SK30298A3 - Cell-cycle checkpoint genes - Google Patents

Description

Gény kontrolujúce bunkový cyklus

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa vztahuje k skupine kontrolných génov, ktoré riadia priebeh bunkového cyklu pre eukaryotických buniek.

Doterajší stav techniky

Riadenie bunioviého cyklu je základom pre rast a zachovnie eukaryotických organizmov, od kvasiniek po cicavce. Eukaryotické bunky si vyvinuli riadiace dráhy nazývané kontrolné body /checkpoints/, ktoré zaisťujú, že jednotlivé individuálne fázy bunečného cyklu sú dokončené predtým, ako je začatá ďalšia fáza. Pri poškodení DNA je tak zvýšená šanca na prežitie bunky jednak priamo mechanizmami opravujúcimi DNA a tiež pozastavením postupu v bunečnom cykle. V závislosti od pozície bunky v bunečnom cykle v dobe ožiarenia, poškodenie DNA v bunkách cicavcov môže zabrániť /a/ prechodu z G1 do S fázy, /b/ priebehu S fázy alebo /c/ prechodu z G2 fázy do raitózy. Predpokladá sa, že takéto kontrolné miesta /checkpoints/ zabránia zhubným udalostiam, ako je replikácia poškodenej DNA a segregácii fragmentovaných chromozómov počas mitózy.

Gén rad3 z Schizosaccharomyces pombe je nevyhnutný pre kontrolné body, ktoré odpovedajú na poškodenie DNA a replikačné bloky. Rad3 je členom lipid kinázovej podtriedy kináz, ktorá obsahuje oblasti vykazujúce sekvenčnú homológiu s lipid kinázovou doménou subjednotky pllO fosfatidylinositol-3 kinázy /PI-3 kináza/. Táto podtrieda tiež zahŕňa proteín ATM, ktorý je defektný u pacientov s ataxiou /ataxia-telangiectasia/.Bunky z týchto pacientov /AT bunky/ nevykazujú opozdenie S fázy po ožiarení a vykazujú takzvanú rádio-rezistentnú DNA syntézu /Painter a Young, 1989/. AT bunky ožiarené v S-fáze akumulujú v G2 letálne poškodenie, pravdepodobne ako následok pokusu replikovať poškodenú DNA. AT bunky ožiarené počas G2 fázy vykazujú odlišný fenotyp: nezastavujú mytózu po poškodení DNA a pokračujú v mitóze s poškodenou DNA /Beamisch a Levin, 1984/. Mutácia v A-T lokuse, kde bol ATM gén lokalizovaný, má teda za následok poškodenie niekolkých kontrolných bodov nevyhnutných na primeranú odpoved na ionizujúce ožiarenie. Medzi ďalšie členy tejto podtriedy lipidových kináz patria: Tellp /Greenwell et al. 1985/, gén zúčastňujúci sa pri udržiavaní správnej dĺžky telomer u Sacharomyces cerevisiae: Esrlp: Meclp a produkt génu pre kontrolný bod mei-41 u Drosophila melanogaster /Hari et al. 1995/.

Podstata vynálezu

Analyzovali sme rad3 gén S.pombe a zistili sme, že amínokyselinová sekvencia je tvorená celkom 2386 aminokyselinami a nie 1070 aminokyselinami, ako uviedol Seatson et al. 1992. Určili sme, že sa jedná o priamy homológ S. cerevisiae Esrlp a že vykazuje zhodnú celkovú štruktúru ako ATM gén. Oblasť C-konca rad3 proteínu obsahuje lipidovú kinázovú doménu, ktorá je pre činnosť Rad3 nevyhnutná. Ukázali sme, že Rad3 je sám schopný vzájomného spájania /self association/. Tiež sme určili proteín kinázovú aktivitu spojenú s Rad3.

Ďalej sme našli ludský analóg rad3. Tento gén, ktorý sme pomenovali ATR /ataxia and rad related/ vykazuje značne vyššiu homológiu s rad3 ako s ATM génom.

Sekvencia ludskej ATR cDNA je uvedená ako Seq ID No.l. Anínokyselinová sekvencia ORF od nukleotidu 80 a 8011 je uvedená ako Seq. ID No.2.

DNA sekvencia otvoreného čítacieho rámca /ORF-open reading fráme/ rad3 je uvedená ako Seq.ID No.3. Výsledok translácie génu- 2386 aminokyselín dlhá sekvencia /nukleotidy 585 až 7742 seq ID No. 3/ je uvedená ako Seq. ID No. 4.

Rovnako tak je dôležité, že vynález poskytuje proteín ATR podlá Seq. ID 2,jeho homológa, jeho polypeptidové fragmenty a tiež protilátky schopné viazať proteín ATR alebo polypeptidové fragmenty. ATR proteín, jeho homológy a fragmenty sú ďalej uvádzané ako polypeptidy vynálezu.

Ďalším aspektom predkladaného vynálezu sú polynukleotidy v značne izolovanej forme schopné selektívnej hybridizácie k Seq ID No.l alebo k jeho komplementu /tj. opačnému prameňu/. Predkladajú sa tiež polynukleotidy kódujúce polypeptidy vynálezu, uvádzané ako polynukleotidy vynálezu zahŕňajú DNA zo Seq.

Takéto polynukleotidy budú vynálezu. Polynukleotidy ID No.l a jej fragmenty, schopné selektívnej hybridizácie k tomuto génu.

Ďalšou stránkou vynálezu sú predkladané rekombinantné vektory nesúce polynukleotid vynálezu, včítane expresných vektorov a metódy kultivácie týchto vektorov vo vhodných hostiteľských bunkách, napríklad za podmienok, v ktorých dochádza k expresii proteínu alebo polypeptidu kódovaných sekvencií vynálezu.

Ďalej vynález poskytuje súpravy obsahujúce polynukleotidy, polypeptidy alebo protilátky vynálezu a metódy použitia takýchto súprav pri diagnóze prítomnosti alebo absencie ATR a jeho homológov, alebo jeho variantov, včítane škodlivých mutantov ATR.

Vynález dalej poskytuje metódy testov na vyhľadávanie potenciálnych substancií využiteľných pre inhibíciu alebo aktiváciu ATR ktivity, alebo aktivity mutovanýh foriem ATR, ktoré postrádajú kontrolnú aktivitu /checkpoint activity/. Vynález tiež popisuje testovacie metódy na vyhľadávanie vhodných substancií použiteľných na inhibíciu interakcie medzi ATR a ostatnými zlúčeninami, ktoré reagujú s ATR, včítane samotného ATR.

V tejto súvislosti vynález tiež poskytuje polynukleotidovú sekvenciu Seq ID No.3 v značne izolovanej forme a proteín Seq ID No.4 v značne izolovanej forme a ich nové fragmenty a varianty.

Detailný popis vynálezu

A. Polynukleotidy

Polynukleotidy vynálezu môžu zahŕňať DNA alebo RNA. Tiež sa môžu vyskytnúť polynukleotidy, ktoré obsahujú vo svojej štruktúre syntetické alebo modifikované nukleotidy. Odborníci poznajú rad rôznych typov modifikácií oligonukleotidov. Patrí medzi ne metylfosfonátová a fosforotioátová chrbtica /metylphosphonate and phosphorothioate backbone/, pridanie akridinového alebo polylyžínového reťazca na 3’ alebo 5¹ koniec molekuly. Pre účely prezentovaného vynálezu je potrebné pochopiť, že polynukleotidy tu popísané môžu byt modifikované akoukoľvek metódou známou odborníkom. Takéto modifikácie môžu byť urobené na zvýšenie aktivity in vivo alebo životnosti polynukleotidov vynálezu.

Polynukleotidy vnálezu schopné selektívnej hybridizácie k DNA Seq ID No. 1 budú všeobecne najmenej zo 70% /lepšie ale najmenej z 80- 90% a ešte lepšie najmenej z 95 %/ homológne s zodpovedajúcimi DNA Seq ID No.l v oblasti najmenej 20, alebo lepšie nejmenej 25-30 /napríklad najmenej 40, 60 alebo 100 alebo aj viac/ susediacich nukleotidov.

Je potrebné uvedomiť si, že odborne školené osoby môžu s použitím rutinných techník urobiť náhradu nukleotidov, ktoré neovplyvnia polypeptidovú sekvenciu kódovanú polynukleotidami vynálezu preto, aby sa prejavilo použitie kodónov určitého hostiteľského organizmu, v ktorom majú byt polypeptidy vynálezu exprimované.

Akákoľvek kombinácia vyššie uvedených stupňov homológie a minimálnych veľkostí môže byt použitá na definovanie polynukleotidov vynálezu, pričom preferovaná je stringentnejšia kombinácia /tj. väčšia homológia pri dlhších úsekoch /. Tak napríklad polynukleotid najmenej s 80% homológiou pri 25 alebo lepšie 30 nukleotidov predstavuje jeden aspekt vynálezu, rovnako ako polynukleotid najmenej s 90 % homológiou pri 40 nukleotidoch.

Polynukleotidy vynálezu môžu poslúžiť na vytvorenie primeru /napr. PCR primeru, primeru pre inú amplifikačnú reakciu/, ako sonda /tj. označené značkou detekovateľnou bežnými prostriedkami- napr. použitím rádioaktívnej alebo nerádioaktívnej značky/, alebo môžu byt polynukleotidy klonované do vektorov. Takéto primery, sondy a ostatné fragmenty budú dlhé najmenej 15 nukleotidov /lepšie najmenej 20 a typicky najmenej 25, 30 alebo 40 nukleotidov dlhé/ a sú tiež zahrnuté do tu používaného termínu polynukleotidy vynálezu.

Polynukleotidy ako DNA polynukleotid a primery podlá tohto vynálezu môžu byt produkované rekombinantne, synteticky odborníkom, technikmi.

alebo

Môžu akýmkoľvek byt tiež iným spôsobom známym klonované štandartnými

Primery budú väčšinou postupným pridávaním jedného požadovanej nukleotidovej využívajú automaty a sú bežne produkované synteticky, nukleotidu až po dosiahnutie sekvencie. Tieto techniky známe.

Ďalšie polynukleotidy budú väčšinou produkované s použitím rekombinantných techník, napríklad využitím techniky PCR klonovania /polymerázová retazová reakcia- po lymerase Chain reaction/. Tá zahŕňa vytvorenie páru primerov /napr. 15-30 nukleotidov dlhých/ k oblasti ATR génu, ktorý chceme klonovať, aplikáciu týchto primerov na mRNA alebo cDNA získanej z ľudských buniek /napr. z deliacich sa buniek ako sú leukocyty z periférnej krvi/, vlastnú PCR reakciu za podmienok vedúcich k amplifikácii žiadúcej oblasti, izoláciu amplifikovaného fragmentu /napr. purifikáciu reakčnej zmesi na agarozovom géli/ a získanie amplifikovanej DNA. Primery môžu byt navrhnuté tak, aby obsahovali vhodné cieľové miesto pre reštrikčný enzým, takže amplifikovaná DNA môže byt naklonovaná do vhodného klonovacieho vektoru.

Tieto techniky sa môžu použiť na získanie celej alebo niektorej časti sekvencie ATR, ktorá je tu opísaná. Genómové klony obsahujúce gén ATR a jeho intróny a promotorové oblasti môžme tiež získať analogickým spôsobom, keď ako východiskový materiál slúži genómová DNA z ludských buniek, napríklad pečeňových buniek.

Aj keď sú techniky tu uvedené obyčajne všeobecne známe, ich popis je možno nájsť hlavne v publikácii Molecular Cloning: A laboratory Manual / Sambrook et al., 1989/.

a*

Polynukleotidy, ktoré sú nie 100% homológne k sekvencii predkladaného vynálezu, ale spadajú do rámca tohto vynálezu, môžu byt získané rôznymi spôsobmi.

Iné tu opísané alelické varianty sekvencie ludského ATR môžu byt získané napríklad testovaním genómových DNA knihovní, pripravených z radu jedincov, napríklad jedincov z rôznych populácií.

Ďalej môžu byť získané homológy ATR napr. zo zvierat, hlavne cicavcov /napr. myší, krýs alebo králikov/ a hlavne primátov a tieto homológy a ich fragmenty budú spravidla schopné selektívne hybridizovať k Seq. ID No.l. Takéto • sekvencie môžu byť získané testovaním cDNA knihovní pripravených z deliacich sa buniek alebo pletív alebo • genómových DNA knihovní z iných živočíšnych druhov a testovaním takýchto knihovní sondami zahŕňajúcimi celú alebo časť Seq. ID.l za vysoko sterilných podmienok /napr. 0,03 M chlorid sodný a 0,03 M citrát sodný pri teplotách asi od 50°c do 60°C /.

Alelické varianty a druhové homológy sa môžu taktiež získať s použitím degenerovanej PCR /degenerate PCR/, pri ktorej sa použijú primery zhotovené tak, aby hybridizovali s cieľovými sekvenciami vnútri variantov a amínokyselinové byt vytipované so sekvenciou homológov kódujúcich konzervované sekvencie.Konzervované sekvencie môžu porovnaním amínokyselinovej sekvencie ATR rad3. Primery budú obsahovať jednu alebo viac degenerovaných pozícií a budú použité za menej stringentných podmienok ako sú tie, ktoré sa použijú na klonovanie sekvencií s jednosekvencovými primerami proti známym sekvenciám.

Takéto polynukleotidy môžu byt tiež získané miestne riadenou mutagenézou sekvencie ATR alebo príslušných alelických variantov. To môže byť napríklad užitočné tam, kde sú nevyhnutné tiché zmeny kodónov pre optimalizáciu vhodnosti kodónov pre určitú hostiteľskú bunku, v ktorej má byť polynukletidová sekvencia exprimovaná. Iné zmeny sekvencie môžu byt žiadúce, ak chceme vniesť nové miesto pre reštrikčný enzým alebo pre zmenu vlastnosti alebo funkcie polypeptidu kódovaného polynukleotidom. Žiadúce môžu byť aj ďalšie zmeny,predstavujúce čiastočné zmeny kódovania nájdené u ATR /ktoré ak vedú k vzniku mutantných ATR génov, ktoré stratili kontrolnú funkciu/. Sondy založené na takýchto zmenách môžu byť použité ako diagnostické sondy na detekciu takýchto ATR mutantov.

Vynález ďalej poskytuje dvojpramenné polynukleotidy zahrňujúce polynukleotidy vynálezu a ich doplnky.

Polynukleotidy alebo primery vynálezu môžu obsahovať o o detekčnú značky. Vhodné značky zahrňujú rádioizotopy ako P alebo ³⁵S, enzýmové značky alebo iné proteínové značky, ako napr. biotín. Takéto značky môžu byt pripojené k polynukleotidom alebo primerom vynálezu a môžu byt detekované s použitím známych techník.

Značené alebo neznačené polynukleotidy alebo primery vynálezu alebo príslušné fragmenty môžu použit osoby, ktoré ovládajú techniku detekcie a sekvenovania nukleových kyselín na detekciu alebo sekvenovanie ATR v ľudskom alebo zvieracom tele.

Takéto detekčné testy všeobecne obsahujú aplikáciu sondy obsahujúcej polynukleotid alebo primer vynálezu na vzorku z ľudí alebo zvierat obsahujúci DNA alebo RNA za hybridizačných podmienok a detekciu akýchkoľvek duplexov vytvorených medzi sondou a nukleovou kyselinou vzorky. Detekciu je možno realizovať s použitím techník ako je PCR lebo imobilizáciou sondy na pevný povrch, odstránením neprihybridizovaných nukleových kyselín a potom detekovaním nukleových kyselín, ktoré prihybridizovali k sonde.Alebo môžu byt nukleové kyseliny vzorky prichytené na pevný povrch a potom sa detekuje množstvo naviazanej sondy k vzorke. Vhodné detekčné metódy pre tieto spôsoby detekcie sú uvedené napríklad v W089/03891 a W090/13667.

Pri sekvenovaní ATR sa aplikuje na cieľový ľudský alebo zvieraciu telovú vzorku /odsahujúcu DNA alebo RNA/ sonda obsahujúca polynukleotid alebo primer vynálezu za hybridizačných podmienok a detekciu sekvencie napríklad Sangerovou dideoxy térmizačnou metódou /vid Sambrook et al:/.

Takáto metóda spravidla zahŕňa elongáciu /za prítomnosti vhodných činidiel/ primeru sntézou komplementárnej DNA alebo RNA a selektívne ukončenie elongačnej reakcie u jedného alebo viac A,C, G alebo T/U rezíduí. Dochádza teda k predlžovaniu prameňa, ktoré je ukončené terminačnou reakciou: dalej nasleduje vlastné určenie sekvencie nukleotidov separáciou podľa veľkosti predĺžených produktov /podľa toho, kde došlo k selektívnemu ukončeniu predlžovania/. Vhodné činidlá zahŕňajú enzým DNA polymerázu, deoxynukleotidy dATP, dCTP, dGTP a dTTP, pufor a ATP. Pre selektívnu termináciu sa používajú dideoxynukleotidy.

Testy pre detekciu alebo sekvenovanie ATR v ľudskom alebo zvieracom organizme môžu byt použité na určenie sekvencie ATR v bunkách individuálnych organizmov, ktoré majú /alebo u ktorých sa predpokladá/ pozmenenú génovú sekvenciu ATR, napríklad u rakovinových buniek včítane buniek leukemických alebo pevných tumorov, ako napr. tumorov prsníka, vaječníkov, tračníka, pankreasu, semeníkov, pečene, mozgu, svalov a kostí.

Naviac, objavenie ATR umožní teraz skúmat vplyv tohto génu pri dedičných poruchách podobným spôsobom ako u génu ATM. Všeobecne to zahŕňa určenie stavu ATR /napr. použitím sekvenčnej analýzy pomocou PCR/ v bunkách odvodených od pacientov chorých, u ktorých replikujúcich sa buniek napr. rakovine, chromozomálnym zmenám alebo s fenotypom s citlivosťou funkcií.

môže dochádzať k poškodeniu rodinnou predispozíciou k alebo nestabilite fenotypu voči poškodeniu reparačných

Sondy vynálezu môžu byt vhodne dodávané vo forme testovacej súpravy vo vhodnom obale. V takejto súprave /ak to vyžaduje daný test/, môže byt sonda naviazaná na pevný povrch. Súprava môže tiež obsahovať vhodné reagenčné činidlá na prípravu analyzovanej vzorky, hybridizácie sondy k nukleovým kyselinám vzorky, kontrolné činidlá, inštrukcie a podobne.

Predkladaný vynález tiež poskytuje polynukleotidy kódujúce dalej opísané polypeptidy vynálezu.Pretože takéto polynukleotidy budú užitočné ako sekvencie pre rekombinantnú produkciu polypeptidov vynálezu, nie je nevyhnutne potrebné, aby selektívne hybridizovali so sekvenciou Seq ID No. l, aj ked by to všeobecne bolo žiadúce. Inak takéto polynukleotidy môžu byt, ak je to potrebné- značené, použité a pripravené tak, ako bolo uvedené vyššie. Polypeptidy vynálezu budú opísané dalej.

Zvlášť preferované polynukleotidy vynálezu sú tie, ktoré sú odvodené od lipid kinázovej domény ATR, ich alelických variantov a druhových homológov. Lipid kinázová doména je reprezentovaná nukleotidami 7054 až 8011 Seq. ID 1. Polynukleotidy vynálezu, ktoré obsahujú túto doménu, sú hlavne preferované. Termín lipid kunázová doména / sa vzťahuje k doméne, ktorá má homológiu s ostatnými lipid kinázami, hlavne s podjednotkou pllO PI-3 kinázy /stanovené porovnaním sekvencií/.

Ostatné preferované polynukleotidy vynálezu sú tie, ktoré obsahujú nukleotidy kódujúce aminokyseliny 181-302 Seq. ID No.2 /nukleotidy 620 - 985 Seq. ID No. 1/ o ktorých sa predpokladá, že tvoria oblasť leucínového zipu /leucine zipper región/, namiesto predpokladanej interakcie proteín-proteín a aminokyseliny 1358-1336 /nukleotidy 4151-4177/, ktoré sú tiež konzervované.

Ďalšia stránka vynálezu - boli pripravené polynukleotidy vynálezu obsahujúce Seq. ID No. 3a jej fragmenty schopné selektívnej hybridizácie k tejto sekvencií /iné ako fragmenty obsahujúce nukleotidy 2482-6599/, u ktorých boli urobené tieto zmeny: odstránenie rezíduí 2499, 2501, 2507 a 2509 a vloženie C medzi 5918/5919.

Zvlášť preferované fragmenty predstavujú tie, ktoré obsahujú rezíduá 6826-7334 /lipid kinázová doména/ a oblasť leucínového zipu /1476 - 1625 a 2310 - 2357/. Ďalej sú obsahujúce konzervovanú oblasť Tieto polypeptidy a fragmenty môžu opísanými vyššie.

preferované fragmenty nukleotidov 3891 - 3917, byť pripravené postupmi

B. Polypeptidy

Polypeptidy vynálezu zahŕňajú polypeptidy v značne izolovanej forme, ktoré obsahujú sekvenciu uvedenú v Seq ID No. 2.

Polypeptidy ďalej zahŕňajú varianty týchto sekvencií, včítane prirodzene sa vyskytujúcich alelických variantov a syntetických variantov, ktoré sú vysoko homológne k daným polypeptidom. V tomto kontexte je značná homológia chápaná ako sekvencia, ktorá má aspoň 70 % /napríklad 80 % lebo 90 %/ homológie /zhoda/ nukleových kyselín na úseku cez 30 aminokyselín so sekvenciou Seq. ID No.2 okrem lipid kinázovej domény a C-koncovej časti /rezídua 2326 - 2644/, kde podstatná homológia je chápaná ako najmenej 80 % homológia, ale lepšie 90 % homológia /identita/ úseku cez 50 aminokyselín.

Medzi polypeptidy patria aj iné polypeptidy kódované homológami ATR z iných druhov včítane zvierat, ako sú cicavce /napr. myši, krysy alebo králiky/ a hlavne primáty a ich varianty definované vyššie.

Polypeptidy vynálezu zahŕňajú fragmenty vyššie uvedených kompletných polypeptidov ich variantov, včítane fragmentov sekvencie uvedenej v Seq. ID No.2.

Medzi preferované fragmenty patria hlavne tie, ktoré obsahujú epitop, hlavne epitop /wich include an epitop, especially an apitop/. Vhodné fragmenty budú mat veľkosť aspoň 5, nap. 10, 12, 15 alebo 20 aminokyselín. Polypeptidové fragmenty proteínu ATR a jeho alelických a druhových variantov môžu obsahovať jednu alebo viac /napr. 2, 3, 5 alebo 10 substancií / substitúcií, delecií alebo inzercií včítane konzervovaných substitúcií.

Konzervované substitúcie sa môžu robit podľa nasledujúcej tabuľky uvádzajúcej konzervatívne substitúcie, kde aminokyseliny v rovnakom bloku v druhom stĺpci a ak je možné aj v rovnakom riadku v tretom stĺpci môžu byt nahradené jedna za druhou.

Alifatické	Nepoláme	GAP I L V
Polárne	C S T M
	N Q
Polárne-nabité	D E
K R
Aromatické		H F W Y
Ostatné		N Q D E

Variantry peptidov vynálezu môžu tiež obsahovať polypeptidy, kde jedna alebo viac špecifikovaných /t.j. prirodzene kódovaných / aminokyselín je odstránená alebo nahradená alebo kde je pridaná jedna alebo viac nešpecifikovaných aminokyselín:

1./ bez straty kinázovej aktivity špecifickej pre polypeptidy vynálezu alebo 2/ so stratou kinázovej aktivity špecifickej pre polypeptidy vynálezu alebo 3/ so stratou schopnosti interakcie s jednotlivými členmi alebo regulátormi kontrolných bodov priebehu bunečného cyklu.

Epitopy môžu byt napríklad určené technikami vyhladávania polypeptidov, ktoré sú opísané napr. v publikácii Geysen et al. Mol. Immunol., 23.: 709 - 715 /1986/.

Polypeptidy vynálezu môžu byt v značne izolovanej forme. Je potrebné vysvetlit, že polypeptidy môžu byt zmiešané s nosičmi alebo riedidlami, ktoré nebudú interferovať so zamýšianým účelom polypeptidov a stále budú považované za značne izolované. Polypeptidy vynálezu môžu byt tiež v značne vyčistenej /purifikovanéj / forme, kedy polypeptidy vynálezu predstavujú spravidla viac ako 90 %, teda napr. 95 % 98% alebo 99% polypeptidov v prípravku. Polypeptidy vynálezu môžu byt modifikované napríklad pridaním histidinových rezíduí s cielom uiahčit ich purifikáciu alebo pridaním signálnej sekvencie s cieíom ulahčit ich sekréciu buniek.

Polypeptidy vynálezu môžu byt označené detekčnou značkou. Detekčná značka môže byt vhodná značka, ktorá umožní detekciu proteínu. Medzi vhodné značky patria napríklad rádioizotopy, napr.¹²⁵I, enzýmy, protilátky, polynukleotidy a ďalšie látky, ako napríklad biotín. Značené polypeptidy vynálezu môžu byt použité v diagnostických postupoch ako imunotesty s cieíom určit množstvo polypeptidu vynálezu vo alebo značené polypeptidy vynálezu môžu vzorke. Polypeptidy byt tiež použité v sérologických alebo bunečných imunologických testoch na detekciu imúnnej reakcie k daným polypeptidom u zvierat a u ludí s použitím štandardných protokolov.

Polypeptidy alebo značené polypeptidy vynálezu alebo ich fragmenty môžu byť tiež prichytené k pevnej fáze, napríklad k povrchu jamky pre imunotesty alebo na testovacie pásiky.

Takéto značené alebo imobilizovené polypeptidy môžu byť dodávané vo forme súprav vo vhodnom obale spoločne s príslušnými činidlami, kontrolami, inštrukciami atď.

Takéto polypeptidy a súpravy môžu byt použité v metódach na imunodetekciu protilátok proti ATR proteínu alebo iným alelickým variantom alebo druhovým variantom.

Imunometódy sú odborníkom známe a všeobecne obsahujú:

a/zaistenie polypeptidu obsahujúceho epitop zachytitelný protilátkou proti danému proteínu b/ inkubáciu biologickej vzorky s daným polypeptidom za podmienok, ktoré umožnia tvorbu komplexu protilátka-antigén a c/ určenie, či došlo k tvorbe komplexu protilátkaantigén obsahujúci daný polypeptid.

Polypeptidy vynálezu môžu byt pripravené synteticky /napr.podlá Geysen et al./ alebo rekombinantne, ako je to opísané ďalej.

Medzi zvlášť preferované polypeptidy vynálezu patria tie ktoré preklenújú alebo sú v lipid kinázovej doméne, menovite aminokyseliny, menovite aminokyseliny 2326- 2644 Seq. ID 2. alebo sekvencie vykazujúce s ňou podstatnú homológiu. Vyššie definované fragmenty z týchto oblastí sú zvlášť preferované. Polypeptidy a ich fragmenty môžu obsahovať zmeny aminokyselín ako je uvedené vyššie, včítane substitúcií na jednej alebo viacerých pozíciách z pozícií 2475, 2480, 2494, ktoré zodpovedajú polohe rad3 substitúcií opísaných v nasledujúcich príkladoch. Medzi preferované substitúcie patria D2475A, N2480K a D249E.

Polypeptidy vynálezu môžu byt použité v in vitro alebo in vivo systémoch bunečných kultúr na štúdium úlohy ATR ako kontrolného génu. Napríklad skrátené alebo modifikované /napr. modifikované v oblasti lipid kinázovej domény/ polypeptidy ATR môžu byt včlenené do bunky s cieľom narušiť normálne kontrolné funkcie, ktoré sú v bunke.

Polypeptidy vynálezu môžu byť zavedené do buniek in situ exprexiou polypeptidu z rekombinantného expresného vektora /viď ďalej /. Expresný vektor môže obsahovať indukovatelný promotor na riadenie expresie polypeptidu.

Použitie hostiteľských buniek cicavcov je možno predpokladať vtedy, ak sa chcú dosiahnuť rôzne post-translačné modifikácie /napr.

glykozylácia, skrátenie, lapidácia fosforylácia tyrosínu, serínu alebo treonínu/, čo môže byt nevyhnutné na dosiahnutie optimálnej bilogickej aktivity rekombinantných produktov expresie vynálezu.

myristolation/, /lapidation/ a

Takéto systémy bunečných kultúr, v ktorých sú exprimované byt použité v testovacích možných substancií, ktoré kontrolné funkcie v bunke.

polypeptidy vynálezu, môžu systémoch na identifikáciu interferujú alebo zosilňujú /viď ďalej/.

V ďalšom pohľade polypeptidy vynálezu zahŕňajú proteín Seq. ID No. 4 a jeho fragmenty z inej oblasti ako fragment zložený z aminokyselín 713 až 1778. Medzi obzvlášť preferované fragmenty patria tie, ktoré zahŕňajú rezíduá 2082 až 2386 /lipid kinázová doména/ a oblasť leucínového zipu /leucine zipper/ 298-347 a 576-591. Ďalej je preferovaný fragment obsahujúci konzervovanú oblasť 1103-1111. Takéto polypeptidy a fragmenty môžu byt pripravené a použité ako je opísané vyššie.

Vynález tiež poskytuje polypeptidy s významnou homológiou k proteínu Seq. ID No. 4 a jeho fragmentom. V tejto súvislosti sa za významnú /podstatnú / homológiu pokladá sekvencia minimálne s 70 %, napr. 80 % alebo 90 % amínokyselinovou homológiou /identitou/ úseku 30 aminokyselín so sekvenciou Seq. ID No. 4 okrem lipid kinázovej domény a C-konca /rezídua 2082-2386/, kde sa za podstatnú homológiu pokladá minimálne 80 %, alebo lepšie aspoň 90 % homológie /identita/ v úseku 50 aminokyselín.

C. Vektory

Polynukleotidy vynálezu môžu byt včlenené do rekmbinačných vektorov schopných replikovať sa. Vektor sa môže použiť na replikáciu nukleovej kyseliny v kompatibilnej hostiteískej bunke. Vynález preto tiež poskytuje metódu na tvorbu polynukleotidov vynálezu včlenením polynukleotidu vynálezu do replikačného vektora, vpravením vektora do kompatibilnej hostiteískej bunky a pestovaním hostiteískej bunky za podmienok, ktoré vyvolajú replikáciu vektora. Vektor sa môže z hostiteíských buniek znovu získať. Vhodné hostiteíské bunky sú opísané ďalej v súvislosti s expresnými vektormi.

D. Expresné vektory

Je žiadúce, keď plynukleotidy vynálezu vo vektore sú funkčne spojené /operably linked/ s riadiacou sekvenciou, ktorá je schopná zaistiť expresiu kódujúcej sekvencie hostiteľskou bunkou, t.j. keď vektor je expresným vektorom.

Termín funkčne spojený sa vzťahuje k vzájomnej pozícii, kde sú opísané zložky v takom vzťahu, ktorý umožňuje ich zamýšľanú funkciu. Riadiaca sekvencia funkčne spojená s kódujúcou sekvenciou je priligovaná tak, že za podmienok vhodných pre riadiacu sekvenciu dôjde k expresii kódujúcej sekvencie.

Takýmito vektormi môže byt transformovaná vyššie opísaná vhodná hostiteľská bunka s cieľom exprimovat polypeptid vynálezu. Vynález teda ďalej poskytuje postup na prípravu polypeptidov podľa vynálezu, ktorý zahŕňa kultiváciu hostiteľskej bunky transformovanej alebo transfektovanej expresným vektorom, ako je opísané vyššie za podmienok, kedy dochádza k expresii kódujúcej sekvencie vektora, ktorá kóduje polypeptid a získanie vytvoreného proteínu.

Vektory môžu byť napríklad plazmidy, vírové alebo fágové vektory poskytnuté s počiatkom replikácie /origin of replication / a prípadne aj promotorom pre expresiu daných polynukleotidov a prípadne aj regulátorom promotoru. Vektory môžu obsahovať jeden alebo viac génov selekčných markerov napríklad gén rezistencie na ampicilín v prípade bakteriálnych plazmidov alebo rezistencie na neomycín v prípade cicavčích vektorov. Vektory sa môžu použiť in vitro, napríklad na tvorbu RNA alebo použité na transfekciu alebo transformáciu hostiteľských buniek. Vektor môže byť tiež upravený na použitie in vivo, napríklad v metódach využívaných pri génovej terapii.

Vynálezu ďalej poskytuje hostiteľské bunky transformované alebo transfektovaná vektory na replikáciu a expresiu polynukleotidov vynálezu. Bunky budú vybraté tak, aby boli kompatibilné s daným vektorom a môžu to byť napríklad bunky bakteriálne, kvasničné, hmyzie alebo cicavčie.

Polynukleotidy vynálezu môžu byt tiež včlenené do vyššie opísaných vektorov v opačnom /antisense/ smere s cieľom, získať antisenze RNA. Antisenze RNA alebo iné antisenze polynukleotidy môžu byt pripravené tiež synteticky. Takéto antisenze nukleotidy sa môžu využiť na kontrolu hladiny ATR alebo jeho variantov alebo druhových homológov.

Promotory a ostatné expresné regulačné signály môžu byť vybraté tak, aby boli zlúčiteľné s hostiteľskou bunkou, pre ktorú bol expresný vektor navrhnutý. Napríklad kvasinkové promotory zahŕňajú s.cerevisiae GAL4 a ADH promotory, S pombe nmtl a adh promotory. Promotory cicavcov obsahujú metálotioneínový promotor /metallotionein promotor/, ktorý reaguje na ionty ťažkých kovov, napríklad kadmia. Vírové promotory, ako napr. SV40 large T antige'n promotor alebo promotory adenovírov môžu byt tiež použité. Všetky tieto promotory sú ľahko dostupné.

E. Protilátky

Vynález tiež poskytuje monoklonálne alebo polyklonálne protilátky proti polypeptidom vynálezu alebo ich fragmentom

Vynález tiež popisuje proces alebo polyklonálnych protilátok Monoklonálne protilátky môžu na produkciu monoklonálnych proti polypeptidom vynálezu, byt pripravené konvenčnou hybridomovou technológiou s využitím polypeptidov vynálezu alebo ich polypeptidových fragmentov ako imunogénov. Polyklonálne protilátky môžu sa tiež pripraviť konvenčnými spôsobmi, ktoré zahŕňajú imunizáciu hostiteľského zvieraťa /napríklad krysy alebo králika / polynukleotidy vynálezu alebo ich peptidovými fragmentárni a získanie imúnneho séra.

Aby mohli byť takéto protilátky pripravené, poskytuje vynález polypeptidy vynálezu alebo ich fragmenty pripojené /haptenised to/ k inému polypeptidu. Takéto komplexy sú použité ako imunogény u cicavcov alebo u ľudí.

Preferované protilátky vynálezu sú schopné selektívnej väzby proteínu ľudského ATR, to znamená s afinitou najmenej lOx ale lepšie aspoň lOOx väčšou ako s rad3 proteínom. Takéto protilátky môžu byt získané rutinnými experimentami napr. výberom oblastí proteínu ATR so sekvenciami odlišnými od zodpovedajúcich oblastí rad3, prípravou peptidov obsahujúcich takéto sekvencie a použitím takýchto peptidov ako imunogénov. Po produkci daných protilátok sa overia ich väzobné vlastnosti. Preferované protilátky vynálezu zahŕňajú tie, ktoré majú schopnosť selektívnej väzby na lipid kinázovú doménu /definovanú vyššie/ ľudského ATR proteínu. Naviae protilátky, ktoré sú schopné väzby ľudskej kvasinkovej /S.pombe/ lipid kinázovej domény s podobnou afinitou ale nie k doménam ATM rodiny proteínov, potom predstavujú ďalšiu stránku vynálezu. Takéto protilátky môžu byt pripravené proti peptidom z lipid kinázovej domény, ktorá zodpovedá oblastiam, ktoré boli uznané ako zhodné alebo podstatne zhodné v ľudských a kvasinkových génoch.

Pre účely tohto vynálezu termín protilátka, ak nie je uvedené inak, zahŕňa fragmenty celých protilátok, ktoré si zachovávajú svoju väzobnú aktivitu k cieľovému tumorovému antigénu. Takéto fragmenty zahŕňajú Fv, F /ab^r/ a F /ab/₂ fragmenty a tiež jednoretazcové protilátky. Okrem toho protilátky a ich fragmenty môžu byt poľudštené protilátky /humanised antibodies/ ako je to opísané v EP-A-239400.

Protilátky sa môžu použit v metódach detekcie polypeptidov vynálezu, prítomných v biologických vzorkách metódami, ktoré obsahujú:

a/ prípravu protilátok vynálezu b/ inkubáciu biologickej vzorky s danou protilátkou za podmienok, ktoré umožňujú tvorbu komplexu protilátka-antigén a c/ určenie, či došlo k tvorbe komplexu anrigén-protilátka s danou protilátkou

Medzi vhodné vzorky patria extrakty z deliacich sa buniek, napr. leukocytov alebo rakovinových buniek, obsahujúcich leukémické bunky a pevné nádory, ako napríklad tumory prsníka, vaječníka, pľúc, tračníka pankreasu, semenníkov, pečene, mozgu, svalov a kostí.

Protilátky vynálezu môžu byt naviazané na pevný povrch alebo pripravené vo forme súpravy vo vhodnom obale spoločne s príslušnými činidlami, kontrolami, inštrukciami atď.

F. Skúšky

Potenciálnou stratégiou na návrh liečiv na protirakovinovú liečbu je narušenie kontrolných bodov bunečného cyklu,či by sa už jednalo o nový postup alebo v kombinovanej terapii s cieľom zvýšiť špecifickú toxicitu súčasných chemoterapeutických látok. Napríklad alkylačné látky /napr.

nitrogén mustard / sa používajú ako chemoterapeutické látky, ktoré poškodia DNA v rýchlo sa deliacich bunkách, čo vedie ku smrti bunky. Toxicita takejto látky môže byť znížená mechanizmami opravujúcimi DNA a cestami kontrolných bodov. Narušenie takýchto mechanizmov zvýši teda účinnosť terapeutických zlúčenín navrhnutých na poškodenie DNA. Narušenie ATR kontrolných bodov bude užitočné hlavne vtedy, ked tumorové bunky už stratili ostatné kontrolné body alebo na poškodenie reagujúce gény, pretože tieto ostatné gény môžu byt schopné doplniť stratu funkcie ATR v netumorových bunkách, čo vedie k ďalšiemu zvýšeniu účinnosti chemoterapeutických látok.

Cieľom pri vývoji protirakovinových zlúčenín je lipid kinázová aktivita ATR, pretože výsledky prezentované v nasledujúcich príkladoch naznačujú, že kinázová doména je nevyhnutná pre funkciu ATR. Predkladaný vynález teda poskytuje testovaciu metódu na zisťovanie možných látok na protirakovinovú liečbu, ktorá obsahuje:

a/ prípravu polypeptidu vynálezu, ktorý nestratil lipid kinázovú aktivitu a substrátu na danú kinázu za podmienok a s takými reagenciami, za ktorých bude kinázová aktivita pôsobiť na substrát b/ zmiešanie daného polypeptidu a substrátu s testovanou látkou c/ meranie stupňa poklesu kinázovej aktivity daného polypeptidu a d/ výber vhodnej látky, ktorá znižuje aktivitu

Test sa môže urobiť in-vitro, napríklad v jamkách mikrotitačnej dosky. Takýto formát sa môže ľahko adaptovať na automatizáciu, ktorá umožňuje testovanie veľkého množstva potenciálnych substancií.

Substrátom môže byt proteín alebo lipidový substrát prírodného alebo syntetického pôvodu, na ktorý bude pôsobit polypeptid vynálezu. Polypeptid vynálezu bude substrát obyčajne fosforylovat.

Odborníci si môžu vybrat akýkoľvek vhodný formát výkonných testov. Typický polypeptid vynálezu, ktorý vykazuje lipid kynázovú aktivitu sa zachytí k pevnému povrchu za prítomnosti substrátu a bunečných a ddlších komponentov, ktoré sú väčšinou nevyhnuté na aktivitu. Označený fosfát a tesotvaná látka sa pridajú do zmesi súčasne alebo v poradí po sebe. Po uplynutí príslušnej reakčnej doby /väčšinou niekoľko minút, ale v každom prípade dostatočne dlho na to, aby došlo k fosforylácii substrátu za neprítomnosti testovanej látky/ sa stanoví množstvo voľného substrátu, napr. precipitácii fosfátu. Testovaná látka, ktorá inhibuje kinázovú aktivitu, bude inhibovať inkorporáciu voľného substrátu do substrátu, a tak ked je nájdený voľný fosfát, naznačuje to prítomnosť inhibície.

Odborníci môžu využiť aj iné metódy.

Testované látky môžu byt pri začiatočnom testovaní navzájom zoskupené, takže je možné v jednej reakcii otestovať napríklad 10 vzoriek a v prípade pozitívneho výsledku uskutočniť individuálne testovanie.

Vhodné látky na testovanie zahŕňajú peptidy, zvyčajne veľké 5-20 aminokyselín, založené na sekvencii kinázovej domény alebo variantách tohto peptidu, kde je nahradené jedno alebo viac residuí tak, ako je opísané vyššie. Môžu byť použité peptidy zo skupiny peptidov s náhodnými sekvenciami alebo sekvenciami, ktoré boli upravené v súlade s cieľom získať maximálne rozsiahly súbor peptidov. Ďalšie možné látky obsahujú inhibítory kináz, čo sú malé molekuly, ako cyklosporinom a staurosporínom príbuzné látky /Cyklosporin-like and staurosporin-like coumpounds/ alebo ďalšie komerčné látky zo skupiny malých molekúl inhibítorov.

Testované látky, ktoré vykazujú aktivitu v in-vitro pokusoch opísaných vyššie, môžu vyt následne testované v systémoch in vivo, ako napríklad kvasinkových alebo cicavčích bunkách, ktoré sa vystavia pôsobeniu inhibítorov a testujú na aktivitu kontrolných bodov.

Ukázali sme tiež, že Rad3 vykazuje proteín kinázovú aktivitu. Cieľové substráty Rad3 proteín kinázovej aktivity sa môžu zistiť zahrnutím testovaných zlúčenín do testov na kinázovú aktivitu. Rad3 proteín je resuspendovaný v kinázovom pufri a inkubovaný buď za prítomnosti alebo neprítomnosti testovanej látky /napr. kazeín, histon Hl alebo príslušný substrátový peptid/. Prenesené množstvo /v moloch/ fosfátu kinázami sa zisťuje autorádiografiou alebo scintilačne.Prenos fosfátu na testovanú látku svedčí o tom, že tetovaná látka je kinázou.

Látky pozmeňujúce Rad3/ATR lipid kinázovú alebo Rad3 proteín kinázovú aktivitu sa môžu zisťovať inkubáciou testovanej látky a Rad3/ATR získaného imunitnou purifikáciou z buniek prirodzene produkujúcich Rad3/ATR.

S Rad3/ATR získaným z rekombinantných prokaryontných alebo eukaryontných buniek produkujúcich enzým alebo purifikovaným Rad3/ATR a určením vplyvu testovanej látky na aktivitu Rad3/ATR. Aktivita Rad3/ATR lipid kinázovej alebo Rad3 proteín kinázovej domény môže byt meraná určením množstva / v moloch/ ³²p-fosfátu preneseného kinázami z gama-³²p-ATP na seba /autofosforylácia/ alebo na vonkajší substrát, ako npr. lipid alebo proteín. Množstvo fosfátu včleneného do substrátu sa meria scintilačne alebo autorádiografiou. Zvýšenie množstva preneseného fosfátu /počtu molov/ na substrát v prítomnosti testovanej látky v porovnaní s množstvom preneseného fosfátu /počtu molov/ bez testovanej látky ukazuje, že testovaná látka pôsobí ako aktivátor danej kinázovej aktivity. A opačne, zníženie množstva preneseného fosfátu /počtu molov/ na substrát v prítomnosti testovanej látky v porovnaní s množstvom preneseného fosfátu /počtu molov/ bez testovanej látky ukazuje, že testovaná látka pôsobí ako inhibítor danej kinázovej aktivity.

vynálezu s produktami

V teste, ktorý sa teraz preferuje, je protilátka proti Rad3/ATR pripojená k agarozovému nosiču /agarose beads/ inkubovaná s bunečným lyzátom pripraveným z hostiteľských buniek produkujúcich Rad3/ATR. Nosič sa potom opláchne /aby sa odstránili na nosič nešpecifický naviazané proteíny / a nosič je potom resuspendovaný v kinázovom pufri /napr. 25 mM K-HEPES pH 7.7 mM chlorid draselný, 10 mM chlorid horečnatý, 0.1 % Nonidet-P-40, 20 % glycerol, 1 mM DTT/. Pridaním 100 uM gama-³²P-ATP /4 juCi/mM/ a exogénneho substrátu /napr. lipidu alebo peptidu/ sa iniciuje reakcia, ktorá prebieha pri 30 °C počas 10 minút. Aktivita kinázy je meraná určením množstva / v moloch/ ³²P-fosfátu preneseného bud na vlastnú kinázu alebo na pridaný substrát. V preferovanom prípade hostiteľské bunky postrádajú vnútornú Rad3/ATR aktivitu.Selektivita látky, ktorá upravuje lipid kinázovú aktivitu Rad3/ATR, môže byt stanovená porovnaním aktivity na Rad3/ATR s jej aktivitou, napr. na iných známych fosfátidylinositol-3 /PI-3/ príbuzných kinázach. Kombinácia rekombinantných Rad3/ATR produktov inými rekombinantnými PI-3 príbuznými kinázovými v rade nezávislých pokusov poskytne systém pre vývoj selektívnych modulátorov Rad3/ATR kinázovej aktivity.

Podobne, selektivita zlúčeniny, ktorá moduluje proteín kinázovú aktivitu Rad3, môže byt určená vo vzťahu k iným proteínovým kinázam, napr.DNA dependentným proteín kinázam alebo ATM.

Dôkaz, že rad mutant rad.D2249E /vičf príklady / môže pôsobiť ako dominantný negatívny mutant naviac naznačuje účasť v jednom alebo viacerých proteínových komplexoch a takéto komplexy samotné môžu byt cieľom pre terapeutické pôsobenie. Ukázali sme, že napr. Rad3 sa môže jednak spojiť sám so sebou alebo spojiť s ATR. Teda je pravdepodobné, že Rad/ATR pôsobia ako multimerné /multimeric/ molekuly. Mutantný kvasinkový rad alebo ľudské ATR gény alebo ich odvodeniny /ktoré tiež nemajú rad/ATR aktivitu/ môžu byt včlenené do bunky, aby pôsobili ako dominantné negatívne mutanty. Teda ak napríklad expresia dominantného negatívneho mutantu /napr. ATR D2475A, N2480K alebo D2494E/ v tumorových bunkách vedie k zvýšenej citlivosti k ožiareniu,ukazuje to,že prírodný ATR je stále aktívny a teda cieľom pre terapeutické látky.

Navzájom sa ovplyvňujúce proteíny včítane komponentov multimerných proteínových komplexov obsahujúcich Rad3 alebo ATR môžu byt identifikované v nasledujúcich experimentoch.

Prvý rozbor uvažovaný vo vynáleze je dvojhybridný test. Dvojhybridný systém bol vyvinutý pre kvasinky /Chien et al., 1991 / a je založený na funkčnej in vivo rekonštitúcii transkripčného faktora, ktorý aktivuje reportérový gén.Konkrétne polynukleotid kódujúci proteín, ktorý vzájomne reaguje s Rad3/ATR je izolovaný:

- transformáciou alebo transfekciou vhodnej hostiteľskej bunky konštruktom DNA, ktorý obsahuje reportérový gén riadený promotorom regulovaným transkripčným faktorom s DNA väzobnou doménou a aktivujúcou doménou

- expresiou prvej hybridnej DNA sekvencie v hostiteľskej bunke kódujúcej prvú syntézu /fusion/ časti alebo celého Rad3/ATR a buď DNA väzobnej oblasti alebo aktivujúcej oblasti transkripčného faktora

- expresiou knihovne /v hostiteľskej bunke/ druhej hybridnej DNA sekvencie kódujúcej druhú syntézu časti alebo celého zamýšľaného Rad3/ATR väzobného proteínu a DNA väzobnou doménou alebo aktivačnú doménu transkripčného faktora, ktorý nie je inkorporovaný v prvej syntéze

- detekciou väzby proteínu reagujúceho s Rad3/ATR k Rad3/ATR v danej hostiteľskej bunke detekciou produktu reportérového génu v hostiteľskej bunke izoláciou druhej hybridnej DNA sekvencie kódujúcej interagujúci proteín z danej hostiteľskej bunky.

V súčasnej dobe sú pri tomto postupe preferované: lexA promotor na riadenie expresie reporterového génu, lacZ reportérový gén, transkripčný faktor obahujúci lexA DNA väzobnú oblasť a GAL4 transaktivačnú doménu a kvasinkové hostiteľské bunky.

Ďalšie testy na identifikáciu proteínov, ktoré reagujú s Rad3 alebo ATR, môžu zahŕňať imoblizáciu Rad3/ATR alebo testovaného proteínu, detekčné značenie neprichyteného väzobného partnera, spoločnú inkubáciu väzobných partnerov a určenie množstva naviazanej značky. Naviazaná značka naznačuje, že testovaný proteín reaguje s Rad3/ATR.

Iný typ testu na identifikáciu proteínov reagujúcich s Rad3 alebo ATR môže zahŕňať imobilizáciu Rad3/ATR alebo ich fragmentu na pevný povrch potiahnutý /alebo nasýtený/ fluorecsenčnou látkou, označenie testovaného proteínu zlúčeninou, schopnou exicitácie fluorescenčnej látky, aplikáciou označeného testovacieho proteínu na imobilizovaný Rad3/ATR, detekciu svetelnej emisie produkovanej fluorescenčnou látkou a identifikáciu vzájomne reagujúcich protexnov ako testovaných proteínov, ktoré vyvolali emisiu svetla fluorescenčnou látkou. Prípadne môže byt testovaný proteín imobilizovaný a v teste môže byt značený Rad3/ATR.

Zlúčeniny, ktoré menia svoje pôsobenie medzi Rad3/ATR a ostatnými bunečnými komponentami, môžu byt použité pri rôznych metódach liečenia rakoviny. Ak napríklad špecifická forma rakoviny je výsledkom mutácie iného génu ako génu ATR /nap. p53 génu/, látka, ktorá inhibuje transkripciu alebo enzymatickú aktivitu ATR a teda kontrolné miesto G₂ fázy bunečného cyklu, môže sa použit na zvýšenie citlivosti rakovinových buniek na chemoterapiu alebo ožarovanie. Terapeutická hodnota takejto látky spočíva vo fakte, že súčasná rádioterapia alebo chemoterapia nerobí vo väčšine prípadov nič na prekonanie schopnosti p53 mutovaných rakovinových buniek opraviť poškodenie DNA vyvolané ako výsledok liečby. Výsledkom je, že rakovinová bunka môže jednoducho opraviť poškodenie DNA. Modulujúce látky vynálezu môžu byt teda použité na zosilnenie účinnosti chemoterapie alebo rádioterapie, alebo sa môžu použit priamo ako chemoterapeutiká.

Testy na idetifikáciu zlúčenín, ktoré ovplyvňujú interakciu Rad3/ATR s inými proteínmi môžu zahŕňať:

- transformáciu alebo transfekciu vhodných hostitelských buniek konštruktom DNA, ktorý obashuje reportérový gén riadený promotorom regulovaným transkripčným faktorom s DNA väzbovou doménou a aktivujúcou doménou

- expresiu prvej hybridnej DNA sekvencie v hostitelských bunkách kódujúcich prvú syntézu /fusion/ časti alebo celého Rad3/ATR a buď DNA väzobnej oblasti alebo aktivujúcej oblasti transkripčného faktora

- expresiu druhej hybridnej DNA sekvencie v hostiteľských bunkách kódujúcej časť alebo celý proteín, ktorý intereaguje s Rad3/ATR a buď DNA väzobnú oblasť alebo aktivujúcu oblasť transkripčného faktora, ktorý nie je inkorporovaný v prvej syntéze

- vyhodnotenie vplyvu testovanej látky na interakciu medzi Rad3/ATR a interagujúcim proteínom detekciou väzby ineteragujúceho proteínu k Rad3/ATR v danej hostiteľskej bunke meraním tvorby produktu reportérového génu v hostiteľskej bunke za prítomnosti alebo neprítomnosti testovanej látky a identifikáciu modulujúcich zlúčenín ako tých testovaných zlúčenín, ktoré ovplyvňujú tvorbu produktu reportérového génu v porovnaní s tvorbou produktu reportérového génu za neprítomnosti modulujúcej látky.

V súčasnej dobe sú pri tomto postupe preferované: lexA promotor na riadenie expresie reportérpvého génu, lacZ reportérový gén, transkripčný faktor obsahujúci lexA DNA väzobnú oblasť a GAL4 transaktivačnú doménu kvasinkovej hostiteľskej bunky.

Ďalšie typy testov na identifikáciu zlúčenín, ktoré menia interakciu medzi Rad3/ATR a ovplyvňujúcim proteínom obsahuje imobilizáciu Rad3/ATR alebo prirodzeného proteínu reagujúceho s Rad3/ATR, detekčné značenie neimobilizovaného väzobného partnera, spoločnú inkubáciu väzobných partnerov a určenie vplyvu testovanej látky na množstvo naviazanej značky. Zníženie množstva značky naviazanej za prítomnosti testovanej látky v porovnaní s množstvom naviazanej značky za neprítomnosti testovanej látky ukazuje, že testovaná látka je inhibítorom interakcie medzi Rad3/ATR a proteínom. Opačne, zvýšené množstvo naviazanej značky za prítomnosti testovanej látky v porovnaní s množstvom značky naviazanej za neprítomnosti testovanej látky ukazuje, že testovaná látka je aktivátorom interakcie medzi Rad3/ATR a proteínom.

Ďalšia metóda používaná vynálezom na idetifikáciu zlúčenín, ktoré ovplyvňujú väzbu medzi Rad3/ATR a interagujúcim proteínom zahŕňa imobilizáciu Rad3/ATR alebo ich fragmentu na pevný povrch potiahnutý /alebo nasýtený/ fluorescenčnou látkou, označenie interagujúceho proteínu zlúčeninou schopnou excitácie fluorescenčnej látky, inkubáciu imobilizovaného Rad3/ATR so značeným interagujúcim proteínom za prítomnosti alebo neprítomnosti testovanej látky, detekciu svetelnej emisie produkovanej fluorescenčnou látkou a identfikáciu modulujúcej zlúčeniny ako tej testovanej látky, ktorá ovplyvní emisiu svetla fluorescenčnou látkou v porovnaní s emisiou svetla fluorescenčnou látkou za neprítomnosti testovanej látky. Prípadne môže byt s Rad3/ATR interagujúcou proteín imobilizovaný a v teste môže byt značený Rad3/ATR.

Ukázali sme,že Rad3 vzájomne reaguje s ATR. Preto vyššie uvedené metódy môžu byt tiež použité na identifikáciu látok, ktoré ovplyvňujú interakciu medzi Rad3 a ATR, kde interagujúci proteín opísaný v testovacích metódach je buď Rad3 alebo ATR.

Ďalej sme ukázali, že Rad3 sa môže viazať medzi sebou, čo by veľmi pravdepodobne naznačovalo, že tiež ATR sa medzi sebou môže viazať. Preto vyššie uvedené metódy sa môžu tiež použiť na idetifikáciu látok, ktoré ovplyvňujú interakciu medzi Rad3-Rad3 a tiež interakciu ATR-ATR.

Takéto látky môžu byt použité terapeuticky na rozrušenie ATR-ATR interakciií a zvýšenie citlivosti tumorových buniek na chemoterapiu alebo rádioterapiu. Vynález teda poskytuje tiež metódu na vyhladávanie vhodných substancií na protirakovinovú terapiu, ktorá obsahuje:

a/ /i/ inkubáciu polypeptidu vynálezu s iným polypeptidom vynálezu /ktorý môže byt ten istý alebo iný / za podmienok, ktoré umožňujú naviazanie prvého polypeptidu na druhý a tvorbu komplexu /ii/ inkubáciu tohto komplexu a testovanej látky alebo a/ inkubáciu polypeptidu vynálezu s iným polypeptidom vynálezu /ktorý môže byt ten istý alebo iný/ za podmienok, ktoré umožnia naviazanie prvého polypeptidu na druhý a tvorbu komplexu za prítomnosti testovanej látky a

b/ určenie, či testovaná látka inhibuje polypeptidu na druhý polypeptid a c/ výber vhodnej substancie, ktorá inhibuje polypeptidu na druhý polypeptid.

väzbu prvého väzbu prvého

Ak je možné, prvý a druhý polypeptid by mali byt navzájom rozlíšené. Napríklad prvý polypeptid a druhý polypeptid môžu byt oba ATR alebo oba Rad3, alebo jeden môže byt ATR a jeden Rad3, alebo odvodeniny buď ATR alebo Rad3, ktoré si uchovali väzobnú aktivitu. Keď sú oba polypeptidy ATR alebo Rad3, mali by byt v týchto testoch použité pokial možno odlišujúce formy ATR/Rad3. Odlíšené môžu byt napríklad značením jedného z polypeptidov. Ako značka sa môže použit rádioaktívna značka, epitopové alebo iné polypeptidové značky /tags/, ako napríklad glutation-S-transferáza /glutation-S-transferase/. Napríklad jedna forma Rad3 môže mat jeden typ epitopovej značky a druhá forma by potom mala iný typ, čo by umožňovalo ich imunologické rozlíšenie, takže naviazanie jedného z nich k druhému môže byt zistené kvantitatívne alebo kvalitatívne.Preferovaná metóda zahrňuje imobilizáciu prvého polypeptidu napríklad na agarosový nosič /agarose beats/ alebo na pevný povrch a druhý polypeptid môže byt volne v roztoku. Väzba je potom určená metódami opísanými vyššie, ktoré sú odborníkom známe.

Vynález sa taktiež týka protilátok /napr. monoklonálnych a polyklonálnych protilátok, jednoretazcových protilátok, chimerické protilátky, CDR-štepové protilátky /CDR-grafted antibodies/ a podobne a iných väzobných proteínov /ako sú napríklad tie identifikované pomocou testov opísaných vyššie/, ktoré sú špecifické pre Rad3 proteín kinázovú doménu alebo Rad3/ATR lipid kinázovú doménu. Väzobné proteíny sú užitočné zas na purifikáciu rekombinantných alebo prirodzene sa vyskytujúcich enzýmov a identifikáciu buniek produkujúcich takéto enzýmy. Testy na detekciu a kvantifikáciu proteínov v bunkách a v tekutinách môžu obsahovát systémy s jednou protilátkou alebo viacerými protilátkami v sendvičovom formáte. Väzobné proteíny sú tiež zrejme účinné v ovplyvňovaní /napr. blokovaní, inhibície alebo stimulácie/ interakcií enzým/substrát alebo enzým/regulátor.

Modulátory Rad3/ATR môžu mat vplyv na kinázovú aktivitu, jej lokalizáciu v bunkách alebo ich interakciu s členmi kontrolných miest bunečného cyklu. Medzi selektívne modulátory môžu patrit napríklad polypeptidy alebo peptidy, ktoré sa špecificky viažu k Rad3/ATR alebo k nukleovej kyseline Rad3/ATR alebo inej nepeptidovej zlúčenine /napr. izolované alebo syntetické molekuly/, ktoré špecificky reagujú s Rad3/ATR alebo s nukleovou kyselinou Rad3/ATR.

Mutantné formy Rad3/ATR, ktoré ovplyvňujú enzymatickú aktivitu alebo bunečnú lokalizáciu nemutovaného Rad3/ATR, sú tiež uvažované v tomto vynáleze.

Okrem toho ako modulátory Rad3/ATR kinázovej aktivity a Rad3/ATR interakcie môžu byť testované kombinačné knihovne /combinatorial libraries/, peptidy a kópie peptidov, definované chemické entity, oligonukleotidy, knihovne prírodných produktov /natural product libraries/ pomocou vyššie opísaných testov.

F. Terapeutické použitie

Modulátory aktivity Rad3/ATR, včítane inhibítorov ich lipid kinázovej a proteín kinázovej aktivity, môžu byť použité pri protinádorovej terapii. Zvlášť sa môžu tieto látky použiť na zvýšenie citlivosti rakovinových buniek na chemoterapiu alebo rádioterapiu na základe ich schopnosti narušiť regulačné funkcie Rad3/ATR v bunečnom cykle.

Vynález teda aktivitu Rad3/ATR zaisťuje použitie zlúčenín, ktoré menia a ktoré sú identifikované na základe vyhladávacích pokusov opísaných vyššie, v metódach liečby rakoviny. V jednom prípade sú uvedené látky schopné inhibície Rad3/ATR lipid kinázovej aktivity alebo Rad3 proteín kinázovej aktivity. V inom prípade sú uvedené látky schopné inhibovať interakciu medzi samotným ATR alebo medzi ATR a iným interagujúcim proteínom, ktorý môže napríklad tvoriť časť multimerného proteínového komplexu.

Je potrebné uvedomiť si, že termínom zlúčenina sú v tomto kontexte myslené tiež látky, ktoré boli vybraté vyššie opísanými testami.

V typickom prípade sú zlúčeniny upravené na klinickú aplikáciu ich zmiešaním s farmaceutický prijateľným nosičom alebo rozpúšťadlom. Vyvinuté môžu byť napríklad na miestnu, mimočrevnú /parenteral/, inravenóznu, vnútrosvalovú, podkožnú, intraokulárnu alebo transdermálnu aplikáciu. Prednostne je zlúčenina používaná vo forme vhodnej na injekčnú aplikáciu. Je vhodná priama injekcia do tumoru pacienta, pretože tak je možno koncentrovať terapeutický efekt na úrovni postihnutého tkaniva.Zlúčeniny preto môžu byt kombinované s akýmkolvek nosičom, ktorý je farmakologicky akceptovateľný pre injektovatelnú formu, hlavne na priamu injekciu na miesto ošetrenia. Farmaceutickým nosičom alebo riediacou látkou môžu byt napríklad sterilné alebo izotonické roztoky.

Výška dávky zlúčeniny môže byt upravená podlá rôznych parametrov, zvlášť podlá použitej zlúčeniny, podlá veku, váhy a stavu ošetrovaného pacienta, podlá použitého spôsobu aplikácie, patologičnosti tumoru a požadovaného klinického režimu. Ako vodítko možno povedať, že množstvo zlúčeniny, použitej na aplikáciu injekčné, je primerané v dávke od 0,01 mg/kg do 30 mg/kg, prednostne ale od 0,1 mg/kg do 10 mg/kg.

Opísané určenie spôsobu aplikácie a velkosti dávky je uvádzané len ako vodítko, pretože zručný praktik bude schopný stanoviť lahko optimálny spôsob aplikácie a dávku pre akéhokoľvek jednotlivého pacienta a jeho stav.

Aplikované zlúčeniny môžu zahŕňať polypeptidy alebo nukleové kyseliny. Nukleové kyseliny môžu kódovať polpeptidy alebo môžu kódovať antisenze konštrukty, ktoré inhibujú expresiu bunečných génov. Nukleové kyseliny môžu byt napríklad aplikované lipofekciou /lipofection/ alebo pomocou vírových vektorov. Nukleová kyselina môže tvoriť napríklad časť vírového vektora, ako je adenovírus. Ak sú použité vírové vektory, je aplikovaná veľkosť dávky v zásade medzi 10⁴a 10¹⁴pfu/ml, výhodne 10⁶ až 10¹⁰pfu/ml. Termín pfu / z anglického plaque forming unit/ zodpovená infekčnosti roztoku víru a je stanovený infekciou vhodnej bunečnej kultúry a meraním / všeobecne po 48 hodinách / počtu škvŕn infekčných buniek. Postupy na stanovenie titru pfu vírového roztoku sú dobre opísané v literatúre.

Týmito metódami môže byt ošetrený akýkoľvek typ rakoviny, napríklad leukémia alebo pevné nádory ako sú nádory prsníka, vaječníkov, pľúc, tračníka, pankreasu, semenníkov, pečene, mozgu, svalov a kostí. Prednostne ale nádorov, ktoré majú normálnu funkciu ATR.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1: vzťah medzi ATR, rad3, mei-41, MEČI, TELÍ a ATM Celkové štruktúry ATR, Rad3, Mei-41, Meclp, Tellp a ATM. Legenda: otvorený štvorček- doména Rad3, šrafované políčkakinázová doména

Dendogram založený na porovnaní sekvencií /sequence alignments/ vytvorený metódou Clustal /PAM250/ s použitím softwaru DNAstar. Rad3/ESRl/mei-41/ATR sú si vzájomne bližšie ako voči ATM a TELÍ. Sekvencie rad3 a ATM sú dostupné v databáze EMBL.

Príklady realizácie vynálezu

Príklad 1

Gén rad3 S. pombe je jeden zo šiestich génov absolútne nevyhnutných pre štruktúru kontrolných bodov /for the DNA structure checkpoints/ u S. pombe /Al-Khodairy and Carr, 1992, Al-Khodairy et al., 1994/. Sekvensia reprezentujúca časť génu rad3 bola opísaná Seatonom et al. /1992/. Pri pokusoch objasniť štruktúru tohto génu z hľadiska intrónov a exónov sme zistili sekvenčné anomálie na oboch /5 a 3 / koncoch. Sekvenovali sme celý gén /viď experimentálne postupy/ a zistili, že rad3 je schopný kódovať produkt dlhý 2386 aminokyselín. C-koncová oblasť obsahuje zhodné sekvencie /consensus sequences/, tuypické pre podtriedu kináz známych ako lipidové kinázy,skupiny , ktorých zakladajúci člen /founder member/ je pllO katalytická podjednotka PI3 kinázy /Heiles et al., 1992/.

Bolo opísané, že skrátený kloň rad3, postrádajúci amíno-koniec a kinázovú oblasť, dopĺňa /complement/ génovo :pR3H1.0 /Jimenez et al., neodstraňuje potenciálnu úlohy tejto domény sme narušený mutant rad3- mutant rad3:

1992/. Takýto poškodený mutant kinázovú doménu. Na objasnenie vytvorili neúčinného mutanta metódou zámeny génu.Tento mutant má aminokyseliny 1477-2271 rad3 včítane zhodnej kinázovej domény nahradený ura4⁺. Tento kmeň rad3.d má identické defekty kontrolného miesta a citlivosť na ožiarenie a hydroxymočovine ako mutant rad3.136 /Našim and Smmith,1992/ a tiež ako pôvodný mutant rad3: : pR3H1.0 /Jimenez at el., 1992, Seaton et al., 1992/ / dáta nie sú uvedené/. Vytvorili sme tri samostatné bodové mutanty s mutáciami v predpokladanej kinázovej doméne rad3 a tieto mutanty sme použili pri experimentoch so zámenou génov na konštrukciu kmeňov s definovanými kinázovými neúčinnými /null/ mutáciami. Všetky tri kmene rad3.D2230A, rad3.N2235K a rad3.D2249E majú identické fenotypy ako neúčinný mutant rad3d /dáta nie sú uvedené/, čo naznačuje, že je kinázová aktivita potrebná na funkciu Rad3. Pri našich zisteniach sa ponúka jedno z vysvetlení výsledkov Seatona et al. /1992/ a Jimenza et al. /1992/ a to, že čiastočný kloň môže vykazovať intragénne komplemenťácie medzi skráteným génom vytvoreným v plazmidu a čiastočnou genomickou deléciou, ktorá zachováva kinázovú funkciu. Takáto interpretácia by bola v súlade s tým, že Rad3 pôsobí ako dímer alebo multimer.

Ak bola neúčinná kinázová alela rad3.D2249E lahko preexprimovaná v divokých typoch buniek pod riadením modifikovaného promotoru nmtl /Maundrell, 1990/, spôsobilo to extrémnu citlivosť na ožiarenie, čo bolo preukázané prúžkovým UV testom a pôsobila ako dominantne negatívny mutant /dáta nie sú uvedené/. Ak bol rovnaký kinázový neúčinný konštrukt exprimovaný vo vyšších hladinách, inhiboval rast /dáta nie sú uvedené/. Prehliadka buniek naznačila, že delenie prebiehalo velmi pomaly a u menších buniek.Divoký typ buniek a bunky obsahujúce prázdny vektor sa delí pri velkosti približne 15 mikrónov, no bunky s vyššou expresiou rad3 a rad3.D2249E sa delia pri velkosti približne 11,2 mikrónov /dáta nie sú uvedené/. U.S. pombe znamená toto väčšinou zrýchlenie mitózy.

Ľudský homológ rad3- ATR

Na identifikáciu ludskej formy rad3 bola použitá kombinácia metód. Týmito metódami sme naklonovali celú kódujúcu oblasť ludského génu /viď materiál a metódy/, ktorý sme nazvali ATR / z anglického ataxia and rad related/. ATR kóduje proteín skladajúci sa z 2644 aminokyselín, ktorý je omnoho bližší produktu rad3 S.pombe, ESR1 S.cerevisiae /Kato and Ogawa, 1994 / a génom mei-41 D.melanogaster /Hari et al., 1995/ ako ľudskému proteínu ADM alebo proteínu TE11 S. cerevisiae /Savitsky et al., 1995, Greenwell et al., 1995 /a je pravdepodobné, že je to skutočný homológ rad3. ESR1 je alelický k mecl/sad3 mutantom kontrolných bodov /Alien et al., 1994, Weinert et al., 1994/, ktoré majú ekvivalentný fenotyp ako rad3. ATR je menej príbuzný ľudskému génu kontrolného bodu ATM, obsahujúcemu na C konci pravdepodobne lipid kinázovú doménu a majúcu podobnú celkovú štruktúru. Sekvenčné porovnania jasne ukázali, že gény rad3/ESRl/MECl/SAD3/mei-41/ATR sú si vzájomne viac príbuzné ako akýkoľvek z nich s génami ATM alebo TELÍ, a že ATM je viac homologná s TELÍ /Obr. 1./

Gén ATM je exprimovaný v širokej škále tkanív /Savitsky et al., 1995/. U.S. cerevisiae vykazuje ESR1 v mitotických bunkách nízku hladinu expresie, gén je však rýchlo indukovaný počas meiózy I /Kato a Ogawa, 1994/. S použitím Nothern blot analýz sme ukázali, že ATR je tiež slabo exprimovaný v mnohých tkanivách, ale že omnoho viac je exprimovaný v semenníkoch /dáta nie sú uvedené/. Ak platí že proteíny ATR , Rad3 a Esrlp sú si vzájomne viac príbuzné ako s proteínom ATM, potom vyššia expresia ATR v semenníkoch je v zhode s pozorovaním, že Esrlp hrá úlohu pri meiotickej rekombinácii /Kato a Ogawa, 1994/. S použitím FISCH a PCR analýzy sme lokalizovali ATR na chromozóme 3q22-3q25 /dáta nie sú uvedené/. Tento región nie je asociovaný so známymi syndrómami so sklonmi k rakovine.

Na ďalší výskum možnosti, že Rad3 pôsobí ako multimér,sme vytvorili dva odlišné konštrukty so značkou /tag/ plné dĺžky rad3 v inducibilnom vektore založenom na pREP. V prvom z nich prebieha translácia Rad3 s dvoma myc epitopovými značkami na N konci, no v druhom prípade sú tieto nahradené trojnásobnou HA epitopovou značkou. Ak sú oba konštrukty exprimované naraz v divokom type buniek, je možné spoločne vyzrážať Rad3 s HA značkami protilátkami špecifickými proti myc a Rad3 s myc značkami protilátkami špecifickými proti HA /dáta nie sú uvedené/. To dokazuje, že proteín rad3 je schopný in vivo asociácie so samým sebou. Tieto výsledky sú úplne v zhode s komplementačnými dátami Jimenéza et al. /1992/.

Hoci gén ATR nemohol doplniť fenotyp mutantov rad3, skúmali sme schopnosť ATR vytvárať proteínový komplex s Rad3 S.pombe, pri expresii ATR a Rad3 S.pombe s myc značkou v rovnakej kvasinkovej bunke. S použitím protilátok proti ATR /ktoré nezrážajú Rad3 S.pombe, vid materiál a metódy / sme boli schopní súčasne vyzrážať kvasinkový proteín. Pomocou špecifických protilátok proti myc, ktoré rozoznávajú Rad3 S.pombe, sme boli tiež schopní vyzrážať ľudský proteín ATR /dáta nie sú uvedené/. Tieto dáta naznačujú, že ľudský a kvasinkový proteín môžu tvoriť heteromerné komplexy, čo podporuje tvrdenia založené na sekvenčnej podobnosti o blízkom funkčnom vzťahu medzi týmito homológami.

Rad3 proteíny vykazujú tiež kinázovú aktivitu.

Zdá sa, že kinázová aktivita proteínov Rad3 in vivo je nepostrádateľná pre ich funkciu, čo naznačovali mutačné experimenty. Túto aktivitu sme študovali detailnejšie. S použitím buniek S.pombe rad3: :ura4 exprimujúci S.pombe Rad3 s HA značkou sme boli schopní detekovať významnú proteín kinázovú aktivitu, ktorá precipituje s HA špecifickými protilátkami len v prípade, že je Rad3 indukovaný a ktorá nie je zmenená následným ožiarením /dáta nie sú uvedené/. Táto aktivita, ktorá je špecifická pre Rad3 alebo kinázy precipitujúce spoločne s Rad3, zrejme odráža fosforyláciu samotného Rad3, lebo významný prúžok o molekulovej hmotnosti okolo 200kD, ktorý je fosforylovaný, môže byť detekovaný pomocou HA protilátok technikou Western blotu /dáta nie sú uvedené/. Pokusy identifikovať vhodné in vitro substráty, ako napr. základnú proteín myelinu /myelin basic proteín/, RP-A či niekoľko purifikovaných proteínov kontrolných miest S.pombe, boli doposiaľ neúspešné. Ak je IP test na detekciu kinázy in vitro robený s bunkami zvýšene exprimujúcimi kinázovo neúčinnou /kinase-null/ D2249E verziou Rad3, je spojená kinázová aktivita, ktorá precipituje s HA špecifickými protilátkami, veľmi znížená /dáta nie sú uvedené/. Tento jav možno vysvetliť niekoľkými možnými spôsobmi. Meraná kinázová aktivita môže odrážať priamo aktivitu Rad3. V tomto prípade môže zvyšková aktivita pozorovaná aj v prípade nefunkčného Rad3 odrážať fakt, že nie sú neznáme prípady, kedy ekvivalenty mutácií D až E u iných proteínových kináz produkovali biologicky inertné proteíny so zvyškovou in vitro biochemickou aktivitou. Alebo môže byt kinázová aktivita, ktorá fosforyluje Rad3 spôsobená asociovanými proteínmi a tieto proteíny môžu interagovať s D2249E mutantným proteínom s menšou účinnosťou.

Diskusia

Kontrolné miesta dráh kontrolujúcich postup bunečným cyklom, ktorý nasleduje po poškodení DNA alebo po zásahu v jednotlivých prípadoch z ktorých sa skladá bunečný cyklus, sú značne dôležité na udržanie genetickej stability a môžu sa považovať za cesty, ktoré potláčajú vznik tumorov. Niekoľko génov potláčajúcich vznik nádorov je tesne spojené s častou kontrolných ciest /viď prehľadná práca Hartwell a Kastan, 1994/. Sú to zvlášť tie, ktoré ovplyvňujú prechod z fázy G1 do fázy S a sú teda úplne zodpovedné za bunečný cyklus. Zbližovanie dvoch kvasinkových modelových systémov v otázke kontrolných miest jasne naznačuje, že gény podieľajúce sa na týchto cestách sú konzervované. Naša práca rozšírila túto konzerváciu na metazoické bunky a vysvetľuje vzťah medzi Rad3. ESR1 /MEC1/SAD3/, mei-41 a ATM génom.

V tejto práci sme ukázali, že bezchybná sekvencia génu rad3 radí jeho produkt do rodiny proteín/lipid kináz vzťahujúcich sa k ATM. Zvýšená expresia u mutanta rad3 /kinázovo defektného / v S.pombe spôsobí dominantne negatívny fenotyp, čo naznačuje, že Rad3 pôsobí ako člen proteínového komplexu, ktorého celistvosť je nevyhnutná na kontrolnú funkciu. To je v súlade so zistením, že všetky delečné mutanty radi, rad9, radl7, rad26 a husi majú fenotypy nerozoznateľné od rad3.d /Sheldrick a Carr, 1993/. Neočakávaný je fakt, že na rozdiel od zvyšných kontrolných radov génov, vysoká úroveň zvýšenej expresie divokých alebo mutantných rad3 alel inhibuje rast a spôsobuje, že dochádza k mitóze buniek menšej veľkosti, čo naznačuje predčasný vstup do mitózy. Tento drobný /semi wee/ fenotyp nie je pozorovaný U neúčinných mutantov a môže naznačovať interferenciu s druhou cestou, ktorej funkcie sa prekrývajú s cestou Rad3 a pôsobia inhibične na mitózu. Kandidátom takej cesty je ATM/TEL1 cesta, pri ktorej boli ukázané niektoré prekrývajúce sa funkcie s ESRl /MEC1/SAD1/ cestou /Morrow et al., 1995/.

Štruktúra ATM je najviac príbuzná štruktúre proteínu Tellp , ktorý sa podieľa na údržbe dĺžky telomery /Greenwell et al., 1995/, hoci sa tiež zdá, že sa funkcia ATM vzťahuje k produktom Rad3/Esrlp/mei-41. Po prvom objave génu ATM a zistení jeho sekvenčnej príbuznosti k rad3/ESRl génom a k TELÍ, nebolo jasné, či sa /ako je to pri mnohých prípadoch pri kvasinkách / gén duplikoval a oddelil v kvasinkách alebo či tieto dva kvasinkové proteíny opisujú konzervované podrodiny tesne príbuzných génov. Dôležitým objavom tejto práce je identifikácia ludského génu ATR, ktorý je úzko príbuzný génom rad3/ESRl/mei-41. To ohraničuje dve štruktúrne odlišné podrodiny proteín/lipid kináz, vzťahujúcich sa ku kontrolným cestám, ktoré sú konzervované v celej eukaryotickej evolúcii. Hoci proteíny týchto dvoch pordodín môžu mať niektoré vzájomne sa prekrývajúce funkcie, kontrolujú asi rozdielne procesy. Tak napríklad podrodina rad3 kontroluje v kvasinkách všetky poškodenia DNA v kontrolných bodoch G1 a G2, a to ako odpoveď na UV a radiačné žiarenie a ďalej tiež kontrolný bod S fázy, ktorý zabraňuje mitóze nasledujúcej po inhibícii replikácie /Al-Khodairy a Carr, 1992, Alien et al., 1994, Weinert et al., 1994/. Oproti tomu A-T bunky vykazujú nenormálne reakcie na úzko špecifickú skupinu látok poškodzujúcich DNA včítane ionizujúcej radiácie, bleomycínu a neocarzinostatínu. Tieto látky vyvolávajú zlomy prameňa DNA ako následok radikálneho napadnutia. Reakcia na UV a väčšinu chemických karcinogénov je normálna, rovnako ako reakcia na inhibíciu syntézy DNA. Je možné, že niektoré alebo všetky zostávajúce kontrolné body poškodenia DNA a kontrolné body S fázy sú kontrolované ATR.

Experimentálne postupy

Kmene, plazmidy a médiá

V príci Gutz et al. /1994/ sú opísané štandardné genetické techniky, rastové podmienky a médiá pre S.pombe. Kmene spOll S.pombe /ura4.D18, leul.32, ade6.704 h/ sú opísané v práci Murray et al., 1992. Plazmid pSUB41 bol dar S.Subramani /Seaton et al., 1992/.

Klonovanie rad3 S.pombe fragment Kpnl dlhý 4.0 kb bol oddelený od pSUB41 a sekvenovaný v oboch smeroch tak, aby sa získala 5’sekvencia rad3. Kloň 3 bol identifikovaný v genómovej knihovni hybridizáciou kolón /Babet et al., 1992/ s použitím 3 sondy dlhej 1 kb odvodenej od publikovanej sekvencie rad3. Potom bol tento kloň sekvenovaný v oboch smeroch. Týmto spôsobom * bola určená úplná sekvencia génu rad3.

t

Null /nuloví/ a kinase dead /kinázovo mŕtvi/ mutanti rad3

Použitím metodík opísaných v práci Barbet et al. , /1992/ bol vytvorený konštrukt rad3, v ktorom bolo 794 aminokyselín medzi aminokyselinami 1477 a 2271 /obsahujúce kinázovú doménu/ nahradené génom ura4+. Lineárny fragment tohto konštruktu bol použitý na transformáciu spOll na uracil prototropu /to uracil prototropy/. Integrácia jedinej kopi na lokuse rad3 bola v takto vytvorenom kontrolovaná Southernovým prenosom. Na vytvorenie miestne /site/ špecifických kinázových null mutácií bol BamHI-SalI fragment rad3 dlhý 3,01 kb na C konci mutovaný: A:

GTTTTCGCCATGGCGCGCTCCCAAACCCAA

B:TTCATCAAACAATATCTTTTCGCCATGGCG

C:CAÄAAAGACAGTTGAATTCGACATGGATAG r s cieľom vložiť do kinázovej domény mutácie D2230A, N2235K , alebo D2249E. Analogické zmeny boli už použité skôr pri analýze PI3 kinázy VPS34 S.cerevisiae /Schu et al., 1993/.

Tieto fragmenty boli potom použité na transformáciu radf3.d null mutanta a nahradenie génu selektované ich schopnosťou rásť na médiách obsahujúcich FOA /Grimm at al., 1988/. Všetky línie boli kontrolované Southernovým prenosom. Expresné konštrukty plné dĺžky rad3.D2230A boli vytvorené v pREPl a pREP41 /Maundrell, 1990/ štandardným subklonovaním nasledujúcim po vnesení Ndel miesta na ATG a vybratí troch interných miest Ndel.

Prúžkový test citlivosti na UV žiarenie

Expresia z REP1 /vysoká / a REP41 /stredná / bola indukovaná nedostatkom tiamínu počas 18 hodín pred nanesením na misky. Misky boli ožiarené znižujúcimi sa dávkami UV žiarenia od 0 do 300Jm”² podľa nastavenia na Stratagene Stratalinker.

Klonovanie a expresia ATR

Na izoláciu vhodnej sondy na identifikáciu cDNA korešpondujúcej s ľudským homológom rad3 boli navrhnuté degenerované oligonukleotidy proti aminokyselinám LGLGDRH /5*oligo, 0DHI8/ a HVDF fD/Nj C /3’ oligo, 0DH-I6/ Rad3/Esrlp. Inozín bol inkorporovaný na pozície štvornásobnej degenerácie a priméry boli zakončené BamHI /0DHI8/ a EcoRI /0DHI6/ na uľahčenie klonovania. Sekvenčná analýza DNA produktu PCR dlhého približne 100 bp, získaného amplifikáciou cDNA z periférnych krvných leukocytov ukázala významné zhody s NEC/rad3. Táto sekvencia bola použitá na syntézu nedegenerovaného priméru /oDH-23 ,GACGCAGAATTCACCAGTCAAAGAATCAAAGAG/ pre PCR S ďalším degenerovaným primerom /oDH17/ navrhnutým proti amínokyselinovej sekvencii KFPP£l/vJ £b/Fj Y /Q/Ej WF

Rad3/Esrlp. 174 párov bází dlhý produkt tejto reakcie bol použitý priamo na preskúmanie cDNA knihovne markofága. Boli izolované štyri pozitívne klony /najväčší z nich bol cca 3 kb veľký.

Zároveň boli prehľadávané databázy pomocou génu rad3

S.pombe plnej dĺžky. Toto prehľadávanie získalo z databázy

EMBL kloň ľudskej cDNA-HSAAADPDG-potenciáIného homológu rad3 /ak bol povolený jeden posun čítacieho rámca pre 233 bp sekvenciu/. Táto sekvencia velká 233 bp je obsiahnutá v kine o velkosti 1,6 kb získaním od Dr.N.Affara, Human Molecular Genetics Group, Cambridge University, UK. Celý kloň /1,6 kb/ bol sekvenovaný a leží vnútri cDNA klonov identifikovaných na základe degenerovanej PCR a skúmaní knihovní. Na identifikáciu celého génu bola urobená RAČE PCR s cDNA odvodenej z placentálnej a tymovej mRNA s použitím inštrukcií poskytovaných s Clontech Marathon Kit. Génové špecifické markery boli odvodené z cDNA klonov. Z týchto experimentov bola zostavená sekvencia cDNA o velkosti 8239 bp s internými ORF /2644 aminokyselín/, 79 bp 5’ nekódujúce oblasti, 194 bp 3 nekódujúcim regiónom a polyA koncom. Čast tejto sekvencie bola stanovená len pomocou PCR. Na vylúčenie chýb boli sekvenované klony minimálne z troch nezávislých PCR reakcií v oboch smeroch.

233 párov bázi dlhá sekvencia zodpovedá sekvencii nukleotidov 6809 až 7042 /celkom 234 nukleotidov/ Seq. ID No.l s výnimkou delécie jednej bázy na pozícii 6942. Táto sekvencia kóduje aminokyseliny 2244 až 2320 Seq.ID No.2.

Sekvencia 1,6 kb dlhého inzertu korešponduje í nukleotidmi 5725 až 7104 /celkom 1353 nukleotidov/ Seq ID No, 1 a kóduje aminokyseliny 1892 až 2340 Seq. ID No.2.

Notern blot hybridizácia: 1,3 kb amplifikovaný v prítomnosti ³²P-dCTP s 279-3 /TGGATGATGACAGCTGTGTC/a 279-6/TGTAGTCGCCTGCTCAATGTC/ Nylonová membrána obsahujúca 2 jug polyA⁺ RNA /frakcionované podlá velkosti/ z kolekcie zdrojov ludských tkanív /Clontech laboratoriesú bola hybridizovaná podlá doporučení výrobcu s výnimkou posledného premytia, ktoré bolo urobené pri 55 °C / a nie pri 50°C / na minimalizáciu možností krížovej hybridizácie s podobnou sekvenciou.

produkt PCR bol použitím primérov

Mapovanie ATR

Gén ATR sme lokalizovali na chromozóme 3 kombináciou metód založených na fluorescenčnej hybridizácii in situ a polymérovej reťazovej reakcii /PCR/. FISH analýza s použitím cDNA klonu identifikovala gén ATR na chromozóm 3, približne na púozícii q22-23. PCR analýza tiež identifikovala gén ATR na chromozóme 3. Dva priméry / OART23:

GACGCAGAATTCACCAGCTAAAGAATCAAAGAG a

OATR26:TGGTTTCTGAGAACATTCCCTGA, ktoré amplifikujú fragment /257 bp/ génu ATR, boli použité na DNA získané z hybridných somatických buniek /človek/hlodavec/ obsahujúcich rôzne skupiny ľudských chromozómov dostupných v NIGMS Human genetic Mutant Celí Repositiry /Drwinga et el.,1993/. K subloklizácii ATR na špecifickú oblasť chromozómu 3 bolo použité PCR s rovnakými primérmi. Templaty na tieto amplifikácie predstavovali vzorky DNA pacientov so skráteniami na chromózme 3 /Leách et al., 1994/.

Imunoprecipitácia /IP/a stanovenie kinázovej akivity s Rad3

Ku komplementačným štúdiám boli gény rad3 S.pombe a ľudského ATR klonované do expresného vektora pREP41. Na označenie proteínov boli použité verzie vektorov, obsahujúce vo vnútri rámca N-koncové tag sekvencie- dvojitý myc alebo trojitý HA tag /Griffiths et al., 1995/. Označené proteíny boli exprimované pestovaním v rastových médiách neobsahujúcich tiamín /Maundrell, 1990/. Bunky kvasiniek lyžovali v lyzovacom pufri /25 mM tris.Cl pH 7,5, 60 mM B-glycerofosfát, 0,1 rnM Na3VO4, 1% Tritón X-100, 50rnM NaCl, 2 mM EDTA, 50mM NaF, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid /PMSF/, 5 pg/ml leupeptín, 5 pg/ml aprotinín, 1 mM DTT/ po pridaní sklenených guličiek a nasledovne dvojminútovej demembrácii. Pri imunoprecipitácii bolo 300 pg celkového proteínového extraktu inkubované pri 4° C s vhodnou protilátkou počas 30 minút. Imunokomplexy sa zrážali po zmiešaní s guličkami s naviazaným proteínom G počas ďalších 30 minút pri 4°C. Pri stanovení kinázovej aktivity boli imunokomplexy premyté štyrikrát lyzovacím pufrom a raz kinázovým pufrom /25 mM Hepes pH 7,7 50 mM KC1, 10 mM MgC112, 0,1 % NP-40, 2%glycerol, 1 mM DTT/.

Potom boli inkubované v kinázovom pufri s 10 /UM ATP /50 Ci/mmol/ počas 15 minút pri teplote 30 θ C. Reakcia bola zastavená prídavkom 20 yul 2X SDS vzorkového pufru. Vzorky boli ďalej rozdelené na 6 % polyakrylamidovom géli. IP Rad3 obsahovali niekoľko fosforylovaných produktov, včítane jedného, ktorý postupoval spoločne so samotným proteínom Rad3 pri westernovej analýze.

Použitá literatúra

Al-Khodairy, and Carr, A.M. (1992). DNA repair mutants defining G2 checkpoint pathways in Schizosaccharomyces porobe. EMBO J. 11, 1343-1350

Al-Khodairy, F., Fotou, E., Sheldrick, K.S., Griffiths, D.J.F., Lehmann, A.R. and Carr, A.M. (1994). Identification and characterization of new elements involved in checkpoints and feedback Controls in fission yeast. Mol. Biol. Celí 5, 147 - 160

Alien, J.B., Zhou, Z., Siede, W., Friedberg, E.C. and Elledge,

S.J. (1994). The SAD1/RAD53 proteín kinase comtrols multiple checkpoints and DNA damage-induced transcription in yeast. Genes Dev. 8.,2416 - 2428

Barbet, N.C., Muriel, W.J., and Carr, A.M. (1992) Versatile shuttle vetors and genomic libraries for ude with Schizosachaccharomyces porobe. Gene 144, 59 - 66

Beamish, H. and Lavin, M.F. (1994). Radiosensitivity in ataxia telangiectasia: anomailes in radiaton-induced celí cycle delay.

Int.J.Radiat, Biol. J. Radiat, Biol. 65, 175-184

Carr. A.M. and Hoekstra, M.F. (1995) The Cellular Responses to DNA Damage. Trends in Celí Biology 5, 32 - 40.

Chien et al., (1991) Proc. Natl. Acad Sci USA 88, 9578-9582

Deng, C., Zhang, P., Harper, J.W., Elledge, S.J. and Leder; P.J. (1995) Mice lacking p21^CÍP1/HAF1 undergo normál development, but are defective in G1 checkpoint control. Celí, (in press).

Drwinga, H.L., Tojia, L.H., Kim, C.H., Greene, A.E., and Mulovor, R.A. (1993). NIGMS Human/Rodent Somatic Celí Hybrid Mapping Panels 1 and 2. Genomics 16:311-314.

El-Deiry, W.S., Tokino, T., Velculescu, V.E., Levy, D.B.,

Parson, R., Trent, J.M., Lin. D., Mercer, W.E., Kinzler, K.W, and Vogelstein, B. (1993) WAF1, a potential mediator of p53 tumour suppression. Celí 75, 817-825

Enoch, T., Carr, A.M. and Nurse, P. (1992). Fission yeast genes involved in coupling mitosis to completion of DNA-replication. Genes Dev. 6, 2035-2046.

Greenwell, P.W., Kronmal, S.L., Porter, S.E., Gassenhuber, J., Obermaier. B. and Petes, T.D. (1995) TEL 1, a gene involved in controlling telomere length in Saccharomyces cerevisiae, is homologous to the human ataxia telangiectasia (ATM) gene. Celí submitted

Grinmm, C., Kholi, J. Murray, J.M. and Maundrell, K. (1988) Genetic engineering of Schizosacharomyces pombe: a systém f or gene disruption and replacement using the ura4 gene as a selectable marker. Mol. Gen. Genet. 215, 81-86.

Gutz, H., Heslot, H. Leupold, U. and Loprieno, N. (1974), In Handbook of Genetics, King R. C., Ed., Plénum Press, New York,

Vol. 1, 395-446.

Hari, K.L., Santerre, A., Sekelsky, J.J., McKint, K.S., Boyd,

J.B. and Hawley, RS. (1995) The mei-4 1 gene of Drosophila melanogaster is functionally homologous to the human ataxia telangiec

Harper, J.W., Adami, G., Wei, N., Keyomarsi, K. and Elledge,

S.J. (1993) The 21 kD Cdk interacting protein Cipl is a potent inhibitor of G1 cyclin dependent kinases. Celí 75, 805-816.

Hartwell, L.H., and Kastan, M.B. (1994). Celí cycle control and Cancer. Science 266, 1821-1828.

Hiles, LD., Otsu, M., Yolinia, S., Fry, M. J., Gout, L, Dhand, R, Panayotou, G., Ruin Larrea., F., Thompson, Ä., Totty, N.F., Hsuan,

J.J., Courtneidge, S.A., Parker, P.J. and Waterfield M.D. (1992) Phosphatidylinositol 3-kinase: structure and expression of the HOkd catalytic subunit. Celí 70, 419-429.

Jimenez, G., Yucel, J., Rowley, R and Subramani S. (1992) ’The rad3+ gene of Schizosaccharomyces pombe is involved in multiple checkpoint functions and in DNA repair. Proc Natl. Acad. sci. USA 87, 4952-4956

Kato, R. and Ogawa, H. (1994) An essentíal gene, ESR1, is required for mitotic celí growth, DNA repair and Meiotic recombination in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 22, 3104-3112.

Lamb, J.R, Petit-Frere, C., Broughton, B.C., Leitrnann, A.R and Green, M.H.L. (1989) Inhibition of DNA replication by ionizing radiation is mediated by a trans acting factor. Int. J. Radiat.

Biol. 56, 125-130.

Leách, R.I., Chine, R., Reus, B.E., Hayes, S., Schantz, L., Dubois, B., Overhauser, J., Ballabio, A., Drabkín, H., Lewis, B.T., Mendgen, G., and Naylor, S.L. (1994) Regional Localisation of 188 Sequence Tagged Sites on a Somatic Celí Hybrid Mapping Panel for Human Chromosome 3 Genomics 24, 549-556

Maundrell, K. (1990). nmtl of fission yeast. A highly transcribed gene completely repressed by thiamine: J. Biol. Chem.

265. 10857-10864.

Morrow. D.M., Tagle. D.A., Shiloh, Y., Collins F.S. and Hieter. P. (1995) HAT1/TEL1, a Saccharomyces cerevisiae homologue of the human gene mutated in ataxia telangiectasia, is functionally related to the yeast checkpoint gene MEC1/ESR1. Celí submitted.

Murray, J.M., Doe, C. Schenk, P. Carr, A.M.. Lehmann, A.R and Watts, F.Z. (1992) Cloning and characterization of the S. pombe radl5 gene, a homologue to the S cerevisiae RAD3 and human ERCC2 genes Nucleic Acids Res. 20, 2673-2678

Našim, A. and Smith, B.P. (1975) Genetic control of radiation sensitivity in Schizosaccharomyces pombe. Genetics 79, 573-582.

Painter, R_B. and Young, B.R ( 1980, Radiosensitivity in ataxiatelangiectasia: A new explanation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77, 7315-7317

Rowley, R, Subratnani, S. and Young, P.G. ( 1992,. Checkpoint Controls in Schizosaccharomyces pornbe, radi. EMBO J. 11. 1335-1342.

Savitsky, K., Bar-Shim, A., Gilad, S., Rotman, G., Ziv, Y., Vanagaite L., Tagle, D.A., Smith, S., Uziel, T., Sfez, S.,

Ashkenazi, M., Pecker, I., Frydman, M., Harnik, R., Patanjali, S.R.,

Simmons, A., Clines, G.A., Sartiel, A., Gatti, R.A., Chessa, L., Sanal, O., Lavíne, M.F., Jaspers, N.G.J., Taylor, M.R, Arlett, C.F., Miki, T., Weissman, S.M., Lovett, M., Collins, F.S. and Shiloh, Y. (1995). A single ataxia telangiectasia gene with a product similar to PI-3 kinase. Science 286, 1749-1753.

Seaton, B.L., Yucel, J., Sunnerhagen P. and Subrannani, 5.

(1992). Isolation and characterisation of the Schizosaccharomyces pombe rad3 gene which is involved in the DNA damage and DNA synthesis checkpoints. Gene 119, 83-89.

Schu, P.V., Takegawa, K., Fry, M.J., Stack, J.H., Waterfield,

M.D. and Emr. S.D. (1993) Phosphatidylinositol 3-kinase encoded by yeast VPS34 gene essential for protein sorting. Science 260, 88-91.

Sheldrick, K.S. and Carr. A.M. (1993). Feedback Controls and G2 checkpoints, fission yeast as a model systém. BioEssays 15, 775-782.

Walworth, N., Davey, S, and Beach, D. (1993). Fission yeast chkl protein kinase links the rad checkpoint pathway to cdc2. Náture 363, 368-371.

Weinert, T.A., and Hartwell, L,H. (1988). The RAD9 gene Controls the celí cycle response to DNA damage in Saccharomyces cerevisiae. Science 241, 317-322.

Weinert, T.A., Kiser, G.L. Hartwell, L.H. (1994). Mitotic checkpoint genes in budding yeast and the dependence of mitosis on DNA replication and repair. Genes Dev. 8, 652-665.

Informácie o sekvenciách sekvencia 10 No. i:ATR seq

GCGCTCTTCCGGCAGCGGTACGTTTGGAGACGCCGGGAACCCGCGTrGGCGTGGTTGACTAGTGCCTCGCAGCCT 75 76 CAGcjATGGGGGAACATGGCCTGGAGCTGGCTTCCATGATCCCCGCCCTGCGGGAGCTGGGCAGTGCCAGAGCAGA 150 151 GGAATATAATACAGTTGTACAGAAGCCAAGACAAATTCTGTGTCAATTCATT6ACCG6ATACTTACAGATGTAAA 225 226 TGnGnGCTGTAGAACnGTAAAGWACTGACTCTCAGCCMCCTCCGTGATGKGCrrGATTrCATCSSGCA 300 301 TATCATGAAATCCTCCCCACnATGrrrGTAMTGTGAGTGGAAGCCATGAGCGCAAAGGCAGl^GTAľrGAATT 375 376 CAGTAATTGGATCATAACGAGACnCTGCGGAnGCAGCAACTCCCTCCTGTCATTTGnACACAAGAAAATCTG 450 451 TGAAGTCATCTGTTCATTAnATTTCTTTTTAAAAGCAAGAGTCCTGCTATrrni3GGGTACTCACAAAAGAATT 525 526 ATTACAACnTrTGAAGACTTGGTTTACCTCCATAGAAGAAATGTGATGGGTCATGCTGTGGAATGGCCAGTGGr 600 601 CATGAGCCGArrnTAAGTCAAnAGATGAACACATGGGATATnACAATCAGCTCCnTGCAGnGATGAfiTAT 675 676 GCAAAATHAGAATrTATTGAAGTCACTn'An'AATGGTTCTTACTCGTATIA'rrGCAATTGTGTTnTTAGAAG 750 751 GCAAGAACrCTTACITTGGCAGATAGGTTGTGTTCTGCTAGAGTATGGTAGTCCAAAAATTAAATCCCTAGCAAT 825 826 TAGCITITTMCAGAACTTrrTCAGCTTC-GAGGACTACCAGCACAACCAGCTAGCACTTnTTCAGCTCATTTTT 900 901 GGAATTATTAAAACACCTTGTAGAAATGGATACTGACCAAnGAAACrCTATGAAGAGCCATTATCAÄAGCTGAT S75 976 AAAGACACTATrrCCCTTTGAAGCAGAAGCTTATAGAAATAKGAACCTGTCrATn'AAATATGCTGCTGGiAAA 1050

1051 ACTCTGTGTCATGTTTGAAGACGGTGTGCTCATGCGGCTTAAGTCTGATTTGCTAAAAGCAGCTTTGTGCCA'nT 1125 1126 ACTGCAGTATTrCCTTAAATTTGľGCCAGCTGGGTATGAATCTGCTrTACAAGTCAGGAAGGTCTATGTGAGAAA 1200 1201 TATTTGTAAAGCTCTTTTGGATGTGCnG&AATTGAGGTAGATGCAGAGTACrrGTTGGGCCCACTTTATGCAGC 1275 1276 TTTGAAAATGGAAAGTATGGAAATCAnGAGGAGAnCAATGCCAAACTCAACAGGAAAACCTCAGCAGTAATAG 1350 1351 TGATGGAATATCACCCAAAAGGCGľCGTCTCAGCTCGTCTCTAAACCCTTCTAAAAGAGCACCAAAACAGACTGA 1425 1426 GGAAATTAAACATGTGGACATGAACCAAAAGAGCATATTATGGAGIGCACTGAAACAGAAAGCT6AATCCCr7CA 1500 1501 GATTTCCCTTGAATACAGTGGCCTAAAGAATCCTGTTATrGAGATGTTAGAAGGAATTGCTGTTGTCTTACAACT 1575 1576 GACTGCTCTGrGTACTGTTCATTGTTCTCATCAAAACATGAACTGCCGTACTTTCAAGGACTGTCAACATAAATC 1650 1651 CAAGAAGAAACCTTCTGrAGTGATAACTTGGATGTCATTGGATITnACACAAAAGrGCTTAAGAGCTGTAGAAfi 1725 1726 TrTGnAGAATCTGnCAGAAACTGGACCTGGAGGCAACCAnGATAAGGTGGTGAAAArrrATGATGCnTGAT 1800 1801 TTATATGCAAGTAAACAGTTCATTTGAAGATCATATCCTGGAAGATTTATGTGGTATGCTCTCACTTCCATGGAT 1875 1876 nAnCCCAnCTGATGATGGCTGTnAAAGHGACCACArnGCCGCTAATCHCTAACAnAAGCTGTAGGAT 1950 1951 TTCAGATAGCTATrCACCACAGGCACAATCACGATGTGTGTTTCTTCTGACTCTGTTTCCAAGAAGAATATTCCT 2025 2026 TGAGTGGAGAACAGCAGnTACAACTGGGCCCTGCAGAGCTCCCATGAAGTAATCCGQGCTAGTTGTGTTAGTGG 2100 2101 ATTmTATCrTAnGCAGCAGCAGAAnCTTGTAACAGAGTTCCCAAGAnCTTATAGATAAAGTCAAAGATGA 2175 2176 TTCTGACATTGTCAAGAAAGAA'rn'GCTTCTATACTTGGrCAACTTGTCTGTACTCTTCACGGCATGTTrrATCT 2250 2251 GACAAGTTCrrTAACAGAACCrrTCTCTGAACACGGACATGTGGACCTCnCTGTAGGAACTTGAAAGCCACrrc 2325 2326 TCAACATGAATGn'CATCnCTCAACTAAAAGCTTCTGľCTGGAAGCCATTCCTrrTCCTACTGAAAAAAAAAAT 2400 2401 ACCTAGTCCAGTAAAACTTGCTTTCATAGATAATCTACATCATCTTTGTAAGCATCTTGATTTTAGAGAAGATGA 2475 2476 AACAGATGTAAAAGCAGTTC'rrGGAACTTTATTAAATTTAA'TGGAAGATCCAGACAAAGATGTTAGAGTGSCTTT 2550 2551 TAGTGGAAATATCAAGCACATAnQjAATCCnGGACTCTGAAGATGGATľTATAAAGGAGCTTTTTGTCrTAAG 2625 2626 AATGAAGGAAGCATATACACATGCCCAAATATCAAGAAATAATGAGCTGAAGGATACCTTGATTCTTACAACAuG 2700 2701 GGATATTGGAAGGGCCGCAAAAGGÁGATTTGGTACCATTTGCACTCrTACACTTATTGCAľTGTTTG'n'ATCCAA 2775 2776 GTCAGCATCTGTCTCTGGAGCAGCATACACAGAAATTAGAGCTCTGGnGCAGCTAAAAGTGTTAAACTGCAAAG 2850 2851 nTnTCAGCCAGTATAAGAAACCCA'lCTGTCAGTTnTGGTAGAATCCCTrCACTCrAGTCAGATGACAGCACT 2925

2926 tccgaatactccatgccagaa^tg-2tg4Cg^t3c τα-γ:” ·??·.··.-74 ·...·:.

wuv 4 C i i C · ta j i i UVWiCt · t¹ *»*✓“·. * é ·* * rf * « rf « ··! i/·*· i t v InC t C V Z 5

3076 ACCTGATCrTGCTGCCAAAGCAAGCCCTGCAGCTTCTGCTCTCATTCGAACTTTAGGAAAACAATTAAATGTCAA 3150 3151 TCGTAGAGAGATTnAATAAÄCAACTrCAAATATATTTTrrCTCATTTGGTCTGTTCnGTTCCAAAGATGAAn 3225 3226 AGAACGTGCCCrrCATTATCTGAAGAATGAAACAGAAATTGAACTGGGGAGCCTGTTGAGACAAGATTrCCAAGG 3300 3301 AnGCATAATGAATrArreCTGCGTAnGGAGAACACTATCAACAGGTTTTTAATGGnTGTCAATACTTGCCTC 3375

3376 ATTTGCATCCAGTGATGATCCATATCAGGGCCCGAGAGATATCATATCACCTGAACTGATGGCTGATTATrTACA 3450

3451 ACCCAAATTGnGGGCArnTGGCrnTÍTTAACATGCAGTTACTGAGCTCTAGTGnGGCAnGAAGATAAGAA 3525 3526 AATGGCCrTGAACAGTTTG4TGTCnTGATGAAG'TľAATĽ'6GW:CCAAACATGTCAGTTCTGTGAGGGTGAAGAT 3600 3601 GATGACCACACTGAGAACTGGCCTTCGATTCAAGGAIGATrrTTCCTGAATTGTGTTGCAGAGCTTGGGACTGCTT 3675 3676 TGnCGCTGCQGGATCATGCrrGTCTGGGCTCCCnCTCAGrCATGTAATAGTAGCTTrennrACCTCTTATACA 3750

3751 CATCCACCCTAAAGAAACTGCASCTATCTTCCACTACCTCATAAnGAAAACAGGGATGCTGTGCAAGAnnCT 3825

3826 TCATGAAATATArnTTTACCTGATCATCCAGAATTAAAAAAGATAAAAGCGGITCTCCAGGAATACAGAAAGGA 3900 3901 GACCTCTGAGAGCACTGATCTTCASACAACTCTTCAGCTCTCTATGAAGGCCAnCAACATGAAAATGTCGATGT 3975 3976 TCGTATTCATGCTCTTACAAGCTTGAAGGAAACCrrCTATAAAAATCAGGAAAAACTGATAAAGTATGCAACAGA 4050 4051 CAGTGAAACAGTAGAACCTATTATCTCACAGTTGGTGACAGTGCnTTGAAAGGHGCCAACATGCAAACTCTCA 4125

4126 AGCTCGGnGCTCTGTGGGGMTGrn'AGGG&äATTGC-GGGCGATAGATCCAGGTCGA'n'AGAnTCTCAACMC 4200

4201 TGAAACTCAAGGAAAAGATTITACATTTGTGACTGGAGTAGAAGAnCAAGCrrTGCCTATGGATTATIGATGGA 4275 4276 GCTAACAAGAGCrTACCnGCGTATGCTGATAATAGCCGAGCTCAAGAnCAGCTGCCTATGCCAnCAGGAGrr 4350 4351 GCrTTCTATTTATGACTGTAGAGAGATGGAGACCAACGGCCCAGGTCACCAAnGTGGAGGAGATTTCCTGAGCA 4425 4426 TGTTCGGGAAATACTAGAACCTCATCTAAATACCAGATACAAGAGTTCTCAGAAGTCAACCGATTGGTCTGGAGT 4500

4501 AAAGAAGCCAATTTACTTAAGTAAA'n'GGGrAGTAACrTTGCAGAATGGTCAGCATCTTGGQCAGGTTATC'n'AT 4575

4576 TACAAAGGTTCGACATGATCTTGCCAGTAAAATTTTCACCTGCTGrAGCATTATGATGAAGCATGATTTCAAAGr 4550 4651 GACCATCTATCrrCTTCCACATAnCTGGTGTATGTCnACTGGGTTGTAATCAAGAAGATCAGCAEGAGGTTrA 4725 4726 TGCAGAAATTATGGCAGnCTAAÄGCATGACGATCAGCATACCATAAATACCCAAGACATTGCATCTGATCTGTG 4300 4801 TCMCTCAGTACACAGAnCuGnCTCCATCCnGACCATCTCACA^ 4875

4876 GAAAGCTGAGAAATGTCCACACAGCAAATCAAACAGAAATAAfiGTAGACTCAATGGTATCTACTGTGGATTATGA 4950

4951 AGACTAŤCAGAGTGTAACCCGTTnCTAGACCTCATACCCCAGGATACTCTGGCAGTAGCTTCCnTCGCTCCAA 5025 5026 AGCATACACACGAGCTGTAATGCACTTTGAATCATTTATTACAGAAAAGAAGCAAAATATTCAGGAACATCTTGG 5100 5101 ATT7TTACAGAAATTGTATGCTGCTATGCATGAACCTGATGGAGTGGCCGGAGTCAGTGCAATTAGAAAGGCAGA 5175 5176 ACCATCTCTAAAAGMCAGATCCnGAACATGAAAGCCnGGCrTCCTGAGGGATGCCACTGCTTGTTATGACAG 5250

5251 GGCTATTCAGCTAGAACCAGACCAGATCATTCATTATCATGGTGTAGTAAAGTCCATGTTAGGTCTTGGTCAGCT 5325

5326 GTCľACTGTTATCACTCAGGTGAATGGAGTGCATGCTAACAGGTCCGAGTGGACAGATGAAKAAACACGTACAG 5400 5401 AGTGGAAGCAGCTTGGAAATTGTCACAGTGGGATTTGGTGGAAAACTAnTGGCAGCAGATGGAAAATCTACAAC 5475

5476 ATGGAGTGTCAGACTGGGACAGCTATTATTATCAGCCAAAAAAAGAGATATCACAGCTTTTTATGACTCACTGAA 5550

5551 ACTAGTGAGAGCAGAACAAATTGTACCTCTTTCAGCTGCAAGCTTTGAAAGAGGCTCCTACCAACGAGGATATGA 5625

5626 ATATArrGTGAGATTGCACATGTTATGTGAGrrGGAGCATAGCATCAAACCACnTrCCAGCAnCTCCAGGTGA 5700

5701 CAGTTCTCAAGAAGATTCTCTAAACTGGGTAGCTCGACTAGAAATGACCCAGAATTCCTACAGAGCCAAGGAGCC 5775 5776 TATCCTGGCTCTCCGGAG6GCrrTACTAAGCCTCAACAAAAGACCAGAnACAATGAAATGGTTGGAGAÁTGCTG 5850 5851 GCTGCAGAGTGCCAGGGTAGCTAGAAAGGCTGuTCACCACCAGACAGCCTACAATGCTCTCCTTAATGCAGGGGA 5925 5926 ATCACGACTCGCÍGAACTGTACGTGGAAAGGGCAAAGTGGCTCTGGTCCAAGGjTGATGTTCACCAGGCACTAAT 6000

6001 TGncnOUWAAC-GTGnGAAnATGTTTrCCTGAAAATGAAACCCCACCTGAGGGTAAGAACATGnAATCCA 6075

6076 TGGTCGAGCTATGCTACľAGTGGGCCGATTTATGGAAGAAACAGCrAACTTTGAAAGCAATGCAAnATGAAAAA 6153 6151 ATATAAGGATGTGACCGCGTGCCTGCCAGAATGGGAGGATGGGCATTTTTACCTTGCCAAGTACTATGACAAAT7 6225 6226 GATGCCCATGGTCACAGACAACAAMTGGAAAAGCAAGGTGATCTCATCQjGTATATAGHCTTCATTTTGGGAG 6300 6301 ATCTCTACAATATGGAAATCAGTTCATATATCAGTCAATGCCACGAATGTTAACTCTATGGCrTGATTATGGTAC 6275

6376 AAAGGCATATGíATGGGAAAAAGCľcSZZGCTCCGATCGTGTACAAATGAGGAATGATTTGGGTAAAATAAACAA 5450 «51 GGnATCADVG4GCATAOWACTATTTAGCTCCATATCAATTnTGACTGCTTrrrCACAAnGATCTCTCGAAT 6525 6526 TrGTCAnCTCACGATGAAGTnTTGTTGrCrTGATGGAAATAATAGCCAAAGTA'nTCTAGCCTATCCTCAACÁ 6600

6601 AGCAATGTGGATGATGACAGCTGTGTCAAAGTCATCTTATCCCATGCGTGTGAACAGATGCAAGGAAATCCTCAA 6675 6676 TAAAGCTAnCATATGAAAAAATCCTTAGAGAAGTTTGTTGGAGATGCAACTCGCCTAACAGATAAGCTTCTAGA '6750 6751 AnGTGCÄATAAACCGGnGATGGAAGTAGnCCACAnAAGCATGAGCACTCArnTAAAATGCnAAAAAGCr 6825 6826 GGTAGAAGAAGCAACAnTAGTGAAATCCTCAnCCTCTACAATCAGTCATGATACCTACACTrCCATCAAnCT 6900 6901 GGGTACCCATGCľAACCATGCrAGCCATGAACCATTTCCTGGACATTGGGCCTATATTGCAGGGTnGATGATAľ 6975 6976 GGTGGAAATTCrľGCTTCTCTrCAGAAACCAAAGAAGAnTCTTTAAAAGGCTCAGATGGAAAGTTCTACATCAT 7050 7051 GATGTGTAAGCCAAAAGATGACCTGAGAAAGGATTGTAGACTAATGGAAnCAATTCCTTCATTAATAAGTGCTT 7125 7126 AAGAAAAGATGCAGAGTCTCGTAGAAGAGAACTTCATAnCGAACATATGCAGTTAnCCACTAAATGATGAATG 7200 7201 TGGGATTATTGAATGGGTGAACAACACTGCTGGrrTGAGACCTATTCTGÄCCAAACTATATAAAGAAAAGGGAGT 7275 7276 GTATATGACAGGAAAAGAACnCGCCAGTGTATGCTACCAAAGTGAGCAGCnTATCTGAAAAACTCAftAGTATT 7350 7351 CCGAGAATTTCTCCrGCCCAGGCATCCTCCTATTTTTCATGAGTGGnTCTGAGAACATTCCCTGATCCTACATC 7425 7426 ATGGTACAGTAGTAGATCAGCnÄCTGCCGTTCCACTGCAGTAATGTCAATGGTTGGTTATATTCTGGGGCTTGG 7500 7501 AGACCGTCATGCTGAWWCTCmGAnCTnGACTGGTGMTGCGTACATGTAGAnTCAAWCW 7575 7576 CAATAAGGGAGAAACCTTTGAAGTTCCAGAAATreTGCCA'TrTCGCCTGACTCATAATATGGTTAATGGAATGGG 7650 7651 TCCTATGGGAACAGAGGGTCTTTTTCGAAGAGCATGTGAAGTTACAATGAGGCTGATGCGTGATCAGCGŕiGAGCC 7725 7726 TTTAATGAGTGTCTTAAAGACTnTCTACATGATCCTCTTGTGGAATGGAGTAAACCAGTGAAAGGGCATTCCAA 7800 7801 AGCGCCACTGAATGAAACTGGASAAGTTGTCAATGAAAAGGCCAAGACCCATGTTCTTGACATTGAGCAGCGACr 7675 7876 ACAAGGTGTAATCAAGACľCGAAATAGAGTGACAGGACTGCCGTTATCrATTGAAGGACATGTGCATTACCTTAT 7950 7951 ACAAGAAGCTACTGATGAAAACTTACTATGCCAGATGTATCTTG6TTGGACTCCATATA|GTGÄAATGAAATTAT 8025 8026 GTAAAAGAATATGnMTMTCTAAAAGTAATGCATTľGGľATGAATCTGŤGGTTGTATCTGTTCAATTCTAÄAG 8100 8101 TACAACATAAATnACGTTCTCAGCAACTGtTTATTTCTCTCTGATCATTAATTATATGTAAAATAATATACATTC 8175 8176 AGnAnAAGAAATAAACTGCTTTCTTAATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAÄAAAAAAAAA 8233

Sequencia ID No.2: ATR proteín

KGEHGLELASMIPALRELGSATPEEYNTWQKPRQILCQFIORILTOVHVVAVELVKKTOSQPTSV 66

MLlDFlQHIHKSSPLKrVNVSGSKERKGSCIEFSNWI ITRLLRIAATPSCHILHKKICEV1CSLLFLFKSKSPAI 141 142 FGVLTKELLQLFEOLVYLHRRHVHGHAVEWPWHSRFL5QIOEHMGYLQSAPLQLHSKQNLEFIEVTLLHVLTRI 216 217 IAIVFFRRQELLLWQIGCVLLEYGSPKIKSLAISFLTELFOLGGLPAQPASTFFSSFLELLKHLYEHOTDQLKLY 291 292 EEPLSKLICTLFPFEAEAYRNIEPVYLNMLLEKLCVNFEOGVLHRLKSDLLKAALCHLLQYFLKFVPAGYESALQ 366 367 VRKVYVRNICKALLDVLGIEVDAEYLIGPLYAALKHESHEIlEEIQCQTQQEHLSSNSDGlSPKRRRlSSSlNPS 441 442 KRAPKQTEEIKHVOKRQKSILWALKQKAESLQISLEYSGLKNPVIEHLEGIAYVLQLTALCTVHCSKQNMNCRT 516 517 FKOCCHKSKKKPSVVITKHSLDFYTKVLKSCRSLLESVQKLOLEATIOKVVKIYOALIYHQVNSSFEOHIlEOlC 591 592 GHLSLPHIYSHSODGCLKLTTFAANLLTLSCRISOSYSPQAQSRCVFLLTLFPRRIFLEWRTAVYNWALQSSHEV 666 667 IRASCVSGFFILLCQONSCNRVPKILIOKVKDOSOIVKKEFASILGQLVCTLHGHFYLTSSLTEPFSEHGHVDLF 741 742 CRNIKÄTSQKECSSSQLKASVCKPFLFIIKKKIPSPVKLAFIDNLHHLCKHLOFREOETDVKAVLGTIUÄ.HECP 816 817 DKDYRVAFSGNIKHILESIDSEOGFIKELFVI.RMKEAYTHAOI5RNNELKD7LIUTGDIGRAAKGQ1.VPFALIH 691 892 LLHCLLSKSASVSGAAYTEIRALVAAKSVKLQSFFSQYKKPICQFLVESLHSSQKTALPNTPCQNADVRKCDVAH 966 967 OREHALNTLSE IANVFDFPOLNHFLTRTLQVU.POLAAKASPAASAI IRTlGKQLNYNRREllINNFKYIFSHLV 1041 1042 CSCSKOELERALHYLKMETElELGSLLRQOFQGLHNELLLRIGEHYOQVFNGLSILASfiASSOOPYQGPROIISP 1116 1117 ELHADYĽQPKLLGILAFFNMQLLSSSVGIEOKKHALNSLMSLHKLHGPKHVSSYRVWWnLRTGLRFKOOFPEl 1191 1192 CCRAWDCFVRCLOHACLGSLLSHVIVALLPLIHIQPKETAAIFHYLI IENROAVQOFLHEIYFLPOHPELKKIKA 1266 1267 VLQEYRKETSESTDLOrrLQLSHKAIQHENYDVRIHALTSLKETLYKNQEKLlKYATDSETVEPI ISQLVTVILK 1341 1342 GCQDANSQARLLCGECLGELGAIOPGRLOFSTTETQGKDFTFVTGVEOSSFAYGLLHELTRAYLAYADNSPAQOS 1416

1417 AAYMQELLS!YCC°.E^wľ”‘iGFG^:

ag-ag·*·.: '.-xcŕKv;: illfhíl>yviigcngíogqeyya£jmavlkhjOGhtint i=66

1567 QOIASOLCQL5TQTVFSKLOHLTGWARHKFQALKAEKCPHSKSNRMKVOSHVSTVQYEOYQSVTRFLOLIPOOTL 1641

1642 AVASFRSKAYTRAVHHFESFITEKKQfiIOEKLGFLOICLYAAMHEPOGVAGVSAIRKAEPSLKEQlĽEHESLGLLR 1716 1717 DATACYDRAIQLEPDQIIHYHGVVKSMLGLGQLSTVITQVNGVHANRSEWTDELNTYRVEAAMKLSQWDLVENYL 1791 1792 AADGKSTTWSVRLGQLLLSAKKRDITAFYĎSLKIVRAEQIVPLSAASFERGSYQRGYEYIVRLHHLCELEHSIKP 1866 1867 LFQHSPGDSSQEOSLKWVARLE^QNSYRAKEPILALRRALLSLNCTiPDYNEMVGEClsLQSARVARKAGHTOTAY 1941 1942 NALUMGESRLAELYVERAKWIWSKGDVHQALIVLQKGVEICFPENETPPEGKM1LIHGRAMLIVGRFMEETA*ÍF 1016 2017 ESNAIKKKYKOVTACLPEWEOGHFYLAKYYDKLHPMVTDNKMEKQGDLIRYIVLHFGRSLQYGNQFIYQSHPRHL 2091 2092 TLWLOYGTKAYEWEKAGRSORVGNRNOLGKINKVITEHrNYLAPYQFLTAFSQLISRICHSHDEVFVVLHEI I AK 2166 2167 VFLAYPQQAMUWfľAVSKSSYPHRVNRCKEILNKAIHHXKSLEKFVGDÄnU.TOKLLELCNKPVDGSSSTLSMST 2241 2242 HFKHLKKLYEEATF5EILIPlQSYHIPTLPSIL6THANHASHEPFPSlWAYIAGFD0MVEILASLQKPKKISLftG 2316 2317 SOGKFYIHHCKPKOOLRKOCRLHEFNSLINKCLRKDAESRRRELHIRTYAVIPLNOECGIIEHYNWrAGLRPlLT 2391 2392 KLYKEKGVYMTGKELRQCMLPKSAALSEKLKVFREFLLPRHPPIFKEWFLRTFPOPTSWYSSRSAYCRSTAVHSH 2466 2467 YGYIIGLGDRHGENILFDSLTGECYHVDFNCIFNKGETFEVPEIVPFRLTHNHVNGHGPHGTEGLFRRACEVTHR 2541 2542 LHRDQREPLHSYLKTFLHOPLVEHSKPVKGHSKAPLNCTGEVVHEKAKTHVDIEQRLGGVIKTRNRVTGLPLSI 2616 2617 EGHVHYLIQEATDENLLCOHYLGKTPYM 2664 bekvencia ID No. 3: rad3.seq

GGTACCAAGTAAAAACTGCTTAGTAAGTATAAAACACAGAAGAATCCGC6ATCTAGTGAACCAATGCCCTGCGTA 75

TGACGCTCCACTGACGCTATAGTCAATGAGAACTAGGATGTGCGAnATAACTTATCTTTTCAATATTrTCTTAT 150 151 TAlTrAmAAGAAATAAnGMnAAMCTCATncrrCrnTAnAGCCGTAAAATAGCTTArnTCTCTCCT 225

301 nATCAGAAACATCCAGCCTAATATTACTTAAAAGnAGrrTCCTCTGAAAATTCAGTATCACAAAAGCTCGnA 375 376 ATTAGCATCGCTCGATACnAGTGCACCATGCATCTTCClTrACCTCGTGAGTGGAAATCGATTTGATAATCGAT 450 451 TGCCACTTTTCGCATAAnCTAnGAGATATnTAnACnACAATCGTCTTrrTATAAATGCTCAAGACrnGAA 525 526 CGCGCGTGTTGCGTnTAAAAAGGCCmmTGAATTGAATCAATGGTTTGATATAGTATGAGCCAACACGCAA 600 601 AAAGGAAAGCTGGGTCACTCGATCTTTCACCCAGAGGCTTAGATGACAGACAGGCTTTCGGACAGCTTTTGAAAG 675 676 AAGTATTAGCATTAGACAAAGAACATGAGTTAGGTAGAAGTAATTCTTTACCATCTATGACCTCCGAGCTTGTTG 750 751 AAGTTTTAATTGAAGTTGGTCTTCTAGCTTTTAAACArGATGATTCAAAATCTGAATTTATCTCTCCTAAGATGC 825 826 TAAAAGAAGCCCATCTCTCTCTACAAGCGTTAATGCTAATCTTAAAAAGGTCTCCGACAGTnTGCGGGAGATTA 900 901 AATCATCTGnACTCrrKGGAnGGATTrTACCCAGGACTATATCAnGTTrGCTGATAnCGTnTATOAGr 975 976 TATTTGACTCATTAAAAGAGTTTCATAAGCTAATTTATCAGCTAATCAGTGAAAAGTCATTCCTATGGGACTTAľ 1050 1051 ATGCTTCGTTrATGCGTrATTGGAAATAnATATTACAAACGTrTCTTCTATAGTTCTCCAAATCACTAATGCTA 1125 1126 CATTCCCTTACAAGATGCCCTCACCCMTTCTCAACCATTGCAGAGrATCTCCCCAAATTATCCAACCCATCGAG 1200 1201 AGGACAAATTTGATTTACTTATCATTAATATAGAGGAGGCTTGTACArnTTCrrTGAAAGTGCCCATTTTTTTG 1275 1276 CACAATGCTCATATTTAAAGAAATCCAATTTTCCTAGTCCACCTCTCTTTACAGCGTGGACTTGGATCAAGCCAT 1350 1351 GTTmTrAAnTrGTTATTTTAnAAMCGAATCAGCATCGGAGACTCACAGCTCTÍTCTACATTTGCATTCAC 1425 1426 GTATAGTCCAAACnTATGCTGTnTrCCTTGAATTnATATATCATGGCCTTCCCATTTGTGAAAAATCTAAAC 1500 1501 ATATTTTAATGTCCTCCATCAACTTAACATTGGGATCATTGAAGAAAACTTATACAGTTGCTAATACTGCTATAT 1575 1576 CTCTTTTrrRCTCTCrnrATrrGTKTACCCAAAACTGTAGCTGGTCTAnCTATCCrnTGGGGTTrCOTAC 1650 1651 TnCTGÄCnCAAGGTATTAGAGCAACnGAACCAGATTCTGATCTCAAAAAGGCAATAATATTATTTAAGTGCA 1725 1726 GATACCAAAGTTCAGAAATAGATCAAACAACTCTCCGTGCTTTTGGCGAAATTTGTACTGGTAAACTTGAAAACA 1800 1S0J CGTTnľrnrrCTAACTCTGAAnAAACCTTTnľCrrrrACATTATCTnCCrTGGACAATGACnGTCAAATATTC 1875 1676 TTAAAGTGuATTTCCAGAATGGTCATAACATATGTACATTTGCAAAATGGTGTATAAACAACAACTTAGATGAAC 1950 1951 CGTCTAATTTAAAGCACnTCGTGAAATGTTAGATTATTATAGCTCTCATAATGnACAATAAG^T'GAGGACGACC 2025 « *» I _t ·*·>, ₍ w a . . *.*·. ·» , . « . . - . — —— ·**-,», « . «y.

««á*. .V.-·”—*···\, . i „ « -i Λ- — *·_· . «i“/·.. · .t» i · »k.

zlu! ATcAAjiACA.^c· ,GľcA.-iji i iciAAGiľAi i i im t i ACTA i i iGAiGAGCGGTCGCCi 11IAAAATTCC7T 2175 2176 ATCACGAATTGTTTTGTGCAnGCTAAAAAATCCCGACATAATrTCCTCTTCTGTTAAACAATCATTGTTGCTTG 2250

2251 ATGGCTTTTTTCGGTGGACCCAGCATTGCTCAAACrnAATAAASAATCAATGTTAAÍiTrrAAGAGAATn'ATTA 2325 2326 TGAAAGCATTAGCCAGTACTTCAAGATGTTTAC6T6TT6TTGCTGCAAAAGTnTGCCC47777C47TA465G4C 2400 2401 CrMTAATCTTGATATA£TTGAAmCACAAG6AAA6TAAAGCCn6ArmTAATAC6TTGAAAATAniXC6G 2475 2476 TGGAAAATACAGCrATTnAGAAACQGTCArjGmCCTGGATCTCCnATCTAGAGTGGTAGAAGAAGAAGAAT 2550 2551 TACATnJGTACTATTGGAAGnATATCnCTGTGATAAACAGCGGAATATTnATCAAGGCATTGGTCTCAGCG 2625 2626 CTCTGCAACAAATTGCCTCGACGCGTCATATATCCGJTTGGCAATTACTTrcrCCATAnGGCCAACAGTGTCCG 2700 2701 nGCGATTGTCCAAGGTATGGGTAAMMCCGAACATAGCCAGTTľATTľGCľCAGCTTATGAATATn'CCGAGG 2775 2776 GCGAmTCmnCGAACACAGGCGTACACTTTACCAnCCnGTACnACTAAAAACAAAGCGnAATAGTAC 2850 2851 GTATAGCTGAACTTTCACAAAGTGATGTTGCTACTrTGTGCCTTACIAATATGCATAAAATCCJTGCTTCGCTAC 2925 2926 7TACrAC6GATCAKCTAATJTGSAAGAGA5TGÍGAT{£TTCTTCTTTCAClGGCCACTTCTGATTTTGAAAAAG 3000 3001 TTGATlTAACGTCTTTGTTACGCTCTGATCCTATn'CTAnACTGTGGAGJTGTTACAGCm'ATCAGAATGATG 3075 3076 TTCCTCATGAAAAAAnGAAAATGCTTTAAGAAAGGTAGCAATGAnGTCTCÍCAAGJGGTTAATGACGAAGACT 3150 3151 TGAGCAATAAGGAAnACmATGATrmTTAATAATCACATTrTGGGTATCnAGCAGAATTrrCTAATATCC 3225 3226 TrAACGACCTGAAAGGAAAGACnCAATTAATGAAAAGATTAAGACAAnGTCGGCAnGAAAAAATGTTATCTT 3300 3301 TATGTGGAGGTGCAGrCAAACnGGAlTACCACAGATACrTTCTAAmACAAAGTGCTTrrCAAAAT6AGCAa 3375 3376 TAAGGTTTTA'nXAATCAAAGCTTGGnCAGTTTGATATTAGCAACCAAGGAGCCQ^GTATMiTTCAATTGCTG 3450 3451 GmAAGTCTTGTAAnnAGCTCCTnAnCCCTTATTrAGAACCACA^AAGCAGAGCTAGTAATTCAAArAT 3525 3526 TTGATTTTATTrCTTCTGACACACACAAGTGCCTACAAGGATTAAAGTGGGCTATCCCCACCAGTCTGGATTCAG 3600 3601 CGTGCTrrAGCCnAAGGCTAAAGAAArAnCTGnCGCnCAAAATGAAGAľrnTACTCTGAGCnCAAAGrA 3675 3676 TAATrAAGTGTn'AACTAACGAAAATGAGCCAGmG'n'AT7TAGGrn'ACAAAAAnAGAAClTnTn7CAAG 3750 3751 CCAAGGTGGACGACnACATGACACACTAAATTTGGACATATCCAACGAAGľTCT&lACCAATTACľAAGATGCC 3825 3826 HnAGAnGTTGTGTAAAATATGCTTCAACAAATATGCAAATATCATATCUGCTCCAAAAAATCn'GGTGAAT 3900 3901 TGGGTGCGATAGATCCCAGCCGCGCCAAGGCTCAACATATTÁTTAAAGAAACAGTTGnCTTGATAACTrľGAAA 3975 3976 ACGG^AAGAAAGmCAAGTJTATTCTAGArnTATGCAATCGCAGrrAAnCCAGCJTrCCrTGTTACrACTG 4050 4051 ATACTAAAGCACAAGGTTTTCnGCCTATGCTCTG&AGAGnTCTAAAGClTGGTGGATTCAAGTCCGCAGTGA 4125 4126 nAATAAAAAAAAG6GACTAACT6rG6rAACAGAACATT6GAT6TCrT7CCCrGAT7TATCCAAACGIGTGCTľA 4200 4201 TACCATmTAACnCCAAGTATCAmAACACCAATCCCCAAAAnGACAUCGGTACCCTAmATAAAGAAA 4275 4276 ArGrTACrATTCATACTTGGATC<AGTTGTTTTCTCn)lAATT6ArG6AGrAC6CCCATTCGCAAAACGCrGAAA 4350 4351 AAA7ATTTGGTArnGT7CGAAAGTAGTGAAAGACCAAGAGGTTAACAnCCCTGTrrrCTTC7TCCCTJTCnG 4425 4426 TnTAAATGrrAnTTAACCGAGrCAGAACTGGAAGnAATAAAGTCAnGAAGAATTCCAGCnGTTATTAATC 4500 4501 AACGjGGACCTGATGGAnAAAnCCGTGGGGCAACAAAGATACACCTCATrTGTAGATGTAnTTrTAAGATTG 4575 4576 TGGATTACCTTAÁCAAAlGGCrTCGCATGCGAAAGAAGAGGAATTGGGATAGACGn'CTGCCAnGCAAGGAAAG 4650 4651 AGAACCGnATATGTCGGTGGAAGATGCTACCTaCGA&ATCATCGATCTCAAAAGnGAGTCATrrcmCTC 4725 4726 GArrrcCnCAAAAACAnAGGTATTGTCrcrrTAMnGTGGAmCATGCTCGTGCAnGTnTAnGGGAGC 4800 4801 MCACATACGTAATGCTACAGCTCaTATCCAGCnTAGAGTCCGAnATAGAGTTrTGCAGGAAATATATGCTG 4875 4876 CAATTGATGATCCASATGAAATCGAAGCAGTGTCnTAAAmCCATGAnACTC6nTGATCAACAACTCCrrr 4950 4951 TACArGAAAAnCAGGAACATGGGACTCGGCmGAGnGnACGAAAnAUAnCAAAAGGATCCrGAAAATA 5025 5026 AAAAGGCGAAAATCGGTTTGCnAACAJGCATGCTGCAAKGGGGCAnATGAAKTCnGmTGAGrrTAGAn 5100 5101 CTmATAATCAATGACAACCACGAGTATTCGAAGATGTTAAATTTGGGTATTGAAGCnCATGGCGUCGCTAT 5175 5176 CTATTGAnCGTTAAAAAASTGTCmCAAAAAGCAACn'6GAATCT7TCGAAGCTAAAnGGGTA(XATAT7TT 5250 5251 ACCAATACCTACGGAAGGAnCTmGCTGAAnGACGGAGCGGCTGCAACCCnGTACGTTGATGCTGCTACAG 5325 5326 CAATTGCAAACACAGGCGGCCATTCÁGCCrATEATTGTTATGATATTn'ATCTAAGCTGCACGCAATTAATGACT 5400 5401 TTAGTAGGATTGCTGAAACTGACGGAATTGTTTCCGACAATCrTGATATTGrrCTTCGCCGTC&jCTTAGCCAAG 5475 5476 TAGCTCCGTACGGTAAAnCAAGCACCAAAÍCCTGTCCACTCACTTAGTTGGCTATGAAAA.ⁱTT^TGⁱ.'.ⁱ.‘^'' - ľ

5551 AGAAAACrGCrGAAATArirrr^.i~-?r: r·.·

57·:: AACA7CGTAAA6CTArTTCrGAATTGAArrmCGCnAATAACAACATGmGArrrGGn6AT6AGCATGAAG 5775

5776 AAAGACCTAAAAArCGTAAAGAAACn7nGGAAATCCACTTAAAGGAAAAGTGTTCT7GAAACnACAAAATGGC 5850 5851 TCGGAAAAGCTGGCCAACTGGGATTGAAGGAľTTGGAGACGTATTATCATAAAGCGGTAGAGATTÍACffAGAAT 5925 5926 GTGAGAATACGCATTATTATCrTGGCCATCATCGAGTTTTAATGTATGAAGMGAACAAAAGCTCCCAGrTAATG 6000 6001 AACAGAGCGAACGATTmAAGTGGrGAGTrAGrAACrCGCATAATTAACGAATTTGGTCGATCTTTGTACTATG 6075

6076 GTACAAATCATATATATGAAAGTATGCCAAAArTGCTCACACTGTGGCnGAľnTG&XCCGAAGAACnCGCT 6150

6151 TATCTAAAGATGACGGCGAAAAGTACmCGTGAACACATTATCTCTTCGAGAAAAAAATCrnEGAACJTATGA 6225 6226 AnCGAATGmGTCGCCnTCTArGAAAAncaCAATACmrrrCTGGnGCAmTCCCAAATGATATCCA 6300 6301 GAGTATGCCATCCAAATAATAAAGnTATAAAATmGGAACATATAAT7GCAAACGTTGTAGCATC7TATCCTG 6375 6376 GGGAGACGCTATGGCAAnAATGGCAACAATAAAATCGACnCTCAAAAGCT,CTCGCTTCGTGGAAAAAGCAm 6450

6451 TAAATGTTTTACATTCTAIXAAGCnTCTÄTGTCTTCCAAAGTTGATATAAAAGCACrCAGTCAATCTGCAAnC 6525

6526 TCATrACTGAAAAGnAATCAArrrGTGCAATACAAGGAnAACAGTAAATCTGTAAAAATGAGCnAAAEGATC 6600 6601 ATTnCGGCTnCTnTGATGATCCGGTAGATTTAGTCATTCCTGCTAAATCATTnTAGACATTACnTACCAG 6675 6676 CTAAAGAIGCTAACAGAGCTAGľCATTATCCATTTCCAAAAACTCAGCCTACTCTGTTGAAATTTGAGGATGAGG 6750 6751 TGGATATAATGAACTCTCTTCAAAAACCAAG4AAAGTGTACGTTAGAGGTACGGATGGCAACTTATACCCATTCT 6825

6826 TGrGCAAACCCAAAGATGATCTTCGTAA&2ATGCTAGATrGATGGAATTTAATAATCTTATTTGTAAAATAnGA 6900

6901 GGAAAGATCAAGAAGCGAACAGAAGGAACľľíJTGTAn'AGAACnATGTTGTTATTCCrn'AAATGAAGAATGCG 6975 6976 GATnATCGAATGGGTAAATCArACľCGTCCArnAGAGAAATnTGnAAAAAGCTATAGACAGAAAAACAnC 7050 7051 CCATATCATATCAAGAAÄTCAAÄGTTGATTTAGACTimGCACTGCGAAGTCCTAACCCTGGTGATATATrTGAAA 7125 7126 AGAAMTCnACCGAAAnTCCTCCAGTTiTn'ATGAGTGuTTIGíTTGAATCTrTCCCAGAACCAAATM'n'GGG 7200

7201 nACTAGrAGACAAAACTATTGCCGAACTTľAGCAGTAATGTCAATAGTTGGCTACGTTTTGGGTrTGGGAGATC 7275

7276 GCCATGGCGAAAACATATTGTT7GATGAA.TTTACAGGTGAAGCTATCCATCTCGATTTCAACTGTCTTTTTGATA 7350 7351 AAGGTCTTACľrTTGAAAAACCTGAAAAGGTGCCGTTCAGAnAACTCATAATATGGTAGATGCAATGGGTCCGA 7425 7426 CAuGnA7GAAGGGGGnTCAGG.AAÄGCTA&CGAAATAACGATGCGGCTTCTTCGCTCAAACCAAGATACAnGA 7500 7501 TGAGCGTACTAGAGTCTTTCCTACATGATCCnTAGTCGAGTGGAATAGAAAGAAGTCGTCAAGCAAGTACCCGA 7575

7576 ATAATGAAGGAAATGAAGrrn'GGATATAATTCGCAWAA'íTTCAAGGCnTATGCCAGGGGAGACGATACCTT 7650

7651 TATCTAHGAAGGGCAAATTCAAGAATTGATCAAATCTGCTGTCAACCCAAAAAACCTGGTAGAAATGTACAnG 7725 7726 GnGGGCTGCTTA'mCTAGCA'iTTTACTAACAAAÄATrrCAATGAACAAGCTACCCATTAnAAACnATGAn 7800 7801 TGAATCGAAGATAmTAriTAnMTCCGATGAAGAAnCTCGCTG«3nGnCAATrTCTTGTAATTTrCCn 7875 7876 CCAnTCTAAATCGTCGATTCGCrrAAATAGGGCACTGGCTTľTTGTGCATTTrTCTCTCGTAAAGCAGCTTCTG 7950

7951 AnGAAÄAAAAGCTATATCTGTnCTGAGTCATCATCCGAATCAACAATATATTnGCAGATCGACCTGCAG 8022

Kurzívou: sekvenované Seatonom et al.

•nrubo: bázy vymazané /deletované/ v práci beaton et al./2499,2501,

2507, 2509/.

Podčiarknuté sú dve bázy oboch strán singl C inzertu /5918/5919/ /Seaton Set al./ /nesprávna báza nie je ukázaná, ale jeden zvyšok oboch strán je uk./.

Sekvencia ID nO. 4: rad5 proteín

HSOHAKRKAGSLOLSPRGlODRGAFGQLLKEVLALOKEHELGRSNSLPSMTSELVEVl.1 EVGLLAFKHDOSKSEF 75 76 ISPKKLK£AHLSLQALKLILi:RSFr/LREII35VTíL0HILPRTISlFADIRFIKlF0SLKEFHia.IYQlISEKS 150 151 FLWOLYASFftRYWKYYITNVSSIVLQITNATFPYKHPSPNSQPLQSlSPNYPlBREOKFDlll INIEEACTFFFE 225 226 SAHFFAQC5YLKKSNFPSPPlFTÄW?n'IKPCFŕNFVILLKRIS!G0S0LFLHLHSRIV0TLCCFSLNFIYHGLPI 300

301 CEKSKHILHSSINITLGSIKKTYTVANTAISLFFLSLFVIPKTVAGIFYPFGVSIISGFKVLEQLEPDSDLKKAI 375

375 ILFKCRYCSSEIDQTTLRAFGEICTGKLENTLFSNSEINIFLLHYLSLCNDISNIIKVOFQNGHNICTFAKUCIH 450 451 NNLOEPSNLKHFREMIOYYSSHNVTISEOOLKMFSLVLCTHVAKVNEKTNSIFRTYEVHGCEVCNSFCU.FDERS 525 526 PFKIPYHELFCAILKNPDIISSSVKOSLLLCGFFRWSCHCSNFHKESHLSLREFIHRALASTSRCIRVVAAXVLP 600

601 IFIKGPNŕiLDIVEFHKESKALIFNTLKILAVENTAILETVILSWISLSRWEEEELHFVLLEVISSVIHSGIFYO 675 676 Gl&J5ALQ3l/^fílil5WiL5PYUPlYSVMYCSHGKFPí/IASLFAQLľMSEGDFLIRTQArrLPFLVLTFN 750 751 FALIYRIAELSQSOYATLCLTN^ILASLLTlOHPNLEESVllLLUiLATSDFEKVOLTSLLRSOPISITVEi.LQ 825 826 L YQNOVPHEKIENAlJKVA'llYSQVYNOEOLSNKEU.WFFNNHILGllAEFSNlLNDlMXTSINEKÍKnVGI 900

901 EMLSLCGGAVKLGLPQILSNLQSAFQNEHLRFYAJKAHFSLIMTKEPEYSSIAGLSLVILPPLFPYLEPQEAE 975

976 LVlQlFDFlSSDTHFCltäLKUAIPTSLDSACFSLKAfólFCSLQNEDFYSELQSIJKCLTNENEPVCYLGLQEL 2050 1051 ELFFQAFYOELWrWLDISNEYLGQLLRCLLOCCYKYASTtttySYlMfflLGELGAlDPSRAKAQHIlKETVY 1125 1126 LDtíF£NGE£SUtFJLDFW)SQLIPAFLVTT0TM(XiFLAYALQ£FLKL6GFKSAVltM(KGLTVYTEHMSLPDL 1200 1201 SfflYLIPFLTSKYHLTPIPKlOIRYPJYFENVTIHnMQLFSLKLHEYAHSQHAEKIFGICSKVVKOQEVNJPCF 1275

1276 ĹLPFĹVLNVlLTESELEYRKVlEEFQLVlNQPGPOGU/SYGQQRYrSFYDVFFKIVDYLNFULRNRFFRíf^RRS 1350

1351 AlARKEHRWSVEOATSRESSISFVESFLSRFPSKTLGIVSLNCGfMRALFYUEQHIRRATAPYAALESQYRVL 1425 1426 QElYAGIODPDEIEAVSuiFfflYSFDQQLLLHENSGJlIDSALSCYEHlQtiOPEfMMlGLLRSHLQSGHYESL 1500 1501 VLSUlSFIINONHEYSKMLNLGIEASHRSLSIDSUKCLSKStlLESFEAKÍGSIFYQYLRKDSFAELTERLQPL Y 1575 1576 VOAATAIANľGAHSAYDCYDILSKLPAIMFSRIAEWGIVSONLDIVLRRRLSQVAPYGKFKHOlLSTHl.VGYE 1650

155J ΚΡΕΝΓΚΚΤΑΕ1ΥίΕΙΑ215^60ηΜΕΝΑ1ίΜΚ)ί^^ΕΑΤ1Ε^2_η^(Χ^ΜΙ5ΕυΐΕ5ίΝΗ^Ρβί 1725

1726 VDEHEERPFflRFETLGHPLFGKVFLFLTKULGKAG0LGLKDL£TYYHFAYElY5ZCEKYWYiQWYl)fíEEEQ 1800 1801 KLPVNEQSERFLSGELVTP.I INEFGR5LYYGTNHIYESHPKLLTLWLDFGAEELRLSKOQGEKYFREHI ISSRKK 1875 1876 SLELHNSNVCRL$MKlPQYFfLVALSQMlSRVCHP.WVYKlLEHIIANVVASYPGETLUQLHATIK5TSG:<RSL 1950 1951 RGKSILHVĽHSRKLSHSSKVDIKALSQSAILITEKLINLCNTRINSKSVKMSLKDHFRLSFOOPVOLVIPAKSFL 2025

2026 OITLPAKDAMRASHYPFPKTQPTLLKFEKVOIHNSLQKPRKVYVRGTDGHLYPFLCKPKDOLRKOARLNEFHNL 21C0

2101 ICKILRKDQEANRRNLCIRTYWIPLNEECGFIEMVNHTRPFREILLKSYRQKflIPISYQEIKVOLOFALRSPHP 2175 2176 GOIFEKKILPKFPPVFYEUFVESFPEPNNWVTSRQNYCRTLAVMSIVGYVLGLGDRHGENIIFDEFTGEAIHVOF 2250 2251 NCLFOKGLTFEKPEKVPFRLTHKHVOAKGPTGYEGGFRKASE ITMRLLRSNQOTLKSVLESFLHOPLVEHNRKKS 2325 2326 SSKYPNNEANEVLDIIRKKFQ3FKPGETIPLSIEGQIQELIKSAVNPXNLVEHYIGWAAYF 2386

Claims (17)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Polynukleotid v značne izolovanej forme,schopný selektívnej hybridizácie s Seq.ID No.l alebo jej komplementom.
2. 2. Polynukleotid podľa nároku 1, zahŕÉajúci Seq.ID No.l alebo jej časť.

   a
3. 3. Polynukleotidová sonda, ktorá zahŕňa časť aspoň 15 nukleotidov polynukleotidu podľa nárokov 1 a 2.
4. 4. Polynukleotid v značne izolovanej forme, zahŕňajúci Seq.ID No.3 alebo jej komplement.
5. 5. Polypeptid v značne izolovanej forme, zahŕňajúci buď sekvencie opísané v Seq ID Nos.2 alebo 4, alebo polypeptid značne homológny k týmto sekvenciám alebo časť polypeptidu Seq. ID No.2.
6. 6. Polynukleotid v značne izolovanej forme kódujúci polypeptid podľa nároku 5.
7. 7. Vektor nesúci polynukleotid definovaný v nárokoch 1,2 alebo

   Ϊ 6.
8. 8. Protilátky schopné viazať polypeptid Seq.ID.No.2 alebo jeho časť.
9. 9. Metóda detekcie prítomnosti či neprítomnosti polynukleotidu podľa nároku 1 vo vzorkách ľudských alebo živočíšnych tkanív. Metóda zahŕňa kontakt vzoriek ľudských alebo živočíšnych tkanív obsahujúcich DNA alebo RNA so sondou obsahujúcou poly57 nukleotid alebo primer podlá nároku 1 za hybridizačných podmienok a detekciu akéhokolvek duplexu vytvoreného medzi sondou a nukleovou kyselinou vo vzorke.
10. 10. Metóda detekcie polypeptidov podlá nároku 6 prítomných v biologických vzorkách. Metóda zahŕňa:

    a/ zaistenie protilátok podlá nároku 7 bú inkubáciu biologických vzoriek s vyššie uvedenými protilátkami za podmienok, ktoré dovolia tvorbu komplexu protilátka- antigén c/ určenie, či sa komplex protilátka-antigén zahŕňajúci vyššie uvedené protilátky vytvoril.
11. 11. Analytická metóda na plošné určovanie potencionálne vhodných látok na protirakovinovú terapiu. Metóda zahŕňa: a/ zaistenie polypeptidu opísaného vo vynáleze, ktorý si uchoval lipidkinázovú aktivitu a substrátu pre danú kinázu za podmienok a s takými reagenciami, že aktivita bude pôsobiť na daný substrát b/ kontakt uvedených polypeptidov substrátu a slubných látok c/ meranie stupňa zníženia kinázovej aktivity polypeptidu d/ selekciu vhodných látok, ktoré spôsobili zníženie aktivity
12. 12. Analytická metóda na plošné určovanie potencionálne vhodných látok na protirakovinovú terapiu. Metóda zahrňuje: a/ I. inkubáciu polypeptidu opísaného vo vynáleze s ďalším polypeptidom opísaným vo vynáleze, ktorý môže byt rovnaký alebo odlišný od prvého polypeptidu za podmienok, ktoré dovolujú prvému polypeptidu naviazať sa na druhý polypeptid a vytvoriť komplex

    II. kontakt takto vzniknutého komplexu s vhodnými látkami alebo a/ inkubáciu polypeptidu opísaného vo vynáleze s ďalším polypeptidom opísaným vo vználeze, ktorý môže byt rovnaký alebo odlišný od prvého polypeptidu za podmienok, ktoré dovoľujú prvému polypeptidu naviazať sa na druhý polypeptid a vytvoriť tak komplex za prítomnosti vhodnej látky b/ stanovenie, či vhodná látka inhibuje väzbu prvého polypeptidu na druhý polypeptid c/ selekciu vhodnej látky, ktorá polypeptidu na druhý polypeptid.

    inhibuje väzbu prvého
13. 13. Metóda podľa nároku 12 , pri ktorej môže byt prvý uvedený polypeptid odlíšený od druhého uvedeného polypeptidu.
14. 14. Metóda liečenia rakoviny u pacientov, ktorá zahrňuje aplikáciu terapeuticky efektívnych množstiev sľubných látok selektovaných metódou akéhokoľvek z nárokov 11 až 13 vyššie uvedeným pacientom.
15. 15. Metóda zvýšenia citlivosti rakovinových buniek pacienta na chemoterapiu alebo rádioterapiu. Táto metóda zahŕňa aplikáciu terapeuticky efektívnych množstiev sľubných látok selektovaných metódou akéhokoľvek z nárokov 11 až 13 vyššie uvedeným pacientom.

    r*
16. 16. Použitie potencionálne vhodných látok selektovaných metódou podľa akéhokoľvek z nárokov 11 až 13 na liečenie rakoviny.
17. 17. Použitie potencionálne vhodných látok selektovaných metódou podľa akéhokoľvek z nárokov 11 až 13 na zvýšenie citlivosti rakovinových buniek ku chemoterapii alebo rádioterapii.