JP2001299368A - Ｄ−型サイクリンに関連する使用方法 - Google Patents
Ｄ−型サイクリンに関連する使用方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 G1期において活性である哺乳類サイクリンを
コードする遺伝子を同定する。 【解決手段】 変異酵母細胞に、試験DNA配列を含む酵
母発現ベクターを導入し、前記変異酵母細胞が、細胞周
期の開始に必須な少なくとも一つの遺伝子内に変異を有
し、前記変異酵母細胞を、前記遺伝子あるいは複数の遺
伝子の発現を阻害するような条件下で増殖させたとき
に、前記変異が、前記細胞周期の開始の直前の期におけ
る停止を引き起こし、前記形質転換された酵母細胞を、
前記遺伝子あるいは複数の遺伝子の発現を阻害する条件
下における増殖能力について、選択するステップを行
う。ここで、前記形質転換された酵母細胞を細胞周期の
開始点に導入するようなDNA試験配列を発現する、形質
転換された酵母細胞が選択される。
コードする遺伝子を同定する。 【解決手段】 変異酵母細胞に、試験DNA配列を含む酵
母発現ベクターを導入し、前記変異酵母細胞が、細胞周
期の開始に必須な少なくとも一つの遺伝子内に変異を有
し、前記変異酵母細胞を、前記遺伝子あるいは複数の遺
伝子の発現を阻害するような条件下で増殖させたとき
に、前記変異が、前記細胞周期の開始の直前の期におけ
る停止を引き起こし、前記形質転換された酵母細胞を、
前記遺伝子あるいは複数の遺伝子の発現を阻害する条件
下における増殖能力について、選択するステップを行
う。ここで、前記形質転換された酵母細胞を細胞周期の
開始点に導入するようなDNA試験配列を発現する、形質
転換された酵母細胞が選択される。
Description
【０００１】発明の背景 典型的な真核細胞の細胞周期は、核分裂（有糸分裂）と
細胞質分裂あるいはサイトキネシスを含むＭ期と、Ｇ１
期から始まってＳ期に入り、Ｇ２期で終了する間期と、
を含む。間期は、次のＭ期の開始まで、有糸分裂が始ま
るまで続く。Ｓ期では、ＤＮＡ複製とヒストンの合成が
行なわれる。一方、Ｇ１及びＧ２期では、損傷を受けた
ＤＮＡは修復されるが、正味のＤＮＡ合成は起こらな
い。細胞周期の間には、いくつかの重要な変化が起こ
る。それには、拘束点あるいは開始点と呼ばれるＧ１期
中の決定的な時点が含まれる。この点を越えると、細胞
は、Ｓ、Ｇ２、Ｍ期を完了するように方向付けられる。
Ｍ期の開始は、あらゆる哺乳細胞で、共通の機構によっ
て調節されているようである。この機構の鍵となる因子
は、プロテインキナーゼｐ３４ｃｄｃ２である。この因
子の活性には、リン酸化状態の変化と、サイクリンと呼
ばれるタンパク質との相互作用が必要である。サイクリ
ンもまた、活性化の後、Ｍ期を進行させる役割を担う。
サイクリンは、海産無脊椎動物の卵で受精に続いて急激
に合成されることから、発見されたタンパク質である
（Rosenthal, E.T.ら, Cell 20:487-494(1980)）。次
に、２つの型のサイクリン、つまりＡとＢの量が、初期
卵割の間に変動することが観察された。これは、これら
のポリペプチドが、有糸分裂の際にタンパク質分解され
るためであり、このことから、この名前が付いた（Evan
s, T.ら, Cell 33:389-396(1983)；Swenson, K.I.ら, C
ell 47:867-870(1986)；Standart, N.ら, Dev. Biol. 1
24:248-258(1987)）。クラムのサイクリンｍＲＮＡが、
カエルの卵母細胞を活性化し、これらの細胞をＭ期に導
入することができることから、サイクリンは、受動的と
いうよりも、能動的に、細胞分裂の調節に関与している
ことが明らかとなった（Swenson, K.I.ら, Cell 47:867
-870(1986)）。カエルの卵母細胞の活性化は、ＭＰＦと
して知られるＭ期誘導因子の合成を伴う（Masui, Y.と
C.L. Markert, J. Exp. Zool. 177:129-146(1971)；Smi
th, L.D.とR.E. Ecker, Dev. Biol. 25:232-247(197
1)）。ＭＰＦは、プロテインキナーゼであり、その触媒
サブユニットはｃｄｃ２プロテインキナーゼのカエルに
おける相同物である（Dunphy, W.G.ら, Cell 54:423-43
1(1988)；Gautier, J.ら, Cell 54:433-439(1988)；Ari
on, D.ら, Cell 55:371-378(1988)）。これまでに、３
つの型のサイクリンが同定されている：Ｂ、Ａ、及び、
ＣＬＮサイクリンである。Ｂ−型サイクリンは、ｃｄｃ
２プロテインキナーゼの不可欠なサブユニットとして機
能することで、有糸分裂中に働くことが示されている
（Booher, R.とD. Beach, EMBO J. 6:3441-3447(198
7)；Draetta, G.ら, Cell 56:829-838(1989)；Labbe,
J.C.ら, Cell 57:253-263(1989)；Labbe, J.C.ら, EMBO
J. 8;3053-3058(1989)；Meijer, L.ら, EMBO J. 8:2275
-2282(1990)；Gautier,J.ら, Cell 60:487-494(199
0)）。また、Ａ−型サイクリンも、独立にｃｄｃ２キナ
ーゼと結合し、有糸分裂以前の分裂周期初期に機能する
酵素を形成する（Draetta, G.ら, Cell 56:829-838(198
9)；Minshull, J.ら, EMBO J. 9:2865-2875(1990)；Gio
rdano, A.ら, Cell 58:981-990(1989)；Pines, J.とT.
Hunter, Nature 346:760-763(1990)）。これらの２つの
クラスのサイクリンの機能上の違いは、完全にはわかっ
ていない。無脊椎動物と脊椎動物の胚におけるサイクリ
ンの細胞学的及び分子的研究は、特に、子嚢酵母におけ
る遺伝学的研究を伴って行なわれた。分裂酵母では、ｃ
ｄｃ１３遺伝子は、ｃｄｃ２と共に作用して有糸分裂へ
の移行を調節するＢ−型サイクリンをコードする（Booh
er, R.とD. Beach, EMBO J. 6:3441-3447(1987)；Boohe
r, R.とD. Beach, EMBO J. 7:2321-2327(1988)；Hagan,
I.ら, J. Cell Sci. 91:587-595(1988)；Solomon, M.
Cell 54:738-740(1988)；Goebl, M.とB. Byers, Cell 5
4:433-439(1988)；Booher, R.N.ら, Cell 58:485-497(1
989)）。出芽酵母及び分裂酵母での遺伝学的研究から、
ｃｄｃ２（あるいは出芽酵母ではＣＤＣ２８）が、細胞
周期の２つの別個の時点で作用することが明らかとなっ
た：有糸分裂と、いわゆる細胞周期の”開始点”におい
て、である（Hartwell,L.H., J. Mol. Biol., 104:803-
817(1971)；Nurse, P.とY. Bissett, Nature 292:558-5
60(1981)；Piggot, J.R.ら, Nature 298:391-393(198
2)；Reed, S.I.とC. Wittenberg, Proc. Nat. Acad. Sc
i. USA 87:5697-5701(1990)）。出芽酵母では、ＣＤＣ
２８タンパク質の開始機能には、このプロテインキナー
ゼの触媒サブユニットが、構造的にＡ及びＢ−型サイク
リンに関連した補助的なタンパク質と結合することが必
要である。この第三のクラスのサイクリンは、Ｃｌｎク
ラスと呼ばれており、３つの遺伝子が部分的に重複した
遺伝子ファミリーを形成していることが報告されている
（Nash, R.ら, EMBO J. 7:4335-4346(1988)；Hadwiger,
J.A.ら, Prot. Natl. Acad. Sci. USA 86:6255-6259(1
989)；Richardson, H.E.ら, Cell 59:1127-1133(198
9)）。ＣＬＮ遺伝子は、開始点の実行に必須であり、こ
れがないと、細胞は細胞周期のＧ１期で停止する。ＣＬ
Ｎ１及びＣＬＮ２転写物は、細胞周期を通して量が変動
するが、ＣＬＮ３転写物は変動しない。さらに、Ｃｌｎ
２タンパク質が、そのｍＲＮＡと並行して変動すること
が示されている（Nash, R.ら, EMBO J. 7:4335-4347(19
88)；Cross, F.R., Mol.Cell. Biol. 8:4675-4584(198
8)；Richardson, H.E.ら, Cell 59:1127-1133(1988)；W
ittenberg,ら, 1990）。様々なサイクリンと結合するこ
とによってｃｄｃ２／ＣＤＣ２８に与えられる正確な生
化学的性質は、まだ完全に解明されていない。しかし、
サイクリン変異体の遺伝学的研究から、これらが触媒サ
ブユニットに対して”Ｇ１”及び”Ｇ２”の性質を与え
ることが明示された（Booher, R.とD. Beach, EMBO J.
6:3441-3447(1987)；Nash, R.ら, EMBO J. 7:4335-4347
(1988)；Richardson, H.E.ら, Cell 59:1127-1133(198
8)）。ｃｄｃ２とサイクリンは、胚と酵母中だけではな
く、ヒトの体細胞中でも発見されている。ｃｄｃ／サイ
クリンＢ酵素の機能は、ヒト細胞中でも、その他の型の
細胞と、同一であるようである（Riabowol, K.ら, Cell
57:393-401(1989)）。また、ヒトＡ型サイクリンも、
ｃｄｃ２と結合した状態で発見されている。ＣＬＮ型の
サイクリンは、哺乳細胞中では発見されていない。細胞
周期の調節に関わる因子とそれらの相互作用をよりよく
理解することは、細胞複製と、おそらくその過程の調節
あるいは変化を、よりよく理解することに貢献するであ
ろう。
細胞質分裂あるいはサイトキネシスを含むＭ期と、Ｇ１
期から始まってＳ期に入り、Ｇ２期で終了する間期と、
を含む。間期は、次のＭ期の開始まで、有糸分裂が始ま
るまで続く。Ｓ期では、ＤＮＡ複製とヒストンの合成が
行なわれる。一方、Ｇ１及びＧ２期では、損傷を受けた
ＤＮＡは修復されるが、正味のＤＮＡ合成は起こらな
い。細胞周期の間には、いくつかの重要な変化が起こ
る。それには、拘束点あるいは開始点と呼ばれるＧ１期
中の決定的な時点が含まれる。この点を越えると、細胞
は、Ｓ、Ｇ２、Ｍ期を完了するように方向付けられる。
Ｍ期の開始は、あらゆる哺乳細胞で、共通の機構によっ
て調節されているようである。この機構の鍵となる因子
は、プロテインキナーゼｐ３４ｃｄｃ２である。この因
子の活性には、リン酸化状態の変化と、サイクリンと呼
ばれるタンパク質との相互作用が必要である。サイクリ
ンもまた、活性化の後、Ｍ期を進行させる役割を担う。
サイクリンは、海産無脊椎動物の卵で受精に続いて急激
に合成されることから、発見されたタンパク質である
（Rosenthal, E.T.ら, Cell 20:487-494(1980)）。次
に、２つの型のサイクリン、つまりＡとＢの量が、初期
卵割の間に変動することが観察された。これは、これら
のポリペプチドが、有糸分裂の際にタンパク質分解され
るためであり、このことから、この名前が付いた（Evan
s, T.ら, Cell 33:389-396(1983)；Swenson, K.I.ら, C
ell 47:867-870(1986)；Standart, N.ら, Dev. Biol. 1
24:248-258(1987)）。クラムのサイクリンｍＲＮＡが、
カエルの卵母細胞を活性化し、これらの細胞をＭ期に導
入することができることから、サイクリンは、受動的と
いうよりも、能動的に、細胞分裂の調節に関与している
ことが明らかとなった（Swenson, K.I.ら, Cell 47:867
-870(1986)）。カエルの卵母細胞の活性化は、ＭＰＦと
して知られるＭ期誘導因子の合成を伴う（Masui, Y.と
C.L. Markert, J. Exp. Zool. 177:129-146(1971)；Smi
th, L.D.とR.E. Ecker, Dev. Biol. 25:232-247(197
1)）。ＭＰＦは、プロテインキナーゼであり、その触媒
サブユニットはｃｄｃ２プロテインキナーゼのカエルに
おける相同物である（Dunphy, W.G.ら, Cell 54:423-43
1(1988)；Gautier, J.ら, Cell 54:433-439(1988)；Ari
on, D.ら, Cell 55:371-378(1988)）。これまでに、３
つの型のサイクリンが同定されている：Ｂ、Ａ、及び、
ＣＬＮサイクリンである。Ｂ−型サイクリンは、ｃｄｃ
２プロテインキナーゼの不可欠なサブユニットとして機
能することで、有糸分裂中に働くことが示されている
（Booher, R.とD. Beach, EMBO J. 6:3441-3447(198
7)；Draetta, G.ら, Cell 56:829-838(1989)；Labbe,
J.C.ら, Cell 57:253-263(1989)；Labbe, J.C.ら, EMBO
J. 8;3053-3058(1989)；Meijer, L.ら, EMBO J. 8:2275
-2282(1990)；Gautier,J.ら, Cell 60:487-494(199
0)）。また、Ａ−型サイクリンも、独立にｃｄｃ２キナ
ーゼと結合し、有糸分裂以前の分裂周期初期に機能する
酵素を形成する（Draetta, G.ら, Cell 56:829-838(198
9)；Minshull, J.ら, EMBO J. 9:2865-2875(1990)；Gio
rdano, A.ら, Cell 58:981-990(1989)；Pines, J.とT.
Hunter, Nature 346:760-763(1990)）。これらの２つの
クラスのサイクリンの機能上の違いは、完全にはわかっ
ていない。無脊椎動物と脊椎動物の胚におけるサイクリ
ンの細胞学的及び分子的研究は、特に、子嚢酵母におけ
る遺伝学的研究を伴って行なわれた。分裂酵母では、ｃ
ｄｃ１３遺伝子は、ｃｄｃ２と共に作用して有糸分裂へ
の移行を調節するＢ−型サイクリンをコードする（Booh
er, R.とD. Beach, EMBO J. 6:3441-3447(1987)；Boohe
r, R.とD. Beach, EMBO J. 7:2321-2327(1988)；Hagan,
I.ら, J. Cell Sci. 91:587-595(1988)；Solomon, M.
Cell 54:738-740(1988)；Goebl, M.とB. Byers, Cell 5
4:433-439(1988)；Booher, R.N.ら, Cell 58:485-497(1
989)）。出芽酵母及び分裂酵母での遺伝学的研究から、
ｃｄｃ２（あるいは出芽酵母ではＣＤＣ２８）が、細胞
周期の２つの別個の時点で作用することが明らかとなっ
た：有糸分裂と、いわゆる細胞周期の”開始点”におい
て、である（Hartwell,L.H., J. Mol. Biol., 104:803-
817(1971)；Nurse, P.とY. Bissett, Nature 292:558-5
60(1981)；Piggot, J.R.ら, Nature 298:391-393(198
2)；Reed, S.I.とC. Wittenberg, Proc. Nat. Acad. Sc
i. USA 87:5697-5701(1990)）。出芽酵母では、ＣＤＣ
２８タンパク質の開始機能には、このプロテインキナー
ゼの触媒サブユニットが、構造的にＡ及びＢ−型サイク
リンに関連した補助的なタンパク質と結合することが必
要である。この第三のクラスのサイクリンは、Ｃｌｎク
ラスと呼ばれており、３つの遺伝子が部分的に重複した
遺伝子ファミリーを形成していることが報告されている
（Nash, R.ら, EMBO J. 7:4335-4346(1988)；Hadwiger,
J.A.ら, Prot. Natl. Acad. Sci. USA 86:6255-6259(1
989)；Richardson, H.E.ら, Cell 59:1127-1133(198
9)）。ＣＬＮ遺伝子は、開始点の実行に必須であり、こ
れがないと、細胞は細胞周期のＧ１期で停止する。ＣＬ
Ｎ１及びＣＬＮ２転写物は、細胞周期を通して量が変動
するが、ＣＬＮ３転写物は変動しない。さらに、Ｃｌｎ
２タンパク質が、そのｍＲＮＡと並行して変動すること
が示されている（Nash, R.ら, EMBO J. 7:4335-4347(19
88)；Cross, F.R., Mol.Cell. Biol. 8:4675-4584(198
8)；Richardson, H.E.ら, Cell 59:1127-1133(1988)；W
ittenberg,ら, 1990）。様々なサイクリンと結合するこ
とによってｃｄｃ２／ＣＤＣ２８に与えられる正確な生
化学的性質は、まだ完全に解明されていない。しかし、
サイクリン変異体の遺伝学的研究から、これらが触媒サ
ブユニットに対して”Ｇ１”及び”Ｇ２”の性質を与え
ることが明示された（Booher, R.とD. Beach, EMBO J.
6:3441-3447(1987)；Nash, R.ら, EMBO J. 7:4335-4347
(1988)；Richardson, H.E.ら, Cell 59:1127-1133(198
8)）。ｃｄｃ２とサイクリンは、胚と酵母中だけではな
く、ヒトの体細胞中でも発見されている。ｃｄｃ／サイ
クリンＢ酵素の機能は、ヒト細胞中でも、その他の型の
細胞と、同一であるようである（Riabowol, K.ら, Cell
57:393-401(1989)）。また、ヒトＡ型サイクリンも、
ｃｄｃ２と結合した状態で発見されている。ＣＬＮ型の
サイクリンは、哺乳細胞中では発見されていない。細胞
周期の調節に関わる因子とそれらの相互作用をよりよく
理解することは、細胞複製と、おそらくその過程の調節
あるいは変化を、よりよく理解することに貢献するであ
ろう。
【０００２】発明の概要 本発明は、以前に報告されたＡ、ＢあるいはＣＬＮ型サ
イクリンに関連するが、別個な、Ｄ−型サイクリンと称
される哺乳類由来の新しいクラスのサイクリンに関する
ものである。詳細には、本発明は、酵母において細胞周
期の開始に必須なＣＬＮ−型遺伝子を代替することがで
きることが示されている遺伝子にコードされる、ヒトサ
イクリンに関するものである。本発明のヒトサイクリン
は、細胞周期の開始に必須なタンパク質を相補し、タン
パク質構造に基づくと、進化樹で、Ａ、ＢあるいはＣＬ
Ｎ型サイクリンとは異なる枝上に位置する。ここでは、
ヒトＤ−型遺伝子ファミリーと称される、Ｄ−型サイク
リンという新しいファミリーに属する３つのメンバーを
説明する。これらは、コード領域全体で平均５７％、サ
イクリンボックスで７８％の同一性を共有する小さな
（３３−３４ＫＤａ）タンパク質をコードする。この新
しいサイクリンファミリーの第一のメンバーであるサイ
クリンＤ１、あるいは、ＣＣＤＮ１は、２９５アミノ酸
残基で、３３，６７０ダルトン（Ｄａ）の推定分子量を
有する。第二のメンバーであるサイクリンＤ２、あるい
は、ＣＣＤＮ２は、２８９アミノ酸残基であり、３３，
０４５ダルトンの推定分子量を有する。これは、染色体
１２ｐのバンドｐ１３にマッピングされている。第三の
メンバーであるサイクリンＤ３、あるいは、ＣＣＤＮ３
は、２９２アミノ酸残基であり、約３２，４８２ダルト
ンの推定分子量を有する。これは、染色体６ｐのバンド
ｐ２１にマッピングされている。ここで説明されている
Ｄ−型サイクリンは、これまでに同定されたうちで、最
小のサイクリンタンパク質である。ここで説明されてい
る３つのサイクリン遺伝子は、全て、同じ位置にイント
ロンが挿入されている。組換え技術を用いて、本発明の
Ｄ−型サイクリンを生産することができる。また、化学
合成、あるいは、これらが天然に存在する供給源から単
離または精製することができる。従って、本発明は、組
換えＤ−型サイクリンと、単離あるいは精製されたＤ−
型サイクリンと、合成Ｄ−型サイクリンとを含む。ま
た、本発明は、哺乳類由来、詳細には、ヒト由来のＤ−
型サイクリンをコードするＤＮＡあるいはＲＮＡと、哺
乳類由来、詳細には、ヒト由来のＤ−型サイクリンに特
異的なポリクローナル及びモノクローナル抗体に関す
る。さらに、本発明は、例えば、その他のＤ−型サイク
リン、あるいは、関連する（しかし、非Ｄ−型の）サイ
クリンなどの、その他のサイクリンをコードする遺伝子
を単離するための方法に関する。また、本発明は、診断
及び治療の側面も有する。例えば、本発明は、組織、及
び、血液、尿、糞便、粘液、唾液などの生物検体中の、
一種のＤ−型サイクリン（あるいは複数のサイクリン）
の存在、及び／あるいは、量を決定する方法に関する。
この方法では、ここに記載されているＤ−型サイクリン
の遺伝子または複数の遺伝子に基づく核酸プローブ、あ
るいは、Ｄ−型サイクリンに特異的な抗体を使用する。
この実施例を用いて、サイクリンレベルあるいは活性が
上昇しているかどうかを調べることによって（活性レベ
ルが上昇していることは、細胞が異常に速い速度で細胞
分裂を行う可能性が高いことを示唆する）、細胞が異常
に速い速度で細胞分裂を行う可能性があるかどうか（す
なわち、細胞が発癌しているか）、を予測することがで
きる。また、本発明は、一種（複数）のＤ−型サイクリ
ン、一種（複数）のＤ−型サイクリンをコードする遺伝
子、あるいは、一種（複数）の転写産物（ＲＮＡ）が、
異常に高レベルであることに基づいて、細胞分裂が異常
に速い速度で起こる可能性を評価する診断方法にも関す
る。さらに、本発明は、細胞中の少なくとも一つのＤ−
型サイクリン、例えば、Ｄ２、Ｄ２あるいはＤ３、の活
性を変化させることによって、細胞分裂を調節する（低
下あるいは上昇させる）方法に関する。詳細には、本発
明は、一種（複数）のＤ−型サイクリンの活性、あるい
は、機能に干渉することによって、細胞分裂の上昇を阻
害するための方法に関する。Ｄ−型サイクリンは（通
常）プロテインキナーゼを活性化するが、この治療方法
では、Ｄ−型サイクリン活性を直接あるいは間接的に阻
害する物質を用いて、Ｄ−型サイクリンのプロテインキ
ナーゼ（例えば、ｐ３４ｃｄｃ２、あるいは、関連のプ
ロテインキナーゼ）活性化力を阻害して、（複数の）Ｄ
−型サイクリンの機能を阻害（部分的にあるいは完全
に）する。このような物質には、アンチ−センス配列、
あるいは、ＤサイクリンをコードするＤＮＡあるいはＲ
ＮＡに結合するその他の転写調節因子；Ｄ−型サイクリ
ン、あるいは、細胞周期を開始するという役割を果たす
ためにＤ−型サイクリンが相互作用、または、結合しな
ければならない分子、に結合する抗体；（複数の）Ｄ−
型サイクリンと結合する物質；（複数の）Ｄ−型サイク
リンを分解、あるいは別の方法で不活性化する物質（例
えば、プロテアーゼ）；Ｄ−型サイクリンがキナーゼの
触媒サブユニットに結合することを妨害する物質（例え
ば、小さな有機分子）、が含まれる。また、本発明の要
旨は、記載の単離方法、診断方法、治療方法に有用な物
質（例えば、オリゴヌクレオチド、抗体、ペプチド）に
関する。
イクリンに関連するが、別個な、Ｄ−型サイクリンと称
される哺乳類由来の新しいクラスのサイクリンに関する
ものである。詳細には、本発明は、酵母において細胞周
期の開始に必須なＣＬＮ−型遺伝子を代替することがで
きることが示されている遺伝子にコードされる、ヒトサ
イクリンに関するものである。本発明のヒトサイクリン
は、細胞周期の開始に必須なタンパク質を相補し、タン
パク質構造に基づくと、進化樹で、Ａ、ＢあるいはＣＬ
Ｎ型サイクリンとは異なる枝上に位置する。ここでは、
ヒトＤ−型遺伝子ファミリーと称される、Ｄ−型サイク
リンという新しいファミリーに属する３つのメンバーを
説明する。これらは、コード領域全体で平均５７％、サ
イクリンボックスで７８％の同一性を共有する小さな
（３３−３４ＫＤａ）タンパク質をコードする。この新
しいサイクリンファミリーの第一のメンバーであるサイ
クリンＤ１、あるいは、ＣＣＤＮ１は、２９５アミノ酸
残基で、３３，６７０ダルトン（Ｄａ）の推定分子量を
有する。第二のメンバーであるサイクリンＤ２、あるい
は、ＣＣＤＮ２は、２８９アミノ酸残基であり、３３，
０４５ダルトンの推定分子量を有する。これは、染色体
１２ｐのバンドｐ１３にマッピングされている。第三の
メンバーであるサイクリンＤ３、あるいは、ＣＣＤＮ３
は、２９２アミノ酸残基であり、約３２，４８２ダルト
ンの推定分子量を有する。これは、染色体６ｐのバンド
ｐ２１にマッピングされている。ここで説明されている
Ｄ−型サイクリンは、これまでに同定されたうちで、最
小のサイクリンタンパク質である。ここで説明されてい
る３つのサイクリン遺伝子は、全て、同じ位置にイント
ロンが挿入されている。組換え技術を用いて、本発明の
Ｄ−型サイクリンを生産することができる。また、化学
合成、あるいは、これらが天然に存在する供給源から単
離または精製することができる。従って、本発明は、組
換えＤ−型サイクリンと、単離あるいは精製されたＤ−
型サイクリンと、合成Ｄ−型サイクリンとを含む。ま
た、本発明は、哺乳類由来、詳細には、ヒト由来のＤ−
型サイクリンをコードするＤＮＡあるいはＲＮＡと、哺
乳類由来、詳細には、ヒト由来のＤ−型サイクリンに特
異的なポリクローナル及びモノクローナル抗体に関す
る。さらに、本発明は、例えば、その他のＤ−型サイク
リン、あるいは、関連する（しかし、非Ｄ−型の）サイ
クリンなどの、その他のサイクリンをコードする遺伝子
を単離するための方法に関する。また、本発明は、診断
及び治療の側面も有する。例えば、本発明は、組織、及
び、血液、尿、糞便、粘液、唾液などの生物検体中の、
一種のＤ−型サイクリン（あるいは複数のサイクリン）
の存在、及び／あるいは、量を決定する方法に関する。
この方法では、ここに記載されているＤ−型サイクリン
の遺伝子または複数の遺伝子に基づく核酸プローブ、あ
るいは、Ｄ−型サイクリンに特異的な抗体を使用する。
この実施例を用いて、サイクリンレベルあるいは活性が
上昇しているかどうかを調べることによって（活性レベ
ルが上昇していることは、細胞が異常に速い速度で細胞
分裂を行う可能性が高いことを示唆する）、細胞が異常
に速い速度で細胞分裂を行う可能性があるかどうか（す
なわち、細胞が発癌しているか）、を予測することがで
きる。また、本発明は、一種（複数）のＤ−型サイクリ
ン、一種（複数）のＤ−型サイクリンをコードする遺伝
子、あるいは、一種（複数）の転写産物（ＲＮＡ）が、
異常に高レベルであることに基づいて、細胞分裂が異常
に速い速度で起こる可能性を評価する診断方法にも関す
る。さらに、本発明は、細胞中の少なくとも一つのＤ−
型サイクリン、例えば、Ｄ２、Ｄ２あるいはＤ３、の活
性を変化させることによって、細胞分裂を調節する（低
下あるいは上昇させる）方法に関する。詳細には、本発
明は、一種（複数）のＤ−型サイクリンの活性、あるい
は、機能に干渉することによって、細胞分裂の上昇を阻
害するための方法に関する。Ｄ−型サイクリンは（通
常）プロテインキナーゼを活性化するが、この治療方法
では、Ｄ−型サイクリン活性を直接あるいは間接的に阻
害する物質を用いて、Ｄ−型サイクリンのプロテインキ
ナーゼ（例えば、ｐ３４ｃｄｃ２、あるいは、関連のプ
ロテインキナーゼ）活性化力を阻害して、（複数の）Ｄ
−型サイクリンの機能を阻害（部分的にあるいは完全
に）する。このような物質には、アンチ−センス配列、
あるいは、ＤサイクリンをコードするＤＮＡあるいはＲ
ＮＡに結合するその他の転写調節因子；Ｄ−型サイクリ
ン、あるいは、細胞周期を開始するという役割を果たす
ためにＤ−型サイクリンが相互作用、または、結合しな
ければならない分子、に結合する抗体；（複数の）Ｄ−
型サイクリンと結合する物質；（複数の）Ｄ−型サイク
リンを分解、あるいは別の方法で不活性化する物質（例
えば、プロテアーゼ）；Ｄ−型サイクリンがキナーゼの
触媒サブユニットに結合することを妨害する物質（例え
ば、小さな有機分子）、が含まれる。また、本発明の要
旨は、記載の単離方法、診断方法、治療方法に有用な物
質（例えば、オリゴヌクレオチド、抗体、ペプチド）に
関する。
【０００３】発明の詳細な説明 ここでは、Ｄ−型サイクリンと称される、新しいクラス
の哺乳類サイクリンタンパク質が同定、単離され、細胞
周期の開始のための制御因子として機能することが示さ
れたことについて説明する。Ｄ−型サイクリンは、細胞
周期の開始に活性が必須であるプロテインキナーゼを活
性化することにより、既知のサイクリンタンパク質の機
能を果たす。このＧ１期の出来事によって、細胞は、細
胞分裂を行うよう方向付けられる。詳細には、ヒトのＤ
−型サイクリンタンパク質と、それらをコードする遺伝
子が同定され、単離された。そして、これらが、酵母で
細胞周期の開始に必須であることが知られているＣＬＮ
型サイクリンを代替可能であることが示された。また、
ＣＣＤＮ２とＣＣＤＮ３の染色体上の座位を決定した。
その結果、新しいクラスのサイクリン（Ｄ型）と、前記
新規なＤ−型サイクリンをコードするＤＮＡ及びＲＮＡ
と、Ｄ−型サイクリンに特異的な（結合する）抗体が提
供される。また、これらを用いて、生物検体中でその他
のサイクリンを同定したり、そのようなタンパク質及び
オリゴヌクレオチドを検出する方法、異常に速い速度で
起こる細胞分裂の阻害や、サイクリン阻害剤の同定を行
う方法が提供される。ヒトＤ−型サイクリンの同定と性
質、及び、これらの新規なサイクリンとその関連物の使
用法について、下記に説明する。
の哺乳類サイクリンタンパク質が同定、単離され、細胞
周期の開始のための制御因子として機能することが示さ
れたことについて説明する。Ｄ−型サイクリンは、細胞
周期の開始に活性が必須であるプロテインキナーゼを活
性化することにより、既知のサイクリンタンパク質の機
能を果たす。このＧ１期の出来事によって、細胞は、細
胞分裂を行うよう方向付けられる。詳細には、ヒトのＤ
−型サイクリンタンパク質と、それらをコードする遺伝
子が同定され、単離された。そして、これらが、酵母で
細胞周期の開始に必須であることが知られているＣＬＮ
型サイクリンを代替可能であることが示された。また、
ＣＣＤＮ２とＣＣＤＮ３の染色体上の座位を決定した。
その結果、新しいクラスのサイクリン（Ｄ型）と、前記
新規なＤ−型サイクリンをコードするＤＮＡ及びＲＮＡ
と、Ｄ−型サイクリンに特異的な（結合する）抗体が提
供される。また、これらを用いて、生物検体中でその他
のサイクリンを同定したり、そのようなタンパク質及び
オリゴヌクレオチドを検出する方法、異常に速い速度で
起こる細胞分裂の阻害や、サイクリン阻害剤の同定を行
う方法が提供される。ヒトＤ−型サイクリンの同定と性
質、及び、これらの新規なサイクリンとその関連物の使
用法について、下記に説明する。
【０００４】ヒトサイクリンＤ１、Ｄ２、Ｄ３の単離と
性質 図１に図示し、例１で詳細に説明するように、３つのＣ
ＬＮ遺伝子のうちの２つ（ＣＬＮ１及びＣＬＮ２）が不
活性であり、第３のＣＬＮ遺伝子の発現が条件的である
ような酵母の変異株を用いて、酵母をＣＬＮ欠損からレ
スキューするような、ヒトｃＤＮＡクローンを同定し
た。酵母発現ベクター（ｐＡＤＮＳ）内に組み込まれた
ヒト神経膠芽細胞種ｃＤＮＡライブラリーを、前記酵母
変異株に導入した。ＣＬＮ遺伝子の機能が３つとも欠損
しているにも関わらず増殖し、かつ、復帰突然変異株で
はないような、酵母の形質転換株２株（ｐＣＹＣＤ１−
２１及びｐＣＹＣＤ１−１９）を同定し、Ｅ．ｃｏｌｉ
中に回収した。これらを酵母に再び導入すると、どちら
も変異株（ＣＬＮ欠損株）をレスキューした。しかし、
レスキューの効率は低く、レスキューされた株の増殖は
比較的悪かった。ｐＣＹＣＤ１−１９及びｐＣＹＣＤ１
−２１は、制限マッピングと、部分的なＤＮＡ配列分析
によって、同じ遺伝子を表す別個のクローンであること
が示された。完全長のｃＤＮＡクローンを得るために、
ｐＣＹＣＤ１−２１の１．２ｋｂの挿入断片をプローブ
として用いて、ＨｅＬａのｃＤＮＡライブラリーをスク
リーニングした。この方法で同定された９個のポジティ
ブクローンのうちの、最長のクローン（ｐＣＹＣＤ１−
１２；１３２５ｂｐ）について、完全に配列決定を行な
った。前記１．２ｋｂの挿入断片の配列を図２に示す。
この遺伝子の予想されるタンパク質産物は、およそ分子
量３４，０００ダルトンである。例４に示すように、ポ
リメラーゼ連鎖反応と、Ｄ−型サイクリンのよく保存さ
れた３つの領域由来の３つのオリゴヌクレオチドプロー
ブを用いて、サイクリンＤ２及びＤ３ｃＤＮＡを単離し
た。記載の通り、この目的のために、２つの５’オリゴ
ヌクレオチドと、１つの３’縮重オリゴヌクレオチドを
使用した。ＣＣＮＤ２遺伝子のヌクレオチド及びアミノ
酸配列と、コードされているＤ２サイクリンタンパク質
を、図３に示す。ＣＣＤＮ３遺伝子のヌクレオチド及び
アミノ酸配列と、コードされているＤ３サイクリンタン
パク質を、図４に示す。ブダペスト条約の合意に基づ
き、１９９１年５月１４日に、プラスミドｐＣＹＣ−Ｄ
３をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（ロックビル、メリーランド州）に寄託した。この寄託
に対して、受託番号６８６２０を得た。ＣＹＣＤ１−Ｈ
１２にコードされているタンパク質の配列を、既知のサ
イクリンのタンパク質配列（図５Ａを参照）と比較した
ところ、この新規サイクリンと、Ａ、Ｂ、ＣＬＮ型サイ
クリンとの間には、相同性が見られた。しかし、ＣＹＣ
Ｄ１が、これらの既存のクラスとは異なることも、明ら
かとなった。この新規サイクリン遺伝子及びその産物
が、その他のサイクリン遺伝子と、進化上、どのように
関連しているかを評価するために、既知の全サイクリン
のアミノ酸配列の比較を広範囲で行なった（図５Ｂ及び
例１）。この比較の結果、ＣＹＣＤ１が、ここではサイ
クリンＤと称される、新しいクラスのサイクリンである
ことが示された。例２に示すように、ノーザン分析を用
いて、ヒト細胞中でのサイクリンＤ１の発現を調査し
た。結果として、いくつかの細胞株では、サイクリンＤ
１の発現レベルが非常に低いことが示された。ＣＹＣＤ
１遺伝子の全コード領域を用いて、ＨｅＬａ細胞由来の
ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを検索した。そして、主要な転写物
が２つ存在し、一方がおよそ４．８ｋｂ、もう一方はお
よそ１．７ｋｂであり、分子量の大きい方がより豊富で
あることが示された。様々なｃＤＮＡライブラリーから
単離されたｃＤＮＡのうちのほとんどは、クローンλＣ
ＹＣＤ１−Ｈ１２に非常に類似していることが判明し
た。従って、ノーザンブロットで検出された１．７ｋｂ
の転写物は、図２のヌクレオチド配列に対応すると考え
られる。大きい（４．８ｋｂ）転写物の由来は不明であ
る。例２で説明するように、検出された２種類（４．８
ｋｂ及び１．７ｋｂ）の転写物は、ＣＹＣＤ１（図６）
のポリアデニル化の差異によって生成したと考えられ
る。例３で説明するように、様々な組織及び細胞株にお
けるサイクリンＤ１の特異的な発現を評価した。完全長
のＣＹＣＤ１クローンを得るために、ｃＤＮＡライブラ
リーのスクリーニングを行なったところ、酵母の形質転
換株作成に使用したヒト神経膠芽細胞腫細胞株（Ｕ１１
８ ＭＧ）由来のｃＤＮＡライブラリーからは、他の３
つのｃＤＮＡライブラリー（ヒトＨｅＬａ細胞ｃＤＮ
Ａ、ヒトＴ細胞ｃＤＮＡ、ヒト奇形腫細胞ｃＤＮＡ）よ
りも多くのポジティブが得られることが示された。ノー
ザン及びウエスタン分析を行って、サイクリンＤ１が差
異的に発現されているかを調べた。結果（例３）より、
神経膠芽細胞腫（Ｕ１１８ ＭＧ）細胞では、転写物の
レベルが、ＨｅＬａ細胞よりも、７から１０倍高いこと
が示された。また、ＨｅＬａ及びＵ１１８ ＭＧ細胞中
には、高分子量及び低分子量の転写物が存在することが
示された。抗ＣＹＬ１抗体を用いたウエスタンブロッテ
ィングでは、神経膠芽細胞腫細胞中で、３４ｋｄのポリ
ペプチドが容易に検出された。また、このタンパク質が
ＨｅＬａ細胞中では非常に少なく、２９３細胞中では検
出されないことが示された。Ｕ１１８ ＭＧ及びＨｅＬ
ａ細胞中で同定された、抗ＣＹＬ１抗体に交差反応する
物質の分子量は、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現されたヒトＣＹ
ＣＤ１タンパク質の分子量と同じであった。以上の結果
より、調査した細胞では、サイクリンＤ１が差異的に発
現し、神経由来の細胞で最も高いレベルであることが示
された。また、ここでは（例６）、ｃＤＮＡプローブを
用いてヒトゲノムライブラリーをスクリーニングし、ヒ
トＤ−型サイクリンのゲノムクローン、詳細には、Ｄ
１、Ｄ２、Ｄ３、を単離し、性質を調べたことを説明す
る。サイクリンＤ１、Ｄ２、Ｄ３プロモーターの核酸配
列を、図１１−１３に示す。詳細には、サイクリンＤ１
ｃＤＮＡクローン全体をプローブとして用いて、正常ヒ
ト肝ゲノムライブラリーをスクリーニングし、その結
果、３個のポジティブクローンを得た。これらのクロー
ンのうちの１つ（Ｇ６）は、１１５０ｂｐの上流プロモ
ーター配列と、１９８ｂｐのエクソンと、それに続いて
イントロンを含むＤＮＡ挿入断片を含んでいた。同様の
方法を用いて、ヒトサイクリンＤ２に対応するラムダゲ
ノムクローンと、ヒトサイクリンＤ３に対応するラムダ
ゲノムクローンを単離し、性質を調べた。あるクローン
（γＤ２−Ｇ４）は、２．７ｋｂのＳａｃＩ ＳｍａＩ
断片を含むことが示された（図８Ｂ）。この断片は、Ｄ
２ｃＤＮＡ中（図３）で同定された推定の開始メチオニ
ンコドンの５’側の配列を１６２０ｂｐと、１９５ｂｐ
のエクソンと、それに続く９０７ｂｐの介在配列を含
む。あるクローン（Ｇ９）は、Ｄ３ｃＤＮＡ中（図４）
で同定された推定の開始メチオニンコドンの５’側の配
列を１．８ｋｂと、１９８ｂｐのエクソン１、６８４ｂ
ｐのエクソン２と、８７０ｂｐのイントロンを含むこと
が示された（図８Ｃ）。このように、ここで説明した研
究の結果、サイクリンＤ、あるいは、Ｄ−型サイクリン
と称される新しいクラスの哺乳類サイクリンが同定さ
れ、遺伝子産物（タンパク質）の構造に基づいて、以前
から知られているサイクリンとは異なることが示され
た。この新しいクラスの３つのメンバー、サイクリンＤ
１あるいはＣＣＮＤ１、サイクリンＤ２あるいはＣＣＤ
Ｎ２、サイクリンＤ３あるいはＣＣＤＮ３、と称され
る、を単離し、配列決定を行なった。これらは、酵母で
細胞周期の開始に必須なプロテインキナーゼ（ＣＤＣ２
８）を活性化する際に、別のサイクリン（ＣＬＮ型）の
役割を果たすことが示された。また、サイクリンＤ１遺
伝子は、様々な細胞型で差異的に発現されており、神経
由来の細胞で最も高く発現されいることが示された。
性質 図１に図示し、例１で詳細に説明するように、３つのＣ
ＬＮ遺伝子のうちの２つ（ＣＬＮ１及びＣＬＮ２）が不
活性であり、第３のＣＬＮ遺伝子の発現が条件的である
ような酵母の変異株を用いて、酵母をＣＬＮ欠損からレ
スキューするような、ヒトｃＤＮＡクローンを同定し
た。酵母発現ベクター（ｐＡＤＮＳ）内に組み込まれた
ヒト神経膠芽細胞種ｃＤＮＡライブラリーを、前記酵母
変異株に導入した。ＣＬＮ遺伝子の機能が３つとも欠損
しているにも関わらず増殖し、かつ、復帰突然変異株で
はないような、酵母の形質転換株２株（ｐＣＹＣＤ１−
２１及びｐＣＹＣＤ１−１９）を同定し、Ｅ．ｃｏｌｉ
中に回収した。これらを酵母に再び導入すると、どちら
も変異株（ＣＬＮ欠損株）をレスキューした。しかし、
レスキューの効率は低く、レスキューされた株の増殖は
比較的悪かった。ｐＣＹＣＤ１−１９及びｐＣＹＣＤ１
−２１は、制限マッピングと、部分的なＤＮＡ配列分析
によって、同じ遺伝子を表す別個のクローンであること
が示された。完全長のｃＤＮＡクローンを得るために、
ｐＣＹＣＤ１−２１の１．２ｋｂの挿入断片をプローブ
として用いて、ＨｅＬａのｃＤＮＡライブラリーをスク
リーニングした。この方法で同定された９個のポジティ
ブクローンのうちの、最長のクローン（ｐＣＹＣＤ１−
１２；１３２５ｂｐ）について、完全に配列決定を行な
った。前記１．２ｋｂの挿入断片の配列を図２に示す。
この遺伝子の予想されるタンパク質産物は、およそ分子
量３４，０００ダルトンである。例４に示すように、ポ
リメラーゼ連鎖反応と、Ｄ−型サイクリンのよく保存さ
れた３つの領域由来の３つのオリゴヌクレオチドプロー
ブを用いて、サイクリンＤ２及びＤ３ｃＤＮＡを単離し
た。記載の通り、この目的のために、２つの５’オリゴ
ヌクレオチドと、１つの３’縮重オリゴヌクレオチドを
使用した。ＣＣＮＤ２遺伝子のヌクレオチド及びアミノ
酸配列と、コードされているＤ２サイクリンタンパク質
を、図３に示す。ＣＣＤＮ３遺伝子のヌクレオチド及び
アミノ酸配列と、コードされているＤ３サイクリンタン
パク質を、図４に示す。ブダペスト条約の合意に基づ
き、１９９１年５月１４日に、プラスミドｐＣＹＣ−Ｄ
３をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（ロックビル、メリーランド州）に寄託した。この寄託
に対して、受託番号６８６２０を得た。ＣＹＣＤ１−Ｈ
１２にコードされているタンパク質の配列を、既知のサ
イクリンのタンパク質配列（図５Ａを参照）と比較した
ところ、この新規サイクリンと、Ａ、Ｂ、ＣＬＮ型サイ
クリンとの間には、相同性が見られた。しかし、ＣＹＣ
Ｄ１が、これらの既存のクラスとは異なることも、明ら
かとなった。この新規サイクリン遺伝子及びその産物
が、その他のサイクリン遺伝子と、進化上、どのように
関連しているかを評価するために、既知の全サイクリン
のアミノ酸配列の比較を広範囲で行なった（図５Ｂ及び
例１）。この比較の結果、ＣＹＣＤ１が、ここではサイ
クリンＤと称される、新しいクラスのサイクリンである
ことが示された。例２に示すように、ノーザン分析を用
いて、ヒト細胞中でのサイクリンＤ１の発現を調査し
た。結果として、いくつかの細胞株では、サイクリンＤ
１の発現レベルが非常に低いことが示された。ＣＹＣＤ
１遺伝子の全コード領域を用いて、ＨｅＬａ細胞由来の
ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを検索した。そして、主要な転写物
が２つ存在し、一方がおよそ４．８ｋｂ、もう一方はお
よそ１．７ｋｂであり、分子量の大きい方がより豊富で
あることが示された。様々なｃＤＮＡライブラリーから
単離されたｃＤＮＡのうちのほとんどは、クローンλＣ
ＹＣＤ１−Ｈ１２に非常に類似していることが判明し
た。従って、ノーザンブロットで検出された１．７ｋｂ
の転写物は、図２のヌクレオチド配列に対応すると考え
られる。大きい（４．８ｋｂ）転写物の由来は不明であ
る。例２で説明するように、検出された２種類（４．８
ｋｂ及び１．７ｋｂ）の転写物は、ＣＹＣＤ１（図６）
のポリアデニル化の差異によって生成したと考えられ
る。例３で説明するように、様々な組織及び細胞株にお
けるサイクリンＤ１の特異的な発現を評価した。完全長
のＣＹＣＤ１クローンを得るために、ｃＤＮＡライブラ
リーのスクリーニングを行なったところ、酵母の形質転
換株作成に使用したヒト神経膠芽細胞腫細胞株（Ｕ１１
８ ＭＧ）由来のｃＤＮＡライブラリーからは、他の３
つのｃＤＮＡライブラリー（ヒトＨｅＬａ細胞ｃＤＮ
Ａ、ヒトＴ細胞ｃＤＮＡ、ヒト奇形腫細胞ｃＤＮＡ）よ
りも多くのポジティブが得られることが示された。ノー
ザン及びウエスタン分析を行って、サイクリンＤ１が差
異的に発現されているかを調べた。結果（例３）より、
神経膠芽細胞腫（Ｕ１１８ ＭＧ）細胞では、転写物の
レベルが、ＨｅＬａ細胞よりも、７から１０倍高いこと
が示された。また、ＨｅＬａ及びＵ１１８ ＭＧ細胞中
には、高分子量及び低分子量の転写物が存在することが
示された。抗ＣＹＬ１抗体を用いたウエスタンブロッテ
ィングでは、神経膠芽細胞腫細胞中で、３４ｋｄのポリ
ペプチドが容易に検出された。また、このタンパク質が
ＨｅＬａ細胞中では非常に少なく、２９３細胞中では検
出されないことが示された。Ｕ１１８ ＭＧ及びＨｅＬ
ａ細胞中で同定された、抗ＣＹＬ１抗体に交差反応する
物質の分子量は、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現されたヒトＣＹ
ＣＤ１タンパク質の分子量と同じであった。以上の結果
より、調査した細胞では、サイクリンＤ１が差異的に発
現し、神経由来の細胞で最も高いレベルであることが示
された。また、ここでは（例６）、ｃＤＮＡプローブを
用いてヒトゲノムライブラリーをスクリーニングし、ヒ
トＤ−型サイクリンのゲノムクローン、詳細には、Ｄ
１、Ｄ２、Ｄ３、を単離し、性質を調べたことを説明す
る。サイクリンＤ１、Ｄ２、Ｄ３プロモーターの核酸配
列を、図１１−１３に示す。詳細には、サイクリンＤ１
ｃＤＮＡクローン全体をプローブとして用いて、正常ヒ
ト肝ゲノムライブラリーをスクリーニングし、その結
果、３個のポジティブクローンを得た。これらのクロー
ンのうちの１つ（Ｇ６）は、１１５０ｂｐの上流プロモ
ーター配列と、１９８ｂｐのエクソンと、それに続いて
イントロンを含むＤＮＡ挿入断片を含んでいた。同様の
方法を用いて、ヒトサイクリンＤ２に対応するラムダゲ
ノムクローンと、ヒトサイクリンＤ３に対応するラムダ
ゲノムクローンを単離し、性質を調べた。あるクローン
（γＤ２−Ｇ４）は、２．７ｋｂのＳａｃＩ ＳｍａＩ
断片を含むことが示された（図８Ｂ）。この断片は、Ｄ
２ｃＤＮＡ中（図３）で同定された推定の開始メチオニ
ンコドンの５’側の配列を１６２０ｂｐと、１９５ｂｐ
のエクソンと、それに続く９０７ｂｐの介在配列を含
む。あるクローン（Ｇ９）は、Ｄ３ｃＤＮＡ中（図４）
で同定された推定の開始メチオニンコドンの５’側の配
列を１．８ｋｂと、１９８ｂｐのエクソン１、６８４ｂ
ｐのエクソン２と、８７０ｂｐのイントロンを含むこと
が示された（図８Ｃ）。このように、ここで説明した研
究の結果、サイクリンＤ、あるいは、Ｄ−型サイクリン
と称される新しいクラスの哺乳類サイクリンが同定さ
れ、遺伝子産物（タンパク質）の構造に基づいて、以前
から知られているサイクリンとは異なることが示され
た。この新しいクラスの３つのメンバー、サイクリンＤ
１あるいはＣＣＮＤ１、サイクリンＤ２あるいはＣＣＤ
Ｎ２、サイクリンＤ３あるいはＣＣＤＮ３、と称され
る、を単離し、配列決定を行なった。これらは、酵母で
細胞周期の開始に必須なプロテインキナーゼ（ＣＤＣ２
８）を活性化する際に、別のサイクリン（ＣＬＮ型）の
役割を果たすことが示された。また、サイクリンＤ１遺
伝子は、様々な細胞型で差異的に発現されており、神経
由来の細胞で最も高く発現されいることが示された。
【０００５】本発明の使用法 ここに説明されている方法と材料を用いて、その他のサ
イクリン（細胞周期の開始に必須な遺伝子を代替するＤ
ＮＡあるいはＲＮＡ）をコードする遺伝子（ＤＮＡある
いはＲＮＡ）を同定することが可能である。この方法
は、ヒトあるいはヒト以外由来の、サイクリンＤクラ
ス、あるいは、その他の（非Ｄ−型）サイクリンに属す
るその他のメンバーを同定するために、使用することが
できる。これは、例えば、例１に説明されているよう
に、ＣＬＮを条件的に発現するような出芽酵母の菌株を
用いて、その他のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニン
グすることによって行うことができる。あるいは、ある
遺伝子がサイクリンの発現を代替する能力を持つかを評
価できるような、その他の変異株を用いて、サイクリン
の相同物を同定することができる。この方法は、ここで
説明するように、特に例１と図１に示すようにして、行
うことができる。適切な酵母ベクター（例えばｐＡＤＮ
Ｓ）に組み込まれたｃＤＮＡライブラリーを、ここに記
載されているような（例１及び実験方法）酵母の変異株
に導入する。使用される株は、改変されたＣＬＮ遺伝子
を含む。ここに記載した特定の菌株の場合は、ＣＬＮ１
及びＣＬＮ２遺伝子が挿入変異によって不活性化されて
おり、また、ＣＬＮ３遺伝子の改変によって、これがガ
ラクトース誘導性・グルコース抑制性のプロモーターか
ら条件的に発現するようになっている。実施例では、こ
のプロモーターは、ガラクトース誘導性・グルコース抑
制性のプロモーターであるが、その他のプロモーターを
用いることもできる。発現ベクター内のｃＤＮＡライブ
ラリーで形質転換した酵母の変異株を、グルコース含有
培地上での増殖能力によって、スクリーニングした。ガ
ラクトースを含有する培地上では、ＣＬＮ３遺伝子が発
現され、ＣＬＮ１及びＣＬＮ２がないにも関わらず、細
胞の生存能力が維持される。グルコースを含有する培地
上では、全てのＣＬＮ機能が失われるため、酵母細胞
は、細胞周期のＧ１期で停止する。従って、酵母の形質
転換株が、グルコース含有培地上で増殖できるというこ
とは、その形質転換株中に、細胞周期の開始に必須な遺
伝子の機能を代替できるＤＮＡが存在することを示して
いる。必ずしも必要ではないが、これは、選択マーカー
（ｐＡＤＮＳ中には、ＬＥＵ２マーカーが存在する）を
有する発現ベクター、例えばｐＡＤＮＳ、を用いること
で確認することができる。プラスミドの安定性を確認す
ることにより、グルコース含有培地上での増殖能力が、
復帰突然変異の結果であるか、あるいは、ＤＮＡ機能の
存在（細胞周期の開始に必須であり、発現していない、
あるいは、機能していない酵母遺伝子を代替するＤＮＡ
の導入）の結果であるかどうかが示される。この方法を
用いて、形質転換株をグルコース上で増殖させた時のＣ
ＬＮ３機能の代替能力によって、全ての型のサイクリン
（Ｄ型、非Ｄ型）を同定することができる。その他のサ
イクリン遺伝子を同定するために、ここに開示されてい
るヒトＤ−型サイクリンＤＮＡの全体あるいは一部をプ
ローブとして用いて、その他のｃＤＮＡあるいはゲノム
ライブラリーをスクリーニングすることができる。例え
ば、それぞれ図２−４の、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３ｃＤＮＡ配
列の全体あるいは一部、あるいは、ここに記載されてい
る対応するゲノム配列の全体あるいは一部を、プローブ
として用いることができる。ハイブリッド形成条件は、
望ましいように変更可能であり、その結果、同定される
配列の、プローブ配列に対する相補性は、高くなった
り、低くなったりする（すなわち、もし、より厳しい、
あるいは、より緩い条件を用いると）。さらに、ＣＹＬ
１や、Ｄ１、Ｄ３あるいはその他のヒトＤ−型サイクリ
ンに対して作成された抗体を用いて、サイクリンをコー
ドすると考えられるＤＮＡを含むベクターで形質転換さ
れた適切な宿主細胞内で生産されたその他の組換えＤ−
型サイクリンを、検出することができる。ここに記載さ
れている研究に基づいて、組織由来の細胞、あるいは、
血液、尿、糞便、粘液、唾液などの生物検体中の、Ｄ−
型サイクリンの発現の変化、あるいは、細胞分裂速度の
上昇を検出することができる。これは、診断、及び、予
後診断の目的で使用できる可能性がある。なぜならば、
例えば、サイクリン遺伝子発現の変化と、細胞のトラン
スフォーメーション、あるいは、細胞の異常な増殖との
間には、何らかの関連があると考えられるからである。
例えば、以前のいくつかの報告では、変化したヒトサイ
クリンＡが、発ガン性に機能することが示唆されてい
る。ヒトサイクリンＡ遺伝子は、肝細胞癌において、Ｂ
型肝炎ウイルス組み込みの標的であることが発見されて
いる（Wand, J.ら, Nature 343:555-557(1990)）。ま
た、サイクリンＡは、ウイルスに感染した細胞中で、ア
デノウイルスＥ１Ａと結合することが示されている（Gi
ordano, A.ら, Cell 58:981-990(1989); Pines, J.とT.
Hunter, Nature 346:760-736(1990)）。さらに、サイ
クリンＤ１遺伝子と同じ配列を有するＰＲＡＤ１遺伝子
は、染色体１１ｑ１３の異常とともに、様々な腫瘍（た
とえば、上皮小体新生物、ヒト乳癌、扁平上皮癌）の形
成において、重要な役割を果たしている可能性がある。
特に、ＣＣＤＮ１（ＰＲＡＤ１）が、ＢＣＬ１癌遺伝子
の候補として同定されたことは、サイクリン遺伝子の発
癌能力を示す最も直接的な証拠を提供する。また、これ
は、Ｄ−型サイクリンのその他のメンバーが、発癌に関
与している可能性を示唆する。これに関して、ＣＣＤＮ
２及びＣＣＤＮ３の染色体上の座位が、それぞれ、１２
ｐ１３と、６ｐ２１であることを決定した。領域１２ｐ
１３は、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄単球性白血
病、急性骨髄性白血病などの疾患の、特定の免疫表現型
に関係する、複数の転移部位を含む。特に、染色体１２
［１（１２ｐ）］短腕の同腕染色体は、ヒトの固形腫瘍
で一貫して見られる数少ない染色体異常であり、成人精
巣生殖細胞腫瘍の９０％で観察される。一方、領域６ｐ
２１は、ＨＬＡ（ヒト白血球会合）複合体の遺伝子座で
あり、ヒトのゲノム中で最もよく性質が調べられている
領域の一つである。これまでに、多くの疾患がＫＬＡ複
合体に関連づけられてきたが、これらの疾患のうちで、
病因が完全にわかっているものは、ほとんどない。サイ
クリンＤ２及びＤ３の分子クローニングと染色体上の座
位決定を行うことで、このような転移に、これらが直接
関与しているかどうか、そして、もし関与している場合
には、これらが活性化されているかを、決定することが
できる。これらの関与が証明された場合には、ここに説
明されている診断及び治療方法を用いて、個人の病態
や、そのような転移に関連して、あるいは、その結果と
して、何らかの状態が発生する可能性を評価することが
でき、また、治療効果の監視（細胞増殖に対する薬剤あ
るいは薬剤類の効果を評価することにより）や、治療を
提供することができる。本発明は、サイクリンＤ１、Ｄ
２、Ｄ３、あるいは、その他のＤ−型サイクリンなど
の、サイクリン遺伝子の発現変化を検出するための、診
断方法を含む。この方法を用いて、細胞内、あるいは、
生物検体中の発現変化を検出することができる。ここに
示すように、サイクリンＤ遺伝子の間では、配列の相同
性が高い。このことは、細胞周期を調節する際に、Ｄ−
型サイクリンの他のメンバーも、同様の機構を使用して
いる可能性を示唆する（例えば、同じ触媒サブユニット
に結合する、同じ基質に作用する）。マウス及びヒト細
胞の双方で、細胞特異的な差異的な発現が見られること
より、異なる細胞系統あるいは異なる組織では、非常に
類似の機能を行うために異なるＤ−型サイクリンが使用
されており、転移あるいはその他の変異の結果としてサ
イクリンＤ遺伝子の組織特異的発現が変化することが、
異常な細胞増殖に寄与している、と示唆することは合理
的であると考えられる。ここで説明するように、サイク
リンＤは、分析した組織で差異的に発現している。詳細
には、神経由来の細胞（例えば、神経膠芽細胞腫細胞）
で、最も高いレベルで発現されていることが示された。
ここで説明する研究の結果、Ｄ−型サイクリンの発現を
検出、及び／あるいは、定量することができ、その結果
を、細胞増殖が正常か、異常か（例えば、異常に速い速
度の）、の指標として利用することができる。差異的な
発現（様々な細胞型内、あるいは、Ｄサイクリンの１つ
あるいは複数の型の発現）を調べることも可能である。
本発明の診断方法では、個人から入手した細胞を加工し
て、その中の核酸配列が、相補的な核酸配列とハイブリ
ッドを形成できるようにする。Ｄ１、Ｄ２、及び／ある
いは、Ｄ３サイクリン（あるいはその他のＤ−型サイク
リン遺伝子）の配列の、全体あるいは一部分を、プロー
ブとして使用することができる。そのようなプローブ
は、Ｄ−型サイクリンの一部分でもよい。そのような部
分は、検体中の相補的な配列とハイブリッドを形成する
ために充分な長さであり、使用条件でハイブリッド形成
を維持し、一般的に、少なくとも６ヌクレオチド長でな
ければならない。ハイブリッド形成は、既知の技術を用
いて検出される（例えば、放射性標識、あるいは、蛍光
標識オリゴヌクレオチドプローブを用いた場合は、標識
されたハイブリッド複合体を測定する）。ハイブリッド
形成が起こった程度を定量する。Ｄ−型サイクリン遺伝
子レベルの上昇は、細胞分裂の可能性が上昇したことの
指標である。あるいは、既知の技術とＤ−型サイクリン
に特異的な抗体を利用することにより、細胞内、特定の
細胞型内、あるいは、体液中に、Ｄ−型サイクリン（あ
るいは複数のサイクリン）がどの程度存在するかを決定
することができる。第３の診断方法では、Ｄ−型サイク
リンが通常あるいは典型的に結合するプロテインキナー
ゼと、Ｄ−型サイクリンの複合体形成を、外来の基質、
たとえばヒストンＨ１を基質として用いて、評価するこ
とができる。Arion, D.ら, Cell, 55:371-378(1988)。
どの診断方法においても、分析した細胞や体液から得ら
れた結果と、適切な対照（例えば、正常なＤ−型サイク
リンレベル及び／あるいは活性を有することが知られて
いる同じ型の細胞。あるいは、正常なＤ−型サイクリン
レベル及び／あるいは活性を有することが知られている
個人から入手した同じ体液。）から得られた結果との比
較を行う。Ｄ−型サイクリンレベル、及び／あるいは、
活性の上昇は、異常な細胞増殖あるいは発癌の可能性が
高いこと、あるいは、異常な増殖あるいは発癌が実際に
起こっていること、の指標である。また、一組のプロー
ブ（例えば、一組の核酸プローブ、あるいは、一組の抗
体）を用いることで、細胞あるいは組織中で、一種以上
のサイクリン（例えば、Ａ、Ｂ、及び／あるいは、Ｄ）
を検出することが可能である。この一組のプローブの構
成成分は、それぞれ特定のサイクリンを認識して結合
し、分析した細胞あるいは組織内における２種あるいは
それ以上のサイクリンに関する情報を、ひとまとめにし
て提供する。そのようなプローブもまた、本発明の主題
である。一般には、それらは、検出可能なように標識さ
れている（例えば、放射性標識、蛍光物質、ビオチンあ
るいは結合対のその他の成分、あるいは、酵素によっ
て）。細胞分裂の阻害、詳細には、さもなければ異常に
速い速度で起こるような細胞分裂の阻害、も可能であ
る。例えば、細胞内に、プロテインキナーゼ−Ｄ−型サ
イクリン複合体の形成を直接あるいは間接的に阻害し
て、プロテインキナーゼの活性化を阻害することができ
る薬剤あるいはその他の物質を導入することによって、
細胞増殖の上昇を抑制、あるいは、防止することができ
る。ある実施態様では、例えば、Ｄ−型サイクリンＤＮ
Ａ及び／あるいはＲＮＡの、転写及び／あるいは翻訳を
防止することによって、間接的に複合体形成を阻害する
ことができる。これは、細胞内にアンチセンスオリゴヌ
クレオチドを導入することによって行うことができる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞内で、サイク
リンをコードする核酸配列とハイブリッドを形成し、そ
れらがそれ以上加工されることを防止する。また、必須
なＤ−型転写因子を妨害することによって、サイクリン
の発現を阻害することも可能である。細胞周期と細胞増
殖の調節において、サイクリン遺伝子の転写が重要な役
割を果たしており、また、サイクリンｍＲＮＡレベルの
変動が細胞分裂の調節において重大である、と考えるの
には理由がある。Ｇ１期とは、外因及び内因に反応し
て、細胞が新しく細胞分裂を行うように方向付けられる
時期である。従って、Ｇ１サイクリンの発現を調節する
転写因子は、細胞増殖の調節において必ず重要である。
転写因子を調節することは、Ｄ−型サイクリンの活性に
影響を与えることができる、１つの方法である。その結
果、転写因子の機能を阻害あるいは防止すると、Ｄ−型
サイクリンの活性が減少する。あるいは、例えば、プロ
テアーゼ、あるいは、サイクリンの分解を促進する物質
を細胞内へ導入することによって、Ｄ−型サイクリンを
分解して、複合体形成を間接的に防止することができ
る。どちらの場合も、この方法を行わない場合よりも、
有効なＤ−型サイクリン量が減少し、効果は間接的であ
る。別の実施態様では、プロテインキナーゼあるいはＤ
−型サイクリンに結合する、あるいは、サイクリンが活
性化するプロテインキナーゼとサイクリンとの間の物理
的結合に干渉する（例えば、挿入によって）、あるい
は、プロテインキナーゼの触媒活性を破壊するような、
薬剤あるいはその他の物質を、細胞内に導入することに
よって、プロテインキナーゼ−Ｄ−型サイクリン複合体
の形成を、より直接的な方法で防止することができる。
これは、この酵素あるいはサイクリンに結合する抗体を
用いて行うことができる。あるいは、内因性のＤ−型サ
イクリンのようにプロテインキナーゼに結合するが、そ
れが結合してもこの酵素が活性化されない、あるいは、
この酵素の不活性化あるいは分解がおこるような、ペプ
チドあるいは低分子量の有機化合物を用いて行うことが
できる。このような目的で使用されるペプチドあるいは
小さな有機化合物は、Ｄ−型サイクリンのアミノ酸分析
に基づいて、結合に必要な残基を含み、存在すると活性
化に結びつくような残基を除くように、デザインされ
る。これは、例えば、結合部位を系統的にマッピングし
て、活性化に必要な部位を認識あるいは結合するが、活
性化を起こさないような分子をデザインすることによっ
て行うことができる。ここで説明するように、組織内で
は、Ｄ−型サイクリンが差異的に発現されている。従っ
て、特定の型の（あるいは複数の型の）Ｄサイクリンの
活性、及び／あるいは、発現レベルを干渉（阻害）する
ようにデザインされた薬剤（例えば、抗体、あるいは、
アンチセンスあるいはその他の核酸分子）を用いること
によって、細胞の細胞分裂活性を選択的に減少させるこ
とが可能である。例えば、中枢神経系、あるいは、その
他の非造血組織の腫瘍を治療する際には、サイクリンＤ
１を特異的に阻害する薬剤が特に有効ではないかと期待
されている。なぜならば、Ｄ１は、差異的に発現するこ
とが示されているからである（神経由来の細胞で、特に
高レベルで発現されている）。また、既知の方法を用い
て、本発明のＤ−型サイクリンに特異的に反応する抗体
を作成することができる。例えば、抗血清を入手したい
Ｄ−型サイクリンを、適切な宿主（例えば、ウサギ、マ
ウス、ラット、ブタ）に注射して、抗体が形成されるた
めに充分な時間がたった後、宿主生物から血液を回収す
ることによって、抗Ｄ−型サイクリン抗血清を作成する
ことができる。既知の方法を使って、モノクローナル抗
体を作成することもできる。Sambrook, J.ら, Molecula
r Cloning: A Laboratory Manual, コールド・スプリン
グ・ハーバー・ラボラトリー、コールド・スプリング・
ハーバー、ニューヨーク州 (1989)。本発明は、また、
化合物あるいは分子を、サイクリン、特にＤ−型サイク
リンの機能を阻害あるいは抑制する能力に関してスクリ
ーニングする方法を含む。例えば、ここに記載されてい
るような、Ｄ１あるいはＤ３のようなＤ−型サイクリン
を発現する変異細胞を用いることができる。Ｄ−型サイ
クリンを阻害する能力を評価する化合物あるいは分子
を、その化合物あるいは分子が細胞内に入るために適し
た条件で、細胞と接触させる。サイクリンが阻害される
と、その結果、細胞が停止する、あるいは、細胞分裂速
度が減少する。評価する化合物あるいは分子の存在下で
の細胞分裂速度あるいは程度を、適切な対照（例えば、
試験する薬剤を添加していない同じ型の細胞）の細胞分
裂と比較することによって、その化合物あるいは分子
が、サイクリンを阻害できるか、阻害できないか、が示
される。既存の化合物あるいは分子、あるいは、サイク
リンによるプロテインキナーゼの活性化を阻害するよう
に開発された化合物あるいは分子の有効性を、この方法
を用いてスクリーニングすることができる。Ｄ−型サイ
クリンを阻害する薬剤もまた、本発明の主題である。本
発明を、以下の例を用いて説明するが、以下の説明は、
何ら限定的なものではない。
イクリン（細胞周期の開始に必須な遺伝子を代替するＤ
ＮＡあるいはＲＮＡ）をコードする遺伝子（ＤＮＡある
いはＲＮＡ）を同定することが可能である。この方法
は、ヒトあるいはヒト以外由来の、サイクリンＤクラ
ス、あるいは、その他の（非Ｄ−型）サイクリンに属す
るその他のメンバーを同定するために、使用することが
できる。これは、例えば、例１に説明されているよう
に、ＣＬＮを条件的に発現するような出芽酵母の菌株を
用いて、その他のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニン
グすることによって行うことができる。あるいは、ある
遺伝子がサイクリンの発現を代替する能力を持つかを評
価できるような、その他の変異株を用いて、サイクリン
の相同物を同定することができる。この方法は、ここで
説明するように、特に例１と図１に示すようにして、行
うことができる。適切な酵母ベクター（例えばｐＡＤＮ
Ｓ）に組み込まれたｃＤＮＡライブラリーを、ここに記
載されているような（例１及び実験方法）酵母の変異株
に導入する。使用される株は、改変されたＣＬＮ遺伝子
を含む。ここに記載した特定の菌株の場合は、ＣＬＮ１
及びＣＬＮ２遺伝子が挿入変異によって不活性化されて
おり、また、ＣＬＮ３遺伝子の改変によって、これがガ
ラクトース誘導性・グルコース抑制性のプロモーターか
ら条件的に発現するようになっている。実施例では、こ
のプロモーターは、ガラクトース誘導性・グルコース抑
制性のプロモーターであるが、その他のプロモーターを
用いることもできる。発現ベクター内のｃＤＮＡライブ
ラリーで形質転換した酵母の変異株を、グルコース含有
培地上での増殖能力によって、スクリーニングした。ガ
ラクトースを含有する培地上では、ＣＬＮ３遺伝子が発
現され、ＣＬＮ１及びＣＬＮ２がないにも関わらず、細
胞の生存能力が維持される。グルコースを含有する培地
上では、全てのＣＬＮ機能が失われるため、酵母細胞
は、細胞周期のＧ１期で停止する。従って、酵母の形質
転換株が、グルコース含有培地上で増殖できるというこ
とは、その形質転換株中に、細胞周期の開始に必須な遺
伝子の機能を代替できるＤＮＡが存在することを示して
いる。必ずしも必要ではないが、これは、選択マーカー
（ｐＡＤＮＳ中には、ＬＥＵ２マーカーが存在する）を
有する発現ベクター、例えばｐＡＤＮＳ、を用いること
で確認することができる。プラスミドの安定性を確認す
ることにより、グルコース含有培地上での増殖能力が、
復帰突然変異の結果であるか、あるいは、ＤＮＡ機能の
存在（細胞周期の開始に必須であり、発現していない、
あるいは、機能していない酵母遺伝子を代替するＤＮＡ
の導入）の結果であるかどうかが示される。この方法を
用いて、形質転換株をグルコース上で増殖させた時のＣ
ＬＮ３機能の代替能力によって、全ての型のサイクリン
（Ｄ型、非Ｄ型）を同定することができる。その他のサ
イクリン遺伝子を同定するために、ここに開示されてい
るヒトＤ−型サイクリンＤＮＡの全体あるいは一部をプ
ローブとして用いて、その他のｃＤＮＡあるいはゲノム
ライブラリーをスクリーニングすることができる。例え
ば、それぞれ図２−４の、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３ｃＤＮＡ配
列の全体あるいは一部、あるいは、ここに記載されてい
る対応するゲノム配列の全体あるいは一部を、プローブ
として用いることができる。ハイブリッド形成条件は、
望ましいように変更可能であり、その結果、同定される
配列の、プローブ配列に対する相補性は、高くなった
り、低くなったりする（すなわち、もし、より厳しい、
あるいは、より緩い条件を用いると）。さらに、ＣＹＬ
１や、Ｄ１、Ｄ３あるいはその他のヒトＤ−型サイクリ
ンに対して作成された抗体を用いて、サイクリンをコー
ドすると考えられるＤＮＡを含むベクターで形質転換さ
れた適切な宿主細胞内で生産されたその他の組換えＤ−
型サイクリンを、検出することができる。ここに記載さ
れている研究に基づいて、組織由来の細胞、あるいは、
血液、尿、糞便、粘液、唾液などの生物検体中の、Ｄ−
型サイクリンの発現の変化、あるいは、細胞分裂速度の
上昇を検出することができる。これは、診断、及び、予
後診断の目的で使用できる可能性がある。なぜならば、
例えば、サイクリン遺伝子発現の変化と、細胞のトラン
スフォーメーション、あるいは、細胞の異常な増殖との
間には、何らかの関連があると考えられるからである。
例えば、以前のいくつかの報告では、変化したヒトサイ
クリンＡが、発ガン性に機能することが示唆されてい
る。ヒトサイクリンＡ遺伝子は、肝細胞癌において、Ｂ
型肝炎ウイルス組み込みの標的であることが発見されて
いる（Wand, J.ら, Nature 343:555-557(1990)）。ま
た、サイクリンＡは、ウイルスに感染した細胞中で、ア
デノウイルスＥ１Ａと結合することが示されている（Gi
ordano, A.ら, Cell 58:981-990(1989); Pines, J.とT.
Hunter, Nature 346:760-736(1990)）。さらに、サイ
クリンＤ１遺伝子と同じ配列を有するＰＲＡＤ１遺伝子
は、染色体１１ｑ１３の異常とともに、様々な腫瘍（た
とえば、上皮小体新生物、ヒト乳癌、扁平上皮癌）の形
成において、重要な役割を果たしている可能性がある。
特に、ＣＣＤＮ１（ＰＲＡＤ１）が、ＢＣＬ１癌遺伝子
の候補として同定されたことは、サイクリン遺伝子の発
癌能力を示す最も直接的な証拠を提供する。また、これ
は、Ｄ−型サイクリンのその他のメンバーが、発癌に関
与している可能性を示唆する。これに関して、ＣＣＤＮ
２及びＣＣＤＮ３の染色体上の座位が、それぞれ、１２
ｐ１３と、６ｐ２１であることを決定した。領域１２ｐ
１３は、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄単球性白血
病、急性骨髄性白血病などの疾患の、特定の免疫表現型
に関係する、複数の転移部位を含む。特に、染色体１２
［１（１２ｐ）］短腕の同腕染色体は、ヒトの固形腫瘍
で一貫して見られる数少ない染色体異常であり、成人精
巣生殖細胞腫瘍の９０％で観察される。一方、領域６ｐ
２１は、ＨＬＡ（ヒト白血球会合）複合体の遺伝子座で
あり、ヒトのゲノム中で最もよく性質が調べられている
領域の一つである。これまでに、多くの疾患がＫＬＡ複
合体に関連づけられてきたが、これらの疾患のうちで、
病因が完全にわかっているものは、ほとんどない。サイ
クリンＤ２及びＤ３の分子クローニングと染色体上の座
位決定を行うことで、このような転移に、これらが直接
関与しているかどうか、そして、もし関与している場合
には、これらが活性化されているかを、決定することが
できる。これらの関与が証明された場合には、ここに説
明されている診断及び治療方法を用いて、個人の病態
や、そのような転移に関連して、あるいは、その結果と
して、何らかの状態が発生する可能性を評価することが
でき、また、治療効果の監視（細胞増殖に対する薬剤あ
るいは薬剤類の効果を評価することにより）や、治療を
提供することができる。本発明は、サイクリンＤ１、Ｄ
２、Ｄ３、あるいは、その他のＤ−型サイクリンなど
の、サイクリン遺伝子の発現変化を検出するための、診
断方法を含む。この方法を用いて、細胞内、あるいは、
生物検体中の発現変化を検出することができる。ここに
示すように、サイクリンＤ遺伝子の間では、配列の相同
性が高い。このことは、細胞周期を調節する際に、Ｄ−
型サイクリンの他のメンバーも、同様の機構を使用して
いる可能性を示唆する（例えば、同じ触媒サブユニット
に結合する、同じ基質に作用する）。マウス及びヒト細
胞の双方で、細胞特異的な差異的な発現が見られること
より、異なる細胞系統あるいは異なる組織では、非常に
類似の機能を行うために異なるＤ−型サイクリンが使用
されており、転移あるいはその他の変異の結果としてサ
イクリンＤ遺伝子の組織特異的発現が変化することが、
異常な細胞増殖に寄与している、と示唆することは合理
的であると考えられる。ここで説明するように、サイク
リンＤは、分析した組織で差異的に発現している。詳細
には、神経由来の細胞（例えば、神経膠芽細胞腫細胞）
で、最も高いレベルで発現されていることが示された。
ここで説明する研究の結果、Ｄ−型サイクリンの発現を
検出、及び／あるいは、定量することができ、その結果
を、細胞増殖が正常か、異常か（例えば、異常に速い速
度の）、の指標として利用することができる。差異的な
発現（様々な細胞型内、あるいは、Ｄサイクリンの１つ
あるいは複数の型の発現）を調べることも可能である。
本発明の診断方法では、個人から入手した細胞を加工し
て、その中の核酸配列が、相補的な核酸配列とハイブリ
ッドを形成できるようにする。Ｄ１、Ｄ２、及び／ある
いは、Ｄ３サイクリン（あるいはその他のＤ−型サイク
リン遺伝子）の配列の、全体あるいは一部分を、プロー
ブとして使用することができる。そのようなプローブ
は、Ｄ−型サイクリンの一部分でもよい。そのような部
分は、検体中の相補的な配列とハイブリッドを形成する
ために充分な長さであり、使用条件でハイブリッド形成
を維持し、一般的に、少なくとも６ヌクレオチド長でな
ければならない。ハイブリッド形成は、既知の技術を用
いて検出される（例えば、放射性標識、あるいは、蛍光
標識オリゴヌクレオチドプローブを用いた場合は、標識
されたハイブリッド複合体を測定する）。ハイブリッド
形成が起こった程度を定量する。Ｄ−型サイクリン遺伝
子レベルの上昇は、細胞分裂の可能性が上昇したことの
指標である。あるいは、既知の技術とＤ−型サイクリン
に特異的な抗体を利用することにより、細胞内、特定の
細胞型内、あるいは、体液中に、Ｄ−型サイクリン（あ
るいは複数のサイクリン）がどの程度存在するかを決定
することができる。第３の診断方法では、Ｄ−型サイク
リンが通常あるいは典型的に結合するプロテインキナー
ゼと、Ｄ−型サイクリンの複合体形成を、外来の基質、
たとえばヒストンＨ１を基質として用いて、評価するこ
とができる。Arion, D.ら, Cell, 55:371-378(1988)。
どの診断方法においても、分析した細胞や体液から得ら
れた結果と、適切な対照（例えば、正常なＤ−型サイク
リンレベル及び／あるいは活性を有することが知られて
いる同じ型の細胞。あるいは、正常なＤ−型サイクリン
レベル及び／あるいは活性を有することが知られている
個人から入手した同じ体液。）から得られた結果との比
較を行う。Ｄ−型サイクリンレベル、及び／あるいは、
活性の上昇は、異常な細胞増殖あるいは発癌の可能性が
高いこと、あるいは、異常な増殖あるいは発癌が実際に
起こっていること、の指標である。また、一組のプロー
ブ（例えば、一組の核酸プローブ、あるいは、一組の抗
体）を用いることで、細胞あるいは組織中で、一種以上
のサイクリン（例えば、Ａ、Ｂ、及び／あるいは、Ｄ）
を検出することが可能である。この一組のプローブの構
成成分は、それぞれ特定のサイクリンを認識して結合
し、分析した細胞あるいは組織内における２種あるいは
それ以上のサイクリンに関する情報を、ひとまとめにし
て提供する。そのようなプローブもまた、本発明の主題
である。一般には、それらは、検出可能なように標識さ
れている（例えば、放射性標識、蛍光物質、ビオチンあ
るいは結合対のその他の成分、あるいは、酵素によっ
て）。細胞分裂の阻害、詳細には、さもなければ異常に
速い速度で起こるような細胞分裂の阻害、も可能であ
る。例えば、細胞内に、プロテインキナーゼ−Ｄ−型サ
イクリン複合体の形成を直接あるいは間接的に阻害し
て、プロテインキナーゼの活性化を阻害することができ
る薬剤あるいはその他の物質を導入することによって、
細胞増殖の上昇を抑制、あるいは、防止することができ
る。ある実施態様では、例えば、Ｄ−型サイクリンＤＮ
Ａ及び／あるいはＲＮＡの、転写及び／あるいは翻訳を
防止することによって、間接的に複合体形成を阻害する
ことができる。これは、細胞内にアンチセンスオリゴヌ
クレオチドを導入することによって行うことができる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞内で、サイク
リンをコードする核酸配列とハイブリッドを形成し、そ
れらがそれ以上加工されることを防止する。また、必須
なＤ−型転写因子を妨害することによって、サイクリン
の発現を阻害することも可能である。細胞周期と細胞増
殖の調節において、サイクリン遺伝子の転写が重要な役
割を果たしており、また、サイクリンｍＲＮＡレベルの
変動が細胞分裂の調節において重大である、と考えるの
には理由がある。Ｇ１期とは、外因及び内因に反応し
て、細胞が新しく細胞分裂を行うように方向付けられる
時期である。従って、Ｇ１サイクリンの発現を調節する
転写因子は、細胞増殖の調節において必ず重要である。
転写因子を調節することは、Ｄ−型サイクリンの活性に
影響を与えることができる、１つの方法である。その結
果、転写因子の機能を阻害あるいは防止すると、Ｄ−型
サイクリンの活性が減少する。あるいは、例えば、プロ
テアーゼ、あるいは、サイクリンの分解を促進する物質
を細胞内へ導入することによって、Ｄ−型サイクリンを
分解して、複合体形成を間接的に防止することができ
る。どちらの場合も、この方法を行わない場合よりも、
有効なＤ−型サイクリン量が減少し、効果は間接的であ
る。別の実施態様では、プロテインキナーゼあるいはＤ
−型サイクリンに結合する、あるいは、サイクリンが活
性化するプロテインキナーゼとサイクリンとの間の物理
的結合に干渉する（例えば、挿入によって）、あるい
は、プロテインキナーゼの触媒活性を破壊するような、
薬剤あるいはその他の物質を、細胞内に導入することに
よって、プロテインキナーゼ−Ｄ−型サイクリン複合体
の形成を、より直接的な方法で防止することができる。
これは、この酵素あるいはサイクリンに結合する抗体を
用いて行うことができる。あるいは、内因性のＤ−型サ
イクリンのようにプロテインキナーゼに結合するが、そ
れが結合してもこの酵素が活性化されない、あるいは、
この酵素の不活性化あるいは分解がおこるような、ペプ
チドあるいは低分子量の有機化合物を用いて行うことが
できる。このような目的で使用されるペプチドあるいは
小さな有機化合物は、Ｄ−型サイクリンのアミノ酸分析
に基づいて、結合に必要な残基を含み、存在すると活性
化に結びつくような残基を除くように、デザインされ
る。これは、例えば、結合部位を系統的にマッピングし
て、活性化に必要な部位を認識あるいは結合するが、活
性化を起こさないような分子をデザインすることによっ
て行うことができる。ここで説明するように、組織内で
は、Ｄ−型サイクリンが差異的に発現されている。従っ
て、特定の型の（あるいは複数の型の）Ｄサイクリンの
活性、及び／あるいは、発現レベルを干渉（阻害）する
ようにデザインされた薬剤（例えば、抗体、あるいは、
アンチセンスあるいはその他の核酸分子）を用いること
によって、細胞の細胞分裂活性を選択的に減少させるこ
とが可能である。例えば、中枢神経系、あるいは、その
他の非造血組織の腫瘍を治療する際には、サイクリンＤ
１を特異的に阻害する薬剤が特に有効ではないかと期待
されている。なぜならば、Ｄ１は、差異的に発現するこ
とが示されているからである（神経由来の細胞で、特に
高レベルで発現されている）。また、既知の方法を用い
て、本発明のＤ−型サイクリンに特異的に反応する抗体
を作成することができる。例えば、抗血清を入手したい
Ｄ−型サイクリンを、適切な宿主（例えば、ウサギ、マ
ウス、ラット、ブタ）に注射して、抗体が形成されるた
めに充分な時間がたった後、宿主生物から血液を回収す
ることによって、抗Ｄ−型サイクリン抗血清を作成する
ことができる。既知の方法を使って、モノクローナル抗
体を作成することもできる。Sambrook, J.ら, Molecula
r Cloning: A Laboratory Manual, コールド・スプリン
グ・ハーバー・ラボラトリー、コールド・スプリング・
ハーバー、ニューヨーク州 (1989)。本発明は、また、
化合物あるいは分子を、サイクリン、特にＤ−型サイク
リンの機能を阻害あるいは抑制する能力に関してスクリ
ーニングする方法を含む。例えば、ここに記載されてい
るような、Ｄ１あるいはＤ３のようなＤ−型サイクリン
を発現する変異細胞を用いることができる。Ｄ−型サイ
クリンを阻害する能力を評価する化合物あるいは分子
を、その化合物あるいは分子が細胞内に入るために適し
た条件で、細胞と接触させる。サイクリンが阻害される
と、その結果、細胞が停止する、あるいは、細胞分裂速
度が減少する。評価する化合物あるいは分子の存在下で
の細胞分裂速度あるいは程度を、適切な対照（例えば、
試験する薬剤を添加していない同じ型の細胞）の細胞分
裂と比較することによって、その化合物あるいは分子
が、サイクリンを阻害できるか、阻害できないか、が示
される。既存の化合物あるいは分子、あるいは、サイク
リンによるプロテインキナーゼの活性化を阻害するよう
に開発された化合物あるいは分子の有効性を、この方法
を用いてスクリーニングすることができる。Ｄ−型サイ
クリンを阻害する薬剤もまた、本発明の主題である。本
発明を、以下の例を用いて説明するが、以下の説明は、
何ら限定的なものではない。
【０００６】例 例３のあとに、例１−３の実験方法を示す。
【０００７】例１ ＣＬＮ欠損をレスキューするヒトｃ
ＤＮＡクローンの同定 Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ 内には、３種類のＣｌｎタ
ンパク質が存在する。ＣＬＮ遺伝子のうちのどれか一つ
を破壊しても、増殖には、ほとんど影響しない。しか
し、３つのＣＬＮ遺伝子全部を破壊すると、細胞はＧ１
期で停止する（Richardson, H. E.ら, Cell 59:1127-11
33(1989)）。以下に示すように、酵母の菌株を作成し
た。この菌株は、ＣＬＮ１及びＣＬＮ２遺伝子内に挿入
変異を含み、これらが不活性化されている。残りのＣＬ
Ｎ３遺伝子をさらに改変し、ガラクトース誘導性・グル
コース抑制性のプロモーターＧＡＬ１から条件的に発現
するようにした（図１参照）。この菌株を３０５−１５
ｄ ＃２１と命名する。ガラクトースを含有する培地中
ではＣＬＮ３遺伝子が発現され、ＣＬＮ１及びＣＬＮ２
遺伝子が欠損しているにも関わらず、細胞の生存能力が
保持される（図１）。グルコース含有培地中では、全て
のＣＬＮの機能が失われ、細胞は細胞周期のＧ１期で停
止する。酵母の発現ベクターｐＡＤＮＳ（Colicelli,
J.ら, Pro. Natl. Acad. Sci. USA 86:3599-3603(198
9)）中に組み込まれたヒト神経膠芽細胞腫ｃＤＮＡライ
ブラリーを、この酵母に導入した。このベクターｐＡＤ
ＮＳは、ＬＥＵ２マーカーと、２μ複製開始点と、酵母
アルコール脱水素酵素遺伝子由来のプロモーター及びタ
ーミネーター配列を有する（図１）。およそ３×１０６
個の形質転換株に関して、グルコース含有培地上での増
殖能力について、スクリーニングを行なった。１２日間
インキューベートした後、１２個のコロニーが得られ
た。これらの大部分は、復帰突然変異株であることが判
明した。しかし、プラスミド安定性試験で評価したとこ
ろ、２個については、グルコース上での増殖活性と、Ｌ
ＥＵ２マーカーの保持とが相関した。これらの２個の酵
母形質転換株は、ｐＣＹＣＤ１−２１、及び、ｐＣＹＣ
Ｄ１−１９と称されるプラスミドを含んでいた（下記参
照）。双方をＥ．ｃｏｌｉ内に回収した。酵母に再び導
入すると、このプラスミドはＣＬＮ欠損株をレスキュー
した。しかし、レスキューの効率が悪く、レスキューさ
れた菌株の増殖も比較的悪かった。制限地図と、部分的
なＤＮＡ配列分析より、ｐＣＹＣＤ１−１９とｐＣＹＣ
１−２１は、同じ遺伝子を示す、別個のクローンである
ことが示された。ｐＣＹＣＤ１−２１の１．２ｋｂの挿
入断片をプローブとして用いて、完全長のｃＤＮＡクロ
ーンのために、ヒトＨｅＬａｃＤＮＡライブラリーをス
クリーニングした。およそ２００万個のｃＤＮＡクロー
ンをスクリーニングし、ポジティブを９個得た。これら
のうちの最長のクローンであるｐＣＹＣＤ１−Ｈ１２
（１３２５ｂｐ）を、完全に配列決定した。この配列
は、コード領域内で非常に高いＧＣ含量（６１％）を示
し、ポリＡテイル（６９個のＡ残基）を含んでいた。こ
の遺伝子の推定されるタンパク質産物の分子量は、ヌク
レオチド１４５に位置する読み枠に一致する最初のＡＵ
Ｇコドンから始めて、３３，６７０ダルトンである（図
２）。推定されるタンパク質は、その他のサイクリンに
関連しており（下記参照）、ｐＩ４．９という非常に低
い値を有する（ヒトサイクリンＡの６．４、ヒトサイク
リンＢの７．７、ＣＬＮ１の５．６と比較して）。これ
は、Ｃ末端に酸性残基が高密度に存在することに大きく
起因する。ヌクレオチド１４５の推定開始メチオニンよ
りも５’側には、メチオニンコドンも、停止コドンも存
在しない。このことと、その他のサイクリンと比較し
て、ＣＹＣＤ１にはＮ末端が欠損しているように見える
ことから（詳細には下記参照）、さらに４種類のヒトｃ
ＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、λＣＹＣＤ１
−Ｈ１２クローンが、ｃＤＮＡの完全な５’部分を欠い
ているかどうかを調べた。このスクリーニングで単離さ
れた１００個以上のｃＤＮＡクローンのうち、λＣＹＣ
Ｄ１−Ｈ１２よりも長い５’領域を有するクローンは見
つからなかった。後に、ウエスタンブロット分析によっ
て、クローンＨ１２が完全長をコードする能力を有する
ことを確認した（下記参照）。ヒトサイクリンＡの４９
ｋｄ、ヒトサイクリンＢの５０ｋｄ、Ｓ． ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅのＣＬＮ１の４９ｋｄと比較して、ＣＹＣＤ
１は、これまでに同定されたサイクリンタンパク質の中
で、最小（３４ｋｄ）のものをコードする。Ａ及びＢ型
サイクリンと比較したところ、この違いは、Ａ及びＢ型
サイクリンで同定されている、いわゆる”デストラクシ
ョンボックス”を含む、ほとんど全てのＮ−末端部分を
欠くためであった（Glotzer, M.ら, Nature 349:132-13
8(1991)）。
ＤＮＡクローンの同定 Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ 内には、３種類のＣｌｎタ
ンパク質が存在する。ＣＬＮ遺伝子のうちのどれか一つ
を破壊しても、増殖には、ほとんど影響しない。しか
し、３つのＣＬＮ遺伝子全部を破壊すると、細胞はＧ１
期で停止する（Richardson, H. E.ら, Cell 59:1127-11
33(1989)）。以下に示すように、酵母の菌株を作成し
た。この菌株は、ＣＬＮ１及びＣＬＮ２遺伝子内に挿入
変異を含み、これらが不活性化されている。残りのＣＬ
Ｎ３遺伝子をさらに改変し、ガラクトース誘導性・グル
コース抑制性のプロモーターＧＡＬ１から条件的に発現
するようにした（図１参照）。この菌株を３０５−１５
ｄ ＃２１と命名する。ガラクトースを含有する培地中
ではＣＬＮ３遺伝子が発現され、ＣＬＮ１及びＣＬＮ２
遺伝子が欠損しているにも関わらず、細胞の生存能力が
保持される（図１）。グルコース含有培地中では、全て
のＣＬＮの機能が失われ、細胞は細胞周期のＧ１期で停
止する。酵母の発現ベクターｐＡＤＮＳ（Colicelli,
J.ら, Pro. Natl. Acad. Sci. USA 86:3599-3603(198
9)）中に組み込まれたヒト神経膠芽細胞腫ｃＤＮＡライ
ブラリーを、この酵母に導入した。このベクターｐＡＤ
ＮＳは、ＬＥＵ２マーカーと、２μ複製開始点と、酵母
アルコール脱水素酵素遺伝子由来のプロモーター及びタ
ーミネーター配列を有する（図１）。およそ３×１０６
個の形質転換株に関して、グルコース含有培地上での増
殖能力について、スクリーニングを行なった。１２日間
インキューベートした後、１２個のコロニーが得られ
た。これらの大部分は、復帰突然変異株であることが判
明した。しかし、プラスミド安定性試験で評価したとこ
ろ、２個については、グルコース上での増殖活性と、Ｌ
ＥＵ２マーカーの保持とが相関した。これらの２個の酵
母形質転換株は、ｐＣＹＣＤ１−２１、及び、ｐＣＹＣ
Ｄ１−１９と称されるプラスミドを含んでいた（下記参
照）。双方をＥ．ｃｏｌｉ内に回収した。酵母に再び導
入すると、このプラスミドはＣＬＮ欠損株をレスキュー
した。しかし、レスキューの効率が悪く、レスキューさ
れた菌株の増殖も比較的悪かった。制限地図と、部分的
なＤＮＡ配列分析より、ｐＣＹＣＤ１−１９とｐＣＹＣ
１−２１は、同じ遺伝子を示す、別個のクローンである
ことが示された。ｐＣＹＣＤ１−２１の１．２ｋｂの挿
入断片をプローブとして用いて、完全長のｃＤＮＡクロ
ーンのために、ヒトＨｅＬａｃＤＮＡライブラリーをス
クリーニングした。およそ２００万個のｃＤＮＡクロー
ンをスクリーニングし、ポジティブを９個得た。これら
のうちの最長のクローンであるｐＣＹＣＤ１−Ｈ１２
（１３２５ｂｐ）を、完全に配列決定した。この配列
は、コード領域内で非常に高いＧＣ含量（６１％）を示
し、ポリＡテイル（６９個のＡ残基）を含んでいた。こ
の遺伝子の推定されるタンパク質産物の分子量は、ヌク
レオチド１４５に位置する読み枠に一致する最初のＡＵ
Ｇコドンから始めて、３３，６７０ダルトンである（図
２）。推定されるタンパク質は、その他のサイクリンに
関連しており（下記参照）、ｐＩ４．９という非常に低
い値を有する（ヒトサイクリンＡの６．４、ヒトサイク
リンＢの７．７、ＣＬＮ１の５．６と比較して）。これ
は、Ｃ末端に酸性残基が高密度に存在することに大きく
起因する。ヌクレオチド１４５の推定開始メチオニンよ
りも５’側には、メチオニンコドンも、停止コドンも存
在しない。このことと、その他のサイクリンと比較し
て、ＣＹＣＤ１にはＮ末端が欠損しているように見える
ことから（詳細には下記参照）、さらに４種類のヒトｃ
ＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、λＣＹＣＤ１
−Ｈ１２クローンが、ｃＤＮＡの完全な５’部分を欠い
ているかどうかを調べた。このスクリーニングで単離さ
れた１００個以上のｃＤＮＡクローンのうち、λＣＹＣ
Ｄ１−Ｈ１２よりも長い５’領域を有するクローンは見
つからなかった。後に、ウエスタンブロット分析によっ
て、クローンＨ１２が完全長をコードする能力を有する
ことを確認した（下記参照）。ヒトサイクリンＡの４９
ｋｄ、ヒトサイクリンＢの５０ｋｄ、Ｓ． ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅのＣＬＮ１の４９ｋｄと比較して、ＣＹＣＤ
１は、これまでに同定されたサイクリンタンパク質の中
で、最小（３４ｋｄ）のものをコードする。Ａ及びＢ型
サイクリンと比較したところ、この違いは、Ａ及びＢ型
サイクリンで同定されている、いわゆる”デストラクシ
ョンボックス”を含む、ほとんど全てのＮ−末端部分を
欠くためであった（Glotzer, M.ら, Nature 349:132-13
8(1991)）。
【０００８】Ｄ１の配列分析とその他のサイクリンとの
比較 配列分析により、ＣＹＣＤ１−Ｈ１２にコードされてい
るタンパク質と、その他のサイクリンとの相同性が明ら
かとなった。しかし、ＣＹＣＤ１が、既存の３つのクラ
スのサイクリン、Ａ、Ｂ及びＣＬＮ、とは異なることは
明らかである。この新しいサイクリンが、その他のサイ
クリンと、進化上、どのように関連するかを調べるため
に、全てのサイクリン遺伝子について、アミノ酸配列の
比較を広範囲に行なった。まず、以前に公表されている
１５個のサイクリンの配列と、ＣＹＣＤ１の配列を、Xi
ongとEickbush（Xiong, Y.とT.H. Eickbush, EMBO J.
9:3353-3362(1990)）によって詳説されている方法を用
いて並べた。挿入／欠失の導入を最小にして、配列間の
相同性が最大となるように、また、可能な限り多くの配
列を含むように努力した。ＣＬＮサイクリンを除いて
は、この整列には約２００個のアミノ酸残基が含まれて
おり、これは、ＣＹＣＤ１の全コード領域の７０％以上
を占める（図５Ａ）。Ａ及びＢ型サイクリンのメンバー
の、並べた領域のＮ−末端側には、保存領域と、いくつ
かの分散した類似点が見られた（Glotzer,M.ら, Nature
349:132-138(1991)）。しかし、これは、ＣＬＮサイク
リン、あるいは、ＣＹＣＤ１及びＣＹＬ１には存在しな
いため、整列中には含まれていない。整列した１７個の
配列を全て対にして比較を行い、パーセント・ダイバー
ジェンスを計算した。それを用いて、ネイーバー・ジョ
イニング法（Saitou, N.とM.Nei, Mol. Biol. Evol. 4:
406-425(1987)、及び、実験方法）により、サイクリン
遺伝子ファミリーの進化樹を作成した。ＣＬＮサイクリ
ンと、その他の３種のサイクリンとの類似性が最も低か
ったため、ＣＬＮサイクリンとその他のサイクリンとの
結合点を、進化樹（図５Ｂ）の根とした。この進化樹か
ら、ＣＹＣＤ１、ＣＹＣＤ２、及び、ＣＹＣＤ３が、サ
イクリンＤと称される新しいクラスのサイクリンである
ことが明らかとなった。
比較 配列分析により、ＣＹＣＤ１−Ｈ１２にコードされてい
るタンパク質と、その他のサイクリンとの相同性が明ら
かとなった。しかし、ＣＹＣＤ１が、既存の３つのクラ
スのサイクリン、Ａ、Ｂ及びＣＬＮ、とは異なることは
明らかである。この新しいサイクリンが、その他のサイ
クリンと、進化上、どのように関連するかを調べるため
に、全てのサイクリン遺伝子について、アミノ酸配列の
比較を広範囲に行なった。まず、以前に公表されている
１５個のサイクリンの配列と、ＣＹＣＤ１の配列を、Xi
ongとEickbush（Xiong, Y.とT.H. Eickbush, EMBO J.
9:3353-3362(1990)）によって詳説されている方法を用
いて並べた。挿入／欠失の導入を最小にして、配列間の
相同性が最大となるように、また、可能な限り多くの配
列を含むように努力した。ＣＬＮサイクリンを除いて
は、この整列には約２００個のアミノ酸残基が含まれて
おり、これは、ＣＹＣＤ１の全コード領域の７０％以上
を占める（図５Ａ）。Ａ及びＢ型サイクリンのメンバー
の、並べた領域のＮ−末端側には、保存領域と、いくつ
かの分散した類似点が見られた（Glotzer,M.ら, Nature
349:132-138(1991)）。しかし、これは、ＣＬＮサイク
リン、あるいは、ＣＹＣＤ１及びＣＹＬ１には存在しな
いため、整列中には含まれていない。整列した１７個の
配列を全て対にして比較を行い、パーセント・ダイバー
ジェンスを計算した。それを用いて、ネイーバー・ジョ
イニング法（Saitou, N.とM.Nei, Mol. Biol. Evol. 4:
406-425(1987)、及び、実験方法）により、サイクリン
遺伝子ファミリーの進化樹を作成した。ＣＬＮサイクリ
ンと、その他の３種のサイクリンとの類似性が最も低か
ったため、ＣＬＮサイクリンとその他のサイクリンとの
結合点を、進化樹（図５Ｂ）の根とした。この進化樹か
ら、ＣＹＣＤ１、ＣＹＣＤ２、及び、ＣＹＣＤ３が、サ
イクリンＤと称される新しいクラスのサイクリンである
ことが明らかとなった。
【０００９】例２ ヒト細胞内でのサイクリンＤ１の発
現 ヒト細胞内でのサイクリンＤ１の発現を、ノーザン分析
を用いて調べた。最初の調査から、いくつかの細胞株で
は、サイクリンＤ１の発現レベルが非常に低いことが示
されていた。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡをＨｅＬａ細胞から調
製し、ＣＹＣＤ１遺伝子の全コード領域を用いて調べ
た。４．８ｋｂ及び１．７ｋｂの、２つの主要転写物が
検出された。高分子量の方がより豊富に存在した。５’
あるいは３’末端が欠損していた数個のｃＤＮＡクロー
ンを除いては、様々な異なるｃＤＮＡライブラリーから
単離されたほとんどのｃＤＮＡクローンは、クローンλ
ＣＹＣＤ１−Ｈ１２に非常に類似していた（図２）。従
って、ノーザン分析で検出された１．７ｋｂの転写物
は、図２のヌクレオチド配列に対応すると考えられる。
４．８ｋｂの大きい転写物の起源を明らかにする目的
で、λＣＹＣＤ１−Ｈ１２クローンの５’及び３’末端
のサブフラグメントを用いて、ｃＤＮＡ及びゲノムライ
ブラリーのスクリーニングを行なった。そして、択一的
な転写開始、ポリアデニル化、及び／あるいは、ｍＲＮ
Ａスプライシングが行われているかを調べた。より長い
ｃＤＮＡクローンを２個、ＨｅＬａ細胞由来のλＣＹＣ
Ｄ１−Ｈ０３４（１．７ｋｂ）とヒト奇形種細胞由来の
λＤＹＤＣ１−Ｔ０７８（４．１ｋｂ）と、さらに、い
くつかのゲノムクローンを単離し、部分的に配列決定を
行なった。λＣＹＣＤ１−Ｈ０３４と、λＤＹＤＣ１−
Ｔ０７８の双方は、５’末端から、λＣＹＣＤ１−Ｈ１
２と同じ配列を有する（図６）。どちらも、ポリアデニ
ル化部位の後ろ側の３’側に、追加の配列を有する点
が、λＣＹＣＤ１−Ｈ１２と異なっている。これらの
３’配列は、λＣＹＣＤ１−Ｈ０３４と、λＤＹＤＣ１
−Ｔ０７８とで同一であるが、後者のクローンではさら
に伸張している（図６）。λＤＹＤＣ１−Ｔ０７８クロ
ーンには、１塩基欠失（Ａ残基）がある。これは多型性
の結果と考えられるが、その他の機構が関与している可
能性を除去することはできない。クローンＴ０７８由来
の、３’末端の余分な配列をプローブとして用いること
により、同じ４．８ｋｂの転写物が検出されたが、１．
７ｋｂの転写物は検出されなかった。ノーザン分析で検
出された２つのｍＲＮＡは、ポリアデニル化の差異によ
って生じると考えられる（図６）。ポリアデニル化は明
らかにおこっているのにも関わらず、奇妙なことに、認
識可能なポリアデニル化配列（ＡＡＵＡＡＡ）は、クロ
ーンλＣＹＣＤ１−Ｈ１２の配列中のどこにも存在しな
い（図２）。ＡＡＵＡＡＡに非常に類似した変異型も存
在しない（ミスマッチ２個以下のものはない）。
現 ヒト細胞内でのサイクリンＤ１の発現を、ノーザン分析
を用いて調べた。最初の調査から、いくつかの細胞株で
は、サイクリンＤ１の発現レベルが非常に低いことが示
されていた。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡをＨｅＬａ細胞から調
製し、ＣＹＣＤ１遺伝子の全コード領域を用いて調べ
た。４．８ｋｂ及び１．７ｋｂの、２つの主要転写物が
検出された。高分子量の方がより豊富に存在した。５’
あるいは３’末端が欠損していた数個のｃＤＮＡクロー
ンを除いては、様々な異なるｃＤＮＡライブラリーから
単離されたほとんどのｃＤＮＡクローンは、クローンλ
ＣＹＣＤ１−Ｈ１２に非常に類似していた（図２）。従
って、ノーザン分析で検出された１．７ｋｂの転写物
は、図２のヌクレオチド配列に対応すると考えられる。
４．８ｋｂの大きい転写物の起源を明らかにする目的
で、λＣＹＣＤ１−Ｈ１２クローンの５’及び３’末端
のサブフラグメントを用いて、ｃＤＮＡ及びゲノムライ
ブラリーのスクリーニングを行なった。そして、択一的
な転写開始、ポリアデニル化、及び／あるいは、ｍＲＮ
Ａスプライシングが行われているかを調べた。より長い
ｃＤＮＡクローンを２個、ＨｅＬａ細胞由来のλＣＹＣ
Ｄ１−Ｈ０３４（１．７ｋｂ）とヒト奇形種細胞由来の
λＤＹＤＣ１−Ｔ０７８（４．１ｋｂ）と、さらに、い
くつかのゲノムクローンを単離し、部分的に配列決定を
行なった。λＣＹＣＤ１−Ｈ０３４と、λＤＹＤＣ１−
Ｔ０７８の双方は、５’末端から、λＣＹＣＤ１−Ｈ１
２と同じ配列を有する（図６）。どちらも、ポリアデニ
ル化部位の後ろ側の３’側に、追加の配列を有する点
が、λＣＹＣＤ１−Ｈ１２と異なっている。これらの
３’配列は、λＣＹＣＤ１−Ｈ０３４と、λＤＹＤＣ１
−Ｔ０７８とで同一であるが、後者のクローンではさら
に伸張している（図６）。λＤＹＤＣ１−Ｔ０７８クロ
ーンには、１塩基欠失（Ａ残基）がある。これは多型性
の結果と考えられるが、その他の機構が関与している可
能性を除去することはできない。クローンＴ０７８由来
の、３’末端の余分な配列をプローブとして用いること
により、同じ４．８ｋｂの転写物が検出されたが、１．
７ｋｂの転写物は検出されなかった。ノーザン分析で検
出された２つのｍＲＮＡは、ポリアデニル化の差異によ
って生じると考えられる（図６）。ポリアデニル化は明
らかにおこっているのにも関わらず、奇妙なことに、認
識可能なポリアデニル化配列（ＡＡＵＡＡＡ）は、クロ
ーンλＣＹＣＤ１−Ｈ１２の配列中のどこにも存在しな
い（図２）。ＡＡＵＡＡＡに非常に類似した変異型も存
在しない（ミスマッチ２個以下のものはない）。
【００１０】例３ 様々な細胞型におけるサイクリンＤ
１の差異的な発現 ＣＹＣＤ１の完全長クローンを得るために、ｃＤＮＡラ
イブラリーをスクリーニングしているときに、酵母の形
質変異株を作成したヒト神経膠芽細胞腫細胞株（Ｕ１１
８ ＭＧ）由来のｃＤＮＡライブラリーからは、その他
の４つのｃＤＮＡライブラリーよりも、多くのポジティ
ブが得られることが明らかとなった。ノーザン及びウエ
スタンブロッティングを行って、サイクリンＤ１が、異
なる組織あるいは細胞株内で、差異的に発現されている
可能性を調べた。全ＲＮＡを、Ｕ１１８ ＭＧから単離
し、ＣＹＣＤ１遺伝子のコード領域をプローブとして用
いて、ノーザンブロットによって分析した。神経膠芽細
胞腫細胞では、Ｈｅｌａ細胞と比較して、転写物のレベ
ルが７から１０倍の高さであった。ＨｅＬａ及びＵ１１
８ ＭＧ細胞の双方で、高分子及び低分子の転写物が両
方とも観察された。Ｕ１１８ ＭＧ細胞中の豊富なＣＹ
ＣＤ１メッセンジャーが、タンパク質レベルに反映され
ているかどうかを調べるために、細胞抽出物を調製し、
マウスＣＹＬ１に対して調製した抗ＣＹＬ１を用いて、
ウエスタンブロッティングを行なった（Matsushime, H.
らより提供）。この抗ＣＹＬ１抗体は、ウエスタンブロ
ッティング上で、ナノグラム量の組換えＣＹＣＤ１を検
出することができた（データ未公開）。また、この抗体
は、免疫沈降とウエスタン分析によって、もとの酵母形
質転換株中のＣＹＣＤ１を検出することもできた。Ｈｅ
Ｌａ、２９３、Ｕ１１８ ＭＧ由来の全細胞抽出物を用
いた最初の実験では、シグナルを得ることができなかっ
た。しかし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとイムノブロッティング
を行う前に、細胞抽出物を前記の血清で免疫沈降したと
ころ、Ｕ１１８ ＭＧ細胞中には、３４ｋｄのポリペプ
チドが容易に検出された。このタンパク質は、ＨｅＬａ
細胞中では豊富というには程遠く、２９３細胞中には検
出できなかった。Ｕ１１８ ＭＧ及びＨｅＬａ由来の、
抗ＣＹＣＬ１交差反応性物質の分子量は、Ｅ．ｃｏｌｉ
中で発現されたヒトＣＹＣＤ１タンパク質の分子量と、
全く同じであった。これから、配列決定を行なったｃＤ
ＮＡクローンが、読み取り枠全体を含むことが示され
た。
１の差異的な発現 ＣＹＣＤ１の完全長クローンを得るために、ｃＤＮＡラ
イブラリーをスクリーニングしているときに、酵母の形
質変異株を作成したヒト神経膠芽細胞腫細胞株（Ｕ１１
８ ＭＧ）由来のｃＤＮＡライブラリーからは、その他
の４つのｃＤＮＡライブラリーよりも、多くのポジティ
ブが得られることが明らかとなった。ノーザン及びウエ
スタンブロッティングを行って、サイクリンＤ１が、異
なる組織あるいは細胞株内で、差異的に発現されている
可能性を調べた。全ＲＮＡを、Ｕ１１８ ＭＧから単離
し、ＣＹＣＤ１遺伝子のコード領域をプローブとして用
いて、ノーザンブロットによって分析した。神経膠芽細
胞腫細胞では、Ｈｅｌａ細胞と比較して、転写物のレベ
ルが７から１０倍の高さであった。ＨｅＬａ及びＵ１１
８ ＭＧ細胞の双方で、高分子及び低分子の転写物が両
方とも観察された。Ｕ１１８ ＭＧ細胞中の豊富なＣＹ
ＣＤ１メッセンジャーが、タンパク質レベルに反映され
ているかどうかを調べるために、細胞抽出物を調製し、
マウスＣＹＬ１に対して調製した抗ＣＹＬ１を用いて、
ウエスタンブロッティングを行なった（Matsushime, H.
らより提供）。この抗ＣＹＬ１抗体は、ウエスタンブロ
ッティング上で、ナノグラム量の組換えＣＹＣＤ１を検
出することができた（データ未公開）。また、この抗体
は、免疫沈降とウエスタン分析によって、もとの酵母形
質転換株中のＣＹＣＤ１を検出することもできた。Ｈｅ
Ｌａ、２９３、Ｕ１１８ ＭＧ由来の全細胞抽出物を用
いた最初の実験では、シグナルを得ることができなかっ
た。しかし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとイムノブロッティング
を行う前に、細胞抽出物を前記の血清で免疫沈降したと
ころ、Ｕ１１８ ＭＧ細胞中には、３４ｋｄのポリペプ
チドが容易に検出された。このタンパク質は、ＨｅＬａ
細胞中では豊富というには程遠く、２９３細胞中には検
出できなかった。Ｕ１１８ ＭＧ及びＨｅＬａ由来の、
抗ＣＹＣＬ１交差反応性物質の分子量は、Ｅ．ｃｏｌｉ
中で発現されたヒトＣＹＣＤ１タンパク質の分子量と、
全く同じであった。これから、配列決定を行なったｃＤ
ＮＡクローンが、読み取り枠全体を含むことが示され
た。
【００１１】実験方法 菌株の作成 親株は、ＢＦ３０５−１５ｄ（ＭＡＴａ ｌｅｕ２−３
ｌｅｕ２−１１２ｈｉｓ３−１１ ｈｉｓ３−１５
ｕｒａ３−５２ ｔｒｐ１ ａｄｅ１ ｍｅｔ１４ ａ
ｒｇ５，６）である（Futcher, B.とJ. Carbon, Mol. C
ell. Biol. 6:2213-2222(1986)）。この菌株を、３段階
で、条件的ｃｌｎ−株に変換した。まず、染色体ＣＬＮ
３遺伝子を、ＧＡＬ１プロモーターの調節下においた。
二方向性のＧＡＬ１０−ＧＡＬ１プロモーターを含む
０．７５ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を、Ｂａｍ
ＨＩ（ＧＡＬ１）末端が、ＣＬＮ３開始コドンの１１０
ヌクレオチド上流に接続するように、ＣＬＮ３遺伝子の
５’末端に融合させた。次に、ＧＡＬ１０プロモーター
からＣＬＮ３の中程まで伸張するＥｃｏＲＩ断片を（Na
sh, R.ら, EMBO J. 7:4335-4346(1988)）、ｐＢＦ３０
のＸｈｏＩとＥｃｏＲＩ部位の間にサブクローニングし
た（Nash, R.ら, EMBO J. 7:4335-4346(1988)）。Ｘｈ
ｏＩ末端とＥｃｏＲＩ末端との連結反応は、末端をクレ
ノウで埋めて、平滑末端連結反応によって行なった（Ｅ
ｃｏＲＩ部位を破壊して）。その結果、通常、ＣＬＮ３
の上流−１１０から−４１１に見られるＤＮＡが、ＧＡ
Ｌ１プロモーターで置きかわった。次に、この新しいｐ
ＢＦ３０誘導体型から、ＥｃｏＲＩからＳｐｈＩまでの
断片を切除した。この断片は、５’及び３’が、ＣＬＮ
３領域と非常に相同であるが、ＣＬＮ３のすぐ上流にＧ
ＡＬ１プロモーターとＵＲＡ３マーカーを有している。
ＢＦ３０５−１５ｄ株をこの断片で形質転換し、Ｕｒａ
＋の形質転換株を選択した。これをサザン分析で確認し
た。さらに、ＧＡＬ１プロモーターが誘導されたとき
と、誘導されていないときとで、細胞の大きさの平均値
を測定した。細胞を１％ラフィノース及び１％ガラクト
ース中で培養して、ＧＡＬ１プロモーターを誘導する
と、細胞体積の平均値は約２５μｍ３（比較として、親
株の細胞体積の平均値は約４０μｍ３である）であり、
一方、プロモーターを誘導しないと（ラフィノースの
み）、あるいは、グルコース存在下で抑制すると、細胞
体積は、野生株よりもずっと大きくなる。これらの実験
から、ＣＬＮ３がＧＡＬ１プロモーターの調節下にある
ことが示された。この細胞では、このＧＡＬ１に調節さ
れたグルコース抑制性の遺伝子が、ＣＬＮ３の唯一の供
給源である、ということに留意することが重要である。
第２に、ＣＬＮ１遺伝子を破壊した。I. FitchよりＣＬ
Ｎ１断片を入手し、これを用いて、ハイブリッド形成に
より、ＣＬＮ１の完全長のクローンを入手し、それをｐ
ＵＣプラスミドにサブクローニングした。ＨＩＳ３遺伝
子を含むＢａｍＨＩ断片を、ＣＬＮ１読み枠中のＮｃｏ
Ｉ部位に挿入した。次に、５’及び３’が、ＣＬＮ１領
域と高い相同性を有するような巨大なＥｃｏＲＩ断片を
切除し、これを用いて、上述したＢＦ３０５−１５ｄ
ＧＡＬ−ＣＬＮ３株を形質転換した。ＹＮＢ−ｈｉｓラ
フィノース・ガラクトース平板上で、形質転換をおこな
った。Ｈｉｓ＋のクローンを選択し、サザン分析で確認
した。最後に、ＣＬＮ２遺伝子を破壊した。I. Fitchよ
りＣＬＮ２断片を入手し、これを用いて、ハイブリッド
形成により、ＣＬＮ２の完全長のクローンを入手し、そ
れをｐＵＣプラスミドにサブクローニングした。ＴＲＰ
１遺伝子を含むＥｃｏＲＩ断片を、ＣＬＮ２読み枠中の
ＳｐｅＩ部位に挿入した。ＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ断片を
切除し、これを用いて、上述のＢＦ３０５−１５ｄ Ｇ
ＡＬ−ＣＬＮＨＩＳ３：：ｃｌｎ１株を形質転換した。
ＹＮＢ−ｔｒｐラフィノース・ガラクトース平板上で、
形質転換をおこなった。Ｔｒｐ＋のクローンを選択し
た。この場合は、ＴＲＰ１断片がＡＲＳ（自律複製配
列）を含むために、形質転換株の多くは、破壊されたＣ
ＬＮ２遺伝子ではなく、自律的に複製するプラスミドを
含んでいた。しかし、形質転換株のうちの数パーセント
は、単純なＴＲＰ１：：ｃｌｎ２破壊株であることが、
表現型分析とサザン分析によって示された。クローン＃
２１と称される、ある特定の３０５−１５ｄ ＧＡＬ１
−ＣＬＮ３ＨＩＳ３：：ｃｌｎ１ ＴＲＰ１：：ｃｌｎ
２形質転換株について、詳細に分析した。この株を１％
ラフィノース及び１％ガラクトース中で生育させると、
この株は、ＣＬＮ野生型の親株と区別できない倍加時間
を有していた。しかし、この株は、ＣＬＮ３過剰発現株
について推定されたとおりに、やや、わい小な表現型を
示した（細胞体積が小さい）。グルコースを添加する
と、あるいは、ガラクトースを除去すると、細胞はＧ１
期に蓄積し、細胞分裂が停止した。しかし、細胞の質量
及び体積は増加し続けた。Ｇ１期に停止した状態で、一
晩、インキュベートした後、出芽した細胞は実質的に観
察されなかった。そして、大部分の細胞は、調節されず
に大きくなったために、溶菌していた。３０５−ｄ１５
＃２１をグルコース平板上に塗布すると、１０−７の
頻度で復帰突然変異株が発生した。これらのグルコース
耐性・ガラクトース非依存性変異株の性質については、
調査を行わなかった。
ｌｅｕ２−１１２ｈｉｓ３−１１ ｈｉｓ３−１５
ｕｒａ３−５２ ｔｒｐ１ ａｄｅ１ ｍｅｔ１４ ａ
ｒｇ５，６）である（Futcher, B.とJ. Carbon, Mol. C
ell. Biol. 6:2213-2222(1986)）。この菌株を、３段階
で、条件的ｃｌｎ−株に変換した。まず、染色体ＣＬＮ
３遺伝子を、ＧＡＬ１プロモーターの調節下においた。
二方向性のＧＡＬ１０−ＧＡＬ１プロモーターを含む
０．７５ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を、Ｂａｍ
ＨＩ（ＧＡＬ１）末端が、ＣＬＮ３開始コドンの１１０
ヌクレオチド上流に接続するように、ＣＬＮ３遺伝子の
５’末端に融合させた。次に、ＧＡＬ１０プロモーター
からＣＬＮ３の中程まで伸張するＥｃｏＲＩ断片を（Na
sh, R.ら, EMBO J. 7:4335-4346(1988)）、ｐＢＦ３０
のＸｈｏＩとＥｃｏＲＩ部位の間にサブクローニングし
た（Nash, R.ら, EMBO J. 7:4335-4346(1988)）。Ｘｈ
ｏＩ末端とＥｃｏＲＩ末端との連結反応は、末端をクレ
ノウで埋めて、平滑末端連結反応によって行なった（Ｅ
ｃｏＲＩ部位を破壊して）。その結果、通常、ＣＬＮ３
の上流−１１０から−４１１に見られるＤＮＡが、ＧＡ
Ｌ１プロモーターで置きかわった。次に、この新しいｐ
ＢＦ３０誘導体型から、ＥｃｏＲＩからＳｐｈＩまでの
断片を切除した。この断片は、５’及び３’が、ＣＬＮ
３領域と非常に相同であるが、ＣＬＮ３のすぐ上流にＧ
ＡＬ１プロモーターとＵＲＡ３マーカーを有している。
ＢＦ３０５−１５ｄ株をこの断片で形質転換し、Ｕｒａ
＋の形質転換株を選択した。これをサザン分析で確認し
た。さらに、ＧＡＬ１プロモーターが誘導されたとき
と、誘導されていないときとで、細胞の大きさの平均値
を測定した。細胞を１％ラフィノース及び１％ガラクト
ース中で培養して、ＧＡＬ１プロモーターを誘導する
と、細胞体積の平均値は約２５μｍ３（比較として、親
株の細胞体積の平均値は約４０μｍ３である）であり、
一方、プロモーターを誘導しないと（ラフィノースの
み）、あるいは、グルコース存在下で抑制すると、細胞
体積は、野生株よりもずっと大きくなる。これらの実験
から、ＣＬＮ３がＧＡＬ１プロモーターの調節下にある
ことが示された。この細胞では、このＧＡＬ１に調節さ
れたグルコース抑制性の遺伝子が、ＣＬＮ３の唯一の供
給源である、ということに留意することが重要である。
第２に、ＣＬＮ１遺伝子を破壊した。I. FitchよりＣＬ
Ｎ１断片を入手し、これを用いて、ハイブリッド形成に
より、ＣＬＮ１の完全長のクローンを入手し、それをｐ
ＵＣプラスミドにサブクローニングした。ＨＩＳ３遺伝
子を含むＢａｍＨＩ断片を、ＣＬＮ１読み枠中のＮｃｏ
Ｉ部位に挿入した。次に、５’及び３’が、ＣＬＮ１領
域と高い相同性を有するような巨大なＥｃｏＲＩ断片を
切除し、これを用いて、上述したＢＦ３０５−１５ｄ
ＧＡＬ−ＣＬＮ３株を形質転換した。ＹＮＢ−ｈｉｓラ
フィノース・ガラクトース平板上で、形質転換をおこな
った。Ｈｉｓ＋のクローンを選択し、サザン分析で確認
した。最後に、ＣＬＮ２遺伝子を破壊した。I. Fitchよ
りＣＬＮ２断片を入手し、これを用いて、ハイブリッド
形成により、ＣＬＮ２の完全長のクローンを入手し、そ
れをｐＵＣプラスミドにサブクローニングした。ＴＲＰ
１遺伝子を含むＥｃｏＲＩ断片を、ＣＬＮ２読み枠中の
ＳｐｅＩ部位に挿入した。ＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ断片を
切除し、これを用いて、上述のＢＦ３０５−１５ｄ Ｇ
ＡＬ−ＣＬＮＨＩＳ３：：ｃｌｎ１株を形質転換した。
ＹＮＢ−ｔｒｐラフィノース・ガラクトース平板上で、
形質転換をおこなった。Ｔｒｐ＋のクローンを選択し
た。この場合は、ＴＲＰ１断片がＡＲＳ（自律複製配
列）を含むために、形質転換株の多くは、破壊されたＣ
ＬＮ２遺伝子ではなく、自律的に複製するプラスミドを
含んでいた。しかし、形質転換株のうちの数パーセント
は、単純なＴＲＰ１：：ｃｌｎ２破壊株であることが、
表現型分析とサザン分析によって示された。クローン＃
２１と称される、ある特定の３０５−１５ｄ ＧＡＬ１
−ＣＬＮ３ＨＩＳ３：：ｃｌｎ１ ＴＲＰ１：：ｃｌｎ
２形質転換株について、詳細に分析した。この株を１％
ラフィノース及び１％ガラクトース中で生育させると、
この株は、ＣＬＮ野生型の親株と区別できない倍加時間
を有していた。しかし、この株は、ＣＬＮ３過剰発現株
について推定されたとおりに、やや、わい小な表現型を
示した（細胞体積が小さい）。グルコースを添加する
と、あるいは、ガラクトースを除去すると、細胞はＧ１
期に蓄積し、細胞分裂が停止した。しかし、細胞の質量
及び体積は増加し続けた。Ｇ１期に停止した状態で、一
晩、インキュベートした後、出芽した細胞は実質的に観
察されなかった。そして、大部分の細胞は、調節されず
に大きくなったために、溶菌していた。３０５−ｄ１５
＃２１をグルコース平板上に塗布すると、１０−７の
頻度で復帰突然変異株が発生した。これらのグルコース
耐性・ガラクトース非依存性変異株の性質については、
調査を行わなかった。
【００１２】酵母スフェロプラストの形質転換 Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ スフェロプラストの形質転
換を、BurgersとPercivalとAllshireに従って行なった
（Burgers, P.M.J.とK.J. Percival, Anal. Biochem. 1
63:391-397(1987); Allshire, R.C., Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 87:4043-4047(1990)）。
換を、BurgersとPercivalとAllshireに従って行なった
（Burgers, P.M.J.とK.J. Percival, Anal. Biochem. 1
63:391-397(1987); Allshire, R.C., Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 87:4043-4047(1990)）。
【００１３】細胞培養 ＨｅＬａ及び２９３細胞を、３７℃で、１０％ウシ胎児
血清で補足したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥ
Ｍ）中で、プレート上あるいは浮遊状態で培養した。神
経膠芽細胞腫Ｕ１１８ ＭＧ細胞を、プレート上で、１
５％ウシ胎児血清と０．１ｍＭ非必須アミノ酸（ギブ
コ）で補足したＤＭＥＭ中で培養した。
血清で補足したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥ
Ｍ）中で、プレート上あるいは浮遊状態で培養した。神
経膠芽細胞腫Ｕ１１８ ＭＧ細胞を、プレート上で、１
５％ウシ胎児血清と０．１ｍＭ非必須アミノ酸（ギブ
コ）で補足したＤＭＥＭ中で培養した。
【００１４】核酸に関する方法 ほとんどの分子生物学的技術は、Sambrookらによる記載
と実質的に同じである（Sambrook, J.ら, Molecular Cl
oning: A Laboratory Manual コールド・スプリング
・ハーバー・ラボラトリー、コールド・スプリング・ハ
ーバー、ニューヨーク州 (1989)）。クローニングベク
ターとして、ファジミドベクターである、ｐＵＣ１１８
あるいはｐＵＣ１１９（Vieira, J.とJ. Messing, Met
h. Enzymol. 153:3-11(1987)）、あるいは、ｐＢｌｕｅ
ｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン）を用いた。シークエネ
ース・キット（ユナイテッド・ステイツ・バイオケミカ
ル）を用いたチェーン・ターミネーター法（Sanger, F.
ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-5467(197
7)）、あるいは、オートメーテッド・シークエンシング
・システム（３７３Ａ、アプライド・バイオシステム
ス）によって、ＤＮＡ配列を決定した。λＺＡＰＩＩに
入ったヒトＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡライブラリーを、スト
ラタジーンより購入した。λｇｔ１０に入ったヒトＴ細
胞ｃＤＮＡライブラリーは、M.Gillmanから寄贈された
（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー）。
ヒト神経膠芽細胞腫Ｕ１１８ ＭＧ、及び、λＺＡＰＩ
Ｉに入った神経膠芽細胞腫ＳＷ１０８８細胞ｃＤＮＡラ
イブラリーは、M. Wiglerから寄贈された（コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー）。λｇｔ１０に
入ったヒト奇形腫細胞ｃＤＮＡライブラリーは、Skowro
nskiより寄贈された（コールド・スプリング・ハーバー
・ラボラトリー）。ヒト正常肝ゲノムライブラリーλＧ
ＥＭ−１１は、プロメガより購入した。細胞培養より、
全ＲＮＡを、Sambrookらによる記載の通りに（Sambroo
k, J.ら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual
コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コー
ルド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州 (198
9)）、グアニジウム・チオシアネートと、引き続いてＣ
ｓＣｌ中の遠心分離を用いて抽出した。ポリ（Ａ）＋ク
イック・プッシュ・カラム（ストラタジーン）を用い
て、全ＲＮＡよりポリ（Ａ）ＲＮＡ＋を単離した。ＲＮ
Ａサンプルを、１％アガロース−ホルムアルデヒド−Ｍ
ＯＰＳゲルで分離し、ニトロセルロースフィルター上に
移した。ノーザンハイブリダイゼーションを（ライブラ
リーのスクリーニングも）、６８℃で、５×デンハルド
溶液、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ
変性サケ精子ＤＮＡ、２５μＭＮａＰＯ４（ｐＨ７．
０）、１０％デキストラン硫酸を含む溶液中で行なっ
た。プローブを、ランダム・プライミング・ラベリング
法により標識した（Feinberg, A.とB. Vogelstein, Ana
l. Biochem. 132:6-13(1983)）。ｃＤＮＡクローンｐＣ
ＹＣＤ１−Ｈ１２由来の１．３ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断
片を、ノーザンハイブリダイゼーション及びゲノムクロ
ーニング用のコード領域プローブとして用いた。ｃＤＮ
ＡクローンｐＣＹＣＤ１−Ｔ０７８由来の１．７ｋｂの
ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、３’断片プローブ
として使用した。バクテリア内でヒトサイクリンＤ１遺
伝子を発現するために、ｐＣＹＣＤ１−Ｈ１２の、ＣＹ
ＣＤ１の読み枠全体を含む１．３ｋｂのＮｃｏＩ−Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ断片を、Ｔ７発現ベクターにサブクローニン
グした（ｐＥＴ３ｄ、Studier, F.W.ら, Methods in En
zymology 185:60-89 (1990)）。この発現構築物を収容
するＥ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３）を、Studierに
従って作成した（Studier,F.W.ら, Methods in Enzymol
ogy 185:60-89 (1990)）。６Ｍ尿素（ＣＹＣＤ１にコー
ドされているｐ３４は、８Ｍ尿素に部分的に可溶性であ
るにすぎない）を含む溶解緩衝液（５ｍＭＥＤＴＡ、１
０％グリセロール、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ
８．０、０．００５％トリトンＸ−１００）中で、音波
処理により、バクテリアの培養物を溶菌し、２０，００
０ｇの力で１５分間遠心分離を行なった。沈澱物を、６
Ｍ尿素を含む溶解緩衝液で１回洗浄し、再び沈澱させ、
８Ｍ尿素を含む溶菌緩衝液で再懸濁して、遠心分離を行
なった。３４ｋｄのタンパク質に富む上澄み液を、１０
％ポリアクリルアミドゲルにロードした。３４ｋｄのバ
ンドをゲルより切り出し、０．１％ＳＤＳ含有ＰＢＳ中
で溶出した。
と実質的に同じである（Sambrook, J.ら, Molecular Cl
oning: A Laboratory Manual コールド・スプリング
・ハーバー・ラボラトリー、コールド・スプリング・ハ
ーバー、ニューヨーク州 (1989)）。クローニングベク
ターとして、ファジミドベクターである、ｐＵＣ１１８
あるいはｐＵＣ１１９（Vieira, J.とJ. Messing, Met
h. Enzymol. 153:3-11(1987)）、あるいは、ｐＢｌｕｅ
ｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン）を用いた。シークエネ
ース・キット（ユナイテッド・ステイツ・バイオケミカ
ル）を用いたチェーン・ターミネーター法（Sanger, F.
ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-5467(197
7)）、あるいは、オートメーテッド・シークエンシング
・システム（３７３Ａ、アプライド・バイオシステム
ス）によって、ＤＮＡ配列を決定した。λＺＡＰＩＩに
入ったヒトＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡライブラリーを、スト
ラタジーンより購入した。λｇｔ１０に入ったヒトＴ細
胞ｃＤＮＡライブラリーは、M.Gillmanから寄贈された
（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー）。
ヒト神経膠芽細胞腫Ｕ１１８ ＭＧ、及び、λＺＡＰＩ
Ｉに入った神経膠芽細胞腫ＳＷ１０８８細胞ｃＤＮＡラ
イブラリーは、M. Wiglerから寄贈された（コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー）。λｇｔ１０に
入ったヒト奇形腫細胞ｃＤＮＡライブラリーは、Skowro
nskiより寄贈された（コールド・スプリング・ハーバー
・ラボラトリー）。ヒト正常肝ゲノムライブラリーλＧ
ＥＭ−１１は、プロメガより購入した。細胞培養より、
全ＲＮＡを、Sambrookらによる記載の通りに（Sambroo
k, J.ら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual
コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コー
ルド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州 (198
9)）、グアニジウム・チオシアネートと、引き続いてＣ
ｓＣｌ中の遠心分離を用いて抽出した。ポリ（Ａ）＋ク
イック・プッシュ・カラム（ストラタジーン）を用い
て、全ＲＮＡよりポリ（Ａ）ＲＮＡ＋を単離した。ＲＮ
Ａサンプルを、１％アガロース−ホルムアルデヒド−Ｍ
ＯＰＳゲルで分離し、ニトロセルロースフィルター上に
移した。ノーザンハイブリダイゼーションを（ライブラ
リーのスクリーニングも）、６８℃で、５×デンハルド
溶液、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ
変性サケ精子ＤＮＡ、２５μＭＮａＰＯ４（ｐＨ７．
０）、１０％デキストラン硫酸を含む溶液中で行なっ
た。プローブを、ランダム・プライミング・ラベリング
法により標識した（Feinberg, A.とB. Vogelstein, Ana
l. Biochem. 132:6-13(1983)）。ｃＤＮＡクローンｐＣ
ＹＣＤ１−Ｈ１２由来の１．３ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断
片を、ノーザンハイブリダイゼーション及びゲノムクロ
ーニング用のコード領域プローブとして用いた。ｃＤＮ
ＡクローンｐＣＹＣＤ１−Ｔ０７８由来の１．７ｋｂの
ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、３’断片プローブ
として使用した。バクテリア内でヒトサイクリンＤ１遺
伝子を発現するために、ｐＣＹＣＤ１−Ｈ１２の、ＣＹ
ＣＤ１の読み枠全体を含む１．３ｋｂのＮｃｏＩ−Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ断片を、Ｔ７発現ベクターにサブクローニン
グした（ｐＥＴ３ｄ、Studier, F.W.ら, Methods in En
zymology 185:60-89 (1990)）。この発現構築物を収容
するＥ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３）を、Studierに
従って作成した（Studier,F.W.ら, Methods in Enzymol
ogy 185:60-89 (1990)）。６Ｍ尿素（ＣＹＣＤ１にコー
ドされているｐ３４は、８Ｍ尿素に部分的に可溶性であ
るにすぎない）を含む溶解緩衝液（５ｍＭＥＤＴＡ、１
０％グリセロール、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ
８．０、０．００５％トリトンＸ−１００）中で、音波
処理により、バクテリアの培養物を溶菌し、２０，００
０ｇの力で１５分間遠心分離を行なった。沈澱物を、６
Ｍ尿素を含む溶解緩衝液で１回洗浄し、再び沈澱させ、
８Ｍ尿素を含む溶菌緩衝液で再懸濁して、遠心分離を行
なった。３４ｋｄのタンパク質に富む上澄み液を、１０
％ポリアクリルアミドゲルにロードした。３４ｋｄのバ
ンドをゲルより切り出し、０．１％ＳＤＳ含有ＰＢＳ中
で溶出した。
【００１５】配列の整列と進化樹の作成 タンパク質配列の整列は、XiongとEickbush（Xiong, T.
とT.H. Eickbush, EMBO J. 9:3353-3362(1990)）によっ
て詳細に説明、かつ、論じられている方法に従って、実
質上、目視で行なった。いくつかの配列中の数字は、挿
入の結果、配列から省略したアミノ酸の数を示してい
る。いくつかの配列中の数字は、挿入の結果、配列から
省略したアミノ酸の数を示している（例えば、ＣＬＮ１
に関して、．．．ＴＷＧ２５ＲＬＳ．．．とは、ＧとＲ
との間から、アミノ酸２５個を省略したことを示す）。
この整列と進化樹で使用した配列の出所は以下の通りで
ある：ＣＹＣＡ−Ｈｓ、ヒトＡ型サイクリン（Wang, J.
ら, Nature 343:555-557(1990)）；ＣＹＣＡ−Ｘ１、ア
フリカツメガエルＡ−型サイクリン（Minshull, J.ら,
EMBO J. 9:2865-2875(1990)）；ＣＹＣＡ−Ｓｓ、クラ
ムＡ−型サイクリン（Swenson, K.I.ら, Cell 47:867-8
70(1986)）；ＣＹＣＡ−Ｄｍ、ショウジョウバエＡ−型
サイクリン（Lehner,C.F.とP.H. O'Farrell, Cell 56:9
57-968(1989)）；ＣＹＣＢ１−Ｈｓ、ヒトＢ１−型サイ
クリン（Pines, J.とT. Hunter,Cell 58:833-846(198
9)）；ＣＹＣＢ１−Ｘ１及びＣＹＣＢ２−Ｘ１、アフリ
カツメガエルＢ１−及びＢ２−型サイクリン（Minshul
l, J.ら,Cell 56:947-956(1989)）；ＣＹＣＢ−Ｓｓ、
クラムＢ−型サイクリン（Westendorf, J.M.ら, J. Cel
l. Biol., 108:1431-1444(1989)）；ＣＹＣＢ−Ａｓ
ｐ、ヒトデＢ−型サイクリン（Tachibana, K.ら, Dev.
Biol. 140:241-252(1990)）；ＣＹＣＢ−Ａｒｐ、ウニ
Ｂ−型サイクリン（Pines, J.とT. Hunter,EMBO J. 6:2
987-2995(1987)）；ＣＹＣＢ−Ｄｍ、ショウジョウバエ
Ｂ−型サイクリン（Lehner,C.F.とP.H. O'Farrell, Cel
l 61:535-547）；ＣＤＣ１３−Ｓｐ、Ｓ．ｐｏｍｂｅの
ＣＤＣ１３（Booher, R.とD. Beach, EMBO J. 7:2321-2
327(1988)）；ＣＬＮ１−Ｓｃ及びＣＬＮ２−Ｓｃ、
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのサイクリン１及び２（Hadw
iger, J.A.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6255-6
259(1989)）；ＣＬＮ３−Ｓｃ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅのサイクリン３（Nash, R.ら,EMBO J. 7:4335-4346
(1988)）。全部で１７種類のサイクリン配列を整列させ
た。各クラスの代表的な２配列を図５Ａに示す。１７種
類の配列を全部対にして比較し、１７配列で共通であっ
た１５４アミノ酸残基から、パーセント・ダイバージェ
ンスを計算した。このアミノ酸残基は、Ａ、Ｂ、及びＤ
−型サイクリンのＮ−末端に位置する５０残基の部分を
含まない。なぜならば、この部分はＣＬＮ型サイクリン
には存在しないからである。ギャップ／挿入は、大きさ
に関わらず、ミスマッチ１つとして数えた。進化樹の作
成に先立って、ポワソン補正（ｄ＝−ｌｏｇｅＳ、ここ
でＳ＝配列相同性（Nei, M. Mollecular Evolutionary
Genetics pp. 387-326 コロンビア大学出版、ニューヨ
ーク州 (1987)）により、全ての値を距離に直した。ロ
チェスター大学で開発されたコンピュータープログラム
を使用して、対の比較、及び、ポワソン補正の計算を行
なった。サイクリン遺伝子ファミリーの進化樹を、ネイ
バー・ジョイニング・プログラムにより作成した（Sait
ou, N.とM. Nei, Mol. Biol. Evol. 4:406-425(198
7)）。コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー
のＶＡＸコンピューター・マイクロＶＭＳ Ｖ４．４を
用いて、全計算を行なった。より多数の残基（例えば、
Ａ、Ｂ、及び、Ｄ−型サイクリンのＣ−末端に位置する
５０残基の部分、図５Ａ）を含む配列の部分集合（例え
ば、Ａ、Ｂ、及び、Ｄ−型サイクリン）を用いて、ある
いは、その他のいくつかの未公表のサイクリン配列を追
加することにより、進化樹の信頼性を評価した。どの場
合にも、図５Ｂに示す進化樹と同じトポロジーを有する
進化樹が作成された。
とT.H. Eickbush, EMBO J. 9:3353-3362(1990)）によっ
て詳細に説明、かつ、論じられている方法に従って、実
質上、目視で行なった。いくつかの配列中の数字は、挿
入の結果、配列から省略したアミノ酸の数を示してい
る。いくつかの配列中の数字は、挿入の結果、配列から
省略したアミノ酸の数を示している（例えば、ＣＬＮ１
に関して、．．．ＴＷＧ２５ＲＬＳ．．．とは、ＧとＲ
との間から、アミノ酸２５個を省略したことを示す）。
この整列と進化樹で使用した配列の出所は以下の通りで
ある：ＣＹＣＡ−Ｈｓ、ヒトＡ型サイクリン（Wang, J.
ら, Nature 343:555-557(1990)）；ＣＹＣＡ−Ｘ１、ア
フリカツメガエルＡ−型サイクリン（Minshull, J.ら,
EMBO J. 9:2865-2875(1990)）；ＣＹＣＡ−Ｓｓ、クラ
ムＡ−型サイクリン（Swenson, K.I.ら, Cell 47:867-8
70(1986)）；ＣＹＣＡ−Ｄｍ、ショウジョウバエＡ−型
サイクリン（Lehner,C.F.とP.H. O'Farrell, Cell 56:9
57-968(1989)）；ＣＹＣＢ１−Ｈｓ、ヒトＢ１−型サイ
クリン（Pines, J.とT. Hunter,Cell 58:833-846(198
9)）；ＣＹＣＢ１−Ｘ１及びＣＹＣＢ２−Ｘ１、アフリ
カツメガエルＢ１−及びＢ２−型サイクリン（Minshul
l, J.ら,Cell 56:947-956(1989)）；ＣＹＣＢ−Ｓｓ、
クラムＢ−型サイクリン（Westendorf, J.M.ら, J. Cel
l. Biol., 108:1431-1444(1989)）；ＣＹＣＢ−Ａｓ
ｐ、ヒトデＢ−型サイクリン（Tachibana, K.ら, Dev.
Biol. 140:241-252(1990)）；ＣＹＣＢ−Ａｒｐ、ウニ
Ｂ−型サイクリン（Pines, J.とT. Hunter,EMBO J. 6:2
987-2995(1987)）；ＣＹＣＢ−Ｄｍ、ショウジョウバエ
Ｂ−型サイクリン（Lehner,C.F.とP.H. O'Farrell, Cel
l 61:535-547）；ＣＤＣ１３−Ｓｐ、Ｓ．ｐｏｍｂｅの
ＣＤＣ１３（Booher, R.とD. Beach, EMBO J. 7:2321-2
327(1988)）；ＣＬＮ１−Ｓｃ及びＣＬＮ２−Ｓｃ、
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのサイクリン１及び２（Hadw
iger, J.A.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6255-6
259(1989)）；ＣＬＮ３−Ｓｃ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅのサイクリン３（Nash, R.ら,EMBO J. 7:4335-4346
(1988)）。全部で１７種類のサイクリン配列を整列させ
た。各クラスの代表的な２配列を図５Ａに示す。１７種
類の配列を全部対にして比較し、１７配列で共通であっ
た１５４アミノ酸残基から、パーセント・ダイバージェ
ンスを計算した。このアミノ酸残基は、Ａ、Ｂ、及びＤ
−型サイクリンのＮ−末端に位置する５０残基の部分を
含まない。なぜならば、この部分はＣＬＮ型サイクリン
には存在しないからである。ギャップ／挿入は、大きさ
に関わらず、ミスマッチ１つとして数えた。進化樹の作
成に先立って、ポワソン補正（ｄ＝−ｌｏｇｅＳ、ここ
でＳ＝配列相同性（Nei, M. Mollecular Evolutionary
Genetics pp. 387-326 コロンビア大学出版、ニューヨ
ーク州 (1987)）により、全ての値を距離に直した。ロ
チェスター大学で開発されたコンピュータープログラム
を使用して、対の比較、及び、ポワソン補正の計算を行
なった。サイクリン遺伝子ファミリーの進化樹を、ネイ
バー・ジョイニング・プログラムにより作成した（Sait
ou, N.とM. Nei, Mol. Biol. Evol. 4:406-425(198
7)）。コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー
のＶＡＸコンピューター・マイクロＶＭＳ Ｖ４．４を
用いて、全計算を行なった。より多数の残基（例えば、
Ａ、Ｂ、及び、Ｄ−型サイクリンのＣ−末端に位置する
５０残基の部分、図５Ａ）を含む配列の部分集合（例え
ば、Ａ、Ｂ、及び、Ｄ−型サイクリン）を用いて、ある
いは、その他のいくつかの未公表のサイクリン配列を追
加することにより、進化樹の信頼性を評価した。どの場
合にも、図５Ｂに示す進化樹と同じトポロジーを有する
進化樹が作成された。
【００１６】免疫沈降及びウエスタンブロット ６０から８０％の密集度の１００ｍｍディッシュ由来の
細胞を、１ｍｌの溶解緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭＥＤＴ
Ａ、０．５％ＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸Ｎ
ａ、１ｍＭＰＭＳＦ）中で、氷上で３０分間溶解させ
た。各細胞溶解物からタンパク質１ｍｇ分を用いて、４
℃で一晩、免疫沈降を行なった。溶解緩衝液で平衡化し
た後、６０μｌのプロテインＡ−アガロース（ピアー
ス）を各免疫沈降物に添加し、一定速度で回転しなが
ら、４℃で１時間インキュベートした。免疫沈降物を溶
解緩衝液で３回洗浄し、最後に５０μｌの２×ＳＤＳタ
ンパク質サンプル緩衝液に再懸濁した。これを５分間煮
沸し、１０％ポリアクリルアミドゲルにロードした。Ｓ
ＤＥエレクトロブロッティング・システム（ミリポア）
を用いて、４００ｍＡの定電流を４５分間で、タンパク
質をニトロセルロースフィルターへ移した。フィルター
を、１×ＰＢＳ、３％ＢＳＡ、０．１％アジ化ナトリウ
ムで、２から６時間ブロッキングし、ＮＥＴゲル緩衝液
（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ
ＮａＣｌ、０．１％ＮＰ−４０、１ｍＭＥＤＴＡ、０．
２５％ゼラチン、０．０２アジ化ナトリウム）で、各１
０分間ずつ６回洗浄した。そして、ブロッキング溶液中
で１時間、振とうしながら、１２５Ｉ−プロテインＡで
放射線標識した。次に、オートラジオグラフィーの前
に、ブロットをＮＥＴゲル緩衝液中で各１０分間ずつ６
回洗浄した。進化樹をネイバー・ジョイニング法（Sait
ou, N.とM. Nei, Mol. Biol. Evol.4:406-425(1987)）
を用いて作成した。水平線の長さがダイバージェンスを
反映している。ＣＬＮサイクリンとその他のサイクリン
を結びつけている節の間の枝の長さは、任意に分けた。
細胞を、１ｍｌの溶解緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭＥＤＴ
Ａ、０．５％ＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸Ｎ
ａ、１ｍＭＰＭＳＦ）中で、氷上で３０分間溶解させ
た。各細胞溶解物からタンパク質１ｍｇ分を用いて、４
℃で一晩、免疫沈降を行なった。溶解緩衝液で平衡化し
た後、６０μｌのプロテインＡ−アガロース（ピアー
ス）を各免疫沈降物に添加し、一定速度で回転しなが
ら、４℃で１時間インキュベートした。免疫沈降物を溶
解緩衝液で３回洗浄し、最後に５０μｌの２×ＳＤＳタ
ンパク質サンプル緩衝液に再懸濁した。これを５分間煮
沸し、１０％ポリアクリルアミドゲルにロードした。Ｓ
ＤＥエレクトロブロッティング・システム（ミリポア）
を用いて、４００ｍＡの定電流を４５分間で、タンパク
質をニトロセルロースフィルターへ移した。フィルター
を、１×ＰＢＳ、３％ＢＳＡ、０．１％アジ化ナトリウ
ムで、２から６時間ブロッキングし、ＮＥＴゲル緩衝液
（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ
ＮａＣｌ、０．１％ＮＰ−４０、１ｍＭＥＤＴＡ、０．
２５％ゼラチン、０．０２アジ化ナトリウム）で、各１
０分間ずつ６回洗浄した。そして、ブロッキング溶液中
で１時間、振とうしながら、１２５Ｉ−プロテインＡで
放射線標識した。次に、オートラジオグラフィーの前
に、ブロットをＮＥＴゲル緩衝液中で各１０分間ずつ６
回洗浄した。進化樹をネイバー・ジョイニング法（Sait
ou, N.とM. Nei, Mol. Biol. Evol.4:406-425(1987)）
を用いて作成した。水平線の長さがダイバージェンスを
反映している。ＣＬＮサイクリンとその他のサイクリン
を結びつけている節の間の枝の長さは、任意に分けた。
【００１７】材料及び方法 以下の材料と方法を、例４−６に記載されている研究中
で用いた。分子クローニング ヒトＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡライブラリー、ヒト神経膠芽
細胞腫細胞Ｕ１１８ＭＧｃＤＮＡライブラリー、ヒト正
常肝ゲノムライブラリー、及び、ハイブリッド形成緩衝
液は、上述の通りである。ヒト海馬ｃＤＮＡライブラリ
ーをストラタジーン社より購入した。高ストリンジェン
シー及び低ストリンジェンシーのハイブリッド形成を、
それぞれ６８℃及び５０℃で行なった。ＰＣＲ反応用の
鋳型ＤＮＡを調製するために、各ｃＤＮＡライブラリー
から約２００万個のラムダファージを１０５ＰＦＵ／１
５０ｍｍプレートの密度でまいた。プレート溶菌液よ
り、Sambrook, J.ら, Molecular Cloning: A Laborator
y Manual 、第二版、コールド・スプリング・ハーバー
・ラボラトリー、コールド・スプリング・ハーバー、ニ
ューヨーク州 (1989)に従って、ＤＮＡを調製した。
で用いた。分子クローニング ヒトＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡライブラリー、ヒト神経膠芽
細胞腫細胞Ｕ１１８ＭＧｃＤＮＡライブラリー、ヒト正
常肝ゲノムライブラリー、及び、ハイブリッド形成緩衝
液は、上述の通りである。ヒト海馬ｃＤＮＡライブラリ
ーをストラタジーン社より購入した。高ストリンジェン
シー及び低ストリンジェンシーのハイブリッド形成を、
それぞれ６８℃及び５０℃で行なった。ＰＣＲ反応用の
鋳型ＤＮＡを調製するために、各ｃＤＮＡライブラリー
から約２００万個のラムダファージを１０５ＰＦＵ／１
５０ｍｍプレートの密度でまいた。プレート溶菌液よ
り、Sambrook, J.ら, Molecular Cloning: A Laborator
y Manual 、第二版、コールド・スプリング・ハーバー
・ラボラトリー、コールド・スプリング・ハーバー、ニ
ューヨーク州 (1989)に従って、ＤＮＡを調製した。
【００１８】例４ ヒトサイクリンＤ２及びＤ３ｃＤＮ
Ａの単離 ヒトサイクリンＤ２及びＤ３ｃＤＮＡを単離するため
に、ヒトＣＣＤＮ１、マウスｃｙｌ１、ｃｙｌ２、及
び、ｃｙｌ３Ｄ−型サイクリンで非常によく保存された
３つの領域から、２個の５’オリゴヌクレオチドと、１
個の３’縮重オリゴヌクレオチドを作成した（Matsushi
me, H.ら, Cell 65:701-713(1991)；Xiong,Y.ら,Cell 6
5:691-699；図８）。第一の５’オリゴヌクレオチドプ
ライマーであるＨＣＮＤ１１は、８１９２倍に縮重した
３８マー（ＴＧＧＡＴＧ［Ｔ／Ｃ］ＴＮＧＡ［Ａ／Ｇ］
ＧＴＮＴＧ［Ｔ／Ｃ］ＧＡ［Ａ／Ｃ］ＧＡ［Ａ／Ｇ］Ｃ
Ａ−［Ａ／Ｇ］ＡＡ［Ａ／Ｇ］ＴＧ［Ｔ／Ｃ］ＧＡ［Ａ
／Ｇ］ＧＡ）（ＳＥＱ ＩＤＮｏ．３７）であり、アミ
ノ酸１３個をコードする（ＷＭＬＥＶＣＥＥＱＫＣＥ
Ｅ）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３８）。第二の５’オリゴ
ヌクレオチドプライマーであるＨＣＮＤ１２は、８１９
２倍に縮重した２９マー（ＧＴＮＴＴ［Ｔ／Ｃ］ＣＣＮ
［Ｔ／Ｃ］ＴＮＧＣＮＡＴＧＡＡ［Ｔ／Ｃ］ＴＡ［Ｔ／
Ｃ］−ＴＮＧＡ）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３９）であ
り、アミノ酸１０個をコードする（ＶＦＰＬＡＭＮＹＤ
Ｌ）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４０）。３’プライマーで
あるＨＣＮＤ１３は、３０７２倍に縮重した２４マー
（［Ａ／Ｇ］ＴＣＮＧＴ［Ａ／Ｇ］ＴＡ［Ａ／Ｇ／Ｔ］
ＡＴ−［Ａ／Ｇ］ＣＡＮＡ［Ａ／Ｇ］［Ｔ／Ｃ］ＴＴ−
［Ｔ／Ｃ］ＴＣ）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４１）であ
り、アミノ酸８個をコードする（ＥＫＬＣＩＹＴＤ）
（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４２）。ＰＣＲ反応を、９４℃
で１分間、４８℃で１分間、７２℃で１分間で、３０サ
イクル行なった。反応液は、５０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭＭｇＣｌ
２、０．０１％ゼラチン、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴ
Ｐ、ｄＴＴＰを各０．２ｍＭ、２．５ユニットのＴａｑ
ポリメラーゼ、５μＭのオリゴヌクレオチド、２−１０
μｇの鋳型ＤＮＡを含む。ＨＣＮＤ１１とＨＣＮＤ１３
で合成されたＰＣＲ産物を、ＨＣＮＤ１２とＨＣＮＤ１
３をプライマーとして用いた第二ラウンドＰＣＴ反応に
よって確認した。１．２％アガロースゲルで分析した
後、期待された長さ（プライマーＨＣＮＤ１１とＨＣＮ
Ｄ１３との間で２００ｂｐ）のＤＮＡ断片を精製し、配
列決定のために、ファジミドベクターｐＵＣ１１８のＳ
ｍａＩ部位にサブクローニングした。完全長のサイクリ
ンＤ３ｃＤＮＡを単離するために、Ｄ３ ＰＣＲ産物の
２０１−ｂｐの断片を、オリゴヌクレオチドプライマー
ＨＣＮＤ１１とＨＣＮＤ１３を用いて、ランダム・プラ
イム標識法（Feinberg,A. P.ら, Anal. Biochem. 132:6
-13(1983)）で標識し、ヒトＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡライ
ブラリーのスクリーニングに使用した。ＣＣＤＮ３遺伝
子を目的としたヒトゲノムライブラリーのスクリーニン
グに使用したプローブは、ｃＤＮＡクローンλＤ３−Ｈ
３４由来の２−ｋｂのＥｃｏＲＩ断片であった。ヒトサ
イクリンＤ３のスクリーニングのための全ハイブリッド
形成を、高ストリンジェンシーで行った。ＣＣＤＮ１及
びＣＣＤＮ３に対応するＰＣＲクローンを、両ｃＤＮＡ
ライブラリーから、繰り返し単離した。ＣＣＤＮ２は単
離しなかった。サイクリンＤ２を単離するために、マウ
スｃｙｌ２ｃＤＮＡ由来の１−ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を
プローブとして用いて、ヒトゲノムライブラリーをスク
リーニングした。低ストリンジェンシー条件下では、こ
のプローブは、ヒトサイクリンＤ１及びＤ２の両方にハ
イブリダイズした。高ストリンジェンシーで、ヒトサイ
クリンＤ１プローブとの別のハイブリッド形成を行うこ
とにより、サイクリンＤ１クローンを除去した。続い
て、部分的な配列決定と、予測されるタンパク質配列
を、ヒトサイクリンＤ１及びＤ３、マウスｃｙｌ２と比
較することによって、ヒトＣＣＤＮ２ゲノムクローンを
同定した。上述のように、遺伝子相補性スクリーニング
を用いて、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅの三連Ｃｌｎ欠損変異株をレスキューすること
によって、ヒトＣＣＤＮ１（サイクリンＤ１）を単離し
た。ヒトとマウスとの間の進化上の近縁度と、ｃｙｌ
１、ｃｙｌ２、及び、ｃｙｌ３内で配列の類似性がある
ことから、ヒトのゲノム中には、さらに２種類のＤ−型
サイクリン遺伝子が存在することが示唆された。推定の
ヒトサイクリンＤ２及びＤ３遺伝子を単離するために、
まず、ＰＣＲ法を用いた。ヒトＣＣＤＮ１、マウスｃｙ
ｌ１、ｃｙｌ２、及び、ｃｙｌ３の非常によく保存され
た領域から、３個の縮重オリゴヌクレオチドプライマー
を作成した。これらのプライマーを用いて、サイクリン
Ｄ１と、マウスｃｙｌ３のヒトの相同物と考えられる２
００−ｂｐのＤＮＡ断片を、ヒトＨｅＬａ細胞及び神経
膠芽細胞腫細胞ｃＤＮＡライブラリーから単離した。こ
のＰＣＲ産物をプローブに用いて、完全長のＤ３クロー
ンを得るために、ヒトＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡライブラリ
ーをスクリーニングした。約１２０万個のｃＤＮＡクロ
ーンをスクリーニングし、６個のポジティブを得た。こ
のスクリーニングからの最長のｃＤＮＡクローンである
λＤ３−Ｈ３４（１９６２ｂｐ）を、完全に配列決定し
た（図４）。仮定のヒトサイクリンＤ２ｃＤＮＡがＰＣ
Ｒで検出されなかったことから、異種プローブとしてマ
ウスｃｙｌ２ｃＤＮＡを用いて、低ストリンジェンシー
で、ヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。
この結果、ＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡライブラリーから、ま
ず、１０個のクローンが単離された。しかし、制限マッ
ピングに基づくと、全クローンがヒトサイクリンＤ１遺
伝子に対応していた。これは、おそらく、ＨｅＬａ細胞
中では、サイクリンＤ２の発現が非常に低レベルである
からである。そこで、Ｄ１とＤ２の構成はほとんど同一
であるという仮定に基づいて、同じプローブを用いてヒ
トゲノムライブラリーをスクリーニングした。得られた
１８個のポジティブのうち、１０個がヒトサイクリンＤ
１に対応し、８個がヒトサイクリンＤ２配列を含むと考
えられた（下記参照）。次に、８個の仮定サイクリンＤ
２クローンのうちの一つであるλＤ２−Ｇ１由来の、
０．４−ｋｂのＢａｍＨＩ断片をプローブとして用い
て、サイクリンＤ２遺伝子の完全長ｃＤＮＡクローンを
探すために、高ストリンジェンシーでヒト海馬ｃＤＮＡ
ライブラリーをスクリーニングした。約１００万個のｃ
ＤＮＡクローンをスクリーニングした後、９個のポジテ
ィブが得られた。最長のｃＤＮＡクローン、λＤ２−Ｐ
３（１９１１ｂｐ）を完全に配列決定した（図３）。λ
Ｄ２−Ｐ３も、λＤ３−Ｈ３４も、ポリ（Ａ）配列を含
まないことから、３’非翻訳領域の一部分が欠けている
ことが示唆された。λＤ２−Ｐ３のＤＮＡ配列より、計
算上の分子量３３，０４５−Ｄａ、２８９−アミノ酸の
タンパク質をコードできる読み枠が、明らかとなった。
λＤ３−Ｈ３４についての同様の分析から、計算上の分
子量３２，４８２−Ｄａのタンパク質をコードする、２
９２−アミノ酸の読み枠が明らかとなった。ヒトサイク
リンＤ１の場合と同様に、λＤ２−Ｐ３（ヌクレオチド
位置２２、図３）と、λＤ３−Ｈ３４（ヌクレオチド位
置１０１、図４）の仮定の開始メチオニンコドンよりも
５’側には、メチオニンコドンも停止コドンも存在しな
い。ヒトサイクリンＤ１及びマウスｃｙｌ１（図７）の
タンパク質配列との比較と、リボヌクレアーゼ保護実験
の予備結果に基づいて、λＤ２−Ｐ３とλＤ３−Ｈ３４
は、どちらも完全長のコード領域を含むと考えられる。
これまでに同定された１１種類の哺乳類サイクリンの全
てのタンパク質配列を比較して、構造上及び進化上の関
係を評価した。これには、サイクリンＡ、サイクリンＢ
１及びＢ２、６個のＤ−型サイクリン（３個がヒト由
来、３個がマウス由来）と、最近同定されたサイクリン
Ｅ及びＣ（図７）が含まれる。この比較から、Ｄ−型サ
イクリンに関するいくつかの特徴が観察された。第一に
は、サイクリンＤ１に関して前述したように、３種のサ
イクリンＤ遺伝子は、全て、２８９から２９５アミノ酸
残基の範囲の、同様の小さなサイズのタンパク質をコー
ドする。これは、これまでに発見されたもののうちで最
短のサイクリンである。第二には、これらは全て、Ａ−
及びＢ−型サイクリンのＮ−末端で同定されている、い
わゆる”デストラクション・ボックス”、を欠く。デス
トラクション・ボックスは、サイクリンを、ユビキチン
依存性分解経路へ標的設定する（Glotzer, M.ら, Natur
e 349:132-138(1991)）。このことから、Ｄ−型サイク
リンは、各細胞周期間の自身の周期的な分解を制御する
ために、別個の機構を進化させた、あるいは、Ｄ−型サ
イクリンはそのような分解を受けない、の何れかが示唆
される。第三に、３種のヒトサイクリンＤ遺伝子は、コ
ード領域全体にわたって非常に高い類似性を有する：Ｄ
１とＤ２との間で６０％、Ｄ２とＤ３との間で６０％、
Ｄ１とＤ３との間で５２％である。第四に、Ｄ−型サイ
クリンのメンバーは、Ｂ−型サイクリンのメンバーより
も、互いにより密接に関連している。サイクリン・ボッ
クス内で、３種のサイクリンＤ遺伝子では平均７８％で
あるのに対して、２種のサイクリンＢ遺伝子では５７％
である。これより、サイクリンＢ１からＢ２が分離した
あとに、Ｄ−型サイクリンの分離（出現）が起こったこ
とが示唆される。最後に、よく性質が調べられている核
分裂Ｂ−型サイクリンを指標として用いると、最も密接
に関連する遺伝子は、サイクリンＡ（平均５１％）、続
いて、Ｅ−型（４０％）、Ｄ−型（２９％）、そして、
Ｃ−型サイクリン（２０％）である。
Ａの単離 ヒトサイクリンＤ２及びＤ３ｃＤＮＡを単離するため
に、ヒトＣＣＤＮ１、マウスｃｙｌ１、ｃｙｌ２、及
び、ｃｙｌ３Ｄ−型サイクリンで非常によく保存された
３つの領域から、２個の５’オリゴヌクレオチドと、１
個の３’縮重オリゴヌクレオチドを作成した（Matsushi
me, H.ら, Cell 65:701-713(1991)；Xiong,Y.ら,Cell 6
5:691-699；図８）。第一の５’オリゴヌクレオチドプ
ライマーであるＨＣＮＤ１１は、８１９２倍に縮重した
３８マー（ＴＧＧＡＴＧ［Ｔ／Ｃ］ＴＮＧＡ［Ａ／Ｇ］
ＧＴＮＴＧ［Ｔ／Ｃ］ＧＡ［Ａ／Ｃ］ＧＡ［Ａ／Ｇ］Ｃ
Ａ−［Ａ／Ｇ］ＡＡ［Ａ／Ｇ］ＴＧ［Ｔ／Ｃ］ＧＡ［Ａ
／Ｇ］ＧＡ）（ＳＥＱ ＩＤＮｏ．３７）であり、アミ
ノ酸１３個をコードする（ＷＭＬＥＶＣＥＥＱＫＣＥ
Ｅ）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３８）。第二の５’オリゴ
ヌクレオチドプライマーであるＨＣＮＤ１２は、８１９
２倍に縮重した２９マー（ＧＴＮＴＴ［Ｔ／Ｃ］ＣＣＮ
［Ｔ／Ｃ］ＴＮＧＣＮＡＴＧＡＡ［Ｔ／Ｃ］ＴＡ［Ｔ／
Ｃ］−ＴＮＧＡ）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３９）であ
り、アミノ酸１０個をコードする（ＶＦＰＬＡＭＮＹＤ
Ｌ）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４０）。３’プライマーで
あるＨＣＮＤ１３は、３０７２倍に縮重した２４マー
（［Ａ／Ｇ］ＴＣＮＧＴ［Ａ／Ｇ］ＴＡ［Ａ／Ｇ／Ｔ］
ＡＴ−［Ａ／Ｇ］ＣＡＮＡ［Ａ／Ｇ］［Ｔ／Ｃ］ＴＴ−
［Ｔ／Ｃ］ＴＣ）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４１）であ
り、アミノ酸８個をコードする（ＥＫＬＣＩＹＴＤ）
（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４２）。ＰＣＲ反応を、９４℃
で１分間、４８℃で１分間、７２℃で１分間で、３０サ
イクル行なった。反応液は、５０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭＭｇＣｌ
２、０．０１％ゼラチン、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴ
Ｐ、ｄＴＴＰを各０．２ｍＭ、２．５ユニットのＴａｑ
ポリメラーゼ、５μＭのオリゴヌクレオチド、２−１０
μｇの鋳型ＤＮＡを含む。ＨＣＮＤ１１とＨＣＮＤ１３
で合成されたＰＣＲ産物を、ＨＣＮＤ１２とＨＣＮＤ１
３をプライマーとして用いた第二ラウンドＰＣＴ反応に
よって確認した。１．２％アガロースゲルで分析した
後、期待された長さ（プライマーＨＣＮＤ１１とＨＣＮ
Ｄ１３との間で２００ｂｐ）のＤＮＡ断片を精製し、配
列決定のために、ファジミドベクターｐＵＣ１１８のＳ
ｍａＩ部位にサブクローニングした。完全長のサイクリ
ンＤ３ｃＤＮＡを単離するために、Ｄ３ ＰＣＲ産物の
２０１−ｂｐの断片を、オリゴヌクレオチドプライマー
ＨＣＮＤ１１とＨＣＮＤ１３を用いて、ランダム・プラ
イム標識法（Feinberg,A. P.ら, Anal. Biochem. 132:6
-13(1983)）で標識し、ヒトＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡライ
ブラリーのスクリーニングに使用した。ＣＣＤＮ３遺伝
子を目的としたヒトゲノムライブラリーのスクリーニン
グに使用したプローブは、ｃＤＮＡクローンλＤ３−Ｈ
３４由来の２−ｋｂのＥｃｏＲＩ断片であった。ヒトサ
イクリンＤ３のスクリーニングのための全ハイブリッド
形成を、高ストリンジェンシーで行った。ＣＣＤＮ１及
びＣＣＤＮ３に対応するＰＣＲクローンを、両ｃＤＮＡ
ライブラリーから、繰り返し単離した。ＣＣＤＮ２は単
離しなかった。サイクリンＤ２を単離するために、マウ
スｃｙｌ２ｃＤＮＡ由来の１−ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を
プローブとして用いて、ヒトゲノムライブラリーをスク
リーニングした。低ストリンジェンシー条件下では、こ
のプローブは、ヒトサイクリンＤ１及びＤ２の両方にハ
イブリダイズした。高ストリンジェンシーで、ヒトサイ
クリンＤ１プローブとの別のハイブリッド形成を行うこ
とにより、サイクリンＤ１クローンを除去した。続い
て、部分的な配列決定と、予測されるタンパク質配列
を、ヒトサイクリンＤ１及びＤ３、マウスｃｙｌ２と比
較することによって、ヒトＣＣＤＮ２ゲノムクローンを
同定した。上述のように、遺伝子相補性スクリーニング
を用いて、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅの三連Ｃｌｎ欠損変異株をレスキューすること
によって、ヒトＣＣＤＮ１（サイクリンＤ１）を単離し
た。ヒトとマウスとの間の進化上の近縁度と、ｃｙｌ
１、ｃｙｌ２、及び、ｃｙｌ３内で配列の類似性がある
ことから、ヒトのゲノム中には、さらに２種類のＤ−型
サイクリン遺伝子が存在することが示唆された。推定の
ヒトサイクリンＤ２及びＤ３遺伝子を単離するために、
まず、ＰＣＲ法を用いた。ヒトＣＣＤＮ１、マウスｃｙ
ｌ１、ｃｙｌ２、及び、ｃｙｌ３の非常によく保存され
た領域から、３個の縮重オリゴヌクレオチドプライマー
を作成した。これらのプライマーを用いて、サイクリン
Ｄ１と、マウスｃｙｌ３のヒトの相同物と考えられる２
００−ｂｐのＤＮＡ断片を、ヒトＨｅＬａ細胞及び神経
膠芽細胞腫細胞ｃＤＮＡライブラリーから単離した。こ
のＰＣＲ産物をプローブに用いて、完全長のＤ３クロー
ンを得るために、ヒトＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡライブラリ
ーをスクリーニングした。約１２０万個のｃＤＮＡクロ
ーンをスクリーニングし、６個のポジティブを得た。こ
のスクリーニングからの最長のｃＤＮＡクローンである
λＤ３−Ｈ３４（１９６２ｂｐ）を、完全に配列決定し
た（図４）。仮定のヒトサイクリンＤ２ｃＤＮＡがＰＣ
Ｒで検出されなかったことから、異種プローブとしてマ
ウスｃｙｌ２ｃＤＮＡを用いて、低ストリンジェンシー
で、ヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。
この結果、ＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡライブラリーから、ま
ず、１０個のクローンが単離された。しかし、制限マッ
ピングに基づくと、全クローンがヒトサイクリンＤ１遺
伝子に対応していた。これは、おそらく、ＨｅＬａ細胞
中では、サイクリンＤ２の発現が非常に低レベルである
からである。そこで、Ｄ１とＤ２の構成はほとんど同一
であるという仮定に基づいて、同じプローブを用いてヒ
トゲノムライブラリーをスクリーニングした。得られた
１８個のポジティブのうち、１０個がヒトサイクリンＤ
１に対応し、８個がヒトサイクリンＤ２配列を含むと考
えられた（下記参照）。次に、８個の仮定サイクリンＤ
２クローンのうちの一つであるλＤ２−Ｇ１由来の、
０．４−ｋｂのＢａｍＨＩ断片をプローブとして用い
て、サイクリンＤ２遺伝子の完全長ｃＤＮＡクローンを
探すために、高ストリンジェンシーでヒト海馬ｃＤＮＡ
ライブラリーをスクリーニングした。約１００万個のｃ
ＤＮＡクローンをスクリーニングした後、９個のポジテ
ィブが得られた。最長のｃＤＮＡクローン、λＤ２−Ｐ
３（１９１１ｂｐ）を完全に配列決定した（図３）。λ
Ｄ２−Ｐ３も、λＤ３−Ｈ３４も、ポリ（Ａ）配列を含
まないことから、３’非翻訳領域の一部分が欠けている
ことが示唆された。λＤ２−Ｐ３のＤＮＡ配列より、計
算上の分子量３３，０４５−Ｄａ、２８９−アミノ酸の
タンパク質をコードできる読み枠が、明らかとなった。
λＤ３−Ｈ３４についての同様の分析から、計算上の分
子量３２，４８２−Ｄａのタンパク質をコードする、２
９２−アミノ酸の読み枠が明らかとなった。ヒトサイク
リンＤ１の場合と同様に、λＤ２−Ｐ３（ヌクレオチド
位置２２、図３）と、λＤ３−Ｈ３４（ヌクレオチド位
置１０１、図４）の仮定の開始メチオニンコドンよりも
５’側には、メチオニンコドンも停止コドンも存在しな
い。ヒトサイクリンＤ１及びマウスｃｙｌ１（図７）の
タンパク質配列との比較と、リボヌクレアーゼ保護実験
の予備結果に基づいて、λＤ２−Ｐ３とλＤ３−Ｈ３４
は、どちらも完全長のコード領域を含むと考えられる。
これまでに同定された１１種類の哺乳類サイクリンの全
てのタンパク質配列を比較して、構造上及び進化上の関
係を評価した。これには、サイクリンＡ、サイクリンＢ
１及びＢ２、６個のＤ−型サイクリン（３個がヒト由
来、３個がマウス由来）と、最近同定されたサイクリン
Ｅ及びＣ（図７）が含まれる。この比較から、Ｄ−型サ
イクリンに関するいくつかの特徴が観察された。第一に
は、サイクリンＤ１に関して前述したように、３種のサ
イクリンＤ遺伝子は、全て、２８９から２９５アミノ酸
残基の範囲の、同様の小さなサイズのタンパク質をコー
ドする。これは、これまでに発見されたもののうちで最
短のサイクリンである。第二には、これらは全て、Ａ−
及びＢ−型サイクリンのＮ−末端で同定されている、い
わゆる”デストラクション・ボックス”、を欠く。デス
トラクション・ボックスは、サイクリンを、ユビキチン
依存性分解経路へ標的設定する（Glotzer, M.ら, Natur
e 349:132-138(1991)）。このことから、Ｄ−型サイク
リンは、各細胞周期間の自身の周期的な分解を制御する
ために、別個の機構を進化させた、あるいは、Ｄ−型サ
イクリンはそのような分解を受けない、の何れかが示唆
される。第三に、３種のヒトサイクリンＤ遺伝子は、コ
ード領域全体にわたって非常に高い類似性を有する：Ｄ
１とＤ２との間で６０％、Ｄ２とＤ３との間で６０％、
Ｄ１とＤ３との間で５２％である。第四に、Ｄ−型サイ
クリンのメンバーは、Ｂ−型サイクリンのメンバーより
も、互いにより密接に関連している。サイクリン・ボッ
クス内で、３種のサイクリンＤ遺伝子では平均７８％で
あるのに対して、２種のサイクリンＢ遺伝子では５７％
である。これより、サイクリンＢ１からＢ２が分離した
あとに、Ｄ−型サイクリンの分離（出現）が起こったこ
とが示唆される。最後に、よく性質が調べられている核
分裂Ｂ−型サイクリンを指標として用いると、最も密接
に関連する遺伝子は、サイクリンＡ（平均５１％）、続
いて、Ｅ−型（４０％）、Ｄ−型（２９％）、そして、
Ｃ−型サイクリン（２０％）である。
【００１９】例５ ＣＣＤＮ２及びＣＣＤＮ３の染色体
上の座位決定 ＣＣＤＮ２ 及びＣＣＤＮ３の染色体上の座位を、蛍光ｉ
ｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成法によって決定した。以
前の記載通りに（Lichter, T.ら, Science 247:64-69(1
990)；Baldini, A.ら, Genomics 9: 770-774(1991)）、
染色体ｉｎ ｓｉｔｕ抑制ハイブリッド形成法、及び、
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド・バンド形成法を行なっ
た。簡単には、それぞれ１５及び１６ｋｂの挿入配列を
含むラムダゲノムＤＮＡλＤ２−Ｇ４及びλＤ３−Ｇ９
を、ニック−トランスレーション（Brigatti, D.J.ら,
Urology 126:32-50(1983)；Boyle, A.L., Current Prot
ocols in Molecular Biology、ウイレー、ニューヨー
ク、１９９１）によって、ビオチン−１１−ｄＵＤＰ
（シグマ）で標識した。プローブの大きさは、２００か
ら４００ヌクレオチドの範囲であり、取り込まれなかっ
たヌクレオチドを、セファデックスＧ−５０スピン・カ
ラムを用いて、プローブより分離した（Sambrook,J.ら,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual 、第二版、
コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コー
ルド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州 (198
9)）。常法（Lichter, T.ら, Science 247:64-69(199
0)）によって調製した中期染色体の展開物を、ビオチン
−標識Ｄ２−Ｇ４あるいはＤ３−Ｇ９で、ｉｎ ｓｉｔ
ｕハイブリッド形成を行なった。デオキシリボヌクレア
ーゼ処理した５μｇのヒト胎盤ＤＮＡ、デオキシリボヌ
クレアーゼ処理した７μｇのサケ精子ＤＮＡ、及び、１
００ｎｇの標識プローブを、変性、プレアニーリングし
た後、この混合物をＡｌｕプレハイブリダイズしたスラ
イドに加えた。この展開物で、４０ｎｇのＡｌｕ４８マ
ー・オリゴヌクレオチドを用いて、共ハイブリッド形成
を行った。それによって、染色体の同定、及び、プロー
ブ位置を明視化するために用いる、ｉｎ ｓｉｔｕハイ
ブリッド形成法のバンドパターンを作成した。変性した
染色体に加える前に、このＡｌｕ配列を、ジゴキシゲニ
ン−１１−ｄＵＴＰ（ベーリンガー−マンハイム）で化
学標識し、変性した。３７℃で１６−１８時間インキュ
ベートし、ハイブリッド形成後の洗浄を行なった後、ス
ライドをブロック溶液と検出試薬でインキュベートした
（Lichter, T.ら, Science 247:64-69(1990)）。蛍光イ
ソチオシアン酸（ＦＩＴＣ）と共役したアビジンＤＣＳ
（５μｇ／ｍｌ）（ベクター・ラボラトリーズ）を用い
て、ビオチン標識ＤＮＡを検出した；ジゴキシゲニン標
識ＤＮＡを、ローダミンと共役した抗ジゴキシゲニン抗
体（ベーリンガー・マンハイム）を用いて検出した。冷
却したＣＣＤカメラ（フォトメトリックスＣＨ２２０）
を装着したツァイス・アクシオスコープ−２０・エピ蛍
光顕微鏡を用いて、蛍光シグナルを別々にイメージ化し
た。アップル・マッキントッシュＩＩＸコンピューター
を用いて、カメラの調製、及び、像の補足を行なった。
以前の記載（Baldini, A.ら, Genomics 9: 770-774(199
1)）通りに、灰色の縮小図を、電子的に仮彩色し、合成
した。ＦＩＴＣとローダミンの像を合成するために、ジ
ーン・ジョイン・マックスピックス（Tim Randによるソ
フトウエア、D.Ward研究室、イエール）を用いて、マッ
キントッシュＩＩｃｉコンピューターでイメージ・プロ
セシングを行なった。コンピューターのモニターから、
直接、写真を撮影した。染色体蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイ
ブリッド形成法を用いて、Ｄ２−Ｇ４及びＤ３−Ｇ９の
座位を決定した。ビオチン標識プローブと、ジゴキシゲ
ニン標識Ａｌｕ４８マー・オリゴヌクレオチドを用い
た、二色の蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成を、直
接、明視化することによって、Ｄ２−Ｇ４が染色体１２
ｐのバンド１３上であり、Ｄ３−Ｇ９が染色体６ｐのバ
ンド２１上である、という細胞遺伝的座位の決定を行な
った（図５）。従来のＲバンド・パターンと一致するＡ
ｌｕ４８マーのＲバンドをイメージ化し、Ｄ２−Ｇ４及
びＤ３−Ｇ９ハイブリダイズ・プローブでできた像と合
成した。対応するＦＩＴＣ及びローダミン像を合成する
ことによって、Ｄ２−Ｇ４及びＤ３−Ｇ９の座位を、Ａ
ｌｕバンドに対して明視化した。合成像により、Ｄ２−
Ｇ４及びＤ３−Ｇ９が、それぞれ染色体１２及び６上に
あることが、直接、明視化された。Ｄ２−Ｇ４プローブ
は、ポジティブＲバンド１２ｐ１３上に位置し、Ｄ３−
Ｇ９は、ポジティブＲバンド６ｐ２１上に位置する。偽
遺伝子サイクリンＤ２あるいはＤ３との、交差ハイブリ
ッド形成は観察されなかった。これは、おそらく、交差
ハイブリッドを形成する可能性のある配列が、プローブ
として使用した１５及び１６ｋｂのゲノム断片のうち
の、ごく小さな部分であり、また、偽遺伝子のヌクレオ
チド配列が、先祖である活性遺伝子の配列からかけ離れ
てしまったためであると考えられる。
上の座位決定 ＣＣＤＮ２ 及びＣＣＤＮ３の染色体上の座位を、蛍光ｉ
ｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成法によって決定した。以
前の記載通りに（Lichter, T.ら, Science 247:64-69(1
990)；Baldini, A.ら, Genomics 9: 770-774(1991)）、
染色体ｉｎ ｓｉｔｕ抑制ハイブリッド形成法、及び、
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド・バンド形成法を行なっ
た。簡単には、それぞれ１５及び１６ｋｂの挿入配列を
含むラムダゲノムＤＮＡλＤ２−Ｇ４及びλＤ３−Ｇ９
を、ニック−トランスレーション（Brigatti, D.J.ら,
Urology 126:32-50(1983)；Boyle, A.L., Current Prot
ocols in Molecular Biology、ウイレー、ニューヨー
ク、１９９１）によって、ビオチン−１１−ｄＵＤＰ
（シグマ）で標識した。プローブの大きさは、２００か
ら４００ヌクレオチドの範囲であり、取り込まれなかっ
たヌクレオチドを、セファデックスＧ−５０スピン・カ
ラムを用いて、プローブより分離した（Sambrook,J.ら,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual 、第二版、
コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コー
ルド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州 (198
9)）。常法（Lichter, T.ら, Science 247:64-69(199
0)）によって調製した中期染色体の展開物を、ビオチン
−標識Ｄ２−Ｇ４あるいはＤ３−Ｇ９で、ｉｎ ｓｉｔ
ｕハイブリッド形成を行なった。デオキシリボヌクレア
ーゼ処理した５μｇのヒト胎盤ＤＮＡ、デオキシリボヌ
クレアーゼ処理した７μｇのサケ精子ＤＮＡ、及び、１
００ｎｇの標識プローブを、変性、プレアニーリングし
た後、この混合物をＡｌｕプレハイブリダイズしたスラ
イドに加えた。この展開物で、４０ｎｇのＡｌｕ４８マ
ー・オリゴヌクレオチドを用いて、共ハイブリッド形成
を行った。それによって、染色体の同定、及び、プロー
ブ位置を明視化するために用いる、ｉｎ ｓｉｔｕハイ
ブリッド形成法のバンドパターンを作成した。変性した
染色体に加える前に、このＡｌｕ配列を、ジゴキシゲニ
ン−１１−ｄＵＴＰ（ベーリンガー−マンハイム）で化
学標識し、変性した。３７℃で１６−１８時間インキュ
ベートし、ハイブリッド形成後の洗浄を行なった後、ス
ライドをブロック溶液と検出試薬でインキュベートした
（Lichter, T.ら, Science 247:64-69(1990)）。蛍光イ
ソチオシアン酸（ＦＩＴＣ）と共役したアビジンＤＣＳ
（５μｇ／ｍｌ）（ベクター・ラボラトリーズ）を用い
て、ビオチン標識ＤＮＡを検出した；ジゴキシゲニン標
識ＤＮＡを、ローダミンと共役した抗ジゴキシゲニン抗
体（ベーリンガー・マンハイム）を用いて検出した。冷
却したＣＣＤカメラ（フォトメトリックスＣＨ２２０）
を装着したツァイス・アクシオスコープ−２０・エピ蛍
光顕微鏡を用いて、蛍光シグナルを別々にイメージ化し
た。アップル・マッキントッシュＩＩＸコンピューター
を用いて、カメラの調製、及び、像の補足を行なった。
以前の記載（Baldini, A.ら, Genomics 9: 770-774(199
1)）通りに、灰色の縮小図を、電子的に仮彩色し、合成
した。ＦＩＴＣとローダミンの像を合成するために、ジ
ーン・ジョイン・マックスピックス（Tim Randによるソ
フトウエア、D.Ward研究室、イエール）を用いて、マッ
キントッシュＩＩｃｉコンピューターでイメージ・プロ
セシングを行なった。コンピューターのモニターから、
直接、写真を撮影した。染色体蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイ
ブリッド形成法を用いて、Ｄ２−Ｇ４及びＤ３−Ｇ９の
座位を決定した。ビオチン標識プローブと、ジゴキシゲ
ニン標識Ａｌｕ４８マー・オリゴヌクレオチドを用い
た、二色の蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成を、直
接、明視化することによって、Ｄ２−Ｇ４が染色体１２
ｐのバンド１３上であり、Ｄ３−Ｇ９が染色体６ｐのバ
ンド２１上である、という細胞遺伝的座位の決定を行な
った（図５）。従来のＲバンド・パターンと一致するＡ
ｌｕ４８マーのＲバンドをイメージ化し、Ｄ２−Ｇ４及
びＤ３−Ｇ９ハイブリダイズ・プローブでできた像と合
成した。対応するＦＩＴＣ及びローダミン像を合成する
ことによって、Ｄ２−Ｇ４及びＤ３−Ｇ９の座位を、Ａ
ｌｕバンドに対して明視化した。合成像により、Ｄ２−
Ｇ４及びＤ３−Ｇ９が、それぞれ染色体１２及び６上に
あることが、直接、明視化された。Ｄ２−Ｇ４プローブ
は、ポジティブＲバンド１２ｐ１３上に位置し、Ｄ３−
Ｇ９は、ポジティブＲバンド６ｐ２１上に位置する。偽
遺伝子サイクリンＤ２あるいはＤ３との、交差ハイブリ
ッド形成は観察されなかった。これは、おそらく、交差
ハイブリッドを形成する可能性のある配列が、プローブ
として使用した１５及び１６ｋｂのゲノム断片のうち
の、ごく小さな部分であり、また、偽遺伝子のヌクレオ
チド配列が、先祖である活性遺伝子の配列からかけ離れ
てしまったためであると考えられる。
【００２０】例６ ヒトＤ−型サイクリンのゲノムクロ
ーンの単離と性質の調査 ゲノム構造を調べ、染色体マッピング用のプローブを得
る目的で、ヒトＤ−型サイクリンのゲノムクローンを単
離し、性質を調べた。１．３ｋｂのサイクリンＤ１ｃＤ
ＮＡクローン全体をプローブとして用いて、ヒト正常肝
ゲノムライブラリーをスクリーニングした。５００万個
のゲノムクローンをスクリーニングし、ポジティブを３
個得た。まず、制限地図とハイブリッド形成を行なった
後、ラムダクローンＧ６を選択し、さらに分析した。λ
Ｄ１−Ｇ６の１．７ｋｂのＢａｍＨＩ断片を、ｐＵＣ１
１８にサブクローニングし、完全に配列決定を行なっ
た。以前に単離されたｃＤＮＡクローンとの比較と、リ
ボヌクレアーゼ保護分析の結果（Withers, D.A.ら, Mo
l. Cell. Biol. 11:4846-4853(1991)）から、この断片
が、サイクリンＤ１遺伝子の５’部分に対応することが
示された。図８Ａに示すように、これは、１１５０ｂｐ
の上流プロモーター配列と、１９８ｂｐのエクソンと、
それに続くイントロンを含む。上述のように（例４）、
マウスｃｙｌ２ｃＤＮＡをプローブとして用いた低スト
リンジェンシー・ハイブリッド形成条件下で、同様のス
クリーニングにより、１８個のラムダクローンが単離さ
れた。以前のｃＤＮＡライブラリー・スクリーニング
で、低ストリンジェンシーでは、マウスｃｙｌ２ｃＤＮ
Ａプローブは、ヒトＤ１遺伝子と交差ハイブリッドを形
成することが分かっていた。そのため、ヒトサイクリン
Ｄ１ｃＤＮＡをプローブとして用いて、高ストリンジェ
ンシーで、ドットブロット・ハイブリッド形成法を行な
った。１８個のクローンのうち、１０個が、ヒトＤ１プ
ローブとハイブリッドを形成し、８個は形成しなかっ
た。高ストリンジェンシーでヒトＤ１プローブとハイブ
リッドを形成しなかった８個のラムダクローンを、制限
消化分析に基づいて、λＤ２−Ｇ１、λＤ２−Ｇ２、λ
Ｄ２−Ｇ４で示される３クラスにそれぞれ分類した。こ
れらのラムダクローンをｐＵＣプラスミドベクターへサ
ブクローニングし、マウスｃｙｌ２ｃＤＮＡプローブを
用いて、サザンハイブリッド形成法により、コード領域
を含む小さな制限断片を同定した。次に、λＤ２−Ｇ１
由来の０．４ｋｂのＢａｍＨＩ断片をプローブとして用
いて、高ストリンジェンシーで、ヒト海馬ｃＤＮＡライ
ブラリーをスクリーニングした。詳細な制限地図と、部
分的な配列決定から、λＤ２−Ｇ１及びλＤ２−Ｇ２
は、同じ遺伝子に対応する異なるクローンであり、一方
で、λＤ２−Ｇ４は、異なる遺伝子に対応すると考えら
れることが示された。λＤ２−Ｇ４由来の２．７ｋｂの
ＳａｃＩ−ＳｍａＩ断片と、λＤ２−Ｇ１由来の１．５
ｋｂのＢｃｌＩ−ＢｇｌＩＩ断片を、完全に配列決定し
た。ヌクレオチド配列の比較より、クローンλＤ２−Ｇ
４は、Ｄ２ｃＤＮＡクローンλＤ２−Ｐ３に対応するこ
とが明かとなった（図３）。図８Ａに示すように、２．
７ｋｂのＳａｃＩ−ＳｍａＩ断片は、Ｄ２ｃＤＮＡ（図
３）中で同定された仮定の開始メチオニンコドンの５’
側の配列を１６２０ｂｐと、１９５ｂｐのエクソンと、
それに続く９０７ｂｐの介在配列を含む。ヒトサイクリ
ンＤ３に対応するラムダゲノムクローンを、ヒトＤ３ｃ
ＤＮＡをプローブとして用いて、同じゲノムライブラリ
ーから単離した。スクリーニングした４００万個のクロ
ーンのうち、９個がポジティブであった。λＤ３−Ｇ４
及びλＤ３−Ｇ９で示される２クラスのクローンを、制
限消化分析により区別した。これらは、どちらも５’サ
イクリンＤ３ｃＤＮＡプローブにハイブリダイズしたた
め、より詳細に制限地図を作成し、完全に配列決定を行
なうために、λＤ３−Ｇ５由来の２．０ｋｂのＨｉｎｄ
ＩＩＩ−ＳｃａＩ制限断片と、λＤ３−Ｇ９由来の３．
７ｋｂのＳａｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片を、さら
に、ｐＵＣプラスミドベクターへサブクローニングし
た。図９Ｃに示すように、クローンＧ９由来の３．７ｋ
ｂ断片は、Ｄ３ｃＤＮＡ（図４）中に同定された仮定の
開始メチオニンコドンの５’側の配列を１．８ｋｂと、
１９８ｂｐのエクソン１、６８４ｂｐのエクソン２、及
び、８７０ｂｐのイントロンを含む。サイクリンＤ１、
Ｄ２、Ｄ３のゲノムクローンの比較から、３種のヒトＣ
ＣＤＮ遺伝子のコード領域は、全て、同じ位置にイント
ロンが介入していることが明かとなった（図８で矢印で
示されている）。これは、サイクリンＤ遺伝子が分離す
る前に、イントロンが生じたことを示す。
ーンの単離と性質の調査 ゲノム構造を調べ、染色体マッピング用のプローブを得
る目的で、ヒトＤ−型サイクリンのゲノムクローンを単
離し、性質を調べた。１．３ｋｂのサイクリンＤ１ｃＤ
ＮＡクローン全体をプローブとして用いて、ヒト正常肝
ゲノムライブラリーをスクリーニングした。５００万個
のゲノムクローンをスクリーニングし、ポジティブを３
個得た。まず、制限地図とハイブリッド形成を行なった
後、ラムダクローンＧ６を選択し、さらに分析した。λ
Ｄ１−Ｇ６の１．７ｋｂのＢａｍＨＩ断片を、ｐＵＣ１
１８にサブクローニングし、完全に配列決定を行なっ
た。以前に単離されたｃＤＮＡクローンとの比較と、リ
ボヌクレアーゼ保護分析の結果（Withers, D.A.ら, Mo
l. Cell. Biol. 11:4846-4853(1991)）から、この断片
が、サイクリンＤ１遺伝子の５’部分に対応することが
示された。図８Ａに示すように、これは、１１５０ｂｐ
の上流プロモーター配列と、１９８ｂｐのエクソンと、
それに続くイントロンを含む。上述のように（例４）、
マウスｃｙｌ２ｃＤＮＡをプローブとして用いた低スト
リンジェンシー・ハイブリッド形成条件下で、同様のス
クリーニングにより、１８個のラムダクローンが単離さ
れた。以前のｃＤＮＡライブラリー・スクリーニング
で、低ストリンジェンシーでは、マウスｃｙｌ２ｃＤＮ
Ａプローブは、ヒトＤ１遺伝子と交差ハイブリッドを形
成することが分かっていた。そのため、ヒトサイクリン
Ｄ１ｃＤＮＡをプローブとして用いて、高ストリンジェ
ンシーで、ドットブロット・ハイブリッド形成法を行な
った。１８個のクローンのうち、１０個が、ヒトＤ１プ
ローブとハイブリッドを形成し、８個は形成しなかっ
た。高ストリンジェンシーでヒトＤ１プローブとハイブ
リッドを形成しなかった８個のラムダクローンを、制限
消化分析に基づいて、λＤ２−Ｇ１、λＤ２−Ｇ２、λ
Ｄ２−Ｇ４で示される３クラスにそれぞれ分類した。こ
れらのラムダクローンをｐＵＣプラスミドベクターへサ
ブクローニングし、マウスｃｙｌ２ｃＤＮＡプローブを
用いて、サザンハイブリッド形成法により、コード領域
を含む小さな制限断片を同定した。次に、λＤ２−Ｇ１
由来の０．４ｋｂのＢａｍＨＩ断片をプローブとして用
いて、高ストリンジェンシーで、ヒト海馬ｃＤＮＡライ
ブラリーをスクリーニングした。詳細な制限地図と、部
分的な配列決定から、λＤ２−Ｇ１及びλＤ２−Ｇ２
は、同じ遺伝子に対応する異なるクローンであり、一方
で、λＤ２−Ｇ４は、異なる遺伝子に対応すると考えら
れることが示された。λＤ２−Ｇ４由来の２．７ｋｂの
ＳａｃＩ−ＳｍａＩ断片と、λＤ２−Ｇ１由来の１．５
ｋｂのＢｃｌＩ−ＢｇｌＩＩ断片を、完全に配列決定し
た。ヌクレオチド配列の比較より、クローンλＤ２−Ｇ
４は、Ｄ２ｃＤＮＡクローンλＤ２−Ｐ３に対応するこ
とが明かとなった（図３）。図８Ａに示すように、２．
７ｋｂのＳａｃＩ−ＳｍａＩ断片は、Ｄ２ｃＤＮＡ（図
３）中で同定された仮定の開始メチオニンコドンの５’
側の配列を１６２０ｂｐと、１９５ｂｐのエクソンと、
それに続く９０７ｂｐの介在配列を含む。ヒトサイクリ
ンＤ３に対応するラムダゲノムクローンを、ヒトＤ３ｃ
ＤＮＡをプローブとして用いて、同じゲノムライブラリ
ーから単離した。スクリーニングした４００万個のクロ
ーンのうち、９個がポジティブであった。λＤ３−Ｇ４
及びλＤ３−Ｇ９で示される２クラスのクローンを、制
限消化分析により区別した。これらは、どちらも５’サ
イクリンＤ３ｃＤＮＡプローブにハイブリダイズしたた
め、より詳細に制限地図を作成し、完全に配列決定を行
なうために、λＤ３−Ｇ５由来の２．０ｋｂのＨｉｎｄ
ＩＩＩ−ＳｃａＩ制限断片と、λＤ３−Ｇ９由来の３．
７ｋｂのＳａｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片を、さら
に、ｐＵＣプラスミドベクターへサブクローニングし
た。図９Ｃに示すように、クローンＧ９由来の３．７ｋ
ｂ断片は、Ｄ３ｃＤＮＡ（図４）中に同定された仮定の
開始メチオニンコドンの５’側の配列を１．８ｋｂと、
１９８ｂｐのエクソン１、６８４ｂｐのエクソン２、及
び、８７０ｂｐのイントロンを含む。サイクリンＤ１、
Ｄ２、Ｄ３のゲノムクローンの比較から、３種のヒトＣ
ＣＤＮ遺伝子のコード領域は、全て、同じ位置にイント
ロンが介入していることが明かとなった（図８で矢印で
示されている）。これは、サイクリンＤ遺伝子が分離す
る前に、イントロンが生じたことを示す。
【００２１】例７ ２個のサイクリンＤ偽遺伝子の単離
と性質調査 クローンλＤ２−Ｇ１からサブクローニングされた１．
５ｋｂのＢｃｌＩ−ＢｇｌＩＩ断片を、完全に配列決定
し、サイクリンＤ２ｃＤＮＡクローンであるλＤ２−Ｐ
３と比較した。図１０に示すように、これは、内部に停
止コドンを３個（ヌクレオチド位置４９５，９５６、１
３１０、アステリスクで示す）と、フレームシフト２個
（位置１１８８、１２９１、スラッシュ線）と、挿入１
個と、欠失１個を含んでいた。また、多数のミスセンス
・ヌクレオチド置換を蓄積しており、そのうちのいくつ
かは、全サイクリンで保存されている位置で発生してい
た。例えば、Ｄ２ｃＤＮＡ（図３）の位置２７７から２
７９に位置するトリプレットＣＧＴは、アミノ酸Ａｒｇ
をコードし、これは全サイクリンで不変の残基である
（図８Ａ）。クローンＤ２−Ｇ１（図１０）の対応する
位置（ヌクレオチド７３１）で、ヌクレオチドがＣから
Ｔへ変化することにより、Ａｒｇではなく、Ｃｙｓをコ
ードするトリプレットＴＧＴが発生した。クローンλＤ
３−Ｇ５由来の２．０ｋｂのＨｉｎｄＩＩ−ＳｃａＩ断
片の配列決定から、サイクリンＤ３偽遺伝子が明らかと
なった（図１１）。ナンセンス変異（ヌクレオチド位置
１２６５）、フレームシフト２個（位置１２１０、１６
７９）、１５ｂｐの内部重複（位置１３６１から１３７
６の下線領域）、及び、多数のミスセンス変異に加え
て、位置１１８２でＡがＧへ変化することにより、その
結果、仮定の開始メチオニンコドンＡＴＧから、Ｖａｌ
をコードするＧＴＧへ、アミノ酸が変化した。これらの
分析に基づいて、クローンλＤ２−Ｐ３及びλＤ３−Ｇ
５が、それぞれサイクリンＤ２及びＤ３の偽遺伝子を含
むと、結論した。
と性質調査 クローンλＤ２−Ｇ１からサブクローニングされた１．
５ｋｂのＢｃｌＩ−ＢｇｌＩＩ断片を、完全に配列決定
し、サイクリンＤ２ｃＤＮＡクローンであるλＤ２−Ｐ
３と比較した。図１０に示すように、これは、内部に停
止コドンを３個（ヌクレオチド位置４９５，９５６、１
３１０、アステリスクで示す）と、フレームシフト２個
（位置１１８８、１２９１、スラッシュ線）と、挿入１
個と、欠失１個を含んでいた。また、多数のミスセンス
・ヌクレオチド置換を蓄積しており、そのうちのいくつ
かは、全サイクリンで保存されている位置で発生してい
た。例えば、Ｄ２ｃＤＮＡ（図３）の位置２７７から２
７９に位置するトリプレットＣＧＴは、アミノ酸Ａｒｇ
をコードし、これは全サイクリンで不変の残基である
（図８Ａ）。クローンＤ２−Ｇ１（図１０）の対応する
位置（ヌクレオチド７３１）で、ヌクレオチドがＣから
Ｔへ変化することにより、Ａｒｇではなく、Ｃｙｓをコ
ードするトリプレットＴＧＴが発生した。クローンλＤ
３−Ｇ５由来の２．０ｋｂのＨｉｎｄＩＩ−ＳｃａＩ断
片の配列決定から、サイクリンＤ３偽遺伝子が明らかと
なった（図１１）。ナンセンス変異（ヌクレオチド位置
１２６５）、フレームシフト２個（位置１２１０、１６
７９）、１５ｂｐの内部重複（位置１３６１から１３７
６の下線領域）、及び、多数のミスセンス変異に加え
て、位置１１８２でＡがＧへ変化することにより、その
結果、仮定の開始メチオニンコドンＡＴＧから、Ｖａｌ
をコードするＧＴＧへ、アミノ酸が変化した。これらの
分析に基づいて、クローンλＤ２−Ｐ３及びλＤ３−Ｇ
５が、それぞれサイクリンＤ２及びＤ３の偽遺伝子を含
むと、結論した。
【００２２】変更例 当業者には、通常の実験法を用いて、ここに記載されて
いる特定の実施例に関して、多くの変更例を実施するこ
とができることがわかるであろう。そのような変更例
も、特許請求の範囲で網羅される。
いる特定の実施例に関して、多くの変更例を実施するこ
とができることがわかるであろう。そのような変更例
も、特許請求の範囲で網羅される。
【００２３】寄託された微生物への言及 本微生物は、国際出願日の明細書１２ページ、２８行に
記載されている。 Ａ．寄託の証明 寄託先 アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション 寄託先の住所 アメリカ合衆国 ２０８５２ メリーランド州 ロック
ビル パークローンドライブ １２３０１ 寄託日 １９９１年５月１４日受託番号 ６８６２０ Ｂ．追加指示 ヨーロッパ特許の指定国に関して、出願人は、ヨーロッ
パ特許条約施行規則第２８規則（４）にもとづいて、下
記をヨーロッパ特許庁へ報告する。アメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクションに受託番号６８６２０で寄
託された生物学的物質は、ヨーロッパ特許の特許付与の
公表、ヨーロッパ特許の拒絶日、取り下げ日、取り下げ
られたとみなされる日まで、ヨーロッパ特許条約施行規
則第２８規則（５）に従う請求によって指名された専門
家に対してのみ、入手可能である。 Ｃ．上記指示の指定国 ＥＰ（ヨーロッパ） ＣＡ（カナダ） ＪＰ（日本） Ｄ．上記指示の備考 受託番号６８６２０
記載されている。 Ａ．寄託の証明 寄託先 アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション 寄託先の住所 アメリカ合衆国 ２０８５２ メリーランド州 ロック
ビル パークローンドライブ １２３０１ 寄託日 １９９１年５月１４日受託番号 ６８６２０ Ｂ．追加指示 ヨーロッパ特許の指定国に関して、出願人は、ヨーロッ
パ特許条約施行規則第２８規則（４）にもとづいて、下
記をヨーロッパ特許庁へ報告する。アメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクションに受託番号６８６２０で寄
託された生物学的物質は、ヨーロッパ特許の特許付与の
公表、ヨーロッパ特許の拒絶日、取り下げ日、取り下げ
られたとみなされる日まで、ヨーロッパ特許条約施行規
則第２８規則（５）に従う請求によって指名された専門
家に対してのみ、入手可能である。 Ｃ．上記指示の指定国 ＥＰ（ヨーロッパ） ＣＡ（カナダ） ＪＰ（日本） Ｄ．上記指示の備考 受託番号６８６２０
図１は、ヒトサイクリン遺伝子の遺伝子スクリーニング
を図示する。図２は、ヒトサイクリンＤ１の核酸配列
（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）及びアミノ酸配列（ＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ．２）である。ヌクレオチド番号とアミノ
酸番号を右に記す。アミノ酸番号は、開始メチオニンを
１番として数えた。停止コドンをアスタリスクで示す。
図３は、ヒトサイクリンＤ２の核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ．３）及びアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．
４）である。ヌクレオチド番号とアミノ酸番号を右に記
す。アミノ酸番号は、開始メチオニンを１番として数え
た。停止コドンをアスタリスクで示す。図４は、ヒトサ
イクリンＤ３の核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５）及
びアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６）である。ヌ
クレオチド番号とアミノ酸番号を右に記す。アミノ酸番
号は、開始メチオニンを１番として数えた。停止コドン
をアスタリスクで示す。図５は、サイクリン遺伝子ファ
ミリーを示す。図５Ａは、７種のサイクリン遺伝子のア
ミノ酸配列を整列したものを示す（ＣＹＣＤ１−Ｈｓ，
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７；ＣＹＣＡ−Ｈｓ，ＳＥＱ Ｉ
Ｄ Ｎｏ．８；ＣＹＣＡ−Ｄｍ，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．
９；ＣＹＣＢ１−Ｈｓ，ＳＥＱＩＤ Ｎｏ．１０；ＣＹ
Ｃ１３−Ｓｐ，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１；ＣＬＮ１−
Ｓｃ，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１２；ＣＬＮ３−Ｓｃ，Ｓ
ＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３）。いくつかの配列中の数字
は、挿入の結果、配列から省略したアミノ酸残基の数を
示す。図５Ｂは、ネイバー・ジョイニング法で作成した
サイクリン・ファミリーの進化樹を図示する；水平線の
長さがダイバージェンスを示す。図６は、サイクリンＤ
１遺伝子転写物の択一的ポリアデニル化を示す。図６Ａ
は、様々な細胞株から単離されたいくつかのｃＤＮＡク
ローンの比較を示す。白抜きの箱は、サイクリンＤ１遺
伝子のコード領域を含む１．７ｋｂの小さな転写物を示
す。斜線の箱は、４．８ｋｂ長の転写物に存在する３’
断片を示す。各ｃＤＮＡクローンの上に制限部位を示し
て、これらのクローンが整列されていることを示す。図
６Ｂは、いくつかのクローンに関して、最初のポリアデ
ニル化部位を取り囲むヌクレオチド配列を示す（ＣＹＣ
Ｄ１−２１，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４；ＣＹＣＤ１−
Ｈ１２，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１５；ＣＹＣＤ１−Ｈ０
３４，ＳＥＱＩＤ Ｎｏ．１６；ＣＹＣＤ１−Ｔ０７
８，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１７、及び、ゲノムクロー
ン；ＣＹＣＤ１−Ｇ０６８，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１
８）。図７は、１１種の哺乳類サイクリンのタンパク質
配列の比較を示す（ＣＹＣＤ１−Ｈｓ，ＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ．１９；ＣＹＬ１−Ｍｍ，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２
０；ＣＹＣＤ２−Ｈｓ，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２１；Ｃ
ＹＣＬ２−Ｍｍ，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２２；ＣＹＣＤ
３−Ｈｓ，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２３；ＣＹＬ３−Ｍ
ｍ，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２４；ＣＹＣＡ−Ｈｓ，ＳＥ
Ｑ ＩＤ Ｎｏ．２５；ＣＹＣＢ１−Ｈｓ，ＳＥＱ Ｉ
Ｄ Ｎｏ．２６；ＣＹＣＢ２−Ｈｓ，ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ．２７；ＣＹＣＣ−Ｈｓ，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２
８；ＣＹＣＥ−Ｈｓ，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２９）。図
８は、ヒトサイクリンＤ遺伝子のゲノム構造を図示す
る。各図形は、各サイクリンＤ遺伝子由来の、完全に配
列決定を行った制限断片を示す。黒塗の箱は、エクソン
配列を示す。白抜きの箱は、イントロン、あるいは、
５’及び３’非翻訳配列を示す。斜線の箱は、偽遺伝子
を示す。各クローンの上に、いくつかの制限部位、ＡＴ
Ｇ、及び、停止コドンを示す。図９は、サイクリンＤ２
偽遺伝子の核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３０）及び
アミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３１）を示す。図
１０は、サイクリンＤ３偽遺伝子の核酸配列（ＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ．３２）及びアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ．３３）を示す。図１１は、１．３ｋｂのヒトサイ
クリンＤ１プロモーターの核酸配列（ＳＥＱＩＤ Ｎ
ｏ．３４）を示す。この配列は、開始ＡＴＧコドンで終
わる。転写は、およそヌクレオチド−１６０で開始す
る。図１２は、１．６ｋｂのヒトサイクリンＤ２プロモ
ーターの核酸配列（ＳＥＱＩＤ Ｎｏ．３５）を示す。
この配列は、開始ＡＴＧコドンで終わる。転写は、およ
そヌクレオチド−１７０で開始する。図１３は、３．２
ｋｂのヒトサイクリンＤ３プロモーターの核酸配列（Ｓ
ＥＱＩＤ Ｎｏ．３６）を示す。この配列は、開始ＡＴ
Ｇコドンで終わる。転写は、およそヌクレオチド−１６
０で開始する。
を図示する。図２は、ヒトサイクリンＤ１の核酸配列
（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）及びアミノ酸配列（ＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ．２）である。ヌクレオチド番号とアミノ
酸番号を右に記す。アミノ酸番号は、開始メチオニンを
１番として数えた。停止コドンをアスタリスクで示す。
図３は、ヒトサイクリンＤ２の核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ．３）及びアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．
４）である。ヌクレオチド番号とアミノ酸番号を右に記
す。アミノ酸番号は、開始メチオニンを１番として数え
た。停止コドンをアスタリスクで示す。図４は、ヒトサ
イクリンＤ３の核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５）及
びアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６）である。ヌ
クレオチド番号とアミノ酸番号を右に記す。アミノ酸番
号は、開始メチオニンを１番として数えた。停止コドン
をアスタリスクで示す。図５は、サイクリン遺伝子ファ
ミリーを示す。図５Ａは、７種のサイクリン遺伝子のア
ミノ酸配列を整列したものを示す（ＣＹＣＤ１−Ｈｓ，
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７；ＣＹＣＡ−Ｈｓ，ＳＥＱ Ｉ
Ｄ Ｎｏ．８；ＣＹＣＡ−Ｄｍ，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．
９；ＣＹＣＢ１−Ｈｓ，ＳＥＱＩＤ Ｎｏ．１０；ＣＹ
Ｃ１３−Ｓｐ，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１；ＣＬＮ１−
Ｓｃ，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１２；ＣＬＮ３−Ｓｃ，Ｓ
ＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３）。いくつかの配列中の数字
は、挿入の結果、配列から省略したアミノ酸残基の数を
示す。図５Ｂは、ネイバー・ジョイニング法で作成した
サイクリン・ファミリーの進化樹を図示する；水平線の
長さがダイバージェンスを示す。図６は、サイクリンＤ
１遺伝子転写物の択一的ポリアデニル化を示す。図６Ａ
は、様々な細胞株から単離されたいくつかのｃＤＮＡク
ローンの比較を示す。白抜きの箱は、サイクリンＤ１遺
伝子のコード領域を含む１．７ｋｂの小さな転写物を示
す。斜線の箱は、４．８ｋｂ長の転写物に存在する３’
断片を示す。各ｃＤＮＡクローンの上に制限部位を示し
て、これらのクローンが整列されていることを示す。図
６Ｂは、いくつかのクローンに関して、最初のポリアデ
ニル化部位を取り囲むヌクレオチド配列を示す（ＣＹＣ
Ｄ１−２１，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４；ＣＹＣＤ１−
Ｈ１２，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１５；ＣＹＣＤ１−Ｈ０
３４，ＳＥＱＩＤ Ｎｏ．１６；ＣＹＣＤ１−Ｔ０７
８，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１７、及び、ゲノムクロー
ン；ＣＹＣＤ１−Ｇ０６８，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１
８）。図７は、１１種の哺乳類サイクリンのタンパク質
配列の比較を示す（ＣＹＣＤ１−Ｈｓ，ＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ．１９；ＣＹＬ１−Ｍｍ，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２
０；ＣＹＣＤ２−Ｈｓ，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２１；Ｃ
ＹＣＬ２−Ｍｍ，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２２；ＣＹＣＤ
３−Ｈｓ，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２３；ＣＹＬ３−Ｍ
ｍ，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２４；ＣＹＣＡ−Ｈｓ，ＳＥ
Ｑ ＩＤ Ｎｏ．２５；ＣＹＣＢ１−Ｈｓ，ＳＥＱ Ｉ
Ｄ Ｎｏ．２６；ＣＹＣＢ２−Ｈｓ，ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ．２７；ＣＹＣＣ−Ｈｓ，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２
８；ＣＹＣＥ−Ｈｓ，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２９）。図
８は、ヒトサイクリンＤ遺伝子のゲノム構造を図示す
る。各図形は、各サイクリンＤ遺伝子由来の、完全に配
列決定を行った制限断片を示す。黒塗の箱は、エクソン
配列を示す。白抜きの箱は、イントロン、あるいは、
５’及び３’非翻訳配列を示す。斜線の箱は、偽遺伝子
を示す。各クローンの上に、いくつかの制限部位、ＡＴ
Ｇ、及び、停止コドンを示す。図９は、サイクリンＤ２
偽遺伝子の核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３０）及び
アミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３１）を示す。図
１０は、サイクリンＤ３偽遺伝子の核酸配列（ＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ．３２）及びアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ．３３）を示す。図１１は、１．３ｋｂのヒトサイ
クリンＤ１プロモーターの核酸配列（ＳＥＱＩＤ Ｎ
ｏ．３４）を示す。この配列は、開始ＡＴＧコドンで終
わる。転写は、およそヌクレオチド−１６０で開始す
る。図１２は、１．６ｋｂのヒトサイクリンＤ２プロモ
ーターの核酸配列（ＳＥＱＩＤ Ｎｏ．３５）を示す。
この配列は、開始ＡＴＧコドンで終わる。転写は、およ
そヌクレオチド−１７０で開始する。図１３は、３．２
ｋｂのヒトサイクリンＤ３プロモーターの核酸配列（Ｓ
ＥＱＩＤ Ｎｏ．３６）を示す。この配列は、開始ＡＴ
Ｇコドンで終わる。転写は、およそヌクレオチド−１６
０で開始する。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１３年３月２９日（２００１．３．２
９）
９）
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒトサイクリン遺伝子の遺伝子スクリーニング
を図示する。
を図示する。
【図２】ヒトサイクリンＤ１の核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ．１）及びアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．
２）である。ヌクレオチド番号とアミノ酸番号を右に記
す。アミノ酸番号は、開始メチオニンを１番として数え
た。停止コドンをアスタリスクで示す。
Ｎｏ．１）及びアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．
２）である。ヌクレオチド番号とアミノ酸番号を右に記
す。アミノ酸番号は、開始メチオニンを１番として数え
た。停止コドンをアスタリスクで示す。
【図３】ヒトサイクリンＤ２の核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ．３）及びアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．
４）である。ヌクレオチド番号とアミノ酸番号を右に記
す。アミノ酸番号は、開始メチオニンを１番として数え
た。停止コドンをアスタリスクで示す。
Ｎｏ．３）及びアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．
４）である。ヌクレオチド番号とアミノ酸番号を右に記
す。アミノ酸番号は、開始メチオニンを１番として数え
た。停止コドンをアスタリスクで示す。
【図４】ヒトサイクリンＤ３の核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ．５）及びアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．
６）である。ヌクレオチド番号とアミノ酸番号を右に記
す。アミノ酸番号は、開始メチオニンを１番として数え
た。停止コドンをアスタリスクで示す。
Ｎｏ．５）及びアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．
６）である。ヌクレオチド番号とアミノ酸番号を右に記
す。アミノ酸番号は、開始メチオニンを１番として数え
た。停止コドンをアスタリスクで示す。
【図５】サイクリン遺伝子ファミリーを示す。図５Ａ
は、７種のサイクリン遺伝子のアミノ酸配列を整列した
ものを示す（ＣＹＣＤ１−Ｈｓ，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．
７；ＣＹＣＡ−Ｈｓ，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８；ＣＹＣ
Ａ−Ｄｍ，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９；ＣＹＣＢ１−Ｈ
ｓ，ＳＥＱＩＤ Ｎｏ．１０；ＣＹＣ１３−Ｓｐ，ＳＥ
Ｑ ＩＤ Ｎｏ．１１；ＣＬＮ１−Ｓｃ，ＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ．１２；ＣＬＮ３−Ｓｃ，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．
１３）。いくつかの配列中の数字は、挿入の結果、配列
から省略したアミノ酸残基の数を示す。図５Ｂは、ネイ
バー・ジョイニング法で作成したサイクリン・ファミリ
ーの進化樹を図示する；水平線の長さがダイバージェン
スを示す。
は、７種のサイクリン遺伝子のアミノ酸配列を整列した
ものを示す（ＣＹＣＤ１−Ｈｓ，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．
７；ＣＹＣＡ−Ｈｓ，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８；ＣＹＣ
Ａ−Ｄｍ，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９；ＣＹＣＢ１−Ｈ
ｓ，ＳＥＱＩＤ Ｎｏ．１０；ＣＹＣ１３−Ｓｐ，ＳＥ
Ｑ ＩＤ Ｎｏ．１１；ＣＬＮ１−Ｓｃ，ＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ．１２；ＣＬＮ３−Ｓｃ，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．
１３）。いくつかの配列中の数字は、挿入の結果、配列
から省略したアミノ酸残基の数を示す。図５Ｂは、ネイ
バー・ジョイニング法で作成したサイクリン・ファミリ
ーの進化樹を図示する；水平線の長さがダイバージェン
スを示す。
【図６】サイクリンＤ１遺伝子転写物の択一的ポリアデ
ニル化を示す。図６Ａは、様々な細胞株から単離された
いくつかのｃＤＮＡクローンの比較を示す。白抜きの箱
は、サイクリンＤ１遺伝子のコード領域を含む１．７ｋ
ｂの小さな転写物を示す。斜線の箱は、４．８ｋｂ長の
転写物に存在する３’断片を示す。各ｃＤＮＡクローン
の上に制限部位を示して、これらのクローンが整列され
ていることを示す。図６Ｂは、いくつかのクローンに関
して、最初のポリアデニル化部位を取り囲むヌクレオチ
ド配列を示す（ＣＹＣＤ１−２１，ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ．１４；ＣＹＣＤ１−Ｈ１２，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．
１５；ＣＹＣＤ１−Ｈ０３４，ＳＥＱＩＤ Ｎｏ．１
６；ＣＹＣＤ１−Ｔ０７８，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１
７、及び、ゲノムクローン；ＣＹＣＤ１−Ｇ０６８，Ｓ
ＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１８）。
ニル化を示す。図６Ａは、様々な細胞株から単離された
いくつかのｃＤＮＡクローンの比較を示す。白抜きの箱
は、サイクリンＤ１遺伝子のコード領域を含む１．７ｋ
ｂの小さな転写物を示す。斜線の箱は、４．８ｋｂ長の
転写物に存在する３’断片を示す。各ｃＤＮＡクローン
の上に制限部位を示して、これらのクローンが整列され
ていることを示す。図６Ｂは、いくつかのクローンに関
して、最初のポリアデニル化部位を取り囲むヌクレオチ
ド配列を示す（ＣＹＣＤ１−２１，ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ．１４；ＣＹＣＤ１−Ｈ１２，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．
１５；ＣＹＣＤ１−Ｈ０３４，ＳＥＱＩＤ Ｎｏ．１
６；ＣＹＣＤ１−Ｔ０７８，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１
７、及び、ゲノムクローン；ＣＹＣＤ１−Ｇ０６８，Ｓ
ＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１８）。
【図７】１１種の哺乳類サイクリンのタンパク質配列の
比較を示す（ＣＹＣＤ１−Ｈｓ，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．
１９；ＣＹＬ１−Ｍｍ，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２０；Ｃ
ＹＣＤ２−Ｈｓ，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２１；ＣＹＣＬ
２−Ｍｍ，ＳＥＱ ＩＤＮｏ．２２；ＣＹＣＤ３−Ｈ
ｓ，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２３；ＣＹＬ３−Ｍｍ，ＳＥ
Ｑ ＩＤ Ｎｏ．２４；ＣＹＣＡ−Ｈｓ，ＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ．２５；ＣＹＣＢ１−Ｈｓ，ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ．２６；ＣＹＣＢ２−Ｈｓ，ＳＥＱ ＩＤＮｏ．２
７；ＣＹＣＣ−Ｈｓ，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２８；ＣＹ
ＣＥ−Ｈｓ，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２９）。
比較を示す（ＣＹＣＤ１−Ｈｓ，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．
１９；ＣＹＬ１−Ｍｍ，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２０；Ｃ
ＹＣＤ２−Ｈｓ，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２１；ＣＹＣＬ
２−Ｍｍ，ＳＥＱ ＩＤＮｏ．２２；ＣＹＣＤ３−Ｈ
ｓ，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２３；ＣＹＬ３−Ｍｍ，ＳＥ
Ｑ ＩＤ Ｎｏ．２４；ＣＹＣＡ−Ｈｓ，ＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ．２５；ＣＹＣＢ１−Ｈｓ，ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ．２６；ＣＹＣＢ２−Ｈｓ，ＳＥＱ ＩＤＮｏ．２
７；ＣＹＣＣ−Ｈｓ，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２８；ＣＹ
ＣＥ−Ｈｓ，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２９）。
【図８】ヒトサイクリンＤ遺伝子のゲノム構造を図示す
る。各図形は、各サイクリンＤ遺伝子由来の、完全に配
列決定を行った制限断片を示す。黒塗の箱は、エクソン
配列を示す。白抜きの箱は、イントロン、あるいは、
５’及び３’非翻訳配列を示す。斜線の箱は、偽遺伝子
を示す。各クローンの上に、いくつかの制限部位、ＡＴ
Ｇ、及び、停止コドンを示す。
る。各図形は、各サイクリンＤ遺伝子由来の、完全に配
列決定を行った制限断片を示す。黒塗の箱は、エクソン
配列を示す。白抜きの箱は、イントロン、あるいは、
５’及び３’非翻訳配列を示す。斜線の箱は、偽遺伝子
を示す。各クローンの上に、いくつかの制限部位、ＡＴ
Ｇ、及び、停止コドンを示す。
【図９】サイクリンＤ２偽遺伝子の核酸配列（ＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ．３０）及びアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ．３１）を示す。
ＩＤ Ｎｏ．３０）及びアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ．３１）を示す。
【図１０】サイクリンＤ３偽遺伝子の核酸配列（ＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ．３２）及びアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ．３３）を示す。
ＩＤ Ｎｏ．３２）及びアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ．３３）を示す。
【図１１】１．３ｋｂのヒトサイクリンＤ１プロモータ
ーの核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３４）を示す。こ
の配列は、開始ＡＴＧコドンで終わる。転写は、およそ
ヌクレオチド−１６０で開始する。
ーの核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３４）を示す。こ
の配列は、開始ＡＴＧコドンで終わる。転写は、およそ
ヌクレオチド−１６０で開始する。
【図１２】１．６ｋｂのヒトサイクリンＤ２プロモータ
ーの核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３５）を示す。こ
の配列は、開始ＡＴＧコドンで終わる。転写は、およそ
ヌクレオチド−１７０で開始する。
ーの核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３５）を示す。こ
の配列は、開始ＡＴＧコドンで終わる。転写は、およそ
ヌクレオチド−１７０で開始する。
【図１３】３．２ｋｂのヒトサイクリンＤ３プロモータ
ーの核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３６）を示す。こ
の配列は、開始ＡＴＧコドンで終わる。転写は、およそ
ヌクレオチド−１６０で開始する。
ーの核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３６）を示す。こ
の配列は、開始ＡＴＧコドンで終わる。転写は、およそ
ヌクレオチド−１６０で開始する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/68 (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ //(Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｒ 1:645） Ｃ１２Ｒ 1:645） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
Claims (6)
- 【請求項１】 G1期において活性である哺乳類サイクリ
ンをコードする遺伝子を同定するための方法であって、 変異酵母細胞に、試験DNA配列を含む酵母発現ベクター
を導入し、前記変異酵母細胞が、細胞周期の開始に必須
な少なくとも一つの遺伝子内に変異を有し、前記変異酵
母細胞を、前記遺伝子あるいは複数の遺伝子の発現を阻
害するような条件下で増殖させたときに、前記変異が、
前記細胞周期の開始の直前の期における停止を引き起こ
し、 前記形質転換された酵母細胞を、前記遺伝子あるいは複
数の遺伝子の発現を阻害する条件下における増殖能力に
ついて、選択する、ステップから成り、 前記形質転換された酵母細胞を細胞周期の開始点に導入
するようなDNA試験配列を発現する、形質転換された酵
母細胞が選択される、ことを特徴とする方法。 - 【請求項２】 前記酵母発現ベクターがｐADNSであり、
前記変異酵母細胞が、不活性なCLN1遺伝子と、不活性な
CLN2遺伝子と、変異CLN3遺伝子とを有し、前記変異CLN3
遺伝子が、グルコース抑制性のプロモーターから条件的
に発現され、発現を阻害する前記条件が、グルコースか
ら構成される培地の存在下での増殖であることを特徴と
する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 D-型サイクリンを含む複合体のキナーゼ
活性の阻害剤を同定するための方法であって、D-型サイ
クリン及びプロテインキナーゼの複合体を試験化合物で
処理する工程と、結果として生じた複合体のキナーゼ活
性を、前記化合物によるサイクリン依存性キナーゼ活性
の阻害を示すキナーゼ活性の減少によって、測定する方
法と、を包含する方法。 - 【請求項４】 D-型サイクリン依存性キナーゼ活性の阻
害剤と同定された複合体が細胞に進入するのに適した条
件において、前記細胞を前記複合体で処理し、細胞分裂
の速度を測定し、この速度と、処理されていない細胞の
分裂速度とを比較する更なる工程、を包含する請求項３
に記載の方法。 - 【請求項５】 阻害剤として同定された１つ又はそれ以
上の化合物を、患者に対する薬剤として投与するために
調剤する更なる工程、を包含する請求項３又は４に記載
の方法。 - 【請求項６】 請求項５に従って調剤された1つ又はそ
れ以上の化合物を、不必要な細胞分裂を制御するのに十
分な量で投与すること、を包含する不必要な細胞分裂の
速度を低下させるための方法。
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| US70151491A | 1991-05-16 | 1991-05-16 | |
| US701,514 | 1991-05-16 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5500242A Division JPH06507787A (ja) | 1991-05-16 | 1992-05-18 | Ｄ−型サイクリン並びにそれに関連する使用方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001299368A true JP2001299368A (ja) | 2001-10-30 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5500242A Withdrawn JPH06507787A (ja) | 1991-05-16 | 1992-05-18 | Ｄ−型サイクリン並びにそれに関連する使用方法 |
| JP2001060722A Pending JP2001299368A (ja) | 1991-05-16 | 2001-03-05 | Ｄ−型サイクリンに関連する使用方法 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5500242A Withdrawn JPH06507787A (ja) | 1991-05-16 | 1992-05-18 | Ｄ−型サイクリン並びにそれに関連する使用方法 |
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|---|---|
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| JP (2) | JPH06507787A (ja) |
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| WO (1) | WO1992020796A2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007121261A (ja) * | 2005-09-27 | 2007-05-17 | Sysmex Corp | 被検出物質の検出方法 |
| JP2008514208A (ja) * | 2004-10-02 | 2008-05-08 | イマティクス バイオテクノロジーズ ゲーエムベーハー | ヒト腫瘍抗原からの免疫原性ｔヘルパーエピトープおよび前記エピトープを使用する免疫療法の方法 |
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| US6372249B1 (en) | 1991-12-16 | 2002-04-16 | Baylor College Of Medicine | Senscent cell-derived inhibitors of DNA synthesis |
| US5543291A (en) * | 1993-01-29 | 1996-08-06 | Dana Farber Cancer Institute | Method of detecting carcinoma |
| US5443962A (en) | 1993-06-04 | 1995-08-22 | Mitotix, Inc. | Methods of identifying inhibitors of cdc25 phosphatase |
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| US6033847A (en) * | 1995-02-06 | 2000-03-07 | St. Jude Children's Research Hospital | InK4c-p18 and InK4d-p19, inhibitors of cyclin-dependent kinases CDK4 and CDK6, and uses thereof |
| US6407062B1 (en) | 1995-09-27 | 2002-06-18 | St. Jude Children's Research Hospital | ARF-P19, a novel regulator of the mammalian cell cycle |
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| US5723313A (en) | 1995-09-27 | 1998-03-03 | St. Jude Children's Research Hospital | ARF-p19, a novel regulator of the mammalian cell cycle |
| GB9718913D0 (en) | 1997-09-05 | 1997-11-12 | Glaxo Group Ltd | Substituted oxindole derivatives |
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| WO2013019730A1 (en) | 2011-07-29 | 2013-02-07 | The Washington University | Antibodies to tip-1 and grp78 |
| EP3172222A4 (en) | 2014-07-24 | 2018-03-21 | Washington University | Compositions targeting radiation-induced molecules and methods of use thereof |
| WO2018148595A1 (en) | 2017-02-10 | 2018-08-16 | Washington University | Antibodies to tip1 and methods of use thereof |
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-
1992
- 1992-05-18 EP EP92913100A patent/EP0584264A1/en not_active Withdrawn
- 1992-05-18 WO PCT/US1992/004146 patent/WO1992020796A2/en not_active Application Discontinuation
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- 1992-05-18 JP JP5500242A patent/JPH06507787A/ja not_active Withdrawn
-
2001
- 2001-03-05 JP JP2001060722A patent/JP2001299368A/ja active Pending
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