０．５％カゼイン）で１：１００に希釈し、全てのＦＳＰ及び対照ペプチドに対する抗体の存在に関して二連で試験した。プレート間の分散の参照として、プレートごとに１つの対照血清を含め、対照血清のペプチド特異的なＯＤを正規化に使用した。希釈血清（５０μｌ／ウェル）を１時間インキュベートし、洗浄工程後、プレートをＨＲＰ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Jackson Immunoresearch, West Grove, PA；ブロッキング緩衝液中、１：１００００）と１時間インキュベートした。洗浄後、５０μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（Sigma, Deisenhofen, Germany）を添加し、３０分後に５０μｌ／ウェルの１ＮＨ_２ＳＯ_４を添加することにより酵素反応を停止させた。吸光度を４５０ｎｍで測定した（参照波長５９５ｎｍ）。特異性の制御のための血清抗体の前吸収は、Reuschenbach et al., 2008において詳細に記載された方法に従って行った。

（Ｂ）結果
ＦＳＰ特異的な抗体がＭＳＩ−ＨＣＲＣ患者、健常なリンチ症候群突然変異保因者、及び健常な対照の末梢血中で検出可能であるかどうかを調べるために、ＥＬＩＳＡ分析を実施した。ＡＩＭ２（−１）、ＨＴ００１（−１）、ＴＡＦ１Ｂ（−１）及びＴＧＦＢＲ２（−１）から誘導される新たに設計されたＦＳＰに対して顕著な反応性が観察された。ＥＬＩＳＡの結果を図３に示している。

実施例３
ＦＳＰ特異的な細胞傷害性Ｔ細胞応答の検出
臨床ＦＳＰ抗原による刺激時のエフェクターＴ細胞上でのＣＤ１０７ａの表面発現を測定した。ＣＤ１０７ａアッセイを用いて、エフェクター細胞からのパーフォリン／グランザイムＢを含有する細胞傷害性粒子の分泌を実証する。ＣＤ１０７ａ分子は細胞傷害性粒子の表面上で発現し、細胞傷害性Ｔ細胞応答との関連で粒子が放出される場合に、細胞表面上で検出可能となる。

ＦＳＰペプチドが細胞傷害性の細胞性免疫応答を誘導する可能性を判断するために、血液を健常ドナーから採取し、Ｔ細胞を抗原提示細胞として樹状細胞を用いてＦＳＰで刺激した。刺激は４週間にわたって週に１回繰り返し行った。４週間後、Ｔ細胞を採取し、標的細胞及びＦＳＰと共インキュベートし、ＣＤ１０７ａアッセイを用いて、細胞傷害性Ｔ細胞応答のペプチド特異的な誘導を分析した。

抗原性ＦＳＰの存在下において抗原提示細胞であるＢ細胞と共インキュベートしたＴ細胞において、ＣＤ１０７ａの表面発現により決定されるように、細胞傷害性応答が観察された（図４Ａ）。４週間の抗原によるＴ細胞の刺激後に、様々な健常ドナーにおいて有意な応答が観察された。代表的な応答を棒グラフに示している。図４ＢはＦＳＰ抗原ＨＴ００１（−１）の非存在下（左パネル）又は存在下（右パネル）での抗原提示細胞であるＢ細胞とインキュベートしたＴ細胞に関するＣＤ１０７ａアッセイの代表的なＦＡＣＳ分析を示す。

参考文献
Cunningham and Wells, Science 244 (1989), 1081-1085.

Fingl et al., The Pharmocological Basis of Therapeutics, Goodman and Gilman, eds. Macmillan Publishing Co., New York, pp. 1-46 (1975).

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配列表

Claims

ＭＳＩ特異的なフレームシフトペプチド（ＦＳＰ）の組合せ、並びにアジュバント、及び／又は免疫賦活性のサイトカイン若しくはケモカインを含有する、結腸直腸がんを予防又は治療する方法において使用されるワクチンであって、該ＦＳＰが以下のアミノ酸配列からなる、ワクチン。
ＮＴＱＩＫＡＬＮＲＧＬＫＫＫＴＩＬＫＫＡＧＩＧＭＣＶＫＶＳＳＩＦＦＩＮＫＱＫＰ（ＴＡＦ１Ｂ（−１））、
ＥＩＦＬＰＫＧＲＳＮＳＫＫＫＧＲＲＮＲＩＰＡＶＬＲＴＥＧＥＰＬＨＴＰＳＶＧＭＲＥＴＴＧＬＧＣ（ＨＴ００１（−１））、及び
ＨＳＴＩＫＶＩＫＡＫＫＫＨＲＥＶＫＲＴＮＳＳＱＬＶ（ＡＩＭ２（−１））
前記ＦＳＰがＴａｇ配列を更に含有する、請求項１に記載のワクチン。
請求項１又は２に記載のＦＳＰをコードする核酸配列又は該核酸配列を含有するベクターを含有する、結腸直腸がんを予防又は治療する方法において使用されるワクチン。
前記ベクターがプラスミド又はウイルスベクターである、請求項３に記載のワクチン。
前記ウイルスベクターがポックスウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アルファウイルスベースのベクター又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項４に記載のワクチン。
前記ポックスウイルスがワクシニアウイルス、ＮＹＶＡＣ、アビポックスウイルス、カナリア痘ウイルス、ＡＬＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ（２）、鶏痘ウイルス又はＴＲＯＶＡＣである、請求項５に記載のワクチン。
前記ＦＳＰ、前記核酸配列又は前記ベクターが水中油型又は油中水型のエマルションビヒクル中に存在する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のワクチン。
１つ又は複数の他の抗原を更に含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のワクチン。
結腸直腸がんの予防又は治療用のワクチンの調製のための請求項１又は２に記載のＭＳＩ腫瘍特異的なフレームシフトペプチド（ＦＳＰ）、請求項３に記載の核酸、又は請求項３〜６のいずれか一項に記載のベクターの使用。
高リスク群の予防ワクチン接種のための請求項９に記載の使用。
前記結腸直腸がんが遺伝性非ポリープ性結腸直腸がん（ＨＮＰＣＣ）である、請求項１に記載のワクチン。