JPH11511984A

JPH11511984A - 細胞周期チェックポイント遺伝子

Info

Publication number: JPH11511984A
Application number: JP9510985A
Authority: JP
Inventors: カー，アントニー，マイケル
Original assignee: アイコスコーポレイション
Priority date: 1995-09-06
Filing date: 1996-09-06
Publication date: 1999-10-19
Also published as: EP0856058A1; NO980957L; CA2231190A1; NO980957D0; AU6884696A; SK30298A3; CN1201492A; GB9518220D0; PL325427A1; BR9610168A; CZ65698A3; IL123553A0; WO1997009433A1; EP0856058B1; CZ292808B6; AU730220B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、真核細胞における細胞周期の進行を制御する、チェックポイント遺伝子のクラス及びそれらのポリペプチド産物に関する。特に、本発明は、Schjzosaccharomyces pombeのrad3遺伝子、そのヒト相同体（ＡＴＲ）及びそれらによってコードされるタンパク質に関する。さらに本発明は、これらチェックポイント遺伝子のポリペプチド産物の活性をモジュレートする化合物を選択するためのアッセイ方法及び選択された化合物の抗ガン療法における使用に関するものである。

Description

【発明の詳細な説明】細胞周期チェックポイント遺伝子本発明は、真核細胞における細胞周期の進行を制御するチェックポイント遺伝子のクラスに関する。発明の背景細胞周期の制御は、酵母から哺乳動物までの真核細胞の生長及び維持の基礎をなすものである。真核細胞は、細胞周期の各ステップが、次のステップが始まる前に完遂することを保証する「チェックポイント」と称される制御経路を展開している。ＤＮＡ損傷に呼応して、直接的なＤＮＡ修復機構及び細胞周期の進行の遅延の双方により、細胞の生存率が高められる。照射時点における周期内での細胞の位置付けに依存して、哺乳動物細胞のＤＮＡ損傷は、（ａ）Ｇ１からＳ期への移行、（ｂ）Ｓ期での進行または（ｃ）Ｇ２から有糸分裂への移行を妨げることができる。かかるチェックポイントは、損傷を受けたＤＮＡの複製や、有糸分裂の際の断片化した染色体の分離などといった有害な事象を妨げると考えられる（Hartwell及びKastan、1994）。 Schjzosaccharomyces pｏmbeのrad3遺伝子が、ＤＮＡ損傷に呼応するチェックポイント及び複製の阻止に必要である。Rad3は、ホスファチジルイノシトール-3 キナーゼ（PI-3キナーゼ）のp110サブユニットの脂質キナーゼドメインに配列相同性を有する領域を有するキナーゼの、脂質キナーゼサブクラスのメンバーである。このサブクラスは毛細（血）管拡張性運動失調症の患者において欠損しているＡＴＭタンパク質も含んでいる。毛細 (血)管拡張性運動失調症の患者からの細胞（ＡＴ細胞）は、照射後にＳ期が遅延されなくなっており、放射線抵抗性のＤＮＡ合成を呈するといわれている（Pain ter及びYoung、1989)。Ｓ期において照射を受けたＡＴ細胞は、おそらくは損傷を受けたＤＮＡを複製しようと試みた結果として、致死的な損傷を伴ってＧ２期で蓄積する。Ｇ２期の際に照射を受けたＡＴ細胞は、異なる表現型を呈し、すなわち、それらの細胞はＤＮＡ損傷後にも有糸分裂を抑止せず、損傷を受けたＤＮＡをもって有糸分裂が進行する（Beamish及びLavin、1994）。しかして、ＡＴＭ遺伝子がマッピングされているＡ−Ｔ座での変異によって、イオン化照射に対する適切な応答のために必要な様々のチェックポイントの破壊が引き起こされる。この脂質キナーゼのサブクラスの他のメンバーに包含されるのは、Tel1p（Green wellら、1985）、Saccharomyces cerevisiaeにおいて染色体の末端小粒（テロメア）の長さを適切に維持することに関連する遺伝子；Esr1p；Mec1p及びDrosophi a melanogaster mei-41チェックポイント遺伝子（Hariら、1995）である。発明の開示本発明者らは、S．pombe rad3遺伝子を分析し、当該遺伝子が、Seatonらが199 2年に報告したように1070のアミノ酸でなく、全長2386アミノ酸のアミノ酸配列を有していることを見出した。本発明者らは、これがS．cerevisiaeのEsr1pの直接的な相同体であること、そしてそれがＡＴＭ遺伝子と同様の全構造を保有していることを確認している。rad3タンパク質のＣ−末端領域は、脂質キナーゼドメインを含み、これがRad3の機能に必要である。Rad3は自己会合ができることも本発明者らは明らかにした。また本発明者らは、Rad3に関連するタンパク質キナーゼ活性も同定した。さらに、本発明者らはrad3に対するヒト相同体をも見出している。ＡＴＲ（at axia and rad related(運動失調及びrad関連)）と命名されたこの遺伝子は、rad 3がＡＴＭ遺伝子との間に呈する相同性よりも有意に高い相同性を呈している。ヒトＡＴＲのｃＤＮＡ配列を、配列番号：１に示す。ヌクレオチド第80位から 8011位までのＯＲＦのアミノ酸配列を、配列番号：２に示す。 rad3の読み取り枠（ＯＲＦ）のＤＮＡ配列を、配列番号：３に示す。遺伝子の 2386アミノ酸（配列番号：３のヌクレオチド第585位から7742位まで）の翻訳タンパク質を、配列番号：４に示す。従って、第１の特徴において、本発明は配列番号：２のＡＴＲタンパク質及びその相同体、そのポリペプチド断片、さらにかかるＡＴＲタンパク質またはそのポリペプチド断片と結合することができる抗体を提供するものである。ＡＴＲタンパク質、その相同体及び断片は、以下、本発明のポリペプチドと称される。他の特徴において、本発明は配列番号：１またはその相補体（すなわち、相補鎖）に選択的にハイブリダイズすることができる、実質的に単離されたフォームのポリヌクレオチドを提供する。かかるポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドと称される。本発明のポリヌクレオチドには、配列番号：１のＤＮＡ及びこの遺伝子と選択的にハイブリダイズすることができるその断片が包含される。さらなる特徴において、本発明は、発現ベクターを含んで、本発明のポリヌクレオチドを有する組換えベクター、及び好適な宿主細胞にて、本発明の配列によってコードされるタンパク質もしくはポリペプチドの発現が起こるような条件下でかかるベクターを生育する方法を提供するものである。さらに別の特徴において、本発明は、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは抗体を含むキット、ならびにＡＴＲ及びその相同体、またはその変異体（有害なＡＴＲの変異を含む）の有無の診断にかかるキットを使用する方法を提供するものである。本発明はさらに、ＡＴＲ活性、またはチェックポイント活性が欠損したＡＴＲの変異型の活性を、阻害または活性化するための化合物としての使用を目的とする候補物質のスクリーニングのためのアッセイ方法を提供する。本発明はさらに、ＡＴＲそれ自体を含め、ＡＴＲと相互作用する他の化合物とＡＴＲとの間の相互作用を阻害するための化合物としての使用を目的とする候補物質のスクリーニングのためのアッセイ方法も提供する。関連する特徴として、本発明はさらに、実質的に単離されたフォームの、配列番号：３のポリヌクレオチド配列、実質的に単離されたフォームの、配列番号：４のタンパク質、ならびにそれらの新規な断片及び変異体を提供する。発明の詳細な説明Ａ．ポリヌクレオチド本発明のポリヌクレオチドには、ＤＮＡまたはＲＮＡが包含されうる。それらは、合成ヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドをその中に含むポリヌクレオチドであってよい。当該技術分野において、数多くのタイプのオリゴヌクレオチドへの修飾が知られている。これらには、メチルホスフォネート及びホスフォロチオエート骨格、分子の３’及び／または５’端でのアクリジンまたはポリリジンの付加が含まれる。本発明の目的のために、本明細書に記載されるポリヌクレオチドを当該技術分野にて利用できる種々の方法により修飾してもよいことは理解されるべきである。かかる修飾は、本発明のポリヌクレオチドのin vivoの活性または寿命を増強するために行われてもよい。配列番号：１のＤＮＡに選択的にハイブリダイズすることができる本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも２０、好ましくは少なくとも２５または３０、例えば、少なくとも４０、６０または１００以上の隣接するヌクレオチドの領域にわたって、配列番号：１の対応するＤＮＡに、概して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０または９０％そしてより好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するものであろう。当業者であれば、本発明のポリペプチドが発現されるべき特定の宿主生物のコドンの使用頻度（codon usage）を反映するように、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列に影響を及ぼさないヌクレオチド置換を慣例的な技術を用いて施すことができることは理解されるべきである。本発明のポリヌクレオチドを特定すべく、前記した相同性の程度及び最小サイズのいかなる組合せを使用してもよいが、さらに厳密な組合せ（すなわち、より長鎖に及んでより高い相同性を有すること）が好ましい。しかして、例えば２５、好ましくは３０のヌクレオチドにわたり、少なくとも８０％の相同性を有するポリヌクレオチド、さらには４０のヌクレオチドにわたり少なくとも９０％の相同性を有するポリヌクレオチドが、本発明の特徴とするものである。本発明のポリヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲプライマー代替増幅反応用のプライマーなどのプライマー、例えば、放射性または非放射性標識を用いて慣用手段により、明示する標識をもって標識付けされたプローブを生産するために使用することができ、あるいはポリヌクレオチドをベクターにクローニングしてもよい。かかるプライマー、プローブ及び他の断片は、少なくとも１５、好ましくは２０、例えば、少なくとも２５、３０または４０の鎖長のヌクレオチドであり、そしてこれらも、本明細書にて使用するところのポリヌクレオチドなる語の範囲に含まれる。本発明のＤＮＡポリヌクレオチド及びプライマーなどのポリヌクレオチドは、組換え法により、合成法により、あるいは当該技術分野において知られる種々の手段によって生産することができる。これらは、標準技術によりクローニングされてもよい。一般に、プライマーは一度に１つのヌクレオチドの所望の核酸配列を段階的に製造することを含む、合成法によって生産されるであろう。自動化された技術を使用してこれを完遂するための技術を、当該技術分野において容易に利用できる。さらに長いポリヌクレオチドは概して、例えば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技術を使用して、組換え手段を用いて生産されよう。この手段はクローニングが所望されるＡＴＲ遺伝子の領域に対する１対のプライマー（例えば、約１５〜３０ヌクレオチド）を作製し、ヒト細胞（例えば、末梢血白血球などの分裂細胞）から得られたｍＲＮＡまたはｃＤＮＡにそのプライマーを接触せしめ、所望の領域の増幅をもたらす条件下でポリメラーゼ連鎖反応を実施し、増幅された断片を単離（例えば、アガロースゲルにて反応混液を精製することによる）し、そして増幅されたＤＮＡを回収する工程を含むとよい。増幅されたＤＮＡが好適なクローニングベクターへとクローニングされうるように、プライマーは好適な制限酵素認識部位を含むように設計されるとよい。かかる技術は、本明細書中で記載されるＡＴＲ配列のすべてまたは一部分を得るために使用されることができる。ＡＴＲ遺伝子を含むゲノミッククローン及びそのイントロン及びプロモーター領域もまた、類似の方法で、ヒト細胞、例えば、肝細胞由来のゲノミックＤＮＡで着手して得ることができる。一般に、本明細書中に記載される技術は当該技術分野においてよく知られているところであるが、特にSambrookら（Molecular Cloning: A Laboratory Manual、1989）を参照するとよい。本発明の配列に１００％の相同性を有するわけではないが本発明の範囲に含まれるポリヌクレオチドは、数多くの方法で得ることができる。本明細書中に記載されるＡＴＲ配列の他のヒト対立変異体は、例えば、異なる個体群由来の個体である、所定範囲の個体からつくられたゲノミックＤＮＡライブラリーをプローブで探索することによって得られうる。加うるに、他の動物、特に哺乳動物（例えば、マウス、ラットまたはウサギ）とりわけ霊長類でのＡＴＲの相同体を得ることができ、かかる相同体及びその断片は概して、配列番号：１と選択的にハイブリダイズすることができるものであろう。かかる配列は、分裂細胞もしくは組織から作製されたｃＤＮＡライブラリー、または他の動物種由来のゲノミックＤＮＡライブラリーをプローブで探索すること、及び高いストリンジェンシーとした媒質の条件下で（例えば、約５０℃ から約６０℃にて、0.3M塩化ナトリウム及び0.03Mクエン酸ナトリウム）配列番号：１のすべてまたは一部分を含むプローブを用いてかかるライブラリーを探索することによって得ることができる。対立変異体及び種相同体を、変異体または保存されたアミノ酸配列をコードする相同体内の標的配列に対して設計されたプライマーを使用する縮重ＰＣＲを用いて得ることもできる。保存された配列は、ＡＴＲアミノ酸配列とrad3のアミノ酸とのアラインメントから予測することができる。プライマーは、１またはそれ以上の縮重箇所を含んでいると考えられ、既知配列に対する単一配列のプライマーでの配列のクローニング用に使用されるよりも低いストリンジェンシーの条件下でそれらプライマーを使用するとよい。あるいは、かようなポリヌクレオチドは、ＡＴＲ配列またはその対立変異体の部位特異的突然変異によっても得られる。この方法は、例えば、ポリヌクレオチド配列が発現される特定の宿主細胞のためのコドン選択を至適化するために、配列に対して沈黙コドンの変更を行う必要がある場合に有用であるかもしれない。他の配列の変更は、制限酵素認識部位を導入するため、またはポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの特性または機能を変化させるために所望されるかもしれない。さらなる変化は、チェックポイント機能を喪失した変異型ＡＴＲ遺伝子を高める、ＡＴＲにおいて認められる特定のコード変更を呈するために望ましいかもしれない。かような変更に基づくプローブは、かかるＡＴＲ変異体を検出するための診断プローブとして使用することができる。本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチド及びその相補体を含んでなる二本鎖ポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドまたはプライマーは、明示する標識を担持していてもよい。好適な標識には、³²Ｐまたは³⁵Ｓなどの放射性同位体、酵素標識、またはビオチンなどの他のタンパク質標識が包含される。かかる標識は、本発明のポリヌクレオチドまたはプライマーに加えられてよく、本質的に既知の技術を使用することによって検出されうる。標識または非標識の、本発明のポリヌクレオチドもしくはプライマーまたはその断片は、ヒトまたは動物体におけるＡＴＲを検出または配列決定するための核酸ベース試験（nucleicacid-based test）において当業者により使用されうる。検出のためのかかる試験は一般に、ハイブリダイゼーション条件下で本発明のポリヌクレオチドまたはプライマーを含むプローブに、ＤＮＡまたはＲＮＡを含有するヒトまたは動物体試料を接触せしめ、そして試料中の核酸とプローブとの間に形成された二本鎖分子を検出する工程を含む。かかる検出は、ＰＣＲなどの技術を使用して、またはプローブを固体支持体に固定化し、プローブにハイブリダイズしない試料中の核酸を除去し、次いでプローブにハイブリダイズしている核酸を検出することによって行うとよい。あるいは、試料の核酸を固体支持体に固定化し、かかる支持体に結合されるプローブの量を検出することもできる。この、その他の様式の好適なアッセイ方法は、例えば、WO89/0381号及びWO90/1366 7号などに開示されている。ＡＴＲ配列決定のための試験は、ハイブリダイゼーション条件下で本発明のポリヌクレオチドまたはプライマーを含むプローブに、標的ＤＮＡまたはＲＮＡを含有するヒトまたは動物体試料を接触せしめ、そして例えば、サンガー・ジデオキシ・チェインターミネーター法などによって配列を決定する工程を含む（Samb rookら、参照）。かかる方法は一般に、好適な試薬の存在下に、標的ＤＮＡまたはＲＮＡに相補的な鎖のプライマーを合成によって伸長させ、そしてＡ、Ｃ、ＧまたはＴ／Ｕ残基の１またはそれ以上にて伸長反応を選択的に終止し、鎖の伸長及び終止反応を起こさせ、選択的な終止が生じるヌクレオチドの配列を決定するために伸長された産物をサイズに従って分離する工程を含む。好適な試薬には、ＤＮＡポリメラーゼ酵素、デオキシヌクレオチドのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、緩衝液ならびにＡＴＰが含まれる。ジデオキシヌクレオチドは、選択的な終止のために使用される。ヒトまたは動物体におけるＡＴＲを検出または配列決定するための試験は、例えば白血病細胞ならびに乳房、卵巣、肺、結腸、膵臓、精巣、肝臓、脳、筋肉及び骨の腫瘍などの固形腫瘍を包含するガン細胞内で、変化したＡＴＲ遺伝子配列を有する、または有することが疑われる個体における細胞内のＡＴＲ配列を決定するために使用するとよい。加うるに、ＡＴＲの発見によって、ＡＴＭ遺伝子と類似の方法で、遺伝性疾患におけるこの遺伝子の役割が調査されることが可能となるであろう。一般にこの調査は、例えば、ガンへの家族性の疾病素質、染色体の破壊または不安定性表現型または修復−損傷感受性表現型などといった、複製している細胞への損傷に関わるかもしれない疾患を有する患者に由来する細胞内でのＡＴＲの状態を確立すること（例えば、ＰＣＲ配列分析を用いる）が含まれよう。本発明のプローブは、好適な容器の中に、試験キットの形態にて適切に包装されるとよい。かかるキットにおいて、そのキットが設計されるアッセイ形式に結合が必要とされる場合に、プローブは固体支持体に結合されるとよい。キットは、プローブで探索されるべき試料を処理するため、試料中の核酸にプローブをハイブリダイズさせるための好適な試薬、対照試薬、説明書等を含むとよい。本発明はさらに、下記の本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。かかるポリヌクレオチドは本発明のポリペプチドの組換え生産のための配列として有用であると考えられるので、それらポリヌクレオチドが配列番号：１の配列に選択的にハイブリダイズすることが必要というわけではないものの、概して選択的にハイブリダイズすることが望ましい。他に、かかるポリヌクレオチドは、所望に応じて前記の通りに標識付け、使用、及び作製されるとよい。本発明のポリペプチドは後述するとおりである。特に好ましい本発明のポリヌクレオチドは、ＡＴＲの脂質キナーゼドメインに由来するポリヌクレオチド、その対立変異体及び種相同体である。脂質キナーゼドメインは、配列番号：１のヌクレオチド第7054位から8011位に表される。このドメインを含む本発明のポリヌクレオチドが、特に好ましい。「脂質キナーゼドメイン」なる語は、配列のアラインメントによって調べた場合に他の既知の脂質キナーゼ、特にPI-3キナーゼのp110サブユニットに相同性を有するドメインを称する。本発明の、他の好ましいポリヌクレオチドは、ロイシンジッパー領域、タンパク質−タンパク質相互作用の推定部位と考えられる配列番号：２のアミノ酸第18 1位から第302位まで（配列番号：１のヌクレオチド第620位から985位まで）、及びやはり保存されている、アミノ酸第1358位から1366位まで（ヌクレオチド第41 51位から第4177位まで）をコードするヌクレオチドを含むものである。さらなる特徴において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号：３のポリヌクレオチド、及び以下の変更がなされたヌクレオチド第2482位から第6599位までからなる断片以外の配列と選択的にハイブリダイズすることができる断片が包含される。上記変更とは、残基2499、2501、2507及び2509の欠失と、5918/5919間へのＣの挿入である。特に好ましい断片には、残基第6826位から7334位まで（脂質キナーゼドメイン）ならびに第1476位から1625位まで及び第2310位から第2357位までのロイシンジッパー領域を含んでなる断片である。加えて、保存された領域第3891位から第39 17位までを含む断片が好ましい。かかるポリペプチド及び断片は、前記の通りに作製及び使用されるとよい。Ｂ．ポリペプチド本発明のポリペプチドには、配列番号：２で示される配列を含む、実質的に単離されたフォームのポリペプチドが包含される。ポリペプチドはさらに、前記ポリペプチドと実質的に相同な、天然に存在する対立変異体及び合成変異体を包含する、かかる配列の変異体を包含する。ここで、実質的な相同性は、脂質キナーゼドメイン及びＣ−末端部分（残基第2326位から2644位まで）を除く配列番号：２の配列と、３０アミノ酸にわたって少なくとも７０％、例えば、８０％または９０％のアミノ酸相同性（同一性）を有する配列と考えられ、好ましくは、実質的な相同性は、５０アミノ酸にわたって少なくとも８０％の相同性、好ましくは９０％の相同性（同一性）として認識される。さらにポリペプチドは、哺乳動物（例えば、マウス、ラットまたはウサギ）、とりわけ霊長類を包含する他の種に由来するＡＴＲ相同体をコードする他のポリペプチド、そして前記したごときそれらの変異体も含むものである。本発明のポリペプチドはまた、配列番号：２に示される配列の断片を包含する、前記全長のポリペプチド及びその変異体の断片をも包含する。好ましい断片には、特にエピトープを含む断片が包含される。好適な断片は、少なくとも約５、例えば、１０、１２、１５または２０アミノ酸のサイズであろう。ＡＴＲタンパク質のポリペプチド断片ならびにその対立変異体及び種変異体は、１またはそれ以上の（例えば、２、３、５または１０）の保存的置換を包含する、置換、欠失または挿入を含みうる。保存的置換は、以下の表に従って作製するとよい。この表は保存的置換を示し、第２カラムの同じブロックにあるアミノ酸、そして好ましくは第３カラムの同じライン上にあるアミノ酸は互いに置換されうるものである。本発明のポリペプチドの変異体はまた、（１）本発明のポリペプチドに特異的なキナーゼ活性を喪失することなく、または（２）本発明のポリペプチドに特異的なキナーゼ活性を無力化する、または（３）細胞周期チェックポイント経路の調節因子のメンバーとの相互作用能を無力化する、１またはそれ以上の特定の（ specified、すなわち、天然においてコードされている）アミノ酸が欠失または置換された、あるいは１またはそれ以上の特定のものでないアミノ酸が付加されたポリペプチドを含んでもよい。エピトープは、Geysenら、Mol.Immunol.23巻、709〜715頁 (1986)に記載されるごときペプチドスキャン技術などの技術のいずれかにより判定しうる。本発明のポリペプチドは、実質的に単離されたフォームであるとよい。ポリペプチドは、かかるポリペプチドにより意図される目的を妨げることのない担体または希釈剤と共に混合されるとよく、そのような混合体もやはり、実質的に単離されたものと認識されることは理解されよう。本発明のポリペプチドはまた、実質的に精製されたフォームであるとよく、この場合概して、調製物中のポリペプチドの９０％を越える量、例えば、９５％、９８％または９９％が本発明のポリペプチドであるように、調製物中にポリペプチドを含むものであるとよい。本発明のポリペプチドは例えば、それらの精製を補助するためのヒスチジン残基の付加や、細胞からの分泌を促進するためのシグナル配列の付加によって修飾されてもよい。本発明のポリペプチドは、明示する標識を用いて標識付けしてもよい。明示する標識は、ポリペプチドが検出されることを許容する好適な標識のいかなるものであってよい。好適な標識には、例えば¹²⁵Ｉなどの放射性同位体、酵素、抗体、ポリヌクレオチド及びビオチンなどのリンカーが包含される。本発明の標識付けされたポリペプチドは、標準的なプロトコルを使用し、動物及びヒトにおいて当該ポリペプチドに対する免疫反応を検出するための、血清学的または細胞を介した免疫アッセイにおいて使用することもできる。本発明のポリペプチドもしくは標識付けされたポリペプチドまたはその断片は、固体相、例えば免疫アッセイウェルまたは計量棒（dipstick）の表面に固定されてもよい。かかる標識付けされた及び／または固定化されたポリペプチドは、好適な試薬、対照、説明書等と共に、好適な容器の中に試験キットの形態にて適切に包装されるとよい。かかるポリペプチド及びキットは、ＡＴＲタンパク質またはその対立もしくは種変異体に対する抗体のイムノアッセイによる検出の方法において使用することができる。イムノアッセイ法は当該技術分野においてよく知られており、概して以下の工程を含む。（ａ）前記タンパク質に対する抗体によって結合可能なエピトープを含むポリペプチドを準備し、（ｂ）抗体−抗原複合体の形成を許容する条件下で、前記ポリペプチドと共に生物学的試料をインキュベートし、そして（ｃ）前記ポリペプチドを含む抗体−抗原複合体が形成されたか否かを判定する。本発明のポリペプチドは、合成手段（例えば、Geysenらにより報告されるとおり）によって、または組換えによって、後述のように得られる。本発明の特に好ましいポリペプチドには、脂質キナーゼドメイン（すなわち、配列番号：２のアミノ酸第2326位から2644位まで）にわたるもの、もしくは当該ドメイン内のもの、またはそれらに実質的に相同性を有する配列を有するものが含まれる。この領域から前記のように特定される断片が、特に好ましい。ポリペプチド及びその断片には、後述の実施例に記載されるrad3の置換位置に対応する第2475位、2480位及び2494位の１またはそれ以上における置換を包含する、前記のごときアミノ酸の変更が含まれてもよい。本発明のポリペプチドは、チェックポイント遺伝子としてのＡＴＲの役割を研究するために、in vitroまたはin vivoの細胞培養系にて使用することができる。例えば、切欠または修飾された（例えば、脂質キナーゼドメインに修飾が施された）ＡＴＲを、細胞内に存在するチェックポイント機能を崩壊させるべく細胞内に導入してもよい。本発明のポリペプチドは、組換え発現ベクター（下記）からのポリペプチドの in situ発現によって細胞内に導入してもよい。発現ベクターは、ポリペプチドの発現を制御する誘導可能なプロモーターを任意に担持してもよい。本発明の組換え発現産物に対して至適な生物学的活性を付与するのに必要でありうるような転写後の修飾（例えば、ミリストレーション、グリコシレーション、切欠、ラピデーション及び、チロシン、セリンまたはスレオニンのリン酸化など）を施すために、哺乳動物宿主細胞を使用することが考えられる。本発明のポリペプチドが発現されるこのような細胞培養系は、細胞におけるチェックポイント機能を妨害または増強する候補物質を同定するためのアッセイシステムにおいて使用することができる（後述）。さらなる特徴において、本発明のポリペプチドは、配列番号：４のタンパク質及びアミノ酸第713位から1778位からなる断片を除く領域由来の前記タンパク質の断片を包含する。特に好ましい断片には、残基第2082位から2386位まで（脂質キナーゼドメイン）ならびにロイシンジッパー領域である第298位から第347位まで及び第576位から591位までを含む断片が包含される。加うるに、保存された領域である第1103位から第1111位までを含む断片が好ましい。かかるポリペプチド及び断片は、前記のとおりに作製及び使用されるとよい。本発明はまた、配列番号：４のタンパク質、及びその断片に実質的に相同性を有するポリペプチドを提供するものである。ここで、実質的な相同性は、脂質キナーゼドメイン及びＣ−末端部分（残基第2082位から2386位まで）を除く配列番号：４の配列と、３０アミノ酸にわたって少なくとも７０％、例えば、８０％または９０％のアミノ酸相同性（同一性）を有する配列と考えられ、好ましくは、実質的な相同性は、５０アミノ酸にわたって少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％の相同性（同一性）として認識される。Ｃ．ベクター本発明のポリヌクレオチドは、複製可能な組換えベクターに組み入れることができる。ベクターは、適合しうる宿主細胞にて核酸を複製するために使用されうる。かくして、さらなる実施態様において、本発明は複製可能なベクターに本発明のポリヌクレオチドを導入し、当該ベクターを適合可能な宿主細胞に導入し、そしてベクターの複製をもたらす条件下で宿主細胞を生育することにより、本発明のポリヌクレオチドを作製する方法を提供するものである。ベクターは宿主細胞から回収されうる。好適な宿主細胞については、発現ベクターと共に以下に記載する。Ｄ．発現ベクター好ましくは、ベクター内の本発明のポリヌクレオチドは、宿主細胞によってコード配列の発現を行うことができるようにする制御配列に作動可能に連結されているものであって、すなわち、好ましいベクターは発現ベクターである。「作動可能に連結される」なる語は、前記成分がそれらに対して意図されるように機能することを許容する関係にある、並列を称する。コード配列に「作動可能に連結される」対照の配列は、対照の配列と適合可能な条件下でコード配列の発現が成し遂げられるように連結される。このようなベクターは、本発明のポリペプチドの発現を行うべく前記のごとき好適な宿主細胞へと形質転換されうる。しかして、本発明のさらなる特徴において、本発明のポリペプチドを調製するための方法が提供され、かかる方法は、以下の工程すなわち、ポリペプチドをコードするコード配列のベクターによる発現を行う条件下で、前記の発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を培養し、そして発現されたポリペプチドを回収する工程を含む。ベクターは例えば、複製の起点、前記ポリヌクレオチドの発現用のプロモーター（任意）及びプロモーターの調節因子（任意）を有する、プラスミド、ウイルスまたはファージベクターであるとよい。ベクターは、１またはそれ以上の選択可能なマーカー遺伝子、例えば細菌プラスミドの場合にはアンピシリン耐性遺伝子、または哺乳動物用ベクターにはネオマイシン耐性遺伝子をを含むとよい。ベクターは、例えばＲＮＡの生産用にin vitroで使用したり、宿主細胞をトランスフェクトまたは形質転換するために使用したりできる。ベクターはさらに、例えば遺伝子療法の方法において、in vivoにおける使用に適用されうる。本発明のさらなる実施態様によれば、本発明のポリヌクレオチドの複製及び発現のためのベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞が提供される。細胞は、前記ベクターに適合性を有するものが選択され、それらは例えば、細菌、酵母、昆虫または哺乳動物細胞であるとよい。本発明のポリヌクレオチドは、アンチセンスＲＮＡの生産を行うために、アンチセンス方向にて前記ベクターに挿入されてもよい。アンチセンスＲＮＡまたは他のアンチセンスポリヌクレオチドは、合成法によっても生産されうる。かかるアンチセンスポリヌクレオチドは、ＡＴＲまたはその変異体または種相同体のレベルを制御する方法において使用してもよい。プロモーター及び他の発現調節シグナルは、発現ベクターが設計される宿主細胞と適合可能となるように選択されるとよい。例えば、酵母プロモーターには、 S．cerevisiae GAL4及びADHプロモーター、S．pombe nmt1及びadhプロモーターが包含される。哺乳動物プロモーターには、カドミウムなどの重金属に応答するように含まれうるメタロチオネインプロモーターが包含される。SV40ラージＴ抗原プロモーターまたはアデノウイルスプロモーターなどのウイルスプロモーターも、使用されうる。これらのプロモーターはすべて、当該分野で容易に入手しうるものである。Ｅ．抗体本発明はまた、本発明のポリペプチドまたはその断片に対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体をも提供するものである。さらに本発明は、本発明のポリペプチドに対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体の生産のための方法を提供する。モノクローナル抗体は、免疫源として本発明のポリペプチドまたはそのペプチド断片を使用し、旧来のハイブリドーマ技術によって調製されうる。ポリクローナル抗体もまた、旧来の手段により調製されえ、これは宿主の動物、例えばラットまたはウサギに本発明のポリペプチドまたはそのペプチド断片を接種し、免疫血清を回収する工程を含む。かかる抗体を作製するために、動物またはヒトにおいて免疫源として使用するため、他のポリペプチドとハプテン化した、本発明のポリペプチドまたはその断片も、さらに本発明によって提供される。本発明の好ましい抗体は、rad3タンパク質の親和性よりも少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも１００倍の親和性をもってヒトＡＴＲタンパク質に選択的に結合することができるものであろう。このような抗体は、慣用の実験によって得ることができ、例えば、rad3の対応する領域とは異なる配列を有するＡＴＲタンパク質の領域を選択し、当該配列を含むペプチドを作製し、そして免疫源として当該ペプチドを使用することによって得られる。抗体の生産の後に、前記抗体の結合を判定するとよい。本発明の好ましい抗体には、ヒトＡＴＲタンパク質の脂質キナーゼドメイン（前記にて規定したとおり）に選択的に結合することができる抗体が包含される。加えて、同様の親和性をもってヒト及び酵母（S．pombe）の脂質キナーゼドメインに結合することができ、ＡＴＭファミリーのタンパク質のドメインにはそのように結合しない抗体もまた、本発明のさらなる特徴をなすものである。かような抗体は、酵母及びヒト遺伝子において同一であるか、または実質的に同一であることが認められる領域に対応する脂質キナーゼドメイン由来のペプチドに対して生じせしめられうる。本発明の目的において、「抗体」なる語は別段に特定しない限り、腫瘍標的抗原に対するそれらの結合活性を保有する断片または抗体全体を包含する。かかる断片には、Fv、F(ab')及びF(ab')₂断片、そして単鎖抗体が包含される。さらには、抗体及びその断片は、例えばEP-A-239400に記載されたヒト化抗体であってもよい。抗体は、以下の工程すなわち、（ａ）本発明の抗体を準備し、（ｂ）抗体−抗原複合体の形成を許容する条件下で、前記抗体と共に生物学的試料をインキュベートし、そして（ｃ）前記抗体を含む抗体−抗原複合体が形成されるか否かを判定する工程を含む方法によって生物学的試料中に存在する本発明のポリペプチドを検出する方法において使用することができる。好適な試料には、白血病細胞または乳房、卵巣、肺、結腸、膵臓、精巣、肝臓、脳、筋肉及び骨の腫瘍などの固形腫瘍を包含するガン細胞などといった分裂細胞からの抽出物が包含される。本発明の抗体は固体支持体に結合され、及び／または、好適な試薬、対照、説明書等と共に、好適な容器の中にキットとして包装されるとよい。Ｆ．アッセイ細胞周期チェックポイントを排除することは、それ自体で新規な処置として、及び現行の化学療法剤の特異的な毒性を向上させる組合せ療法としての双方における、抗ガン療法のための薬物を開発または設計するための潜在性を有するストラテジーである。例えば、ナイトロジェン・マスタードなどのアルキル化剤は、速やかに分裂している細胞におけるＤＮＡに損傷を与え、細胞死に至らしめる化学療法剤として使用されている。かかる薬剤の毒性は、ＤＮＡ修復及びチェックポイント機構によって低減されるかもしれない。この機構を排除することは、しかして、ＤＮＡに損傷を与えるように設計された治療用化合物の有効性を高めるであろう。ＡＴＲチェックポイントの排除は、腫瘍細胞が他のチェックポイントまたは損傷応答遺伝子を喪失している場合に特に有用であると考えられ、これは、これらの他の遺伝子が、腫瘍細胞でない細胞のＡＴＲ機能の喪失を補うことができるかもしれず、化学療法剤の有効性のより一層の増強につながるためである。ＡＴＲの脂質キナーゼ活性は、抗ガン用化合物を開発する上での標的である。これは、以下の実施例によって、キナーゼドメインがＡＴＲ機能に必須であることが示唆されることによる。かくして、本発明は、抗ガン療法のための候補物質をスクリーニングするためのアッセイ方法であって、以下の工程すなわち、（ａ）脂質キナーゼ活性を有する本発明のポリペプチド及び当該キナーゼのための基質を、かかるキナーゼ活性が基質に対して作用するような条件下に試薬と共に準備し、（ｂ）候補物質に当該ポリペプチド及び基質を接触せしめ、（ｃ）ポリペプチドのキナーゼ活性の減少の程度を測定し、そして（ｄ）活性の減少をもたらす候補物質を選択する工程を含むアッセイ方法を提供する。アッセイはin vitroで、例えばミクロタイターディッシュのウェルにて行うとよい。このような方式は、容易に自動化に適用でき、数多くの候補物質をスクリーニングすることが可能となる。基質は本発明のポリペプチドが作用するであろうタンパク質または脂質であって、天然に起源を有するものでも合成されたものでもよい。通常、本発明のポリペプチドは、基質をリン酸化するであろう。アッセイのために好適な形式であればいずれも、スループットアッセイの技術分野の当業者によって使用されうる。典型的には、脂質キナーゼ活性を保有する本発明のポリペプチドは、活性のために通常必要とされる基質ならびに細胞成分及び他の成分の存在下、固体支持体に結合されよう。標識付けされたホスフェート及び候補物質は、同時にまたはいずれかを先の順で連続的に混合物に添加されよう。好適な反応時間（通常は数分であり、とにかく候補物質が存在しない状態で基質のリン酸化が起こるに充分な時間）を経た後、遊離のホスフェートの量を、例えばホスフェートの沈降によって調べる。キナーゼ活性を阻害する候補物質は、基質への遊離のホスフェートの取り込みを阻害すると考えられ、従って、遊離のホスフェートが認められれば、それは阻害の指標となるのである。他のアッセイ形式も、当業者によって使用されうる。候補物質は反応当たり例えば１０の化合物のバッチで、最初のスクリーニングに使用し、そして阻害を示すそれらのバッチの化合物は、個々に試験されるとよい。好適な候補物質には、ペプチド、特に約５から２０アミノ酸のサイズの、キナーゼドメインの配列に基づくもの、または前記のように１またはそれ以上の残基が置換されたかかるペプチドの変異体が包含される。ランダムな配列または、最大限に多様なペプチドのパネルを提供するために一貫して変化させた配列を含むペプチドのパネル由来のペプチドも使用されうる。さらなる候補物質には、シクロスポリン様化合物及びスタウロスポリン様化合物などの小分子、または小分子阻害剤のパネルにて市販されている他の化合物である、キナーゼ阻害剤が包含される。前記したようなin vitroスクリーニングにおいて活性を示す候補物質は、次いで、阻害剤に曝されてチェックポイント活性について試験される、酵母または哺乳動物細胞などのin vivoの系で試験することができる。本発明者らは、Rad3がタンパク質キナーゼ活性を保有していることを示している。Rad3タンパク質キナーゼ活性の標的基質は、キナーゼ活性のためのアッセイにおいて被験化合物を取り込むことによって同定されうる。Rad3タンパク質は、キナーゼ緩衝液に再懸濁され、そして被験化合物（例えば、カゼイン、ヒストンH1、または適切な基質ペプチド）の存在下または非存在下のいずれかでインキュベートされる。ホスフェートの被験化合物への移送が、被験化合物はキナーゼの基質であるということの指標となる。 Rad3/ＡＴＲ脂質キナーゼまたはRad3タンパク質キナーゼ活性をモジュレートする薬剤は、被験化合物とRad3/ＡＴＲを天然に発現している細胞から免疫的に精製されたRad3/ＡＴＲを、酵素を発現している組換え原核細胞もしくは真核細胞から得られたRad3/ＡＴＲと共に、または精製されたRad3/ＡＴＲと共にインキュベートし、次いでRad3/ＡＴＲ活性に対する被験化合物の効果を判定することによって同定できる。Rad3/ＡＴＲ脂質キナーゼまたはRad3タンパク質キナーゼドメインの活性は、それ自体（自己リン酸化）かまたは脂質もしくはタンパク質などの外来基質に、ガンマー³²Ｐ−ＡＴＰからキナーゼによって移送された³²Ｐ −ホスフェートのモル数を定量することによって測定することができる。基質に取り込まれたホスフェートの量は、シンチレーション計数またはオートラジオグラフィーによって測定される。被験化合物の非存在下に基質に移送されたホスフェートのモル数に比較して、被験化合物の存在下に基質に移送されたホスフェートのモル数が増加していれば、被験化合物が当該キナーゼ活性の活性化剤であることが示される。逆に、被験化合物の非存在下に基質に移送されたホスフェートのモル数に比較して、被験化合物の存在下に基質に移送されたホスフェートのモル数が減少していれば、モジュレーターが当該キナーゼ活性の阻害剤であることが示される。現在のところ好ましいアッセイにおいて、アガロースビーズに結合されたRad3/ＡＴＲ抗体が、Rad3/ＡＴＲを発現している宿主細胞から調製された細胞溶解液とインキュベートされる。ビーズに非特異的に結合しているタンパク質を除去するためにビーズを洗浄し、次いでキナーゼ緩衝液（例えば、25 mM K-HEPES pH 7.7、50 mM塩化カリウム、10 mM塩化マグネシウム、0.1％ Nonid et-P-40、20％グリセロール、１mM DTTなど）にビーズが再懸濁される。反応は、100μMのガンマー³²Ｐ−ＡＴＰ（４ Ci/mM）及び脂質またはペプチドなどの外来基質の添加によって開始され、そして３０℃にて１０分間、反応が行われる。キナーゼの活性は、キナーゼ自体または添加された基質に移送された³²Ｐ−ホスフェートのモル数を定量することによって測定される。好ましい実施態様において、宿主細胞は内在性のRad3/ＡＴＲキナーゼ活性を欠損している。Rad3/ＡＴＲの脂質キナーゼ活性をモジュレートする化合物の選択性は、Rad3/ＡＴＲに対するその活性を例えば、他の既知のホスファチジルイノシトール-3（PI-3）関連キナーゼに対する活性と比較することによって評価することができる。独立した一連のアッセイにおける、本発明の組換えRad3/ＡＴＲ産物と他の組換えPI-3-関連キナーゼタンパク質産物との組合せにより、Rad3/ＡＴＲキナーゼ活性の選択的モジュレーターを開発するためのシステムが提供される。同様に、Rad3のタンパク質キナーゼ活性をモジュレートする化合物の選択性を、例えば、ＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼまたはＡＴＭなどといった他のタンパク質キナーゼを参考にして判定することもできる。加うるに、rad3変異体のrad.D2249E（実施例を参照のこと）が、優性の負の変異体として作用することができることが立証され、１またはそれ以上のタンパク質複合体の関与が示唆されるところとなり、そしてかかる複合体はそれ自体、治療的介入のための標的となりうる。本発明者らは、例えば、Rad3が自己会合及びＡＴＲとの会合の双方を行うことができることを示している。従って、Rad/ＡＴＲはマルチマー分子として機能するらしいと考えられる。変異型の酵母またはヒトＡＴＲ遺伝子、またはその断片で、やはりRad/ＡＴＲ活性を欠くものを細胞内に導入し、優性の負の変異体として作用させることができる。しかして、例えば腫瘍細胞内の優性の負の変異体（例えば、ＡＴＲ D2475A、N2480KまたはD2494E）によって放射線照射への感受性の増強が引き起こされれば、元来のＡＴＲはそれまで通りに機能していることが示唆され、従ってこれが治療剤のための標的となりうることが示される。 Rad3またはＡＴＲを包含するマルチマーのタンパク質複合体の成分を含む相互作用性タンパク質を、以下のアッセイによって同定することができる。本発明により企図される第１のアッセイは、２−ハイブリッドスクリーニングである。２−ハイブリッド系は、酵母にて開発され（Chienら、(1991)）、レポーター遺伝子を活性化する転写因子のin vivoでの機能的再構成に基づくものである。詳細には、ＤＮＡ結合ドメイン及び活性化ドメインを有する転写因子によって調節されるプロモーターの制御下にレポーター遺伝子を含むＤＮＡ構築体で適切な宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトし、 Rad3/ＡＴＲの一部またはすべてと、前記転写因子のＤＮＡ結合ドメインまたは活性化ドメインのいずれかとの第１融合体をコードする第１ハイブリッドＤＮＡ配列を宿主細胞にて発現させ、 Rad3/ＡＴＲ結合タンパク質と推定されるタンパク質の一部またはすべてと、前記転写因子のＤＮＡ結合ドメインまたは活性化ドメインのいずれかで前記第１融合体に組み込まれていないものとの第２融合体をコードする第２ハイブリッドＤＮＡ配列のライブラリーを宿主細胞にて発現させ、宿主細胞におけるレポーター遺伝子産物の生産を検出することにより特定の宿主細胞でのRad3/ＡＴＲへのRad3/ＡＴＲ相互作用性タンパク質の結合を検出し、そしてかかる特定の宿主細胞から、相互作用性タンパク質をコードする第２ハイブリッドＤＮＡ配列を単離することによって、Rad3/ＡＴＲと相互作用するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが単離される。かかるアッセイにて使用するために現在のところ好ましいのは、レポーター遺伝子であるlacZレポーター遺伝子の発現を駆動するためのlexAプロモーター、lexAＤＮＡ結合ドメイン及びGAL4トランス活性化ドメインを含む転写因子、ならびに酵母宿主細胞である。 Rad3またはＡＴＲと相互作用するタンパク質を同定するための他のアッセイには、Rad3/ＡＴＲまたは被験タンパク質を固定化し、固定化されなかった方の結合パートナーを検出可能に標識付けし、結合パートナーを一緒にインキュベートし、そして結合した標識の量を定量することが包含されうる。結合された標識により、被験タンパク質がRad3/ＡＴＲと相互作用することが示唆される。 Rad3/ＡＴＲと他の細胞成分との間の相互作用をモジュレートする化合物は、ガンの治療方法おいて使用されうる。例えば、特定の型のガンがp53遺伝子などのＡＴＲ以外の遺伝子における変異に起因している場合、ＡＴＲの転写または酵素活性、しかしてＧ₂細胞周期チェックポイントを阻害する薬剤を使用して、ガンの細胞を化学療法または放射線療法に対してより高感受性とすることができる。処置の結果として賦課されたＤＮＡ損傷を検知し修正する、p53変異体ガン性細胞の能力を凌ぐためには、現行の放射線療法または化学療法がほとんどの場合に無力であるという事実に基づき、このような薬剤の治療上の価値が認められるものである。結果的に、ガン細胞は簡単にＤＮＡ損傷を修復できるのである。本発明のモジュレーション剤は従って、化学療法または放射線療法の補助的薬剤となりえ、あるいはそれ自体が化学療法剤として直接的に活性を有するかもしれない。他のタンパク質とRad3/ＡＴＲとの相互作用をモジュレートする化合物を同定するためのアッセイには、ＤＮＡ結合ドメイン及び活性化ドメインを有する転写因子によって調節されるプロモーターの制御下にレポーター遺伝子を含むＤＮＡ構築体で適切な宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトし、 Rad3/ＡＴＲの一部またはすべてと、前記転写因子のＤＮＡ結合ドメインまたは活性化ドメインのいずれかとの第１融合体をコードする第１ハイブリッドＤＮＡ配列を宿主細胞にて発現させ、 Rad3/ＡＴＲ結合タンパク質と相互作用するタンパク質の一部またはすべてと、前記転写因子のＤＮＡ結合ドメインまたは活性化ドメインのいずれかで前記第１融合体に組み込まれていないものとをコードする第２ハイブリッドＤＮＡ配列を宿主細胞にて発現させ、被験化合物の存在下または非存在下での、宿主細胞におけるレポーター遺伝子産物の生産を測定することにより特定の宿主細胞でのRad3/ＡＴＲへの相互作用性タンパク質の結合を検出することによって、Rad3/ＡＴＲと相互作用性タンパク質との間の相互作用に対する被験化合物の効果を評価し、そしてモジュレーション化合物の非存在下におけるレポーター遺伝子産物の生産に比較してレポーター遺伝子産物の生産を変化させる被験化合物としてモジュレーション化合物を同定する工程が含まれる。かかるアッセイにて使用するために現在のところ好ましいのは、レポーター遺伝子、ｌacZレポーター遺伝子の発現を駆動するためのlexAプロモーター、lexAＤＮＡ結合ドメイン及びGAL4トランス活性化ドメインを含む転写因子、ならびに酵母宿主細胞である。 Rad3/ＡＴＲと相互作用性タンパク質との間の相互作用をモジュレートする化合物を同定するための別のタイプのアッセイには、Rad3/ＡＴＲまたは天然のRad 3/ＡＴＲ相互作用性タンパク質を固定化し、固定化されなかった方の結合パートナーを検出可能に標識付けし、結合パートナーを一緒にインキュベートし、そして結合される標識の量に対する被験化合物の効果を定量することが包含されえ、このアッセイで被験化合物の非存在下に結合された標識の量に比較して、被験化合物の存在下に結合される標識が減少していれば、被験薬剤がRad3/ＡＴＲとタンパク質との相互作用の阻害剤であることが示される。逆に、被験化合物の非存在下に結合される標識の量に比較して、被験化合物の存在下での結合が増加していれば、モジュレーターと推定される被験薬剤がRad3/ＡＴＲとタンパク質との相互作用の活性化剤であることが示される。 Rad3/ＡＴＲと相互作用性タンパク質との間の結合をモジュレートする化合物を同定するための、本発明によって企図されるさらに別の方法には、蛍光剤が被覆（または含浸）された固体支持体上にRad3/ＡＴＲまたはその断片を固定化し、蛍光剤を励起することができる化合物で相互作用性タンパク質を標識付けし、固定化されたRad3/ＡＴＲを標識付けされた相互作用性タンパク質に被験化合物の存在下または非存在下に接触させ、蛍光剤による光の放射を検出し、そして蛍光剤による光の放出を惹き起こす被験化合物として、モジュレートを行う化合物を同定することが包含される。あるいは、アッセイにて、Rad3/ＡＴＲ相互作用性タンパク質を固定化し、そしてRad3/ＡＴＲが標識付けされてもよい。本発明者らは、Rad3がＡＴＲと相互作用することを示している。従って、前記のアッセイを、Rad3とＡＴＲとの間の相互作用をモジュレートする化合物を同定するために使用することができ、この場合アッセイ法にて記載された相互作用性タンパク質はRad3またはＡＴＲのいずれかである。本発明者らはまた、Rad3がそれ自体に結合することができることも示しており、ＡＴＲもまたそれ自体に結合できることを強く示すものである。従って、前記したアッセイ法を、Rad3−Rad3の相互作用及びＡＴＲ−ＡＴＲの相互作用をモジュレートする化合物を同定するために使用してもよい。このような化合物は、ＡＴＲ−ＡＴＲの相互作用を破壊し、そして化学療法及び／または放射線療法に対するガン細胞の感受性を高めるために、治療のために使用することができよう。しかして、本発明は抗ガン療法のための候補物質をスクリーニングするためのアッセイ方法を提供するものであり、その方法は、以下の工程すなわち、（ａ）（ｉ）本発明のポリペプチドと、第１のポリペプチドと同じかまたは異なりうる本発明の別のポリペプチドとを、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとが結合して複合体を形成することを許容する条件下でインキュベートし、（ｉｉ）しかして形成された複合体を候補物質と接触せしめるか、または（ａ）本発明のポリペプチドと、第１のポリペプチドと同じかまたは異なりうる本発明の他のポリペプチドとを、候補物質の存在下に、第１のポリペプチドが第２のポリペプチドと結合して複合体を形成することを許容する条件下でインキュベートし、（ｂ）第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの結合を候補物質が阻害するか否かを判定し、そして（ｃ）第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの結合を阻害する候補物質を選択する工程を含む。好ましくは、第１及び第２のポリペプチドは互いに相違するとよい。例えば、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドは双方ともＡＴＲであっても、もしくは双方ともRad3であっても、または１つがＡＴＲでも、１つがRad3もしくはＡＴＲかRad3のいずれかの結合活性を保有する誘導体であってもよい。双方のポリペプチドがＡＴＲまたはRad3である場合、好ましくは、これらのアッセイにおいて２つの識別可能なフォームのＡＴＲ/Rad3が使用される。それらは、例えばいずれかのポリペプチドを標識付けすることによって識別される。標識の例としては、放射活性標識、エピトープタグまたはグルタチオン-S-トランスフェラーゼなどの他のポリペプチドのタグが挙げられる。例えば、Rad3の１つの型は１つの型のエピトープタグを有し、いま１つの型は異なるエピトープタグを有するとよく、そうすれば片方がもう一方に結合したことが定量的または定性的に確認されうるよう、免疫学的に識別されることが可能となる。好ましい方法において、第１のポリペプチドが例えばアガロースビーズまた固体支持体に固定化され、そして第２のポリペプチドが遊離溶液中に存在するとよい。次いで前記の当業者によってよく知られた方法を使用して結合が定量される。本発明によってされに企図されるのは、Rad3タンパク質キナーゼドメインまたはRad3/ＡＴＲ脂質キナーゼドメインに対して特異的な抗体産物（例えばモノクローナル及びポリクローナル抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ−移植抗体等）及び他の結合タンパク質（前記のアッセイにて同定されたタンパク質など）である。結合タンパク質は、単離された天然由来の酵素または組換え酵素を使用して創出することができる。転じて、結合タンパク質は組換え及び天然に存在する酵素を精製するため、及びかかる酵素を生産している細胞を同定するために有用である。細胞内及び流体中のタンパク質の検出及び定量のためのアッセイには、単一の抗体物質または「サンドイッチ」アッセイ様式における複数の抗体物質が包含されうる。結合タンパク質は、酵素／基質または酵素／レギュレーターの相互作用をモジュレートする（すなわち、阻止、阻害、または刺激する）うえでも極めて有用である。 Rad3/ＡＴＲのモジュレーターは、そのキナーゼ活性、細胞内におけるその局在性、及び／または細胞周期チェックポイント経路のメンバーとの相互作用に影響を及ぼしうる。選択的なモジュレーターには、例えば、Rad3/ＡＴＲもしくはR ad3/ＡＴＲ核酸に特異的に結合するポリペプチドもしくはペプチド、及び／またはRad3/ＡＴＲもしくはRad3/ＡＴＲ核酸と特異的に反応する他の非ペプチド化合物（例えば、単離されたまたは合成による有機分子）が包含されうる。野生型の Rad3/ＡＴＲの酵素活性または細胞内局在に影響を及ぼすRad3/ＡＴＲの変異型もまた、本発明によって企図される。さらに、組合せ（combinatorial）ライブラリー、ペプチド及び疑似ペプチド、規定された化学物体、オリゴヌクレオチド、及び天然産物ライブラリーを、前記のごときアッセイにおいてRad3/ＡＴＲキナーゼ活性及びRad3/ ＡＴＲ相互作用のモジュレーターとしての活性についてスクリーニングするとよい。Ｆ．治療用途 Rad3/ＡＴＲ活性のモジュレーターは、それらの脂質キナーゼ及びタンパク質キナーゼ活性の阻害剤を含め、抗ガン療法にて使用されうる。特に、Rad3/ＡＴＲの細胞周期調節機能を破壊するそれらの能力の効により化学療法及び／または放射線療法に対するガン細胞の感受性を高めるために使用されうる。しかして本発明は、ガンの治療方法において、前記のごときスクリーニングアッセイにより同定された、Rad3/ＡＴＲ活性をモジュレートする化合物の用途を提供するものである。一つの実施態様において、前記化合物は、Rad3/ＡＴＲ脂質キナーゼ及び／またはRad3タンパク質キナーゼ活性を阻害することができる。別の実施態様において、前記化合物はＡＴＲとそれ自体の間及び／または、ＡＴＲと、例えば通常にはマルチマータンパク質複合体の一部を形成しうる他の相互作用性タンパク質との間の相互作用を阻害することができる。本明細書中の文脈において、「化合物」なる語は前記アッセイにおいて選択される候補物質をも意味することは理解されるべきである。典型的には、化合物は医薬上容認しうる担体または希釈剤にそれらを混合することにより臨床での投与用に製剤化される。例えば、それらは局所、非経口、静脈内、筋肉内、皮下、眼内または経皮投与用に製剤化することができる。好ましくは、化合物は注射可能な形態にて使用される。患者の腫瘍に対する直接の注射が、侵襲を受けた組織のレベルで治療効果を濃縮することを可能とならしめるので有利である。従って、注射可能な製剤用に、好ましくは、処置されるべき部位に直接注射するために化合物を医薬上容認しうる賦形剤のいずれかのものと混合されるとよい。医薬上容認しうる担体または希釈剤は、例えば無菌または等張の溶液でありうる。使用される化合物の用量は、様々なパラメータに従って、特に使用される化合物、処置を受ける患者の年齢、体重及び状態、使用される投与方式、腫瘍の病理ならびに必要とされる臨床的摂生に従って調整するとよい。指針として、注射により投与される化合物の量は、好適には0.01 mg/kgから30 mg/kg、好ましくは、 0.1 mg/kgから10 mg/kgである。投与されるべき化合物には、ポリペプチドまたは核酸が包含されうる。核酸は、ポリペプチドをコードするとよく、あるいはそれらは細胞の遺伝子の発現を阻害するアンチセンス構築体をコードするものでもよい。核酸は、例えばリポフェクションによって、またはウイルスベクターによって投与されうる。例えば、核酸は、アデノウイルスなどのウイルスベクターの一部を形成してもよい。ウイルスベクターが使用される場合、一般に投与される用量は、10⁴から10¹⁴pfu/mlの間、好ましくは、10⁶から10¹⁰pfu/mlまでである。pfu（「プラーク形成単位」）なる語は、ウイルス溶液の感染性に対応するものであり、適切な培養細胞を感染させ、感染された細胞のプラーク数を一般的には４８時間後に測定することによって決定される。ウイルス溶液のpfuタイターを決定するための技術は、文献に詳報されている。これらの方法によって様々なガンのタイプ、例えば白血病ならびに乳房、卵巣、肺、結腸、膵臓、精巣、肝臓、脳、筋肉及び骨の腫瘍などの固形腫瘍が治療されうる。好ましくは、腫瘍は正常なＡＴＲ機能を有するものである。図面の説明図１ＡＴＲ、rad3、mei-41、MEC1、TEL1及びＡＴＭの関連Ａ．ＡＴＲ、Rad3、Mei-41、Mec1p、Tel1p及びＡＴＭの全構造。解説：白抜きの四角形−Rad3ドメイン；斜線付ボックス−キナーゼドメインＢ．ＤＮＡstarソフトウェアを使用し、クラスタル（Clustal）法（PAM250）によって作成された配列アラインメントに基づいた系統樹。rad3/ESR1/mei-41/ＡＴＲは、ＡＴＭ及びTEL1とよりもさらに密接に関連するものである。rad3及びＡＴＭの配列は、ＥＭＢＬデータベースより入手できる。以下の実施例によって本発明をさらに示す。実施例１ S．pombeのrad3遺伝子は、S．pombeにおけるＤＮＡ構造チェックポイントのために絶対的に必要な６つの遺伝子のうちの１つである（Al-Khodairy及びCarr.19 92；Al-Khodairyら、1994）。rad3遺伝子の一部を表す配列は、Seatonら(1992) によって報告された。この遺伝子のイントロン／エクソン構造を明らかにする試みにおいて、本発明者らは5'及び3'端の双方に配列決定の異常（anomaly）を同定した。本発明者らは、完全な遺伝子を配列決定し（実験法を参照されたい）、そしてrad3が2386アミノ酸の産物をコードすることができることを見出した。Ｃ −末端領域には、脂質キナーゼとして知られているキナーゼのサブクラスに典型的なコンセンサス配列が含まれており、それが見出されたもののメンバーはPI3キナーゼのp110触媒サブユニットである（Hilesら、1992）。アミノ末端及びキナーゼ領域を欠く欠失型rad3クローンは、rad3のrad3::pR3H 1.0遺伝子破壊変異体を捕捉することが報告されている。この破壊変異体では、タンパク質キナーゼドメインは除去されていない。このドメインの役割を明確化するために、本発明者らは遺伝子置換によってヌル変異体を作製した。この変異体は、ura4⁺によって置換されたキナーゼコンセンサスドメインを含む、rad3のアミノ酸第1477〜2271位を有している。この株、rad3.d.は、rad3.136変異体（N asim及びSmith、1975）及び元のrad3::pR3H1.0破壊変異体（Jimenezら、1992；S eatonら、1992）と同様のチェックポイント欠損及び放射／ヒドロキシウレア感受性を有する（データは示さず）。本発明者らは、rad3のキナーゼドメインと推定されるドメインに３つの別個の部位特異的変異を創出し、これらを特定のキナーゼヌル変異を有する株を構築するための遺伝子置換実験において使用した。３つの遺伝子、rad3.D2230A、 rad3.N2235K及びrad3.D2249Eはすべて、rad3.dヌル変異体と同様の表現型を有しており（データは示さず）、キナーゼ活性がRad3機能に必須であることを示唆するものであった。本発明者らの発見に鑑み、Seaton ら（1992）及びJimenezら(1992)の結果の１つの解釈は、欠損を受けた遺伝子を担持するプラスミドと、キナーゼ機能を保有するゲノムの部分的な欠失との遺伝子間の相補を、一部のクローンが示すのかもしれないということである。キナーゼヌル対立遺伝子のrad3.D2249Eが、修飾されたnmt1プロモーター（Mau ndrell、1990）の制御下に野生型細胞にて適度に過剰発現されると、ＵＶストリップテストによってアッセイした場合に顕著な放射線感受性を生じさせ、そして優性の負の変異体として作用した（データは示さず）。同様のキナーゼヌル構築体をさらに高レベルに発現させると、生育が阻害された（データは示さず）。細胞を検査すると、分裂は極めてゆっくりと継続しており、そしてより小さなサイズの細胞である野生型細胞及び空のベクターを含む細胞はおよそ15ミクロンで分裂するが、一方rad3及びｒad3.D2249Eを過剰発現している細胞はおよそ11.2ミクロンで分裂する（データは示さず）ことが示される。S．pｏmbeにおいて、このことは通常、有糸分裂の進行を示唆するものである。ヒトrad3相同体、ＡＴＲ rad3のヒト型を同定するために、方法を組み合わせて適用した。これらの研究によって、本発明者らはヒト遺伝子の全コード領域をクローニングし（材料及び方法を参照されたい）それをＡＴＲ（ataxia and rad related(運動失調及びｒａｄ関連)）と命名した。ＡＴＲは、ヒトＡＴＭ及びS．ceｒevｉsｉae Tel1タンパク質（Savitskyら、1995；Greenwellら、1995）よりもS．pombe rad3、S．cer evisiae ESR1（Kato及びOgawa、1994）ならびにD．melanogaster mei-41遺伝子（Hariら、1995）とより密接に関連しており、そしてrad3の真の相同体であるらしい、2644アミノ酸のタンパク質をコードすることができる。ESR1は、rad3と同様の表現型を有するmec1/sad3チェックポイント変異体（Allenら、1994；Weiner tら、1994）に対する対立形質である。ＡＴＲは、ヒトチェックポイント遺伝子のＡＴＭに、より密接に関連しており、Ｃ−末端の脂質キナーゼドメインと推定されるドメインを含み、同様の全構造を有している。配列のアラインメントによって、rad3/ESR1(MEC1/SAD3）mei-41/ＡＴＲ遺伝子は、他のいずれかのもののＡＴＭまたはTEL1に対する関連性よりも密接に、相互に関連しており、ＡＴＭのTEL1への相同性がより高いことが明らかに証明された（図１）。ＡＴＭ遺伝子は、広く多様な組織にて発現されている（Savitskyら、1995）。 S．cerevisiaeでは、ESR1は有糸分裂細胞において低レベルの発現を示すが、減数分裂Ｉに際しては速やかに誘導される（Kato及びOgawa、1994）。ノザンブロット分析を使用して、本発明者らは、ＡＴＲも多くの組織においてわずかに発現しているが、精巣での発現はさらに高いことを立証している（データは示さず）。ＡＴＲ、Rad3及びEsr1pタンパク質がＡＴＭに対するよりも互いの関連性が高いのであれば、精巣でのＡＴＲ発現がより高いことは、減数分裂での組換えにおいてEsr1pが役割を果たすという観察（Kato及びOgawa、1994）に矛盾しないものである。ＦＩＳＨ及びＰＣＲ分析を使用して、本発明者らは染色体3q22〜3q25にＡＴＲをマッピングしている（データは示さず）。この領域は、既知のガン傾向症候群とは無関係である。 Rad3がマルチマーとして作用する可能性をさらに探索するために、本発明者らはpREPに基づく誘導可能なベクターにて、２つ別々の、タグ付けがなされた全長 rad3の構築体を創出した。そのうちの１つでは、Rad3はＮ末端での２つのmycエピトープタグと共に翻訳され、いま１つのものでは、これらがトリプルＨＡエピトープタグに置換されている。双方の構築体が野生型細胞にて一緒に発現されると、myc特異性抗体でＨＡタグ付けされたRad3を、そしてＨＡ特異性抗体でmycタグ付けされたRad3を共沈させることが可能となる（データは示さず）。このことから、in vivoでRad3タンパク質は自己会合できることが立証され、そしてこれはJimenezら(1992)の相補データに矛盾しないものである。ＡＴＲ遺伝子は、rad3変異体の表現型を補足することができなかったが、本発明者らは同じ酵母細胞にてＡＴＲとmycタグ付けしたS．pombe Rad3を発現することにより、ＡＴＲがS．pombe Rad3とタンパク質複合体を形成する能力を研究した。抗ＡＴＲ抗体（S．pombe Rad3を沈降させないもの。材料及び方法を参照のこと）を使用して、本発明者らは酵母タンパク質を共沈させることができた。本発明者らはまた、S．pombe Rad3を認識するmyc−特異性抗体でＡＴＲタンパク質を沈降させることもできた（データは示さず）。これらのデータから、ヒト及び酵母タンパク質はヘテロマー複合体を形成することができることが示され、これは、配列の相似性に基づき、これら相同体間の密接なる機能的関連性が含意されることを示唆するものである。 Rad3タンパク質は、キナーゼ活性に関与している。突然変異誘発実験によって、Rad3タンパク質のin vivoでのキナーゼ活性がそれらの機能のために必須であるらしいことが示唆されるので、本発明者らはさらにこの活性について調べた。ＨＡタグ付けされたS．pｏmbe Rad3を発現している S．Pｏmbe rad3::ura4細胞を使用して、本発明者らはRad3が誘導された場合のみにＨＡ−特異性抗体と共に沈降し、そして照射後に変化することのない、有意なタンパク質キナーゼ活性を検出することができた（データは示さず）。抗−ＨＡ抗体を用いたウェスタン分析によって、リン酸化されている200kDを越える主要バンドが検出できるので、Rad3または共沈するキナーゼに特異的なこの活性は、 Rad3それ自体のリン酸化を反映するものらしいと考えられる。ミエリン塩基性タンパク質、RP-A及びS．pombeの様々な精製されたチェックポイントタンパク質などの至便なin vitro基質を同定するための試みは、これまでには成功を修めていない。Rad3の「キナーゼ−ヌル」 D2249Eバージョンを過剰発現している細胞を用いて、ＩP in vitroキナーゼアッセイを実施すると、ＨＡ−特異性抗体によって沈降せしめられる会合キナーゼ活性は有意に減少する（データは示さず）。これに対する説明は、様々なものが可能である。測定されたキナーゼ活性は、Rad3活性を直接的に反映できよう。この場合、キナーゼが死滅したRad3で認められる残存活性は、残存するin vitroでの生化学的活性を有する生物学的に不活性なタンパク質を作出するような、他のタンパク質キナーゼにおけるDからEへの同様の変異が知られていなくないという事実を反映しうるものであろう。あるいは、Rad3をリン酸化するキナーゼ活性は会合タンパク質に起因しているかもしれず、そしてこれらタンパク質はD2249E変異体タンパク質と、より低い効率で相互作用するのかもしれない。ディスカッションＤＮＡ損傷後の細胞周期の進行または、かかる周期を含む個々の事象における干渉を制御しているチェックポイント経路は、遺伝的安定性を維持する上でかなり重要なものであり、そして腫瘍形成を抑制する経路であると考えることができる。様々な腫瘍サプレッサー遺伝子が、チェックポイント経路のサブセットに密に関与しており（Hartwell及びKastan、1994）、特にＧ1からＳ期への移行及び細胞周期へのコミットメント（commitment）に影響を及ぼすものに関与している。チェックポイントに対する２つの酵母モデル系の相近性（convergence）により、これらの経路に関わる遺伝子が保存されていることが明瞭に示される。本発明者らの研究は、後生動物細胞へのかかる保存に及び、そしてrad3、ESR1(MEC1/SAD3)、mei-41及びＡＴＭ遺伝子間の関係を明らかにするものである。本発明において、rad3遺伝子の正しい配列は、ＡＴＭに関連するタンパク質／脂質キナーゼのファミリーにその産物を配することが立証される。S．pombeにおけるキナーゼ欠損rad3変異体の過剰発現によって優性の負の表現型が現れ、これによってRad3は、その完全性がチェックポイント機能に欠かせないタンパク質複合体のメンバーとして作用することが示唆される。これは、rad1、rad9、rad17 、rad26及びhus1欠失変異体がすべてrad3.dと識別不可能な表現型を有しているとの観察（Sheldri-ck及びCarr、1933）に矛盾しないものである。予期せざることに、残りのチェックポイントrad遺伝子とは異なり、野生型または変異型のrad 3対立遺伝子を高レベルに過剰発現させると、細胞の生長が阻害され、そして小さな細胞サイズで有糸分裂が惹き起こされ、このことは未成熟で有糸分裂に突入することを示唆している。この「半幼弱（semi wee）」表現型は、ヌル変異体では観察されず、機能がRad3の機能と重複していて有糸分裂を阻害するように作用する第２経路における干渉を示唆するものかもしれない。かかる経路に対する候補として、ＡＴＭ/TEL1経路が挙げられ、これはESR1(MEC1/SAD1)経路とある程度重複する機能を有することが示されている（Morrowら、1995）。ＡＴＭの構造は、テロメアの長さを維持することに関与するTel1pに最も密接に関連している（Greenwellら、1995）。しかしながら、ＡＴＭ機能はRad3/Esr1 p/mei-41産物の機能にも関連しているようである。ＡＴＭ遺伝子及び、ＡＴＭ遺伝子とrad3/ESR1遺伝子との、そしてTEL1との配列の関連が最初に発見されてから、酵母で多くの場合にあるように、遺伝子が酵母にて二分裂及び分岐したものか、または２つの酵母タンパク質が密接に関連する遺伝子の保存されたサブファミリーで規定されるのか、明らかにはならなかった。本発明による重要な要旨は、rad3/ESR1/mei-41と、より密接に関連するヒト遺伝子、ＡＴＲの同定である。これは、真核生物の進化に際して保存されているタンパク質／脂質キナーゼの、構造的に相違する２つのチェックポイント関連サブファミリーを特定するものである。これら２つのサブファミリーのタンパク質はある程度重複する機能を有するかもしれないが、おそらくこれらは相違するプロセスを制御するのである。例えば、酵母におけるrad3サブファミリーは、ｕｖ及びイオン化照射の双方に応答したＧ1及びＧ2チェックポイントＤＮＡ損傷のすべて、ならびに複製の阻害に続く有糸分裂を妨げるＳ期チェックポイントを制御する（Al -Khodairy及びCarr、1992；Allenら、1994；Weinertら、1994）。これに対して、Ａ−Ｔ細胞はイオン化照射、ラジカル攻撃の結果ＤＮＡに鎖の破損を生み出すブレオマイシン及びネオカルジノスタチンを包含する狭い範囲のＤＮＡ損傷性薬剤に対して異常な応答を呈する。ＤＮＡ合成の阻害に対すると同様、ｕｖ及びほとんどの化学発ガン剤に対する応答は正常である。残存するＤＮＡ損傷チェックポイント及びＳ期チェックポイントのいくらかまたはすべては、ＡＴＲによって制御されている可能性がある。実験法株、プラスミド及び培地標準的な遺伝子工学の技術、S．pｏmbeのための生育条件及び培地は、Gutzら( 1974)に記載されている。S．pombe株sp011（ura4.D18,leu1.32 ade6.704 h）は、既に報告されている（Murrayら、1992）。プラスミドpSUB41は、S．Subramaniから入手した（Seaton ら、1992）。 S．pombe rad3のクローニング pSUB41から4.0 kbのKpn1断片を切り出し、5’rad3配列を得るために、両方向に配列決定した。3'クローンは、ゲノミックライブラリー（Barbetら、1992）より、公開されたrad3配列に由来する1kbの3'プローブを使用したコロニーハイブリダイゼーションによって同定し、そして両方向に配列決定した。このようにして、rad3遺伝子の全配列を組み立てた。ヌル及び「キナーゼ死滅」rad3変異体第1477位のアミノ酸と第2271位のアミノ酸との間（キナーゼドメインを含んでいる）の794アミノ酸がura4+遺伝子で置換されたrad3の構築体を、Barbetら(199 2)に記載された方法論を使用して創出した。これの直鎖断片を使用して、sp011 をウラシル原栄養体に形質転換し、そしてrad3座での単一コピーの統合を、サザンブロッティングによって確認した。部位特異的なキナーゼヌル変異を創出すべく、キナーゼドメインにD2230A、N2235KまたはD2249E変異を導入するため、（Ａ：GTTTTCGCCATGGCGCGCTCCCAAACCCAA、Ｂ：TTCATCAAACAATATCTTTTCGCCATGGCG、またはＣ：CAAAAAGACAGTTGAATTCGACATGGATAG）のいずれかで、rad3のＣ−末端3.01 kbの BamHI-SalI断片を変異させた。これまでに、S．cerevisiaeのPI3キナーゼ VPS34の分析にて似通った変更が使用されている（Schuら、1993）。これらの断片を、次いでrad3.dヌル変異に形質転換するために使用し、ＦＯＡを含有する培地での生長能力によって遺伝子の置換体を選択した（Grimmら、1988）。すべての株を、サザンブロッティングによって確認した。rad3.D2230Aの全長を発現する構築体は、標準的なサブクローニングを行い、その後、ATGにNdeI部位を導入し、そして３つの内部NdeI部位を欠失させることによって、pREP1及びpREP41（Maundrell、1990）にて創出した。 REP1（高い）及びREP41（中程度）からの発現は、播種に先駆けて１８時間チアミンを非存在とすることによって誘導した。Stratagene Stratalinkerにセッティングし、プレート下で0から300 Jm^-2までの勾配のｕｖ量にて、プレートを照射した。ＡＴＲのクローニング及び発現ヒトrad3相同体に対応するｃＤＮＡを同定するために適切なプローブを単離すべく、Rad3/Esr1pのアミノ酸LGLGDRH（5'オリゴ；oDH18）及びHVDF[D/N]C（3'オリゴ；oDH-16）に対して縮重オリゴヌクレオチドを設計した。４倍の縮重の位置にイノシンを組入れ、そしてクローニングを容易ならしめるためにプライマーは BamHI（oDH18）及びEcoRI（oDH16）で尾部修飾した。末梢血白血球ｃＤＮＡの増幅より得られた100 bpまでのＰＣＲ産物のＤＮＡ配列分析によって、MEC1/rad3 との有意な類似性が証明された。この配列を使用して、Rad3/Esr1pのアミノ酸配列KFPP[I/V][L/F]Y[Q/E]WFに対して設計されたさらなる縮重プライマー（oDH17 ）を用いたＰＣＲのため、非縮重プライマー（oDH-23；GACGCAGAATTCACCAGTCAAA GAATCAAAGAG）を合成した。この反応の174 bpの産物を、マクロファージｃＤＮＡライブラリーを直接スクリーニングするために使用した。４つの陽性クローンが単離された（最大のものはおよそ3ｋｂ）。平行して、EMBLデータベースに由来する全長のS．pomberad3でデータベース検索を実施し、233 bpの配列において単一のフレームシフトが許容されればrad3の相同体の可能性を有するものとして、ヒトｃＤＮＡクローン、HSAAADPDGを検索した。この233 bpの配列は、連合王国、ケンブリッジ大学のHuman Molecular Genetics Research Grou p、Dr．N．Affaraより得られた1.6 kbのクローンに含まれている。クローン全体（1.6 kb）を配列決定したが、これは縮重ＰＣＲ及びライブラリースクリーニングによって同定されたｃＤＮＡクローン内に位置するものであった。遺伝子全体を同定すべく、Clontech Marathon Kitに提供されている説明内容を使用して、胎盤及び胸腺ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡにつき、ＲＡＣＥＰＣＲ実験を実施した。遺伝子特異的なプライマーは、そのｃＤＮＡクローンに由来するものであった。これらの実験から、2644アミノ酸の内部ＯＲＦ、79 bpの5'非コード領域、194 b pの3'非コード領域及びポリA⁺テイルをもって、8239 bpのｃＤＮＡ配列を組み立てた。エラーを回避するために、最低３回の別々のＰＣＲ反応からのクローンを、両方向に配列決定した。 233 bpの配列は、第6942位での単一塩基の欠失を除き、配列番号：１のヌクレオチド第6809位から7042位までの配列（合計234ではない（nt））に対応している。この配列は、配列番号：２のアミノ酸第2244位から2320位までをコードしている。「1.6 kb」インサートの配列は、配列番号：１のヌクレオチド第5725位から71 04位（1353ではない（nt））に対応しており、そして配列番号：２のアミノ酸第 1892位から2340位までをコードしている。ノザンブロットハイブリダイゼーション：プライマー279-3（TGGATGATGACAGCTGTGTC）及び279-6（TGTAGTCGCTGCTCAATGTC ）を使用して³²Ｐ−ｄＣＴＰの存在下に1.3 kbのＰＣＲ産物を増幅させた。様々なヒト組織のソース由来の、サイズ分画されたポリA+ＲＮＡを２μg含有するナイロン膜（Clontech Laboratories）にて、関連配列への交差ハイブリダイゼーションの可能性を最小にするために最終洗浄を50℃でなく55℃にて行ったことを除いては製造業者により推奨されるとおりに、プローブでの探索を行った。ＡＴＲのマッピング蛍光in situハイブリダイゼーションとポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づくアッセイを組み合わせることにより、本発明者らはＡＴＲ遺伝子を第３染色体にマッピングした。ｃＤＮＡクローンを使用したＦＩＳＨ分析によって、ＡＴＲ遺伝子は第３染色体上、およそq22-23の位置に同定された。ＡＴＲ遺伝子の25 7 bp断片を増幅する２つのプライマー（oATR23：GACGCAGAATTCACCAGTCAAAGAATCA AAGAG及びoATR26：TGGTTTCTGAGAACATTCCCTGA）を、NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository（Drwingaら、1993）より入手可能な、様々なヒト染色体パネルを含むヒト／齧歯類体細胞ハイブリッドに由来するＤＮＡに対して使用した。同じプライマーでのＰＣＲを行って、第３染色体上の特定の領域にＡＴＲを下位局在化特定（sub-localise）した。これらの増幅のための鋳型は、第３染色体に欠損を有する患者由来のＤＮＡ試料からなっていた（Leachら、1994）。 Rad3を用いた免疫沈降（ＩＰ）及びキナーゼアッセイ S．pombe rad3及びヒトＡＴＲ遺伝子を、相補性試験用にpREP41発現ベクターへとクローニングした。タンパク質をタグ付けするために、２つのmycまたは３つのＨＡタグのいずれかのフレーム内Ｎ末端タグ配列を含むこれらのベクターのバージョンを使用した（Griffithsら、1995）。タグ付けされたタンパク質は、チアミンを含まない培地中で生育することにより発現された（Maundrell、1990）。ガラスビーズを添加することにより溶解用緩衝液（25 mM Tris-Cl pH 7.5、60mM B- グリセロホスフェート、0.1 mM Na₃VO₄、1％Triton X-100、50 mM NaCl、2 mM E DTA、50 mM NaF、1 mMフッ化フェニルメチルスルホニル[PMSF]、5μg/mlロイペプチン、5μg/mlアプロチニン、1 mMDTT）中で溶解された酵母細胞は次いで２分間、膜破壊器（dismembrinator）にて処理した。ＩＰのために、300μgの総タンパク質抽出物を、適切な抗体と共に氷上で３０分間インキュベートし、4℃にてさらに３０分間、プロテインＧビーズと混合することによって免疫複合体を沈降させた。キナーゼ活性のために、免疫複合体を溶解用緩衝液で４回洗浄し、キナーゼ緩衝液（25 mM Hepes pH 7.7、50 mM KCl、10 mM MgCl₂、0.1％NP-40、2％グリセロール、1 mM DTT）で１回洗浄して、10μMＡＴＰ［50 Ci/mmol］を含有するキナーゼ緩衝液中で30℃にて１５分間インキュベートした。6％ポリアクリルアミドゲルにて分離するに先駆けて、20ulの2X SDS試料用緩衝液を用いて反応を停止した。ウェスタン分析で、Rad3タンパク質自体と同じ位置に移動するものを含め、Rad3のＩＰは様々なリン酸化産物を含んでいた。斜体は、Seatonらにより配列決定されたもの強調字体は、Seatonらにて欠失していた塩基（2499、2501、2507、2509）下線は、Seatonらにて、いずれか片方側に単一のCの挿入があった２つの塩基（5 918/5919）、（すなわち、正しくない塩基は示していないが、いずれか片方側の１残基は存在する）

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＧ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 33/53 33/53 Ｄ // Ｃ０７Ｋ 14/39 Ｃ０７Ｋ 14/39 Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/19 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．配列番号：１またはその相補配列と選択的にハイブリダイズすることができる、実質的に単離されたフォームのポリヌクレオチド。２．配列番号：１で示されるポリヌクレオチドまたはその断片を含む、請求の範囲第１項記載のポリヌクレオチド。３．請求の範囲第１または２項記載のポリヌクレオチドの少なくとも１５ヌクレオチドの断片を含むポリヌクレオチドプローブ。４．配列番号：３またはその相補配列を含む、実質的に単離されたフォームのポリヌクレオチド。５．配列番号：２または４のポリペプチド、実質的にそれらと相同性を有するポリペプチド、または配列番号：２のポリペプチドの断片のいずれかで示される配列を含む、実質的に単離されたフォームのポリペプチド。６．請求の範囲第５項記載のポリペプチドをコードする、実質的に単離されたフォームのポリヌクレオチド。７．請求の範囲第１、２または６項記載のポリヌクレオチドを有するベクター。８．配列番号：２またはその断片のポリペプチドに結合することができる抗体。９．ヒトまたは動物体試料中における請求の範囲第１項記載のポリヌクレオチドの有無を検出するための方法であって、以下の工程すなわち、ＤＮＡまたはＲＮＡを含有するヒトまたは動物体試料を、ハイビリダイゼーション条件下で請求の範囲第１項記載のポリヌクレオチドまたはプライマーを含むプローブに接触せしめ、そしてプローブと試料中の核酸との間に形成される二本鎖分子を検出する工程を含む方法。１０．生物学的試料中に存在する請求の範囲第６項記載のポリペプチドを検出する方法であって、以下の工程すなわち、（ａ）請求の範囲第７項記載の抗体を準備し、（ｂ）抗体−抗原複合体の形成を許容する条件下で、該抗体と共に生物学的試料をインキュベートし、そして（ｃ）該抗体を含む抗体−抗原複合体が形成されるか否かを判定する工程を含む方法。１１．抗ガン療法のための候補物質をスクリーニングするためのアッセイ方法であって、以下の工程すなわち、（ａ）脂質キナーゼ活性を有する本発明のポリペプチド及び該キナーゼのための基質を、かかるキナーゼ活性が基質に対して作用するような条件下に試薬と共に準備し、（ｂ）候補物質に該ポリペプチド及び基質を接触せしめ、（ｃ）該ポリペプチドのキナーゼ活性の減少の程度を測定し、そして（ｄ）活性の減少をもたらす候補物質を選択する工程を含むアッセイ方法。１２．抗ガン療法のための候補物質をスクリーニングするためのアッセイ方法であって、以下の工程すなわち、（ａ）（ｉ）本発明のポリペプチドと、第１のポリペプチドと同じかまたは異なりうる本発明の別のポリペプチドとを、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとが結合して複合体を形成することを許容する条件下でインキュベートし、（ii）しかして形成された複合体を候補物質と接触せしめるか、または（ａ）本発明のポリペプチドと、第１のポリペプチドと同じかまたは異なりうる本発明の他のポリペプチドとを、候補物質の存在下に、第１のポリペプチドが第２のポリペプチドと結合して複合体を形成することを許容する条件下でインキュベートし、（ｂ）第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの結合を候補物質が阻害するか否かを判定し、そして（ｃ）第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの結合を阻害する候補物質を選択する工程を含む方法。１３．前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドとが識別されうる請求の範囲第１２項記載の方法。１４．請求の範囲第１１乃至１３項のいずれかに記載の方法によって選択された候補物質の治療上有効な量を患者に投与することを含む、患者におけるガンの治療方法。１５．請求の範囲第１１乃至１３項のいずれかに記載の方法によって選択された候補物質の治療上有効な量を患者に投与することを含む、患者における化学療法及び／または放射線療法へのガン細胞の感受性を高める方法。１６．ガンの治療のための、請求の範囲第１１乃至１３項のいずれかに記載の方法によって選択された候補物質の使用。１７．化学療法及び／または放射線療法へのガン細胞の感受性を高めるための、請求の範囲第１１乃至１３項のいずれかに記載の方法によって選択された候補物質の使用。