JPH06507787A

JPH06507787A - Ｄ−型サイクリン並びにそれに関連する使用方法

Info

Publication number: JPH06507787A
Application number: JP5500242A
Authority: JP
Inventors: ビーチ　デイビッド　エイチ．
Original assignee: コールドスプリングハーバーラボラトリー
Priority date: 1991-05-16
Filing date: 1992-05-18
Publication date: 1994-09-08
Also published as: JP2001299368A; WO1992020796A2; WO1992020796A3; CA2103161A1; EP0584264A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】Ｄ−サイ　リン並びにそ　に　る発明Φ茸量典型的な真核細胞の細胞周期は、核分裂（有糸分裂）と細胞質分裂あるいはサイトキネシスを含むＭ期と、Ｇ１期から始まって８期に入り、６２期で終了するＭ期と、を含む。Ｍ期は、次のＭ期の開始まで、有糸分裂が始まるまで続く。８期では、ＤＮＡ複製とヒストンの合成が行なわれる。一方、Ｇ１及び０２期では、損傷を受けたＤＮＡは修復されるが、正味のＤＮＡ合成は起こらない。細胞周期の間には、いくつかの重要な変化が起こる。それには、拘束点あるいは開始点と呼ばれる６１期中の決定的な時点が含まれる。この点を越えると、細胞は、８１６２、Ｍ期を完了するように方向付けられる。

Ｍ期の開始は、あらゆる哺乳細胞で、共通の機構によって調節されているようである。この機構の鍵となる因子は、プロティンキナーゼｐ　３４　”ｔ″である。この因子の活性には、リン酸化状態の変化と、サイクリンと呼ばれるタンパク質との相互作用が必要である。サイクリンもまた、活性化の後、Ｍ期を進行させる役割を担う。

サイクリンは、海産無を椎動物の卵で受精に続いて急激に合成されることから、発見されたタンパク質である（Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ、　Ｅ、Ｔ、ら、釦旦２０：４８７−４９４（１９８０））。

次に、２つの型のサイクリン、つまりＡとＢの量が、初期卵割の間に変動することが観察された。これは、これらのポリペプチドが、有糸分裂の際にタンパク質分解されるためてあり、このことから、この名前が付いた（Ｅｖａｎｓ、　Ｔ、ら、釦旦クラムのサイクリンｍＲＮＡが、カエルの卵母細胞を活性化し、これらの細胞をＭ期に導入することができることから、サイクリンは、受動的というよりも、能動的に、細胞分裂の調節に関与していることが明らかとなった（Ｓｗｅｎｓｏｎ、　Ｌ　Ｉ。

：］２９−１４６（１９７１）　；　Ｓｍ１ｔｈ、Ｌ、　Ｄ、とＲ，Ｅ、Ｅｃｋｅｒ、　Ｄｅｖ、Ｂｉｏｌ、２５：２３２−２４７（１９７P））。

ＭＰＦは、プロティンキナーゼであり、その触媒サブユニットはｃｄｃ２プロティンキナーゼのカエルにおける相同吻である（Ｄｕｎｐｈｙ、　Ｗ、Ｇ、ら、　Ｃｅ１ｌ　５４：４２３−４３１（１９８８）　；　Ｇａｕｔｉｅｒ、Ｊ、ら、Ｃｅ１ｌ　５４：４３３−４３９（１９８８）　；Ａｒ１ｏｎ、Ｄ、ら、Ｃｅ１ｌ　５５：R７１− ３７８（１９８８））。

これまでに、３つの型のサイクリンが同定されている：Ｂ、Ａ、及び、ＣＬＮサイタリンである。Ｂ−型サイクリンは、ｃｄｃ２プロティンキナーゼの不可欠なサブユニットとして機能することで、有糸分裂中に働（ことが示されている（Ｂｏｏｈｅｒ、Ｒとり、Ｂｅａｃｈ、ＥＭＢＯＪ、６：３４４１−３４４７（１９８７）　；Ｄｒａｅｔｔａ、Ｇ、ら、Ｃｅ１ｌ　５６：８２９−８３８（１９８９）　ｌ　Ｌａｂｂｅ、Ｊ、Ｃ，ら、Ｃｅ１ｌ　５７：２５３−２６３（１９８９）　；　Ｌａｂｂｅ、Ｊ、ＣCら、輝ＢＯＪ、８；３０５３−３０５８（１９８９）　：　Ｍｅｉｊｅｒ、Ｌ、ら、ＥＭＢＯＪ、影２２７５−２２８２（１９９０）　；Ｇａｕｔ奄■ ｒ、　Ｊ、ら、　Ｃｅ１ｌ　６０：４８７−４９４（１９９０））　、また、Ａ −型サイクリンも、独立にｃｄｃ２キナーゼと結合し、有糸分裂以前の分裂周期初期に機能する酵素を形成する（Ｄｒａｅｔｔａ、Ｇ　ら、Ｃｅ１ｌ　５６：８２９−８３８（１９８９）　；Ｍｉｎｓｈｕｌｌ、Ｊ、ら、　ＥＭＢＯＪ、９：２８６５−Q ８７５（１９９０）　；Ｇｉｏｒｄａｎｏ、Ａ、ら、　Ｃｅ１ｌ　５８：９８１ −９９０（１９８９）　；Ｐｉｎｅｓ、Ｊ、とＴ、Ｈｕｎｔ■秩B Ｎａｔｕｒｅ　３４６：７６０−７６３（１９９０））。これらの２つのクラスのサイクリンの機能上の違いは、完全にはわかっていない。

無を椎動物とを椎動物の胚におけるサイクリンの細胞学的及び分子的研究は、特に、子嚢酵母における遺伝学的研究を伴って行なわれた。分裂酵母では、ｃｄｃ１３遺伝子は、ｃｄｃ２と共に作用して有糸分裂への移行を調節するＢ−型サイクリンをコードする（Ｂｏｏｈｅｒ、　Ｒ，とり、　Ｂｅａｃｈ、　ＥＭＢＯＪ、　６：３４４１−３４４７（１９８７）　；Ｂｏｏｈｅｒ、　Ｒ，とり、　Ｂｅａｃｈ、　ＥＭＢＯＪ、　７：２３２１−２３２７（１９８８）劃ａｇａｎ、１．ら、Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｓモ堰B ９１：５８７−５９５（１９８８）　；　Ｓｏｌｏｍｏｎ、Ｍ、　Ｃｅ旦５４ニア３８−７４０（１９８８）　；Ｇｏｅｂｌ、　Ｍ、とＢ、aｙｅｒｓ、　Ｃｅ旦５４：４３３−４３９（１９８８）　；　Ｂｏｏｈｅｒ、Ｒ，Ｎ　ら１図旦５８：４８５−４９７（１９８９））。

出芽酵母及び分裂酵母での遺伝学的研究から、ｃｄｃ２　（あるいは出芽酵母ではＣＤＣ２８）が、細胞周期の２つの別個の時点で作用することが明らかとなった。有糸分裂と、いわゆる細胞周期の”開始点“において、である（Ｈａｒｔｗｅｌ　１゜Ｌ、Ｈ，、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、１０４：８０３−８１７（１９７１）；Ｎｕｒｓｅ、Ｐ、とＹ、Ｂ１５ｓｅｔｔ、Ｎａｔｕｒｅ　２X ２：５５８−５６０（１９８１）　；　Ｐｉｇｇｏｔ、Ｊ、　Ｒ，ら、Ｎａｔｕｒｅ　２９８：３９１−３９３（１９８２）　；　ＲｅｅｄAＳ、　１．とＣｌＷｉｔｔｅｎｂｅｒｇ、　ＰｒｏＣ，Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８７：５６９７−５７０１（１９９０））。

出芽酵母では、ＣＤＣ２８タンパク質の開始機能には、このプロティンキナーゼの触媒サブユニットが、構造的にへ及びＢ−型サイクリンに関連した補助的なタンパク質と結合することが必要である。この第三のクラスのサイクリンは、ＣＩｎクラスと呼ばれており、３つの遺伝子が部分的に重複した遺伝子ファミリーを形成していることが報告されている（Ｎａｓｈ、　Ｒ，ら１則Δ火ヱ：４３３５ −４３４６（１９８８）；　Ｈａｄｗｉｇｅｒ、Ｊ、　Ａ、ら、Ｐｒｏｔ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８６：６２５５−６２５９（１９８９）　；Ｒ奄モ■■ ｒｄｓｏｎ、　Ｈ，Ｅ、ら、ン旦５９：１１２７−１１３３（１９８９））　、　ＣＬＮ遺伝子は、開始点の実行に必須であり、これがないと、細胞は細胞周期のＧ１期で停止する。ＣＬＮＩ及びＣＬＮ２転写物は、細胞周期を通して量が変動するが、ＣＬＮ３転写物は変動しない。さらに、ＣＩｎ２タンパク質が、そのｍＲＮＡと並行して変動することが示されている（Ｎａｓｈ、　Ｒ，ら、　Ｅ！！ＢＯＪ、　Ｚ：４３３５−４３４７（１９８８）　；Ｃｒｏｓｓ、　Ｆ、Ｒ，、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、８：４６７５−４５８４（１９８８）　；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ、Ｈ，Ｅ、　ら、　（≧＝１１５９：１１２７−１１R３（１９８８）；　Ｗｉｔｔｅｎｂｅｒｇ、ら、１９９０）　。

様々なサイクリンと結合することによってｃ　ｄ　ｃ　２／ＣＤＣ２８に与えられる正確な生化学的性質は、まだ完全に解明されていない。しかし、サイクリン変異体の遺伝学的研究から、これらが触媒サブユニットに対して”Ｇ１”及び” Ｇ２”の性質を与えることが明示された（Ｂｏｏｈｅｒ、Ｒ，とり、　Ｂｅａｃｈ、　ＥＭＢＯＪ、　６：３４４１−３４４７（１９８７）　；　Ｎａ５ｈ、Ｒ，ら、　ＥＭＢＯＪ、７：４３３５−４３４７（１９８８）　；　Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ、Ｈ，Ｅ、轣A幻１１５９：１１２７−１１３３（１９８８））。

ｃｄｃ２とサイクリンは、胚と酵母中だけではなく、ヒトの体細胞中でも発見されている。ｃｄｃ／サイクリンＢ酵素の機能は、ヒト細胞中でも、その他の型の細胞と、同一であるようである（Ｒｉａｂｏｗｏｌ、　Ｌら、釦旦、　５７：３９３−４０１（１９８９））。

また、ヒトＡ型サイクリンも、ｃｄｃ２と結合した状態で発見されている。ＣＬＮ型のサイクリンは、哺乳細胞中では発見されていない。細胞周期の調節に関わる因子とそれらの相互作用をよりよく理解することは、細胞複製と、おそらくその過程の調節あるいは変化を、よりよく理解することに貢献するであろう。

＆咀の概要本発明は、以前に報告されたＡ、ＢあるいはＣＬＮ型サイクリンに関連するが、別個な、Ｄ〜型サイクリンと称される哺乳類由来の新しいクラスのサイクリンに関するものである。詳細には、本発明は、酵母において細胞周期の開始に必須なＣＬＮ−型遺伝Ｐを代替することができることが示されている遺伝子にコードされる、ヒトサイクリンに関するものである。本発明のヒトサイクリンは、細胞周期の開始に必須なタンパク質を相補し、タンパク質構造に基づくと、進化樹で、Ａ、ＢあるいはＣＬＮ型サイすリンとは異なる枝上に位置する。ここでは、ヒトＤ−型遺伝子ファミリーと称される、Ｄ−型サイクリンという新しいファミリーに属する３つのメンバーを説明する。これらは、コード領域全体で平均５７％、サイクリンボックスで７８％の同一性を共有する小さな（３３−３４ＫＤａ）タンパク質をコードする。この新しいサイクリンファミリーの第一のメンバーであるサイクリンＤ１、あるいは、ＣＣＤＮＩは、２９５アミノ酸残基で、３３，６７０ダルトン（Ｄａ）の推定分子量を有する。第二のメンバーであるサイクリンＤ２、あるいは、ＣＣＤＮ２は、２８９アミノ酸残基であり、３３，０４５ダルトンの推定分子量を有する。これは、染色体１２ｐのバンドｐ１３にマツピングされている。第三のメンバーであるサイクリンＤ３、あるいは、ＣＣＤＮ３は、２９２アミノ酸残基であり、約３２，４８２ダルトンの推定分子量を有する。これは、染色体６ｐのハンドｐ２１にマツピングされている。ここで説明されているＤ−型サイクリンは、これまでに同定されたうちで、最小のサイクリンタンパク質である。ここで説明されている３つのサイクリン遺伝子は、全て、同じ位置にイントロンが挿入されている。組換え技術を用いて、本発明のＤ−型サイクリンを生産することができる。また、化学合成、あるいは、これらが天然に存在する供給源から単離または精製することができる。従って、本発明は、組換えＤ− 型サイクリンと、単離あるいは精製されたＤ−型サイクリンと、合成り一型すイタリンとを含む。

また、本発明は、哺乳類由来、詳細には、ヒト由来のＤ−型サイクリンをコードするＤＮＡあるいはＲＮＡと、哺乳類由来、詳細には、ヒト由来のＤ−型サイクリンに特異的なポリクローナル及びモノクローナル抗体に関する。

さらに、本発明は、例えば、その他のＤ−型サイクリン、あるいは、関連する（しかし、非り一型の）サイクリンなどの、その他のサイクリンをコードする遺伝子を単離するための方法に関する。また、本発明は、診断及び治療の側面も有する。例えば、本発明は、組織、及び、血液、尿、糞便、粘液、唾液などの生物検体中の、一種のＤ−型サイクリン（あるいは複数のサイクリン）の存在、及び／あるいは、量を決定する方法に関する。この方法では、ここに記載されているＤ −型サイクリンの遺伝子または複数の遺伝子に基づく核酸プローブ、あるいは、Ｄ−型サイクリンに特異的な抗体を使用する。この実施例を用いて、サイクリンレベルあるいは活性が上昇しているかどうかを調べることによって（活性レベルが上昇していることは、細胞が異常に速い速度で細胞分裂を行う可能性が高いことを示唆する）、細胞が異常に速い速度で細胞分裂を行う可能性があるかどうか（すなわち、細胞が発癌しているか）、を予測することができる。また、本発明は、一種（複数）のＤ−型サイクリン、一種（複数）のＤ−型サイクリンをコードする遺伝子、あるいは、一種（複数）の転写産物（ＲＮＡ）が、異常に高レベルであることに基づいて、細胞分裂が異常に速い速度で起こる可能性を評価する診断方法にも関する。

さらに、本発明は、細胞中の少なくとも一つのＤ−型サイクリン、例えば、Ｂ２、Ｂ２あるいはＢ３、の活性を変化させることによって、細胞分裂を調節する（低下あるいは上昇させる）方法に関する。詳細には、本発明は、一種（複数）のＤ−型サイクリンの活性、あるいは、機能に干渉することによって、細胞分裂の上昇を阻害するための方法に関する。Ｄ−型サイクリンは（通常）プロティンキナーゼを活性化するが、この治療方法では、Ｄ−型サイクリン活性を直接あるいは間接的に阻害する物質を用いて、Ｄ−型サイクリンのプロティンキナーゼ（例えば、ｐ３４°６°２、あるいは、関連のプロティンキナーゼ）活性化力を阻害して、（複数の）Ｄ−型サイクリンの機能を阻害（部分的にあるいは完全に）する。このような物質には、アンチ−センス配列、あるいは、ＤサイクリンをコードするＤＮＡあるいはＲＮＡに結合するその他の転写調節因子：Ｄ−型サイクリン、あるいは、細胞周期を開始するという役割を果たすためにＤ−型サイクリンが相互作用、または、結合しなければならない分子、に結合する抗体、（複数の）Ｄ−型サイクリンと結合する物質；　（複数の）Ｄ−型サイクリンを分解、あるいは別の方法で不活性化する物質（例えば、プロテアーゼ）：Ｄ−型サイクリンがキナーゼの触媒サブユニットに結合することを妨害する物質（例えば、小さな有機分子）、が含まれる。また、本発明の要旨は、記載の単離方法、診断方法、治療方法に有用な物質（例えば、オリゴヌクレオチド、抗体、ペプチド）に関する。

Ｍ厘の交単望脱朋図１は、ヒトサイクリン遺伝子の遺伝子スクリーニングを図示する。

図２は、ヒトサイクリンＤ１の核酸配列（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、１）及びアミノ酸配列（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、２）である。ヌクレオチド番号とアミノ酸番号を右に記す。アミノ酸番号は、開始メチオニンを１番として数えた。停止コドンをアスタリスクで示す。

図３は、ヒトサイクリンＤ２の核酸配列（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、３）及びアミノ酸配列（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、４）である。ヌクレオチド番号とアミノ酸番号を右に記す。アミノ酸番号は、開始メチオニンを１番として数えた。停止コドンをアスタリスクで示す。

図４は、ヒトサイクリンＤ３の核酸配列（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、５）及びアミノ酸配列（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、６）である。ヌクレオチド番号とアミノ酸番号を右に記す。アミノ酸番号は、開始メチオニンを１番として数えた。停止コドンをアスタリスクで示す。

図５は、サイクリン遺伝子ファミリーを示す。

図５Ａは、７種のサイクリン遺伝子のアミノ酸配列を整列したものを示す（ＣＹＣＤＩ−Ｈｓ、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、７；ＣＹＣＡ−Ｈｓ、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、８；ＣＹＣＡ−Ｄｍ、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、９；ＣＹＣＢＩ−Ｈｓ、５ＥＱＩＤ　Ｎｏ、１０；ＣＹＣｌ３−３ｐ、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、１１；ＣＬＮＩ−３ｃ、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、１２；ＣＬＮ３−３ｃ、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、１３）。いくつかの配列中の数字は、挿入の結果、配列から省略したアミノ酸残基の数を示す。

図５Ｂは、ネイバー・ジョイユング法で作成したサイクリン・ファミリーの進化樹を図示する。水平線の長さがダイバージェンスを示す。

図６は、サイタリンＤ１遺伝子転写物の択一的ポリアデニル化を示す。

図６Ａは、様々な細胞株から単離されたい（つかのｃＤＮＡクローンの比較を示す。白抜きの箱は、サイクリン遺伝子伝子のコード領域を含む１．７ｋｂの小さな転写物を示す。斜線の箱は、４．８ｋｂ長の転写物に存在する３′断片を示す。各ｃＤＮＡクローンの上に制限部位を示して、これらのクローンが整列されていることを示す。

図６Ｂは、い（つかのクローンに関して、最初のポリアデニル化部位を取り囲むヌクレオチド配列を示す（ＣＹＣＤＩ−２１，ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、１４；ＣＹＣＤＩ−Ｎ１２．ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、１５；ＣＹＣＤＩ−ＨＯ３４，５ＥＱＩＤ　Ｎｏ、１６；ＣＹＣＤＩ−ＴＯ７８，ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、１７、及び、ゲノムクローン；ＣＹＣＤＩ−ＧＯ６８，ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、１８）。

図７は、１１種の哺乳類サイクリンのタンパク質配列の比較を示す（ＣＹＣＤｌ −Ｈｓ、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、１９；ＣＹＬＩ−Ｍｍ、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ。

２０；ＣＹＣＤ２−Ｈｓ、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、２１　；ＣＹＣＬ２−Ｍｍ、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、２２；ＣＹＣＤ３−Ｈｓ、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、２３；ＣＹＬ３−Ｍｍ、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、２４；ＣＹＣＡ−Ｈｓ、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ。

２５；ＣＹＣＢＩ−Ｈｓ、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、２６；ＣＹＣＥ２−Ｈｓ、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、２７；ＣＹＣＣ−Ｈｓ、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、２８：ＣＹＣＥ −Ｈｓ、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、２９）。

図８は、ヒトサイクリンＤ遺伝子のゲノム構造を図示する。各図形は、各サイクリンＤ遺伝子由来の、完全に配列決定を行った制限断片を示す。黒塗の箱は、エクソン配列を示す。白抜きの箱は、イントロン、あるいは、５′及び３′非翻訳配列を示す。斜線の箱は、偽遺伝子を示す。各クローンの上に、いくつかの制限部位、ＡＴＧ、及び、停止コドンを示す。

図９は、サイクリンＤ２偽遺伝子の核酸配列（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、３０）及びアミノ酸配列（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、３１）を示す。

図１０は、サイクリンＤ３偽遺伝子の核酸配列（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、３２）及びアミノ酸配列（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、３３）を示す。

図１１は、１．３ｋｂのヒトサイクリンＤ１プロモーターの核酸配列（ＳＥＱＩＤ　Ｎｏ、３４）を示す。この配列は、開始ＡＴＧコドンで終わる。転写は、およそヌクレオチド−１６０で開始する。

図１２は、１．６ｋｂのヒトサイ久リンＤ２プロモーターの核酸配列（ＳＥＱＩＤ　Ｎｏ、３５）を示す。この配列は、開始ＡＴＧコドンで終わる。転写は、およそヌクレオチド−１７０で開始する。

図１３は、３．２ｋｂのヒトサイクリンＤ３プロモーターの核酸配列（ＳＥＱＩＤ　Ｎｏ、３６）を示す。この配列は、開始ＡＴＧコドンで終わる。転写は、およそヌクレオチド−１６０で開始する。

光用の詳刺μ既朋ここでは、Ｄ−型サイクリンと称される、新しいクラスの哺乳類サイクリンタンパク質が同定、単離され、細胞周期の開始のための制御因子として機能することが示されたことについて説明する。Ｄ−型サイクリンは、細胞周期の開始に活性が必須であるプロティンキナーゼを活性化することにより、既知のサイクリンタンパク質の機能を果たす。このＧ１期の出来事によって、細胞は、細胞分裂を行うよう方向付けられる。詳細には、ヒトのＤ−型サイクリンタンパク質と、それらをコードする遺伝子が同定され、単離された。そして、これらが、酵母で細胞周期の開始に必須であることが知られているＣＬＮ型サイクリンを代替可能であることが示された。また、ＣＣＤＮ２とＣＣＤＮ３の染色体上の座位を決定した。

その結果、新しいクラスのサイクリン（Ｄ型）と、前記新規なり一型すイクリシをコードするＤＮＡ及びＲＮＡと、Ｄ−型サイクリンに特異的な（結合する）抗体が提供される。また、これらを用いて、生物検体中でその他のサイクリンを同定したり、そのようなタンパク質及びオリゴヌクレオチドを検出する方法、異常に速い速度で起こる細胞分裂の阻害や、サイクリン阻害剤の同定を行う方法が提供される。

ヒトＤ−型サイクリンの同定と性質、及び、これらの新規なサイクリンとその関連物の使用法について、下記に説明する。

ヒトサイ　リンＤｉ　Ｄ２　Ｄ３の　と図１に図示し、例１で詳細に説明するように、３つのＣＬＮ遺伝子のうちの２つ（ＣＬＮＩ及びＣＬＮ２）が不活性であり、第３のＣＬＮ遺伝子の発現が条件的であるような酵母の変異株を用いて、酵母をＣＬＮ欠損からレスキューするような、ヒトｃＤＮＡクローンを同定した。

酵母発現ベクター（ｐＡＤＮＳ）内に組み込まれたヒト神経膠芽細胞種ｃＤＮＡライブラリーを、前記酵母変異株に導入した。ＣＬＮ遺伝子の機能が３つとも欠損しているにも関わらず増殖し、かつ、復帰突然変異株ではないような、酵母の形質転換株２株（ｐＣＹＣＤｌ−２１及びｐｃＹｃＤｌ−１９）を同定し、Ｅ、ｃｏｌｉ中に回収した。これらを酵母に再び導入すると、どちらも変異株（ＣＬＮ欠損株）をレスキューした。しかし、レスキューの効率は低く、レスキューされた株の増殖は比較的悪かった。

ｐＣＹＣＤｌ−１９及びｐｃＹｃＤｌ−２１は、制限マツピングと、部分的なりＮＡ配列分析によって、同じ遺伝子を表す別個のクローンであることが示された。完全長のｃＤＮＡクローンを得るために、ｐｃＹｃＤｌ−２１の１．　２ｋｂの挿入断片をプローブとして用いて、ＨｅＬａのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。この方法で同定された９個のポジティブクローンのうちの、最長のクローン（ｐｃＹｃＤｌ−１２；　１３２５ｂｐ）について、完全に配列決定を行なった。前記１．２ｋｂの挿入断片の配列を図２に示す。この遺伝子の予想されるタンパク質産物は、およそ分子量３４，０００ダルトンである。

例４に示すように、ポリメラーゼ連鎖反応と、Ｄ−型サイクリンのよ（保存された３つの領域由来の３つのオリゴヌクレオチドプローブを用いて、サイクリンＤ２及びＤ３ｃＤＮＡを単離した。記載の通り、この目的のために、２つの５゛オリゴヌクレオチドと、１つの３′縮重オリゴヌクレオチドを使用した。ＣＣＮＤ２遺伝子のヌクレオチド及びアミノ酸配列と、コードされているＤ２サイクリンタンパク質を、図３に示す。ＣＣＤＮ３遺伝子のヌクレオチド及びアミノ酸配列と、コードされているＤ３サイクリンタンパク質を、図４に示す。ブダペスト条約の合意に基づき、１９９１年５月１４田こ、プラスミドｐＣＹＣ−Ｄ３をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ロックビル、メリーランド州）に寄託した。この寄託に対して、受託番号６８６２０を得た。

ＣＹＣＤＩ−ＨＩ３にコードされているタンパク質の配列を、既知のサイクリンのタンパク質配列（図５Ａを参照）、と比較したところ、この新規サイクリンと、Ａ、ＢＳＣＬＮ型サイクリンとの間には、相同性が見られた。しかし、ＣＹＣＤＩが、これらの既存のクラスとは異なることも、明らかとなった。

この新規サイクリン遺伝子及びその産物が、その他のサイクリン遺伝子と、進化上、どのように関連しているかを評価するために、既知の全サイクリンのアミノ酸配列の比較を広範囲で行なった（図５Ｂ及び例１）。この比較の結果、ＣＹＣＤＩが、ここではサイクリンＤと称される、新しいクラスのサイクリンであることが示された。

例２に示すように、ノーザン分析を用いて、ヒト細胞中でのサイクリンＤ１の発現を調査した。結果として、いくつかの細胞株では、サイクリンＤ１の発現レベルが非常に低いことが示された。ＣＹＣＤＩ遺伝子の全コード領域を用いて、ＨｅＬａ細胞由来のポリ（Ａ）’ＲＮＡを検索した。そして、主要な転写物が２つ存在し、一方がおよそ４．８ｋｂ、もう一方はおよそ１．７ｋｂであり、分子量の大きい方がより豊富であることが示された。様々なｃＤＮＡライブラリーから単離されたｃＤＮＡのうちのほとんどは、クローンλＣＹＣＤ１−Ｈ１２に非常に類似していることが判明した。従って、ノーザンプロットで検出された１、７ｋｂの転写物は、図２のヌクレオチド配列に対応すると考えられる。大きい（４゜８ｋｂ）転写物の由来は不明である。例２で説明するように、検出された２種類（４，８ｋｂ及び１．７ｋｂ）の転写物は、ＣＹＣＤＩ　（図６）のポリアデニル化の差異によって生成したと考えられる。

例３で説明するように、様々な組織及び細胞株におけるサイクリンＤ１の特異的な発現を評価した。完全長のＣＹＣＤＩクローンを得るために、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行なったところ、酵母の形質転換株作成に使用したヒト神経膠芽細胞腫細胞株（Ｕ１１８　ＭＧ）由来のｃＤＮＡライブラリーからは、他の３つのｃＤＮＡライブラリー（ヒトＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡ、ヒトＴ細胞ｃＤＮＡ、ヒト奇形腫細胞ｃＤＮＡ）よりも多くのポジティブが得られることが示された。ノーザン及びウェスタン分析を行って、サイクリンＤ１が差異的に発現されているかを調べた。結果（例３）より、神経膠芽細胞腫（Ｕ１１８　ＭＧ）細胞では、転写物のレベルが、ＨｅＬａ細胞よりも、７から１０倍高いことが示された。また、ＨｅＬａ及びＵ１１８．ＭＧ細胞中には、高分子量及び低分子量の転写物が存在することが示された。抗ＣＹＬ１抗体を用いたウェスタンブロッティングでは、神経膠芽細胞腫細胞中で、３４ｋｄのポリペプチドが容易に検出された。また、このタンパク質がＨｅＬａ細胞中では非常に少なく、２９３細胞中では検出されないことが示された。Ｕ１１８ＭＧ及びＨｅＬａ細胞中で同定された、抗ＣＹＬ１抗体に交差反応する物質の分子量は、Ｅ、ｃｏｌｉ中で発現されたヒトＣＹＣＤＩタンパク質の分子量と同じであった。以上の結果より、調査した細胞では、サイクリンＤ１が差異的に発現し、神経由来の細胞で最も高いレベルであることが示された。

また、ここでは（例６）　、ｃＤＮＡプローブを用いてヒトゲノムライブラリーをスクリーニングし、ヒトＤ−型サイクリンのゲノムクローン、詳細には、Ｄｌ、Ｄ２、Ｄ３、を単離し、性質を調べたことを説明する。サイクリンＤ１、Ｄ２、Ｄ３プロモーターの核酸配列を、図１１−１３に示す。詳細には、サイクリンＤ１ｃＤＮＡクローン全体をプローブとして用いて、正常ヒト肝ゲノムライブラリーをスクリーニングし、その結果、３個のポジティブクローンを得た。これらのクローンのうちの１つ（Ｇ６）は、１１５０ｂｐの上流プロモーター配列と、１９８ｂｐのエクソンと、それに続いてイントロンを含むＤＮＡ挿入断片を含んでいた。同様の方法を用いて、ヒトサイクリンＤ２に対応するラムダゲノムクローンと、ヒトサイクリンＤ３に対応するラムダゲノムクローンを単離し、性質を調べた。あるクローン（ｙＤ２−Ｇ４）は、２．７ｋｂの５ａｃｌ　Ｓｍａｌ断片を含むことが示された（図８Ｂ）。この断片は、Ｄ２ｃＤＮＡ中（図３）で同定された推定の開始メチオニンコドンの５゛側の５１１を１６２０ｂｐと、１９５ｂｐのエクソンと、それに続＜９０７ｂｐの介在配列を含む。あるクローン（Ｃ９）は、ＤａｃＤＮＡ中（図４）で同定された推定の開始メチオニンコドンの５°側の配列を１．８ｋｂと、１９８ｂｐのエクソン１．６８４ｂｐのエクソン２と、８７０ｂｐのイントロンを含むことが示された（図８Ｃ）。

このように、ここで説明した研究の結果、サイクリンＤ１あるいは、Ｄ−型サイクリンと称される新しいクラスの哺乳類サイクリンが同定され、遺伝子産物（タンパク質）の構造に基づいて、以前から知られているサイクリンとは異なることが示された。この新しいクラスの、３つのメンバー、サイクリンＤ１あるいはＣＣＮＤＩ、サイクリンＤ２あるいはＣＣＤＮ２、サイクリンＤ３あるいはＣＣＤＮ３、と称される、を単離し、配列決定を行なった。これらは、酵母で細胞周期の開始に必須なプロティンキナーゼ（ＣＤＣ２８）を活性化する際に、別のサイクリン（ＣＬＮ型）の役割を果たすことが示された。また、サイタリンＤ１遺伝子は、様々な細胞型で差異的に発現されており、神経由来の細胞で最も高く発現されいることが示された。

本発盟Ω望月法ここに説明されている方法と材料を用いて、その他のサイクリン（細胞周期の開始に必須な遺伝子を代替するＤＮＡあるいはＲＮＡ）をコードする遺伝子（ＤＮＡあるいはＲＮＡ）を同定することが可能である。この方法は、ヒトあるいはヒト以外由来の、サイクリン遺伝子ス、あるいは、その他の（非り一部）サイクリンに属するその他のメン／神を同定するために、使用することができる。これは、例えば、例１に説明されているように、ＣＬＮを条件的に発現するような出芽酵母の菌株を用いて、その他のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって行うことができる。あるいは、ある遺伝子がサイクリンの発現を代替する能力を持つかを評価できるような、その他の変異株を用いて、サイクリンの相同物を同定することができる。この方法は、ここで説明するように、特に例１と図１に示すようにして、行うことができる。適切な酵母ベクター（例えばｐＡＤＮＳ）に組み込まれたｃＤＮＡライブラリーを、ここに記載されているような（例１及び実験方法）酵母の変異株に導入する。使用される株は、改変されたＣＬＮ遺伝子を含む。ここに記載した特定の菌株の場合は、ＣＬＮＩ及びＣＬＮ２遺伝子が挿入変異によって不活性化されており、また、ＣＬＮ３遺伝子の改変によって、これがガラクトース誘導性・グルコース抑制性のプロモーターから条件的に発現するようになっている。実施例では、このプロモーターは、ガラクトース誘導性・グルコース抑制性のプロモーターであるが、その他のプロモーターを用いることもできる。

発現ベクター内のｃＤＮＡライブラリーで形質転換した酵母の変異株を、グルコース含有培地上での増殖能力により、て、スクリーニングした。ガラクトースを含有する培地上では、ＣＬＮ３遺伝子が発現され、ＣＬＮＩ及びＣＬＮ２がな０にも関わらず、細胞の生存能力が維持される。グルコースを含有する培地上で（よ、全てのＣＬＮ機能が失われるため、酵母細胞は、細胞周期の６１期で停止する。

従って、酵母の形質転換株が、グルコース含有培地上で増殖できると（Ｘうこと（よ、その形質転換株中に、細胞周期の開始に必須な遺伝子の機能を代替できるＤＮＡが存在することを示している。必ずしも必要ではないが、これは、選択マーカー（ｐＡＤＮＳ中には、ＬＥＵ２マーカーが存在する）を有する発現ベクター、例えばｐＡＤＮＳ、を用いることで確認することができる。プラスミドの安定性を確認することにより、グルコース含有培地上での増殖能力が、復帰突然変異の結果であるか、あるいは、ＤＮＡ機能の存在（細胞周期の開始に必須であり、発現していない、あるいは、機能していない酵母遺伝子を代替するＤＮＡの導入）の結果であるかどうかが示される。この方法を用いて、形質転換株をグルコース上で増殖させた時のＣＬＮ３機能の代替能力によって、全ての型のサイクＩＪン（Ｄ型、非り型）を同定することができる。

その他のサイクリン遺伝子を同定するために、ここに開示されてＬ）るヒトＤ− 型サイクリンＤＮＡの全体あるいは一部をプローブとして用しＸで、その他のｃＤＮＡあるいはゲノムライブラリーをスクリーニングすること力（できる。例え（ｆｌそれぞれ図２−４の、Ｄｌ、Ｄ２、Ｄ３ｃＤＮＡ配列の全体あるＬ）ｉよ一部、あるいは、ここに記載されている対応するゲノム配列の全体あるシ）（マ一部を、プローブとして用いることができる。１１イブ１ルソド形成条件は、望まし０よう１こ変更可能であり、その結果、同定される配列の、プローブ配列に対する相補性（よ、高くなったり、低くなったりする（すなわち、もし、より厳しｐｚ、ある（為（よ、より緩い条件を用いると）。さらに、ＣＹＬｌや、Ｄｌ、Ｄ３あるり、Ｘはその他のヒトＤ−型すイクｌルに対して作成された抗体を用いて、サイクリンをコードすると考えられるＤＮＡを含むベクターで形質転換された適切な宿主細胞内で生産されたその他の組換えＤ−型サイクリンを、検出することができる。

ここに記載されている研究に基づいて、組織由来の細胞、あるいは、血液、尿、糞便、粘液、唾液などの生物検体中の、Ｄ−型サイクリンの発現の変化、あるいは、細胞分裂速度の上昇を検出するこ１とができる。これは、診断、及び、予後診断の目的で使用できる可能性がある。なぜならば、例えば、サイクリン遺伝子発現の変化と、細胞のトランスフォーメーション、あるいは、細胞の異常な増殖との間には、何らかの関連があると考えられるからである。例えば、以前のいくつかの報告では、変化したヒトサイクリンＡが、発ガン性に機能することが示唆されている。ヒトサイクリンＡ遺伝子は、肝細胞癌において、Ｂ型肝炎つィルス組み込みの標的であることが発見されている（Ｗａｎｄ、　Ｊ、ら、　Ｎａｔｕｒｅ　３４３：５５５−５５７（１９９０））。また、サイクリンＡは、ウィルスに感染した細胞中で、アデノウィルスＥＩＡと結合することが示されている（Ｇｉｏｒｄａｎｏ、　Ａ、ら、　Ｃｅ１ｌ　５８：９８１−９９０（１９８９）；　Ｐｉｎｅｓ、　Ｊ、とＴ、　Ｈｕｎｔｅｒ、　Ｎａｔｕｒｅ　３４６：７６０−７３６（１９９０））、さらに、サイクリン遺伝子伝子と同じ配列を有するＰＲＡＤ１遺伝子は、染色体１１ｑ１３の異常とともに、様々な腫瘍（たとえば、上皮小体新生物、ヒト乳癌、扁平上皮癌）の形成において、重要な役割を果たしている可能性がある。特に、ＣＣＤＮＩ　（ＰＲＡＤＩ）が、ＢＣＬ１癌遺伝子の候補として同定されたことは、サイクリン遺伝子の発癌能力を示す最も直接的な証拠を提供する。また、これは、Ｄ−型サイクリンのその他のメンバーが、発癌に関与している可能性を示唆する。これに関して、ＣＣＤＮ２及びＣＣＤＮ３の染色体上の座位が、それぞれ、１２ｐ１３と、６ｐ２１であることを決定した。領域１２ｐ１３は、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄単球性白血病、急性骨髄性白血病などの疾患の、特定の免疫表現型に関係する、複数の転移部位を含む。特に、染色体１２　［１（１２ｐ）］短腕の同腕染色体は、ヒトの固形腫瘍で一貫して見られる数少ない染色体異常であり、成人精巣生殖細胞腫瘍の９０％で観察される。一方、領域６ｐ２１は、ＨＬＡ　（ヒト白血球会合）複合体の遺伝子座であり、ヒトのゲノム中で最もよく性質が調べられている領域の一つである。これまでに、多くの疾患がＫＬＡ複合体に関連づけられてきたが、これらの疾患のうちで、病因が完全にわかっているものは、はとんどない。サイクリンＤ２及びＤ３の分子クローニングと染色体上の座位決定を行うことで、このような転移に、これらが直接関与しているかどうか、そして、もし関与している場合には、これらが活性化されているかを、決定することができる。

これらの関与が証明された場合には、ここに説明されている診断及び治療方法を用いて、個人の病態や、そのような転移に関連して、あるいは、その結果として、何らかの状態が発生する可能性を評価することができ、また、治療効果の監視（細胞増殖に対する薬剤あるいは薬剤類の効果を評価することにより）や、治療を提供することができる。

本発明は、サイクリンＤ１、Ｄ２、Ｄ３、あるいは、その他のＤ−型サイクリンなどの、サイクリン遺伝子の発現変化を検出するための、診断方法を含む。この方法を用いて、細胞内、あるいは、生物検体中の発現変化を検出することができる。ここに示すように、サイクリンＤ遺伝子の間では、配列の相同性が高い。

このことは、細胞周期を調節する際に、Ｄ−型サイクリンの他のメンバーも、同様の機構を使用している可能性を示唆する（例えば、同じ触媒サブユニットに結合する、同じ基質に作用する）。マウス及びヒト細胞の双方で、細胞特異的な差異的な発現が見られることより、異なる細胞系統あるいは異なる組織では、非常に類似の機能を行うために異なるＤ−型サイクリンが使用されており、転移あるいはその他の変異の結果としてサイクリンＤ遺伝子の組織特異的発現が変化することが、異常な細胞増殖に寄与している、と示唆することは合理的であると考えられる。ここで説明するように、サイクリンＤは、分析した組織で差異的に発現している。詳細には、神経由来の細胞（例えば、神経膠芽細胞腫細胞）で、最も高いレベルで発現されていることが示された。

ここで説明する研究の結果、Ｄ−型サイクリンの発現を検出、及び／あるいは、定量することができ、その結果を、細胞増殖が正常か、異常か（例えば、異常に速い速度の）、の指標として利用することができる。差異的な発現（様々な細胞型内、あるいは、Ｄサイクリンの１つあるいは複数の型の発現）を調べることも可能である。

本発明の診断方法では、個人から入手した細胞を加工して、その中の核酸配列が、相補的な核酸配列とハイブリッドを形成できるようにする。Ｄｌ、Ｄ２、及び／あるいは、Ｄ３サイタリン（あるいはその他のＤ−型サイクリン遺伝子）の配列の、全体あるいは一部分を、プローブとして使用することができる。そのようなプローブは、Ｄ〜型サイクリンの一部分でもよい。そのような部分は、検体中の相補的な配列とハイブリッドを形成するために充分な長さであり、使用条件でハイブリッド形成を維持し、一般的Ｊこ、少なくとも６ヌクレオチド長でなければならない。ハイブリッド形成は、既知の技術を用いて検出される（例えば、放射性標識、あるいは、蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブを用いた場合は、標識されたハイブリッド複合体を測定する）。ハイブリッド形成が起こった程度を定量する。Ｄ−型サイクリン遺伝子レベルの上昇は、細胞分裂の可能性が上昇したことの指標である。

あるいは、既知の技術とＤ−型サイクリンに特異的な抗体を利用することにより、細胞内、特定の細胞型内、あるいは、体液中に、Ｄ−型サイクリン（あるいは複数のサイクリン）がどの程度存在するかを決定することができる。第３の診断方法では、Ｄ−型サイクリンが通常あるいは典型的に結合するプロティンキナーゼと、Ｄ−型サイクリンの複合体形成を、外来の基質、たとえばヒストンＨ１を基質として用いて、評価することができる。Ａｒ１ｏｎ、　Ｄ、ら、　Ｃｅ１ｌ、　５５：３７１−３７８（１９８８）。どの診断方法においても、分析した細胞や体液から得られた結果と、適切な対照（例えば、正常なり一部サイクリンレベル及び／あるいは活性を有することが知られている同じ型の細胞。あるいは、正常なり一部サイクリンレベル及び／あるいは活性を有することが知られている個人から入手した同じ体液。）から得られた結果との比較を行う。Ｄ−型サイクリンレベル、及び／あるいは、活性の上昇は、異常な細胞増殖あるいは発癌の可能性が高いこと、あるいは、異常な増殖あるいは発癌か実際に起こっていること、の指標である。また、−組のプローブ（例えば、−組の核酸プローブ、あるいは、−組の抗体）を用いることで、細胞あるいは組織中で、一種以上のサイクリン（例えば、Ａ、Ｂ、及び／あるいは、Ｄ）を検出することが可能である。この −組のプローブの構成成分は、それぞれ特定のサイクリンを認識して結合し、分析した細胞あるいは組織内における２種あるいはそれ以上のサイクリンに関する情報を、ひとまとめにして提供する。

そのようなプローブもまた、本発明の主題である。一般には、それらは、検出可能なように標識されている（例えば、放射性標識、蛍光物質、ビオチンあるいは結合対のその他の成分、あるいは、酵素によって）。

細胞分裂の阻害、詳細には、さもなければ異常に速い速度で起こるような細胞分裂の阻害、も可能である。例えば、細胞内に、プロティンキナーゼ−Ｄ−型サイクリン複合体の形成を直接あるいは間接的に阻害して、プロティンキナーゼの活性化を阻害することができる薬剤あるいはその他の物質を導入することによって、細胞増殖の上昇を抑制、あるいは、防止することができる。ある実施態様では、例えば、Ｄ−型サイクリンＤＮＡ及び／あるいはＲＮＡの、転写及び／あるいは翻訳を防止することによって、間接的に複合体形成を阻害することができる。

これは、細胞内にアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入することによって行うことができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞内で、サイクリンをコードする核酸配列とハイブリッドを形成し、それらがそれ以上加工されることを防止する。また、必須なり一型転写因子を妨害することによって、サイクリンの発現を阻害することも可能である。細胞周期と細胞増殖の調節において、サイクリン遺伝子の転写が重要な役割を果たしており、また、サイクリンｍＲＮＡレベルの変動が細胞分裂の調節において重大である、と考えるのには理由がある。Ｇ１期とは、外因及び内因に反応して、細胞が新しく細胞分裂を行うように方向付けられる時期である。従って、Ｇ１サイクリンの発現を調節する転写因子は、細胞増殖の調節において必ず重要である。転写因子を調節することは、Ｄ−型サイクリンの活性に影響を与えることができる、１つの方法である。その結果、転写因子の機能を阻害あるいは防止すると、Ｄ−型サイクリンの活性が減少する。あるいは、例えば、プロテアーゼ、あるいは、サイクリンの分解を促進する物質を細胞内へ導入することによって、Ｄ−型サイクリンを分解して、複合体形成を間接的に防止することができる。どちらの場合も、この方法を行わない場合よりも、有効なり一部サイクリン量が減少し、効果は間接的である。

別の実施態様では、プロティンキナーゼあるいはＤ−型サイクリンに結合する、あるいは、サイクリンが活性化するプロティンキナーゼとサイクリンとの間の物理的結合に干渉する（例えば、挿入によって）、あるいは、プロティンキナーゼの触媒活性を破壊するような、薬剤あるいはその他の物質を、細胞内に導入することによって、プロティンキナーゼ−Ｄ−型サイクリン複合体の形成を、より直接的な方法で防止することができる。これは、この酵素あるいはサイクリンに結合する抗体を用いて行うことができる。あるいは、内因性のＤ−型サイクリンのようにプロティンキナーゼに結合するが、それが結合してもこの酵素が活性化されない、あるいは、この酵素の不活塊化あるいは分解がおこるような、ペプチドあるいは低分子量の有機化合物を用いて行うことができる。このような目的で使用されるペプチドあるいは小さな有機化合物は、Ｄ−型サイクリンのアミノ酸分析に基づいて、結合に必要な残基を含み、存在すると活性化に結びつ（ような残基を除くように、デザインされる。これは、例えば、結合部位を系統的にマツピングして、活性化に必要な部位を認識あるいは結合するが、活性化を起こさないような分子をデザインすることによって行うことができる。ここで説明するように、組織内では、Ｄ−型サイクリンが差異的に発現されている。従って、特定の型の（あるいは複数の型の）Ｄサイクリンの活性、及び／あるいは、発現レベルを干渉（阻害）するようにデザインされた薬剤（例えば、抗体、あるいは、アンチセンスあるいはその他の核酸分子）を用いることによって、細胞の細胞分裂活性を選択的に減少させることが可能である。例えば、中枢神経系、あるいは、その他の非造血組織の腫瘍を治療する際には、サイクリンＤ１を特異的に阻害する薬剤が特に有効ではないかと期待されている。なぜならば、ＤＩは、差異的に発現することが示されているからである（神経由来の細胞で、特に高レベルで発現されている）。

また、既知の方法を用いて、本発明のＤ−型サイクリンに特異的に反応する抗体を作成することができる。例えば、抗血清を入手したいＤ−型サイクリンを、適切な宿主（例えば、ウサギ、マウス、ラット、ブタ）に注射して、抗体が形成されるために充分な時間がたった後、宿主生物から血液を回収することによって、抗り一部すイタリン抗血清を作成することができる。既知の方法を使って、モノクローナル抗体を作成することもできる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、ら、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：Ｊ↓ユ四鮭四り勤ｎｕａ　１．　コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク州　（１９８９）。

本発明は、また、化合物あるいは分子を、サイクリン、特にＤ−型サイクリンの機能を阻害あるいは抑制する能力に関してスクリーニングする方法を含む。例えば、ここに記載されているような、ＤｌあるいはＤ３のようなり一部サイクリンを発現する変異細胞を用いることができる。Ｄ−型サイクリンを阻害する能力を評価する化合物あるいは分子を、その化合物あるいは分子が細胞内に入るために適した条件で、細胞と接触させる。、サイクリンが阻害されると、その結果、細胞が停止する、あるいは、細胞分裂速度が減少する。評価する化合物あるいは分子の存在下での細胞分裂速度あるいは程度を、適切な対照（例えば、試験する薬剤を添加していない同じ型の細胞）の細胞分裂と比較することによって、その化合物あるいは分子が、サイクリンを阻害できるか、阻害できないか、が示される。

既存の化合物あるいは分子、あるいは、サイクリンによるプロティンキナーゼの活性化を阻害するように開発された化合物あるいは分子の有効性を、この方法を用いてスクリーニングすることができる。Ｄ−型サイクリンを阻害する薬剤もまた、本発明の主題である。

本発明を、以下の例を用いて説明するが、以下の説明は、何ら限定的なものではない。

何例３のあとに、例１−３の実験方法を示す。

Ｉ　ＣＬＮ　レスキュー　るヒトｃＤＮＡ　ローンの口Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ内には、３種類のＣ１ｎタンパク質が存在する。

ＣＬＮ遺伝子のうちのどれか一つを破壊しても、増殖には、はとんど影響しない。

しかし、３つのＣＬＮ遺伝子全部を破壊すると、細胞はＧ１期で停止する（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ、　［Ｌ　Ｅ、ら、　Ｃｅ１ｌ　５９：１１２７−１１３３（１９８９））　、以下に示すように、酵母の菌株を作成した。この菌株は、ＣＬＮＩ及びＣＬＮ２遺伝子内に挿入変異を含み、これら力坏活性化されている。残りのＣＬＮ３遺伝子をさらに改変し、ガラクトース誘導性・グルコース抑制性のプロモーターＧＡＬＬから条件的に発現するようにした（図１参照）。この菌株を３０５−１５ｄ　＃２１と命名する。ガラクトースを含有する培地中ではＣＬＮ３遺伝子が発現され、ＣＬＮＩ及びＣＬＮ２遺伝子力次損しているにも関わらず、細胞の生存能力が保持される（図１）。グルコース含有培地中では、全てのＣＬＮの機能が失われ、細胞は細胞周期のＧ１期で停止する。

酵母の発現ベクターｐＡＤＮＳ　（Ｃｏ、１ｉｃｅｌｌｉ、　Ｊ、ら、　Ｐｒｏ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ糾３５９９−３６０３（１９８９））中に組み込まれたヒト神経膠芽細胞腫ｃＤＮＡライブラリーを、この酵母に導入した。このベクターｐＡＤＮＳは、ＬＥＵ２マーカーと、２μ複製開始点と、酵母アルコール脱水素酵素遺伝子由来のプロモーター及びターミネータ−配列を有する（図１）。およそ３Ｘ１０’個の形質転換株に関して、グルコース含有培地上での増殖能力について、スクリーニングを行なった。１２［コ間インキニーベートした後、１２個のコロニーが得られた。これらの大部分は、復帰突然変異株であることが判明した。しかし、プラスミド安定性試験で評価したところ、２個については、グルコース上での増殖活性と、ＬＥＵ２マーカーの保持とが相関した。これらの２個の酵母形質転換株は、ｐｃＹｃＤｌ−２１、及び、ｐｃＹｃＤｌ−１９と称されるプラスミドを含んでいた（下記参照）。双方をＥ、ｃｏｌｉ内に回収した。酵母に再び導入すると、このプラスミドはＣＬＮ欠損株をレスキューした。しかし、レスキューの効率が悪く、レスキューされた菌株の増殖も比較的悪かった。

制限地図と、部分的なりＮＡ配列分析より、ｐｃＹｃＤｌ−１９とｐｃＹｃｌ− ２１は、同じ遺伝子を示す、別個のクローンであることが示された。ｐＣＹＣＤＩ−２１の１．２ｋｂの挿入断片をプローブとして用いて、完全長のｃＤＮＡクローンのために、ヒトＨｅＬａｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。

およそ２００万個のｃＤＮＡクローンをスクリーニングし、ポジティブを９個得た。これらのうちの最長のクローンであるｐｃＹｃＤｌ−ＨＩ３　（１３２５ｂｐ）を、完全に配列決定した。この配列は、コード領域内で非常に高いＧＣ含量（６１％）を示し、ポリＡテイル（６９個のＡ残基）を含んでいた。この遺伝子の推定されるタンパク質産物の分子量は、ヌクレオチド１４５に位置する読み枠に一致する最初のＡＵＧコドンから始めて、３３，６７０ダルトンである（図２）。

推定されるタンパク質は、その他のサイクリンに関連しており（下記参照）、ｐ１４．９という非常に低い値を有する（ヒトサイクリンＡの６．４、ヒトサイクリンＢの７７、ＣＬＮＩの５６と比較して）。これは、Ｃ末端に酸性残基が高密度に存在することに大きく起因する。

ヌクレオチド１４５の推定開始メチオニンよりも５°側には、メチオニンコドンも、停止コドンも存在しない。この、ことと、その他のサイクリンと比較して、ＣＹＣＤＩにはＮ末端が欠損しているように見えることから（詳細には下記参照）、さらに４種類のヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、λＣＹＣＤＩ−８１２クローンが、ｃＤＮＡの完全な５゛部分を欠いているかどうかを調べた。

このスクリーニングで単離された１００個以上のｃＤＮＡクローンのうち、λＣＹＣＤＩ−Ｈ１２よりも長い５′領域を有するクローンは見つからなかった。後に、ウェスタンプロット分析によって、クローンＨ１２が完全長をコードする能力を有することを確認した（下記参照）。

ヒトサイクリンＡの４９ｋｄ、ヒトサイクリンＢの５０ｋｄ、Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＣＬＮＩの４９ｋｄと比較して、ＣＹＣＤＩは、これまでに同定されたサイクリンタンパク質の中で、最小（３４ｋ　ｄ）のものをコードする。Ａ及びＢ型サイクリンと比較したところ、この違いは、Ａ及びＢ型サイクリンで同定されている、いわゆる”デストラクションボックス”を含む、はとんど全てのＮ−末端部分を欠（ためであった（Ｇｌｏｔｚｅｒ、　ｌ！、ら、　Ｎａｔｕｒｅ　３４’ｌＪ：１３２−１３８（１９９１））。

ＤＩの配列　とその　のサイ　リンとの比配列分析により、ＣＹＣＤＩ−ＨＩ３にコードされているタンパク質と、その他のサイクリンとの相同性が明らかとなった。しかし、ＣＹＣＤｌが、既存の３つのクラスのサイクリン、Ａ、Ｂ及びＣＬＮ、とは異なることは明らかである。

この新しいサイクリンが、その他のサイクリンと、進化上、どのように関連するかを調べるために、全てのサイクリン遺伝子について、アミノ酸配列の比較を広範囲に行なった。まず、以前に公表されている１５個のサイクリンの配列と、ＣＹＣＤ　１の配列を、ＸｉｏｎｇとＥｉｃｋｂｕｓｈ　（Ｘｉｏｎｇ、Ｙ、とＴ、Ｈ，Ｅｉｃｋｂｕｓｈ、ＥＭＢＯＪ、　釦３３５３−３３６２（１９９０））によって詳説されている方法を用いて並べた。挿入／欠失の導入を最小にして、配列間の相同性が最大となるように、また、可能な限り多くの配列を含むように努力した。ＣＬＮサイクリンを除いては、この整列には約２００個のアミノ酸残基が含まれており、これは、ＣＹＣＤＩの全コード領域の７０５以上を占める（図５Ａ）。Ａ及びＢ型サイクリンのメンバーの、並べた領域のＮ−末端側には、保存領域と、いくつかの分散した類似点が見られた（Ｇｌｏｔｚｅｒ。

稙ら、顕庚民別冴：１３２−１３８（１９９１））　、　ｌ、かし、これは、ＣＬＮサイタリン、あるいは、ＣＹＣＤＩ及びＣＹＬｌには存在しないため、整列中には含まれていない。

整列した１７個の配列を全て対にして比較を行い、パーセント・ダイバージェンスを計算した。それを用いて、ネイーバー・ジョイユング法（Ｓａｉｔｏｕ、　Ｎ、と菖。

Ｎｅｉ、　！！ｏ１．　Ｂｉｏｌ、　Ｅｖｏｌ、　４：４０６−４２５（１９８７）、及び、実験方法）により、サイクリン遺伝子ファミリーの進化樹を作成した。ＣＬＮサイクリンと、その他の３種のサイクリンとの類似性が最も低かったため、ＣＬＮサイクリンとその他のサイクリンとの結合点を、進化樹（図５Ｅ）の根とした。この進化樹から、ＣＹＣＤＩ、ＣＹＣＤ２、及び、ＣＹＣＤ３が、サイクリンＤと称される新しいクラスのサイクリンであることが明らかとなった。

ガλ−亘ト縄狗　でのサイ　リンＤ１のヒト細胞内でのサイクリンＤ１の発現を、ノーザン分析を用いて調べた。最初の調査から、い（つかの細胞株では、サイクリンＤ１の発現レベルが非常に低いことが示されていた。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡをＨｅＬａ細胞から調製し、ＣＹＣＤＩ遺伝子の全コード領域を用いて調べた。

４．８ｋｂ及び１．７ｋｂの、２つの主要転写物が検出された。高分子量の方がより豊富に存在した。５゛あるいは３′末端が欠損していた数個のｃＤＮＡクローンを除いては、様々な異なるｃＤＮＡライブラリーから単離されたほとんどのｃＤＮＡクローンは、クローンλＣＹＣＤＩ−８１２に非常に類似していた（図２）。従って、ノーザン分析で検出された１、７ｋｂの転写物は、図２のヌクレオチド配列に対応すると考えられる。

４．８ｋｂの大きい転写物の起源を明らかにする目的で、λＣＹＣＤＩ−Ｈ１２クローンの５′及び３゛末端のサブフラグメントを用いて、ｃＤＮＡ及びゲノムライブラリーのスクリーニングを行なった。そして、択一的な転写開始、ポリアデニル化、及び／あるいは、ｍＲＮＡスプライシングが行われているかを調べた。より長いｃＤＮＡクローンを２個、）ＩｅＬａ細胞由来のλＣＹＣＤＩ−ＨＯ３４（１，７ｋｂ）とヒト奇形種細胞由来のλＤＹＤＣＩ−ＴＯ７８（４，１ｋｂ）と、さらに、い（つかのゲノムクローンを単離し、部分的に配列決定を行なった。λＣＹＣＤＩ−Ｈ０３４と、λＤＹＤＣＩ−ＴＯ７８の双方は、５゛末端から、λＣＹＣＤ１−Ｈ１２と同じ配列を有する（図６）。どちらも、ポリアデニル化部位の後ろ側の３′側に、追加の配列を有する点が、λＣＹＣＤＩ−Ｈ１２と異なっている。これらの３′配列は、λＣＹＣＤｌ−ＨＯ３４と、λＤＹＤＣ１−ＴＯ７８とで同一であるが、後者のクローンではさらに伸張している（図６）。λＤＹＤＣＩ−ＴＯ７８クローンには、１塩基欠失（Ａ残基）がある。これは串型性の結果と考えられるが、その他の機構が関与している可能性を除去することはできない。クローンＴ０７８由来の、３°末端の余分な配列をプローブとして用いることにより、同じ４．８ｋｂの転写物が検出されたが、１．　７ｋｂの転写物は検出されなかった。

ノーザン分析で検出された２つのｍＲＮＡは、ポリアデニル化の差異によって生じると考えられる（図６）。ポリアデニル化は明らかにおこっているのにも関わらず、奇妙なことに、認識可能なポリアデニル化配列（ＡＡＵＡＡＡ）は、クローンλＣＹＣＤ１−８１２の配列中のどこにも存在しない（図２）。ＡＡＵＡＡＡに非常に類似した変異型も存在しない（ミスマツチ２個以下のものはない）。

３　々な　胞　にお（るサイ　リンＤ１の　・なＣＹＣＤＩの完全長クローンを得るために、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングしているときに、酵母の形質変異株を作成したヒト神経膠芽細胞腫細胞株（Ｕ１１８　ＭＧ）由来のｃＤＮＡライブラリーからは、その他の４つのｃＤＮＡライブラリーよりも、多くのポジティブが得られることが明らかとなった。ノーザン及びウェスタンブロッティングを行って、サイクリンＤ１が、異なる組織あるいは細胞株内で、差異的に発現されている可能性を調べた。全ＲＮＡを、Ｕ１１８ＭＧから単離し、ＣＹＣＤＩ遺伝子のコード領域をプローブとして用いて、ノーザンプロットによって分析した。神経膠芽細胞腫細胞では、Ｈｅ１ａ細胞と比較して、転写物のレベルが７から１０倍の高さであった。ＨｅＬａ及びＵ１１８ＭＧ細胞の双方で、高分子及び低分子の転写物が両方とも観察された。

０１１８ＭＧ細胞中の豊富なＣＹＣＤＩメツセンジャーが、タンパク質レベルに反映されているかどうかを調べるために、細胞抽出物を調製し、マウスｃＹＬ１に対して調製した抗ＣＹＬ１を用いて、ウェスタンブロッティングを行なった（Ｍａｔｓｕｓｈｉｍｅ、　Ｈらより提供）。こ、の抗ＣＹＬ１抗体は、ウェスタンブロツティング−ヒで、ナノグラム量の組換えＣＹＣＤＩを検出することができた（データ未公開）。また、この抗体は、免疫沈降とウェスタン分析によって、もとの酵母形質転換株中のＣＹＣＤＩを検出することもできた。ＨｅＬａ、２９３、Ｕｌ１８　ＭＧ由来の全細胞抽出物を用いた最初の実験では、シグナルを得ることができなかった。しかし、５ＤＳ−ＰＡＧＥとイムノブロッティングを行う前に、細胞抽出物を前記の血清で免疫沈降したところ、Ｕ１１８ＭＧ細胞中には、３４ｋｄのポリペプチドが容易に検出された。このタンパク質は、ＨｅＬａ細胞中では豊富というには程遠く、２９３細胞中には検出できなかった。Ｕ１１８ＭＧ及びＨｅＬａ由来の、抗ＣＹＣＬＩ交差反応性物質の分子量は、Ｅ、ｃｏｌｉ中で発現されたヒトＣＹＣＤ１タンパク質の分子量払全く同じであった。

これから、配列決定を行なったｃＤＮＡクローンが、読み取り枠全体を含むことが示された。

実験方法菌株の作成親株は、ＢＦ３０ＢＦ３０５−１５ｄ（］ｅｕ２−３　１ｅｕ２−１１２ｈｉｓ３−１１　ｈｉｓ３−１５　ｕｒａ３−５２　ｔｒｐｌ　ａｄｅｌ　ｍｅｔ１４　ａｒｇ５．６）である（Ｆｕｔｃｈｅｒ、　Ｂ、とＪ、　Ｃａｒｂｏｎ、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、β２２＋３−２２２２（１９８６））　、この菌株を、３段階で、条件的ｃｌｎ−株に変換した。まず、染色体ＣＬＮ３遺伝子を、ＧＡＬＬプロモーターの調節下においた。二方向性のＧＡＬｌｏ−ＧＡＬ１プロモーターを含む０．７５ｋｂのＥｃｏＲＩ−Ｂａｍ）１１断片を、ＢａｍＨＩ　（ＧＡＬＩ）末端が、ＣＬＮ３開始コドンの１１０ヌクレオチド上流に接続するように、ＣＬＮ３遺伝子の５゛末端に融合させた。次に、ＧＡＬＩＯプロモーターからＣＬＮ３の中程まで伸張するＥｃｏＲＩ断片を１部位の間にサブクローニングした（Ｎａｓｈ、　Ｒ，ら、　ＥＭＢＯＪ、　７：４３３５−４３４６（１９８８））。

Ｘｈｏｌ末端とＥｃｏＲＩ末端との連結反応は、末端をフレノウで埋めて、平滑末端連結反応によって行なった（Ｅ　ｃ、ｏ　Ｒ１部位を破壊して）。その結果、通常、ＣＬＮ３の上流−１１０から−４１１に見られるＤＮＡが、ＧＡＬＩプロモーターで置きかわった。次に、この新しいｐＢＦ３０誘導体型から、ＥｃｏＲＩからＳｐｈ　ｒまでの断片を切除した。この断片は、５゛及び３′が、ＣＬＮ３領域と非常に相同であるが、ＣＬＮ３のすぐ上流にＧＡＬ１プロモーターとＵＲＡ３７−カーを有している。ＢＦ３０５−１５ｄ株をこの断片で形質転換し、Ｕｒａ＋の形質転換株を選択した。これをサザン分析で確認した。さらに、ＧＡＬＩプロモーターが誘導されたときと、誘導されていないときとで、細胞の大きさの平均値を測定した。細胞を１％ラフィノース及び１％ガラクトース中で培養して、ＧＡＬＩプロモーターを誘導すると、細胞体積の平均値は約２５μｍ３（比較として、親株の細胞体積の平均値は約４０μｍ３である）であり、一方、プロモーターを誘導しないと（ラフィノースのみ）、あるいは、グルコース存在下で抑制すると、細胞体積は、野生株よりもずっと太き（なる。これらの実験から、ＣＬＮ３がＧＡＬＩプロモーターの調節下にあることが示された。この細胞では、このＧＡＬｌに調節されたグルコース抑制性の遺伝子が、ＣＬＮ３の唯一の供給源である、ということに留意することが重要である。

第２に、ＣＬＮＩ遺伝子を破壊した。１．　ＦｉｔｃｈよりＣＬＮＩ断片を入手し、これを用いて、ハイブリッド形成により、ＣＬＮＩの完全長のクローンを入手し、それをｐＵＣプラスミドにサブクローニングした。ＨＩＳ３遺伝子を含むＢａｍＨ１断片を、ＣＬＮＩ読み枠中のＮｃｏ１部位に挿入した。次に、５′及び３゜が、ＣＬＮＩ領域と高い相同性を有するような巨大なＥｃｏＲＩ断片を切除し、これを用いて、上述したＢＦ３０５−１５ｄ　ＧＡＬ−ＣＬＮ３株を形質転換した。ＹＮＢ−ｈｉｓラフィノース・ガラクトース平板上で、形質転換をおこなった。Ｈｉｓ＋のクローンを選択し、サザン分析で確認した。

最後に、ＣＬＮ２遺伝子を破壊した。１．　ＦｉｔｃｈよりＣＬＮ２断片を入手し、これを用いて、ハイブリッド形成により、ＣＬＮ２の完全長のクローンを入手し、それをｐＵＣプラスミドにサブクローニングした。ＴＲＰｌ遺伝子を含むＥｃ。

Ｒ１断片を、ＣＬＮ２読み枠中の５ｐｅ１部位に挿入した。ＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ断片を切除し、これを用いて、上述のＢＦ３０５−１５ｄ　ＧＡＬ−ＣＬＮＨＩＳ３：　：ｃｌｎｌ株を形質転換した。ＹＮＢ−ｔｒｐラフィノース・ガラクトース平板上で、形質転換をおこなった。Ｔｒｐ＋のクローンを選択した。この場合は、ＴＲＰ１断片がＡＲ３＜自律複製配列）を含むために、形質転換株の多（は、破壊されたＣＬＮ２遺伝子ではなく、自律的に複製するプラスミドを含んでいた。しかし、形質転換株のうちの数パーセントは、単純なＴＲＰＩ：：ｃｌｎ２破壊株であることが、表現型分析とサザン分析によって示された。

クローン＃２１と称される、ある特定の３０５−１５ｄ　ＧＡＬＬ−ＣＬＮ３ＨＩＳ３：：ｃｌｎｌ　ＴＲＰＩ：：ｃｌｎ２形質転換株について、詳細に分析した。この株を１％ラフィノース及び１％ガラクトース中で生育させると、この株は、ＣＬＮ野生型の親株と区別できない倍加時間を有していた。しかし、この株は、ＣＬＮ３過剰発過剰発現−て推定されたとおりに、やや、わい小な表現型を示した（細胞体積が小さい）。グルコースを添加すると、あるいは、ガラクトースを除去すると、細胞はＧ１期に蓄積し、細胞分裂が停止した。しかし、細胞の質量及び体積は増加し続けた。Ｇ１期に停止した状態で、−晩、インキュベートした後、出芽した細胞は実質的に観察されなかった。そして、大部分の細胞は、調節されずに大きくなったために、溶菌していた。

３０５−ｄ１５　Ｒ２１をグルコース平板上に塗布すると、１０−７の頻度で復帰突然変異株が発生した。これらのグルコース耐性・ガラクトース非依存性変異株の性質については、調査を行わなかった。

スフェロプラストの≦ Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅスフエｏプラストの形質転換を、ＢｕｒｇｅｒｓとＰｅｒｃｉｖａｌと＾１ｌｓｈｉｒｅに従って行なった（Ｂｕｒｇｅｒｓ、　Ｐ、Ｍ、Ｊ、とに、Ｊ、　Ｐｅｒｃｉｖａｌ、　Ａｎａｌ、　Ｂｉ。

ｃｈｅｍ、　１６３：３９１−３９７（１９８７）；＾１ｌｓｈｉｒｅ、　Ｒ，Ｃ，、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ`　８７：４０４３−４０４７（１９９０））。

担胆培養ＨｅＬａ及び２９３細胞を、３７℃で、１０％ウシ胎児血清で補足したダルベツコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、プレート上あるいは浮遊状態で培養した。神経膠芽細胞腫Ｕ１１８　ＭＧｍ胞を、プレート上で、１５％ウシ胎児血清と０．１ｍＭ非必須アミノ酸（ギブコ）で補足したＤＭＥＭ中で培養した。

楳敢但又す蚤方法はとんどの分子生物学的技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋらによる記載と実質的に同じである（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ、ら、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：＾Ｌａｂｏｒａｔｏ　Ｍａｎｕａｌ　Ｄ−ルドＱスプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク州　（１９８９））。

クローニングベクターとして、ファジミドベクターである、ｐｕｃ　１１８あるいはｐ　ＵＣ１１９（Ｖｉｅｉｒａ、　Ｊ、とＪ、　Ｍｅｓｓｉｎｇ、　恥功工随敲設シ１５３：３−１１（１９８７））　、あるいは、ｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔ　（ストラタジーン）を用いた。シークエネース・キット（ユナイテッド・スティソ・バイオケミカル）を用いたチェーン・ターミネータ−法（Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、ら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ臥亙：５４６３−５４６７（１９７７））　、あるいは、オートメーテツド・シーフェンシング・システム（３７３Ａ、アプライド・バイオシステムス）によって、ＤＮＡ配列を決定した。

λＺＡＰＩＩに入ったヒトＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡライブラリーを、ストラタジーンより購入した。λｇｔｌｏに入ったヒトＴ細胞ｃＤＮＡライブラ１）、−は、証。

Ｇｉｌｌｍａｎから寄贈された（コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ −）。ヒト神経膠芽細胞腫Ｕ１１８　ＭＧ、及び、λＺＡＰＩＩに入った神経膠芽細胞腫５Ｗ１０８８細胞ｃＤＮＡライブラリーは、Ｍ、　Ｗｉｇｌｅｒから寄贈された（コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−）。λｇｔ　１０に入ったヒト奇形腫細胞ｃＤＮＡライブラリーは、Ｓｋｏｗｒｏ口ｓｋｉより寄贈された（コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−）。ヒト正常肝ゲノムライブラリーλＧＥＭ−１１は、プロメガより購入した。

細胞培養より、全ＲＮＡを、Ｓａｍｂｒｏｏｋらによる記載の通りに（ＳａｌＩｌｂｒｏｏｋ、　Ｊ、ら。

閤ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ　］−ルド・スプリングＨハーバ−・ラボラトリ−、コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク州　（１９８９））、グアニジウム・チオシアネートと、引き続いてＣｓＣｌ中の遠心分離を用いて抽出した。ポリ（Ａ）＋クイック・ブツシュ・カラム（ストラタジーン）を用いて、全ＲＮＡよりポリ（Ａ）ＲＮＡ＋を巣離した。ＲＮＡサンプルを、１％アガロース−ホルムアルデヒド−ＭＯＰＳゲルで分離し、ニトロセルロースフィルター上に移した。ノーサンハイブリダイゼーションを（ライブラリーのスクリーニングも）、６８℃で、５×デンハル、ド溶液、２ｘＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、２５μＭＮａＰＯ４（ｐＨ７，０）、１０％デキストラン硫酸を含む溶液中で行なった。プローブを、ランダム・プライミング・ラベリング法により標識した（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ、　Ａ、とＢ、　Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ、Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１３２：６−１３（１９８３））。ｃ　Ｄ　Ｎ　ＡクローンｐｃＹｃＤ１−８１２由来の１．３ｋｂのＨｉｎｄｌｌｌ断片を、ノーサンハイブリダイゼーション及びゲノムクローニング用のコード領域プローブとして用いた。ｃＤＮＡクローンｐｃＹｃＤ１−Ｔ０７８由来の１．７ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、３′断片プローブとして使用した。

バクテリア内でヒトサイクリンＤ１遺伝子を発現するために、ｐＣＹＣＤｌ−８１２の、ＣＹＣＤｌの読み枠全体を含む１．３ｋｂのＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、Ｔ７発現ベクターにサブクローニングした（　ｐ　Ｅ　Ｔ　３　ｄ　５Ｓｔｕｄｉｅｒ、　Ｆ。

Ｗら、Ｖ功Δ５ｉｎＥｎα■角釘濁：６０−８９　（１９９０））。この発現構築物を収容するＥ、ｃｏｌｉ株ＢＬ２１　（ＤＥ３）を、５ｔｕｄｉｅｒに従って作成した（Ｓｔｕｄｉｅｒ、　Ｆ。

Ｗら、　ｉｇｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｌｏ　−１８５：６０−８９　（１９９０））　、　６Ｍ尿素（ＣＹＣＤＩにコードされているｐ３４は、８Ｍ尿素に部分的に可溶性であるにすぎない）を含む溶解緩衝液（５ｍＭＥＤＴＡ、１０％グリセロール、５０ｍＭＴ　ｒ　ｉ　ｓ　−ＨＣｌ、ｐＨ８，０，０００５％トリトンＸ−１００）中で、音波処理により、バクテリアの培養物を溶菌し、２０．０００ｇの力で１５分間遠心分離を行なった。沈澱物を、６Ｍ尿素を含む溶解緩衝液で１回洗浄し、再び沈澱させ、８Ｍ尿素を含む溶菌緩衝液で再懸濁して、遠心分離を行なった。３４ｋｄのタンパク質に富む上澄み液を、１０９６ポリアクリルアミドゲルにロードした。３４ｋｄのバンドをゲルより切り出し、０１％ＳＤＳ含有ＰＢＳ中で溶出した。

配列の整ダ１と°化　のタンパク質配列の整列は、ＸｉｏｎｇとＥｉｃｋｂｕｓｈ　（Ｘｉｏｎｇ、　Ｔ、とＴ、ｔｌ、　Ｅｉｃｋｂｕｓｈ、　ＥｉｌＢＯＪ、♀：３３５３−３３６２（１９９０））によって詳細に説明、かつ、論じられている方法に従って、実質上、目視で行なった。い（つかの配列中の数字は、挿入の結果、配列から省略したアミノ酸の数を示している。

い（つかの配列中の数字は、挿入の結果、配列から省略したアミノ酸の数を示している（例えば、ＣＬＮＩに関して１．、、ＴＷＧ２５ＲＬＳ、、、とは、ＧとＲとの間から、アミノ酸２５個を省略したことを示す）。この整列と進化樹で使用した配列の出所は以下の通りである・ＣＹＣＡ−Ｈｓ、ヒトＡ型サイクリン（Ｔａｎｇ、　Ｊ−ら、　Ｎａｔｕｒｅ　３４３：５５５−５５７（１９９０））　；　ＣＹＣＡ−Ｘ　１、アフリカッメガエルＡ−型サイクリン（Ｍｉｎｓｈｕｌｌ、　Ｊ、ら、　ＥＭＢＯＪ、　影２８６５−２８７５（１９９０））　；　ＣＹＣＡ−３ｓ、クラムＡ−型すイタリン（Ｓｗｅｎｓｏｎ、　Ｋ、１．ら、　Ｃｅ１ｌ　４７：８６７−８７０（１９８６））；ＣＹＣＡ−Ｄｍ、ショウジヨウバエＡ−型すイタリン（Ｌｅｈｎｅｒ、　Ｃ，Ｆ、とＰ、Ｈ，Ｏ’Ｆａｒｒｅｌｌ、　Ｃｅ旦５６：９５７−９６８（１９８９））　；　ＣＹ　ＣＢ　１−　Ｈｓ　、ヒトＢ１−型サイクリン（Ｐｉｎｅｓ、　Ｊ、とＴ、　［１ｕ１ｔｅｒ、Ｃｅ旦５８：８３３−８４６（１９８９））　；　ＣＹ　ＣＢ　１−　Ｘ　１及びＣＹＣＢ２−Ｘｉ、アフリカッメガエルＢ１−及びＢ２−型サイクリン（Ｍｉｎｓｈｕｌｌ。

Ｊら、孕現ム削：９４７−９５６（１９８９））　；　ＣＹ　ＣＢ　−Ｓ　ｓ　、クラムＢ−型サイクリン（Ｗｅｓｔｅｎａｏｒｆ、Ｊ、Ｍ、ら、Ｊ、Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、１０８：１４３１−１４４４（１９８９））　；　ＣＹＣＢ− Ａｓｐ、ヒトデＢ−型すイタリン（Ｔａｃｈｉｂａｎａ、　Ｋ、ら、　Ｄｅｗ、　Ｂｉｏｌ、　１４０：２４ト２５２（１９９０））；ＣＹＣＢ−Ａｒｐ１ウニＢ−型サイクリン（Ｐｉｎｅｓ、　Ｊ、とＴ、　ｌ１ｌｕｎｔｅｒ、　ＥＭＢ（しＲ６：２９８７−２９９５（１９８７））　；　ＣＹＣＢ−Ｄｍ、ショウジョウバより一部サイクリン（Ｌｅｈｎｅｒ、　Ｃ，Ｆ、とＰ、１１．０°Ｆａｒｒｅｌｌ、　Ｃｅ月−６１＋５３５−５４７）　；　ＣＤＣｌ　３−３ＩＮ、Ｓ、ｐ。

ｍｂｅのＣＤＣ１３（Ｂｏｏｈｅｒ、Ｒ，とり、Ｂｅａｃｈ、ＥＭＢＯＪ、７：２３２１−２３２７（１９８８））　；　ＣＬＮＩ−３ｃ及びＣＬＮ２−３ｃ、Ｓ、ｃｅ　ｒｅｖ　ｉ　ｓ　ｉ　ａｅのサイクリン１及び２　（Ｈａｄｗｉｇｅｒ、Ｊ、Ａ、ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８６：６２５５−６２５９（１９８９））　；ＣＬＮ３−３ｃ、Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのサイクリン３　（Ｎａｓｈ、　Ｒ，ら、農ヌしＪ、　７：４３３５−４３４６（１９８８））。

全部で１７種類のサイクリン配列を整列させた。各クラスの代表的な２配列を図５Ａに示す。

１７種類の配列を全部対にして比較し、１７配列で共通であった１５４アミノ酸残基から、パーセント・ダイバージェンスを計算した。このアミノ酸残基は、Ａ、Ｂ、及びＤ−型サイクリンのＮ−木端に位置する５ｏ残基の部分を含まない。

なぜならば、この部分はＣＬＮ型サイクリンには存在しないがらである。ギャップ／挿入は、大きさに関わらず、ミスマツチ１つとして数えた。進化樹の作成にｏｌｌｅｃｕｌａｒ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｐｐ、　３８７−３２６　コロンビア大学出版、ニューヨーク州　（１９８７））により、全ての値を距離に直した。ロチニスター大学で開発されたコンピュータープログラムを使用して、対の比較、及び、ポヮソン補正の計算を行なった。サイク１ル遺伝子ファミリーの進化樹を、ネイバ町ジョイニング・プログラムにより作成した（Ｓａｉｔｏｕ、　Ｎ、とＬ　Ｎｅｉ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　Ｅｖｏｌ、　４：４０６−４２５（１９８７））。コールド・スプリング・ハーバ町ラボラトリ−のＶＡＸコンピューター・マイクロＶＭＳ　Ｖ４．４を用いて、全計算を行なった。より多数の残基（例えば、Ａ、Ｂ、及び、Ｄ−型サイクリンのＣ−末端に位置する５ｏ残基の部分、図５Ａ）を含む配列の部分集合（例えば、Ａ、Ｂ、及び、Ｄ−型サイクリン）を用いて、あるいは、その他のいくっがの未公表のサイタリン配列を追加することにより、進化樹の信頼性を評価した。どの場合にも、図５Ｂに示す進化樹と同じトポロジーを有する進化樹が作成された。

びウェス　ンブロ・′トロ０から８０９６の密集度の１００ｍｍディツシュ由来の細胞を、１ｍｌの溶解緩衝液（５０ｍＭＴｒ　ｉ　５−ＨＣＬ　ｐＨ７，４，１５０ｍＭＮａＣ１，２０ｍＭＥＤＴＡ、０．５％ＮＰ−４０，０．５％デオキシコール酸Ｎａ、１ｍＭＰＭＳＦ）中で、氷上で３０分間溶解させた。各細胞溶解物がらタンパク質１ｍｇ分を用いて、４℃で一晩、免疫沈降を行なった。溶解緩衝液で平衡化した後、６０μｍのプロティンＡ−アガロース（ピアース）を各免疫沈降物に添加し、一定速度で回転しながら、４℃で１時間インキュベートした。免疫沈降物を溶解緩衝液で３回洗浄し、最後に５０μｍの２ＸＳＤＳタンパク質サンプル緩衝液に再懸濁した。これを５分間煮沸し、１０％ポリアクリルアミドゲルにロードした。

ＳＤＥエレクトロブロッティング・システム（ミリポア）を用いて、４００ｍＡの定電流を４５分間で、タンパク質をニトロセルロースフィルターへ移した。フィルターを、１ｘＰＢＳ、３％ＢＳＡ、Ｏ，，１％アジ化ナトリウムで、２から６時間ブロッキングし、ＮＥＴゲル緩衝液（５０ｍＭＴｒ　ｉ　５−ＨＣＬ　ｐＨ７，５，１５０ｍＭＮａＣｌ、０．１％ＮＰ−４０，１ｍＭＥＤＴＡ、０．２５％ゼラチン、０．０２アジ化ナトリウム）で、各１０分間ずつ６回洗浄した。

そして、ブロッキング溶液中で１時間、振とうしながら、１ｆｆｉｓ　１−プロティンＡで放射線標識した。次に、オートラジオグラフィーの前に、プロットをＮＥＴゲル緩衝液中で各１０分間ずつ６回洗浄した。

している。ＣＬＮサイタリンとその他のサイクリンを結びつけている節の間の枝の長さは、任意に分けた。

材料及び方法以下の材料と方法を、例４−６に記載されている研究中で用いた。

分子２旦二壬２グヒトＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡライブラリー、ヒト神経膠芽細胞腫細胞Ｕ１１８ＭＧｃＤＮＡライブラリー、ヒト正常肝ゲノムライブラリー、及び、ハイブリッド形成緩衝液は、上述の通りである。ヒト海馬ｃＤＮＡライブラリーをストラタジーン社より購入した。高ストリンジエンシー及び低ストリンジエンシーのハイブリッド形成を、それぞれ６８℃及び５０℃で行なった。ＰＣＲ反応用の鋳型ＤＮＡを調製するために、各ｃＤＮＡライブラリーから約２００万個のラムダファージを１０’ＰＦＵ／１５０ｍｍプレートの密度でまいた。プレート溶菌液より、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、ら、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：八Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ　、第二板、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク州　（１９８９）に従って、ＤＮＡを調製した。

倒４　ヒトサイクリンＤ２　びＤ３ｃＤＮＡのヒトサイクリンＤ２及びＤ３ｃＤＮＡを単離するために、ヒトＣＣＤＮＩ、マウスｃｙｌｌ、ｃｙ１２、及び、ｃｙ、ｌ３Ｄ−型サイクリンで非常によく保存された３つの領域から、２個の５゛オリゴヌクレオチドと、１個の３°縮重オリゴヌクレオチドを作成した（Ｍａｔｓｕｓｈｉｍｅ、　Ｈ，ら、　Ｃｅ１ｌ　６５ニア０ｌ−７１３（１９９１）　；　Ｘｉｏｎｇ。

Ｙ、ら、Ｃｅ１ｌ　６５：６９１−６９９　、図８）。第一の５″オリゴヌクレオチドプライマーであるＨＣＮＤｌｌは、８１９２倍に縮重しだ３８マー（ＴＧＧＡＴＧ　［Ｔ／Ｃ］　ＴＮＧＡ　［Ａ／Ｇ］　ＧＴＮＴＧ　［Ｔ／Ｃコ　ＧＡ　［Ａ／Ｃコ　ＧＡ　［Ａ／Ｇ］　ＣＡ−［Ａ／Ｇ］　ＡＡ　［Ａ／Ｇ］　ＴＧ　［Ｔ／ＣＩ　ＧＡ　［Ａ／Ｇ］　ＧＡ）（ＳＥＱ　ＩＤＮｏ、３７）であり、アミノ酸１３個をコードする（ＷＭＬＥＶＣＥＥＱＫＣＥＥ）（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、３８）。第二の５°オリゴヌクレオチドプライマーであるＨＣＮＤｌ２は、８１９２倍に縮重した２９マー（ＧＴＮＴＴ　［Ｔ／Ｃ］ＣＣＮ　［Ｔ／Ｃコ　ＴＮＧＣＮＡＴＧＡＡ　［Ｔ／Ｃコ　ＴＡ　［Ｔ／Ｃ］　−ＴＮＧＡ）（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、３９）であり、アミノ酸１０個をコードする（ＶＦＰＬＡＭＮＹＤＬ）（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、４０）、３’　プライマーであるＨＣＮＤｌ３は、３０７２倍に縮重した２４マー（［Ａ／Ｇ］　ＴＣＮＧＴ　［Ａ／ＧコＴＡ［Ａ／Ｇ／Ｔ］　ＡＴ−［Ａ／Ｇ］　ＣＡＮＡ　［Ａ／Ｇ］　［Ｔ／Ｃ］　ＴＴ −［Ｔ／Ｃ］ＴＣ）（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、４１）であり、アミノ酸８個をコードする（ＥＫＬＣＩＹＴＤ）（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、４２）、ＰＣＲ反応を、９４℃で１分間、４８℃で１分間、７２℃で１分間で、３０サイクル行なった。反応液は、５０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭＴ　ｒ　ｉ　ｓ　−ＨＣＩ　（ｐＨ８，３）、１．５ｍＭＭｇＣｌ５．０゜０１％ゼラチン、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰを各０．２ｍＭ、２゜５ユニツトのＴａｑポリメラーゼ、５μＭのオリゴヌクレオチド、２−１０μｇの鋳型ＤＮＡを含む。ＨＣＮＤＩＩとＨＣＮＤｌ３で合成されたＰＣＲ産物を、ＨＣＮＤｌ　２とＨＣＮＤｌ３をプライマーとして用いた第二ラウンドＰＣＴ反応によって確認した。１２９６アガロースゲルで分析した後、期待された長さくプライマーＨＣＮＤＩＩとＨＣＮＤｌ３との間で２００ｂｐ）のＤＮＡ断片を精製し、配列決定のために、ファジミドベクターｐＵｃ１１８のＳｍａ　１部位にサブクローニングした。

完全長のサイクリンＤ３ｃＤＮＡを単離するために、Ｄ３　ＰＣＲ産物の２０１ −ｂｐの断片を、オリゴヌクレオチドプライマーＨＣＮＤＩＩとＨＣＮＤ　１３を用いて、ランダム・プライム標識法（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ、　Ａ、　Ｐ、ら、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１３２：６−１３（１９８３））で標識し、ヒトＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに使用した。ＣＣＤＮ３遺伝子を目的としたヒトゲノムライブラリーのスクリーニングに使用したプローブは、ｃＤＮＡクローンλＤ３−８３４由来の２−ｋｂのＥｃｏＲＩ断片であった。ヒトサイクリンＤ３のスクリーニングのための全ハイブリッド形成を、高ストリンジエンシーで行った。

ＣＣＤＮＩ及びＣＣＤＮ３に対応するＰＣＲクローンを、両ｃＤＮＡライブラリーから、繰り返し単離した。ＣＣＤＮ２は単離しなかった。サイクリンＤ２を単離するために、マウスｌ土２ｃＤＮＡ由来の１−ｋｂのＥｃｏＲＩ断片をプローブとして用いて、ヒトゲノムライブラリーをスクリーニングした。低ストリンジエンシー条件下では、このプローブは、ヒトサイクリンＤ１及びＤ２の両方にハイブリダイズした。高ストリンジエンシーで、ヒトサイクリンＤ１プローブとの別のハイブリッド形成を行うことにより、サイクリンＤ１クローンを除去した。

続いて、部分的な配列決定と、予測されるタンパク質配列を、ヒトサイクリンＤ１及びＤ３、マウス旦ヱ±又と比較することによって、ヒトＣＣＤＮ２ゲノムクローンを同定した。

上述のように、遺伝子相補性スクリーニングを用いて、Ｓａｃｃｈａｒｏｍ且且ｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの三連旦上ユ欠損変異株をレスキューすることによって、ヒトＣＣＤＮＩ　（サイクリンＤＩ）を単離した。ヒトとマウスとの間の進化上の近縁度と、且ヱ上１、且ヱ±７１及び、ｆｆ上１内で配列の類似性があることから、ヒトのゲノム中には、さらに２種類のＤ−型サイクリン遺伝子が存在することが示唆された。推定のヒトサイクリンＤ２及びＤ３遺伝子を単離するために、まず、ＰＣＲ法を用いた。ヒトＣＣＤＮＩ、マウスＵ上よ、且ヱ士ス、及び、Ｕ上Ｊの非常によく保存された領域から、３個の縮重オリゴヌクレオチドプライマーを作成した。これらのプライマーを用いて、サイクリンＤ１と、マウスｃｙ１３のヒトの相同物と考えられる２００−ｂｐのＤＮＡ断片を、ヒトＨｅＬａ細胞及び神経膠芽細胞腫細胞ｃＤＮＡライブラリーから単離した。このＰＣＲ産物をプローブに用いて、完全長のＤ３クローンを得るために、ヒトＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。約１２０万個のｃＤＮＡクローンをスクリーニングし、６個のポジティブを得た。このスクリーニングからの最長のｃＤＮＡクローンであるλＤ３−８３４　（１９６２ｂｐ）を、完全に配列決定した（図４）。

仮定のヒトサイクリンＤ２ｃＤＮＡがＰＣＲで検出されなかったことから、異種プローブとしてマウス１ヱ↓２ｃＤＮＡを用いて、低ストリンジエンシーで、ヒトゲノムライブラリーをスクリーニングした。この結果、ＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡライブラリーから、まず、１０個のクローンが単離された。しかし、制限マツピングに基づくと、全クローンがヒトサイクリンＤ１遺伝子に対応していた。

これは、おそらく、ＨｅＬａ細胞中では、サイクリンＤ２の発現が非常に低レベルであるからである。そこで、ＤｌとＢ２の構成はほとんど同一であるという仮定に基づいて、同じプローブを用いてヒトゲノムライブラリーをスクリーニングした。得られた１８個のポジティブのうち、１０個がヒトサイクリンＤ１に対応し、８個がヒトサイクリンＢ２配列を含むと考えられた（下記参照）。次に、８個の仮定サイクリンＢ２クローンのうちの一つであるλＤ２−Ｇｌ由来の、０゜４−ｋｂのＢａｍＨＩ断片をプローブとして用いて、サイクリンＢ２遺伝子の完全長ｃＤＮＡクローンを探すために、高ストリンジエンシーでヒト海馬ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。約１００万個のｃＤＮＡクローンをスクリーニングした後、９個のポジティブが得られた。最長のｃＤＮＡクローン、λＤ２−Ｐ３　（１９１，１ｂｐ）を完全に配列決定した（図３）。λＤ２−Ｐ３も、λＤ３−Ｈ３４も、ポリ（Ａ）配列を含まないことから、３゛非翻訳領域の一部分が欠けていることが示唆された。

λＤ２−Ｐ３のＤＮＡ配列より、計算上の分子量３３，０４５−Ｄａ、２８９＝アミノ酸の夕〉バク質をコードできる読み枠が、明らかとなった。λＤ３−８３４についての同様の分析から、計算上の分子量３２．４８２−Ｄａのタンパク質をコードする、２９２−アミノ酸の読み枠が明らかとなった。ヒトサイクリンＤｉの場合と同様に、λＤ２−Ｐ３　（ヌクレオチド位置２２、図３）と、λＤ３ −８３４　（ヌクレオチド位置１０１、図４）の仮定の開始メチオニンコドンよりも５゛側には、メチオニンコドンも停止コドンも存在しない。ヒトサイクリンＤ保護実験の予備結果に基づいて、λＤｊ２−Ｐ３とλＤ３−Ｈ３４は、どちらも完全長のコード領域を含むと考えられる。

これまでに同定された１１種類の哺乳類サイクリンの全てのタンパク質配列を比較して、構造上及び進化上の関係を評価した。これには、サイクリンＡ１サイクリンＢ１及びＢ２．６個のＤ−型サイクリン（３個がヒト由来、３個がマウス由来）と、最近同定されたサイクリンＥ及びＣ（図７）が含まれる。この比較から、Ｄ−型サイクリンに関するいくつかの特徴が観察された。第一には、サイクリンＤ１に関して前述したように、３種のサイクリンＤ遺伝子は、全て、２８９には、これらは全て、Ａ−及びＢ−型サイクリンのＮ−末端で同定されている、いわゆる”デストラクション・ボックス”、を欠（。デストラクション・ポックとの間で５２％である。第四に、Ｄ−型サイクリンのメンバーは、Ｂ−型サイク５　ＣＣＤＮ２　びＣＣＤＮ３の　上の　１ＣＣＤＮ２及びＣＣＤＮ３の染色体上の座位を、蛍光ｉｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成法によって決定した。以前の記載通りに（Ｌｉｃｈｔｅｒ、　Ｔ、ら、　５ｃｉｅｎ＋≧＆げ：６４−６９（１９９０）　；　Ｂａ１ｄｉｎｉ、＾、ら、　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　９：　７７０− ７７４（１９９１））　、染色体ｉｎ　ｓ土工旦抑制ハイブリッド形成法、及び、ｉｎ　５ｉｔｕハイブリツド・バンド形成法を行なった。簡単には、それぞれ１５及び１６ｋｂの挿入配列を含むラムダゲノムＤＮＡλＤ２−Ｇ４及びλＤ３ −Ｇ９を、ニック−トランスレーション（Ｂｒｉｇａｔｔｉ、Ｄ、Ｊ　ら、　欺劇旦間１２６：３２−５０（１９８３）　；　Ｂｏｙｌｅ、Ａ、Ｌ、、　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔ盾■ ｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ　、ウイレー、ニューヨーク、１９９１）によって、ビオチン−１１−ｄＵＤＰ　（シグマ）で標識した。プローブの大きさは、２００から４００ヌクレオチドの範囲であり、取り込まれなかったヌクレオチドを、セファデックスＧ−５０スピン・カラムを用いて、プローブより分離した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ。

Ｊ、ら、　Ｍｏ１ｅ観如り旦−…匣ＬＬ坏内■小山り呻曵酊、第二版、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク州　（１９８９））　、常法（Ｌｉｃｈｔｅｒ、　Ｔ、ら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４７：６４−６９（１９９０））によって調製した中期染色体の展開物を、ビオチン−標識Ｄ２−Ｇ４あるいはＢ３−Ｇ９で、ｉｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成を行なった。デオキシリボヌクレアーゼ処理した５μｇのヒト胎盤ＤＮＡ、デオキシリボヌクレアーゼ処理した７μｇのサケ精子ＤＮＡ、及び、１１００ｎの標識プローブを、変性、プレアニーリングした後、この混合物をΔ１旦プレハイブリダイズしたスライドに加えた。この展開物で、４０％ｇのへ土凹４８マー・オリゴヌクレオチドを用いて、共ハイブリッド形成を行った。それによって、染色体の同定、及び、プローブ位置を明視化するために用いる、土ｎ　５ｉｔｕ−ハイブリッド形成法のバンドパターンを作成した。変性した染色体に加える前に、このへ１旦配列を、ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰ（ベーリンガーーマンハイムンで化学標識し、変性した。３７℃で１６−１８時間インキュベートし、ハイブリッド形成後の洗浄を行なった後、スライドをブロック溶液と検出試薬でインキュベートした（Ｌｉｃｈｔｅｒ、　Ｔ、ら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４７：６４−６９（１９９０））。蛍光イソチオシアン酸（ＦＩＴＣ）と共役したアビジンＤＣ３（５μｇ／ｍ１）（ベクター・ラボラトリーズ）を用いて、ビオチン標識１）ＮＡを検出した；ジゴキシゲニン標識ＤＮＡを、ローダミンと共役した抗ジゴキシゲニン０・エビ蛍光顕微鏡を用いて、蛍光シグナルを別々にイメージ化した。アップル像を合成するために、ジーン・シタイン・マックスピックス（Ｔｉｍ　Ｒａｎｄによるソフトウェア、Ｄ、Ｗａｒｄ研究室、イエール）を用いて、マツキントラシュｌ１ｃｉコンピユーターでイメージ・プロセシングを行なった。コンピューターのモニターから、直接、写真を撮影した。

染色体蛍光ｉｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成法を用いて、Ｂ２−Ｇ４及びＢ３− Ｇ９の座位を決定した。ビオチン標識プローブと、ジゴキシゲニン標１ｋＡｌ旦１３上であり、Ｂ３−Ｇ９が染色体６ｐのバンド２１上である、という細胞遺伝された。Ｂ２−Ｇ４プローブは、ポジティブＲバンド１２ｐｌａ上に位置し、Ｂ３−６９は、ポジティブＲバンド６ｐ２１上に位置する。

分であり、また、偽遺伝子のヌクレオチド配列が、先祖である活性遺伝子の配列からかけ離れてしまったためであると考えられる。

６　ヒトＤ−サイ　ｉンの゛ツム　ローンの　と　のゲノム構造を調べ、染色体マツピング用のプローブを得る目的で、ヒトＤ−型サイクリンのゲノムクローンを単離し、性質を調べた。１．３ｋｂのサイタリンＤ１ｃＤＮＡクローン全体をプローブとして用いて、ヒト正常肝ゲノムライブラリーをスクリーニングした。

５００万個のゲノムクローンをスクリーニングし、ポジティブを３個得た。まず、制限地図とハイブリッド形成を行なった後、ラムダクローンＧ６を選択し、さらに分析した。λＤＩ−Ｇ６の１．７ｋｂの旦且工Ｈ１断片を、ｐＵＣ１１８にサブクローニングし、完全に配列決定を行なった。

以前に単離されたｃＤＮＡクローンとの比較と、リボヌクレアーゼ保護分析の結果（Ｗｉｔｈｅｒｓ、　Ｄ、＾、ら、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　１１：４８４６−４８５３（１９９１））から、この断片が、サイクリンＤ１遺伝子の５゛部分に対応することが示された。図８Ａに示すように、これは、１１５０ｂｐの上流プロモーター配列と、１９８ｂｐのエクソンと、それに続くイントロンを含む。

上述のように（例４）、マウス１ヱ±２ｃＤＮＡをプローブとして用いた低ストリンジエンシー・ハイブリッド形成条件下で、同様のスクリーニングにより、１８個のラムダクローンが単離された。以前のｃＤＮＡライブラリー・スクリーニングで、低ストリンジエンシーでは、マウスＵ±２ｃＤＮＡプローブは、ヒトＤ１遺伝子と交差ハイブリッドを形成することが分かっていた。そのため、ヒトサイクリンＤ１ｃＤＮＡをプローブとして用いて、高ストリンジエンシーで、ドツトプロット・ハイブリッド形成法を行なった。１８個のクローンのうち、１０個が、ヒトＤ１プローブとハイブリッドを形成し、８個は形成しなかった。高ストリンジエンシーでヒトＤ１プローブとハイブリッドを形成しなかった８個のラムダクローンを、制限消化分析に基づいて、λＤ２−Ｇｌ、λＤ２−Ｇ２、λＤ２ −Ｇ４で示される３クラスにそれぞれ分類した。これらのラムダクローンをｐＵＣプラスミドベクターへサブクローニングし、マウス旦ヱ±２ｃＤＮＡプローブを用いて、サザンハイブリッド形成法により、コード領域を含む小さな制限断片を同定した。次に、λＤ２−Ｇｌ由来の０．４ｋｂの旦ａｍＨＩ断片をプローブとして用いて、高ストリンジエンシーで、ヒト海馬ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。詳細な制限地図と、部分的な配列決定から、λＤ２−Ｇｌ及び λＤ２−Ｇ２は、同じ遺伝子に対応する異なるクローンであり、一方で、λＤ２ −Ｇ４は、異なる遺伝子に対応すると考えられることが示された。λＤ２−６４由来の２゜７ｋｂの旦互旦Ｉ一旦工互Ｉ断片と、λＤ２−Ｇｌ由来の１，５ｋｂの旦旦↓Ｉ一旦Ｘ±１１断片を、完全に配列決定した。ヌクレオチド配列の比較より、クローンλＤ２−Ｇ４は、Ｄ　２　ｃ　ＤＮＡクローンλＤ２−Ｐ３に対応することが明かとなった（図３）。図８Ａに示すように、２．７ｋｂのＳａｃＩ−３ｍａ　Ｉ断片は、Ｄ２ｃＤＮＡ（図３）中で同定された仮定の開始メチオニンコドンの５゛側の配列を１６２０ｂｐと、１９５ｂｐのエクソンと、それに続く９０７ｂｐの介在配列を含む。

ヒトサイクリンＤ３に対応するラムダゲノムクローンを、ヒトＤ３ｃＤＮＡをプローブとして用いて、同じゲノムライブラリーから単離した。スクリーニングした４００万個のクローンのうち、９個がポジティブであった。λＤ３−Ｇ４及び λＤ３−Ｇ９で示される２クラスのクローンを、制限消化分析により区別した。

これらは、どちらも５°サイクリンＤ３ｃＤＮＡプローブにハイブリダイズしたため、より詳細に制限地図を作成し、完全に配列決定を行なうために、λＤ３− ６５由来の２．ＯｋｂのＨｉｎｄｌ　Ｉ　ｌ−３ｃａｌ制限断片と、λＤ３−Ｇ９由来（７）３．７ｋｂの旦且ｃｌ一旦土ｎｄＩＩＩ制限断片を、さらに、ｐＵＣプラスミドベクターへサブクローニングした。図９Ｃに示すように、クローン６９由来の３．７ｋｂ断片は、Ｄ３ｃＤＮＡ（図４）中に同定された仮定の開始メチオニンコドンの５′側の配列を１．８ｋｂと、１９８ｂｐのエクソン１．６８４ｂｐのエクソン２、及び、８７０ｂｐのイントロンを含む。

サイクリンＤ１、Ｄ２、Ｄ３のゲノムクローンの比較から、３種のヒトＣＣＤＮ遺伝子のコード領域は、全て、同じ位置にイントロンが介入していることが明かとなった（図８で矢印で示されている）。これは、サイクリンＤ遺伝子が分離する前に、イントロンが生じたことを示す。

７２個のサイクリンＤ　遺−の　と且工ＩＴ断片を、完全に配列決定し、サイクリンＤ２ｃＤＮＡクローンであるλ Ｄ２−Ｐ３と比較した。図１０に示すように、これは、内部に停止コドンを３個（ヌクレオチド位！４９５，９５６１，１３１０、アステリスクで示す）と、フレームシフト２個（位置１１８８．１２９１、スラッシュ線）と、挿入１個と、欠失１個を含んでいた。また、多数のミスセンス・ヌクレオチド置換を蓄積しており、そのうちのいくつかは、全サイクリンで保存されている位置で発生していた。

例えば、Ｄ２ｃＤＮＡ（図３）の位置２７７から２７９に位置するトリプレットＣＧＴは、アミノ酸Ａｒｇをコートし、これは全サイクリンで不変の残基である（図８Ａ）。クローンＤ２−Ｇｌ　（図１０）の対応する位置（ヌクレオチド７３１）で、ヌクレオチドがＣからＴへ変化することにより、Ａｒｇではなく、ＣｙＳをコードするトリプレットＴＧＴが発生した。クローンλＤ３−Ｇ５由来の２０ｋｂの旦±ｎｄＩＩ−５ｃａＩ断片の配列決定から、サイクリンＤ３偽遺伝子が明らかとなった（図１１）。ナンセンス変異（ヌクレオチド位置１２６５）、フレームシフト２個（位置１２１０．１６７９）、１５ｂｐの内部重複（位置１３６１から１３７６の下線領域）、及び、多数のミスセンス変異に加えて、位置１１８２でＡがＧへ変化することにより、その結果、仮定の開始メチオニンコドンＡＴＧから、ＶａｌをコードするＧＴＧへ、アミノ酸が変化した。これらの分析に基づいて、クローンλＤ２−Ｐ３及びλＤ３−Ｇ５が、それぞれサイクリンＤ２及びＤ３の偽遺伝子を含むと、結論した。

支文例当業者には、通常の実験法を用いて、ここに記載されている特定の実施例に関して、多くの変更例を実施することができることがわかるであろう。そのような変更例も、以下のクレームで網羅される。

Ｆ工Ｇ、１３補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成５年１１月１６日国際出願番号　［ＰＣＴ／ＵＳ９２１０４１４６］コールドスプリングハーバ− バングタウンロード　１００名　称　コールド　スプリング　ハーバ−ラボラトリ−５、補正書の提出年月日平成５年６月１５日国際出願臼の請求の範囲５２ページ請木の範囲３７　サイクリンＤ２及びサイクリンＤ３、から構成される群より選択される、ことを特徴とする精製された組換えＤ−型サイクリン。

３８　図３のアミノ酸配列、あるいは、図４のアミノ酸配列を有する、ことを特徴とする組換えＤ−型サイクリン。

３９、サイクリンＤ２及びサイクリンＤ３、から構成される群より選択される、ことを特徴とする精製されたＤ−型サイクリン。

４０、図３のアミノ酸配列、あるいは、図４のアミノ酸配列を有する、ことを特徴とする精製されたＤ−型サイクリン。

４１　図３の核酸配列、あるいは、図４の核酸配列と同一のタンパク質をコードする核酸配列を有する、ことを特徴とする単離されたＤＮＡ。

４２、図３の核酸配列、及び、図４の核酸配列、から構成される群より選択される核酸配列と特異的にハイブリッドを形成する、ことを特徴とするＤＮＡ断片プローブ。

４３、前記ＤＮＡ断片が標識されている、ことを特徴とする請求項４２記載のＤＮＡ断片プローブ。

４４、前記標識が、放射性標識、蛍光標識、酵素標識、及び、結合対の構成要素から構成される群より選択される、ことを特徴とする請求項４３記載のＤＮＡ断片。

国際出願臼の請求の範囲５２ページ（続き）４５　哺乳類由来のサイクリンＤ２１．あるいは、Ｄ３のうちの、少なくとも一つに特異的に結合する、ことを特徴とする抗体。

４６、標識されたモノクローナル抗体である、ことを特徴とする請求項４５記載の抗体。

国際出願臼の請求の範囲５３ページ４７　酵母において細胞周期の開始に必須な遺伝子中の変異をレスキューする遺伝子を同定するための方法であって、変異酵母細胞に、試験ＤＮＡ配列を含む酵母発現ベクターを導入し、前記変異酵母細胞が、細胞周期の開始に必須な少なくとも一つの遺伝子内に変異を有し、前記酵母の変異株を前記遺伝子あるいは複数の遺伝子の発現を阻害するような条件下で増殖させたときに、前記変異が、前記細胞周期の開始の直前の期における停止を引き起こし、前記形質転換された酵母細胞を、前記遺伝子あるいは複数の遺伝子の発現を阻害する条件下における増殖能力について、選択する、ステップから成り、前記形質転換された酵母細胞を細胞周期の開始点に導入するようなりＮＡ試験配列を発現する、形質転換された酵母細胞が選択される、ことを特徴とする方法。

４８　前記酵母発現ベクターがｐＡＤＮＳであり、前記変異酵母細胞が、不活性なＣＬＮＩ遺伝子と、不活性なＣＬＮ２遺伝子と、変異ＣＬＮ３遺伝子とを有し、前記変異ＣＬＮ３遺伝子が、グルコース抑制性のプロモーターから条件的に発現され、発現を阻害する前記条件が、グルコースから構成される培地の存在下での増殖である、ことを特徴とする請求項４７記載の方法。

４９、試験細胞中の、哺乳類由来のサイクリンＤ２、あるいは、サイクリン遺伝子伝子に相同的なサイクリン遺伝子を検出する方法であって、試験細胞、及び、対照細胞由来の核酸を、別個に、ＤＮＡ断片プローブと混和し、前記断片プローブが、図３あるいは図４の配列を有するＤＮＡ由来であり、相補的な核酸配列の複合体形成に適した条件下で、前記混和を行ない、前記試験細胞中の前記複合体の存在を検出する、ことを特徴とする方法。

国際出願臼の請求の範囲５４ページ５０　生物検体中の、Ｄ２サイタリン、あるいは、Ｄ３サイタリンを検出する方法であって、生物検体を、Ｄ２サイクリン、あるいは、Ｄ３サイクリンのうちの少なくとも一つに特異的な抗体と混和し、前記抗体の結合を検出する、ステップから成り、結合が、Ｄ２サイクリン、あるいは、Ｄ３サイクリンの存在を示す、ことを特徴とする方法。

５１、前記抗体が標識されている、ことを特徴とする請求項５０記載の方法。

５２　生物検体中の、Ｄ２サイクリン、あるいは、Ｄ３サイクリンの発現レベルを決定する方法であって、生物検体を、Ｄ２サイクリン、あるいは、Ｄ３サイクリンのうちの少なくとも一つに特異的な抗体と混和し、前記生物検体中、及び、対照検体中における前記抗体の結合レベルを検出し、前記対照細胞が、Ｄ２サイクリン、あるいは、Ｄ３サイクリンを基本的なレベルで発現する、ステップから成り、前記生物検体中、及び、前記対照検体中における前記抗体の結合レベルを比較して、前記発現レベルを決定する、ことを特徴とする方法。

５３、前記抗体が標識されている、ことを特徴とする請求項５２記載の方法。

国際出願臼の請求の範囲５４ページ（続き）５４、試験細胞中の、哺乳類由来のサイクリンＤ２、あるいは、サイクリンＤ３の転写レベルの上昇を検出する方法であって、試験細胞、及び、対照細胞由来の核酸を、別個に、ＤＮＡ断片プローブと混和し、前記断片プローブが、図３あるいは図４の配列を有するＤＮＡ由来であり、相補的な核酸配列の複合体形成に適した条件下で、前記混和を行ない、前記試験細胞、及び、前記対照細胞中の前記複合体量をそれぞれ検出し、前記試験細胞中で検出された前記複合体量を、前記対照細胞中で検出された複合体量と比較する、ステップから成り、前記対照細胞と比較して前記試験細胞中の複合体量の方が多いことが、前記試験細胞中における、サイクリンＤ２、あるいは、サイクリンＤ３の転写の上昇を示す、ことを特徴とする方法。

５５、細胞分裂の阻害方法であって、細胞中に、サイクリン依存性プロティンキナーゼがサイクリンＤ２、あるいは、Ｄ３の何れかと複合体を形成することを特異的に阻害する物質を導入する、ステップから成る、ことを特徴とする方法。

５６　前記物質が、ａ）図３あるいは図４のＤＮＡ配列と同一の配列を有するオリゴヌクレオチド配列、ｂ）サイクリンＤ２、あるいは、サイクリンＤ３のうちの少なくとも一つに特異的に結合する抗体、ＣサイクリンＤ２、あるいは、サイクリンＤ３を分解する物質、ｄ）オリゴペプチド、から構成される群より選択される、ことを特徴とする請求項５５記載の方法。

国際出願日の請求の範囲５５ページ５７　細胞中の、細胞周期の開始に必須なプロティンキナーゼの活性化を阻害する方法であって、細胞中に。

ａ）図３あるいは図４のＤＮＡ配列と同一の配列を有するオリゴヌクレオチド配列、ｂ）細胞周期の開始に必須なプロティンキナーゼに対する結合特異性を有するペプチドであって、前記ペプチドの結合によって、前記プロティンキナーゼとサイクリンＤ２あるいはサイクリンＤ３との複合体の形成が防止され、前記ペプチドの結合によって、前記プロティンキナーゼが活性化されない、ペプチド、Ｃ）サイクリンＤ２、あるいは、サイクリンＤ３のうち少なくとも一つに特異的に結合するブロッキング抗体、国際出願日の請求の範囲５６ページｄ）サイクリンＤ２、あるいは、サイ、幻ルＤ３を特異的に分解する物質、から構成される群より選択される物質を、細胞中に導入する、ことを特徴とする方法。

国際調査報告フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｑ　１／６８　Ａ　７８２３−４ＢＩ

Claims

【特許請求の範囲】

１．出芽酵母において細胞開始に必須なＣＬＮ−型タンパク質を代替する、ことを特徴とする哺乳類由来の組換えサイクリン。
２．Ｄ−型サイクリンである、ことを特徴とする請求項１記載の組換えサイクリン。
３．ヒト由来である、ことを特徴とする請求項２記載の組換えサイクリン。
４．サイクリンＤ１、サイクリンＤ２、及び、サイクリンＤ３から構成される群より選択される、ことを特徴とする請求項３記載の組換えＤ型サイクリン。
５．哺乳類由来で、概算分子量が３４ｋＤである、ことを特徴とする精製されたＤ−型サイクリン。
６．図２のアミノ酸配列、図３のアミノ酸配列、あるいは、図４のアミノ酸配列を有する、ことを特徴とする請求項５記載の精製されたＤ型サイクリン。
７．サイクリンＤ１、サイクリンＤ２、及び、サイクリンＤ３から構成される群より選択される、ことを特徴とする請求項５記載の精製されたＤ型サイクリン。
８．哺乳類由来で、概算分子量が３４ｋＤである、ことを特徴とする組換えＤ− 型サイクリン。
９．図２のアミノ酸配列、図３のアミノ酸配列、あるいは、図４のアミノ酸配列を有する、ことを特徴とする請求項８記載の組換えＤ−型サイクリン。
１０．哺乳類由来の概算分子量が３４ｋＤであるＤ−型サイクリンをコードする、ことを特徴とする単離されたＤＮＡ。
１１．図２の核酸配列、図３の核酸配列、あるいは、図４の核酸配列を有する、ことを特徴とする請求項１０記載の単離されたＤＮＡ。
１２．出芽酵母において細胞周期の開始に必須なＣＬＮ−型タンパク質を代替するＤ−型サイクリンタンパク質をコードする、ことを特徴とする単離されたＤＮＡ。
１３．図２の核酸配列、図３の核酸配列、及び、図４の核酸配列から構成される群より選択される核酸配列の、少なくとも一部分とハイブリッドを形成する、ことを特徴とするＤＮＡプローブ。
１４．標識されている、ことを特徴する請求項１３記載のＤＮＡプローブ。
１５．前記標識が、放射性標識、蛍光標識、酵素標識、及び、結合対の構成要素から構成される群より選択される、ことを特徴とする請求項１４記載の標識ＤＮＡプローブ。
１６．哺乳類由来の概算分子量が３４ｋＤであるＤ−型サイクリンと特異的に結合する、ことを特徴とする抗体。
１７．標識されたモノクローナル抗体である、ことを特徴とする請求項１６記載の抗体。
１８．酵母において細胞周期の開始に必須な遺伝子を代替するＤＮＡを同定する方法であって、ａ）細胞周期の開始に必須な遺伝子を条件的に発現する、変異酵母細胞を提供し、ｂ）（ａ）の変異酵母細胞に、酵母において細胞周期の開始に必須な遺伝子を代替する能力を評価するＤＮＡを含み、前記変異酵母細胞中で前記ＤＮＡを発現する酵母ベクターを、導入し、ｃ）（ａ）で提供された変異酵母細胞において細胞周期の開始に必須な遺伝子が発現されない条件下で、増殖能力に基づいて、（ｂ）で作成した形質転換された変異酵母細胞を選択する、ステップから成り、（ｃ）の条件下での増殖能力か、形質転換された酵母の変異株中に、細胞増殖の開始に必須な遺伝子を代替するＤＮＡが存在することを示す、ことを特徴とする方法。
１９．前記酵母の変異株が、不活性のＣＬＮ１及びＣＬＮ２遺伝子と、グルコース抑制性プロモーターから条件的に発現される改変ＣＬＮ３とを有し、前記酵母ベクターがｐＡＤＮＳであり、（ｂ）で作成した形質転換された変異酵母の、グルコース存在下における増殖能力を評価することによって、（ｃ）の選択を行なう、ことを特徴とする請求項１８記載の方法。
２０．酵母において細胞周期の開始に必須な遺伝子を代替する前記ＤＮＡが、Ｄ −型サイクリンである、ことを特徴とする請求項１９記載の方法。
２１．（ｃ）で選択された形質転換された酵母の変異株中の酵母ベクターの安定性を確認することによって、グルコースの存在下における増殖能力が、復帰突然変異の結果ではないことを確認する、ことから更に成る、ことを特徴とする請求項２０記載の方法。
２２．酵母において細胞周期の開始に必須な遺伝子を代替するサイクリンをコードするＤＮＡを同定する方法であって、ａ）ＣＬＮ１遺伝子及びＣＬＮ２遺伝子が不活性であり、ＣＬＮ３遺伝子が条件的に発現される変異酵母細胞を提供し、ｂ）（ａ）の変異酵母細胞に、ＣＬＮ３遺伝子を代替する能力を評価するＤＮＡを含む酵母ベクターｐＡＤＮＳを導入して、形質転換された変異酵母細胞を作成し、ｃ）（ｂ）で作成した形質転換された変異酵母細胞を、グルコース含有培地上で維持し、ｄ）グルコース含有培地上における増殖能力に基づいて、（ｂ）で作成した形質転換された変異酵母細胞を選択する、ステップから成る、ことを特徴とする方法。
２３．（ｄ）で選択された形質転換された変異酵母細胞中の酵母ベクターｐＡＮＤＮＳの安定性を確認する、ことから更に成る、ことを特徴とする請求項２２記載の方法。
２４．酵母において細胞周期の開始に必須な遺伝子を代替するサイクリンが、Ｄ −型サイクリンである、ことを特徴とする請求項２３記載の方法。
２５．細胞中の、哺乳類由来のサイクリンをコードするＤＮＡを検出する方法であって、ａ）前記細胞中の核酸配列が、相補的な核酸配列とハイブリッドを形成できるように細胞を加工し、ｂ）（ａ）の産物を、哺乳類由来のＤ−型サイクリンをコードするＤＮＡ、あるいは、哺乳類由来のＤ−型サイクリンをコードするＤＮＡに相補的なＤＮＡと混和し、ｃ）（ｂ）の産物を、相補的な核酸配列がハイブリッドを形成するために適した条件下に保持し、ｄ）相補的な核酸配列のハイブリッド形成を検出する、ステップから成り、ハイブリッド形成が、哺乳類由来のＤ−型サイクリンをコードするＤＮＡが存在することを示す、ことを特徴とする方法。
２６．（ｂ）において、（ａ）の産物を、図２の配列を有するＤＮＡ、図２の配列に相補的なＤＮＡ、図３の配列を有するＤＮＡ、及び、図３の配列に相補的なＤＮＡから構成される群より選択されるＤＮＡと混和する、ことを特徴とする請求項２５記載の方法。
２７．前記サイクリンがＤ−型サイクリンである、ことを特徴する請求項２６記載の方法。
２８．（ｄ）で検出されたハイブリッド形成を、適切な対照細胞中で検出されたハイブリッド形成と比較する、ことから更に成り、（ｄ）で検出されたハイブリッド形成が、対照細胞中のハイブリッド形成よりも大きい場合には、哺乳類由来のＤ−型サイクリンをコードするＤＮＡのレベルが上昇していることが示される、ことを特徴とする請求項２７記載の方法。
２９．生物検体中の、Ｄ−型サイクリンを検出する方法であって、ａ）Ｄ−型サイクリンレベルを評価する生物検体を提供し、ｂ）前記生物検体を、Ｄ−型サイクリンに特異的な抗体と混和し、ｃ）（ｂ）の抗体と前記生物検体中の成分との結合を検出する、ステップから成り、結合が、Ｄ−型サイクリンの存在を示す、ことを特徴とする方法。
３０．Ｄ−型サイクリンに特異的な抗体が標識されている、ことを特徴とする請求項２９記載の方法。
３１．生物検体中の、Ｄ−型サイクリンの増幅を検出する方法であって、ａ）Ｄ −型サイクリンレベルを評価する生物検体を提供し、ｂ）前記生物検体を、Ｄ− 型サイクリンに特異的な抗体と混和し、ｃ）Ｄ−型サイクリンに特異的な抗体と生物検体中のＤ−型サイクリンとの結合の程度を決定し、ｄ）（ｃ）の結果を、適切な対照中における前記Ｄ−型サイクリンに特異的な抗体とＤ−型サイクリンとの結合の程度と、比較する、ステップから成り、生物検体中での前記抗体とＤ−型サイクリンとの結合が、適切な対照中での結合よりも大きい場合には、Ｄ−型サイクリンが増幅していることが示される、ことを特徴とする方法。
３２．前記Ｄ−型サイクリンに特異的な抗体が標識されている、ことを特徴とする請求項３１記載の方法。
３３．細胞中の、哺乳類由来のＤ−型サイクリンレベルの上昇を検出する方法であって、ａ）細胞中の核酸が相補的な核酸配列とハイブリッドを形成できるように、分析する細胞を加工し、ｂ）前記の条件下で、（ａ）の産物を、哺乳類由来のＤ−型サイクリンをコードするＤＮＡとハイブリッドを形成するＤＮＡと混和し、ｃ）（ｂ）の混和物を、相補的な核酸配列がハイブリッドを形成するために適した条件下に保持し、ｄ）相補的な核酸配列のハイブリッド形成を検出し、ｅ）（ｄ）で検出されたハイブリッド形成を、適切な対照細胞中のハイブリッド形成と比較する、ステップから成り、ハイブリッド形成が、哺乳類由来のＤ−型サイクリンの存在を示し、さらに、（ｄ）のハイブリッド形成が対照細胞中よりも大きいことが、哺乳類由来のＤ−型サイクリンレベルが上昇していることを示す、ことを特徴とする方法。
３４．細胞分裂を阻害する方法であって、細胞内で細胞周期の開始に必須なプロテインキナーゼ−Ｄ−型サイクリン複合体の形成に干渉する薬剤を、細胞中に導入する、ことから成る、ことを特徴とする方法。
３５．前記薬剤が、ａ）Ｄ−型サイクリンをコードするＤＮＡに結合するオリゴヌクレオチド配列、ｂ）Ｄ−型サイクリンに特異的に結合する抗体、ｃ）Ｄ−型を分解する物質、ｄ）オリゴペプチド、から構成される群より選択される、ことを特徴とする請求項３４記載の方法。
３６．細胞周期の開始に必須なプロテインキナーゼの活性化を、細胞中で阻害する方法であって、ａ）Ｄ−型サイクリンをコードするＤＮＡに結合するオリゴヌクレオチド、ｂ）細胞周期の開始に必須なプロテインキナーゼに結合するが、活性化しないペプチド、ｃ）Ｄ−型サイクリンに特異的に持合する抗体、ｄ）Ｄ−型サイクリンを分解する物質、から構成される群より選択される薬剤を、前記細胞中に導入する、ことから成る、ことを特徴とする方法。