ES2319286T3 - Epitopos inmunogenos de linfocitos t colaboradores de antigenos de tumor humanos y utilizacion de dichos epitopos en metodos inmunoterapeuticos. - Google Patents
Epitopos inmunogenos de linfocitos t colaboradores de antigenos de tumor humanos y utilizacion de dichos epitopos en metodos inmunoterapeuticos. Download PDFInfo
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Abstract
Un péptido asociado a tumor con una longitud de entre 15 y 30 aminoácidos, que comprende un aminoácido contiguo conforme a SEQ ID n.º 1.
Description
Epítopos inmunógenos de linfocitos T
colaboradores de antígenos de tumor humanos y utilización de dichos
epítopos en métodos inmunoterapéuticos.
La presente invención se refiere a métodos
inmunoterapéuticos y a moléculas y a células para su uso en métodos
inmunoterapéuticos. En concreto, la presente invención se refiere a
la inmunoterapia del cáncer y, en particular, al cáncer renal. La
presente invención se refiere, además, a epítopos peptídicos de
linfocitos T colaboradores asociados a tumores, solos o en
combinación con otros péptidos asociados a tumores, que actúan como
ingredientes activos de vacunas que estimulan las respuestas
inmunológicas contra los tumores. En particular, la presente
invención se refiere a 338 novedosas secuencias peptídicas derivadas
de moléculas HLA de clase II de líneas celulares tumorales humanas,
que pueden ser usadas en la composición de vacunas para provocar
respuestas inmunológicas antitumorales.
La estimulación de la respuesta inmunológica
depende de la presencia de antígenos, reconocidos como extraños por
el sistema inmune huésped. El descubrimiento de la existencia de
antígenos asociados a tumores ha abierto la posibilidad de utilizar
el sistema inmune del huésped para intervenir en el crecimiento del
tumor. En la inmunoterapia del cáncer, actualmente se están
explorando diversos mecanismos para aprovechar las ramas humorales
y celulares del sistema inmune.
Determinados elementos de la respuesta
inmunológica celular son capaces de reconocer y destruir células
tumorales. El aislamiento de linfocitos T citotóxicos de
poblaciones de células destructoras de tumores o de sangre
periférica sugiere que estos linfocitos tienen un papel importante
en la defensa inmunológica natural contra el cáncer (Cheever y col,
"Annals N.Y. Acad. Sci". 1993 690: 101-112). En
particular, los linfocitos T CD8^{+} (TCD8^{+}), que reconocen
péptidos que alojan moléculas de clase I del complejo mayor de
histocompatibilidad (MHC) de, normalmente, 8 a 10 residuos
derivados de proteínas ubicadas en el citosol, tienen un papel
importante en esta respuesta. Las moléculas MHC humanas también se
designan antígenos de leucocito humano (HLA).
Existen dos clases de moléculas MHC: las
moléculas MHC de clase I, que se encuentran en la mayoría de las
células con un núcleo con péptidos resultantes de la división
proteolítica de proteínas endógenas y péptidos más largos; las
moléculas MHC de clase II, que sólo se encuentran en células
profesionales presentadoras de antígenos (APC). Presentan péptidos
de proteínas exógenas que son absorbidos por las APC durante el
proceso de endocitosis y, posteriormente, son procesadas. Los
complejos de péptido y MHC de clase I son reconocidos por
linfocitos T citotóxicos CD8^{+}. Los complejos de péptido y MHC
de clase II son reconocidos por linfocitos T colaboradores
CD4^{+}.
Para que un péptido provoque una respuesta
inmunológica celular, debe estar unido a una molécula MHC. Este
proceso depende del alelo de la molécula MHC y de polimorfismos
específicos de la secuencia de los aminoácidos del péptido. Los
péptidos de unión a moléculas MHC de clase I suelen tener una
longitud de 8 a 10 residuos y contienen dos residuos conservados en
su secuencia que interaccionan con el surco de unión correspondiente
de la molécula MHC.
Ahora existen numerosos ejemplos de TCD8^{+},
tanto humanos como de ratones, que reconocen específicamente
células tumorales y desarrollan una actividad terapéutica tras el
traslado adoptivo, induciendo, en algunos casos, la remisión
completa. Sin embargo, a pesar del potencial de los linfocitos T
para erradicar tumores, es obvio, teniendo en cuenta el crecimiento
progresivo de la mayoría de los cánceres, que muchos tumores no son
reconocidos por TCD8^{+} en vivo. A pesar de que se ha encontrado
una variedad de tumores inmunógenos, ha sido difícil demostrar la
estimulación de una respuesta inmune antitumoral efectiva:
Los antígenos que son reconocidos por los
linfocitos T específicos de tumores, es decir, sus epítopos, pueden
ser moléculas derivadas de cualquier clase de proteínas, como
enzimas, receptores, factores de transcripción, etc. Además, los
antígenos asociados a tumores también pueden estar presentes sólo en
células tumorales como, por ejemplo, como producto de genes
mutados. Otra clase importante de antígenos asociados a tumores son
las estructuras específicas de tejidos, como los antígenos CT
(testículo canceroso) que son expresados en distintos tipos de
tumor y en tejido sano del testículo.
Se han identificado diversos antígenos asociados
a tumores. Además, se están dedicando muchos esfuerzos a la
identificación de antígenos adicionales asociados a tumores. Algunos
grupos de antígenos asociados a tumores, también llamados por los
expertos "antígenos específicos de tumor", son específicos de
tejidos. Algunos ejemplos incluyen, sin limitarse a ellos, la
tirosinasa para el melanoma, el PSA y PSMA para el cáncer de
próstata y los cruzamientos cromosómicos, como el bcr/abl, en el
linfoma. Sin embargo, muchos de los antígenos asociados a tumores
que se han identificado tienen lugar en muchos tipos de tumores y,
algunos, como las proteínas oncógenas y/o los genes supresores de
tumores (los genes supresores de tumores para el cáncer renal, por
ejemplo, son analizados en Linehan, W. M, M. M. Walther, B. Zbar;
The genetic basis of cancer of the kidney; "J Urol";
dic. 2003;170 (6 Pt 1): 2163-72), que son los que
realmente causan el evento de transformación, tienen lugar en casi
todos los tipos de tumor. Por ejemplo, las proteínas celulares
normales que controlan el crecimiento y la diferenciación celular,
como las p53 (que es un ejemplo de gen supresor de tumor), ras,
c-met, myc, pRB, VHL y HER-2/neu,
pueden acumular mutaciones y resultar en una regulación ascendente
de la expresión de estos productos genéticos, transformándolos así
en oncógenos (McCartey y col; "Cancer Research"; 1998; 15: 58
2601-5. Disis y col; "Ciba Found. Symp"; 1994;
187: 198-211). Estas proteínas mutantes pueden ser
el blanco de una respuesta inmune específica de tumor en muchos
tipos de cáncer.
Un gen supresor de tumor es un gen que reduce la
probabilidad de que una célula de un organismo multicelular se
convierta en una célula tumoral. La mutación o eliminación de dicho
gen aumenta la probabilidad de desarrollar un tumor. En ese
sentido, un gen supresor de tumor es similar a un oncogén. Los genes
supresores de tumor o, más exactamente, las proteínas que
codifican, tienen un efecto amortiguador o represor en la regulación
del ciclo celular. Los genes/proteínas supresores de tumor realizan
esto básicamente de tres maneras: 1. Mediante la represión de los
genes esenciales para que el ciclo celular continúe. Si éstos genes
no son expresados, el ciclo celular no continuará y la división
celular inhibirá de forma efectiva. 2. Asociando el ciclo celular a
daños en el ADN. Mientras haya DNA dañado en la célula, ésta no se
debe dividir. Si el daño se puede reparar, el ciclo celular
continuará. 3. Si el daño no se puede reparar, la célula comenzará
el proceso de apoptosis -la muerte celular programada- para anular
la amenaza que supone para el bienestar del organismo. La primera
proteína supresora de tumor que se descubrió fue la pRb del
retinoblastoma humano. Un gen supresor de tumor importante es el
p53 (véase más arriba).
La transformación de proteínas a partir de virus
oncogénicos, como las E6 y E7 a partir del VPH o la EBNA1 a partir
del virus de Epstein-Barr (VEB), también ocurre en
muchos tipos de tumor y puede ser el blanco de una respuesta inmune
específica de tumor en múltiples tipos de cáncer (McKaig y col.
"Head Neck" 1998 20(3):250-65. Punwaney
y col. "Head Neck" 1999 21(1):21-9.
Serth y col. "Cancer Res". 1999
15:59(4):823-5. Pagano, J. S. "Proc. Assoc.
Am. Physicians" 1999 111(6):573-80). La
proteínas huésped que no son oncogénicas, como las familias MAGE y
MUC, son también ubicuas. Específicamente, la familia MAGE de
antígenos se ha encontrado en muchos tipos de cáncer, como el cáncer
de mama, de pulmón, de esófago, hepático, tiroideo, el
neuroblastoma, el cáncer gástrico, el melanoma y el mieloma múltiple
(Gillespie, A. M. y Coleman, R. E. "Cancer Treat. Rev". 1999
25(4):219-27). La familia MUC de antígenos se
ha asociado al cáncer de ovario y de endometrio, el cáncer de mama,
el mieloma múltiple, el cáncer de páncreas y el cáncer rectal y de
colon (Segal-Eiras, A. y Croce, M. V. "Allergol.
Immunopathol". 1997 25(4):176-81).
Además, la mayoría de los cánceres están
asociados a más de un antígeno. Algunos ejemplos de tumores que
expresan más de un antígeno tumoral incluyen, sin limitarse a
ellos, el cáncer de mama, asociado a MUC-1,
HER-2/neu, MAGE, p53, T/Tn y CEA; el cáncer de
colon, asociado a MUC-2 y MUC-4,
CEA, p53 y la familia MAGE; el melanoma, asociado a miembros de la
familia MAGE, a MART-1 y gp100; y el cáncer de
próstata, asociado a GM2, Tn, sTn, al antígeno
Thompson-Friedenreich (TF), MUC1, MUC2, la cadena
beta de la gonadotropina coriónica humana (hCG beta), HER2/neu,
PSMA y PSA. De hecho, se han sugerido los paneles de antígenos para
su uso en la inmunoterapia contra el cáncer con el fin de compensar
el hecho de que puedan desarrollarse variantes de los tumores con
pérdida de antígenos bajo la presión del sistema inmune (Zhang y
col. "Clin. Cancer Res". 1998 4:2669. Kawashima y col. "Hum.
Immunol". 1998 59:1).
Para que las proteínas puedan ser reconocidas
por los linfocitos T citotóxicos como antígenos de tumores
específicos, y para que se puedan utilizar en terapia, deben
cumplirse una serie de requisitos. El antígeno debe estar expresado
principalmente por células tumorales, y no por tejidos sanos
normales o en pequeñas cantidades. También es deseable, no sólo que
el antígeno correspondiente esté presente en un tipo de tumor, sino
que, además, aparezca en concentraciones altas (en número de copias
por célula, por ejemplo). La presencia de epítopos en la secuencia
de aminoácidos del antígeno es esencial, ya que el péptido
("péptido inmunógeno") que deriva de un antígeno asociado a un
tumor debe inducir una respuesta de los linfocitos T in vitro
o in vivo.
Hasta ahora, se han descrito numerosas
estrategias para encauzar antígenos hacia la vía de procesamiento de
clase II. Es posible incubar células presentadoras de antígenos
(APC) con el antígeno deseado para que sea absorbido y procesado
(Chaux, P., Vantomme, V., Stroobant, V., Thielemans, K., Corthals,
J., Luiten, R., Eggermont, A. M., Boon, T. & van der, B. P.
(1999) J. Exp. Med. 189, 767-778).
Otras estrategias usan las proteínas de fusión, que contienen
secuencias blanco lisosomales. Expresadas en APC, estas proteínas de
fusión dirigen a los antígenos al compartimento de procesamiento de
clase II (Marks, M. S., Roche, P. A., van Donselaar, E., Woodruff,
L., Peters, P. J. & Bonifacino, J. S. (1995) J. Cell
Biol. 131, 351-369, Rodriguez, F.,
Harkins, S., Redwine, J. M., de Pereda, J. M. & Whitton, J. L.
(2001) J. Virol. 75, 10421-10430).
En la inmunización contra los tumores, los
linfocitos T colaboradores desempeñan una función importante en la
organización de la función efectora de los CTL. Los epítopos de los
linfocitos T colaboradores que desencadenan una respuesta de los
linfocitos T colaboradores del tipo Th1 apoyan las funciones
efectoras de los linfocitos T citotóxicos CD8^{+}, que incluyen
funciones citotóxicas dirigidas contra células tumorales que
presentan MHC/péptidos asociados a tumores en sus superficies. De
esta forma, los epítopos peptídicos de linfocitos T colaboradores
asociados a tumores, solos o en combinación con otros péptidos
asociados a tumores, pueden actuar como ingredientes activos de
vacunas que estimulen las respuestas inmunológicas contra los
tumores.
La tarea principal en el desarrollo de una
vacuna tumoral es, por tanto, la identificación y caracterización
de novedosos antígenos asociados a tumores y epítopos inmunógenos de
linfocitos T colaboradores derivados de ellos que puedan ser
reconocidos por linfocitos T citotóxicos CD4^{+}. Un objeto de la
presente invención es, por tanto, proporcionar novedosas secuencias
de aminoácidos para el péptido que tiene la habilidad de unirse a
una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) humano
de clase II.
\newpage
Conforme a la presente invención, este objeto se
consigue proporcionando un péptido asociado a tumor de una longitud
de entre 15 y 30 aminoácidos que comprende una secuencia contigua de
aminoácidos conforme a la SEQ ID n.º 1 de la lista de secuencias
adjunta, en la que el péptido tiene la habilidad de unirse a una
molécula del complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de
clase II.
La presente invención describe además 337
novedosas secuencias peptídicas derivadas de moléculas HLA de clase
II de líneas celulares tumorales humanas, en particular líneas
celulares de cáncer renal, que pueden ser usadas en la composición
de vacunas para provocar respuestas inmunológicas antitumorales. Las
secuencias peptídicas han sido identificadas por medio de un
enfoque combinado nuevo y de aplicación general para la
identificación de ligandos desconocidos de clase II de HLA
procesados de forma natural de antígenos definidos -asociados a
tumores, por ejemplo. Así pues, se han identificado nuevos y
prometedores candidatos para la inmunoterapia basada en péptidos de
una forma que incluye la selección de antígenos tumorales de interés
destacable y la cuidadosa determinación de las secuencias de
péptidos derivadas de los mismos.
Un primer aspecto de la invención proporciona un
péptido como el anterior, siempre que el péptido no sea el
polipéptido humano intacto del que deriva la secuencia de
aminoácidos (es decir, una de las secuencias completas incluidas en
los ID de enlace del locus. Véase la tabla adjunta más abajo para
los números de registro).
Tal y como se describe más abajo, el péptido que
forman la base de la presente invención ha sido identificado como
presentado por células portadoras de MHC de clase II (células
Awells). Por tanto, este péptido en particular, así como
todos los péptidos que contengan la secuencia (a saber,
péptidos derivados), provocarán muy probablemente una respuesta
específica de los linfocitos T, si bien el alcance de dicha
respuesta podría variar de un péptido a otro. Podrían producirse
diferencias debido a mutaciones en los mencionados péptidos, por
ejemplo (véase más abajo). El experto en la materia conoce bien los
métodos que se pueden aplicar para determinar el alcance de una
respuesta inducida por un péptido individual, en particular con
respecto a los ejemplos contenidos aquí y en la literatura sobre la
materia.
Preferentemente, un péptido conforme a la
presente invención consiste en una secuencia de aminoácidos conforme
a la SEQ ID n.º 1.
Un péptido conforme a la presente invención
puede contener, además de la secuencia según la SEQ ID n.º 1,
cadenas de aminoácidos adicionales localizadas en el
N-terminal y/o el C-terminal que no
necesariamente forman parte del péptido que actúa como secuencia
central del péptido que comprende el motivo de unión y como epítopo
inmunógeno de linfocito T colaborador.
Sin embargo, estas cadenas pueden ser
importantes para proporcionar una introducción eficiente en las
células del péptido de la presente invención. En una de las
modalidades de la invención, el péptido comprende los 80
aminoácidos N-terminal de la cadena invariante
asociada al antígeno HLA-DR (p33, en la siguiente
Ii), como se deriva del NCBI (National Center for Biotechnology
Information), número de registro del GenBank X00497 (Strubin,
M, B. Mach y E. O. Long; The complete sequence of the mRNA for
the HLA-DR-associated invariant
chain reveals a polypeptide with an unusual transmembrane
polarity; "EMBO J"; 1984; 3 [4],
869-872).
Como puede derivarse de la base de datos aquí
descrita, determinadas posiciones de péptidos de unión de
HLA-DR son residuos conservados que forman una
secuencia central que se ajusta al motivo de unión del surco de
unión del HLA. Las modificaciones de éstos y otros residuos que
participan en la unión de HLA-DR pueden mejorar la
unión sin alterar el reconocimiento de los CTL.
Los residuos de aminoácidos que no son
esenciales para interactuar con el receptor del linfocito T pueden
ser modificados mediante el reemplazo con otro aminoácido cuya
incorporación no afecte de forma sustancial a la reactividad del
linfocito T ni elimine la unión con el MHC relevante.
Se sabe, además, que los péptidos presentados
por MHC de clase II están compuestos de una "secuencia
central" con un determinado motivo de aminoácidos específico de
HLA y, opcionalmente, extensiones N- y/o C-terminal
que no interfieren con la función de la secuencia central (es decir,
son considerados irrelevantes en la interacción del péptido y el
linfocito T). Las extensiones N- y/o C-terminal
pueden tener una longitud de entre 1 y 10 aminoácidos,
respectivamente. Por lo tanto, un péptido preferido en la presente
invención exhibe una longitud de entre 9 y 30 aminoácidos. Este
péptido puede ser usado o bien directamente, para cargar moléculas
MHC de clase II, o bien la secuencia puede ser clonada en los
vectores según la descripción que se detalla más abajo.
Si un péptido que es mayor de unos 12 residuos
de aminoácidos es usado directamente para unirse a una molécula
MHC, se prefiere que los residuos que flanquean la región central de
unión de HLA sean los que no afecten de forma sustancial a la
habilidad del péptido de unirse específicamente al surco de unión de
la molécula MHC o de presentar al péptido al CTL.
Se pueden derivar ejemplos de péptidos de
variantes, motivos y ligandos de MHC, así como determinados ejemplos
de extensiones N- y/o C-terminal en la base de
datos SYFPEITHI (Rammensee H, J. Bachmann, N. P. Emmerich, O. A.
Bachor y S. Stevanovic; SYFPEITHI: database for MHC ligands and
peptide motifs; "Immunogenetics"; noviembre de 1999; 50
[3-4]: 213-9. Review) en
http://syfpeithi.bmi-heidelberg.com y en las
referencias allí citadas.
Algunos ejemplos de péptidos para el
HLA-DR en la base de datos son: K H K V
\underbar{Y A C E V T H Q G} L S S
derivado de la cadena Ig kappa 188-203 (Kovats y
col; "Eur J Immunol".; abril de 1997; 27 [4]:
1014-21); K V Q \underbar{W K V D N
A L Q S} G N S derivado de la cadena Ig kappa
145-159 (Kovats y col; "Eur J Immunol".; abril
de 1997; 27 [4]: 1014-21); L P R L I \underbar{A
F T S E H S H F} derivado de GAD65
270-283 (Endl y col; "J Clin Invest"; mayo de
1997; 15, 99 [10]: 2405-15) o F \underbar{F
R M V I S N P A} A T H Q D I D F L I derivado
de GAD65 556-575 (Endl y col; "J Clin Invest";
mayo de 1997; 15, 99 [10]: 2405-15). Además, los
péptidos también pueden derivarse de secuencias mutadas de
antígenos, como en el caso del \underbar{A T G F K Q S S
K} A L Q R P V A S, derivado de la proteína de fusión
bcr-abl de 210 kD (Bosch y col; "Blood";
noviembre de 1996; 1, 88 [9]: 3522-7), G
\underbar{Y K V L V L N P S} V A A T,
derivado de HCV-1 NS3 28-41
(Diepolder y col; "J Virol"; agosto de 1997; 71 [8]:
6011-9), o \underbar{F R K Q N P D I
V} I Q Y M D D L Y V G, derivado de HIV-1
(HXB2) RT 326-345 (van der Burg y col; "J
Immunol". enero de 1999; 1, 162 [1]: 152-60).
Todos los aminoácidos de "anclaje" (como ejemplos de
HLA-DR4, véase Friede y col; "Biochim Biophys
Acta"; Junio de 1996; 7, 1316 [2]: 85-101. Sette
y col; "J Immunol". septiembre de 1993
15,151[6]:3163-70. Hammer y col; "Cell";
julio de 1993 16,74[1]:197-203. Hammer y col;
"J. Exp. Med"; mayo de 1995; 1, 181 [5]:
1847-55) se han indicado en negrita y las supuestas
secuencias centrales se han subrayado.
En el concepto "péptido" no sólo incluimos
moléculas en las que los residuos de aminoácidos están unidas por
enlaces peptídicos (-CO-NH-), sino también moléculas
en las que el enlace peptídico está invertido. Estas formas
retro-inverso pueden hacerse usando métodos
conocidos por los especialistas en la materia, como los descritos
por Meziere y col. (1997); "J. Immunol"; 159,
3230-3237. Este enfoque implica la creación de
pseudopéptidos que contengan modificaciones en el esqueleto, y no en
la orientación de las cadenas laterales. Meziere y col. (1997)
muestran que, al menos para respuestas de linfocitos T colaboradores
y MHC de clase II, estos pseudopéptidos son útiles. Los péptidos
de tipo retro-inverso, que contienen uniones
NH-CO en lugar de uniones peptídicas
CO-NH, son mucho más resistentes a la
proteólisis.
Normalmente, el péptido de la invención se
caracteriza porque, si aparece expresado en una célula presentadora
de antígenos, puede ser procesada de forma que se produzca un
fragmento capaz de unirse a una molécula MHC adecuada y pueda ser
presentada por la célula apropiada y provocar una respuesta
adecuada. Se apreciará que un fragmento producido a partir del
péptido puede ser también un péptido de la invención.
Convenientemente, el péptido de la invención contiene una porción
que incluye la secuencia de aminoácidos dada o una porción o
variante de la misma y otra porción más que le confiere alguna
propiedad deseable. Por ejemplo, la porción añadida puede incluir
otro epítopo de linfocito T (independientemente de que derive o no
del mismo polipéptido que la primera porción que contiene el
epítopo de linfocito T) o una proteína o un péptido portadores. Por
lo tanto, en una modalidad, el péptido de la invención es una
proteína humana truncada o una proteína de fusión de un fragmento
proteico y otra porción de polipéptido, siempre que la porción
humana incluya una o más secuencias de aminoácidos de
invención.
En una modalidad especialmente preferida, el
péptido de la invención incluye la secuencia de aminoácidos de la
invención y, al menos, un epítopo de linfocito T más, que es capaz
de facilitar la producción de una respuesta del linfocito T
dirigida al tipo de tumor expresado de forma aberrante por un
antígeno asociado a un tumor. Por lo tanto, los péptidos de la
invención incluyen cadenas perladas de polipéptidos que también
pueden ser usadas como vacunas.
Se entenderá de lo que sigue que, en algunas
aplicaciones, se usan directamente los péptidos de la invención (es
decir, no son producidos por expresión de un polinucleótido en una
célula del paciente o en una célula suministrada al paciente).
Se prefiere que los péptidos de la invención
puedan unirse al HLA-DR. En particular, se prefiere
que los péptidos se unan de forma selectiva al
HLA-DR4.
Los péptidos de la invención son particularmente
útiles en métodos inmunoterapéuticos para detectar y destruir
células que expresan de forma aberrante polipéptidos que forman la
base de los péptidos de la presente invención. Debido a que estos
péptidos específicos consistentes en las secuencias de aminoácidos
dadas se unen al HLA-DR, se prefiere que los
péptidos de la invención sean aquellos que unan
HLA-DR y que, una vez formado, el complejo
HLA-DR-péptido, cuando esté presente
en la superficie de una célula presentadora de antígeno adecuada,
sea capaz de provocar la producción de un CTL que reconozca una
célula que exprese de forma aberrante un polipéptido que comprenda
la secuencia de aminoácidos dada.
En una modalidad de la presente invención, el
péptido de la presente invención comprende los 80 aminoácidos
N-terminal de la cadena invariante asociada al
antígeno HLA-DR (p33, en la siguiente Ii), como se
deriva del NCBI, número de registro del GenBank X00497 (véase
también más adelante).
En el término "expresado de forma
aberrante" incluimos el significado de que el polipéptido está
sobreexpresado en comparación con los niveles normales de expresión
o que el gen es silencioso en el tejido del que deriva el tumor
pero sí se expresa en el tumor. Con el término "sobreexpresado"
queremos decir que el polipéptido está presente a un nivel al menos
1,2 veces mayor que en tejido normal. Preferentemente a un nivel 2
veces mayor y, más preferentemente, a un nivel 5 ó 10 veces mayor
que en el tejido normal.
Los péptidos (al menos los que contienen enlaces
peptídicos entre residuos de amino ácidos) pueden ser sintetizados
por el modo de poliamida Fmoc de síntesis de péptidos de fase
sólida, tal y como describen Lu y col. (1981) "J. Org. Chem"
46, 3433 y las referencias ahí contenidas. La protección temporal
del grupo N-amino se debe al grupo
9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc). La división
repetitiva de este grupo de protección de alta base lábil se lleva
a cabo utilizando piperidina al 20% en N,
N-dimetilformamida. Las funcionalidades de la
cadena lateral pueden estar protegidas como sus butil éteres (en el
caso de la serina treonina y de la tirosina), butil ésteres (en el
caso del ácido glutámico y del ácido aspártico), derivado del
butiloxicarbonilo (en el caso de la lisina y la histidina),
derivado del tritilo (en el caso de la cisteína) y de
4-methoxi-2,3,6-trimetilbencenosulfonilo
(en el caso de la arginina). En donde la glutamina o la asparagina
son residuos C-terminales, se hace uso del grupo
4,4'-dimetoxibencihidrilo para la protección de las
funcionalidades amido de la cadena lateral. El apoyo de la fase
sólida se basa en un polímero polidimetil-acrilamido
constituido a partir de los tres monómeros dimetilacrilamido
(monómero esqueleto), bisacriloiletileno diamino (interconector) y
acriloilsarcosino metil éster (agente funcionalizador). El agente
ligado divisible péptido-resina usado es el derivado
del ácido
4-hidroximetil-fenoxiacético ácido
lábil. Todos los derivados de aminoácidos se añaden como sus
derivados anhídridos simétricos preformados, con la excepción de la
asparagina y la glutamina, que se añaden usando un procedimiento
inverso de acoplamiento mediado por N,
N-diciclohexil-carbodiimida/1hidroxibenzotriazol.
Todas las reacciones de acoplamiento y desprotección son
controladas usando procedimientos analíticos de isotina, ácido
trinitrobencenosulfónico o ninhidrina. Al completarse la síntesis,
los péptidos se separan de la resina con eliminación concomitante
de los grupos de protección de la cadena lateral por medio del
tratamiento con ácido trifluoroacético al 95% que contenga una
mezcla depuradora al 50%. Los depuradores utilizados normalmente
son etanoditiol, fenol, anisol y agua. La elección exacta depende de
los aminoácidos constituyentes del péptido que se esté
sintetizando.
El ácido trifluoroacético se elimina por
evaporación en vacío, con la posterior trituración con éter
dietílico, proporcionando el péptido crudo. Los depuradores se
eliminan por un procedimiento de extracción simple que, en la
liofilización de la fase acuosa, proporciona un péptido crudo libre
de depuradores. Los reactivos para la síntesis de péptidos se pueden
adquirir en Calbiochem-Novabiochem (UK) Ltd,
Nottingham NG7 2QJ, UK.
La purificación se puede realizar mediante
técnicas, o combinación de técnicas, como la cromatografía de
exclusión, la cromatografía de intercambio de iones y, normalmente,
la cromatografía líquida de alto rendimiento en fase invertida.
El análisis de los péptidos puede llevarse a
cabo por medio de la cromatografía en capa delgada, la cromatografía
líquida de alto rendimiento en fase invertida, el análisis de los
aminoácidos después de la hidrólisis ácida, el análisis de
espectrometría de masas por bombardeo con átomos rápidos y el
análisis de espectrometría de masa MALDI y
ESI-Q-TOF.
Un aspecto más de la invención proporciona un
ácido nucleico (es decir, un polinucleótido) que codifica un
péptido de la invención. El polinucleótido puede ser ADN, ADNc, PNA,
CNA, ARN o combinaciones de los mismos y puede contener o no
contener intrones. Naturalmente, sólo son codificables por el
polinucleótido los péptidos que contienen residuos de aminoácidos
naturales unidos por enlaces peptídico naturales. Un aspecto más de
la invención proporciona un vector de expresión capaz de expresar un
polipéptido según la invención.
Se han desarrollado una variedad de métodos para
ligar polinucleótidos, especialmente ADN, con vectores; por
ejemplo, mediante extremos cohesivos complementarios. Por ejemplo,
se pueden añadir extensiones complementarias del homopolímero al
segmento de ADN que se vaya a insertar en el ADN vector. El vector y
el segmento de ADN se unen entonces, mediante un enlace de
hidrógeno, entre las colas homopoliméricas complementarias para
formar moléculas de ADN recombinante.
Los conectores sintéticos que contengan uno o
más sitios de restricción proporcionan un método alternativo para
unir el segmento de ADN a los vectores. El segmento de ADN, generado
por digestión de restricción de endonucleasa como se describió
anteriormente, es tratado con la ADN polimerasa T4 bacteriófaga o la
ADN polimerasa I de E. coli, enzimas que eliminan los
extremos 3' monocatenarios con sus actividades exonucleolíticas
3'-5' y rellenan los extremos 3' con sus actividades
de polimerización.
La combinación de estas actividades genera, por
tanto, segmentos de ADN de extremo romo. Los segmentos de extremo
romo se incuban entonces con exceso molar de moléculas de conexión,
en presencia de una enzima que es capaz de catalizar la unión de
moléculas de ADN de extremo romo, como la ADN ligasa T4
bacteriófaga. Por tanto, los productos de la reacción son segmentos
de ADN que portan secuencias de ligador polimérico en sus extremos.
Estos segmentos de ADN son divididos entonces con la enzima de
restricción apropiada y ligados a un vector de expresión que ha
sido dividido con una enzima que produce extremos compatibles con
los del segmento de ADN.
Los ligadores sintéticos que contienen una
variedad de sitios de endonucleasa de restricción se pueden adquirir
de diversas fuentes, incluyendo International Biotechnologies Inc,
New Haven, CN, EUA.
Una forma deseable de modificar el ADN
codificante del polipéptido de la invención es usar la reacción en
cadena de la polimerasa descrita por Saiki y col. (1988)
"Science" 239, 487-491. Este método puede
usarse para introducir el ADN en un vector adecuado, por ejemplo
manipulando los sitios de restricción apropiados, o puede usarse
para modificar en ADN de otras formas útiles conocidas por los
expertos en la materia. En este método, para que el ADN sea
amplificado enzimáticamente es flanqueado por dos cebadores
específicos que se incorporan al ADN amplificado. Estos cebadores
específicos pueden contener sitios de reconocimiento de endonucleasa
de restricción que pueden ser usados para la clonación en vectores
de expresión mediante métodos conocidos por los expertos en la
materia.
El ADN (o, en el caso de los vectores
retrovirales, el ARN) se expresa entonces en un huésped apropiado
para producir un polipéptido que comprende el compuesto de la
invención. Así, el ADN que codifica el polipéptido que constituye
el compuesto de la invención puede ser usado de acuerdo con técnicas
conocidas, modificadas convenientemente en vista de las enseñanzas
contenidas en la presente invención, para construir un vector de
expresión que entonces es usado para transformar una célula huésped
apropiada para la expresión y producción del polipéptido de la
invención. Dichas técnicas incluyen las descritas en las patentes de
EUA n.º 4.440.859, concedida el 3 de abril de 1984 a Rutter y col;
4.530.901, concedida el 23 de julio de 1985 a Weissman; 4.582.800,
concedida el 15 de abril de 1986 a Crowl; 4.677.063, concedida del
30 de junio de 1987 a Mark y col; 4.678.751, concedida el 7 de
julio de 1987 a Goeddel; 4.704.362, concedida el 3 de noviembre de
1987 a Itakura y col; 4.710.463, concedida el 1 de diciembre de
1987 a Murray; 4.757.006, concedida el 12 de julio de 1988 a Toole
Jr. y col; 4.766.075, concedida el 23 de agosto de 1988 a Goeddel y
col. y 4.810.648, concedida el 7 de marzo de 1989 a Stalker.
El ADN (o, en el caso de los vectores
retrovirales, el ARN) que codifica el polipéptido que constituye el
compuesto de la invención puede unirse a una amplia variedad de
secuencias de ADN para su introducción en el huésped adecuado. El
ADN acompañante dependerá de la naturaleza del huésped, de la forma
de introducción del ADN en el huésped y de si se desea la
integración o el mantenimiento episomal.
Generalmente, el ADN se inserta en un vector de
expresión como, por ejemplo, un vector plasmídico, con la
orientación adecuada y el marco de lectura correcto para la
expresión. Si es necesario, el ADN puede unirse a las secuencias
adecuadas de nucleótidos de control regulador de traducción y
transcripción reconocidas por el huésped deseado, aunque tales
controles suelen estar disponibles en el vector de expresión. El
vector se introduce entonces en el huésped mediante las técnicas
habituales. Generalmente, no todos los huéspedes serán
transformados por el vector. Por lo tanto, será necesario
seleccionar las células huésped transformadas. Una de las técnicas
de selección implica la incorporación en el vector de expresión de
una secuencia de ADN con los elementos de control necesarios, que
codifique un carácter seleccionable en la célula transformada como,
por ejemplo, la resistencia a antibióticos.
De forma alternativa, el gen para dicho carácter
seleccionable puede estar en otro vector, que es usado para
cotransformar la célula huésped deseada.
Las células huésped que han sido transformadas
por el ADN recombinante de la invención son cultivadas entonces
durante el tiempo necesario y en las condiciones apropiadas,
conocidas por los expertos en la materia en vista de las enseñanzas
descritas en la presente invención, para permitir la expresión del
polipéptido, que entonces puede ser recuperado.
Se conocen muchos sistemas de expresión, entre
los que se encuentran bacterias (E. coli y Bacillus
subtilis, por ejemplo), levaduras (Saccharomyces
cerevisiae, por ejemplo), hongos filamentosos
(Aspergillus, por ejemplo) y células de plantas, animales e
insectos. Con preferencia, el sistema podrá ser de células
Awells.
Un promotor es un elemento de control de la
expresión formado por una secuencia de ADN que permite que tengan
lugar la unión de la ARN polimerasa y la trascripción. Las
secuencias de promotores compatibles con huéspedes bacterianos se
encuentran normalmente en los vectores plasmídicos que contienen
sitios de restricción adecuados para la inserción de un segmento de
ADN de la presente invención. Algunos vectores plasmídicos
procarióticos típicos son pUC18, pUC19, pBR322 y pBR329, que se
pueden adquirir en Biorad Laboratories, (Richmond, CA, EUA); y
pTrc99A y pKK223-3, que se pueden adquirir en
Pharmacia, Piscataway, NJ, EUA.
Un vector plasmídico típico de células de
mamíferos es el pSVL, que se puede adquirir en Pharmacia,
Piscataway, NJ, EUA Este vector usa el promotor tardío SV40 para
llevar a cabo la expresión de los genes clonados, habiéndose
encontrado el mayor nivel de expresión en las células productoras de
antígenos T, como las células COS-1. Un ejemplo de
vector de expresión inducible de mamífero es el pMSG, que también
puede adquirirse en Pharmacia. Este vector usa el promotor inducido
por glucocorticoide del duplicado del terminal largo del virus del
tumor mamario del ratón para llevar a cabo la expresión del gen
clonado. Los vectores plasmídicos de levadura
pRS403-406 y pRS413-416 son útiles
y, normalmente, pueden adquirirse en Stratagene Cloning Systems, La
Jolla, CA 92037, EUA Los plásmidos pRS403, pRS404, pRS405 y pRS406
son plásmidos de integración de levadura (YIps) e incorporan los
marcadores seleccionables de levadura HIS3, TRP1, LEU2 y URA3. Los
plásmidos pRS413-416 son plásmidos de centrómero de
levadura (Ycps). Se conocen otros vectores y sistemas de expresión
para ser usados con una variedad de células huésped.
La presente invención también hace referencia a
una célula huésped transformada con un constructo vector
polinucleótido de la presente invención. La célula huésped puede
ser procariótica o eucariótica. En algunas circunstancias, las
células bacterianas pueden ser preferentemente células huésped
procarióticas y, normalmente, son una cepa de E. coli como,
por ejemplo, las cepas E. coli DH5, que pueden adquirirse en
Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, EUA, y RR1, que
se puede adquirir en la American Type Culture Collection
(ATCC) de Rockville, MD, EUA (No ATCC 31343). Las células huésped
eucarióticas preferidas incluyen células de levadura, insectos y
mamíferos y, con preferencia, células de vertebrados como, por
ejemplo, de ratón, rata, mono o líneas celulares humanas de riñón o
fibroblásticas. Las células huésped de levadura incluyen las YPH499,
YPH500 y YPH501, que normalmente pueden adquirirse en Stratagene
Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, EUA Las células huésped de
mamíferos preferidas incluyen células de ovario de hámster chino
(CHO), disponibles en la ATCC, como CCL61; células embrionarias de
ratón suizo NIH NIH/3T3, disponibles en la ATCC, como CRL 1658;
células COS-1 derivadas de riñón de mono,
disponibles en la ATCC, como CRL 1650 y 293 células de riñón
embrionario humano. Las células de insecto preferida son las
células Sf9 que pueden sufrir transfección con vectores de
expresión de baculovirus.
La transformación de los huéspedes celulares
apropiados con un constructo de ADN de la presente invención se
lleva a cabo con métodos bien conocidos que suelen depender del tipo
de vector usado. Con respecto a la transformación de las células
huésped procarióticas, véase, por ejemplo, Cohen y col. (1972)
"Proc. Natl. Acad. Sci". EE. UU, 69, 2110 y Molecular
Cloning, A Laboratory Manual de Sambrook y col. (1989) "Cold
Spring Harbor Laboratory", Cold Spring Harbor, NY. La
transformación de las células de levadura se describe en Methods
In Yeast Genetics, A Laboratory Manual de Sherman y col. (1986)
"Cold Spring Harbor" NY. También es útil The method of
Beggs (1978) "Nature" 275, 104-109. Con
respecto a las células de vertebrados, los reactivos útiles para la
transfección de dichas células como, por ejemplo, el fosfato
cálcico y el dextran DEAE o las formulaciones de liposomas, se
pueden adquirir en Stratagene Cloning Systems, o Life Technologies
Inc., Gaithersburg, MD 20877, EUA La electroporación también es
útil para la transformación y/o transfección de las células, y se
conoce bien su uso para la transformación de células de levadura,
bacterias, insectos y vertebrados.
Las células transformadas con éxito, es decir,
las que contienen un constructo de ADN de la presente invención,
pueden ser identificadas por medio de técnicas conocidas. Por
ejemplo, las células resultantes de la introducción de un
constructo de expresión de la presente invención pueden cultivarse
para producir un polipéptido de la invención. Las células pueden
ser cultivadas y lisadas, y el contenido de su ADN puede ser
examinado en busca de la presencia de ADN usando un método como el
descrito por Southern (1975), "J. Mol. Biol". 98,503 o por
Berent y col. (1985), "Biotech". 3,208. De forma alternativa,
la presencia la proteína en el sobrenadante puede ser detectada
usando anticuerpos, como se describe más abajo.
Además del análisis directo de la presencia de
ADN recombinante, la transformación puede confirmase por medio de
métodos inmunológicos bien conocidos cuando el ADN recombinante es
capaz de dirigir la expresión de la proteína. Por ejemplo, las
células transformadas con un vector de expresión producen proteínas
que presentan la antigenicidad apropiada. Las muestras de células
que puedan haber sufrido transformación se cultivan y analizan en
busca de la proteína utilizando los anticuerpos adecuados. Así,
además de las propias células huésped transformadas, la presente
invención también considera el cultivo de dichas células,
preferentemente monoclonal (clonalmente homogéneo) o derivado de un
cultivo monoclonal, en un medio de nutrientes.
Se apreciará que algunas células huésped de la
invención son útiles en la preparación de péptidos de la invención
como, por ejemplo, células de bacterias, levadura e insectos. Sin
embargo, también podrán ser útiles para ciertos métodos
terapéuticos otras células huésped. Por ejemplo, las células
presentadora de antígenos, como las células dendríticas, pueden ser
usadas para expresar los péptidos de la invención de forma que sean
cargadas en las moléculas MHC adecuadas.
Otro aspecto de la invención proporciona un
método para producir un péptido para su inyección intravenosa
(i.v.), subcutánea (s.c.), intradérmica (i.d.), intraperitoneal
(i.p.) e intramuscular (i.m.). Las formas preferidas de inyección
de péptidos son s.c, i.d, i.p, i.m. e i.v. Las formas preferidas de
inyección de ADN son i.d, i.m, s.c, i.p. e i.v. Podrán darse dosis
de entre 1 y 500 mg de péptido a ADN.
En otro aspecto de la invención, se describe un
método para matar células diana en un paciente cuyas células diana
expresan de forma aberrante un polipéptido que comprende una
secuencia de aminoácidos de la invención. El método comprende la
administración al paciente de una cantidad efectiva de un péptido
según la invención, o una cantidad efectiva de un polinucleótido o
un vector de expresión que codifique dicho péptido, en la que la
cantidad de dicho péptido o la cantidad de dicho polinucleótido o
vector de expresión es efectiva para provocar una respuesta inmune
contra la célula diana en el paciente. La célula diana es una célula
de cáncer o de tumor.
El péptido o el ácido nucleico codificador del
péptido constituye una vacuna contra el tumor o el cáncer. Puede
administrarse directamente al paciente, en el órgano afectado o
sistémicamente; o aplicarse ex vivo en células del paciente
o de una línea celular humana que después se administra al paciente;
o usada in vitro para seleccionar una subpoblación de
células inmunes del paciente, al que luego se le vuelven a
administrar. Si el ácido nucleico se administra in vitro en
las células, puede ser útil para las células su transfección para
coexpresar citocinas como la interleucina-2. El
péptido podrá ser sustancialmente puro; o estar combinado con un
adyuvante que estimule la respuesta inmune como Detox; o usado en
combinación con citocinas estimuladoras de la respuesta inmune; o
ser administrado con un sistema de liberación apropiado como, por
ejemplo, liposomas. El péptido también podrá conjugarse con un
vehículo apropiado como la hemocianina de lapa californiana (KLH) o
el manano (véase el documento WO 95/18145 y Longenecker y col.
(1993) "Ann. NY Acad. Sci". 690,276-291). El
péptido también podrá estar etiquetado, o ser una proteína de fusión
o ser una molécula híbrida. Los péptidos cuya secuencia se da en la
presente invención han de estimular el linfocito T citotóxico CD4.
Sin embargo, la estimulación es más eficiente con la ayuda de
linfocitos T CD4^{+}. Así, las secciones de fusión de una
molécula híbrida proporcionan epítopos que estimulan a los
linfocitos T CD4^{+}. Estos epítopos son conocidos por los
expertos en la materia e incluyen a los identificados en el toxoide
tetánico. El polinucleótido puede ser substancialmente puro o estar
contenido en un vector o en un sistema de liberación adecuados.
Entre los vectores y los sistemas de liberación
adecuados se encuentran los virales, como los sistemas basados en
adenovirus, virus de la vaccinia, retrovirus, virus del herpes,
virus adenoasociados o híbridos que contengan elementos de más de
un virus. Los sistemas de liberación no virales incluyen lípidos
catiónicos y polímeros catiónicos, conocidos por los expertos en la
liberación de ADN. La liberación física por medio de una "pistola
genética", por ejemplo, también puede usarse. El péptido o el
péptido codificado por el ácido nucleico puede ser una proteína de
fusión, con un epítopo del toxoide tetánico que estimule los
linfocitos T CD4^{+}, por ejemplo.
El péptido para una vacuna contra el cáncer
puede ser cualquier péptido apropiado conforme a la invención.
Cualquier ácido nucleico administrado al
paciente es estéril y apirógeno. El ADN desnudo puede ser
administrado por vía intramuscular, intradérmica o subcutánea. Los
péptidos pueden ser administrados por vía intramuscular,
intradérmica o subcutánea.
La vacunación resulta en una respuesta de los
linfocitos T citotóxicos estimulados por células presentadoras de
antígenos. Una vez que los linfocitos T citotóxicos han sido
sensibilizados, puede resultar ventajoso el aumento de la expresión
del MHC en las células tumorales.
También puede ser útil la direccionalización de
la vacuna hacia poblaciones específicas de células como, por
ejemplo, hacia células presentadoras de antígenos, bien por medio de
inyecciones, vectores de direccionalización y sistemas de
liberación; o por purificación selectiva de dicha población de
células del paciente y administración ex vivo del péptido o
del ácido nucleico (las células dendríticas, por ejemplo, pueden
clasificarse tal y como se describe en Zhoy y col. [1995]
"Blood" 86,3295-3301; o en Roth y col. [1996]
"Scand. J. Immunology" 43,646-651). Por
ejemplo, los vectores de direccionalización pueden comprender un
promotor específico de tumor o de tejido que dirige la expresión
del antígeno al lugar adecuado.
Otro aspecto de la invención, por tanto,
proporciona una vacuna efectiva contra el cáncer o las células
tumorales o cancerosas, que comprende una cantidad efectiva de un
péptido según la invención o un ácido nucleico que codifica dicho
péptido. Asimismo, se prefiere particularmente que la vacuna sea una
vacuna de ácidos nucleicos. Se sabe que la inoculación de una
vacuna de ácidos nucleicos - -como una vacuna de
ADN - - que codifique un polipéptido provoca una
respuesta de los linfocitos T.
Convenientemente, la vacuna de ácidos nucleicos
puede comprender cualquier medio de liberación adecuado del ácido
nucleico. El ácido nucleico, preferentemente ADN, puede estar
desnudo (es decir, sin ningún otro componente sustancial para ser
administrado) o puede ser liberado en un liposoma o como parte de un
sistema de liberación de un vector viral.
Se cree que la absorción del ácido nucleico y la
expresión del polipéptido codificado por parte de las células
dendríticas puede ser el mecanismo de sensibilización de la
respuesta inmune. Sin embargo, aunque las células dendríticas
pueden no sufrir la transfección, siguen siendo importantes porque
detectan el péptido expresado de las células del tejido que hayan
sufrido la transfección.
Se prefiere que la vacuna -como, por ejemplo, la
vacuna de ADN- sea administrada en el músculo. También se prefiere
que sea administrada en la piel. La vacuna de ácidos nucleicos puede
administrarse sin adyuvante. La vacuna de ácidos nucleicos también
puede administrarse con un adyuvante como BCG o alum. Otros
adyuvantes adecuados son el estimulón QS21 de Aquila (Aquila
Biotech, Worcester, MA, EUA), derivado de la saponina; extractos
micobacterianos y pared bacteriana mimética sintética y adyuvantes
registrados como el Detox. Quil A, otro adyuvante derivado de la
saponina, también puede ser usado (Superfos, Dinamarca). Se prefiere
que la vacuna de ácidos nucleicos se administre sin adyuvantes.
Otros adyuvantes, como el adyuvante de Freund, también pueden ser
útiles. También puede ser útil administrar el péptido conjugado con
la hemocianina de lapa californiana, preferentemente también con un
adyuvante.
La terapia de inmunización contra el cáncer por
medio de un polinucleótico se describe en Conry y col. (1996)
"Seminars in Oncology" 23,135-147; Condon y
col. (1996) "Nature Medicine" 2,1122-1127;
Gong y col. (1997) "Nature Medicine" 3,558-561;
Zhai y col. (1996) "J. Immunol". 156,700-710;
Graham y col. (1996) "Int J. Cancer"
65,664-670; y Burchell y col. (1996) pp
309-313 In: Breast Cancer, Advances in biology
and therapeutics, Calvo y col. (eds), "John Libbey
Eurotext".
Otro aspecto de la presente invención
proporciona el uso de un péptido según la invención, o de un
polinucleótido o un vector de expresión que codifique dicho
péptido, en la fabricación de un medicamento para matar células
diana en un paciente cuyas células diana expresan de forma aberrante
un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la
invención.
Otro aspecto de la invención proporciona un
método para producir linfocitos T citotóxicos (CTL) activados in
vitro, método que comprende el contacto in vitro de los
CTL con moléculas humanas MHC de clase II con carga de antígenos,
expresadas en la superficie de una célula presentadora de antígenos
adecuada durante un periodo de tiempo suficiente para activar, de
una forma propia de los antígenos, dichos CTL, en donde el antígeno
es un péptido según la invención.
Apropiadamente, los CTL son linfocitos
colaboradores CD4^{+}, con preferencia de tipo TH1. Las moléculas
MHC de clase II pueden ser expresadas en la superficie de cualquier
célula adecuada. Se prefiere que dicha célula no exprese de forma
natural moléculas MHC de clase II (en cuyo caso, se realiza la
transfección en la célula para que exprese dicha molécula) o, si lo
hace, sea defectuosa en las vías de procesamiento o de presentación
de los antígenos. En este sentido, es posible que la célula que
expresa la molécula MHC de clase II sea sensibilizada completamente
con un antígeno del péptido antes de activar los CTL.
La célula presentadora de antígenos (o célula
estimulante) se caracteriza por tener en su superficie una molécula
MHC de clase II y, preferentemente, no ser capaz de realizar por sí
misma la carga de dicha molécula con el antígeno seleccionado. Tal
y como se describe más abajo, la molécula MHC de clase II puede
cargarse fácilmente in vitro con el antígeno
seleccionado.
Preferentemente, la célula del mamífero carece o
tiene un nivel o función reducida del transportador peptídico TAP.
Entre las células adecuadas que carecen del transportador TAP se
incluyen las T2, RMA-s y Drosophilia. TAP es el
transportador asociado al procesamiento antigénico.
La línea celular humana T2 con carga peptídica
defectuosa está disponible en la ATCC, 12301 Parklawn Drive,
Rockville, Maryland 20852, EUA, con el n.º de catálogo CRL 1992. La
línea 2 de Drosophila de Schneider está disponible en la ATCC, con
el número de catálogo CRL 19863. La línea celular del ratón
RMA-S se describe en Karre y Ljunggren (1985),
"J. Exp. Med"., 162, 1745.
Convenientemente, la célula huésped, antes de la
transfección, no expresa moléculas MHC de clase I de forma
sustancial. También se prefiere que la célula estimulante exprese
una molécula importante para la estimulación conjunta del linfocito
T como, por ejemplo, cualquiera de las B7.1, B7.2,
ICAM-1 y LFA 3.
Las secuencias de ácidos nucleicos de numerosas
moléculas MHC de clase II, así como las moléculas de estimulación
conjunta, están disponibles públicamente en las bases de datos
GenBank y EMBL.
En otra modalidad, también se pueden utilizar
combinaciones de moléculas HLA.
El uso de vacunas de poliepítopos recombinantes
para la liberación de linfocitos T citotóxicos CD8^{+} múltiples
se describe en Thomson y col. (1996) "J. Immunol". 157,
822-826 y en el documento WO 96/03144. En relación
a la presente invención, puede ser conveniente incluir en una única
vacuna un péptido (o un ácido nucleico que codifique un péptido)
que incluya, en cualquier orden, una secuencia de aminoácidos de la
presente invención y un epítopo estimulador de los linfocitos T
CD4^{+} (como el toxoide tetánico). Esta vacuna sería
particularmente útil en el tratamiento del cáncer. Estas vacunas
"perladas" son características de las vacunas de ADN.
Pueden usarse otros métodos para generar
linfocitos T citotóxicos in vitro. Por ejemplo, los métodos
descritos en Peoples y col. (1995) "Proc. Natl. Acad. Sci".,
EUA, 92,432-436 y en Kawakami y col. (1992) "J.
Immunol". 148,638643 usan linfocitos autólogos destructores de
tumores en la generación de linfocitos T citotóxicos. En Plebanski
y col. (1995) "Eur. J. Immunol". 25,1783-1787,
se hace uso de linfocitos autólogos de sangre periférica (PLB) en
la preparación de linfocitos T citotóxicos. En Jochmus y col.
(1997) "J. Gen. Virol". 78,1689-1695, se
describe la producción de linfocitos T citotóxicos autólogos por
medio de la utilización de células dendríticas sensibilizadas de
forma reiterada con péptidos o polipéptidos o por medio de la
infección con un virus recombinante. Hill y col. (1995) "J. Exp.
Med". 181,2221-2228 y Jerome y col. (1993) "J.
Immunol". 151,1654-1662, usan linfocitos B en la
producción de linfocitos T citotóxicos autólogos. Adicionalmente,
en la preparación de CTL autólogos también pueden usarse macrófagos
sensibilizados de manera repetida con péptidos o polipéptidos, o
infectados con virus recombinante.
Las células alogénicas también pueden ser usadas
en la preparación de linfocitos T citotóxicos. Este método se
describe en detalle en el documento WO 97/26328. Por ejemplo, además
de las células de Drosophilia y T2, pueden usarse otras células
para presentar antígenos, como las células CHO, las células de
insecto infectadas por baculovirus o células diana de bacterias,
levadura o infectadas por vaccinia. Adicionalmente, pueden usarse
virus de plantas. Véase, por ejemplo, Porta y col. (1994)
"Virology" 202, 449-955, en donde se describe
el desarrollo del virus del mosaico del garbanzo como un sistema de
alto rendimiento para la presentación de péptidos foráneos.
Los linfocitos T citotóxicos activados, que son
dirigidos contra los péptidos de la invención, son útiles para
terapia. Así, la invención describe linfocitos T citotóxicos
activados que pueden obtenerse por los métodos anteriores.
Otro aspecto de la invención proporciona
linfocitos T citotóxicos (CTL) que reconocen de forma selectiva a
una célula que exprese de forma aberrante un polipéptido que
comprenda una secuencia de aminoácidos de la invención. Con
preferencia, el CTL reconoce a la mencionada célula por interacción
con el complejo de péptidos/HLA (por ejemplo, de unión). Los CTL
son útiles en un método para matar células diana en un paciente
cuyas células diana expresan de forma aberrante un polipéptido que
comprende una secuencia de aminoácidos de la invención, en el que
al paciente se le administra un número efectivo de los CTL
activados. Los CTL administrados al paciente pueden derivar del
paciente y se activados tal y como se describe más arriba (es decir,
son CTL autólogos) De forma alternativa, los CTL pueden no ser del
paciente, sino de otro individuo. Evidentemente, se prefiere que se
trate de un individuo sano. Por "individuo sano" entendemos un
individuo con buena salud en general, preferentemente con un
sistema inmune competente y, más preferentemente, que no sufra
ninguna enfermedad que pueda ser fácilmente detectable.
\newpage
Los CTL activos expresan un receptor de
linfocitos T (TCR) que reconoce a las células que expresan el
polipéptido aberrante. Resulta de utilidad que el ADNc que codifica
el TCR esté clonado del CTL activado y transferido a otro CTL para
su expresión.
In vivo, las células diana para el CTL
CD4^{+} conforme a la presente invención pueden ser células del
tumor (que, a veces, expresa MHC de clase II) y/o células del
estroma que rodean al tumor (células tumorales) (que, a veces,
también expresan MHC de clase II).
Los TCR de clones de CTL de la invención
específicos para los péptidos de la invención son clonados. El uso
de los TCR en los clones de CTL se determina usando (i) anticuerpos
monoclonales específicos de región variable y (ii) RT PCR con
cebadores específicos para las familias de genes Va y Vp. Se prepara
una genoteca de ADNc a partir de ARNm poli-A
extraído de los clones de CTL. Se usan los cebadores específicos
para la porción C-terminal de las cadenas a y P de
TCR y para la porción N-terminal de los segmentos Va
y P identificados. El ADNc completo para la cadena a y b de TCR se
amplifica con una ADN-polimerasa de alta fidelidad y
los productos amplificados son clonados a un vector de clonación
adecuado. Los genes clonados de las cadenas a y P pueden ser unidos
en un TCR de cadena única por medio del método descrito por Chung y
col. (1994) "Proc. Natl. Acad. Sci". EUA
91,12654-12658. En este constructo de cadena única,
el segmento VaJ está seguido por el segmento V DJ, seguido a su vez
por el segmento Cp, seguido a su vez por el segmento citoplasmático
y la transmembrana de la cadena CD3. Este TCR de cadena única se
inserta entonces en un vector de expresión retroviral (puede usarse
un panel de vectores basado en su habilidad para infectar linfocitos
T CD8^{+} humanos maduros y para mediar en la expresión génica:
El sistema retroviral de vectores Kat es una de las posibilidades
preferidas [véase Finer y col. (1994) "Blood" 83, 43]). Los
retrovirus anfotróficos de alta valoración son usados para infectar
linfocitos T CD8^{+} o CD4^{+} purificados, aislados de las
sangre periférica de pacientes con tumor (siguiéndose el protocolo
publicado por Roberts y col. (1994) en "Blood" 84,
2878-2889). Los anticuerpos
Anti-CD3 son usados para desencadenar la
proliferación de linfocitos T CD8^{+} purificados, lo que
facilita la integración retroviral y expresión estable de TCR de
cadena única. La eficacia de la transducción retroviral se
determina por coloración de los linfocitos T CD8^{+} infectados
con anticuerpos específicos del TCR de cadena única. El análisis
in vitro de los linfocitos T CD8^{+} transducidos establece
que muestran la misma toxicidad específica de tumor que con el clon
de CTL allo-restringido del que originalmente se
clonaron las cadenas de TCR. Las poblaciones de linfocitos T
CD8^{+} transducidos con la especificidad esperada pueden ser
usadas en la inmunoterapia adoptiva de los pacientes con tumores.
Los pacientes pueden ser tratados con entre 10^{8} y 10^{11}
CTL autólogos transducidos. De forma análoga a los CD8^{+}, se
pueden generar linfocitos T colaboradores CD4^{+} transducidos con
constructos
relacionados.
relacionados.
Otros sistemas adecuados para introducir genes
en CTL se describen en Moritz y col. (1994) "Proc. Natl. Acad.
Sci". USA 91,4318-4322. Eshhar y col. (1993)
"Proc. Natl. Acad. Sci". USA 90,720-724 y Hwu
y col. (1993) "J. Exp. Med". 178, 361-366
también describen la transfección de los CTL. Por tanto, otro
aspecto de la invención proporciona un TCR que reconoce una célula
que expresa de forma aberrante un polipéptido que comprende una
secuencia de aminoácidos de la invención. El TCR se obtiene del CTL
activado.
Al igual que el TCR, se incluyen en la presente
invención moléculas funcionalmente equivalentes al TCR. Éstas
incluyen cualquier molécula funcionalmente equivalente a un TCR, que
puede realizar la misma función que el TCR. En particular, dichas
moléculas incluyen TCR modificados genéticamente de cadena única y
tres dominios, fabricadas por el método descrito por Chung y col.
(1994) "Proc. Natl. Acad. Sci". EUA 91,
12654-12658, mencionado anteriormente. La invención
también describe un polinucleótido que codifica el TCR o la molécula
funcionalmente equivalente, y un vector de expresión que codifica
el TCR o una molécula funcionalmente equivalente. Los vectores de
expresión adecuados para la expresión del TCR de la invención
incluyen los descritos más arriba en relación a la expresión de los
péptidos de la invención.
Se prefiere, sin embargo, que los vectores de
expresión sean capaces de expresar el TCR en un CTL después de la
transfección.
La invención describe un método para matar
células diana en un paciente cuyas células diana expresan de forma
aberrante un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos
de la invención. El método comprende los siguientes pasos: (1)
obtención de CTL del paciente; (2) introducción en dichas células de
un polinucleótido que codifique un TCR o una molécula
funcionalmente equivalente, como se definió más arriba, y (3)
introducción al paciente de las células producidas en el paso
(2).
La invención describe un método para matar
células diana en un paciente cuyas células diana expresan de forma
aberrante un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos
como la definida en los otros aspectos de la invención. El método
comprende los siguientes pasos: (1) obtención de células
presentadoras de antígenos, como células dendríticas, del paciente;
(2) contacto de dichas células presentadoras de antígenos con un
péptido, como se definió en los otros aspectos de la invención, o
con un polinucleótido que codifique dicho péptido, ex vivo y
(3) reintroducción en el paciente de las células presentadoras de
antígenos así tratadas.
Preferentemente, las células presentadoras de
antígenos son células dendríticas. Las células dendríticas son
células dendríticas autólogas sensibilizadas de manera repetid con
un péptido antigénico. El péptido antigénico puede ser cualquier
péptido antigénico adecuado que desencadene una respuesta adecuada
de los linfocitos T. La terapia de linfocitos T con células
dendríticas autólogas sensibilizadas de manera repetida con péptidos
de un antígeno asociado a un tumor se describe en Murphy y col.
(1996) "The Prostate" 29, 371-380 y en Tjua y
col. (1997) "The Prostate" 32, 272-278.
En otra modalidad, las células presentadoras de
antígenos, como las células dendríticas, son contactadas con un
polinucleótido que codifica un péptido de la invención. El
polinucleótido puede ser cualquier polinucleótido adecuado y se
prefiere que sea capaz de transducir la célula dendrítica resultante
en la presentación de un péptido e inducción de inmunidad.
Convenientemente, el polinucleótido puede estar
comprendido en un polinucleótido viral o en un virus. Por ejemplo,
se ha demostrado que las células dendríticas transducidas por
adenovirus inducen inmunidad antitumoral específica de antígeno en
relación con MUC1 (véase Gong y col. [1997] "Gene Ther".
4,1023-1028). De forma similar, pueden usarse
sistemas basados en adenovirus (véase, por ejemplo, Wan y col.
[1997] "Hum. Gene Ther". 8,1355-1363);
sistemas retrovirales (Specht y col. [1997] "J. Exp. Med".
186,1213-1221 y Szabolcs y col. [1997]);
transferencia sanguínea mediada por partícula a células dendríticas
(Tuting y col. [1997] "Eur. J. Immunol". 27,
2702-2707) y ARN (Ashley y col. [1997] "J. Exp.
Med". 186, 1177 1182).
Se apreciará que, con respecto a los métodos
para matar células diana en un paciente, se prefiere especialmente
que las células diana sean células cancerosas y, más aún, que sean
células de cáncer renal.
Se prefiere especialmente que los pacientes que
sean tratados con los métodos tengan un haplotipo
HLA-DR. Así, en una modalidad preferida, el
haplotipo HLA del paciente se habrá determinado antes del
tratamiento. El análisis del haplotipo HLA del paciente puede
efectuarse mediante los métodos adecuados, conocidos por los
expertos en la materia.
La invención incluye en particular el uso de
péptidos de la invención (o polinucleótidos que los codifiquen)
para la vacunación activa in vivo; para la manipulación in
vitro de células dendríticas autólogas seguida de la
introducción de dichas células para activar repuestas de CTL; para
activar CTL autólogos in vitro seguido de terapia adoptiva
(es decir, los CTL así manipulados son introducidos en el paciente);
y para activar CTL de donantes sanos (MHC apareado o desapareado)
in vitro seguido por terapia adoptiva.
En una modalidad preferida, las vacunas de la
presente invención se administran a un huésped tanto solas como en
combinación con otras terapias contra el cáncer para inhibir o
suprimir la formación de tumores.
La vacuna de péptidos puede administrarse sin
adyuvante. La vacuna de péptidos también puede administrarse con un
adyuvante como BCG o alum. Otros adyuvantes adecuados son el
estimulón QS21 de Aquila (Aquila Biotech, Worcester, MA, EUA),
derivado de la saponina; extractos micobacterianos y pared
bacteriana mimética sintética y adyuvantes registrados como el
Detox. Quil A, otro adyuvante derivado de la saponina, también puede
ser usado (Superfos, Dinamarca). Otros adyuvantes, como el
adyuvante de Freund o el GMCSF, también pueden ser útiles. También
puede ser útil administrar el péptido conjugado con la hemocianina
de lapa californiana, preferentemente también con un adyuvante.
Los péptidos conformes a la invención también
pueden ser usados como reactivos diagnósticos. Con ellos puede
analizarse si, en una población de CTL, aparecen CTL dirigidos
específicamente contra un péptido o inducidos por una terapia.
Además, el aumento de linfocitos T precursores puede ser analizado
con los péptidos que tengan una reactividad contra el péptido
definido. Además, el péptido puede ser usado como marcador para
controlar la progresión de la enfermedad de un tumor que expresa el
antígeno mencionado del que el péptido deriva.
En la tabla 1 adjunta, se enumeran los péptidos
identificados. Además, en la tabla se nombran las proteínas de las
que deriva el péptido así como la posición respectiva del péptido en
la proteína correspondiente. Además, se dan los números de registro
respectivos vinculados al Genbank del National Centre for
Biotechnology Information del National Institute of
Health (véase http: www.ncbi.nlm.nih.gov).
En otra modalidad preferida, los péptidos son
usados para la tinción de leucocitos, en particular de linfocitos
T. Este uso es particularmente ventajoso si se prueba que en una
población de CTL aparecen CTL específicos dirigidos contra un
péptido. Además, el péptido puede usarse como marcador para
determinar la evolución de una terapia contra una enfermedad o
trastorno tumoral.
En otra modalidad preferida, los péptidos son
usados para la producción de un anticuerpo. Los anticuerpos
policlonales pueden obtenerse de forma estándar con la inmunización
de animales, por medio de la inyección del péptido y la
subsiguiente purificación de la globulina inmune. Los anticuerpos
monoclonales pueden producirse siguiendo los protocolos estándar,
como los descritos, por ejemplo, en "Methods Enzymol". (1986),
121, Hybridoma technology and monoclonal antibodies.
En otro aspecto, la invención se refiere a una
composición farmacéutica que contiene uno o más de los mencionados
péptidos conformes a la invención. Esta composición se administra
por vía parenteral como, por ejemplo, subcutánea, intradérmica,
intramuscular o por vía oral. Para ello, los péptidos son disueltos
o suspendidos en un vehículo farmacéuticamente aceptable y
preferiblemente acuoso. Además, la composición puede contener
excipientes como soluciones reguladoras, aglutinantes, agentes
blásticos, diluyentes, aromas, lubricantes, etc. Los péptidos
también pueden administrase junto con substancias estimulantes de la
respuesta inmune, como las citocinas. Una lista completa de
excipientes que pueden usarse para esta composición aparece, por
ejemplo, en A. Kibbe, "Handbook of Pharmaceutical Excipients",
3. Ed., 2000, American Pharmaceutical Association and
pharmaceutical press. La composición puede usarse para la
prevención, profilaxis y/o terapia de enfermedades tumorales.
La preparación farmacéutica con al menos uno de
los péptidos de la presente invención que comprenda la SEQ ID n.º 1
es administrada a un paciente que sufra una enfermedad tumoral que
esté asociada al péptido o antígeno respectivo. Así puede
desencadenarse una respuesta inmune específica de CTL.
En otro aspecto de la presente invención, una
combinación de dos o varios péptidos conformes a la presente
invención pueden usarse como vacuna, tanto en combinación directa
como dentro del mismo régimen de tratamiento. Además, pueden usarse
combinaciones con otros péptidos como, por ejemplo, péptidos
específicos de MHC de clase I. El experto en la materia será capaz
de seleccionar las combinaciones preferidas de péptidos inmunógenos
por medio del análisis, por ejemplo, de la generación de linfocitos
T in vitro así como su eficacia y presencia global, la
proliferación, afinidad y expansión de determinados linfocitos T
para determinados péptidos, y la funcionalidad de los linfocitos T;
por ejemplo, analizando la producción de
IFN-\gamma (véanse también los ejemplo más
abajo). Normalmente, los péptidos más eficaces son entonces
combinados como vacuna para los propósitos descritos más
arriba.
Una vacuna adecuada contendrá 2, 3, 4, 5, 6, 7,
8, 9 ó 10 péptidos distintos, preferiblemente 4, 5, 6 ó 7 péptidos
distintos y, más preferiblemente, 6 péptidos diferentes.
Finalmente, la vacuna puede depender del tipo de
cáncer específico que el paciente sufra así como del estado de la
enfermedad, regímenes de tratamiento anteriores, el estado inmune
del paciente y, naturalmente, el haplotipo HLA del paciente.
Se ha comprobado que los 80 aminoácidos
N-terminales de la Ii son suficientes para dirigir a
las proteínas a la vía de procesamiento de clase II (Sanderson, S.,
Frauwirth, K. & Shastri, N. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.
A 92, 7217-7221, Wang, R. F., Wang, X., Atwood, A.
C., Topalian, S. L. & Rosenberg, S. A. (1999) Science 284,
1351-1354). Con el fin de proporcionar una
demostración del concepto de la presente invención, los inventores
generaron proteínas de fusión consistentes en los 80 aminoácidos
N-terminales de la Ii y un antígeno ejemplar
asociado a diversas malignidades, la ciclina D1 (CCND1).
La ciclina D1 es un regulador del ciclo celular
que participa en la transición G1-S a través de
interacciones con quinasas ciclina-dependientes.
Además, la ciclina D1 es un proto-oncogén y se ha
demostrado su sobreexpresión en muchos tipos de tumor (Hedberg, Y.,
Davoodi, E., Roos, G., Ljungberg, B. & Landberg, G. (1999) Int.
J. Cancer 84, 268-272, Vasef, M. A., Brynes, R. K.,
Sturm, M., Bromley, C. & Robinson, R. A. (1999) Mod. Pathol.
12, 412-416, - Troussard, X.,
Avet-Loiseau, H., Macro, M., Mellerin, M. P., Malet,
M., Roussel, M. & Sola, B. (2000) Hematol. J. 1,
181-185) mientras que aparece expresado con poca
intensidad en muchos órganos y tejidos sanos sin una distribución
particular, a excepción del hígado y la fibra muscular lisa superior
aórtica (Weinschenk, T., Gouttefangeas, C., Schirle, M., Obermayr,
F., Walter, S., Schoor, O., Kurek, R., Loeser, W., Bichler, K. H.,
Wernet, D. et al. (2002) Cancer Res. 62,
5818-5827). En un enfoque espectrométrico de masas
diferencial, los inventores compararon espectros de masas de
péptidos HLA purificados de células transfectadas y sin transfectar
y usaron los péptidos resultantes de interés en experimentos de
sensibilización in vitro de linfocitos T CD4^{+}
colaboradores, con el fin de demostrar el carácter inmunógeno de
estos ligandos HLA de clase II.
La identificación de epítopos de linfocitos T
colaboradores de antígenos asociados a tumores sigue siendo una
tarea importante en la inmunoterapia contra los tumores. En este
sentido, aportamos un método de aplicación general y péptidos que
derivados del análisis diferencial de péptidos por espectrometía de
masas para identificar ligandos MHC de clase II, presentados y
procesados de forma natural, de antígenos asociados a tumores. Este
enfoque combina por primera vez la transfección de APC con un vector
que codifique una proteína de fusión entre la cadena invariante y
el antígeno de interés, la elución de péptidos unidos a HLA y la
identificación por espectrometría de masas de los péptidos
derivados del antígeno presentados por el agente de transfección,
por comparación con las células no transfectadas. Además, pudimos
validar el método mostrando que los linfocitos T inducidos contra
el péptido identificado reconoces específicamente a los agentes de
transfección que sobreexpresan el antígeno cognado. Aunque todavía
se tiene que probar la inmunogenicidad in vivo de los
péptidos identificados, nuestro enfoque conduce a la
caracterización exacta de los ligandos MHC de clase II procesados de
forma natural. Así, los inventores evitan probar péptidos
sintéticos solapados de antígenos asociados a tumores o un intervalo
amplio de péptidos seleccionados por predicción de epítopos, ya que
es menos exacto que la predicción de epítopos de clase I. En
comparación con laboriosos ensayos de linfocitos T que podrían
conducir a la identificación de crípticos epítopos de linfocitos T
incapaces de inducir la activación de los linfocitos T in
vivo (Anderton, S. M., Viner, N. J., Matharu, P., Lowrey, P. A.
& Wraith, D. C. (2002) Nat. Immunol. 3,
175-181), el trabajo puede centrarse en los pocos
péptidos que se encuentran para ser presentados. Además, con este
método no es necesario producir el antígeno recombinante o disponer
de líneas celulares tumorales que expresen el antígeno para probar
que los péptidos se procesan de forma natural.
Los inventores usaron el
N-terminal de Ii para dirigir antígenos asociados a
tumores al compartimento de procesamiento de clase II de células B
transformadas por el VEB. Para conseguir esto, construimos un vector
versátil con el que se puede expresar cualquier antígeno como una
proteína de fusión con Ii y que ayuda a determinar el nivel de
expresión de la proteína en células transfectadas mediante el
análisis de transferencia Western. Ya se ha mostrado que el
N-terminal de Ii es suficiente para dirigir
proteínas al compartimento de procesamiento de clase II. Pero,
hasta ahora, esto sólo se ha descrito en un modelo que utiliza
ovalbúmina (Sanderson, S., Frauwirth, K. & Shastri, N. (1995)
Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 92, 7217-7221) para
identificar antígenos desconocidos usando genotecas de ADNc que
codifican proteínas de fusión (Wang, R. F., Wang, X., Atwood, A.
C., Topalian, S. L. & Rosenberg, S. A. (1999) Science 284,
1351-1354) o para confirmar la especificidad de
clones de linfocitos T conocidos (Chaux, P., Vantomme, V.,
Stroobant, V., Thielemans, K., Corthals, J., Luiten, R., Eggermont,
A. M., Boon, T. & van der, B. P. (1999) J. Exp. Med. 189,
767-778). No tenemos conocimiento de que este
método se haya usado antes para identificar péptidos unidos a MHC de
clase II, presentados de forma natural, de antígenos asociados a
tumores conocidos. El análisis diferencial de ligandos de clase II
de células transfectadas y no transfectadas por espectrometría de
masas MALDI y la posterior caracterización por espectrometría de
masas ESI de los péptidos expresados diferencialmente tiene como
resultado un método directo para identificar ligandos de clase II
de los antígenos de interés. La transfección de las células con
proteínas de fusión queratina 18 mostró que nuestro método es de
aplicación general para los antígenos de interés. También
pudimos describir un péptido presentado por HLA-DR a partir de un transgén modelo, la queratina 18.
pudimos describir un péptido presentado por HLA-DR a partir de un transgén modelo, la queratina 18.
Los inventores identificaron un antígeno
inmunógeno del péptido de ciclina D1 presentado por
HLA-DR4 con la secuencia NPPSMVAAGSVVAAV (SEQ ID
n.º 1), así como otros 337 péptidos asociados al antígeno HLA de
clase II, eluidos de una línea celular tumoral humana transfectada.
El péptido de ciclina D1 y otros péptidos identificados a partir de
la línea celular humana son posibles candidatos para el desarrollo
clínico de vacunas terapéuticas para el tratamiento de cánceres
humanos (Weinschenk, T., Gouttefangeas, C., Schirle, M., Obermayr,
F., Walter, S., Schoor, O., Kurek, R., Loeser, W., Bichler, K. H.,
Wernet, D. et al. (2002) Cancer Res. 62,
5818-5827).
Ahora se describirá la invención en más detalle,
haciéndose referencia a las siguientes figuras, al listado de
secuencias y a los ejemplos. Los siguientes ejemplos se ofrecen sólo
con fines ilustrativos y no pretenden limitar la invención.
Las secuencias SEQ ID n.º 1 a SEQ ID n.º 338
muestran secuencias de péptidos de epítopos de linfocitos T que
contienen péptidos presentados por el MHC de clase II.
Las SEQ ID n.º 339 a 350 muestran secuencias de
cebadores como se han usado en los ejemplos.
La figura 1 muestra un primer análisis de
transferencia Western de proteínas de fusión generadas en el
transcurso de los experimentos.
La figura 2 muestra un segundo análisis de
transferencia Western de proteínas de fusión generadas en el
transcurso de los experimentos.
La figura 3 muestra los cromatogramas de la HPLC
de la línea celular sin transfectar y el clon de ciclina D1 de Ii de
Awells.
Las figuras 4 y 5 muestran los análisis
espectrométricos de masas de una fracción preferida con una señal
individual infrecuente.
La figura 6 muestra la identificación de los
péptidos NPPSMVAAGSVVAAV (SEQ ID n.º 1) (ciclina
D1_{198-212}).
La figura 7 muestra la estimulación específica
de los linfocitos T por el péptido de ciclina D1 (panel superior) y
la producción de citocina de los linfocitos T en respuesta al
péptido (panel inferior).
La figura 8 muestra un control negativo de la
activación inespecífica de linfocitos T colaboradores CD4^{+} con
receptores de linfocitos T específicos de
HLA-DR4/ciclina D1_{198-212}.
Como resultará obvio para los expertos en la
materia al leer la descripción y los ejemplos presentes, la
invención también se refiere a otros epítopos de antígenos
asociados a tumores, tal y como se describe específicamente en los
siguientes ejemplos, relacionados con un antígeno inmunógeno de
péptido de ciclina D1 presentado por HLA-DR4 con la
secuencia NPPSMVAAGSVVAAV (SEQ ID n.º 1), y la queratina 18. Los
ejemplos deben interpretarse como esbozos generales que los
expertos en la materia pueden aplicar fácilmente a todos los
epítopos de antígenos asociados a tumores de la presente invención
(es decir, que comprendan cualquiera de las secuencias SEQ ID n.º 1
a 338) y así aplicar enteramente la presente invención.
Abreviaturas utilizadas en la presente
solicitud:
- Ac:
- anticuerpo
- Ag:
- Antígeno
- APC:
- célula presentadora de antígeno
- CD:
- grupo de diferenciación
- cpm:
- recuentos por minuto
- DC:
- célula dendrítica
- VEB:
- virus de Epstein-Barr
- ESI:
- ionización por electrospray
- HLA:
- antígeno de leucocito humano
- HPLC:
- cromatografía líquida de alto rendimiento
- IFN:
- Interferón
- Ii:
- cadena invariante (CD74)
- IL:
- interleucina
- MALDI:
- láser de matriz asistida de ionización desorción
- MHC:
- Complejo mayor de histocompatibilidad
- MS:
- espectrometría de masas
- OD_{450}:
- densidad óptica a una longitud de onda de 450 nm
- PBMC:
- células mononucleares de sangre periférica
- PCR:
- reacción en cadena de la polimerasa
- PHA:
- Fitohemaglutinina
- SDS-PAGE:
- electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfatosódico
- SI:
- índice de estimulación
- TOF:
- tiempo de vuelo
\vskip1.000000\baselineskip
Se mantuvo línea celular humana
B-linfoblastoide Awells (IHW-No.
9090; HLA-DRB1*0401, HLA-DRB4*0101)
en medio RPMI 1640 (C.C. Pro, Neustadt, Alemania) con un 10% de FCS
(Pan, Aidenbach, Alemania) y se complementó con 2 mM de
L-glutamina (BioWhittaker, Verviers, Bélgica), 100
U/ml de penicilina y 100 \mug/ml de estreptomicina
(BioWhittaker). En el caso de los clones de células transfectadas,
se añadieron 0,8 mg/ml de G418 (PAA Laboratories, Linz, Austria).
Se generaron agentes de transfección estables por electroporación de
células Awells (280 V, 975 \muF; Gene Pulser II, Biorad, Múnich,
Alemania), seguida de la clonación mediante el método de dilución
límite. Los anticuerpos L243
(anti-HLA-DR) (Lampson, L. A. &
Levy, R. (1980) J. Immunol. 125,
293-299) y W6/32 (anti HLA de clase I) (Brodsky, F.
M. & Parham, P. (1982) J. Immunol. 128,
129-135) fueron purificados de sobrenadantes de
cultivo de hibridoma utilizando cuentas de
A-sefarosa de proteína (Pharmacia, Uppsala,
Suecia). Se indujo la línea celular Th y se cultivó en IMDM
(BioWhittaker) con un 10% de suero humano AB
(Pel-Freez Clinical Systems, LLC, Milwaukee, WI,
EUA) y complementada con 100 U/ml de penicilina y 100 \mug/ml de
estreptomicina, 2 mM de L-glutamina y 50 \muM de
\beta-mercaptoetanol. Los anticuerpos usado en el
análisis de citometría de flujo se adquirieron de PharMingen (San
Diego, CA, EUA).
Se amplificó el ADNc codificante de los 80
aminoácidos N-terminal de la Ii (NCBI, número de
registro de GenBank X00497) en una PCR a partir del vector
pBluescript II KS(+) 41-1 (Stratagene, Heidelberg,
Alemania), adquirido de A. Melms, (Malcherek, G., Wirblich, C.,
Willcox, N., Rammensee, H. G., Trowsdale, J. & Melms, A. (1998)
Eur. J. Immunol. 28, 1524-1533) y
subclonado en los sitios HindIII y BamHI de pcDNA3
(pcDNA3-Ii; Invitrogen, Karlsruhe, Alemania)
mediante los cebadores 5' ATCGAAGCTTCCAAGATGCACAGGAGGAGAAGC (SEQ ID
n.º 339) y 3' ATCGGGATCCTTTGTCCAGCCGGCCCTGCTG (SEQ ID n.º 340). Los
genes de interés se amplificaron en una PCR a partir de ADNc de
tejido renal maligno mediante los cebadores 5'
ATCGGAATTCtGAGCTT
CACCACTCGCTCC (SEQ ID n.º 341) y 3' ATCGGCGGCCGCTTAATGCCTCAGAACTTTGGT (SEQ ID n.º 342) para la queratina 18 (NCBI, número de registro GenBank X12881), y los cebadores 5' ATCGGAATTCTGGAACAC
CAGCTCCTGTGC (SEQ ID n.º 343) y 3' ATCGGCGGCCGCTCAGATGTCCACGTCCCGCAC (SEQ ID n.º 344) para la ciclina D1 (NCBI, GenBank X59798), respectivamente. El ADNc obtenido fue subclonado mediante la clonación TOPO TA (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) e insertado finalmente en los sitios EcoRI y NotI de la Ii pcDNA3, dentro de la secuencia de la Ii.
CACCACTCGCTCC (SEQ ID n.º 341) y 3' ATCGGCGGCCGCTTAATGCCTCAGAACTTTGGT (SEQ ID n.º 342) para la queratina 18 (NCBI, número de registro GenBank X12881), y los cebadores 5' ATCGGAATTCTGGAACAC
CAGCTCCTGTGC (SEQ ID n.º 343) y 3' ATCGGCGGCCGCTCAGATGTCCACGTCCCGCAC (SEQ ID n.º 344) para la ciclina D1 (NCBI, GenBank X59798), respectivamente. El ADNc obtenido fue subclonado mediante la clonación TOPO TA (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) e insertado finalmente en los sitios EcoRI y NotI de la Ii pcDNA3, dentro de la secuencia de la Ii.
Se aisló ARN de células usando el reactivo
TRIzol (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) conforme a las
recomendaciones del fabricante. Se sintetizó ADNc a partir de 1
\mug del ARN total. Se efectuó una PCR cuantitativa en tiempo
real (qPCR) usando el sistema de detección de secuencias ABI PRISM
7000 (Applied Biosystems, Darmstadt, Alemania). Se usó SYBR Green
PCR Master Mix (Applied Biosystems) para la amplificación de la PCR
y la detección en tiempo real de los productos de la PCR. Las
secuencias de los cebadores son las siguientes: 18S ARNr, cebadores
5' CGGCTACCACATCCAAGGAA (SEQ ID n.º 345) y 3' GCTGGAATTACCGCGGCT
(SEQ ID n.º 346); Queratina 18, cebadores 5' GAGCCTGGAGACCGAGAAC
(SEQ ID n.º 347) y 3' TTGCGAAGATCT
GAGCCC (SEQ ID n.º 348); ciclina D1, cebadores 5' CACGATTTCATTGAACACTTCC (SEQ ID n.º 349) y 3' TGAACTTCACATCTGTGGCAC (SEQ ID n.º 350). Las PCR se efectuaron en 20 \mul con 300 nM de cada cebador (18S cebador inverso: sólo 50 nM). Todas las muestras se amplificaron por duplicado. Las diferencias de expresión entre las células transfectadas y las normales para distintos genes se calcularon a partir de curvas de amplificación mediante cuantificación relativa, utilizando el método comparado del ciclo de umbral (C_{T}) (disponible en http://docs.appliedbiosystems.com/pebiodocs/04303859.pdf). Se seleccionó ARN ribosomal 18S como gen de referencia para las normalizaciones.
GAGCCC (SEQ ID n.º 348); ciclina D1, cebadores 5' CACGATTTCATTGAACACTTCC (SEQ ID n.º 349) y 3' TGAACTTCACATCTGTGGCAC (SEQ ID n.º 350). Las PCR se efectuaron en 20 \mul con 300 nM de cada cebador (18S cebador inverso: sólo 50 nM). Todas las muestras se amplificaron por duplicado. Las diferencias de expresión entre las células transfectadas y las normales para distintos genes se calcularon a partir de curvas de amplificación mediante cuantificación relativa, utilizando el método comparado del ciclo de umbral (C_{T}) (disponible en http://docs.appliedbiosystems.com/pebiodocs/04303859.pdf). Se seleccionó ARN ribosomal 18S como gen de referencia para las normalizaciones.
Se detectaron proteínas de fusión mediante el
análisis de transferencia Western, utilizando el AcMo PIN.1
(Stressgen, Biomol, Hamburgo, Alemania), ligado a los residuos de
aminoácidos 12-28 de la Ii. Resumidamente, las
células se lisaron como se describe (Hsieh, C. S., deRoos, P.,
Honey, K., Beers, C. & Rudensky, A. Y. (2002) J.
Immunol. 168, 2618-2625), los lisados se
hirvieron en amortiguador Laemmli de carga, se separaron en
SDS-PAGE al 12% y se transfirieron a membranas de
nitrocelulosa. Después de una saturación con BSA, las membranas se
incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con el AcMo PIN.1 (1
\mug/ml). Las proteínas se visualizaron utilizando IgG ovino
anti-ratón acoplado a peroxidasa (Amersham
Pharmacia, Friburgo, Alemania). En algunos casos, las células
transfectadas se cultivaron con 10-100 \muM de
cloroquina (Sigma, Steinheim, Alemania) con el fin de investigar la
direccionalización endosomal/lisosomal de las proteínas de fusión.
Después se lisaron las células y se detectaron las proteínas
mediante transferencia Western, como se describió anteriormente.
La queratina 18-Ii también se
detectó mediante inmunoprecipitación y posterior digestión in
situ con tripsina, seguida de análisis de espectrometría de
masas. Resumidamente, las células se lisaron como se ha descrito
(Hsieh, C. S., deRoos, P., Honey, K., Beers, C. & Rudensky, A.
Y. (2002) J. Immunol. 168, 2618-2625)
y se incubaron con el AcMo PIN.1 y cuentas de
A-sefarosa de proteína (Pharmacia, Uppsala, Suecia).
Las bolitas de sefarosa se lavaron, se hirvieron en amortiguador
Laemmli de carga y se colocaron en SDS-PAGE al 12%.
Los puntos de proteínas se eliminaron del gel y se digirieron in
situ con tripsina, esencialmente como se ha
descrito(Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O. & Mann, M.
(1996) Anal. Chem. 68, 850-858). El
análisis posterior se efectuó en un espectrómetro de masas
MALDI-TOF (Reflex III, Bruker Daltonik, Bremen,
Alemania). La identidad de las proteínas se verificó por espectros
de espectrometría de masas en tándem registrados en un espectrómetro
de masas en tándem de tiempo de vuelo de aceleración, híbrido y
ortogonal (QStar Pulsar i Qqoa Tof; Applied
Biosystems-MDS Sciex, Weiterstadt, Alemania).
Las bolitas de células congeladas (3,5 a 5 x
10^{10} células) se procesaron como se ha descrito (Schirle, M.,
Keilholz, W., Weber, B., Gouttefangeas, C., Dumrese, T., Becker, H.
D., Stevanovic, S. & Rammensee, H. G. (2000) Eur. J.
Immunol. 30, 2216-2225) y los péptidos se
aislaron conforme a los protocolos estándar (Seeger, F. H.,
Schirle, M., Keilholz, W., Rammensee, H. G. & Stevanovic, S.
(1999) Immunogenetics 49, 996-999)
utilizando el AcMo L243 específico de HLA-DR
(Lampson, L. A. & Levy, R. (1980) J. Immunol. 125,
293-299).
Los péptidos se separaron por cromatografía
líquida de alto rendimiento en fase invertida (HPLC, SMART system,
\muRPC C2/C18 SC 2.1/10; Amersham Pharmacia Biotech, Friburgo,
Alemania) y las fracciones se analizaron mediante espectrometría de
masas MALDI-TOF (MS), utilizando un espéctómetro de
masas Bruker Reflex III (Bruker Daltonik). Los péptidos presentados
de forma diferente se siguieron analizando mediante espectrometría
de masas nano-ESI (ionización de electrospray) en
tándem en un en un espectrómetro de masas en tándem de tiempo de
vuelo de aceleración, híbrido y ortogonal (Q-TOF;
Micromass, Manchester, Reino Unido), como se ha descrito (Schirle,
M., Keilholz, W., Weber, B., Gouttefangeas, C., Dumrese, T., Becker,
H. D., Stevanovic, S. & Rammensee, H. G. (2000) Eur. J.
Immunol. 30, 2216-2225).
Los péptidos fueron sintetizados en el
sintetizador de péptidos EPS221 (Abimed, Langenfeld, Alemania)
siguiendo la estrategia Fmoc/tBu. Tras la eliminación de la resina
por el tratamiento con TFA/fenol/etanoditiol/tioanisol/agua
(90/3.75/1.25/2.5/2.5 por vol.) durante 1 o 3 horas (péptidos con
arginina), los péptidos fueron precipitados desde el
metil-tert butil éter, lavados una vez con
metil-tert butil éter, dos veces con éter dietílico
y resuspendidos en agua antes de la liofilización. Los productos de
la síntesis fueron analizados por HPLC (Varian star, Zinsser
analytics, Múnich, Alemania) y por espectrometría de masas de
MALDI-TOF (future, GSG, Bruchsal, Alemania). Los
péptidos con una pureza de menos del 80% fueron purificados por HPLC
de preparación.
Se prepararon células mononucleares de sangre
periférica (PBMC) conforme a los procedimientos habituales, a
partir de HLA-DRB1*0408-,
HLA-DRB1*1101-, HLA-DRB3*0202-,
HLA-DRB4*01-positivo de un donante.
Las células dendríticas (DC) se obtuvieron de PBMC adherentes al
plástico cultivadas con GM-CSF y
IL-4 durante 6 días como se describió anteriormente
(Bender, A., Sapp, M., Schuler, G., Steinman, R. M. & Bhardwaj,
N. (1996) J. Immunol. Methods 196,
121-135), a excepción de que el medio utilizado fue
X-VIVO 15 (BioWhittaker) sin suero. Al sexto día se
analizaron las células dendríticas inmaduras por citometría de flujo
en busca de expresión de CD1a, CD11c, CD14, CD40, CD83, CD86 y
HLA-DR en la superficie celular, con un aparato
FACScalibur con software CELLQuest (Becton Dickinson, Mountain
View, CA). Las DC se maduraron después con 50 \mug/ml de ácido
poliinosínico-policitidílico (Poly I/C, Amersham
Pharmacia, Uppsala, Suecia) y 10 ng/ml de
TNF-\alpha (PharMingen) durante dos días más y se
volvieron a analizar mediante citometría de flujo en busca de
expresión de CD14, CD80, CD83 y CD86 en la superficie celular. Las
DC maduras mostraron una clara regulación ascendente de las
moléculas CD80, CD83 y CD86.
Se cargaron 3 x 10^{5} DC maduras durante dos
horas con 10 \muM del péptido NPPSMVAAGSVVAAV en una placa de 24
pocillos y se lavaron exhaustivamente. A continuación, se añadieron
4 x 10^{6} PBMC autólogas frescas a las DC, en presencia de 10
ng/ml de IL-12p70 para favorecer el desarrollo de
Th-1. Las PBMC se reestimularon semanalmente con
PBMC autólogas, irradiadas y con carga de péptidos en presencia de
10 U/ml de IL-2 y 5 ng/ml de IL-7.
Tras 3 y 5 reestimulaciones, los linfocitos T se mezclaron y se
probaron con PBMC autólogas en presencia del péptido. La línea
celular de linfocitos T colaboradores se amplificó entonces cada 1 o
2 semanas con PBMC alogénicas irradiadas en presencia de 1
\mug/ml de PHA, 25-50 U/ml de IL-2
y 5 ng/ml de IL-7 y después se probó para comprobar
el reconocimiento de las líneas celulares transfectadas. Cada tres o
cuatro semanas, la línea celular de linfocitos T colaboradores se
reestimulaba con PBMC autólogas irradiadas en presencia de 10
\muM de péptido, 10 U/ml de IL-2 y 5 ng/ml
de
IL-7.
IL-7.
La activación de los linfocitos T colaboradores
se comprobó por proliferación celular, calculada mediante
incorporación de timidina y secreción de citocina. Resumidamente, se
incubaron 2 x 10^{5} células por triplicado en una placa de 96
pocillos con 2 x 10^{5} PBMC autólogas irradiadas en presencia o
ausencia de 10 \muM de péptido o 3 \mug/ml de PHA. Tras 24
horas, se cultivaron y congelaron dos porciones de 50 \mul de
sobrenadante y se añadieron 50 \mul de medio fresco a las
células. Tras 54 horas, se añadieron 50 \mul de medio tritiado
con timidina (0.074 MBq/pocillo, Hartmann Analytic, Braunschweig,
Alemania) y se midió la incorporación de timidina a las 72 horas
utilizando un centellómetro (Microbeta, Wallac, Friburgo, Alemania).
La proliferación celular se expresa en forma de índice de
estimulación (SI), que corresponde a la siguiente proporción: (media
de cpm de linfocitos T estimulados)/(media de cpm de linfocitos T
sin estimular). La secreción e IL-2 se midió
utilizando la línea celular CTLL-2 dependiente de
IL-2. Resumidamente, se incubaron 10^{4} células
en presencia de sobrenadantes durante 20-24 horas.
A continuación, se añadió medio con timidina (0.055 MBq/pocillo)
durante 7-8 horas más y se midió la incorporación
de timidina como se describió anteriormente. Los resultados también
se expresan en forma de índice de estimulación.
La secreción de IFN-\gamma,
IL-4 e IL-6 se midió mediante
sándwich ELISA, utilizando pares de anticuerpos y
estreptavidina conjugada con peroxidasa, adquirida de PharMingen y
conforme a las recomendaciones del fabricante. Utilizamos
Supersensitive TMB (Sigma, Deisenhofen, Alemania) como substrato y
la reacción fue detenida con una solución de 2 M de
H_{2}SO_{4}. A continuación se midió la OD_{450} y los
resultados se expresaron en pg/ml conforme a los estándares.
La ausencia de reacción alogénica detectable de
los linfocitos T contra los agentes de transfección se demostró
mediante el cultivo conjunto de PBMC frescas del donante utilizadas
para generar la línea de linfocitos T colaboradores en presencia de
varios números de células de agentes de transfección irradiados. La
proliferación celular y la secreción de IL-2,
IL-4, IL-6 e
IFN-\gamma se midió como se describió
anteriormente y se determinó así la proporción de efector/diana para
otros experimentos.
El reconocimiento del péptido procesado
naturalmente derivado de la ciclina D1 se evaluó mediante el cultivo
conjunto de la línea celular de linfocitos T colaboradores
específica del péptido (2 x 10^{5} células) en presencia de
células Awells (4 x 10^{4} células) transfectadas con un plásmido
codificador de ciclina D1 o de queratina 18 como control negativo y
conforme a la proporción de células determinada más arriba. Como
controles positivos se utilizaron PBMC autólogas irradiadas en
presencia de 10 \muM de péptido o 3 \mug/ml de PHA. La
proliferación celular y la secreción de IL-2 e
IFN-\gamma se midió como se describió
anteriormente. En algunos experimentos, las células se cultivaron en
presencia de 20 \mug/ml de anticuerpo L243 purificado.
Clonamos el ADNc codificador de los 80
aminoácidos N-terminales de la Ii en el vector
pcDNA3 de tal forma que el extremo 3' del inserto era seguido por
un sitio de clonación general (GCS). Esto nos proporcionó un vector
versátil capaz de expresar proteínas de fusión de la Ii y los genes
de interés. En el marco de la Ii, clonamos el ADNc de la ciclina D1
así como la queratina 18 como control.
La línea celular Awells se transfectó de forma
estable con vectores codificadores de las dos proteínas de fusión
mediante electroporación. Posteriormente, se generaron clones de
células aisladas y se evaluó su expresión antigénica a nivel de
ARNm y de proteínas. En comparación con el tipo normal (línea
celular sin transfectar), el clon óptimo de queratina 18 de Ii
expresó 5.700 veces más queratina 18 y el clon óptimo de ciclina D1
de Ii expresó 1.200 veces más ciclina D1, como resultó del análisis
de PCR cuantitativo en tiempo real. Los datos se normalizaron en ARN
ribosómico 18S.
En anticuerpo PIN.1 se utilizó para detectar las
proteínas de fusión de Ii mediante análisis de transferencia
Western. En comparación con el tipo normal, donde sólo se detectaron
dos bandas correspondientes a dos isoformas de Ii (Warmerdam, P.
A., Long, E. O. & Roche, P. A. (1996) J. Cell Biol.
133, 281-291), se observó en cada clon una
banda adicional en representación de las proteínas de fusión de la
queratina 18 de Ii o la ciclina D1 de Ii, con los pesos moleculares
esperados (Figura 1). En el caso del clon
Awells-Ii-queratina 18, la proteína
de fusión también se identificó mediante inmunoprecipitación,
seguida de digestión in situ con tripsina y el posterior
análisis
MS/MS.
MS/MS.
También se evaluaron los niveles de expresión de
HLA de clase I y II en la superficie celular mediante citometría de
flujo con el fin de determinar si el procedimiento de transfección y
clonación interfirió en ellos. Ambos clones mostraron niveles de
expresión normales de moléculas HLA de clase I y II en comparación
con la línea celular sin transfectar.
Ya se ha descrito que el
N-terminal de Ii es suficiente para dirigir
proteínas a la vía del MHC de clase II (Sanderson, S., Frauwirth,
K. & Shastri, N. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A
92, 7217-7221, Wang, R. F., Wang, X.,
Atwood, A. C., Topalian, S. L. & Rosenberg, S. A. (1999)
Science 284, 1351-1354, Malcherek,
G., Wirblich, C., Willcox, N., Rammensee, H. G., Trowsdale, J. &
Melms, A. (1998) Eur. J. Immunol. 28,
1524-1533). Con el fin de comprobar si nuestros
constructos seguían realmente dicha ruta de procesamiento de
antígenos, incubamos los agentes de transfección durante 4 horas con
cantidades cada vez mayores de cloroquina, un fármaco citotóxico
que inhibe la degradación lisosomal de las proteínas mediante el
aumento del pH lisosomal (Kaplan, J. & Keogh, E. A. (1981)
Cell 24, 925-932, Tietze, C.,
Schlesinger, P. & Stahl, P. (1982) J. Cell Biol.
92, 417-424, Seglen, P. O. (1983) Methods
Enzymol. 96:737-64.,
737-764). Después se lisaron las células y se
detectaron las proteínas de fusión mediante transferencia Western.
La figura 2 muestra que las bandas de proteínas se vuelven más
intensas a medida que se aumentan las cantidades de cloroquina, lo
que indica que las cantidades de proteínas de fusión aumentan con el
aumento de concentración de cloroquina y demuestra que las proteínas
de fusión siguen la vía del MHC de clase II de degradación de
proteínas.
proteínas.
Se cultivaron de 3,5 a 5 x 10^{10} células de
cada clon y de la línea celular sin transfectar y los péptidos
unidos a HLA-DR se aislaron y separaron mediante
HPLC, como se describió anteriormente (Seeger, F. H., Schirle, M.,
Keilholz, W., Rammensee, H. G. & Stevanovic, S. (1999)
Immunogenetics 49, 996-999). Se
compararon los cromatogramas de la HPLC de la línea celular sin
transfectar y el clon de ciclina D1 de Ii de Awells (figura 3).
Algunas diferencias menores, en su mayoría cuantitativas, en el
repertorio de péptidos presentados por HLA-DR
dieron como resultado trazas UV ligeramente diferentes, como se
muestra en la figura 3. Tal y como esperábamos, no se pudieron
asignar señales UV diferenciadas a los péptidos presentados
exclusivamente por los agentes de transfección. Las únicas
diferencias sutiles en la presentación de péptidos restringidos por
HLA-DR entre Awells y las líneas transfectadas
también se detectaron mediante análisis MALDI-TOF,
en el que la mayoría de las fracciones de la HPLC contenían modelos
idénticos. La figura 4 muestra el análisis por espectrometría de
masas de la única fracción con una señal individual diferenciada
(m/z: 1732,96), que sólo se produjo en la mezcla de péptidos eluida
de la línea transfectada de queratina 18 y que representaba un
péptido derivado de la queratina 18. En la figura 5, la señal m/z
de 1370.1 indica un péptido presentado exclusivamente a partir del
agente de transfección de la ciclina D1. Ambos péptidos se
analizaron más detalladamente mediante ESI MS/MS de nanoflujo (MS
en tándem). Los inventores pudieron identificar los péptidos
NPPSMVAAGSVVAAV (SEQ ID n.º 1) (ciclina
D1_{198-212}) (figura 6) y SHYFKIIEDLRAQI (SEQ ID
n.º 2) (queratina 18_{126-139}) derivados de las
dos proteínas de fusión transfectadas, respectivamente. Las
secuencias se verificaron mediante espectros de masas de los
péptidos sintéticos correspondientes.
Con el fin de establecer una prueba de concepto
para la identificación de péptidos novedosos derivados de HLA de
clase II, asociados a tumores y supuestamente inmunógenos, se
indujeron linfocitos T específicos para el péptido identificado de
ciclina D1 mediante estimulación in vitro con el
correspondiente péptido sintético cargado en células dendríticas
HLA-DR4^{+}. Después de las
(re)estimulaciones in vitro tercera y quinta,
respectivamente, se evaluó la especificidad de la línea celular de
linfocitos T colaboradores. Los linfocitos T se estimularon
específicamente con el péptido de ciclina D1, como se muestra en la
figura 7 (panel superior). Los linfocitos T proliferaron en
respuesta a PBMC autólogas cargadas con el péptido de ciclina D1 (SI
= 5,4). Como control positivo, PHA indujo una fuerte proliferación
de linfocitos T (SI = 330). Los inventores analizaron a
continuación qué tipo de linfocitos T colaboradores (Th1 o Th2) se
estimuló en respuesta al péptido mediante un examen del perfil de
la citocina. Como también se muestra en la figura 7 (panel
inferior), los linfocitos T produjeron IL-2 en
respuesta al péptido, aunque en poca proporción, al mismo tiempo que
continuaban sensibilizados ante la estimulación de PHA. Al
contrario, la estimulación de los linfocitos T inducida por el
péptido dio como resultado una fuerte secreción de
IFN-\gamma (3250 pg/ml, fig. 7C) pero ninguna
secreción de IL-4 o IL-6, aunque
los linfocitos T continuaban sensibilizados de forma fuerte y
moderada ante la secreción de citocina inducida por PHA,
respectivamente. En la figura 8 se presenta la estimulación con un
péptido sin relación alguna como control negativo para la eventual
activación indeterminada de linfocitos T colaboradores con
receptores de linfocitos T específicos de
HLA-DR4/ciclina D1_{198-212}. En
conclusión, la línea celular establecida de linfocitos T
colaboradores CD4^{+} es específica para el péptido de ciclina
D1_{198-212} y es del tipo Th1. Este tipo es
especialmente importante para ayudar a los linfocitos T citotóxicos
CD8^{+} específicos a eliminar células
tumorales.
tumorales.
Debido a que las células Awells y la línea de
linfocitos T no se igualan perfectamente en HLA, evaluamos primero
si podía darse alguna reacción alogénica al cultivar ambos.
Resumidamente, se cultivaron de forma conjunta distintos números de
células de agentes de transfección de
Awells-Ii-queratina 18 o
Awells-Ii-ciclina D1irradiados, en
presencia de un número constante de PBMC del donante de linfocitos
T, y se midió la proliferación celular así como la secreción de
IL-2, IL-4, IL-6 e
IFN-\gamma. Ambos agentes de transfección
indujeron una proliferación moderada de los linfocitos T en números
elevados células, pero no se observó secreción de citocina (no se
muestran datos). Decidimos utilizar una proporción de (linfocitos T
efectores)/(células diana) de 5/1, en la que sólo se observó una
ligera proliferación de linfocitos T en ausencia de secreción de
citocina. Como consecuencia, la activación de los linfocitos T con
resultado de secreción de citocina sólo se pudo inducir
específicamente mediante el antígeno cognado presentado por el
agente de transfección.
La línea celular de linfocitos T colaboradores
específica para el péptido de ciclina D1 pudo reconocer las células
transfectadas que sobreexpresaban la proteína de ciclina D1 y
procesaban y presentaban de forma natural el péptido de ciclina D1
en asociación con las moléculas HLA-DR. Tal y como
se muestra en la figura 8, los agentes de transfección
Awells-Ii-ciclina D1 pudieron
activar específicamente la línea celular de linfocitos T
colaboradores como se observa por la secreción de
IL-2 (SI = 40). Por el contrario, los agentes de
transfección de Awells-Ii-queratina
18 (utilizados como control negativo para la estimulación de
linfocitos T y que presentan el péptido_{126-139}
no relacionado de queratina 18, en asociación con
HLA-DR) no indujeron la activación de linfocitos T,
lo que indica que la línea celular de linfocitos T colaboradores
específica del péptido reconoce específicamente el antígeno
cognado. Además, estos resultados demuestran que el péptido de
ciclina D1 utilizado en la presente invención es un péptido
procesado de forma natural que contiene un epítopo de linfocitos T.
Esta activación se pudo inhibir (en un 71,2%) mediante al presencia
del anticuerpo de bloqueo L243 específico de
HLA-DR.
Los linfocitos T citotóxicos activados (CTL) se
producen utilizando moléculas HLA-DR de clase II y
el péptido de ciclina D1_{198-212} (SEQ ID n.º
1).
En general, el método descrito en la solicitud
de patente de PCT WO 93/17095 se utiliza para producir los CTL. Las
células Awells se utilizan para presentar el antígeno peptídico a
las CTL. La molécula HLA-DR se expresa en las
células Awells. El péptido evaluado se sintetiza en un sintetizador
de Applied Biosystems, ABI 431A (Foster City, CA, EUA) y se
purifica posteriormente mediante HPLC. Como se describe en detalle
en WO 93/17095, con el fin de optimizar las condiciones in
vitro para la generación de linfocitos T citotóxicos
específicos, el cultivo de células de estimulación se mantiene en un
medio apropiado. Las células de estimulación son células Awells, que
son mantenidas, preferentemente, en un medio sin suero (por ejemplo,
Excell 400).
\newpage
Antes de la incubación de las células de
estimulación con las células que se desean activar -es decir,
células CD4^{+} precursoras-, se añade una cantidad de péptidos
antigénicos al cultivo de células de estimulación, suficiente para
cargarse en las moléculas de clase II humanas para su expresión en
la superficie de las células de estimulación. Una cantidad
suficiente de péptido es una cantidad que permite que unas 200 o,
preferentemente 200 o más, moléculas MHC humanas de clase II
cargadas con el péptido sean expresadas en la superficie de cada
célula de estimulación. Las células de estimulación se incuban
habitualmente con >20 pg/ml de péptido.
Las células CD4^{+} precursoras o en reposo se
incuban a continuación en un cultivo con las células de estimulación
adecuadas durante un periodo de tiempo suficiente para activar las
células CD4^{+}. Las células CD4^{+} se activarán así de forma
específicamente antigénica. La proporción de células (efectoras)
CD4^{+} precursoras o en reposo y de células de estimulación
puede variar de individuo a individuo y puede depender de variables
como la propensión de los linfocitos de un individuo a las
condiciones de cultivo. El linfocito: la proporción de la célula de
estimulación (célula Awells) se encuentra habitualmente en un rango
aproximado de 30: 1 y 300: 1. Por ejemplo, 3 x 10^{1} PBL humanas
y 1 x 10^{6} células Awells vivas se añaden y mantienen en 20 ml
de medio de cultivo RPMI 1640.
El cultivo efector/estimulador se mantiene el
tiempo necesario para estimular un número de linfocitos CD4^{+}
efectivo o utilizable terapéuticamente. El tiempo óptimo habitual es
entre uno y cinco días, con un "plateau", es decir, un nivel
de activación "máximo" específico de CD4^{+}, que normalmente
se observa tras cinco días de cultivo. La activación in
vitro de los linfocitos CD4^{+} se detecta habitualmente en un
periodo de tiempo breve tras la transfección de un línea celular.
La expresión transitoria en una línea celular transfectada capaz de
activar linfocitos CD4^{+} se detecta en las 48 horas siguientes a
la transfección. Esto indica claramente que tanto los cultivos
estables como los transitorios de células transformadas que expresan
moléculas MHC humanas de clase II son efectivos para activar células
CD4^{+}.
Los linfocitos CD4^{+} activados pueden
separarse de forma efectiva de las células de estimulación (Awells)
utilizando anticuerpos monoclonales específicos para las células de
estimulación, para los péptidos cargados en las células de
estimulación o para los linfocitos CD4^{+} (o una parte de los
mismos) para unir su ligando complementario adecuado. Las moléculas
de anticuerpos etiquetados se extraen entonces de la mezcla de
células efectoras de estimulación mediante métodos de
inmunoprecipitación o inmunoensayo.
Las cantidades citotóxicas efectivas de los
linfocitos CD4^{+} activados pueden variar según se utilicen in
vivo o in vitro, o según la cantidad y el tipo de células
diana de estas células citotóxicas. Para humanos adultos se utilizan
una cantidad aproximada de entre 1 x 10^{6} y 1 x 10^{12} de CTL
activadas.
Los linfocitos CD4^{+} activados se recogen
del cultivo de células Awells antes de la administración de
linfocitos CD4^{+} al individuo en tratamiento.
Para volver a introducir componentes celulares
se utilizan métodos como los ilustrados en los documentos US Patent
n.º 4.844.893 de Honsik y col. y US Patent n.º 4.690.915 de
Rosenberg. Por ejemplo, es apropiada la administración de linfocitos
CD8 activados mediante infusión intravenosa.
<110> Immatics biotechnologies GmbH
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<120> Epítopos inmunógenos de linfocitos
T colaboradores de antígenos de tumor humanos y utilización de
dichos epítopos en métodos inmunoterapéuticos
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<130> FB14464
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<160> 338
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<170> PatentIn version 3.1
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<210> 1
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<211> 15
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<211> 16
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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\hskip1cm
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<213> Homo sapiens
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\hskip1cm
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<211> 15
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<213> Homo sapiens
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\hskip1cm
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<213> Homo sapiens
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<400> 310
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\hskip1cm
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<213> Homo sapiens
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<400> 313
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<211> 15
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<213> Homo sapiens
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<400> 314
\hskip1cm
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<211> 16
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<213> Homo sapiens
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\hskip1cm
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<213> Homo sapiens
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<400> 316
\hskip1cm
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<211> 15
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<213> Homo sapiens
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<400> 317
\hskip1cm
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<211> 14
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<213> Homo sapiens
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<400> 318
\hskip1cm
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<211> 13
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<213> Homo sapiens
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<400> 319
\hskip1cm
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<211> 15
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<213> Homo sapiens
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<400> 320
\hskip1cm
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<211> 13
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<213> Homo sapiens
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<400> 321
\hskip1cm
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<211> 15
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<213> Homo sapiens
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<400> 322
\hskip1cm
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<211> 16
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 323
\hskip1cm
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<210> 324
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<211> 12
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 324
\hskip1cm
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<210> 325
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 325
\hskip1cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 326
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 326
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 327
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 327
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 328
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 328
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 329
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 329
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 330
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 330
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 331
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 331
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 332
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 332
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 333
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 333
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 334
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 334
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 335
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 335
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 336
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 336
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 337
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 337
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 338
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 338
\hskip1cm
Claims (25)
1. Un péptido asociado a tumor con una longitud
de entre 15 y 30 aminoácidos, que comprende un aminoácido contiguo
conforme a SEQ ID n.º 1.
2. El péptido asociado a tumor conforme a la
reivindicación 1, que consiste en una secuencia de aminoácidos
conforme a SEQ ID n.º 1.
3. El péptido asociado a un tumor conforme a las
reivindicaciones 1 ó 2, que tiene la habilidad de unirse a una
molécula del complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de
clase II, en particular a HLA-DR4.
4. El péptido asociado a tumor conforme a la
reivindicación 3, en donde, cuando está unido a
HLA-DR, es capaz de provocar la producción de un
linfocito T citotóxico (CTL) que reconoce una célula que expresa de
forma aberrante un polipéptido que comprende la secuencia dada de
aminoácidos.
5. El péptido asociado a un tumor conforme a
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el péptido
incluye enlaces no peptídicos.
6. El péptido asociado a un tumor conforme a
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el péptido es una
proteína de fusión que, en particular, comprende aminoácidos
N-terminal de la cadena invariante (Ii) asociada a
un antígeno HLA-DR.
7. Un ácido nucleico que consiste en la región
codificante para un péptido conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6.
8. El ácido nucleico conforme a la
reivindicación 7', que es ADN, ADNc, PNA, CNA, RNA o combinaciones
de los mismos.
9. Un vector de expresión capaz de expresar un
ácido nucleico conforme a las reivindicaciones 7 ó 8.
10. Una célula huésped que comprende un ácido
nucleico conforme a las reivindicaciones 7 ó 8 o un vector de
expresión conforme a la reivindicación 9.
11. La célula huésped conforme a la
reivindicación 10 que es una célula Awells recombinante.
12. Un método para producir un péptido asociado
a tumor conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6. El
método comprende el cultivo de la célula huésped conforme a la
reivindicación 11 y el aislamiento del péptido de la célula huésped
o de su medio de cultivo.
13. Una composición farmacéutica que comprende
un péptido asociado a tumor conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, un ácido nucleico conforme a las
reivindicaciones 7 ó 8 o un vector de expresión conforme a la
reivindicación 9 y un portador farmacéuticamente aceptable.
14. Un péptido asociado a tumor conforme a
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, un ácido nucleico conforme
a las reivindicaciones 7 ó 8 o un vector de expresión conforme a la
reivindicación 9 para su uso en medicina.
15. Una vacuna contra el cáncer que comprende un
péptido asociado a tumor conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, un ácido nucleico conforme a las
reivindicaciones 7 ó 8 o un vector de expresión conforme a la
reivindicación 9.
16. El uso de un péptido asociado a tumor
conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o un ácido
nucleico conforme a las reivindicaciones 7 ó 8 o un vector de
expresión conforme a la reivindicación 9 en la fabricación de un
medicamento para destruir células diana en un paciente cuyas células
diana expresan de forma aberrante un polipéptido que comprende una
secuencia de aminoácidos como la de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6.
17. Un método para producir linfocitos T
citotóxicos (CTL) activados in vitro, método que comprende el
contacto in vitro de los CTL con moléculas humanas MHC de
clase II con carga de antígenos, expresadas en la superficie de una
célula presentadora de antígenos adecuada durante un periodo de
tiempo suficiente para activar, de una forma propia de los
antígenos, dichos CTL, en donde el antígeno es un péptido según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
18. El método conforme a la reivindicación 17,
en la que el antígeno se carga en moléculas MHC de clase II
expresadas en la superficie de una célula presentadora de antígeno
adecuada por medio de la puesta en contacto de una cantidad
suficiente del antígeno con una célula presentadora de antígeno.
19. El método conforme a la reivindicación 17,
en la que la célula presentadora de antígeno comprende un vector de
expresión conforme a la reivindicación 11.
20. El método conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 17 a 19 en las que la molécula MHC de clase II es
HLA-DR4.
21. Los linfocitos T citotóxicos (CTL)
activados, producidos mediante el método conforme a cualquiera de
las reivindicaciones 17 a 19, que, de forma selectiva, reconocen una
célula que expresa de forma aberrante un polipéptido que comprende
una secuencia de aminoácidos dada en cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6.
22. Un receptor de linfocitos T (TCR) que
reconoce específicamente una secuencia de aminoácidos dada en
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, pudiéndose obtener el TCR
del linfocito T citotóxico (CTL) de la reivindicación 21.
23. El uso de linfocitos T citotóxicos como se
definió en la reivindicación 21 en la fabricación de un medicamento
para destruir células diana en un paciente cuyas células diana
expresan de forma aberrante un polipéptido que comprende una
secuencia de aminoácidos dada en cualquiera de las reivindicaciones
1 a 6.
24. El uso de un péptido asociado a tumor o de
un ácido nucleico o de linfocitos T citotóxicos conforme a la
reivindicación 21 para fabricar un medicamento para destruir células
diana en un paciente en el que las células diana son células de
cáncer.
25. El uso conforme a la reivindicación 24 en el
que dicho cáncer es cáncer renal que expresa de forma aberrante el
polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como la dada
en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
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