CN105916976A - 碳水化合物富集的重组微生物 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及经过改造而用于增强所需碳水化合物的生产的重组微生物，以及尤其可用作动物饲料成分的相关生物质和组合物。本公开还提供相关方法。

Description

碳水化合物富集的重组微生物
序列表参考
与此同时根据37C.F.R.§1.821以计算机可读形式(CRF)通过EFS-Web作为文件名200206_416WO_SEQUENCE_LISTING.txt以电子方式提交的“序列表”以引用的方式并入本文。序列表的电子副本创建于2015年1月16日，并且占用磁盘大小为277千字节。
发明领域
本公开涉及新型重组C1代谢微生物以及相关组合物和方法，该新型重组C1代谢微生物包含用于增强碳水化合物生产的经过改造的代谢途径。
背景
动物饲料利用中效率的提高已在过去数十年中通过使用饲料添加剂得以实现。这些添加的物质增加动物饲料组合物的营养含量、能含量和/或抗病性质。对商业动物生产商日益严峻的挑战是谷物成本的上涨。成本上涨部分归因于对用于生物燃料和人类食品使用的谷物的竞争性需求。随着谷物和蛋白组分成本上涨，加上可用于饲料生产的土地有限，具有有益的营养和抗病性质的可替代的低成本动物饲料产品将是非常理想的。
发明概要
在一个实施方案中，本公开提供一种重组C1代谢微生物，其包含选自由以下组成的组的外源性核酸：编码碳水化合物生物合成酶的外源性核酸，和编码可操作地连接至编码天然碳水化合物生物合成酶的核酸的表达控制序列的核酸，其中所述重组C1代谢微生物能够将天然气来源的碳原料转化成所需碳水化合物。通常，天然气来源的碳原料是天然气或甲烷。
在另一个实施方案中，本公开提供一种来源于本公开的重组C1代谢微生物的生物质。
在又一个实施方案中，本公开提供一种包含从本公开的生物质提取的碳水化合物的碳水化合物组合物，其中所述组合物展现出小于-30‰的δ13C。
在再一个实施方案中，本公开提供一种包含本公开的生物质的动物饲料。
在另一个实施方案中，本公开提供一种包含本公开的生物质或组合物的培养基或发酵培养基。
本公开还提供相关方法。
详述
本公开提供具有利用相对低成本的碳原料作为能源的能力的新型重组C1代谢微生物以及相关生物质、组合物和方法。本公开的重组微生物经过改造用于商业上可取的某些碳水化合物的增强的生产。这些重组微生物以及来源于它们的生物质和碳水化合物组合物用作动物(例如像，家畜、鱼类、家禽等)以及培养微生物或发酵微生物的营养来源。
在一个实施方案中，本公开提供一种重组C1代谢微生物，其中所述重组C1代谢微生物包含选自由以下组成的组的外源性核酸：编码碳水化合物生物合成酶的外源性核酸，和编码可操作地连接至编码天然碳水化合物生物合成酶的核酸的表达控制序列的核酸，其中所述重组C1代谢微生物能够将天然气碳原料转化成碳水化合物。如本文所更加详细地描述的，当这些重组微生物在天然气来源的C1基质存在下培养时，它们通常展现出小于-30‰的δ13C，并且常常小于-40‰。通产，重组微生物为非光合C1代谢微生物。
在这些实施方案中，本公开的重组微生物经过改造以将天然气来源的原料转化成更有价值的碳水化合物，与更昂贵的碳水化合物相比，天然气来源的原料成本相对较低并且资源丰富(例如，天然气或C1基质，诸如来自天然气的甲烷)。如本文所用，术语“天然气来源的原料”是指天然气或从天然气分离的任何组分(包括C1基质)或由天然气转化的任何组分(即，合成气)。
术语“天然气”在本文是指可通过常规方法(例如，多孔储层的钻孔和注水法)或非常规方法(例如，具有低透气性的地层的水力压裂、水平钻孔或定向钻孔)获得的天然存在的气体混合物。气体混合物由甲烷和其他化合物(包括其他C1化合物)以及其他低碳烷烃气体(例如像，乙烷、丙烷、丁烷、戊烷等)、二氧化碳、氮气、硫化氢等及其组合组成。非常规天然气可获自例如像以下的来源：致密砂岩气，其形成于砂岩或碳酸盐岩中；煤层甲烷，其形成于煤藏中并吸附于煤炭颗粒中；页岩气，其形成于细粒度页岩中并吸附于粘土颗粒中或保留于小空隙或微裂缝内；甲烷水合物，其是在低温和高压下在诸如海洋下和永久冻土的地点中形成的天然气和水的结晶组合。
如本文使用，术语“C1基质”或“C1化合物”是指缺少碳-碳键的任何含碳分子或组合物。示例性C1基质包括合成气、甲烷、甲醇、甲醛、甲酸或其盐、一氧化碳、二氧化碳、甲基化胺类(例如，甲胺、二甲胺、三甲胺等)、甲基化硫醇类、甲基卤素(例如，溴甲烷、氯甲烷、碘代甲烷、二氯甲烷等)、氰化物或其任何组合。
在本公开的某些实施方案中，天然气来源的原料可为天然气、来自天然气的C1基质或合成气。通常，C1基质为甲烷。已利用天然气来源的碳基质作为原料的示例性重组C1代谢微生物展现出不同的同位素碳标记，这在本文中进行了更加详细的描述。这种显著的同位素碳标记还通过此类重组微生物的组合物和产物(例如，生物质、碳水化合物组合物等)来展现。
在另一个实施方案中，本公开提供一种包含编码碳水化合物生物合成酶的外源性核酸的重组C1代谢微生物，其中所述C1代谢微生物能够将甲烷转化成碳水化合物。示例性碳水化合物为葡聚糖。在一些实施方案中，碳水化合物为β-(1,3)-葡聚糖，并且可为支化或非支化的或其组合。通常，C1代谢微生物为非光合C1代谢微生物。
如本文使用，“C1代谢微生物”或“C1代谢非光合微生物”是指具有使用C1基质作为能量来源或作为其主要的能量和生物质来源的能力，并且可或可不使用其他碳基质(诸如糖和复杂碳水化合物)获得能量和生物质的任何微生物。例如，C1代谢微生物可氧化C1基质，诸如甲烷或甲醇。C1代谢微生物包括细菌(诸如甲烷氧化菌和甲基营养菌)和酵母。在某些实施方案中，C1代谢微生物不包括光合微生物，诸如藻类。在一些实施方案中，C1代谢微生物将为“专性C1代谢微生物”，意指其唯一的能量来源为C1基质。在其他实施方案中，C1代谢微生物(例如，甲烷氧化菌)将在C1基质原料存在下培养(即，使用C1基质作为能量来源)。
本公开的重组C1代谢微生物经过改造而用于所需碳水化合物的增强的生产，并且在一个实施方案中，包含编码碳水化合物生物合成(CB)酶的外源性核酸。术语“碳水化合物生物合成酶”和“CB酶”在本文可互换地使用以指涉及通过重组宿主C1代谢微生物进行的碳水化合物的生产的酶。
编码用于本公开的实践中的CB酶的外源性核酸通常经过密码子优化以在重组宿主C1代谢微生物中最佳表达，并且编码原生自与所述宿主C1微生物异源的物种或者作为存在于自然界中的酶的突变体(即，变体)的酶。
如本文所用，术语“碳水化合物”是指单糖、二糖或多糖。用于本公开的实践中的适合的外源性核酸包括编码涉及单糖，例如像葡萄糖、果糖、核糖、甘油醛、半乳糖等；二糖，例如像乳糖、蔗糖、麦芽糖、纤维二糖(cellulobiose)等及其混合物；或多糖，包括例如非支化或支化的葡聚糖等及其混合物的生产的酶的那些外源性核酸。实例性葡聚糖包括α-葡聚糖，例如像右旋糖酐、糖原、支链淀粉、淀粉等以及β-葡聚糖，例如像β-1,4-葡聚糖(即，纤维素)、β-1,3-葡聚糖、β-(1,3)(1,4)-葡聚糖、β-(l,3)(l,6)-葡聚糖等及其混合物。
在具体实施方案中，CB酶是涉及非支化或支化的葡聚糖或其混合物的生产的酶。已知β-葡聚糖具有有益的治疗性质，包括作为强力的免疫兴奋剂以及良性和恶性肿瘤的强力拮抗剂。还已知β-葡聚糖降低胆固醇和甘油三酸酯水平。参见，D.Akramiené等,Medicina(kaunas),2007；43(8):597。β-葡聚糖是由具有β-(1,3)和/或β-(1,4)和/或β-(1,6)键的β-D-吡喃葡萄糖基单位构成的葡萄糖聚合物的异质组。它们已从数个来源中分离，所述来源包括植物(燕麦、大麦、麸皮、海藻、玉米、大豆等)、细菌(例如，卡氏肺孢菌(Pneumocystis carinii)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、烟曲霉菌(Aspergillusfumigatus)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、白色念珠菌(Candida albicans)等)以及真菌(即，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和蘑菇，例如像香菇(shiitake)(香菇(Lentinus edodes))、灰树花(maitake)(灰树花(Grifola frondosa))、裂裥菌素(裂褶菌(Schizophillum commune)和SSG(核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum))。自1980年以来在日本来自香菇和裂褶菌的β-葡聚糖提取物已用于治疗癌症。同上。
适用于本公开的实践中的外源性核酸包括编码涉及糖异生、糖原生成、α-或β-葡聚糖生物合成和已知产生碳水化合物的其他代谢途径的酶的那些外源性核酸。
适合的外源性核酸包括编码选自由以下组成的组的糖异生酶的那些外源性核酸：丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、烯醇化酶、磷酸甘油酸变位酶、磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、A型醛缩酶、果糖1,6-二磷酸酶、磷酸果糖激酶、磷酸葡糖异构酶、己糖激酶、葡糖-6-磷酸等。
其他适合的外源性核酸包括编码选自由以下组成的组的糖原生成酶的那些外源性核酸：葡糖-1-磷酸腺苷酰基转移酶、糖原合成酶等。
上述酶类可见于数个异源性物种中，包括微生物(例如像细菌和酵母，包括例如大肠杆菌(E.coli)、谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)、酿酒酵母等)以及高级真菌(诸如，蘑菇等)以及藻类和植物。
适合的外源性核酸包括编码葡聚糖生物合成酶(例如像葡聚糖合酶)的那些外源性核酸。示例性葡聚糖合酶为β-1,3-葡聚糖合酶。所述外源性核酸可编码来自以下物种的葡聚糖生物合成酶(例如，葡聚糖合酶(例如像β-1,3-葡聚糖合酶))：植物(燕麦、大麦、麸皮、海藻、玉米、大豆等)、细菌(例如，卡氏肺孢菌、新型隐球菌、烟曲霉菌、荚膜组织胞浆菌、白色念珠菌等)或真菌(即，酿酒酵母和蘑菇，例如像香菇(香菇(Lentinus edodes))、灰树花(灰树花(Grifola frondosa))、裂裥菌素(裂褶菌(Schizophillum commune)和SSG(核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum))。数个β-(1,3)-葡聚糖合酶的氨基酸和核酸序列是已知的。参见，例如，美国专利号5,194,600、WO99/49047和EP 0 724 644 B 1，这些专利均以引用方式并入本文。在某些具体实施方案中，外源性核酸编码具有在下文表A中示出的以下任何SEQ NO的氨基酸序列的碳水化合物生物合成酶：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36或38。如上所述，外源性核酸通常经过密码子优化以在重组C1微生物中最佳表达。表A还提供了编码这些CB酶的示例性核酸序列。这些核酸序列已经过密码子优化以在荚膜甲基球菌(Methylococcus capsulatus)Bath中表达。
表A：示例性碳水化合物生物合成酶
用于本公开的实践中的适合的外源性核酸包括编码变体CB酶序列的那些外源性核酸，所述变体CB酶序列与参照或亲本野生型多肽序列(例如像，对应于以下SEQ ID NO中的任何一个的参照序列：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36或38)至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同，条件是所述变体保留目标碳水化合物生物合成酶活力。在某些实施方案中，CB酶变体多肽将包括在预定位点处相对于参照或亲本野生型CB酶的至少一个氨基酸置换(例如，1、2、3、5、6、7、8、9或10或更多或多达20、25或30个置换)，条件是变体保留目标CB酶活力。CB酶变体多肽还可包含一个或多个保守置换。“保守置换”在本领域公认为一个氨基酸对具有相似性质的另一个氨基酸的置换。示例性保守置换为本领域所熟知(参见，例如，WO 97/09433,第10页；Lehninger,Biochemistry,第2版；Worth Publishers,Inc.NY:NY(1975),第71-77页；Lewin,Genes IV,Oxford University Press,NY and Cell Press,Cambridge,MA(1990),第8页,这些文献均以引用方式并入本文)。用于产生编码此类变体酶的适合的外源性核酸的方法在本文进行了更加详细的描述。
两个或更多个核酸或氨基酸序列之间的“同一性百分比”是序列共有的相同位点的数量的函数(即，同一性％＝相同位点的数量/位点的总数x 100)，考虑了为优化两个或更多个序列的比对而需要引入的缺口数和各缺口的长度。两个或更多个序列之间的序列比较和同一性百分比的测定可使用数学算法诸如默认参数的BLAST和GappedBLAST程序来完成(例如，Altschul等,J.Mol.Biol.215:403,1990；还参见，BLASTN于万维网ncbi.nlm.nih.gov/BLAST,这些文献均以引用方式并入本文)。
如上所指出，编码用于本公开的实践中的CB酶的外源性核酸可经过密码子优化以在C1代谢微生物中表达。原始宿主之外的重组蛋白的表达可能较为困难。例如，已在不同种类的细菌之间观察到密码子使用偏好性的变化(Sharp等,Nucl.Acids.Res.33:1141,2005,其以引用方式并入本文)。甚至天然宿主之内的重组蛋白的过表达也可能较为困难。在某些实施方案中，将要引入至如本文所述的宿主中的核酸可在引入宿主细胞中之前进行密码子优化以确保蛋白质表达有效或增强。密码子优化是指在转化之前改变基因或核酸的编码区中的密码子以反映宿主的代表性密码子使用，而没有改变由非天然DNA分子编码的多肽。用于异源宿主中最适基因表达的密码子优化方法先前已有所描述(参见，例如，Welch等,PLoS One 4:e7002,2009；Gustafsson等,Trends Biotechnol.22:346,2004；Wu等,Nucl.Acids Res.35:D76,2007；Villalobos等,BMC Bioinformatics 7:285,2006；美国专利公布号2011/0111413和2008/0292918；这些文献方法的公开以引用方式整体并入本文)。编码适用于本公开的实践中的CB酶的外源性核酸包括具有与选自由以下SEQ ID NO组成的组的核酸参照序列至少约85％相同的核酸序列的那些外源性核酸：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35和37。在一些实施方案中，编码CB酶的外源性核酸具有与选自由以下SEQ ID NO组成的组的核酸参照序列至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％以及至少约99％序列相同的核酸序列：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35和37。编码适用于本发明实践中的CB酶的例证性外源性核酸包括已经过密码子优化以在荚膜甲基球菌Bath中最佳表达的序列，例如像以下SEQID NO中的任何一个：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35和37。
类似地，编码多肽变体的本公开的外源性核酸分子可使用以上提到的参考文献中描述的基于系统发育的方法来设计(美国专利号8,005,620；Gustafsson等；Welch等；Villalobos等；Minshull等，这些文献均以引用方式并入本文)。
编码碳水化合物生物合成酶的外源性核酸包括了编码具有或保留相应碳水化合物生物合成酶活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的多核苷酸。通过计算多肽将底物转化成产物的能力来确定多肽是否具有特定活性的方法是本领域已知的。
在一些实施方案中，外源性核酸编码可操作地连接至编码天然碳水化合物生物合成酶的核酸的表达控制序列。通常，表达控制序列是导致天然碳水化合物生物合成酶的过表达的一种序列。如本文所用，当提及基因或蛋白质时“过表达的”和“过表达”意指基因或蛋白质的表达或活性的增加。增加的表达或活性包括经过增加而高于野生型(天然的或非基因工程改造的)对照或参照微生物的水平的基因或蛋白质的表达或活性。如果在微生物中表达或活性是非正常表达或是活跃的，则基因或蛋白质是过表达的。如果在重组微生物中比在野生型对照或参照微生物中表达或活性延长或存在更久，则基因或蛋白质是过表达的。
除上文描述的外源性核酸之外，本公开的重组C1代谢微生物还可包含增强所需碳水化合物生产的其他遗传修饰。例如，当外源性核酸编码碳水化合物生物合成酶时，重组C1代谢微生物还可包含可操作地连接至编码碳水化合物生物合成酶的外源性核酸以增强所需碳水化合物生产的外源性表达控制序列。适用于本公开的实践中的表达控制序列在本文进行了更加详细的描述。
另选地或另外，本公开的重组C1代谢微生物还可包含可操作地连接至编码内源酶的内源性核酸的外源性表达控制序列，内源酶利用碳水化合物生物合成酶利用的相同底物中的一种或多种或者利用所需碳水化合物作为底物(即，“竞争性”内源酶)。这可用来下调竞争性内源酶。
在一些实施方案中，期望通过使竞争性内源酶突变来减少或抑制所述竞争性内源酶活性以使其活性缺失或减弱。如本文所用的“抑制”或“抑制的”是指靶基因表达或相对于对照、内源性或参照分子的靶分子活性的直接或间接的改变、减少、下调、废除或缺失，其中该改变、减少、下调或废除是统计学上、生物学上、工业上或临床上显著的。
用于使C1代谢微生物中的内源性基因功能下调、失活、敲除或缺失的各种方法是本领域已知的。例如，靶向的基因破坏是用于基因下调的有效方法，其中将外源性多核苷酸插入至结构基因中以破坏转录。包含侧接具有与将破坏的靶宿主基因的一部分高度同源性的序列的外源性插入DNA(例如，遗传标记)的基因盒被引入至宿主C1代谢微生物中。外源性DNA通过天然DNA复制机制破坏靶宿主基因。等位基因交换构建C1代谢微生物(包括甲烷氧化菌)的缺失/插入突变株已在例如Toyama和Lidstrom,Microbiol.144:183,1998；Stoylar等,Microbiol.145:1235,1999；Ali等,Microbiol.152:2931,2006；Van Dien等,Microbiol.149:601,2003；Martin和Murrell,FEMS Microbiol.Lett.127:243,2006中有所描述，这些文献均以引用方式并入本文。
例如，在本公开的一些实施方案中，重组C1代谢微生物还可包含内源性糖原合成酶活性和/或内源性葡糖磷酸变位酶活性的缺失。还可靶向下调涉及其他途径诸如氨基酸合成途径的酶以使宿主微生物的代谢活性集中于碳水化合物生物合成上。
重组C1代谢微生物因此可经过改造以具有生产提高的水平的所需碳水化合物的能力。在这些实施方案中的一些中，当在天然气来源的原料(例如，天然气、甲烷等)存在下在至少一组培养条件下培养时，培养重组C1代谢微生物产生大于天然C1代谢微生物所产生的水平至少约10％并且多达天然C1代谢微生物所产生的水平约2倍至约3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍以及多达约500倍或约1000倍的水平的所需碳水化合物。在其他实施方案中，当在天然气来源的原料存在下在至少一组培养条件下培养时，重组C1代谢微生物产生大于天然C1代谢微生物所产生的水平至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％并且多达天然C1代谢微生物所产生的水平约2倍至约3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍至约500倍或约1000倍的水平的所需碳水化合物。通常，当在天然气来源的原料存在下在至少一组培养条件下培养时，本发明的重组C1代谢微生物所产生的所需碳水化合物产品的提高的水平是天然C1代谢微生物所产生的水平的至少约2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍。
用于外源性核酸在微生物生物体中表达的重组方法是本领域所熟知的。此类方法可见于例如Sambrook等,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第三版,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(2001)；以及Ausubel等,Current Protocols in Molecular Biology,JohnWiley和Sons,Baltimore,MD(1999)中有所描述，这些文献均以引用方式并入本文。编码酶或其功能片段的核酸分子的遗传修饰可向从天然存在状态改变的重组细胞赋予生化或代谢能力。
如本文所用，当提及核酸、多肽(诸如酶)、化合物或活性时术语“内源性”和“天然”是指正常存在于宿主细胞中的核酸、多肽、化合物或活性。术语“同源的”或“同系物”是指来自分子或活性与存在于或来源于宿主细胞(种或品系)的分子或活性相同或相似的外源性(非天然)来源的分子或活性。
如本文使用，当提及核酸分子、构建体或序列时术语“外源性”是指并非原生自细胞的核酸分子或核酸分子序列的一部分(所述核酸分子或核酸分子序列的一部分在所述细胞中表达)、原生自已改变或突变的宿主细胞的核酸分子或核酸分子的一部分或与相似条件下的天然表达水平相比具有改变的表达的核酸分子。例如，外源控制序列(例如，启动子、增强子)可用来以不同于在自然界或培养物中正常表达的基因或核酸分子的方式调控基因或核酸分子的表达。在某些实施方案中，外源性核酸分子可与天然宿主细胞基因同源，但可具有改变的表达水平或具有不同的序列或两者。在其他实施方案中，外源性核酸分子对于宿主细胞或宿主基因组来说可能不是内源的，但反而可能已通过接合、转化、转染、电穿孔等添加至宿主细胞中，其中添加的分子可整合至宿主基因组中或可作为染色体外遗传物质(例如，质粒或其他自主复制型载体)而存在。
在某些实施方案中，多于一种的外源性核酸分子可引入至宿主细胞中作为单独核酸分子、作为多顺反子核酸分子、作为编码融合蛋白的单一核酸分子或其任何组合，并且仍视为多于一种的外源性核酸。例如，可修饰C1代谢微生物以表达两种或更多种外源性核酸分子，所述外源性核酸分子可能相同或不同，编码一种或多种如本文所公开的碳水化合物生物合成酶。在某些实施方案中，编码碳水化合物生物合成酶的多核苷酸分子的多个拷贝被引入至宿主细胞中，所述多个拷贝可以是编码相同碳水化合物生物合成酶或不同碳水化合物生物合成酶的多核苷酸的两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个拷贝。
宿主细胞以及转化方法
在实施本发明的实践的过程中，上文描述的外源性核酸被转化至宿主细胞中，该宿主细胞为C1代谢微生物。使用的C1代谢微生物可以是天然适应菌株(例如，进行发酵以选择与亲本菌株相比具有提高的生长速率和增加的总生物质产量的菌株)或者被重组修饰以产生或过表达目标碳水化合物生物合成酶和/或具有增加的生长速率。通常，C1代谢微生物是非光合C1微生物(例如，并非藻类或植物)。
在某些实施方案中，本公开使用C1代谢微生物，该C1代谢微生物为原核生物或细菌，诸如甲基单胞菌属(Methylomonas)、甲基细菌属(Methylobacter)、甲基球菌属(Methylococcus)、甲基弯曲菌属(Methylosinus)、甲基孢囊菌属(Methylocystis)、甲基微菌属(Methylomicrobium)、甲烷单胞菌属(Methanomonas)、嗜甲基菌属(Methylophilus)、甲基菌属(Methylobacillus)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、生丝微菌属(Hyphomicrobium)、黄色杆菌属(Xanthobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、副球菌属(Paracoccus)、诺卡氏菌属(Nocardia)、节杆菌属(Arthrobacter)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)或假单胞菌属(Pseudomonas)。
在其他实施方案中，使用的C1代谢细菌为甲烷氧化菌或甲基营养菌。示例性甲烷氧化菌包括甲基单胞菌属、甲基细菌属、甲基球菌属、甲基弯曲菌属、甲基孢囊菌属、甲基微菌属、甲烷单胞菌属、甲基胞菌属(Methylocella)或其组合。示例性甲基营养菌包括扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、耐辐射甲基杆菌(Methylobacteriumradiotolerans)、杨树甲基杆菌(Methylobacterium populi)、氯甲烷甲基杆菌(Methylobacterium chloromethanicum)、结瘤甲基杆菌(Methylobacterium nodulans)或其组合。如本文所用，术语“甲基营养菌”是指能够氧化含有至少一个碳并且不含碳-碳键的任何形式(例如，固体、液体、气体)的任何化合物的任何细菌。在某些实施方案中，甲基营养菌可为甲烷氧化菌。例如，“甲烷氧化菌”是指具有氧化甲烷作为碳和能量来源(其可能是主要的碳和能量来源)的能力的任何甲基营养菌。示例性甲烷氧化菌包括甲基单胞菌属、甲基细菌属、甲基球菌属、甲基弯曲菌属、甲基孢囊菌属、甲基微菌属或甲烷单胞菌属。
甲烷氧化菌基于它们的碳同化途径和内膜结构而分为三组：I型(γ变形菌门)、II型(α变形菌门)和X型(γ变形菌门)。I型甲烷氧化菌利用核酮糖单磷酸(RuMP)途径进行碳同化，而II型甲烷氧化菌利用丝氨酸途径。X型甲烷氧化菌利用RuMP途径，但还表达低水平的丝氨酸途径的酶。用于本发明的实践中的甲烷氧化菌包括专性甲烷氧化菌，其只可利用C1基质作为碳和能量来源；以及兼性甲烷氧化菌，其天然具有利用一些多碳基质作为碳和能量来源的能力。
用于本发明的实践中的示例性兼性甲烷氧化菌包括甲基胞菌属、甲基孢囊菌属和甲基荚膜菌属(Methylocapsa)的一些种(例如，森林甲基胞菌(Methylocella silvestris)、沼泽甲基胞菌(Methylocella palustris)、冻原甲基胞菌(Methylocella tundrae)、道氏甲基孢囊菌菌株SB2(Methylocystis daltona strain SB2)、苔藓甲基孢囊菌(Methylocystisbryophila)和金色甲基荚膜菌KYG(Methylocapsa aurea KYG))、嗜有机甲基杆菌(Methylobacterium organophilum)(ATCC 27,886)、嗜油甲基菌(Methylibium petroleiphilum)或其高生长变体。用于本发明的实践中的示例性专性甲烷氧化菌包括荚膜甲基球菌Bath(NCIMB 11132)、甲基单胞菌属16a(Methylomonas sp.16a)(ATCC PTA 2402)、发孢甲基弯曲菌OB3b(Methylosinus trichosporium OB3b)(NRRL B-11,196)、生孢甲基弯曲菌(Methylosinus sporium)(NRRL B-11,197)、小甲基孢囊菌(Methylocystis parvus)(NRRL B-11,198)、甲烷甲基单胞菌(Methylomonas methanica)(NRRL B-11,199)、白色甲基单胞菌(Methylomonas albus)(NRRL B-11,200)、荚膜甲基细菌Y(Methylobacter capsulatus Y)(NRRL B-11,201)、鞭毛甲基单胞菌属AJ-3670(Methylomonas flagellata sp.AJ-3670)(FERM P-2400)、极端嗜酸甲烷氧化菌(Methylacidiphilum infernorum)、Methylacidiphilumfumariolicum、嗜喊甲基微菌(Methylomicrobium alcaliphilum)、Methyloacida kamchatkensis或其高生长变体。
用于本发明的实践中的适合的C1代谢微生物包括合成气代谢细菌，例如像梭菌属(Clostridium)、穆尔氏菌属(Moorella)、火球菌属(Pyrococcus)、真杆菌属(Eubacterium)、脱硫杆菌属(Desulfobacterium)、一氧化碳嗜热菌属(Carboxydothermus)、产醋菌属(Acetogenium)、醋酸杆菌属(Acetobacterium)、厌氧醋菌属(Acetoanaerobium)、丁酸杆菌属(Butyribaceterium)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)等。示例性合成气代谢细菌包括自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)、杨氏梭菌(Clostridium ljungdahli)、拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei)、嗜羧基梭菌(Clostridium carboxydivorans)、食甲基丁酸杆菌(Butyribacteriummethylotrophicum)、伍氏梭菌(Clostridium woodii)、新产丙醇梭菌(Clostridium neopropanologen)等。
用于本发明的实践中的其他适合的C1代谢微生物包括真核生物，例如像酵母，包括假丝酵母属(Candida)、亚罗酵母属(Yarrowia)、汉逊酵母属(Hansenula)、毕赤酵母属(Pichia)、球拟酵母属(Torulopsis)、红酵母属(Rhodotorula)等。
用可帮助生长的异源生物体，本公开的每种微生物均可作为分离培养物而生长，或者这些微生物中的一种或多种可组合以产生混合培养物。当提及微生物时术语“异源的”是指与宿主细胞不同的种类。在其他实施方案中，本公开的C1代谢非光合微生物为专性C1代谢非光合微生物，诸如专性甲烷氧化菌或甲基营养菌。
前述C1代谢微生物中的任何一种均可用作亲本或参照宿主细胞以制备本公开的重组C1代谢微生物。如本文使用，术语“重组体”是指具有至少一种遗传改变或已通过引入外源性核酸分子来修饰的非天然存在的生物体、微生物、细胞、核酸分子或载体，或者是指已被改变以使得内源性核酸分子或基因的表达可受控制的细胞。重组体还指从具有一种或多种此类修饰的细胞衍生或者作为具有一种或多种此类修饰的细胞的子代的细胞。遗传改变包括例如引入编码蛋白质或酶的可表达的核酸分子的修饰或其他核酸分子添加、缺失、置换或细胞遗传物质的其他功能的改变。例如，重组细胞可表达并非以相同形式存在于天然细胞(即，未修饰或野生型细胞)中的基因或其他核酸分子，或者可提供改变的表达模式的内源性基因，即否则可过表达、欠表达、最低限度地表达或根本不表达的此类基因。
本文描述的任何重组C1代谢微生物或甲烷氧化菌均可转化以包含至少一种外源性核酸来提供具有新的或增强的活性(例如，酶活性)的宿主，或者可使用本领域已知的任何各种方法进行遗传修饰以移除或基本减少内源性基因功能。
转化是指将核酸分子(例如，外源性核酸分子)引入至宿主细胞中。转化的宿主细胞可以染色体外的方式携带外源性核酸分子或者整合至染色体中。整合至宿主细胞基因组和自主复制型载体通常引起所转化的核酸分子的遗传学上稳定的遗传。含有转化的核酸分子的宿主细胞被称为“非天然存在的”或“基因工程改造的”或“重组的”或“转化的”或“转基因的”细胞(例如，细菌)。
用于外源性核酸在C1代谢微生物(例如，甲烷氧化菌)中的表达的表达系统和表达载体是已知的。
C1代谢细菌的电穿孔在本文有所描述，并且先前已在例如Toyama等,FEMS Microbiol.Lett.166:1,1998；Kim和Wood,Appl.Microbiol.Biotechnol.48:105,1997；Yoshida等,Biotechnol.Lett.23:787,2001以及美国专利申请公布号2008/0026005中有所描述。
细菌接合，是指涉及供体细胞和受体细胞的直接接触的特定类型的转化，更加常用于将核酸分子转移至C1代谢细菌中。细菌接合涉及将“供体”细胞和“受体”细胞以彼此紧密接触的方式混合在一起。接合通过形成供体细菌与受体细菌之间的胞质联丝，随着新合成的供体核酸分子单向转移至受体细胞中而发生。接合反应中的受体是可通过水平转移从供体细菌接受核酸的任何细胞。接合反应中的供体是含有接合质粒、接合转座子或转移质粒(mobilized plasmid)的细菌。供体质粒的物理转移可通过自主转移质粒或借助于“辅助”质粒而发生。涉及C1代谢细菌的接合在本文有所描述，并且先前已在Stolyar等,Mikrobiologiya 64:686,1995；Motoyama等,Appl.Micro.Biotech.42:67,1994；Lloyd等,Arch.Microbiol.171:364,1999；PCT公布号WO02/18617；以及Ali等,Microbiol.152:2931,2006中有所描述。
适用于本发明的实践中的表达控制序列包括例如启动子、终止子、增强子、阻遏物、诱导物等。适用于本发明的实践中的启动子可为组成型、渗漏型(leaky)或诱导型，并且原生自或非原生自所用的宿主细胞。示例性启动子包括丙酮酸脱羧酶(PDC)启动子、磷酸脱氧木酮糖合成酶启动子、甲醇脱氢酶启动子(MDH)(例如像，来自荚膜甲基球菌Bath(登录号MCA0779)的mxaF基因的上游基因间区中的启动子或来自M.extorquens的MDH启动子(参见，Springer等,FEMSMicrobiol.Lett.160:119(1998))、6-磷酸己酮糖合成酶启动子、核糖体蛋白S16启动子、丝氨酸羟甲基转移酶启动子、丝氨酸乙醛酸氨基转移酶启动子、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶启动子、T5启动子、Trc启动子、用于PHA合成的启动子(Foellner等,Appl.Microbiol.Biotechnol.40:284,1993)、丙酮酸脱羧酶启动子(Tokuhiro等,Appl.Biochem.Biotechnol.131:795,2006)、乳糖操纵子Plac启动子(Toyama等,Microbiol.143:595,1997)、杂合启动子诸如Ptrc(Brosius等,Gene27:161,1984)、从甲基营养菌(EP 296484)、甲烷氧化菌中的天然质粒鉴定出的启动子等。
此外，可利用用于外源性核酸分子的高表达的适合的同源性或异源性启动子。例如，美国专利号7,098,005描述了用于在甲烷或甲醇存在下C1代谢细菌中的异源性编码核酸的高表达的启动子的使用。
在某些实施方案中，期望使编码碳水化合物生物合成酶的外源性核酸的调控型表达优化非天然存在的C1代谢微生物的生长速率并且可在各种碳源条件下改善细菌生长。这可通过使用诱导型启动子系统来实现。
在某些实施方案中，编码CB酶的核酸可操作地连接至诱导型启动子。用于本发明的实践中的诱导型启动子系统包括本领域已知的那些，并且包括四环素诱导型启动子系统；IPTG/lac操纵子诱导型启动子系统、热休克诱导型启动子系统；金属应答启动子系统；硝酸盐诱导型启动子系统；光诱导型启动子系统；蜕皮激素诱导型启动子系统、所描述的用于甲基营养菌和甲烷氧化菌的诱导型/调控型系统(参见，例如，美国专利申请号US 2010/0221813,其以引用方式并入本文)等。例如，在一个实施方案中，非天然存在的C1代谢微生物(例如，甲烷氧化菌、甲基营养菌)包含：(1)编码CB酶，可操作地连接至侧接lacO操纵子序列的操纵子的外源性核酸；以及(2)编码lacI阻遏蛋白，可操作地连接至组成型启动子(例如，6-磷酸己酮糖合成酶启动子)的外源性核酸。诱导在LacI阻遏蛋白结合至侧接LDH或其他启动子的lacO操纵子序列时启动，阻止转录。IPTG结合lacI阻遏物并将其从lacO序列中释放，允许转录。通过使用诱导型启动子系统，可通过添加诱导物来控制乳酸盐合成。
用于本发明的实践中的表达系统和表达载体任选地含有遗传因子，例如像一个或多个用于翻译起始的核糖体结合位点和转录终止位点、多腺苷酸化信号、限制性内切酶位点、多克隆位点、其他编码段等。在某些实施方案中，启动子和/或密码子优化(上文进行了详细描述)用于编码一种或多种碳水化合物生物合成酶的外源性多核苷酸在宿主甲烷氧化菌中的高组成型表达。还可利用外源性核酸在宿主甲烷氧化菌中的调控型表达。例如，可使用如例如美国专利申请号2010/0221813中所述的甲基营养菌和甲烷氧化菌中的重组蛋白表达的诱导型/调控型系统。
生产所需碳水化合物的方法
本公开提供一种通过在甲烷(来自任何来源)或天然气来源的碳原料存在下在足以产碳水化合物的条件下培养本公开的重组C1代谢微生物来生产碳水化合物的方法。在具体实施方案中，本公开提供一种通过在天然气来源的碳原料存在下在足以产生碳水化合物的条件下培养重组C1代谢微生物来生产碳水化合物的方法，其中所述C1代谢微生物包含编码碳水化合物生物合成酶的外源性核酸。通常，天然气来源的碳原料是天然气、甲烷或合成气。实施例1阐明了用于培养示例性C1代谢微生物的条件。
在又一个实施方案中，本公开提供一种生产碳水化合物的方法，所述方法包括在甲烷存在下在足以产生碳水化合物的条件下培养重组C1代谢微生物，其中所述C1代谢微生物包含编码碳水化合物生物合成酶的外源性核酸。在此实施方案中，来自任何来源的甲烷适用于本发明的实践中，包括天然气、生物甲烷等。如本文所用，术语“生物甲烷”是指由有机物例如像粪肥、废水泥浆、城市固体废物等在缺氧情况下的发酵产生的甲烷。
各种培养方法可用于本文描述的微生物。例如，C1代谢微生物(诸如甲烷氧化菌或甲基营养菌)可通过分批培养或连续培养方法来生长。在某些实施方案中，培养物生长于受控培养装置诸如发酵罐、生物反应器、中空纤维小室等中。一般对数生长期的细胞经常负责在一些系统中大量生产目标产物或中间物，而静止期或指数期后生产可在其他系统中获得。
经典分批培养方法是将培养基组成在培养开始时设定并且在培养过程期间不改变的封闭系统。也就是说，将培养基在培养过程开始时用选择的一种或多种微生物接种，然后使其生长而不向系统中添加任何东西。如本文使用，“分批”培养涉及不改变初始添加的具体碳源的量，而可在培养期间监测并改变因素如pH和氧浓度的控制。在分批系统中，系统的代谢物和生物质组成不断地变化直至培养结束时。在分批培养物内，细胞(例如，细菌如甲基营养菌)一般从静态迟缓期移至高生长对数生长期直至生长速率降低或停止的静止期(并且如果条件不变化，则将最终导致细胞死亡)。
补料分批系统是随着培养进行而以增量添加目标碳基质的标准分批系统的变型。当细胞代谢可能受降解物阻遏抑制时并且当期望在培养基中具有有限量的基质时，补料分批系统是适用的。由于很难测量补料分批系统中的实际基质浓度，因此基于可测量因素诸如pH、溶解氧和废气分压的变化来进行估计。分批和补料分批培养方法在本领域中是常见的并且是已知的(参见，例如，Thomas D.Brock,Biotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology,第2版(1989)Sinauer Associates,Inc.,Sunderland,MA；Deshpande,Appl.Biochem.Biotechnol.36:227,1992)。
向生物反应器中连续添加界定的培养基，同时将等量的用过的(“受制约的”)培养基同时移除以进行加工，就此意义上而言连续培养是“开放的”系统。连续培养通常使细胞维持在恒定较高的液相密度下，其中细胞主要处于对数生长期。另选地，连续培养可用固定化细胞(例如，生物膜)来实施，其中连续地添加碳和营养物并且从细胞团块中连续地移除有价值的产物、副产物和废弃产物。细胞固定化可使用由天然材料、合成材料或其组合构成的各种固体支持物来实现。
连续或半连续培养允许调节一种或多种影响细胞生长或最终产物浓度的因素。例如，一种方法可使有限营养物维持在固定比率(例如，碳源、氮)并且允许所有其他参数随着时间的推移而变化。在其他实施方案中，可连续地改变影响生长的多种因素，同时使如通过培养基浑浊度测量的细胞浓度维持恒定。连续培养系统的目标是维持稳态生长条件，同时将由于培养基抽取而导致的细胞损失相对于细胞生长速率而加以平衡。调节用于连续培养过程的营养物和生长因素的方法和使产物形成速率最大化的技术在本领域中是众所周知的(参见，Brock,1992)。
液相生物反应器(例如，搅拌釜式、填充床式、一液相式、双液相式、中空纤维膜式)是本领域所熟知的，并且可用于非天然存在的微生物的生长和生物催化。
通过使用气相生物反应器，通过非天然存在的微生物、细胞裂解物或其无细胞部分来从气体而不是从液体中吸收用于生物生产的基质。气相生物反应器与微生物的使用是本领域已知的(例如，美国专利号2,793,096；4,999,302；5,585,266；5,079,168；以及6,143,556；美国依法注册的发明H1430；美国专利申请公布号2003/0032170；Emerging Technologies in Hazardous Waste Management III,1993,Tedder和Pohland编,第411-428页)。示例性气相生物反应器包括单程系统、闭环泵送系统和流化床反应器。通过利用气相生物反应器，甲烷或其他气态基质可很容易地用于通过具有例如单加氧酶活性的多肽进行的转化。在某些实施方案中，用于将气体转化成碳水化合物的方法在气相生物反应器中进行。在其他实施方案中，用于将气体转化成碳水化合物的方法在流化床反应器中进行。在流化床反应器中，流体(即，气体或液体)向上穿过颗粒床载剂(通常为沙子、粒状活性炭或硅藻土)，微生物可在其上附着并生长。流体速度使颗粒床载剂和所附着的微生物悬浮(即，床流化)。附着至颗粒床载剂的微生物在流体中自由地循环，允许流体中基质至微生物和增加的微生物生长的有效传质。实例性流化床反应器包括栓塞流反应器和完全混合反应器。流化床反应器与微生物生物膜的使用是本领域已知的(例如，Pfluger等,Bioresource Technol.102:9919,2011；Fennell等,Biotechnol,Bioengin.40:1218,1992；Ruggeri等,Water Sci.Technol.29:347,1994；美国专利号4,032,407；4,009,098；4,009,105；以及3,846,289)。
本公开描述的重组C1代谢微生物可作为分离纯培养物而生长，其中可帮助生长或帮助C1代谢微生物中的一种或多种不同菌株或种的异源非C1代谢微生物可组合以产生混合培养物。
在某些实施方案中，本公开的碳水化合物在特定细胞生长期(例如，迟缓期、对数期、静止期或死亡期)期间产生。期望来自原料的碳转化成碳水化合物而不是转化成C1代谢微生物的生长和维持。在一些实施方案中，将如本文所提供的非天然存在的C1代谢微生物(例如，甲烷氧化菌、甲基营养菌)培养成低至中等细胞密度(OD600)，然后启动碳水化合物生产。在一些实施方案中，碳水化合物在甲烷氧化菌不再分裂或分裂很慢时产生。在一些实施方案中，碳水化合物只在静止期期间产生。在一些实施方案中，碳水化合物在对数期和静止期期间产生。
包含由本文提供的重组C1代谢微生物(例如，甲烷氧化菌、甲基营养菌)产生的碳水化合物的发酵罐组合物还可包含与生物发酵过程相关的其他有机化合物。例如，发酵的生物副产物可包括一种或多种醇、环氧化物、醛、酮、酯或其组合。在某些实施方案中，发酵罐组成可含有一种或多种以下醇：甲醇、乙醇、丁醇或丙醇。其他化合物，诸如H2O、CO、CO2、CO N2、H2、O2和未利用的碳原料(诸如甲烷、乙烷、丙烷和丁烷)也可存在于发酵罐废气中。
在某些实施方案中，本文提供的重组C1代谢微生物(例如，甲烷氧化菌、甲基营养菌)产生约0.001g/L培养物至约500g/L培养物的本发明的碳水化合物。在一些实施方案中，所产生的碳水化合物的量为约1g/L培养物至约100g/L培养物。在一些实施方案中，所产生的碳水化合物的量为约0.001g/L、0.01g/L、0.025g/L、0.05g/L、0.1g/L、0.15g/L、0.2g/L、0.25g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L、1g/L、2.5g/L、5g/L、7.5g/L、10g/L、12.5g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L、60g/L、70g/L、80g/L、90g/L、100g/L、125g/L、150g/L、175g/L、200g/L、225g/L、250g/L、275g/L、300g/L、325g/L、350g/L、375g/L、400g/L、425g/L、450g/L、475g/L或500g/L。
产物
除本文描述的重组C1代谢细胞之外本公开还提供其他有用的产物。在一个实施方案中，本公开提供一种包含如本文所述的重组C1代谢微生物的生物质。在具体实施方案中，本公开提供一种包含重组C1代谢微生物的生物质，其中重组C1代谢微生物包含编码碳水化合物生物合成酶的外源性核酸，并且其中重组C1代谢微生物能够将天然气来源的原料转化成所需碳水化合物。在具体实施方案中，外源性核酸编码β-葡聚糖生物合成酶，例如β-(1,3)-葡聚糖合酶。在一些实施方案中，生物质包含重组C1代谢微生物和所需碳水化合物，其中所需碳水化合物为β-葡聚糖，并且重组C1代谢微生物包含编码β-葡聚糖生物合成酶的外源性核酸，并且其中重组C1代谢微生物能够将天然气来源的原料转化成β-葡聚糖。示例性β-葡聚糖包括β-(1,3)-葡聚糖、β-(1,3)(1,6)-葡聚糖、β-(1,3)(1.4)-葡聚糖和β-(1,4)-葡聚糖。在某些实施方案中，所需碳水化合物选自β-(1,3)-葡聚糖、β-(1,3)(1,6)-葡聚糖或β-(1,3)(1.4)-葡聚糖。在其他实施方案中，所需碳水化合物为β-(1,3)-葡聚糖。
在又一个实施方案中，本公开提供一种包含重组C1代谢微生物的生物质，其中重组C1代谢微生物包含编码碳水化合物生物合成酶的外源性核酸，并且其中重组C1代谢微生物能够将甲烷转化成所需碳水化合物。在具体实施方案中，外源性核酸编码β-葡聚糖生物合成酶，例如β-(1,3)-葡聚糖合酶，并且重组C1代谢微生物能够将甲烷转化成β-葡聚糖。通常β-葡聚糖选自由以下组成的组：β-葡聚糖，例如像β-(1,3)-葡聚糖、β-(1,3)(1,6)-葡聚糖、β-(1,3)(1,4)-葡聚糖和β-(1,4)-葡聚糖。在某些实施方案中，所需碳水化合物选自由以下组成的组：β-(1,3)-葡聚糖、β-(1,3)(1,6)-葡聚糖、β-(1,3)(1,4)-葡聚糖。在其他实施方案中，所需碳水化合物为β-(1,3)-葡聚糖。
如本文所用，“生物质”是指具有生物学来源的有机物，其可包括一种或多种全细胞、裂解细胞、细胞外物质等。例如，从培养的微生物(例如，细菌或酵母培养物)收获的物质被认为是生物质，其可包括细胞、细胞膜、细胞质、内含体、分泌或排泄至培养基中的产物或其任何组合。在某些实施方案中，生物质包含本公开的C1代谢微生物和培养的培养基，本公开的C1代谢微生物在所述培养基中生长。在其他实施方案中，生物质包含从生长于C1基质(例如，天然气、甲烷等)上的培养物中回收的本公开的C1代谢微生物(完整的或裂解的或两者)。在其他实施方案中，生物质包含来自培养于C1基质上的C1代谢微生物培养物的废培养基上清液。这种培养物可被认为是可再生资源。本发明的生物质关于所需碳水化合物的水平富集的。
提供有用于细胞生长的天然气来源的基质的本公开的重组C1代谢微生物在如他们的δ13C值所代表的他们的碳指纹(就像来源于此类重组C1代谢微生物的产物)方面各有不同。作为背景技术，稳定同位素测量值和质量平衡方法广泛用来评估甲烷的全球源和宿(参见，Whiticar和Faber,Org.Geochem.10:759,1986；Whiticar,Org.Geochem.16:531,1990)。为了使用残余甲烷的δ13C值来确定氧化量，必须了解由甲烷的微生物氧化所引起的同位素分馏的程度。例如，好氧甲烷氧化菌可通过特异性酶(甲烷单加氧酶(MMO))来代谢甲烷。甲烷氧化菌将甲烷转化成甲醇并随后转化成甲醛。甲醛可进一步氧化成CO2来以还原当量(NADH)的形式向细胞提供能量，或者通过RuMP或丝氨酸循环并入至生物质中(Hanson和Hanson,Microbiol.Rev.60:439,1996)，所述RuMP或丝氨酸循环直接类似于光合生物中的碳同化途径。更具体地说，I型甲烷氧化菌使用用于生物合成的RuMP途径并且产生完全来自CH4的生物质，而II型甲烷氧化菌使用使来自CH4的50％-70％的细胞碳和来自CO2的30％-50％的细胞碳同化的丝氨酸途径(Hanson和Hanson,1996)。在例如Templeton等(Geochim.Cosmochim.Acta 70:1739,2006)中提供了用于测量碳同位素组成的方法，所述方法以引用方式整体并入本文。实施例2描述不同C1代谢微生物的细胞的稳定碳同位素分布的表征。细胞的高度负δ13C值类似地反映在从这些细胞中提取的化合物(即，脂质部分)的δ13C方面。本文描述的本发明产物(即，如本文所述的本公开的重组C1代谢微生物、来源于此的相关生物质和碳水化合物组合物)的δ13C可根据如实施例2所展示使用的C1基质的来源和纯度而变化。
在某些实施方案中，本公开的重组C1代谢微生物以及来源于此的相关生物质和碳水化合物组合物展现出的δ13C小于-30‰、小于-31‰、小于-32‰、小于-33‰、小于-34‰、小于-35‰、小于-36‰、小于-37‰、小于-38‰、小于-39‰、小于-40‰、小于-41‰、小于-42‰、小于-43‰、小于-44‰、小于-45‰、小于-46‰、小于-47‰、小于-48‰、小于-49‰、小于-50‰、小于-51‰、小于-52‰、小于-53‰、小于-54‰、小于-55‰、小于-56‰、小于-57‰、小于-58‰、小于-59‰、小于-60‰、小于-61‰、小于-62‰、小于-63‰、小于-64‰、小于-65‰、小于-66‰、小于-67‰、小于-68‰、小于-69‰或小于-70‰。
在某些实施方案中，本公开的重组C1代谢微生物以及来源于此的相关生物质和碳水化合物组合物展现出的δ13C为约-35‰至约-50‰、-45‰至约-35‰，或约-50‰至约-40‰，或约-45‰至约-65‰，或约-60‰至约-70‰或约-30‰至约-70‰。
在其他实施方案中，C1代谢非光合微生物生物质的δ13C小于约-30‰或范围为约-40‰至约-60‰。在某些实施方案中，生物质包含重组C1代谢非光合微生物和废培养基，或者生物质包含来自重组C1代谢非光合微生物的培养物的废培养基上清液组合物，其中所述生物质的δ13C小于约-30‰。在某些其他实施方案中，碳水化合物组合物从生物质中提取或浓缩，所述生物质可包含重组C1代谢非光合微生物和来自培养物的废培养基或来自重组C1代谢非光合微生物的培养物的废培养基上清液组合物。
在某些实施方案中，来源于C1代谢微生物的碳水化合物组合物(其可任选地为来自C1代谢微生物生物质的提取物或分离物)包含组合物重量的至少约50％至约80％的氢、氧和碳原子，并且其中组合物的δ13C小于约-35‰，或小于约-36‰，或小于约-37‰，或小于约-38‰，或小于约-39‰或小于约-40‰。在某些实施方案中，来源于此的碳水化合物组合物包含具有氢、氧和碳原子的分子，其中氢、氧和碳原子为组合物重量的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％，或至少80％，或至少90％,或至少95％，并且当在存在或不存在铜的情况下培养时，其中组合物的δ13C的范围为约-30‰至约-70‰，或者其中生物质的δ13C随细胞密度增加而减少约-5‰至约-20‰，或者其中生物质的δ13C比同时产生的CO2的δ13C高5‰至15‰的平均数。
通常，碳水化合物组合物包含多糖，并且在某些情况下，其包含单糖。在其他实施方案中，碳水化合物组合物包含二糖。在一些实施方案中，碳水化合物包含β-葡聚糖。通常，β-葡聚糖为β-(1,3)-葡聚糖。在其他实施方案中，β-葡聚糖为β-(1,3)(1,6)-葡聚糖，或β-(1,3)(1,4)-葡聚糖或β-(1,6)-葡聚糖。来源于在天然气来源的基质存在下培养的重组C1代谢微生物的碳水化合物组合物展现出上文描述的δ13C值。
下文的实施例阐明了在天然气来源的原料存在下培养的一些C1代谢微生物的δ13C的表征。
本公开还提供包含本公开的重组C1代谢微生物、相关生物质和/或碳水化合物组合物的动物饲料。如在本发明的实践中所设想的，动物饲料可以是牲畜饲料(例如像，猪饲料、牛饲料、绵羊饲料等)、家禽饲料(例如像，鸡饲料、火鸡饲料等)或鱼饲料(例如像，鲑鱼饲料、贝类饲料等)。动物饲料还可包含添加剂，例如像植物来源的材料(包括例如来源于谷物的那些材料，例如像玉米、大麦、燕麦、大米、黑麦、小麦、高粱、啤酒糟等；以及来源于豆类的那些材料，例如像苜蓿、三叶草、豌豆、黄豆、扁豆、大豆等)、动物来源的材料(例如像，鱼粉)和/或微生物来源的材料(包括例如来自可为例如细菌、酵母或藻类的异源微生物的生物质)。在一些实施方案中，植物来源的材料添加剂是大豆粉或豌豆蛋白。
在又一个实施方案中，本公开提供一种包含本公开的重组C1代谢微生物、相关生物质和/或碳水化合物组合物的培养基或发酵培养基。通常，培养基或发酵培养基还包含氨基酸和/或水。在另一个实施方案中，本公开提供一种包含如本文所述的培养基或发酵培养基以及第二微生物的细胞培养物组合物。通常，第二微生物为细菌、酵母或藻类。
本发明的实施方案包括如下：
1.一种生物质，其来源于重组C1代谢微生物的培养物，其中所述重组微生物包含编码碳水化合物生物合成酶的外源性核酸，其中所述重组C1代谢能够将天然气来源的碳原料转化成所需碳水化合物。
2.一种生物质，其来源于重组C1代谢微生物的培养物，其中所述重组C1代谢微生物包含编码碳水化合物生物合成酶的外源性核酸，其中所述重组C1代谢微生物能够将甲烷转化成所需碳水化合物。
3.如实施方案1-2中任一项所述的生物质，其中所述重组C1代谢微生物是非光合C1代谢微生物。
4.如实施方案1-3中任一项所述的生物质，其中所述碳水化合物选自由多糖、二糖和单糖组成的组。
5.如实施方案4所述的生物质，其中所述碳水化合物为单糖。
6.如实施方案4所述的生物质，其中所述碳水化合物为二糖。
7.如实施方案4所述的生物质，其中所述碳水化合物为多糖。
8.如实施方案7所述的生物质，其中所述多糖为β-葡聚糖。
9.如实施方案8所述的生物质，其中所述β-葡聚糖为β-(1,3)-葡聚糖。
10.如实施方案8所述的生物质，其中所述β-葡聚糖为β-(1,3)(1,6)-葡聚糖。
11.如实施方案8所述的生物质，其中所述β-葡聚糖为β-(1,3)(1,4)-葡聚糖。
12.如实施方案8所述的生物质，其中所述β-葡聚糖为β-(1,4)-葡聚糖。
13.如实施方案8所述的生物质，其中所述β-葡聚糖为β-(1,6)-葡聚糖。
14.如实施方案1-13中任一项所述的生物质，其中所述外源性核酸的序列经过密码子优化以在所述重组C1代谢微生物中最佳表达。
15.如实施方案1-14中任一项所述的生物质，其中所述外源性核酸编码糖异生酶。
16.如实施方案15所述的生物质，其中所述糖异生酶选自由以下组成的组：丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、烯醇化酶、磷酸甘油酸变位酶、磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、A型醛缩酶、果糖1,6-二磷酸酶、磷酸果糖激酶、磷酸葡糖异构酶、己糖激酶和葡糖-6-磷酸。
17.如实施方案1-14中任一项所述的生物质，其中所述外源性核酸编码糖原生成酶。
18.如实施方案17所述的生物质，其中所述糖原生成酶选自由以下组成的组：葡糖-1-磷酸腺苷酰基转移酶、糖原合成酶和1,4-α-葡聚糖分支蛋白。
19.如实施方案8-14中任一项所述的生物质，其中所述外源性核酸是β-葡聚糖合酶。
20.如实施方案1-19中任一项所述的生物质，其中所述外源性核酸编码对于细菌是内源性的碳水化合物生物合成酶。
21.如实施方案1-19中任一项所述的生物质，其中所述外源性核酸编码对于选自由酵母、真菌和植物组成的组的生物体是内源性的碳水化合物生物合成酶。
22.如实施方案1-19中任一项所述的生物质，其中所述外源性核酸编码对于选自由大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌组成的组的微生物是内源性的碳水化合物生物合成酶。
23.如实施方案1-14中任一项所述的生物质，其中所述外源性核酸编码选自由以下任何SEQ ID NO组成的组的碳水化合物生物合成酶：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36和38。
24.如实施方案1-23中任一项所述的生物质，其中所述编码碳水化合物生物合成途径的酶的外源性核酸可操作地连接至表达控制序列。
25.如实施方案24所述的生物质，其中所述表达控制序列是外源性表达控制序列。
26.如实施方案1-25中任一项所述的生物质，其中所述C1代谢微生物还包含内源酶活性的缺失。
27.根据实施方案1-26中任一项所述的生物质，其中所述C1代谢微生物是甲烷氧化菌。
28.根据实施方案27所述的生物质，其中所述甲烷氧化菌为甲基单胞菌属、甲基细菌属、甲基球菌属、甲基弯曲菌属、甲基孢囊菌属、甲基微菌属、甲烷单胞菌属、甲基胞菌属或甲基荚膜菌属。
29.如实施方案27所述的生物质，其中所述甲烷氧化菌选自由以下组成的组：荚膜甲基球菌Bath菌株、甲烷甲基单胞菌16a(ATCC PTA2402)、发孢甲基弯曲菌OB3b(NRRL B-11,196)、生孢甲基弯曲菌(NRRL B-11,197)、小甲基孢囊菌(NRRL B-11,198)、甲烷甲基单胞菌(NRRL B-11,199)、白色甲基单胞菌(NRRL B-11,200)、荚膜甲基细菌(NRRL B-11,201)、嗜有机甲基杆菌(ATCC 27,886)、甲基单胞菌属AJ-3670(FERM P-2400)、森林甲基胞菌、沼泽甲基胞菌(ATCC 700799)、冻原甲基胞菌、道氏甲基孢囊菌菌株SB2、苔藓甲基孢囊菌、金色甲基荚膜菌KYG、极端嗜酸甲烷氧化菌、嗜油甲基菌和嗜喊甲基微菌。
30.根据实施方案1和3-29中任一项所述的生物质，其中所述天然气来源的碳原料选自由以下组成的组：天然气、合成气、甲烷、甲醇、甲醛、甲酸、一氧化碳、二氧化碳、氰化物、甲胺、甲硫基、甲基卤素及其任何组合或两种或更多种。
31.如实施方案30所述的生物质，其中所述天然气来源的碳原料是天然气。
32.如实施方案1和3-30中任一项所述的生物质，其中所述天然气来源的碳原料是甲烷。
33.如实施方案30所述的生物质，其中所述天然气来源的碳原料是合成气。
34.如实施方案30所述的生物质，其中所述C1代谢微生物是合成气代谢细菌。
35.根据实施方案34所述的生物质，其中所述合成气代谢细菌选自由以下组成的组：自产乙醇梭菌、杨氏梭菌、拉氏梭菌、嗜羧基梭菌、食甲基丁酸杆菌、伍氏梭菌和新产丙醇梭菌。
36.根据实施方案1和3-35中任一项所述的生物质，其中所述生物质的δ13C小于-40‰。
37.如实施方案2所述的生物质，其中所述甲烷为生物甲烷。
38.一种组合物，其包含碳水化合物组合物，其中所述碳水化合物组合物展现出小于-40‰的δ13C。
39.如实施方案38所述的组合物，其中所述碳水化合物包括β-葡聚糖。
40.如实施方案39所述的组合物，其中所述β-葡聚糖为β-(1,3)-葡聚糖。
41.一种动物饲料，其包含如实施方案1-37中任一项所述的生物质或如实施方案38-40中任一项所述的组合物。
42.如实施方案41所述的动物饲料，其还包含植物来源的材料。
43.如实施方案41所述的动物饲料，其中所述植物来源的材料选自由大豆粉和豌豆蛋白组成的组。
44.一种培养基或发酵培养基，其包含如实施方案1-37中任一项所述的生物质或如实施方案38-40中任一项所述的组合物。
45.一种重组C1代谢微生物，其中所述重组微生物包含编码碳水化合物生物合成酶的外源性核酸，其中所述重组C1代谢微生物能够将天然气来源的碳原料转化成所需碳水化合物。
46.一种重组C1代谢微生物，其中所述重组C1代谢微生物包含编码碳水化合物生物合成酶的外源性核酸，其中所述重组C1代谢微生物能够将甲烷转化成所需碳水化合物。
47.如实施方案45-46中任一项所述重组C1代谢微生物，其中所述重组C1代谢微生物是非光合C1代谢微生物。
48.如实施方案45-47中任一项所述的重组C1代谢微生物，其中所述碳水化合物选自由多糖、二糖和单糖组成的组。
49.如实施方案48所述的重组C1代谢微生物，其中所述碳水化合物为单糖。
50.如实施方案48所述的重组C1代谢微生物，其中所述碳水化合物为二糖。
51.如实施方案48所述的重组C1代谢微生物，其中所述碳水化合物为多糖。
52.如实施方案51所述的重组C1代谢微生物，其中所述多糖为β-葡聚糖。
53.如实施方案52所述的重组C1代谢微生物，其中所述β-葡聚糖为β-(1,3)-葡聚糖。
54.如实施方案52所述的重组C1代谢微生物，其中所述β-葡聚糖为β-(1,3)(1,6)-葡聚糖。
55.如实施方案52所述的重组C1代谢微生物，其中所述β-葡聚糖为β-(1,3)(1,4)-葡聚糖。
56.如实施方案52所述的重组C1代谢微生物，其中所述β-葡聚糖为β-(1,4)-葡聚糖。
57.如实施方案52所述的重组C1代谢微生物，其中所述β-葡聚糖为β-(1,6)-葡聚糖。
58.如实施方案45-57中任一项所述的重组C1代谢微生物，其中所述外源性核酸的序列经过密码子优化以在重组C1代谢微生物中最佳表达。
59.如实施方案45-58中任一项所述的重组C1代谢微生物，其中所述外源性核酸编码糖异生酶。
60.如实施方案59所述的重组C1代谢微生物，其中所述糖异生酶选自由以下组成的组：丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、烯醇化酶、磷酸甘油酸变位酶、磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、A型醛缩酶、果糖1,6-二磷酸酶、磷酸果糖激酶、磷酸葡糖异构酶、己糖激酶和葡糖-6-磷酸。
61.如实施方案45-58中任一项所述的重组C1代谢微生物，其中所述外源性核酸编码糖原生成酶。
62.如实施方案61所述的重组C1代谢微生物，其中所述糖原生成酶选自由以下组成的组：葡糖-1-磷酸腺苷酰基转移酶、糖原合成酶和1,4-α-葡聚糖分支蛋白。
63.如实施方案52-57中任一项所述的重组C1代谢微生物，其中所述外源性核酸是β-葡聚糖合酶。
64.如实施方案45-63中任一项所述的重组C1代谢微生物，其中所述外源性核酸编码对于细菌是内源性的碳水化合物生物合成酶。
65.如实施方案45-63中任一项所述的重组C1代谢微生物，其中所述外源性核酸编码对于选自由酵母、真菌和植物组成的组的生物体是内源性的碳水化合物生物合成酶。
66.如实施方案45-63中任一项所述的重组C1代谢微生物，其中所述外源性核酸编码对于选自由大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌组成的组的微生物是内源性的碳水化合物生物合成酶。
67.如实施方案45-57中任一项所述的重组C1代谢微生物，其中所述外源性核酸编码选自由以下任何SEQ ID NO组成的组的碳水化合物生物合成酶：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36和38。
68.如实施方案45-67中任一项所述的重组C1代谢微生物，其中所述编码碳水化合物生物合成途径的酶的外源性核酸可操作地连接至表达控制序列。
69.如实施方案68所述的重组C1代谢微生物，其中所述表达控制序列是外源性表达控制序列。
70.如实施方案45-69中任一项所述的重组C1代谢微生物，其中所述C1代谢微生物还包含内源酶活性的缺失。
71.根据实施方案45-70中任一项所述的重组C1代谢微生物，其中所述C1代谢微生物是甲烷氧化菌。
72.根据实施方案71所述的重组C1代谢微生物，其中所述甲烷氧化菌为甲基单胞菌属、甲基细菌属、甲基球菌属、甲基弯曲菌属、甲基孢囊菌属、甲基微菌属、甲烷单胞菌属、甲基胞菌属或甲基荚膜菌属。
73.如实施方案71所述的重组C1代谢微生物，其中所述甲烷氧化菌选自由以下组成的组：荚膜甲基球菌Bath菌株、甲烷甲基单胞菌16a(ATCC PTA 2402)、发孢甲基弯曲菌OB3b(NRRL B-11,196)、生孢甲基弯曲菌(NRRL B-11,197)、小甲基孢囊菌(NRRL B-11,198)、甲烷甲基单胞菌(NRRL B-11,199)、白色甲基单胞菌(NRRL B-11,200)、荚膜甲基细菌(NRRL B-11,201)、嗜有机甲基杆菌(ATCC 27,886)、甲基单胞菌属AJ-3670(FERM P-2400)、森林甲基胞菌、沼泽甲基胞菌(ATCC 700799)、冻原甲基胞菌、道氏甲基孢囊菌菌株SB2、苔藓甲基孢囊菌、金色甲基荚膜菌KYG、极端嗜酸甲烷氧化菌、嗜油甲基菌和嗜喊甲基微菌。
74.根据实施方案45和47-73中任一项所述的重组C1代谢微生物，其中所述天然气来源的碳原料选自由以下组成的组：天然气、合成气、甲烷、甲醇、甲醛、甲酸、一氧化碳、二氧化碳、氰化物、甲胺、甲硫基、甲基卤素及其任何组合或两种或更多种。
75.如实施方案74所述的重组C1代谢微生物，其中所述天然气来源的碳原料是天然气。
76.如实施方案74所述的重组C1代谢微生物，其中所述天然气来源的碳原料是甲烷。
77.如实施方案74所述的重组C1代谢微生物，其中所述天然气来源的碳原料是合成气。
78.如实施方案77所述的重组C1代谢微生物，其中所述C1代谢微生物是合成气代谢细菌。
79.根据实施方案78所述的生物质，其中所述合成气代谢细菌选自由以下组成的组：自产乙醇梭菌、杨氏梭菌、拉氏梭菌、嗜羧基梭菌、食甲基丁酸杆菌、伍氏梭菌和新产丙醇梭菌。
80.根据实施方案45和47-79中任一项所述的重组C1代谢微生物，其中所述生物质的δ13C小于-40‰。
81.如实施方案46所述的重组C1代谢微生物，其中所述甲烷为生物甲烷。
82.一种生产碳水化合物的方法，所述方法包括在天然气来源的碳原料存在下在足以产生所述碳水化合物的条件下培养如实施方案45和47-68中任一项所述的重组C1代谢微生物。
83.一种生产碳水化合物的方法，所述方法包括在甲烷存在下在足以产生所述碳水化合物的条件下培养如实施方案46所述的重组C1代谢微生物。
84.如实施方案83所述的方法，其中所述碳水化合物为β-葡聚糖。
85.一种碳水化合物，其通过如实施方案82所述的方法来产生，其中所述碳水化合物展现出在约-40‰至约-60‰的范围内的δ13C。
结合以下非限制性实施例可更好理解本发明的前述及其他方面。
实施例
实施例1
用于C1代谢微生物的培养条件和生物反应器条件
本公开的示例性C1代谢微生物(甲烷氧化菌、甲基营养菌、梭状芽孢杆菌(clostridia))培养于试管中、小瓶中、瓶子中、平板上或生物反应器(发酵)中。本实施例描述了用于各种微生物的生长条件、培养基和碳源。
发孢甲基弯曲菌菌株OB3b(NCIMB 11131)；甲基单胞菌属菌株 16a(ATCC PTA-2402)；或甲烷甲基单胞菌
对于血清瓶，将细菌在30℃下在希金斯最低硝酸盐培养基(NSM；Cornish等,J.Gen.Microbiol.130:2565,1984；Park等,Biotechnol.Bioeng.38:423,1991)或MM-W1培养基中培养。将顶部空间组成调节至1:1体积的甲烷:空气。将瓶子以200-250rpm的速率震荡。另选地，将培养物在含有1.5％w/v琼脂的NSM培养基平板上维持，在含有1:1(v/v)甲烷:空气气体混合物的气密室中或在甲醇蒸汽(通过在石蜡膜密封的平板的盖子中的0.5mL甲醇)存在下或在增补有0.5％甲醇的NSM培养基平板上生长。在30℃下，将平板在加湿室中倒置孵育。
使用的NSM培养基的组成如下：1.0g MgSO4*7H2O、0.20gCaCl2*6H2O、2.0ml螯合铁溶液(0.1g柠檬酸铁(III)铵或0.5g氯化铁(III)；0.2g EDTA、钠盐；0.3ml浓HCl；100.0ml蒸馏的去离子H2O)、1.0g KNO3、0.5ml微量元素溶液(500.0mg EDTA、200.0mg FeSO4.7H2O、10.0mg ZnSO4*7H2O、3.0mg MnCl2*4H2O、30.0mg H3BO3、20.0mg CoCl2*6H2O、1.0mg CaCl2*2H2O、2.0mgNiCl2*6H2O、3.0mgNa2MoO4*2H2O、1.0L蒸馏水)、0.272g KH2PO4、0.717gNa2HPO4*12H2O、任选地12.5g精制琼脂(例如，Oxoid L28琼脂或BactoTM琼脂；制备平板时使用)、1.0L蒸馏的去离子水，将pH调节至6.8并且在121℃下高压灭菌15分钟。
对于发酵，将含有1L无菌限定培养基MM-W1的2升生物反应器用来自在供应有1:1(v/v)甲烷和空气混合物的MM-W1中生长的血清瓶分批培养物(10-20％v/v)的细胞接种。使用的培养基MM-W1的组成如下：0.8mM MgSO4*7H2O、10mM NaNO3、0.14mM CaCl2、1.2mM NaHCO3、2.35mM KH2PO4、3.4mM K2HPO4、20.7μMNa2MoO4*2H2O、1μM CuSO4*5H2O、10μM FeIII-Na-EDTA和1mL/升的微量金属溶液(含有每升500mg FeSO4*7H2O、400mg ZnSO4*7H2O、20mg MnCl2*7H2O、50mg CoCl2*6H2O、10mg NiCl2*6H2O、15mg H3BO3、250mg EDTA)。在将培养基高压灭菌并冷却后，添加磷酸盐、碳酸氢盐和FeIII-Na-EDTA。在某些发酵中，将碳酸氢盐添加至0.1％(w/v)。将反应器内容物用架空叶轮以恒定的750rpm搅拌。将培养物用以约60mL/min至约120mL/min喷射的恒定甲烷补料，同时以约10mL/min-100mL/min的可变速率供应浓缩的氧气(至少85％)以维持约40％至约80％(相对于培养基的空气饱和度)的溶解氧水平。
将生物反应器的温度维持在30℃，并且每4小时至约24小时利用向培养物中自动添加0.5M NaOH和0.5M HC1以及其他添加物来将pH维持在7.1±0.1处(相当于OD600增加大约5OD单位)。其他添加物在金属添加物(最终浓度10μM CuSO4、5μM FeSO4、5μMFeIII-Na-EDTA)与营养添加物(5.75mM KxHyPO4、10mM NaNO3)之间交替。在这些条件下，对于大于20的OD600，观察到基本线性生长，有效生物质产生率为每升每天约2.7克至约3.3克干细胞重量。将培养物生物质通过离心收获，在MM-W1培养基中洗涤一次，并且将回收的生物质在-80℃下冷冻或者立即用于细胞组分的分级分离(例如，脂质提取)。
半连续发酵方法也可用来维持生物质生产率并减少与发酵关闭和启动相关的时间(即，周转期或提前期)。
随着培养密度接近(但在进入前)静止期，以大约12-24小时的间隔进行细菌生物质的收获。将大约一半的生物反应器体积通过用离心泵转移至单独的容器来移除。然后将等体积无菌或回收的培养基返还至生物反应器中，以便反应器的光密度为其初始值的大约一半。根据以上方案继续生物反应器发酵，以便可在单次发酵运行期间实施多个周期的生长和生物质回收。
荚膜甲基球菌Bath(NCIMB 11132)
将细菌在42℃下在含有希金斯最低硝酸盐培养基(NSM)或MM-W1培养基的血清瓶中培养。将顶部空间组成调节至1:1体积的甲烷:空气。将瓶子以200-250rpm的速率震荡。另选地，将培养物在用1.5％w/v琼脂固化的NSM培养基平板上维持，在含有1:1(v/v)甲烷:空气气体混合物的气密室中生长。在42℃下，将平板在所述室中倒置孵育。
对于发酵，将含有1.25L无菌培养基MMF1.1的3升生物反应器用来自在供应有1:1(v/v)甲烷和空气混合物的相同培养基中生长的血清瓶分批培养物(10-20％v/v)的细胞接种。培养基MMF1.1的组成如下：0.8mM MgSO4*7H2O、40mM NaNO3、0.14mM CaCl2、6mMNaHCO3、4.7mM KH2PO4、6.8mM K2HPO4、20.7μM Na2MoO4*2H2O、6μM CuSO4*5H2O、10μM FeIII-Na-EDTA和1mL/升的微量金属溶液(含有每升500mg FeSO4*7H2O、400mg ZnSO4*7H2O、20mg MnCl2*7H2O、50mg CoCl2*6H2O、10mg NiCl2*6H2O、15mgH3BO3、250mg EDTA)。在将培养基高压灭菌并冷却后，添加磷酸盐、碳酸氢盐和FeIII-Na-EDTA。将反应器内容物用架空叶轮以恒定的750rpm搅拌。将培养物用以约60mL/min至约200mL/min喷射的恒定甲烷补料，同时以15mL/min-90mL/min的可变速率供应浓缩的氧气(>85％)，并且使溶解氧水平维持在10％以下(相对于培养基的空气饱和度)。
将生物反应器的温度维持在44℃，并且每3-6小时利用向培养物中自动添加0.5M NaOH和0.5M HC1以及铜和铁的添加物(最终浓度5μM CuSO4、5μM FeSO4、10μM FeIII-Na-EDTA)来将pH维持在7.0±0.1处(相当于在达到OD 5之后，OD600增加大约3-5OD单位)。在这些条件下，对于大于10的OD600，观察到基本线性生长，有效生物质产生率为每升每天约多于5克干细胞重量。将培养物生物质通过离心收获，将细胞在MM-W1培养基中洗涤一次，并且将细胞团块在-80℃下冷冻或者立即用于细胞组分的分级分离。
营养耗竭被认作为可限制发酵期间生长收率的问题。为避免营养物的限制，在培养物OD600超过5之后，启动由2倍浓缩MMF1.1构成的主要氮和磷酸盐营养物补料。当扩大培养物体积时，以对应于大约一半的培养物生长速率的稀释率启动营养物补料以避免冲洗并且维持OD的增加。根据以上方案继续生物反应器发酵，以便可在单次发酵运行期间实施多个周期的生长和生物质回收。
扭脱甲基杆菌或发孢甲基弯曲菌菌株OB3b(NCIMB 11131)
将细菌在30℃下在含有用0.5％甲醇增补的希金斯最低硝酸盐培养基(NSM)的试管中培养。将试管以200-250rpm的速率震荡。另选地，将培养物在含有1.5％w/v琼脂的NSM培养基平板上维持，在甲醇蒸汽(通过在石蜡膜密封的平板的盖子中的0.5mL甲醇)存在下生长或用0.5％甲醇增补。在30℃下，将平板在标准大气压下在加湿室中倒置孵育。
对于发酵，将含有1L限定培养基MM-W1的2升生物反应器用来自培养试管分批培养物的细胞(10-20％v/v)接种。培养基MM-W1的组成如以上所述。将反应器内容物用架空叶轮以恒定的800rpm搅拌。将培养物用甲烷的初始灌注补料至0.5％的最终浓度并且用可变甲烷补料来补料，同时以30mL/min-100mL/min的可变速率供应纯氧以维持60％-90％(相对于培养基的空气饱和度)的溶解氧水平。
将生物反应器的温度维持在30℃，并且利用自动添加0.5MNaOH和1M HC1以及如以上所述的金属添加物和营养添加物来将pH维持在7.1±0.1处。在这些条件下，对于大于20的OD600，观察到基本线性生长，有效生物质产生率每升每天2.7克至3.3克干细胞重量。将培养物生物质通过离心收获，将细胞在MM-W1培养基中洗涤一次，并且将细胞团块在-80℃下冷冻或者立即用于细胞组分的分级分离。
半连续发酵方法也可用来维持生物质生产率并减少与发酵关闭和启动相关的时间(即，周转期或提前期)。
随着培养密度接近(但在进入前)静止期，以大约12-24小时的间隔进行积累的细菌生物质的收获。将大约一半的生物反应器体积通过用离心泵转移至单独的容器来移除。然后将等体积新鲜或回收的培养基返还至生物反应器中，以便反应器的光密度为其初始值的大约一半。根据以上方案继续生物反应器发酵，以便在单次发酵运行期间实施多个周期的生长和生物质回收。
自产乙醇梭菌和杨氏梭菌
将梭菌属细菌在100mL改良的PETC培养基(ATCC培养基1754)中在37℃下在具有丁基橡胶塞和200kPa钢厂废气的塑料涂覆的500ml SchottGL45瓶中厌氧培养。通过测量600nm处的光密度(OD600)来监测生长。
改良的PETC培养基含有(每升)1g NH4C1、0.4g KC1、0.2gMgSO4*7H2O、0.8g NaCl、0.1g KH2PO4、20mg CaCl2*2H2O、10ml微量元素溶液(参见如下)、10ml Wolfe氏维生素溶液(参见如下)、2g NaHCO3和1mg刃天青。在将pH调节至5.6之后，将培养基煮沸、厌氧分配并在121℃下高压灭菌15分钟。将钢厂废气(组成：44％CO、32％N2、22％CO2、2％H2)或当量合成混合物用作碳源。培养基的最终pH为5.9，并且用0.008％(w/v)的浓度的盐酸半胱氨酸和Na2S来还原。
微量元素含有每升2g次氮基三乙酸(在添加剩余成分之前，用KOH调节至pH 6)、1g MnSO4、0.8g Fe(SO4)2(NH4)2*6H2O、0.2gCoCl2*6H2O、0.2mg ZnSO4*7H2O、20mg CuCl2*2H2O、20mgNiCl2*6H2O、20mg Na2MoO4*2H2O、20mg Na2SeO4和20mgNa2WO4。
Wolfe氏维生素溶液(Wolin等,J.Biol.Chem.238:2882,1963)含有(每升)2mg生物素、2mg叶酸、10mg盐酸吡哆醇、5mg盐酸硫胺素、5mg核黄素、5mg烟酸、5mg D-(+)-泛酸钙、0.1mg维生素B12、5mg对氨基苯甲酸和5mg硫辛酸。
a.自产乙醇梭菌发酵
使用类似于例如美国专利申请号2011/0300593中描述的那些的方法来进行自产乙醇梭菌的发酵。简言之，将含有1.3L溶液A(3.083g NH4Ac；0.61g MgCl2*6H2O；0.294g CaCl2*2H2O；0.15g KC1；0.12g NaCl(任选的)；用蒸馏水补足至1L)的2升生物反应器用N2气体来喷射。添加85％H3PO4溶液(2.025mL，30mM)，并且使用浓缩的NH4OH水溶液将pH调节至5.3。然后添加13.5mL溶液B(20.0mg生物素；20.0mg叶酸；10.0mg盐酸吡哆醇；50.0mg盐酸硫胺素；50.0mg核黄素；50.0mg烟酸；50.0mg D-(*)-泛酸钙；50.0mg维生素B12；50.0mg对氨基苯甲酸；50.0mg硫辛酸；用蒸馏水补足至1L)，并且将溶液用N2气体来喷射。添加氯化铬(II)直到溶液的氧化-还原电位(ORP)减少至大约-200mV，其中添加刃天青(1.35mL的2g/L溶液)。添加多硫化钠(5.4mL的3M溶液，参见如下)，并且将溶液用N2来喷射，然后用含有CO的气体(1％H2；13％N2；71％CO；15％CO2)来喷射。添加金属硫化物溶液(150mL，参见如下)，并且在用大约5％(v/v)水平的活跃生长的自产乙醇梭菌培养物接种之前，将溶液喷射另外30分钟。
在装有Na2S(93.7g，0.39mol)和200ml H2O的500ml烧瓶中制备多硫化钠溶液。将溶液搅拌直到盐溶解，并且在恒定N2流下添加硫(25g，0.1mol)。在室温下搅拌2小时后，将多硫化钠溶液(相对于Na约4M，并且相对于硫约5M)(现在为透明红棕色液体)转移至N2吹扫的血清瓶中，并且包裹在铝箔中。
在配备有气密入口和出口的1L三颈烧瓶中制备铬(II)溶液以允许在惰性气体下工作并且随后将所需产物转移至适合的存储烧瓶中。将烧瓶用CrCl3*6H2O(40g，0.15mol)、锌粒[20目](18.3g，0.28mol)、汞(13.55g，1mL，0.0676mol)和500mL蒸馏水填装。接着用N2冲洗一小时，将混合物温热至约80℃以启动反应。在恒定N2流下搅拌两小时后，将混合物冷却至室温，并且连续搅拌另一个48小时，到那时反应混合物变成深蓝色溶液。将溶液转移至N2吹扫的血清瓶中，并且在4℃下储存而用于将来使用。
通过将约950mL溶液A添加至1L发酵罐中并用N2气体喷射来制备金属硫化物溶液。添加85％H3PO4溶液(1.5mL，30mM)，并且使用浓缩的NH4OH水溶液将pH调节至5.3。添加溶液B(10mL)，并且将溶液用N2喷射。添加氯化铬(II)直到溶液的氧化-还原电位(ORP)减少至大约-200mV，其中添加刃天青(1mL的2g/L溶液)。添加溶液C(1/10；10ml FeCl3；5ml CoCl2；5ml NiCl2；1ml H3BO3；1ml Na2MoO4；1ml MnCl2；1ml Na2WO4；1ml ZnCl2；1ml Na2SeO3；至1L培养基中)，然后添加多硫化钠(2mL的3M溶液)，然后将溶液用N2气体喷射。
由自产乙醇梭菌在分批条件下在多硫化物存在下进行的包含CO的基质的发酵在2-3天周期内产生基本增加的积累率，和大约4g/L的最终生物质积累。例如，大约1天的短暂迟缓期后，生物质可在发酵的大约36小时内从约0.5g/L增加至至少3.5g/L。此外，在生长期期间在多硫化合物(通常存在于分批培养中)存在下不产生乙酸盐，并且在某些情况下一些乙酸盐被消耗，以致在发酵罐中存在乙酸盐的量的净减少。将培养物生物质通过离心收获，将细胞在培养基中洗涤一次，并且将细胞团块在-80℃下冷冻或者立即用于细胞组分的分级分离。
半连续发酵方法也可用来维持生物质生产率并减少与发酵关闭和启动相关的时间(即，周转期或提前期)。
随着培养密度接近(但在进入前)静止期，以大约12-24小时的间隔进行积累的细菌生物质的收获。将大约一半的生物反应器体积通过用离心泵转移至单独的容器来移除。然后将等体积新鲜或回收的培养基返还至生物反应器中，以便反应器的光密度为其初始值的大约一半。根据以上方案继续生物反应器发酵，以便在单次发酵运行期间实施多个周期的生长和生物质回收。
b.杨氏梭菌发酵
使用例如美国专利号5,173,429和5,593,886中描述的那些方法的类似方法来进行杨氏梭菌的发酵。简言之，使用杨氏梭菌的生物学纯培养来进行分批发酵。在80％氮气和20％CO2的气氛中厌氧地实施培养基的制备((1)80.0mL盐，其包含KH2PO4 3.00g/L、K2HPO4 3.00g/L、(NH4)2SO4 6.00g/L、NaCl 6.00g/L、MgSO4*2H2O 1.25g/L；(2)1.0g酵母提取物；(3)1.0g胰酶解酪蛋白；(4)3.0ml PFN(Pfenning)微量金属溶液，其包含FeCl2*4H2O 1500mg、ZnSO4*7H2O 100mg、MnCl2*4H2O 30mg、H3BO3 300mg、CoCl2*6H2O 200mg、CuCl2*H2O 10mg、NiCl2*6H2O 20mg、NaMoO4*2H2O 30mg、Na2SeO3 10mg，并用蒸馏水补足至1L；(5)10.0ml B族维生素，其包含盐酸吡哆醛10mg、核黄素50mg、盐酸硫胺素50mg、烟酸50mg、D-泛酸钙50mg、硫辛酸60mg、对氨基苯甲酸50mg、叶酸20mg、生物素20mg、氰钴胺50mg，并用蒸馏水补足至1L；(6)0.5g盐酸半胱氨酸；(7)0.06g CaCl2*2H2O；(8)2.0g NaHCO3；(9)1.0mL刃天青(0.01％)；以及(10)920.0mL蒸馏水)。在发酵期间控制培养基的pH并且用HCl维持在5.0处。如果需要，用无菌10％NaOH或1.0％乙酸溶液进行pH的调节。将培养基转移至157.5mL血清瓶中并且用丁基橡胶塞和铝封条密封。然后将瓶子在121℃下高压灭菌20分钟。
开始试验之前的大约48小时，在类似于如上所述的那些的瓶子中由杨氏梭菌的储用培养物制备种子培养物。使种子培养物在振荡器培养箱中在37℃下生长，并且以100rpm震荡。向培养物中添加还原溶液(2.0ml Na2S，2.5％溶液以及2.0ml盐酸半胱氨酸，3.5％溶液)，将所述培养物置于振荡器培养箱中大约15分钟以允许完全除氧和温度顺应。不像用于分离生物体的生物学纯培养物的程序，在分批发酵中不需要添加甲烷抑制剂。
在含有营养培养基的New Brunswick Scientific Bioflow IIc 2.5升发酵罐中在37℃下进行具有杨氏梭菌的发酵，并且维持1.5升的恒定液面，同时将液体用以大约每分钟500立方厘米的速率引入的气体以高达每分钟1,000转数的可变速率搅拌。最佳气体保留时间在三分钟的范围内。气体补料随着由细菌进行的摄取而改变，这反过来是细胞密度的函数。
随着培养密度接近(但在进入前)静止期，以大约12-24小时的间隔进行积累的细菌生物质的收获。将大约一半的生物反应器体积通过用离心泵转移至单独的容器来移除。然后将等体积新鲜或回收的培养基返还至生物反应器中，以便反应器的光密度为其初始值的大约一半。根据以上方案继续生物反应器发酵，以便在单次发酵运行期间实施多个周期的生长和生物质回收。
实施例2
来自C1代谢微生物的脂质的稳定碳同位素分布
通过元素分析仪/连续流同位素比质谱仪使用与IsoPrime100IRMS(Isoprime,Cheadle,UK)相结合的CHNOS元素分析仪(varioISOTOPE cube,Elementar,Hanau,Germany)来分析发孢甲基弯曲菌生物质和脂质部分干样品的碳和氮含量(干重％)以及碳(13C)和氮(15N)稳定同位素比。将在发酵罐或血清瓶中培养的甲烷氧化菌生物质的样品离心，重悬于去离子水中，并且将相当于0.2mg-2mg碳(约0.5mg-5mg干细胞重量)的体积转移至5x 9mm锡囊(Costech AnalyticalTechnologies,Inc.,Valencia,CA)中并在80℃下干燥24小时。类似地，将先前提取的脂质部分悬浮于氯仿中，并将含有0.1mg-1.5mg碳的体积转移至锡囊中并在80℃下蒸发至干燥24小时。含有0.1mg碳的标准物提供可靠的δ13C值。
同位素比以“δ”符号来表示(‰)，其中相对于在每百万偏差基础上的标准物的同位素组成的物质的同位素组成由以下等式给出：δ13C(或δ15N)＝(R样品/R标准物-1)x 1,000，其中R为重同位素形式对轻同位素形式的分子比率。碳的标准物为Vienna Pee Dee Belemnite(V-PDB)，并且氮的标准物为空气。将NIST(国家技术标准局)提案的SRM(标准参考物质)号1547(桃树叶)用作校准用基准。在加州大学伯克利分校的稳定同位素生物地球化学中心进行所有同位素分析。C和N同位素分析的长期外部精度分别为0.10‰和0.15‰。
使发孢甲基弯曲菌菌株OB3b以三个不同发酵批次在甲烷上生长，使荚膜甲基球菌Bath以两个不同发酵批次在甲烷上生长，并且使甲基单胞菌属16a以单个发酵批次在甲烷上生长。分析来自这些培养物中的每个的生物质的稳定碳同位素分布(δ13C值；参见表3)。
表3.不同甲烷氧化菌的稳定碳同位素分布
*DCW、干细胞重量以从测量到的光密度(OD600)利用比相关因素关联Mt OB3b的1.0g/L至0.558g/L的OD、Mc Bath的1.0g/L至0.355g/L的OD和Mms 16a的1.0g/L至0.42g/L的OD而计算出的g/L来列出。对于Mt OB3b，每次发酵使用的碳酸氢盐的初始浓度为1.2mM或0.01％(批号68C)和0.1％或12mM(批号68A和68B)。
EFT＝有效发酵时间(以小时计)
此外，对来自如实施例1所述的在生物反应器中的甲烷上生长的菌株发孢甲基弯曲菌OB3b(Mt OB3b)、荚膜甲基球菌Bath(Mc Bath)和甲基单胞菌属16a(Mms 16a)的生物质和相应脂质部分(参见表4)进行稳定碳同位素分析。
表4.细胞和脂质的稳定碳同位素分布
批号 菌株 δ13C细胞 δ13C脂质
68C Mt OB3b -57.7 -48.6
62A Mc Bath -57.6 -52.8
66A Mms 16a -64.4 -42.2
分别在94h时(3.14g DCW/L)、26h时(2.2g DCW/L)和39h时(1.14g DCW/L)收获来自菌株Mt OB3b、Mc Bath和Mms 16a的生物质。表4中脂质的δ13C值表示重复测定的平均值。
实施例3
甲烷来源和纯度对脂质的稳定碳同位素分布的影响
为检测在含有天然气组分的甲烷上的甲烷氧化菌的生长，将含有100mL限定培养基MMS1.0的一系列0.5升血清瓶用来自在供应有1:1(v/v)甲烷和空气混合物的相同培养基中生长的血清瓶分批培养物(5％v/v)的发孢甲基弯曲菌OB3b或荚膜甲基球菌Bath接种。培养基MMS1.0的组成如下：0.8mM MgSO4*7H2O、30mM NaNO3、0.14mMCaCl2、1.2mM NaHCO3、2.35mM KH2PO4、3.4mM K2HPO4、20.7μMNa2MoO4*2H2O、6μM CuSO4*5H2O、10μM FeIII-Na-EDTA和1mL/升的微量金属溶液(含有每升：500mg FeSO4*7H2O、400mg ZnSO4*7H2O、20mg MnCl2*7H2O、50mg CoCl2*6H2O、10mg NiCl2*6H2O、15mg H3BO3、250mg EDTA)。在将培养基高压灭菌并冷却后，添加磷酸盐、碳酸氢盐和FeIII-Na-EDTA。培养基的最终pH为7.0±0.1。
将所接种的瓶子用橡胶套塞密封，并且用通过注射器添加的60mL甲烷气体通过无菌的0.45μm滤器和无菌的27G针头来注射。将复制的培养物各自用60mL体积的99％纯度的(A)甲烷(2.0级,Praxairthrough Alliance Gas,San Carlos,CA)、代表天然气标准的70％纯度的(B)甲烷(Sigma-Aldrich；还含有9％乙烷、6％丙烷、3％甲基丙烷、3％丁烷及其他较小烃组分)、作为甲烷来源A和B的1:1混合物递送的85％纯度的(C)甲烷；以及(D)>93％甲烷(1.3级，Specialty ChemicalProducts,South Houston,TX；内部分析显示组成>99％甲烷)。将培养物在30℃(发孢甲基弯曲菌菌株OB3b)或42℃(荚膜甲基球菌Bath)下用250rpm旋转震荡孵育，并且以大约12小时间隔通过取出1mL样品以测定OD600来计算生长。在这些时候，将瓶子放空，并且将顶部空间用60mL各自的甲烷来源(A、B、C或D)和60mL浓缩氧气(至少85％纯度)替换。以约24小时间隔将5mL样品移除，将细胞通过离心(8,000rpm，10分钟)回收，然后在分析前在-80℃下储存。
实施对来源于发孢甲基弯曲菌菌株OB3b和荚膜甲基球菌Bath的甲烷氧化菌生物质的碳和氮含量(干重％)以及碳(13C)和氮(15N)稳定同位素比的分析。表5示出来自在具有不同水平和纯度的甲烷上以及在不同批次的瓶培养中生长的荚膜甲基球菌Bath的生物质样品的稳定碳同位素分析的结果。
表5.在具有不同纯度的不同甲烷来源上生长的荚膜甲基球菌Bath的 稳定碳同位素分布
*甲烷纯度：A：99％甲烷，2.0级(最小值99％)；B：70％甲烷，天然气标准(含有9％乙烷、6％丙烷、3％甲基丙烷、3％丁烷)；C：85％甲烷(A甲烷和B甲烷的1:1混合物)
时间＝瓶培养时间(以小时计)
在一种甲烷来源(A，99％)上生长的荚膜甲基球菌Bath的平均δ13C为-41.2±1.2，然而在一种不同的甲烷来源(B，70％)上生长的荚膜甲基球菌Bath的平均δ13C为-44.2±1.2。当甲烷来源A和B混合时，观察到-43.8±2.4的中间平均δ13C。这些数据显示了由于输入甲烷的δ13C的差异，在甲烷来源A和B上生长的细胞材料的δ13C彼此显著不同。但是，在两种气体的混合物上生长的细胞优先地利用12C，并且因此显示出更负δ13C值的趋势。
进行相似的实验以检验在不同甲烷来源上以及在不同批次的瓶培养中生长的两种不同甲烷氧化菌(荚膜甲基球菌Bath和发孢甲基弯曲菌OB3b)是否显示δ13C分布(参见，表6)的差异。
表6.在不同纯度的不同甲烷来源上生长的不同甲烷氧化菌的稳定碳 同位素分布
*甲烷来源和纯度：A：99％甲烷(2.0级)；D：>93％甲烷(1.3级)
时间＝瓶培养时间(以小时计)
在第一甲烷来源(A)上生长的荚膜甲基球菌的平均δ13C为-44.5±8.8，然而在相同甲烷来源上生长的发孢甲基弯曲菌的平均δ13C为-47.8±2.0。在第二甲烷来源(B)上生长的荚膜甲基球菌的平均δ13C为-37.9±0.4，然而发孢甲基弯曲菌的平均δ13C为-39.8±4.5。这些数据显示了在甲烷来源上生长的细胞材料的δ13C高度类似于来自在相同甲烷来源上生长的不同菌株的细胞材料的δ13C。因此，观察到的细胞材料的δ13C似乎主要依赖于输入气体的组成，而不是所研究的特定细菌菌株的性质。
可组合以上所述的各个实施方案来提供其他实施方案。本说明书中提及的或本申请数据表中列出的专利和非专利出版物的全部内容(包括2014年1月16日提交的美国临时专利申请号61/928,366的公开)以引用方式整体并入本文。如果需要采用各种专利、申请和出版物的构思来提供其他实施方案，可修改实施方案的方面。
可根据以上详细说明来对实施方案进行这些变化和其他变化。通常，在以下实施方案中，所使用的术语不应该解释为将实施方案限于本说明书和权利要求书中公开的具体实施方案，而应该解释为包括所有可能实施方案以及此类实施方案所授权的等效物的全部范围。因此，实施方案不受公开限制。

Claims (43)

1.一种重组C1代谢微生物，其包含选自由以下组成的组的外源性核酸：编码碳水化合物生物合成酶的外源性核酸，和编码可操作地连接至编码天然碳水化合物生物合成酶的核酸的表达控制序列的核酸，其中所述重组C1代谢微生物能够将天然气来源的碳原料转化成所需碳水化合物。
2.如权利要求1所述的重组C1代谢微生物，其中所述外源性核酸编码碳水化合物生物合成酶。
3.如权利要求1-2中任一项所述的重组C1代谢微生物，其中所述天然气来源的原料是天然气。
4.如权利要求1-3中任一项所述的重组C1代谢微生物，其中所述天然气来源的原料是甲烷。
5.如权利要求1-4中任一项所述的重组C1代谢微生物，其中所述重组C1代谢微生物能够产生所述所需碳水化合物，所产生的水平大于天然C1代谢微生物所产生的水平至少10％。
6.如权利要求1-5中任一项所述的重组C1代谢微生物，其中所述C1代谢微生物是甲烷氧化菌。
7.如权利要求1-6中任一项所述的重组C1代谢微生物，其中所述所需碳水化合物选自由多糖、二糖和单糖组成的组。
8.如权利要求7所述的重组C1代谢微生物，其中所述所需碳水化合物是多糖，所述多糖是β-葡聚糖。
9.如权利要求1-8中任一项所述的重组C1代谢微生物，其中所述β-葡聚糖选自由以下组成的组：β-(1,3)-葡聚糖、β-(1,3)(1,6)-葡聚糖、β-(1,3)(1,4)-葡聚糖、β-(1,4)-葡聚糖和β-(1,6)-葡聚糖。
10.如权利要求8-9中任一项所述的重组C1代谢微生物，其中所述外源性核酸编码碳水化合物生物合成酶，所述碳水化合物生物合成酶是葡聚糖合酶。
11.如权利要求1-7中任一项所述的重组C1代谢微生物，其中所述外源性核酸编码作为糖异生酶的碳水化合物生物合成酶。
12.如权利要求11所述的重组C1代谢微生物，其中所述糖异生酶选自由以下组成的组：丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、烯醇化酶、磷酸甘油酸变位酶、磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、A型醛缩酶、果糖1,6-二磷酸酶、磷酸果糖激酶、磷酸葡糖异构酶、己糖激酶和葡糖-6-磷酸。
13.如权利要求1-7中任一项所述的重组C1代谢微生物，其中所述外源性核酸编码作为糖原生成酶的碳水化合物生物合成酶。
14.如权利要求13所述的重组C1代谢微生物，其中所述糖原生成酶选自由以下组成的组：葡糖-1-磷酸腺苷酰基转移酶、糖原合成酶和1,4-α-葡聚糖分支蛋白。
15.如权利要求1-14中任一项所述的重组C1代谢微生物，其中所述外源性核酸编码对于细菌是内源性的碳水化合物生物合成酶。
16.如权利要求1-14中任一项所述的重组C1代谢微生物，其中所述外源性核酸编码对于选自由酵母、真菌和植物组成的组的生物体是内源性的碳水化合物生物合成酶。
17.如权利要求1-14中任一项所述的重组C1代谢微生物，其中所述外源性核酸编码对于选自由大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌组成的组的微生物是内源性的碳水化合物生物合成酶。
18.如权利要求1-7中任一项所述的重组C1代谢微生物，其中所述外源性核酸编码碳水化合物生物合成酶，所述碳水化合物生物合成酶具有与选自由以下SEQ ID NO组成的组的参照序列至少90％相同的氨基酸序列：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36和38。
19.如权利要求1和3-9中任一项所述的重组C1代谢微生物，其中所述外源性核酸编码可操作地连接至编码天然碳水化合物生物合成酶的核酸的表达控制序列。
20.如权利要求19所述的重组C1代谢微生物，其中所述天然碳水化合物生物合成酶是天然糖异生酶。
21.如权利要求19所述的重组C1代谢微生物，其中所述天然碳水化合物生物合成酶是天然糖原生成酶。
22.如权利要求19所述的重组C1代谢微生物，其中所述天然碳水化合物生物合成酶是天然葡聚糖合酶。
23.如权利要求1-22中任一项所述的重组C1代谢微生物，其中所述外源性核酸经过密码子优化以在所述重组C1代谢微生物中最佳表达。
24.如权利要求1-6中任一项所述的重组C1代谢微生物，其中所述外源性核酸编码碳水化合物生物合成酶，所述碳水化合物生物合成酶包含与选自由以下SEQ ID NO组成的组的核酸参照序列至少85％相同的核酸序列：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35和37。
25.如权利要求1-24中任一项所述的重组C1代谢微生物，其中所述微生物展现出小于-30‰的δ13C。
26.如权利要求25所述的重组C1代谢微生物，其中所述微生物展现出小于-40‰的δ13C。
27.一种生物质，其来源于如权利要求1-26中任一项所述的重组C1代谢微生物。
28.如权利要求27所述的生物质，其中所述生物质展现出小于-30‰的δ13C。
29.如权利要求28所述的生物质，其中所述生物质展现出小于-40‰的δ13C。
30.一种碳水化合物组合物，其包含从如权利要求27-29中任一项所述的生物质中提取的碳水化合物，其中所述组合物展现出小于-30‰的δ13C。
31.如权利要求30所述的组合物，其中所述组合物展现出小于-40‰的δ13C。
32.一种动物饲料，其包含如权利要求27-29中任一项所述的生物质或如权利要求30-31中任一项所述的碳水化合物组合物。
33.如权利要求32所述的动物饲料，其还包含选自由以下组成的组的添加剂：植物来源的材料、动物来源的材料和微生物来源的材料。
34.如权利要求33所述的动物饲料，其中所述添加剂是来源于异源微生物的微生物来源材料。
35.如权利要求33所述的动物饲料，其中所述添加剂是植物来源的材料。
36.如权利要求35所述的动物饲料，其中所述植物来源的材料来源于玉米。
37.如权利要求35所述的动物饲料，其中所述植物来源的材料选自由大豆粉和豌豆蛋白组成的组。
38.如权利要求33所述的动物饲料，其中所述添加剂是动物来源的材料。
39.如权利要求38所述的动物饲料，其中所述动物来源的材料是鱼粉。
40.一种培养基或发酵培养基，其包含如权利要求27-29中任一项所述的生物质或如权利要求30-31中任一项所述的组合物。
41.一种生产所需碳水化合物的方法，所述方法包括在天然气来源的碳原料存在下在足以产生所述所需碳水化合物的条件下培养如权利要求1-26中任一项所述的重组C1代谢微生物。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述天然气来源的碳原料是天然气。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述天然气来源的碳原料是甲烷。
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