CN106029870A - 用于增强的氨基酸产生的微生物及相关方法 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及经工程化用于增强产生所需氨基酸的重组微生物以及相关生物质,和可尤其用作动物饲料成分的组合物。本公开还提供相关的方法。
Description
序列表的引用
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发明领域
本公开涉及用于增强的氨基酸产生的新型微生物及来源于重组C1代谢微生物的饲料产品(其包含用于增强的氨基酸产生的工程化代谢途径),及相关组合物和方法。
背景
在过去的几十年,在整个饲料添加剂使用过程中,获得了动物饲料利用效率的改善。这些添加的物质增加了动物饲料组合物的营养素-含量、能量-含量和/或抵御疾病性质。对于商业动物产生商日益增大的挑战是谷物成本上涨。上涨的成本部分由于生物燃料和人类食物用途对谷物的竞争性需求导致。随着谷物和蛋白质组分成本上涨,加上有限的饲料产生可用土地,将非常需要具有有益的营养性和抵御疾病性的可替代低成本动物饲料产品。
发明概述
在第一个实施方案中,本发明提供包含第一外源核酸的重组C1代谢微生物,所述第一外源核酸选自由编码L-氨基酸生物合成酶的外源核酸和编码可操作地连接至编码天然L-氨基酸生物合成酶的核酸的表达控制序列组成的组,其中所述重组C1代谢微生物能够将天然气来源的碳原料转化为所需的L-氨基酸,并且其中重组C1代谢微生物的δ13C低于-30‰。
在另一个实施方案中,本发明的重组C1代谢微生物还包含编码贮存多肽(cachepolypeptide)的第二外源核酸。在另外的实施方案中,本发明提供来源于本发明的重组C1代谢微生物培养物的生物质,及包含本发明的生物质的组合物。在另一个实施方案中,本发明提供氨基酸组合物,其包含从本发明的生物质提取的一种或多种氨基酸。
在另一个进一步的实施方案中,本发明提供动物饲料,其包含本发明的生物质或氨基酸组合物。在一些实施方案中,所述动物饲料还包含选自由植物来源的物质、动物来源的物质和微生物-来源的物质组成的组的添加剂。
在另一些进一步的实施方案中,本发明提供产生所需L-氨基酸的方法,所述方法包括在天然气来源的碳原料的存在下在足以产生所需L-氨基酸的条件下培养本发明的重组C1代谢微生物。在一些实施方案中,所述L-氨基酸展现了低于-30‰的δ13C。
在另一个实施方案中,本发明提供产生富L-氨基酸的生物质的方法,所述方法包括在天然气来源的碳原料的存在下在培养基中在足以促进重组C1代谢微生物生长为生物质的条件下培养本发明的重组C1代谢微生物。
附图简述
图1提供了在如实施例4所述从赖氨酸生物合成操纵子过表达单独基因的荚膜甲基球菌(Methylococcus capsulatus)巴斯(Bath)菌株中胞外L-赖氨酸产生水平的图解描述。对于每个菌株,显示在异源表达指定基因的菌株的细胞上清液检测到的胞外L-赖氨酸浓度除以培养物光密度(OD600nm)。基因型关键34和1067分别是空质粒对照和在相同的启动子背景下表达非相关基因(荧光蛋白)的对照。所述图显示了指定基因的过表达导致胞外L-赖氨酸增加超过空质粒对照(基因型关键34)和表达非相关基因(绿色荧光蛋白)的对照。
图2提供了如实施例5所述在异源表达不同的密码子优化序列(各自编码相同的贮存蛋白质(高赖氨酸含量多肽))的菌株的细胞生物质样品中检测到的细胞相关的L-赖氨酸的浓度的图解描述。基因型关键34是空质粒对照。所述条表示每个实验基因型中的八个克隆的平均值。
图3提供了如实施例6所述于来自异源表达富赖氨酸贮存多肽(HighK)和dapA的菌株的培养物的干重生物质中测定的细胞相关的L-赖氨酸水平的图解描述。所述条表示每个实验基因型的八个克隆的平均值。实验菌株1186-1193中的所有HighK基因编码相同的氨基酸序列,但具有不同的密码子使用。所述图说明这些基因的共表达导致一系列增强的细胞-相关的L-赖氨酸产生。
图4提供了如实施例6所述在异源表达富赖氨酸贮存多肽(HighK)和dapA的菌株的培养物上清液样品中检测到的胞外L-赖氨酸水平的图示。所述条表示每个实验基因型的八个克隆的平均值。基于每组克隆的平均值,所述图说明所述基因组合的表达导致胞外L-赖氨酸超过对照(基因型关键1067)8至23倍。
详述
本公开提供具有利用相对低成本碳原料作为能量来源能力的新型重组C1代谢微生物,且此外提供所需的相关生物质、营养素产品、组合物。本发明的重组微生物经工程化以用于增强的商业所需L-氨基酸产生。这些重组微生物以及来源其的生物质和L-氨基酸组合物可用作动物(诸如,例如牲畜、鱼、禽类等)以及培养或发酵的微生物的营养来源。
在一个实施方案中,本发明提供了重组C1代谢微生物,其中所述重组C1代谢微生物包含选自由以下组成的组的外源核酸:编码L-氨基酸生物合成酶的外源核酸和编码可操作地连接至编码天然L-氨基酸生物合成酶的核酸的表达控制序列的外源核酸,其中所述重组C1代谢微生物能够将天然气碳原料转化为所需的L-氨基酸,并且其中所述重组C1代谢微生物展现了低于-30‰且通常低于-35‰的δ13C。典型地,所述重组C1代谢微生物是非光合C1代谢微生物,且更典型地,其是甲烷营养型微生物。
在这些实施方案中,本发明的重组微生物经工程化以将为相较于更昂贵的碳水化合物相对低成本且丰富能源的天然气-来源的原料(例如,天然气或从天然气来源的C1底物(诸如例如甲烷))转化为更高价值的营养素。如本文所用,术语"天然气-来源的原料"是指天然气或从天然气分离的任何组分(包括C1底物)或从天然气转化的任何组分(如合成气)。
术语"天然气"在本文中是指可通过常规方法(如多孔储器的钻孔和注水)或非常规方法(如具有低透气性的地层的水力压裂、水平钻孔或定向钻孔)获得的天然存在的气体混合物。所述气体混合物由甲烷和其它化合物(包括其它C1化合物)以及其它轻烷烃气体(诸如例如乙烷、丙烷、丁烷、戊烷等)、二氧化碳、氮气、硫化氢等及其组合组成。非常规天然气可从以下来源获得:诸如例如在砂岩或碳酸盐中形成的致密砂岩气、在煤沉积物中形成且在煤颗粒中吸附的煤床甲烷、在细粒页岩中形成且在粘土粒中吸附或保持在小孔或微裂隙内的页岩气、为在低温和高压下在地方(诸如在海洋和永冻土下)处形成的天然气和水的晶体组合的甲烷水合物。
如本文所用,"C1底物"或"C1化合物"是指含有缺乏碳-碳键的分子或组分的任何碳。示例性C1底物包括合成气、甲烷、甲醇、甲醛、甲酸或其盐、一氧化碳、二氧化碳、甲基化胺(如甲胺、二甲胺、三甲胺等)、甲基化硫醇、甲基卤(如溴甲烷、氯甲烷、碘甲烷、二氯甲烷等)、氰化物或其任何组合。
在本发明的某些实施方案中,天然气-来源的原料通常是天然气、来自天然气的C1底物,或为合成气。典型地,所述C1底物是甲烷。利用天然气-来源的碳底物作为原料的本发明重组C1代谢微生物展现了不同的同位素碳标志,这在下文中更详细描述。这种不同的同位素碳标志也通过此类重组微生物的产物(如生物质、L-氨基酸、L-氨基酸组合物等)展现。
如本文所用,术语"C1代谢微生物"或"C1代谢非光合微生物"是指具有使用C1底物作为能量来源或作为其主要能量和生物质来源的能力的任何微生物,并且可使用或可使用其它碳底物(诸如糖和复合碳水化合物)用于能量和生物质。例如,C1代谢微生物可氧化C1底物诸如甲烷或甲醇。C1代谢微生物包括细菌(诸如甲烷营养菌和嗜甲基菌)及酵母。在某些实施方案中,C1代谢微生物不包括光合微生物,诸如藻类。在一些实施方案中,所述C1代谢微生物将为"专性C1代谢微生物",意为其唯一能量来源是C1底物。在另外的实施方案中,C1代谢微生物(如甲烷营养菌)将在C1底物原料的存在下培养(即使用C1底物作为能量来源)。
本发明的重组C1代谢微生物经工程化以用于经由工程化编码核酸的L-氨基酸生物合成(AB)酶或其表达增强所需L-氨基酸的产生。术语"L-氨基酸生物合成酶"和"AB酶"在本文中可互换使用来指代参与重组宿主C1代谢微生物产生L-氨基酸的酶。
在一个实施方案中,本发明提供包含第一外源核酸的重组C1代谢微生物,所述第一外源核酸选自由编码L-氨基酸生物合成酶的外源核酸和编码可操作地连接至编码天然L-氨基酸生物合成酶的核酸的表达控制序列的外源核酸组成的组。典型地,如下文更详细地描述,所述重组C1代谢微生物的δ13C低于-30‰。通常,所述重组C1代谢微生物是甲烷营养型微生物。
在一些实施方案中,本发明的重组C1代谢微生物还包含编码贮存多肽的第二外源核酸。如本文所用,术语"贮存多肽"是指具有以下氨基酸序列的多肽,所述氨基酸序列:(1)至少约10个氨基酸残基长;和(2)包含目的在于以一定水平增强的L-氨基酸,所述水平为氨基酸序列中氨基酸残基总数的至少10%(按物种分)。典型地,所述贮存多肽不是AB(氨基酸生物合成)酶。
如实施例所证实,贮存多肽可用于促进本发明的重组C1代谢微生物中所需L-氨基酸产生增强。在一些实施方案中,贮存多肽的氨基酸序列可为(1)至少约10个氨基残基长、至少约15、至少约20、至少约30、至少约40、至少约50、至少约60、至少约70、至少约80、至少约90、至少约100、至少约150、至少约200、至少约250、至少约300、至少约350、至少约400、至少约450或至少约500个氨基酸残基长;且(2)包含目的在于以一定水平增强的L-氨基酸,所述水平是氨基酸序列内的氨基酸残基总数的至少约10%(按物种分),或所述水平为氨基酸序列内的氨基酸残基的总数的至少约11%、至少约12%、至少约13%、至少约14%、至少约15%、至少约16%、至少约17%、至少约18%、至少约19%、至少约20%、至少约21%、至少约22%、至少约23%、至少约24%、至少约25%、至少约26%、至少约27%、至少约28%、至少约29%、至少约30%、至少约31%、至少约32%、至少约33%、至少约34%、至少约35%、至少约36%、至少约37%、至少约38%、至少约39%、至少约40%、至少约41%、至少约42%、至少约43%、至少约44%、至少约45%、至少约46%、至少约47%、至少约48%、至少约49%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%或至少约95%。本发明实践中采用的贮存多肽可为天然存在的多肽或非-天然存在的多肽。编码贮存多肽的第二外源核酸通常经密码子优化以用于从重组宿主C1代谢微生物最佳表达。示例性贮存多肽是如实施例5和6所示的S9A家族肽酶(SEQ ID NO:152)。经密码子优化以用于从荚膜甲基球菌巴斯最佳表达的编码S9A家族肽酶的核酸序列提供为SEQ ID NO:152、154、156、158、160、162、164和166。如本文所用,术语"多肽"和"蛋白质"可互换使用指代氨基酸残基聚合物。
本领域的普通技术人员可通过搜索其中至少10%的总氨基酸含量为所需L-氨基酸的蛋白质容易地鉴别适用于本发明的贮存多肽。这可例如通过查询来自目标生物的所有蛋白质的序列数据库(诸如例如GENBANK(万维网址ncbi.nlm.nih.gov/genbank/))、然后计算每种蛋白质的[所需氨基酸的发生]/[蛋白质序列长度]比率来进行。这一分析的结果可基于所述比率过滤和分类以寻找合适的蛋白质。
用于本发明实践中的编码AB酶和贮存多肽的外源核酸通常经密码子优化以用于从重组宿主C1代谢微生物最佳表达。这些可编码对于宿主C1微生物异源的物种是天然的酶或蛋白质,或编码天然存在的多肽的突变体(即变体)。当第一外源核酸编码AB酶时,所述外源核酸可为编码参与L-氨基酸的生物合成的AB酶的核酸,所述L-氨基酸选自由以下组成的组:L-赖氨酸、L-色氨酸、L-甲硫氨酸、L-半胱氨酸、L-苏氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-缬氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-甘氨酸、L-鸟氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸和L-酪氨酸。在一些实施方案中,所述L-氨基酸选自由L-赖氨酸、L-色氨酸、L-甲硫氨酸、L-半胱氨酸、L-苏氨酸等组成的组。在一些情况下,所述L-氨基酸选自由L-赖氨酸、L-色氨酸、L-甲硫氨酸、L-半胱氨酸和L-苏氨酸组成的组。合适的外源核酸包括编码选自由以下组成的组的L-氨基酸生物合成酶的那些:
(i)L-赖氨酸生物合成酶,诸如例如:赖氨酸-敏感性天冬氨酸激酶III(lysC)、天冬氨酸激酶、天冬氨酸-半醛脱氢酶(asd)、二氢吡啶二羧酸合酶(dapA)、二氢吡啶二羧酸还原酶(dapB)、2,3,4,5-四氢吡啶-2,6-甲酸N-琥珀酰转移酶(dapD)、乙酰鸟氨酸/琥珀酰二氨基庚二酸氨基转移酶(argD)、琥珀酰-二氨基庚二酸脱琥珀酰酶(dapE)、琥珀酰二氨基庚二酸转氨酶、二氨基庚二酸差向异构酶(dapF)、二氨基庚二酸二羧酶(lysA)等;
(ii)L-色氨酸生物合成酶,诸如例如分支酸-丙酮酸裂解酶(ubiC)、邻氨基苯甲酸合酶组分I(trpE)、邻氨基苯甲酸合酶组分II(trpG)、邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶(trpD)、磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶(trpC)、色氨酸生物合成蛋白质(trpC)、N-(5'磷酸核糖基)邻氨基苯甲酸异构酶(trpF)、吲哚-3-甘油磷酸合酶、色氨酸合酶α链(trpA)、色氨酸合酶β链(trpB)等;
(iii)L-甲硫氨酸生物合成酶,诸如例如高丝氨酸O-琥珀酰转移酶(metA)、胱硫醚γ-合酶(metB)、蛋白质MalY、胱硫醚β-裂解酶(metC)、B12-依赖性甲硫氨酸合酶(metH)、5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸-高半胱氨酸S-甲基转移酶(metE)等;
(iv)L-半胱氨酸生物合成酶,并且其中所述半胱氨酸生物合成酶选自由丝氨酸乙酰转移酶(CysE)、半胱氨酸合酶A、半胱氨酸合酶B等组成的组;及
(v)L-苏氨酸生物合成酶,诸如例如天冬氨酸转氨酶、PLP-依赖性氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、天冬氨酸激酶、天冬氨酸-半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合酶等。
以上的酶可见于多种异源物种中,包括微生物诸如例如大肠杆菌(E.coli)和谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。在某些特定的实施方案中,所述外源核酸编码具有下文表A所示的SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148或150的任一条序列的L-氨基酸生物合成酶。如上所述,所述外源核酸通常经密码子优化以用于从重组C1代谢微生物最佳表达。编码AB酶的示例性核酸序列还提供在表A中。这些核酸序列经密码子优化以用于在荚膜甲基球菌巴斯中表达。
表A.示例性氨基酸生物合成酶
适用于本发明实践中的外源核酸包括编码变体AB酶序列的那些,所述序列与参考或亲本野生型多肽序列至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一,诸如例如对应于SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148或150的任一者的参考序列,前提是所述变体保留目标L-氨基酸生物合成酶活性。在某些实施方案中,所述AB酶变体多肽将包含在相对于参考或亲本野生型AB酶的预定位置处的至少一个氨基酸取代(如1、2、3、5、6、7、8、9或10或更多或多达20、25或30个取代),前提是变体保留了目标AB酶活性。所述AB酶变体多肽可另外包含一个或多个保守性取代。"保守性取代"在本领域中被认为是将一种氨基酸取代为具有类似性质的另一种氨基酸。示例性保守性取代在本领域中是熟知的(参见如WO 97/09433,第10页;Lehninger,Biochemistry,第2版;Worth Publishers,Inc.NY:NY(1975),第71-77页;Lewin,Genes IV,OxfordUniversity Press,NY and Cell Press,Cambridge,MA(1990),第8页,其通过引用并入本文)。
用于产生编码此类变体酶的适合外源核酸的方法更详细地描述于下文中。
两个或更多个核酸或氨基酸序列之间的"同一性百分比"是考虑了空位数目和需要引入以优化两条或多条序列比对的每个空位的长度,由所述序列共享的同一位置的数目的函数(即同一性%=同一位置的数目/位置总数x 100)。比较序列和测定两条或多条序列之间的同一性百分比可使用数学算法获得,诸如在其缺省参数下的BLAST和空位BLAST程序(如Altschul等,J.Mol.Biol.215:403,1990;还参见BLASTN,万维网址ncbi.nlm.nih.gov/BLAST,其通过引用并入本文)。
如上所示,本发明实践中采用的外源核酸可经密码子优化以用于在C1代谢微生物中表达。重组蛋白质的表达在其原始宿主外可能是难的。例如,密码子使用偏好变化在不同的细菌物种中观察到(Sharp等,Nucl.Acids.Res.33:1141,2005,其通过引用并入本文)。甚至在它们天然宿主内的重组蛋白质的过表达也可能是难的。在某些实施方案中,如本文所述的待引入宿主的核酸可经受密码子优化,之后引入宿主以确保蛋白质表达是有效或增强的。密码子优化是指在转化之前改变基因或核酸编码区的密码子以反映宿主的典型密码子使用而不改变由非天然DNA分子编码的多肽。之前已经描述了用于在异源宿主中的最佳基因表达的密码子优化方法(参见如Welch等,PLoS One4:e7002,2009;Gustafsson等,TrendsBiotechnol.22:346,2004;Wu等,Nucl.Acids Res.35:D76,2007;Villalobos等,BMCBioinformatics 7:285,2006;美国专利公开No.2011/0111413和2008/0292918;所述方法的公开内容通过引用以其整体并入本文)。编码适用于本发明实践中的AB酶的外源核酸包括具有与选自由以下组成的组的核酸参考序列至少约85%同一性的核酸序列的那些:SEQID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147和149。编码适用于本发明实践中的CB酶的说明性外源核酸包括经经密码子优化以用于在荚膜甲基球菌巴斯中最佳表达的序列,诸如例如SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147和149的任一者。
类似地,本公开编码多肽变体的外源核酸分子可使用基于以上指定的参考文献中所述的系统发育方法设计(美国专利No.8,005,620;Gustafsson等;Welch等;Villalobos等;Minshull等,其全部内容通过引用并入本文)。
编码L-氨基酸生物合成酶的外源核酸包括编码具有或保留相应L-氨基酸生物合成酶活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的多核苷酸。通过测量多肽转化底物为产物的能力确定多肽是否具有特定活性的方法是本领域已知的。
在一些实施方案中,所述外源核酸编码可操作地连接至编码天然碳水化合物生物合成酶的核酸的表达控制序列。典型地,所述表达控制序列是导致天然L-氨基酸生物合成酶过表达的一种表达控制序列。
当第一外源核酸编码AB酶时,其通过可操作地连接至外源性表达控制序列。所述外源性表达控制序列可能可操作地连接至编码L-氨基酸生物合成酶的外源核酸以增强所需L-氨基酸的产生。所述外源性表达控制序列通常经密码子优化以用于从C1代谢微生物宿主细胞最佳表达。
在一些实施方案中,所述第一外源核酸编码可操作地连接至编码天然L-氨基酸生物合成酶的核酸的表达控制序列。示例性表达控制序列包括下文所述的启动子。在这些实施方案中,天然L-氨基酸生物合成酶的表达通常增加(即过表达)。增加的表达或活性包括基因或蛋白质的表达或活性增加高于野生型(天然或非-遗传工程化)对照或参考微生物的水平。如果表达或活性是在基因或蛋白质不正常表达或无活性的微生物中,则所述基因或蛋白质过表达。如果表达或活性比野生型对照或参考微生物延长或更久存在于重组微生物中,则基因或蛋白质过表达。如本文所用,"过表达的"和"过表达"当指代基因或蛋白质时意指基因或蛋白质的表达或活性增加。术语"核酸"、"多核苷酸"和"基因"在本文中可互换使用来指代单链或双链形式的核酸残基(如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)聚合物。
除了上文所述的外源核酸之外,本发明的重组C1代谢微生物还可包含增强所需L-氨基酸产生的遗传修饰。例如,本发明的重组C1代谢微生物还可包含可操作地连接至编码内源性酶的内源性核酸的外源性表达控制序列,所述内源性酶利用一种或多种由L-氨基酸生物合成酶所利用的相同底物或利用所需的L-氨基酸作为底物(即"竞争性"内源性酶)。这可以进行以下调竞争性内源性酶。
在一些实施方案中,可能需要通过突变竞争性内源性酶以缺失或减弱其活性,从而降低或抑制竞争性内源性酶活性。如本文所用的"抑制"或"抑制的"是指靶基因表达或靶分子活性相对于对照、内源性或参考分子直接或间接改变、降低、下调、消除或缺失,其中改变、降低、下调或消除是统计学上、生物上、工艺上或临床上显著的。
用于在C1代谢微生物中下调、失活、敲除或缺失内源性基因功能的各种方法是本领域已知的。例如,当将外源性多核苷酸插入结构基因以破坏转录时,靶向基因破坏是有效的基因下调方法。将包含位于具有与待破坏的靶宿主基因一部分的高度同源性的序列侧翼的外源性插入DNA(如遗传标记)的基因盒引入宿主C1代谢微生物。外源性DNA经由天然DNA复制机制破坏靶宿主基因。在C1代谢微生物(包括甲烷营养型细菌)中等位交换以构建缺失/插入突变体已描述于例如Toyama和Lidstrom,Microbiol.144:183,1998;Stoylar等,Microbiol.145:1235,1999;Ali等,Microbiol.152:2931,2006;Van Dien等,Microbiol.149:601,2003;Martin和Murrell,FEMS Microbiol.Lett.127:243,2006中,其全部内容通过引用并入本文。例如,参与诸如碳水化合物合成途径的其它途径的酶还可靶向下调以将宿主微生物的代谢活性集中于L-氨基酸生物合成上。
所述重组C1代谢微生物因此可被工程化以具有以增强的水平产生所需L-氨基酸的能力。在这些实施方案的一些中,当在天然气-来源的原料(如天然气、甲烷等)的存在下在至少一组的培养条件下培养时,所述重组C1代谢微生物以一定水平产生所需的L-氨基酸,所述水平比由天然C1代谢微生物产生的水平至少大约10%且是由天然C1代谢微生物产生的水平的高达约2-倍、高达约3-、4-、5-、10-、20-、30-、40-、50-、60-、70-、80-、90-、100-和高达约500-或约1000-倍。在其它实施方案中,当在天然气-来源的原料的存在下在至少一组的培养条件下培养时,所述重组C1代谢微生物以一定水平产生所需的L-氨基酸,所述水平比由天然C1代谢微生物产生的水平大至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%或至少约95%大于且是由天然C1代谢微生物产生的水平的高达约2-倍、高达约3-、4-、5-、10-、20-、30-、40-、50-、60-、70-、80-、90-、100-至约500-或约1000-倍。典型地,当在天然气-来源的原料的存在下在至少一组的培养条件下培养时,由本发明的重组C1代谢微生物产生所需L-氨基酸的增强水平是天然C1代谢微生物的水平的至少约2-倍、3-、4-、5-、10-、20-、30-、40-、50-、60-、70-、80-、90-或100-倍。
用于在微生物中表达外源核酸的重组方法是本领域熟知的。此类方法可见于描述于例如Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,Cold SpringHarbor Laboratory,New York(2001);和Ausubel等,Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley and Sons,Baltimore,MD(1999)中,其全部内容通过引用并入本文。对编码酶或其功能片段的核酸分子的遗传修饰可赋予从其天然存在状态改变的重组细胞以生物化学能力或代谢能力。
如本文所用,术语"内源性"和"天然的"当指代核酸、多肽(诸如酶)、化合物或活性时,是指正常存在于宿主细胞中的核酸、多肽、化合物或活性。术语"同源性"或"同系物"是指外源性(非天然的)来源的分子或活性,其是与存在于或来源于宿主细胞、物种或菌株的分子或活性相同或类似的分子或活性。
如本文所用,术语"异源性"和"外源性"当指代核酸分子、构建体或序列时是指并非对表达其的细胞是天然的核酸分子或核酸分子序列一部分,对已经改变或突变的宿主细胞是天然的核酸分子或核酸分子一部分,或者在类似条件下与天然表达水平相比表达改变的核酸分子。例如,异源对照序列(如启动子、增强子)可用于以不同于天然或在培养物中正常表达的基因或核酸分子的方式调控基因或核酸分子的表达。在某些实施方案中,异源核酸分子可能对于天然宿主细胞基因是同源性的,但可具有改变的表达水平或具有不同序列或这两者。在其它实施方案中,异源或外源核酸分子对于宿主细胞或宿主基因组可能不是内源性的,但反而可通过接合、转化、转染、电穿孔等添加至宿主细胞,其中可将添加的分子整合至宿主基因组中,或可作为染色体外遗传物质(如质粒或其它自复制载体)存在。术语"异源性"当指代生物时是指不同于宿主细胞的物种。
在某些实施方案中,可将多于一种异源或外源核酸分子引入宿主细胞作为各自的核酸分子、作为多顺反子核酸分子、作为编码融合蛋白质的单个核酸分子或其任何组合,并且仍然被认为多于一种异源或外源核酸。例如,可修饰C1代谢微生物以表达可相同或不同的两种或多种异源或外源核酸分子,所述核酸分子编码如本文公开的一种或多种L-氨基酸生物合成酶。在某些实施方案中,将L-氨基酸生物合成酶-编码多核苷酸分子的多个拷贝引入宿主细胞,其可为相同L-氨基酸生物合成酶或不同L-氨基酸生物合成酶编码多核苷酸的两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个拷贝。
宿主细胞和转化方法
在进行本发明的实践中,将上文所述的外源核酸转化至为C1代谢微生物的宿主细胞中。采用的C1代谢微生物可为适用的天然菌株(如进行发酵以选择与亲本菌株相比具有改善的生长速率和增加总生物质产率的菌株),或经重组修饰以产生或过表达目标L-氨基酸生物合成酶和/或具有增加的生长速率。典型地,C1代谢微生物是非光合C1微生物(如并非藻类或植物)。
在某些实施方案中,本公开采用C1代谢微生物,其为原核生物或细菌,诸如甲基单胞菌属(Methylomonas)、甲基杆菌属(Methylobacter)、甲基球菌属(Methylococcus)、甲基弯菌属(Methylosinus)、甲基孢囊菌属(Methylocystis)、甲基微菌属(Methylomicrobium)、甲烷单胞菌属(Methanomonas)、嗜甲基菌属(Methylophilus)、甲基菌属(Methylobacillus)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、生丝微菌属(Hyphomicrobium)、黄色杆菌属(Xanthobacter)、杆菌属(Bacillus)、副球菌属(Paracoccus)、诺卡氏菌属(Nocardia)、节细菌属(Arthrobacter)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)或假单胞菌属(Pseudomonas)。
在另外的实施方案中,采用的C1代谢细菌是甲烷营养菌或嗜甲基菌。示例性甲烷营养菌包括甲基单胞菌属、甲基杆菌属、甲基球菌属、甲基弯菌属、甲基孢囊菌属、甲基微菌属、甲烷单胞菌属、甲基胞菌属(Methylocella)或其组合。示例性嗜甲基菌包括扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、耐辐射甲基杆菌(Methylobacteriumradiotolerans)、白杨甲基杆菌(Methylobacterium populi)、氯甲烧甲基杆菌(Methylobacterium chloromethanicum)、结瘤甲基杆菌(Methylobacterium nodulans)或其组合。如本文所用,术语"嗜甲基细菌"是指任何能够氧化呈任何形式(如固体、液体、气体)的含有至少一个碳且不含有碳-碳键的任何化合物的细菌。在某些实施方案中,嗜甲基细菌可为甲烷营养菌。例如,"甲烷营养型细菌"是指具有氧化甲烷作为碳和能量来源的能力的任何嗜甲基细菌,其可能是碳和能量的主要来源。示例性甲烷营养型细菌包括甲基单胞菌属、甲基杆菌属、甲基球菌属、甲基弯菌属、甲基孢囊菌属、甲基微菌属或甲烷单胞菌属。
甲烷营养型细菌基于其碳同化途径和内部膜结果被分类为三组:I型(γ变形菌)、II型(α变形菌和X型(γ变形菌)。I型甲烷营养菌使用核酮糖单磷酸(RuMP)途径用于碳同化,而II型甲烷营养菌使用氨酸途径。X型甲烷营养菌使用RuMP途径但还表达低水平的丝氨酸途径酶。本发明实践中采用的甲烷营养型细菌包括仅可利用C1底物用于碳和能量来源的专性甲烷营养菌,和天然具有利用一些多碳底物作为碳和能量来源的能力的兼性甲烷营养菌。
本发明实践中采用的示例性兼性甲烷营养菌包括甲基胞菌属、甲基孢囊菌属和甲基荚膜菌属的一些种(如森林甲基胞菌(Methylocella silvestris)、沼泽甲基胞菌(Methylocella palustris)、冻原甲基胞菌(Methylocella tundrae)、道氏甲基孢囊菌(Methylocystis daltona)菌株SB2、苔藓甲基孢囊菌(Methylocystis bryophila)和金色甲基荚膜菌属(Methylocapsa aurea)KYG)、嗜有机甲基杆菌(Methylobacteriumorganophilum)(ATCC 27,886)、甲基叔丁基醚降解菌(Methylibium petroleiphilum)或其高生长变体。用于本发明实践中的示例性专性甲烷营养型细菌包括荚膜甲基球菌巴斯(NCIMB 11132)、甲基单胞菌属某种16a(ATCC PTA 2402)、发孢甲基弯菌(Methylosinustrichosporium)OB3b(NRRL B-11,196)、生孢甲基弯菌(Methylosinus sporium)(NRRL B-11,197)、小甲基孢囊菌(Methylocystis parvus)(NRRL B-11,198)、甲烷甲基单胞菌(Methylomonas methanica)(NRRL B-11,199)、白色甲基单胞菌(Methylomonas albus)(NRRL B-11,200)、荚膜甲基杆菌(Methylobacter capsulatus)Y(NRRL B-11,201)、鞭毛甲基单胞菌(Methylomonas flagellata)某种AJ-3670(FERM P-2400)、大地甲基嗜酸菌(Methylacidiphilum infernorum)、Methylacidiphilum fumariolicum、嗜喊甲基微菌(Methylomicrobium alcaliphilum)、堪察加半岛甲基酸性菌(Methyloacidakamchatkensis)或其高生长变体。
适用于本发明实践中的C1代谢微生物包括合成气代谢细菌,诸如例如梭菌属(Clostridium)、穆尔氏菌属(Moorella)、热球菌属(Pyrococcus)、优杆菌属(Eubacterium)、脱硫杆菌属(Desulfobacterium)、氧化碳嗜热菌(Carboxydothermus)、产醋菌属(Acetogenium)、醋酸杆菌属(Acetobacterium)、厌氧醋菌属(Acetoanaerobium)、丁酸杆菌属(Butyribaceterium)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)等。示例性合成气代谢细菌包括产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)、杨氏梭菌(Clostridiumljungdahli)、拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei)、食一氧化碳梭菌(Clostridiumcarboxydivorans)、食甲基丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)、伍氏梭菌(Clostridium woodii)、产丙醇梭菌(Clostridium neopropanologen)等。
其它适用于本发明实践中的C1代谢微生物包括真核生物,诸如例如酵母,包括假丝酵母属(Candida)、亚罗酵母属(Yarrowia)、汉逊酵母属(Hansenula)、(Pichia)、球拟酵母属(Torulopsis)、红酵母属(Rhodotorula)等。
本公开的微生物的每一种可用可能有助于生长的异源生物生长为经分离的培养物,或这些细菌的一种或多种可组合以产生混合的培养物。在另一些进一步的实施方案中,本公开的C1代谢非光合微生物是专性C1代谢非光合微生物,诸如专性甲烷营养菌或嗜甲基菌。
之前提及的C1代谢微生物的任一种可用作亲本或参考宿主细胞以制备本公开的重组C1代谢微生物。如本文所用,"重组"是指具有至少一种遗传改变或已通过引入异源核酸分子修饰的非天然存在的生物、微生物、细胞、核酸分子或载体,或者是指经改变以使得可控制内源性核酸分子或基因的细胞。重组还是指来源于细胞的细胞或者具有一种或多种此类修饰的细胞的后代。遗传改变包括例如,引入编码蛋白质或酶的可表达核酸分子的修饰,或其它核酸分子添加、缺失、取代或细胞遗传物质的其它功能改变。例如,重组细胞可表达在天然细胞(即未修饰的或野生型细胞)内不以同一形式存在的基因或其它核酸分子,或可提供改变的内源基因表达形式,此类基因可能另外过表达、低表达、最小表达或完全不表达。
本文所述的重组C1代谢微生物或甲烷营养型细菌的任一者可经转化以包含至少一种外源核酸以向宿主提供新活性或增强的活性(如酶促活性),或可使用本领域已知的各种方法进行遗传修饰以去除或基本上减少内源基因功能。
转化是指引入核酸分子(如外源性或异源核酸分子)至宿主细胞。转化的宿主细胞可在染色体外载有外源或异源核酸分子或者整合在染色体内。整合至宿主细胞基因组和自复制载体内通常导致转化的核酸分子的遗传稳定的遗传性。含有转化的核酸分子的宿主细胞被称为"非天然存在的"或"遗传工程化"或"重组"或"转化的"或"转基因"细胞(如细菌)。
用于在C1代谢微生物(如甲烷营养型细菌)中表达异源核酸的表达系统和表达载体是已知的。
C1代谢细菌的电穿孔描述于本文中并且之前已描述于例如Toyama等,FEMSMicrobiol.Lett.166:1,1998;Kim和Wood,Appl.Microbiol.Biotechnol.48:105,1997;Yoshida等,Biotechnol.Lett.23:787,2001及美国专利申请公开No.2008/0026005中。
细菌接合,是指涉及供体与受体细胞直接接触的特定类型的转化,其频繁地用于转移核酸分子至C1代谢细菌中。细菌接合涉及将"供体"和"受体"细胞与彼此密切接触地混合在一起。接合通过在供体与受体细菌之间形成胞质联丝发生,而单向转移新合成的供体核酸分子至受体细胞中。接合反应中的受体是可通过从供体细菌水平转移接受核酸的任何细胞。接合反应中的供体是含有接合质粒、接合转座子或运动质粒的细菌。供体质粒的物理转移可通过自主转移质粒或在"辅助"质粒的协助下发生。涉及C1代谢细菌的接合在本文中描述,并且之前已描述于Stolyar等,Mikrobiologiya 64:686,1995;Motoyama等,Appl.Micro.Biotech.42:67,1994;Lloyd等,Arch.Microbiol.171:364,1999;PCT公开No.WO 02/18617;和Ali等,Microbiol.152:2931,2006中。
适用于本发明实践中的表达控制序列包括例如启动子、终止子、增强子、阻遏物、诱导子等。适用于本发明实践中的启动子可为组成型的、渗漏的或可诱导的,并且对于采用的宿主细胞是天然或非-天然的。示例性启动子包括丙酮酸脱羧酶(PDC)启动子、脱氧-木酮糖磷酸合酶启动子、甲醇脱氢酶启动子(MDH)(诸如,例如在荚膜甲基球菌巴斯(Acc.No.MCA0779)mxaF基因的上游基因间区内的启动子或扭脱甲基杆菌的MDH启动子(参见Springer等,FEMS Microbiol.Lett.160:119(1998))、己酮糖6-磷酸合酶启动子、核糖体蛋白质S16启动子、丝氨酸羟甲基转移酶启动子、丝氨酸-乙醛酸氨基转移酶启动子、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶启动子、T5启动子、Trc启动子、用于PHA合成的启动子(Foellner等,Appl.Microbiol.Biotechnol.40:284,1993)、丙酮酸脱羧酶启动子(Tokuhiro等,Appl.Biochem.Biotechnol.131:795,2006)、lac操纵子Plac启动子(Toyama等,Microbiol.143:595,1997)、杂合启动子诸如Ptrc(Brosius等,Gene 27:161,1984)、从嗜甲基菌(EP 296484)、甲烷营养菌中的天然质粒鉴定的启动子等。
另外地,可使用适用于外源核酸分子高表达的同源性或异源启动子。例如,美国专利No.7,098,005描述了使用启动子用于在C1代谢细菌内在异源编码核酸的甲烷或甲醇的存在下高表达。
在某些实施方案中,调控表达编码L-氨基酸生物合成酶的外源核酸可能是需要的以优化非-天然存在的C1代谢微生物的生长速率并且可在多种碳来源条件下改善细菌生长。这可通过使用可诱导的启动子系统实现。
在某些实施方案中,编码AB酶的核酸可操作地连接至可诱导的启动子。本发明实践中采用的可诱导启动子系统包括本领域已知的那些,并且包括四环素可诱导的启动子系统;IPTG/lac操纵子可诱导的启动子系统、热激可诱导的启动子系统;金属响应性启动子系统;硝酸盐可诱导的启动子系统;光可诱导的启动子系统;蜕皮素可诱导的启动子系统、描述用于嗜甲基细菌和甲烷营养型细菌中的可诱导/可调控的系统(参见如美国专利申请No.US 2010/0221813,其通过引用并入本文)等。例如,在一个实施方案中,所述非-天然存在的C1代谢微生物(如甲烷营养菌、嗜甲基菌)包含:(1)可操作地连接至位于lacO操纵子序列侧翼的启动子的编码AB酶的外源核酸,和(2)可操作地连接至组成型启动子(如己酮糖-6-磷酸合酶启动子)的编码lacI阻遏蛋白的外源核酸。当LacI阻遏蛋白结合至在LDH或其它启动子侧翼的lacO操纵子序列时,启动诱导,从而预防转录。IPTG结合lacI阻遏物且从lacO序列释放其,从而允许转录。通过使用可诱导的启动子系统,乳酸盐合成可通过添加诱导剂控制。
本发明实践中采用的表达系统和表达载体任选地含有遗传元件,诸如例如用于翻译起始的一个或多个核糖体结合位点和转录终止位点、聚腺苷酸化信号、限制酶位点、多克隆位点、其它克隆区段等。在某些实施方案中,启动子和/或密码子优化(更详细地描述于上文中)用于在宿主甲烷营养型细菌中的编码一种或多种碳水化合物生物合成酶的外源性多核苷酸的高组成型表达。还可使用在宿主甲烷营养型细菌中调控的外源核酸表达。例如,可使用如于例如美国专利申请No.US 2010/0221813中所述的于嗜甲基细菌和甲烷营养型细菌中重组蛋白质表达的可诱导/可调控系统。
在某些实施方案中,启动子或密码子优化(更详细地描述于上文中)用于在宿主甲烷营养型细菌中编码一种或多种L-氨基酸生物合成酶的外源性多核苷酸的高组成型表达。还可利用在宿主甲烷营养型细菌中外源核酸的经调控的表达。例如,可使用如于例如美国专利申请No.US 2010/0221813中所述的于嗜甲基细菌和甲烷营养型细菌中重组蛋白质表达的可诱导/可调控系统。
产生所需的L-氨基酸的方法
本发明提供产生L-氨基酸的方法,所述方法包括在天然气来源的碳原料的存在下在足以产生L-氨基酸的条件下培养重组C1代谢微生物,其中所述C1代谢微生物包含编码L-氨基酸生物合成酶的外源核酸。典型地,所述天然气来源的碳原料是天然气、甲烷或合成气。适用于培养本发明的微生物的说明性条件描述于实施例中。
多种培养方法可用于本文所述的微生物。例如,C1代谢微生物(诸如甲烷营养菌或嗜甲基细菌)可通过分批培养或连续培养方法生长。在某些实施方案中,将培养物在控制的培养装置(诸如发酵罐、生物反应器、中空纤维细胞等)中生长。通常,以对数期生长的细胞通常负责在一些系统中目标产物或中间体的大量生产,而稳定期或指数期后产生可在其它系统中获得。
典型的分批培养方法是当培养开始时设定了培养基组分且培养基组分在培养过程期间不改变的密封系统。即,将培养基在培养过程开始时用一种或多种选择的微生物接种,然后使其在不添加任何物质至系统中的情况下生长。如本文所用,"分批"培养是指不改变初始添加的特定碳来源的量,而可在培养期间监测和改变因素(诸如pH和氧浓度)的对照。在分批系统中,系统的代谢物和生物质组成持续改变直到培养终止。在批量培养物中,细胞(如细菌,诸如嗜甲基菌)将通常从静止迟滞期移至高生长对数期至稳定期,其中生长速率减少或停止(并且如果条件不改变则将最终导致细胞死亡)。
补料分批培养是标准分批系统的变化,在所述系统中随着培养进展以一定增量添加目标碳底物的。补料分批系统当细胞代谢可能通过分解代谢物抑制抑制时并且当在培养基中需要具有有限量的底物时是有用的。因为难于测量补料分批系统中的实际底物浓度,所以基于可测量因子(诸如pH、溶解的氧和废气分压)的改变作出评估。分批和补料分批培养方法是本领域常见和已知的(参见如Thomas D.Brock,Biotechnology:A Textbook ofIndustrial Microbiology,第2版(1989)Sinauer Associates,Inc.,Sunderland,MA;Deshpande,Appl.Biochem.Biotechnol.36:227,1992)。
连续培养是以下含义的"开放"系统:持续添加限定的培养基至生物反应器而同时去除等量的使用("条件")的培养基用于处理。连续培养通常使细胞维持恒定高液相密度,其中细胞主要处于对数生长期。可替代地,连续培养可用经固定的细胞(如生物膜)实施,其中持续添加碳和营养素并且从细胞团块中持续去除有价值的产物、副产物和废物。细胞固定可用由天然材料、合成材料或其组合组成的各种各样的固体支撑物实现。
连续或半连续培养允许调节影响细胞生长或终产物浓度的一个或多个因素。例如,一种方法可以固定的速率维持有限的营养素(如碳来源、氮)并允许所有其它参数随着时间改变。在其它实施方案中,影响生长的若干因素可持续改变同时如通过培养基浊度测量的细胞浓度保持恒定。连续培养系统的目标是维持稳态生长条件同时平衡由于针对细胞生长速率排掉的培养基导致的细胞损失。为了最大化产物形成率,用于连续培养工艺和技术的调节营养素和生长因子的方法是本领域熟知的(参见Brock,1992)。
液相生物反应器(如搅拌槽、填充床、单液相、双液相、中空纤维膜)是本领域熟知的,并且可用于非-天然存在的微生物的生长和生物催化。
通过使用气相生物反应器,用于生物产生的底物由非-天然存在的微生物、细胞裂解物或其不含细胞的级分从气体吸收,而非从液体。使用具有微生物的气相生物反应器是本领域已知的(如美国专利No.2,793,096;4,999,302;5,585,266;5,079,168;和6,143,556;美国法定发明登记H1430;美国专利申请公开No.2003/0032170;EmergingTechnologies in Hazardous Waste Management III,1993,Tedder和Pohland编辑,第411–428页)。示例性气相生物反应器包括单程系统、闭环泵送系统;和流化床反应器。通过利用气相生物反应器,甲烷或其它气相底物可容易地用于由例如具有单氧酶活性的多肽进行的生物转化。在某些实施方案中,用于将气体转化为L-氨基酸的方法在气相生物反应器中进行。在另外的实施方案中,用于将气体转化为L-氨基酸的方法在流化床反应器中进行。在流化床反应器中,使流体(即气体或液体)向上通过其上附接和生长的微生物的颗粒床载体、通常是沙、颗粒活性碳或硅藻土。流体速度是使得颗粒床载体和附接的微生物悬浮(即床流化)。附接至颗粒床载体的微生物在流体中自由循环,从而允许流体中底物有效质量传递至微生物和增加的微生物生长。示例性流化床反应器包括推流反应器和完全混合的反应器。使用具有微生物生物膜的流化床反应器是本领域已知的(如Pfluger等,BioresourceTechnol.102:9919,2011;Fennell等,Biotechnol,Bioengin.40:1218,1992;Ruggeri等,Water Sci.Technol.29:347,1994;美国专利No.4,032,407;4,009,098;4,009,105;和3,846,289)。
本公开所述的重组C1代谢微生物可生长为经分离的纯培养物,与可有助于生长的异源非-C1代谢微生物或与C1代谢微生物的一种或多种不同菌株或物种可合并产生混合培养物。
在某些实施方案中,本发明的L-氨基酸在特定细胞生长期(如迟滞期、对数期、稳定期或死亡期)期间产生。可能需要待转化为L-氨基酸的来自原料的碳而非C1代谢微生物的生长和维持。在一些实施方案中,使如本文提供的非-天然存在的C1代谢微生物(如甲烷营养菌、嗜甲基菌)培养至低至中等细胞密度(OD600),然后L-氨基酸的产生开始。在一些实施方案中,产生L-氨基酸而甲烷营养型细菌不再分裂或非常缓慢地分裂。在一些实施方案中,所述L-氨基酸仅在稳定期期间产生。在一些实施方案中,所述L-氨基酸在对数期和稳定期期间产生。
包含由本文提供的重组C1代谢微生物(如甲烷营养菌、嗜甲基菌)产生的L-氨基酸的发酵罐组合物还可包含与生物发酵过程相关的其它有机化合物。例如,发酵的生物副产物可包括醇、环氧化物、醛、酮、酯的一种或多种或其组合。在某些实施方案中,所述发酵罐组合物可含有以下醇的一种或多种:甲醇、乙醇、丁醇或丙醇。其它化合物诸如H2O、CO、CO2、CO N2、H2、O2和未利用的碳原料(诸如甲烷、乙烷、丙烷和丁烷)也可存在于发酵罐灭菌气体中。
在某些实施方案中,本文提供的重组C1代谢微生物(如甲烷营养菌、嗜甲基菌)以约0.001g/L的培养物至约500g/L的培养物产生本发明的L-氨基酸。在一些实施方案中,产生的L-氨基酸的量是约1g/L的培养物至约100g/L的培养物。在一些实施方案中,产生的L-氨基酸的量是约0.001g/L、0.01g/L、0.025g/L、0.05g/L、0.1g/L、0.15g/L、0.2g/L、0.25g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L、1g/L、2.5g/L、5g/L、7.5g/L、10g/L、12.5g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L、60g/L、70g/L、80g/L、90g/L、100g/L、125g/L、150g/L、175g/L、200g/L、225g/L、250g/L、275g/L、300g/L、325g/L、350g/L、375g/L、400g/L、425g/L、450g/L、475g/L或500g/L。
产物
除了本发明的重组C1代谢细胞之外,本发明提供其它有用的产物。在一个实施方案中,本发明提供来源于本发明的重组C1代谢微生物的培养物的生物质。在一个特定实施方案中,本发明提供包含重组C1代谢微生物的生物质,其中所述重组C1代谢微生物包含编码L-氨基酸生物合成酶的外源核酸且其中所述重组C1代谢微生物能够将天然气-来源的原料转化为所需的L-氨基酸。在另一个实施方案中,本发明提供包含重组C1代谢微生物的生物质,其中所述重组C1代谢微生物包含编码L-氨基酸生物合成酶的外源核酸且其中所述重组C1代谢微生物能够将甲烷转化为所需的L-氨基酸
如本文所用,"生物质"是指具有生物来源的有机物质,其可包括全细胞、裂解细胞、胞外物质等的一种或多种。例如,从培养的微生物中收获的物质(如细菌或酵母培养物)被认为是生物质,其可包括细胞、细胞膜、细胞质、包涵体、分泌或排泄至培养基的产物或其任何组合。在某些实施方案中,生物质包含本公开的C1代谢微生物连同培养基,在所述培养基中生长本公开的C1代谢微生物。在其它实施方案中,生物质包含从在C1底物(如天然气、甲烷等)上生长的培养物恢复的本公开的C1代谢微生物(全部或裂解的或两者)。在另外其它实施方案中,生物质包含在C1底物上培养的C1代谢微生物的培养物的消耗培养基上清液。此类培养物可被认为是可再生资源。就所需L-氨基酸的水平而言,本发明的生物质是富含的。
为细胞生长向其提供天然气-来源的底物的本发明的重组C1代谢微生物就如由其δ13C值表示的其碳指纹而言是独特的(来源自此类重组C1代谢微生物的产物也是这样)。通过背景,合适的同位素测量和质量平衡方法广泛用于评估全球来源和甲烷吸附物(参见Whiticar和Faber,Org.Geochem.10:759,1986;Whiticar,Org.Geochem.16:531,1990)。为了使用残余甲烷的δ13C值测定氧化量,有必要了解由甲烷的微生物氧化导致的同位素分级分离程度。例如,好氧甲烷营养菌可通过一种特定酶甲烷单加氧酶(MMO)代谢甲烷。甲烷营养菌将甲烷转化为甲醇且随后转化为甲醛。甲醛可经进一步氧化成CO2以向细胞提供呈还原当量(NADH)形式的能量,或通过与光合生物中的碳同化途径类似的RuMP或丝氨酸循环掺入至生物质内(Hanson和Hanson,Microbiol.Rev.60:439,1996)。更特别地,I型甲烷营养菌使用RuMP途径用于生物质合成并完全从CH4产生生物质,而II型甲烷营养菌使用从CH4同化50–70%细胞碳且从CO2同化30–50%细胞碳的丝氨酸途径(Hanson和Hanson,1996)。用于测量碳同位素组合物的方法提供于例如Templeton等(Geochim.Cosmochim.Acta 70:1739,2006)中,所述方法在此通过引用以其整体并入。实施例2描述了在不同C1代谢微生物的细胞中稳定的碳同位素分布的表征。所述细胞的高度负δ13C值在从如实施例所述的那些细胞提取的化合物的δ13C值中类似反映。本文所述的本发明产物的δ13C(即本发明的重组C1代谢微生物(如上文所述)、从其来源的相关生物质和L-氨基酸及组合物)可如实施例3所证明根据所用C1底物的来源和纯度改变。
在某些实施方案中,本发明的重组C1代谢微生物及从其来源的相关生物质和L-氨基酸及组合物展现了低于-30‰、低于-31‰、低于-32‰、低于-33‰、低于-34‰、低于-35‰、低于-36‰、低于-37‰、低于-38‰、低于-39‰、低于-40‰、低于-41‰、低于-42‰、低于-43‰、低于-44‰、低于-45‰、低于-46‰、低于-47‰、低于-48‰、低于-49‰、低于-50‰、低于-51‰、低于-52‰、低于-53‰、低于-54‰、低于-55‰、低于-56‰、低于-57‰、低于-58‰、低于-59‰、低于-60‰、低于-61‰、低于-62‰、低于-63‰、低于-64‰、低于-65‰、低于-66‰、低于-67‰、低于-68‰、低于-69‰或低于-70‰的δ13C。
在某些实施方案中,本发明的重组C1代谢微生物以及从其来源的相关生物质和L-氨基酸及组合物展现了约-35‰至约-50‰、-45‰至约-35‰、或约-50‰至约-40‰、或约-45‰至约-65‰、或约-60‰至约-70‰、或约-30‰至约-70‰的δ13C。
在另外的实施方案中,C1代谢非光合微生物生物质具有低于约-30‰、或在约-40‰至约-60‰范围内的δ13C。在某些实施方案中,所述生物质包含重组C1代谢非光合微生物连同消耗培养基,或者所述生物质包含重组C1代谢非光合微生物培养物的消耗培养基上清液组合物,其中所述生物质的δ13C低于约-30‰。在某些其它实施方案中,所述L-氨基酸组合物从生物质提取或浓缩,所述生物质可包含重组C1代谢非光合微生物连同培养物的消耗培养基或者重组C1代谢非光合微生物培养物的消耗培养基上清液组合物。
在某些实施方案中,来源于C1代谢微生物的L-氨基酸组合物(其可任选地为来自C1代谢微生物生物质的提取物或分离物)包含至少约50重量%至约80重量%的组合物的氢、氧和碳原子,且其中所述组合物的δ13C低于约-35‰或低于约-36‰或低于约-37‰或低于约-38‰或低于约-39‰或低于约-40‰。在某些实施方案中,来源于其的L-氨基酸组合物包含具有氢、氧和碳原子的分子,其中所述氢、氧和碳原子是至少50重量%、至少55重量%、至少60重量%、至少65重量%、至少70重量%、至少75重量%、或至少80重量%、或至少90重量%、或至少95重量%的组合物,且其中所述组合物的δ13C在约-30‰至约-70‰的范围内,或其中生物质中的δ13C随着细胞密度增加而减小约-5‰至约-20‰,或其中所述生物质的δ13C比在相同时间产生的CO2的δ13C高平均5‰至15‰(当在存在或不存在铜的情况下培养时)。
在天然气-来源的原料的存在下培养的一些C1代谢微生物的δ13C的表征在下文中实施例说明。
本发明还提供了动物饲料,其包含本发明的重组C1代谢微生物、相关生物质和/或L-氨基酸组合物。如在本发明的实践中所设想,所述动物饲料可为牲畜饲料(诸如例如猪饲料、牛饲料、羊饲料等)、禽类饲料(诸如,例如鸡饲料、火鸡饲料等)或鱼饲料(诸如,例如鲑鱼饲料、甲壳类动物饲料等)。所述动物饲料还可包含添加剂,诸如例如植物来源的物质(包括例如来源于谷物(诸如例如玉米、大麦、燕麦、大米、黑麦、小麦、高粱、布鲁尔氏消耗谷物(Brewer's spent grain)等)的那些;及来源于豆类(诸如例如紫苜蓿、苜蓿、豌豆、蚕豆、扁豆、大豆等)的那些)、动物-来源的物质(诸如例如鱼粉)和/或微生物-来源的物质(包括例如来自可为例如细菌、酵母或藻类的异源微生物的生物质)。在一些实施方案中,植物来源的物质添加剂是大豆粕或豌豆蛋白质。
在另一个实施方案中,本发明提供培养物或发酵培养基,其包含本发明的重组C1代谢微生物、相关的生物质和/或L-氨基酸组合物。典型地,所述培养物或发酵培养基还包含碳水化合物(如糖等)和/或水。在另一个实施方案中,本发明提供包含本发明培养或发酵培养基与第二微生物的细胞培养物组合物。典型地,所述第二微生物是细菌、酵母或藻类细胞。
本发明的实施方案包括以下:
1.一种生物质,其来源于重组C1代谢微生物培养物,其中所述重组C1代谢微生物包含编码L-氨基酸生物合成酶的外源核酸,其中所述C1代谢微生物能够将天然气来源的碳原料转化为L-氨基酸,并且其中所述生物质的δ13C低于-40‰。
2.如实施方案1所述的生物质,其中所述重组C1代谢微生物是非光合C1代谢微生物。
3.如实施方案1-2中任一项所述的生物质,其中所述外源核酸编码选自由以下组成的组酶:赖氨酸生物合成酶、色氨酸生物合成酶、甲硫氨酸生物合成酶、半胱氨酸生物合成酶和苏氨酸生物合成酶。
4.如实施方案1-3中任一项所述的生物质,其中所述外源核酸编码选自由以下组成的组的赖氨酸生物合成酶:赖氨酸-敏感性天冬氨酸激酶III(lysC)、天冬氨酸激酶、天冬氨酸-半醛脱氢酶(asd)、二氢吡啶二羧酸合酶(dapA)、二氢吡啶二羧酸还原酶(dapB)、2,3,4,5-四氢吡啶-2,6-甲酸N-琥珀酰转移酶(dapD)、乙酰鸟氨酸/丁二酸二氨基庚二酸氨基转移酶(argD)、琥珀酰-二氨基庚二酸脱琥珀酰酶(dapE)、琥珀酰二氨基庚二酸转氨酶、二氨基庚二酸差向异构酶(dapF)和二氨基庚二酸二羧酶(lysA)。
5.根据实施方案4所述的生物质,其中所述L-氨基酸是L-赖氨酸。
6.如实施方案1-3中任一项所述的生物质,其中所述外源核酸编码选自由以下组成的组的色氨酸生物合成酶:分支酸-丙酮酸裂解酶(ubiC)、邻氨基苯甲酸合酶组分I(trpE)、邻氨基苯甲酸合酶组分II(trpG)、邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶(trpD)、磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶(trpC)、色氨酸生物合成蛋白质(trpC)、N-(5'磷酸核糖基)邻氨基苯甲酸异构酶(trpF)、吲哚-3-甘油磷酸合酶、色氨酸合酶α链(trpA)和色氨酸合酶β链(trpB)。
7.根据实施方案6所述的生物质,其中所述L-氨基酸是L-色氨酸。
8.如实施方案1-3中任一项所述的生物质,其中外源核酸编码选自由以下组成的组的甲硫氨酸生物合成酶:高丝氨酸O-琥珀酰转移酶(metA)、胱硫醚γ-合酶(metB)、蛋白质MalY、胱硫醚β-裂解酶(metC)、B12-依赖性甲硫氨酸合酶(metH)和5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸-高半胱氨酸S-甲基转移酶(metE)。
9.根据实施方案8所述的生物质,其中所述L-氨基酸是L-甲硫氨酸。
10.如实施方案1-3中任一项所述的生物质,其中所述外源核酸编码选自由以下组成的组的半胱氨酸生物合成酶:丝氨酸乙酰转移酶(CysE)、半胱氨酸合酶A和半胱氨酸合酶B。
11.根据实施方案10所述的生物质,其中所述L-氨基酸是L-半胱氨酸。
12.如实施方案1-3中任一项所述的生物质,其中所述外源核酸编码选自由以下组成的组的苏氨酸生物合成酶:天冬氨酸转氨酶、PLP-依赖性氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、天冬氨酸激酶、天冬氨酸-半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶和苏氨酸合酶。
13.如实施方案12所述的生物质,其中所述L-氨基酸是L-苏氨酸。
14.根据实施方案1-13中任一项所述的生物质,其中所述外源核酸编码对选自由大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌组成的组微生物是内源性的L-氨基酸生物合成酶。
15.如实施方案1-2中任一项所述的生物质,其中所述外源核酸编码选自由以下组成的组的L-氨基酸生物合成酶序列:SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148或150的任一者。
16.根据实施方案1-15中任一项所述的生物质,其中所述外源核酸的序列经密码子优化以用于从重组C1代谢微生物最佳表达。
17.根据实施方案1-16中任一项所述的生物质,其中编码L-氨基酸生物合成酶的所述外源核酸可操作地连接至表达控制序列。
18.如实施方案17所述的生物质,其中所述表达控制序列是外源性表达控制序列。
19.根据实施方案1-18中任一项所述的生物质,其中所述C1代谢微生物还包含内源性酶活性的缺失。
20.根据实施方案1-19中任一项所述的生物质,其中所述C1代谢微生物是甲烷营养菌。
21.根据实施方案20所述的生物质,其中所述甲烷营养菌是甲基单胞菌属、甲基杆菌属、甲基球菌属、甲基弯菌属、甲基孢囊菌属、甲基微菌属、甲烷单胞菌属、甲基胞菌属或甲基荚膜菌属。
22.如实施方案20所述的生物质,其中所述甲烷营养菌选自由以下组成的组:荚膜甲基球菌巴斯菌株、甲烷甲基单胞菌16a(ATCC PTA 2402)、发孢甲基弯菌OB3b(NRRL B-11,196)、生孢甲基弯菌(NRRL B-11,197)、小甲基孢囊菌(NRRL B-11,198)、甲烷甲基单胞菌(NRRL B-11,199)、白色甲基单胞菌(NRRL B-11,200)、荚膜甲基杆菌(NRRL B-11,201)、嗜有机甲基杆菌(ATCC 27,886)、甲基单胞菌属某种AJ-3670(FERM P-2400)、森林甲基胞菌、沼泽甲基胞菌(ATCC700799)、冻原甲基胞菌、道氏甲基孢囊菌菌株SB2、苔藓甲基孢囊菌、金色甲基荚膜菌属KYG、大地甲基嗜酸菌、甲基叔丁基醚降解菌和嗜喊甲基微菌。
23.根据实施方案1-22中任一项所述的生物质,其中所述天然气来源的碳原料选自由以下组成的组:天然气、合成气、甲烷、甲醇、甲醛、甲酸、一氧化碳、二氧化碳、氰化物、甲胺、甲基硫醇、甲基卤素及其任何组合或两个或多个。
24.根据实施方案23所述的生物质,其中所述天然气来源的碳原料是天然气。
25.根据实施方案23所述的生物质,其中所述天然气来源的碳原料是甲烷。
26.根据实施方案23所述的生物质,其中所述天然气来源的碳原料是合成气。
27.根据实施方案23所述的生物质,其中所述C1代谢微生物是合成气代谢细菌。
28.根据实施方案27所述的生物质,其中所述合成气代谢细菌选自由以下组成的组:产乙醇梭菌、杨氏梭菌、拉氏梭菌、食一氧化碳梭菌、嗜甲基丁酸杆菌、伍氏梭菌和产丙醇梭菌。
29.如实施方案1-28中任一项所述的生物质,其中所述生物质的δ13C低于-50‰。
30.一种包含L-氨基酸的组合物,其中所述组合物展现了低于-40‰的δ13C。
31.如实施方案30所述的组合物,其中L-氨基酸选自由以下组成的组:L-赖氨酸、L-色氨酸、L-甲硫氨酸、L-半胱氨酸和L-苏氨酸。
32.一种动物饲料,其包含如实施方案1-29中任一项所述的生物质或如实施方案30-31中任一项所述的组合物。
33.如实施方案32所述的动物饲料,其还包含植物来源的物质。
34.如实施方案33所述的动物饲料,其中所述植物来源的物质选自由大豆粕和豌豆蛋白质组成的组。
35.一种培养物或发酵培养基,其包含如实施方案1-27中任一项所述的生物质或如实施方案40-42中任一项所述的组合物。
36.一种包含编码L-氨基酸生物合成酶的外源核酸的重组C1代谢微生物,其中所述C1代谢微生物能够将天然气来源的碳原料转化为L-氨基酸,并且其中所述生物质的δ13C低于-40‰/。
37.如实施方案36所述的重组C1代谢微生物,其中所述重组C1代谢微生物是非光合C1代谢微生物。
38.根据实施方案36-37中任一项所述的重组C1代谢微生物,其中所述外源核酸编码选自由以下组成的组的酶:赖氨酸生物合成酶、色氨酸生物合成酶、甲硫氨酸生物合成酶、半胱氨酸生物合成酶和苏氨酸生物合成酶。
39.根据实施方案36-38中任一项所述的重组C1代谢微生物,其中所述外源核酸编码选自由以下组成的组的赖氨酸生物合成酶:赖氨酸-敏感性天冬氨酸激酶III(lysC)、天冬氨酸激酶、天冬氨酸-半醛脱氢酶(asd)、二氢吡啶二羧酸合酶(dapA)、二氢吡啶二羧酸还原酶(dapB)、2,3,4,5-四氢吡啶-2,6-甲酸N-琥珀酰转移酶(dapD)、乙酰鸟氨酸/丁二酸二氨基庚二酸氨基转移酶(argD)、琥珀酰-二氨基庚二酸脱琥珀酰酶(dapE)、琥珀酰二氨基庚二酸转氨酶、二氨基庚二酸差向异构酶(dapF)和二氨基庚二酸二羧酶(lysA)。
40.根据实施方案39所述的重组C1代谢微生物,其中L-氨基酸是L-赖氨酸。
41.根据实施方案36-38中任一项所述的重组C1代谢微生物,其中所述外源核酸编码选自由以下组成的组的色氨酸生物合成酶:分支酸-丙酮酸裂解酶(ubiC)、邻氨基苯甲酸合酶组分I(trpE)、邻氨基苯甲酸合酶组分II(trpG)、邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶(trpD)、磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶(trpC)、色氨酸生物合成蛋白质(trpC)、N-(5'磷酸核糖基)邻氨基苯甲酸异构酶(trpF)、吲哚-3-甘油磷酸合酶、色氨酸合酶α链(trpA)和色氨酸合酶β链(trpB)。
42.根据实施方案41所述的重组C1代谢微生物,其中L-氨基酸是L-色氨酸。
43.根据实施方案36-38中任一项所述的重组C1代谢微生物,其中外源核酸编码选自由以下组成的组的甲硫氨酸生物合成酶:高丝氨酸O-琥珀酰转移酶(metA)、胱硫醚γ-合酶(metB)、蛋白质MalY、胱硫醚β-裂解酶(metC)、B12-依赖性甲硫氨酸合酶(metH)和5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸-高半胱氨酸S-甲基转移酶(metE)。
44.根据实施方案43所述的重组C1代谢微生物,其中L-氨基酸是L-甲硫氨酸。
45.根据实施方案36-38中任一项所述的重组C1代谢微生物,其中所述外源核酸编码选自由丝氨酸乙酰转移酶(CysE)半胱氨酸合酶A和半胱氨酸合酶B组成的组的半胱氨酸生物合成酶。
46.根据实施方案45所述的重组C1代谢微生物,其中L-氨基酸是L-半胱氨酸。
47.根据实施方案36-38中任一项所述的重组C1代谢微生物,其中所述外源核酸编码选自由以下组成的组的苏氨酸生物合成酶:天冬氨酸转氨酶、PLP-依赖性氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、天冬氨酸激酶、天冬氨酸-半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶和苏氨酸合酶。
48.如实施方案47所述的重组C1代谢微生物,其中L-氨基酸是L-苏氨酸。
49.根据实施方案36-48中任一项所述的重组C1代谢微生物,其中所述外源核酸编码对于选自由大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌组成的组的微生物是内源性的L-氨基酸生物合成酶。
50.根据实施方案36-37中任一项所述的重组C1代谢微生物,其中所述外源核酸编码选自由以下组成的组的L-氨基酸生物合成酶序列:SEQ ID NO:、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148和150的任一者。
51.根据实施方案36-50中任一项所述的重组C1代谢微生物,其中所述外源核酸的序列经密码子优化以用于从所述重组C1代谢微生物最佳表达。
52.根据实施方案36-51中任一项所述的重组C1代谢微生物,其中编码L-氨基酸生物合成酶的所述外源核酸可操作地连接至表达控制序列。
53.如实施方案52所述的重组C1代谢微生物,其中所述表达控制序列是外源性表达控制序列。
54.根据实施方案36-53中任一项所述的重组C1代谢微生物,其中所述C1代谢微生物还包含内源性酶活性的缺失。
55.根据实施方案36-54中任一项所述的重组C1代谢微生物,其中所述C1代谢微生物是甲烷营养菌。
56.根据实施方案55所述的重组C1代谢微生物,其中所述甲烷营养菌是甲基单胞菌属、甲基杆菌属、甲基球菌属、甲基弯菌属、甲基孢囊菌属、甲基微菌属、甲烷单胞菌属、甲基胞菌属或甲基荚膜菌属。
57.如实施方案55所述的重组C1代谢微生物,其中所述甲烷营养菌选自由以下组成的组:荚膜甲基球菌巴斯菌株、甲烷甲基单胞菌16a(ATCC PTA 2402)、发孢甲基弯菌OB3b(NRRL B-11,196)、生孢甲基弯菌(NRRL B-11,197)、小甲基孢囊菌(NRRL B-11,198)、甲烷甲基单胞菌(NRRL B-11,199)、白色甲基单胞菌(NRRL B-11,200)、荚膜甲基杆菌(NRRL B-11,201)、嗜有机甲基杆菌(ATCC 27,886)、甲基单胞菌属某种AJ-3670(FERM P-2400)、森林甲基胞菌、沼泽甲基胞菌(ATCC 700799)、冻原甲基胞菌、道氏甲基孢囊菌菌株SB2、苔藓甲基孢囊菌、金色甲基荚膜菌属KYG、大地甲基嗜酸菌、甲基叔丁基醚降解菌和嗜喊甲基微菌。
58.根据实施方案36-57中任一项所述的重组C1代谢微生物,其中所述天然气来源的碳原料选自由以下组成的组:天然气、合成气、甲烷、甲醇、甲醛、甲酸、一氧化碳、二氧化碳、氰化物、甲胺、甲基硫醇、甲基卤素及其任何组合或两个或多个。
59.如实施方案58所述的重组C1代谢微生物,其中所述天然气来源的碳原料是天然气。
60.如实施方案58所述的重组C1代谢微生物,其中所述天然气来源的碳原料是甲烷。
61.如实施方案58所述的重组C1代谢微生物,其中所述天然气来源的碳原料是合成气。
62.如实施方案61所述的重组C1代谢微生物,其中所述C1代谢微生物是合成气代谢细菌。
63.根据实施方案62所述的重组C1代谢微生物,其中所述合成气代谢细菌选自由以下组成的组:产乙醇梭菌、杨氏梭菌、拉氏梭菌、食一氧化碳梭菌、嗜甲基丁酸杆菌、伍氏梭菌和产丙醇梭菌。
64.根据实施方案36-63中任一项所述的重组C1代谢微生物,其中所述生物质的δ13C低于-50‰。
65.一种产生L-氨基酸的方法,所述方法包括在天然气来源的碳原料的存在下在足以产生L-氨基酸的条件下培养如实施方案36-64中任一项所述的重组C1代谢微生物。
66.一种由如实施方案65所述的方法产生的L-氨基酸,其中所述L-氨基酸展现了低于-40‰的δ13C。
本发明的之前和其它方面可结合以下非限制性实施例而更容易理解。
实施例
实施例1
C
1
代谢微生物培养和生物反应器条件
将本公开的示例性C1代谢微生物(甲烷营养菌、嗜甲基菌、梭菌属)培养在管内、小瓶内、瓶内、板上、或生物反应器(发酵)内。用于各种微生物的生长条件、培养基和碳来源描述于本实施例中。
发孢甲基弯菌菌株OB3b(NCIMB 11131);甲基单胞菌属某种菌株16a(ATCC PTA-
2402);或甲烷甲基单胞菌
对于血清瓶,将细菌在30℃下在希金斯最低硝酸盐培养基(NSM;Cornish等,J.Gen.Microbiol.130:2565,1984;Park等,Biotechnol.Bioeng.38:423,1991)或MM-W1培养基中培养。将顶部空间组成调整为1:1体积的甲烷:空气。将瓶以200-250rpm的速率振荡。可替代地,将培养物维持在于含1:1(v/v)甲烷:空气气体混合物的气密室中或在甲醇蒸汽(经由石蜡膜-密封板的封盖内的0.5mL甲醇)的存在下生长的含有1.5%w/v琼脂的NSM-培养基板上,或者在补充有0.5%甲醇的NSM-培养基板上。将板在加湿室中在30℃下倒置孵育。
所用的NSM培养基的组成如下:1.0g MgSO4*7H2O、0.20g CaCl2*6H2O、2.0ml螯合铁溶液(0.1g柠檬酸铁(III)铵或0.5g氯化铁(III);0.2g EDTA钠盐;0.3ml浓HCl;100.0ml蒸馏去离子H2O)、1.0g KNO3、0.5ml微量元素溶液(500.0mg EDTA、200.0mg FeSO4.7H2O、10.0mg ZnSO4*7H2O、3.0mg MnCl2*4H2O、30.0mg H3BO3、20.0mg CoCl2*6H2O、1.0mg CaCl2*2H2O、2.0mg NiCl2*6H2O、3.0mg Na2MoO4*2H2O、1.0L蒸馏水)、0.272g KH2PO4、0.717gNa2HPO4*12H2O、任选的12.5g纯化琼脂(如Oxoid L28或BactoTM琼脂;当制备板时使用)、1.0L蒸馏去离子水,pH调节至6.8并在121℃下高压灭菌15分钟。
对于发酵,向含有1L灭菌限定培养基MM-W1的2-升生物反应器接种来自在供应了1:1(v/v)甲烷与空气混合物的MM-W1中生长的血清瓶批次培养物(10-20%v/v)的细胞。所用的培养基MM-W1的组成如下:0.8mM MgSO4*7H2O、10mM NaNO3、0.14mM CaCl2、1.2mMNaHCO3、2.35mM KH2PO4、3.4mM K2HPO4、20.7μM Na2MoO4*2H2O、1μM CuSO4*5H2O、10μM FeIII-Na-EDTA和1mL/升的微量金属溶液(每升含有500mg FeSO4*7H2O、400mg ZnSO4*7H2O、20mgMnCl2*7H2O、50mg CoCl2*6H2O、10mg NiCl2*6H2O、15mg H3BO3、250mg EDTA)。在将培养基高压灭菌和冷却后,添加磷酸盐、碳酸氢盐和FeIII-Na-EDTA。在某些发酵中,添加多达0.1%(w/v)的碳酸氢盐。将反应器内含物用顶置叶轮以恒定750rpm搅拌。将培养物用以约60mL/min至约120mL/min喷射的恒定甲烷补料,同时以约10-100mL/min的可变速率供应浓氧(至少85%)以维持约40%至约80%的溶解的氧水平(相对于培养基的空气饱和)。
将生物反应器内的温度维持在30℃,且约每4小时至约24小时(对应于大约5OD单位的OD600增加)使用自动添加0.5M NaOH和0.5M HCl、连同其它添加至培养物将pH维持在7.1±0.1。其它添加交替为金属添加(10μM CuSO4、5μM FeSO4、5μM FeIII-Na-EDTA最终浓度)和营养素添加(5.75mM KxHyPO4,10mM NaNO3)。在这些条件下,观察到基本上线性生长至大于20的OD600,其有效的生物质产生速率为约2.7至约3.3g干细胞重量/升/天。培养生物质通过离心收集、在MM-W1培养基中洗涤一次,并且将回收的生物质在-80℃下冷冻或立即用于细胞组分的分级分离(如脂质提取)。
还可施加半连续发酵方法以维持生物质产率且减少与发酵关闭和开始相关的时间(即运转时间或前置时间)。
随着培养物浓度接近稳定期(但在进入稳定期之前),细菌生物质的收集以大约12-24小时间隔进行。大约一半的生物反应器体积通过经由离心泵转移至单独的容器去除。然后将等体积的灭菌或回收培养基返回至生物反应器,使得反应器的光密度为其初始值的大约一半。根据以上方案继续生物反应器发酵,使得多个周期的生长和生物质回收可在单个发酵运行期间进行。
荚膜甲基球菌巴斯(NCIMB 11132)
将细菌在42℃下培养在含有希金斯最低硝酸盐培养基(NSM)或MM-W1培养基的血清瓶内。将顶部空间组成调整为1:1体积的甲烷:空气。将瓶以200-250rpm的速率振荡。可替代地,将培养物维持在含有1:1(v/v)甲烷:空气气体混合物的气密室内生长的用1.5%w/v琼脂固化的NSM-培养基板上。将板在加湿室中在42℃下倒置孵育于室内。
对于发酵,向含有1.25L灭菌培养基MMF1.1的3-升生物反应器接种来自在供应了1:1(v/v)甲烷与空气混合物的相同培养基中生长的血清瓶批次培养物(10-20%v/v)的细胞。培养基MMF1.1的组成如下:0.8mM MgSO4*7H2O、40mM NaNO3、0.14mM CaCl2、6mM NaHCO3、4.7mM KH2PO4、6.8mM K2HPO4、20.7μM Na2MoO4*2H2O、6μM CuSO4*5H2O、10μM FeIII-Na-EDTA和1mL/升的微量金属溶液(每升含有500mg FeSO4*7H2O、400mg ZnSO4*7H2O、20mg MnCl2*7H2O、50mg CoCl2*6H2O、10mg NiCl2*6H2O、15mg H3BO3、250mg EDTA)。在将培养基高压灭菌和冷却后,添加磷酸盐、碳酸氢盐和FeIII-Na-EDTA。将反应器内含物用顶置叶轮以恒定750rpm搅拌。将培养物用以约60至约200mL/min喷射的恒定甲烷补料,同时以15-90mL/min的可变速率供应浓氧(>85%)并且将溶解的氧水平维持低于10%(相对于培养基的空气饱和)。
将生物反应器内的温度维持在44℃,且每3-6小时(在达到OD 5后,对应于大约3-5OD单位的OD600增加)使用自动添加0.5M NaOH和0.5M HCl、连同铜和铁添加(5μM CuSO4、5μM FeSO4、10μM FeIII-Na-EDTA最终浓度)至培养物来将pH维持在7.0±0.1。在这些条件下,观察到基本上线性生长至大于10的OD600,其有效的生物质产生速率为大于5克干细胞重量/升/天。培养生物质通过离心收集、在MM-W1培养基中洗涤细胞一次,并且将细胞沉淀在-80℃下冷冻或立即用于细胞组分的分级分离。
营养素消耗被认为是可限制发酵期间的生长产率的问题。为了避免营养素(主要是氮和磷酸盐)的限制,由2-倍浓度的MMF1.1组成的营养素进料在培养物OD600超过5后开始。营养素进料以对应于大约一半的培养物生长速率的稀释率开始以避免洗脱且维持OD增加同时扩充培养物体积。根据以上方案继续生物反应器发酵,使得多个周期的生长和生物质回收可在单个发酵运行期间进行。
扭脱甲基杆菌或发孢甲基弯菌菌株OB3b(NCIMB 11131)
细菌在30℃下在含有补充有0.5%甲醇的希金斯最低硝酸盐培养基(NSM)的管中培养。将管以200-250rpm的速率振荡。可替代地,将培养物维持在于甲醇蒸汽(经由石蜡膜-密封板的封盖内的0.5mL甲醇)的存在下生长的含有1.5%w/v琼脂或者补充有0.5%甲醇的NSM-培养基板上。将板在加湿室中在正常气氛下在30℃下倒置孵育。
对于发酵,向含有1L限定培养基MM-W1的2-升生物反应器接种来自培养管批次培养物(10-20%v/v)的细胞。培养基MM-W1的组成如上文所述。将反应器内含物用顶置叶轮以恒定800rpm搅拌。将培养物用初始大剂量的甲醇至0.5%的最终浓度和可变的甲醇进料补料,同时以30-100mL/min的可变速率供应纯氧以维持60-90%的溶解的氧水平(相对于培养基的空气饱和)。
将生物反应器内的温度维持在30℃,且如上文所述使用自动添加0.5M NaOH和1MHCl、连同金属和营养素添加将pH维持在7.1±0.1。在这些条件下,观察到基本上线性生长至大于20的OD600,其有效的生物质产生速率为2.7至3.3克干细胞重量/升/天。培养生物质通过离心收集,将细胞在MM-W1培养基中洗涤一次,并且将细胞沉淀在-80℃下冷冻或立即用于细胞组分的分级分离。
还可施加半连续发酵方法以维持生物质产率且减少与发酵关闭和开始相关的时间(即运转时间或前置时间)。
随着培养物浓度接近稳定期(但在进入稳定期之前),积累的细菌生物质的收集以大约12-24小时的间隔进行。大约一半的生物反应器体积通过经由离心泵转移至单独的容器去除。然后将等体积的新鲜或回收培养基返回至生物反应器,使得反应器的光密度为其初始值的大约一半。根据以上方案继续生物反应器发酵持续,使得多个周期的生长和生物质回收可在单个发酵运行期间进行。
产乙醇梭菌和杨氏梭菌
将梭菌属细菌在37℃下培养在具有丁基橡胶塞和200kPa炼钢厂废气的塑料涂敷的500ml-Schott GL45瓶内的100mL改良PETC培养基(ATCC培养基1754)中。通过测量600nm下的光密度(OD600)监测生长。
改良PETC培养基含有(每升)1g NH4Cl、0.4g KCl、0.2g MgSO4*7H2O、0.8g NaCl、0.1g KH2PO4、20mg CaCl2*2H2O、10ml微量元素溶液(参见下文)、10ml沃尔夫氏维生素溶液(Wolfe's vitamin溶液,参见下文)、2g NaHCO3和1mg刃天青。在将pH调节至5.6后,将培养基煮沸、缺氧分散并在121℃下高压灭菌15分钟。炼钢厂废气(组成:44%CO、32%N2、22%CO2、2%H2)或等效的合成混合物用作碳来源。所述培养基具有5.9的最终pH且用浓度为0.008%(w/v)的半胱氨酸-HCl和Na2S还原。
微量元素溶液每升含有2g氨三乙酸(在添加剩余成分之前用KOH调节至pH 6)、1gMnSO4、0.8g Fe(SO4)2(NH4)2*6H2O、0.2g CoCl2*6H2O、0.2mg ZnSO4*7H2O、20mg CuCl2*2H2O、20mg NiCl2*6H2O、20mg Na2MoO4*2H2O、20mg Na2SeO4和20mg Na2WO4。
沃尔夫氏维生素溶液(Wolin等,J.Biol.Chem.238:2882,1963)含有(每升)2mg生物素、2mg叶酸、10mg盐酸吡哆醇、5mg硫胺-HCl、5mg核黄素、5mg烟酸、5mg D-(+)-泛酸钙、0.1mg维生素B12、5mg对氨基苯甲酸和5mg硫辛酸。
a.产乙醇梭菌发酵
产乙醇梭菌的发酵使用与例如美国专利申请No.2011/0300593中所述的那些方法类似的方法进行。简而言之,将含有1.3L溶液A(3.083g NH4Ac;0.61g MgCl2*6H2O;0.294gCaCl2*2H2O;0.15g KCl;0.12g NaCl(任选的);用蒸馏水补加至1L)的2-升生物反应器用N2气体喷射。添加85%H3PO4溶液(2.025mL,30mM)并使用浓水性NH4OH调节pH至5.3。然后添加13.5mL溶液B(20.0mg生物素;20.0mg叶酸;10.0mg吡哆醇HCl;50.0mg硫胺*HCl;50.0mg核黄素;50.0mg烟酸;50.0mg D-(*)-泛酸钙;50.0mg维生素B12;50.0mg对氨基苯甲酸;50.0mg硫辛酸;用蒸馏水补加至1L)并将溶液用N2气体喷射。添加氯化铬(II)直至所述溶液的氧化-还原电位(ORP)降低至大约-200mV,其中添加刃天青(1.35mL 2g/L溶液)。添加多硫化钠(5.4mL 3M溶液,参见下文)并将溶液用N2喷射,然后用含有CO的气体(1%H2;13%N2;71%CO;15%CO2)喷射。添加金属硫化物溶液(150mL,参见下文)并将溶液再喷射30分钟,之后以大约5%(v/v)的水平用活性生长的产乙醇梭菌培养物接种。
多硫化钠溶液在充入Na2S(93.7g,0.39mol)和200ml H2O的500ml烧瓶中制备。搅拌所述溶液直至盐溶解且在恒定N2流下添加硫(25g,0.1mol)。在室温下搅拌2小时后,将现在为透明红褐色液体的多硫化钠溶液(就Na而言为约4M且就硫而言为约5M)转移至N2吹扫的血清瓶内,并且包裹在铝箔内。
在配有气密入口和出口的1L三颈烧瓶中制备铬(II)溶液以允许在惰性气体下允许且随后转移所需产物至合适的贮存烧瓶内。向所述烧瓶充入CrCl3*6H2O(40g,0.15mol)、锌颗粒[20目](18.3g,0.28mol)、汞(13.55g,1mL,0.0676mol)和500mL蒸馏水。在用N2冲洗1小时后,将混合物升温至约80℃以起始反应。在恒定N2流下搅拌两小时后,将混合物冷却至室温并再持续搅拌48小时,到这个时候反应混合物变成深蓝色溶液。将所述溶液转移至N2吹扫的血清瓶内并在4℃下贮藏以用于未来使用。
金属硫化物溶液通过添加约950mL溶液A至1L发酵罐内并用N2气喷射制备。添加85%H3PO4溶液(1.5mL,30mM)并将pH使用浓水性NH4OH调节至5.3。添加溶液B(10mL)并将溶液用N2喷射。添加氯化铬(II)直至所述溶液的氧化-还原电位(ORP)降低至大约-200mV,其中添加刃天青(1mL 2g/L溶液)。添加溶液C(1/10;10ml FeCl3;5ml CoCl2;5ml NiCl2;1mlH3BO3;1ml Na2MoO4;1ml MnCl2;1ml Na2WO4;1ml ZnCl2;1ml Na2SeO3;至1L培养基内),然后添加多硫化钠(2mL 3M溶液),然后将所述溶液用N2气体喷射。
在分批条件下在多硫化物的存在下由产乙醇梭菌发酵包含CO的底物导致经2-3天时间基本上增加的累积速率和大约4g/L的最终生物质累积。例如,在大约1天的短迟滞期后,所述生物质可经大约36小时发酵从约0.5g/L增加至至少3.5g/L。此外,在多硫化物的存在下(如通常在分批发酵中存在的)在生长期期间不产生乙酸盐,并且在某些情况下消耗一些乙酸盐,使得发酵罐内乙酸盐量有净减少。培养生物质通过离心收集、在培养基中洗涤细胞一次,并且将细胞沉淀在-80℃下冷冻或立即用于细胞组分的分级分离。
还可施加半连续发酵方法以维持生物质产率且减少与发酵关闭和开始相关的时间(即运转时间或前置时间)。
随着培养物浓度接近稳定期(但在进入稳定期之前),细菌生物质的收集以大约12-24小时的间隔进行。大约一半的生物反应器体积通过经由离心泵转移至单独的容器去除。然后将等体积的新鲜或回收培养基返回至生物反应器,使得反应器的光密度为其初始值的大约一半。根据以上方案继续生物反应器发酵,使得多个周期的生长和生物质回收可在单个发酵运行期间进行。
b.杨氏梭菌发酵
杨氏梭菌的发酵使用与例如美国专利No,5,173,429和5,593,886中所述的那些方法类似的方法进行。简而言之,分批发酵使用杨氏梭菌的生物纯培养物进行。制备培养基((1)80.0mL盐,其包含KH2PO43.00g/L、K2HPO4 3.00g/L、(NH4)2SO4 6.00g/L、NaCl 6.00g/L、MgSO4*2H2O 1.25g/L;(2)1.0g酵母提取物;(3)1.0g胰蛋白酶;(4)3.0ml PFN(Pfenning)微量金属溶液,其包含FeCl2*4H2O 1500mg、ZnSO4*7H2O 100mg、MnCl2*4H2O 30mg、H3BO3 300mg、CoCl2*6H2O 200mg、CuCl2*H2O 10mg、NiCl2*6H2O 20mg、NaMoO4*2H2O 30mg、Na2SeO3 10mg和达1L的蒸馏水;(5)10.0ml B维生素,包含吡哆醛HCl 10mg、核黄素50mg、硫胺HCl 50mg、烟酸50mg、Ca-D-泛酸盐50mg、硫辛酸60mg、对氨基苯甲酸50mg、叶酸20mg、生物素20mg、氰钴胺50mg和达1L的蒸馏水;(6)0.5g半胱氨酸HCl;(7)0.06g CaCl2*2H2O;(8)2.0g NaHCO3;(9)1.0mL刃天青(0.01%);和(10)920.0mL蒸馏水)在80%氮和20%CO2的气氛内缺氧进行。所述培养基的pH在发酵期间控制,并且用HCl维持在5.0。如果需要,调节pH用无菌10%NaOH或1.0%乙酸溶液进行。将培养基转移至157.5mL血清瓶并用丁基橡胶塞和铝封密封。然后将瓶在121℃下高压灭菌20分钟。
在开始实验之前大约48小时,将种子培养物在与如上文所述的那些瓶类似的那些瓶从杨氏梭菌的储用培养物制备。将种子培养物在振荡孵育器内在37℃下生长并且以100rpm振荡。添加还原溶液(2.0ml Na2S、2.5%溶液和2.0ml半胱氨酸-HCl,3.5%溶液)至培养物,将其置于振荡孵育器内大约15分钟以允许完全氧去除和温度驯化。不像用于分离有机物的生物纯培养物的程序,添加甲烷抑制剂在分批发酵中不是所需的。
使用杨氏梭菌的发酵在含有营养素培养基的New Brunswick ScientificBioflow IIc 2.5-升发酵罐中在37℃下进行,并且维持1.5升的恒定液面同时将流体以高达1,000转/分钟的可变速率用以大约500立方厘米/分钟的速率引入的气体搅动。最佳气体滞留时间在三分钟的范围内。气体进料随着细菌对其的摄取而变化,其继而是细胞密度的函数。
随着培养物浓度接近稳定期(但在进入稳定期之前),细菌生物质的收集以大约12-24小时的间隔进行。大约一半的生物反应器体积通过经由离心泵转移至单独的容器去除。然后将等体积的新鲜或回收培养基返回至生物反应器,使得反应器的光密度为其初始值的大约一半。根据以上方案继续生物反应器发酵,使得多个周期的生长和生物质回收可在单个发酵运行期间进行。
实施例2
来自C
1
代谢微生物的脂质的稳定碳同位素分布
经由元素分析仪/持续流体同位素比率质谱,使用与IsoPrime100IRMS(Isoprime,Cheadle,UK)耦合的CHNOS元素分析仪(vario ISOTOPE cube,Elementar,Hanau,Germany),分析发孢甲基弯菌生物质和液体级分的干样品的碳和氮含量(%干重量),及碳(13C)和氮(15N)稳定同位素比率。将在发酵罐或血清瓶中培养的甲烷营养型生物质的样品离心、重新悬浮于去离子水中,并且将对应于0.2-2mg碳(约0.5-5mg干细胞重量)的体积转移至5x 9mm锡胶囊(Costech Analytical Technologies,Inc.,Valencia,CA)并且在80℃下干燥24小时。类似地,将之前萃取的液体级分悬浮于氯仿中,并且将含有0.1-1.5mg碳的体积转移至锡胶囊并且在80℃下蒸发24小时至干燥。含有0.1mg碳的标准物提供可靠的δ13C值。
同位素比率以"δ"标记(‰)表达,其中物质的同位素组成相对于标准物的同位素组成(在百万分之一偏差的基础上)通过δ13C(或δ15N)=(R样品/R标准物-1)x 1,000给出,其中R是重与轻同位素形式的分子比率。碳标准物是Vienna Pee Dee Belemnite(V-PDB)和氮标准物是空气。NIST(National Institute of Standards and Technology)提出的SRM(标准参考材料)No.1547桃叶用作校准标准物。所有同位素分析在稳定同位素生物地球化学中心(Center for Stable Isotope Biogeochemistry,University of California,Berkeley)进行。C和N同位素分析的长期外部精准度分别为0.10‰和0.15‰。
将发孢甲基弯菌菌株OB3b以三个不同发酵批次生长在甲烷上,并且将甲基单胞菌属某种16a以单个发酵批次生长在甲烷上。分析这些培养物的每一种的生物质的稳定碳同位素分布(δ13C值;参见表1)。
表1.不同甲烷营养菌中的稳定的碳同位素分布
*DCW(干细胞重量)以g/L报告,其使用特定相关因子相关1.0至0.558g/L的OD(对于Mt OB3b)、1.0至0.355g/L的OD(对于Mc Bath)及1.0至0.42g/L的OD(对于Mms 16a))从测量的光密度(OD600)计算。对于Mt OB3b,每次发酵所用的碳酸氢盐的初始浓度为1.2mM或0.01%(批次号68C)和0.1%或12mM(批次号68A和68B)。
EFT=按小时计的有效发酵时间
此外,对如实施例1所述的生物反应器内的甲烷上生长的菌株发孢甲基弯菌OB3b(Mt OB3b)、荚膜甲基球菌巴斯(Mc Bath)和甲基单胞菌属某种16a(Mms 16a)的生物质和相应的液体级分(参见表2)进行稳定碳同位素分析。
表2.细胞和脂质内的稳定碳同位素分布
批次号 | 菌株 | δ13C细胞 | δ13C脂质 |
68C | Mt OB3b | -57.7 | -48.6 |
62A | Mc Bath | -57.6 | -52.8 |
66A | Mms 16a | -64.4 | -42.2 |
分别在94小时(3.14g DCW/L)、26小时(2.2g DCW/L)和39小时(1.14g DCW/L)收集来自菌株Mt OB3b、Mc Bath和Mms 16a的生物质。表4中的脂质的δ13C值代表一式两份测定的平均值。
实施例3
甲烷来源和纯度对脂质中稳定碳同位素分布的影响
为了检查含有天然气组分的甲烷上甲烷营养菌生长,将含有100mL限定培养基MMS1.0的一系列0.5-升血清瓶用来自在供应了甲烷和空气1:1(v/v)混合物的相同培养基内生长的血清瓶分批培养物(5%v/v)的发孢甲基弯菌OB3b或荚膜甲基球菌巴斯接种。培养基MMS1.0的组成如下:0.8mM MgSO4*7H2O、30mM NaNO3、0.14mM CaCl2、1.2mM NaHCO3、2.35mMKH2PO4、3.4mM K2HPO4、20.7μM Na2MoO4*2H2O、6μM CuSO4*5H2O、10μM FeIII-Na-EDTA及1mL/升的微量金属溶液(每L含有:500mg FeSO4*7H2O、400mg ZnSO4*7H2O、20mg MnCl2*7H2O、50mgCoCl2*6H2O、10mg NiCl2*6H2O、15mg H3BO3、250mg EDTA)。在将培养基高压灭菌且冷却之后,添加磷酸盐、碳酸氢盐和FeIII-Na-EDTA。培养基的最终pH是7.0±0.1。
将接种瓶用橡胶套塞密封并经由注射器通过无菌0.45μm过滤器和无菌27G针注射添加的60mL甲烷气体。将一式两份培养物各自注射60mL体积的(A)99%纯度的甲烷(2.0级,Praxair through Alliance Gas,San Carlos,CA)、(B)70%纯度甲烷,代表天然气标准(Sigma-Aldrich;还含有9%乙烷、6%丙烷、3%甲基丙烷、3%丁烷和其它微量烃组分)、(C)以甲烷来源A和B的1:1混合物递送的85%纯度的甲烷;及(D)>93%甲烷(1.3级,SpecialtyChemical Products,South Houston,TX;内部分析显示组成>99%甲烷)。将培养物在30℃(发孢甲基弯菌菌株OB3b)或42℃(荚膜甲基球菌巴斯)下在以250rpm旋转振荡下孵育,并且通过取出1mL样品来测定OD600以大约12小时的间隔测量生长。在这些时间,将瓶排空并用60mL各种甲烷来源(A、B、C或D)和60mL浓氧(至少85%纯度)替代顶部空间。以约24小时的间隔,去除5mL样品,将细胞通过离心(8,000rpm,10分钟)去除,然后在分析前在-80℃下贮藏。
进行分析来源于发孢甲基弯菌菌株OB3b和荚膜甲基球菌巴斯的甲烷营养型生物质的碳和氮含量(%干重量)及碳(13C)和氮(15N)稳定同位素比率。表3显示用于来自在具有不同水平纯度的甲烷上和各个批次的瓶培养物内生长的荚膜甲基球菌巴斯的生物质样品的稳定碳同位素分析的结果。
表3.在具有不同纯度的不同甲烷来源上生长的荚膜甲基球菌巴斯的稳定碳同位素分布
*甲烷纯度:A:99%甲烷,2.0级(min.99%);B:70%甲烷,天然气标准(含有9%乙烷、6%丙烷、3%甲基丙烷、3%丁烷);C:85%甲烷(A和B甲烷的1:1混合物)
时间=按小时计的瓶培养时间
在一种来源的甲烷(A,99%)上生长的荚膜甲基球菌巴斯的平均δ13C是-41.2±1.2,而在不同来源的甲烷(B,70%)上生长的荚膜甲基球菌巴斯的平均δ13C是-44.2±1.2。当将甲烷来源A和B混合时,观察到中间平均值δ13C为-43.8±2.4。这些数据显示在甲烷来源A和B上生长的细胞物质的δ13C由于输入甲烷的δ13C的差异显著不同于彼此。但是,在两种气体的混合物上生长的细胞利用12C,且因此显示出更负的δ13C值的趋势。
进行类似实验以检查在不同甲烷来源上和各个批次的瓶培养物中生长的两种不同的甲烷营养菌,荚膜甲基球菌巴斯和发孢甲基弯菌OB3b是否显示出δ13C分布差异(参见表4)。
表4.在不同纯度的不同甲烷来源上生长的不同甲烷营养菌的稳定碳同位素分布
*甲烷来源和纯度:A:99%甲烷(2.0级);D:>93%甲烷(1.3级)
时间=按小时计的瓶培养时间
在第一甲烷来源(A)上生长的荚膜甲基球菌的平均δ13C是-44.5±8.8,而在相同甲烷来源上生长的发孢甲基弯菌的平均δ13C是-47.8±2.0。在第二甲烷来源(B)上生长的荚膜甲基球菌的平均δ13C为-37.9±0.4,而发孢甲基弯菌的平均δ13C是-39.8±4.5。这些数据显示在甲烷来源上生长的细胞物质的δ13C与来自在相同来源的甲烷上生长的不同菌株的细胞物质的δ13C高度类似。因此,观察到的细胞物质的δ13C看起来主要依赖于输入气体的组成而非研究的特定细菌菌株的性质。
实施例4
荚膜甲烷球菌巴斯菌株内的L-赖氨酸生物合成操纵子的各个或两个基因的克隆
和表达
为了创建过产生氨基酸L-赖氨酸的甲烷营养型细菌菌株,含有编码酶二氢吡啶二羧酸合酶(dapA)(SEQ ID NO 121)或二氨基庚二酸脱羧酶(lysA)(SEQ ID NO:123)和二氨基庚二酸差向异构酶(dapF)(SEQ ID NO:125)或琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶(dapE)(SEQ ID NO:127)或天冬氨酸半醛脱氢酶(asd)(SEQ ID NO:129)或二氢吡啶羧酸还原酶(dapB)(SEQ ID NO:131)或乙酰鸟氨酸氨基转移酶(argD)(SEQ ID NO:133)的氨基酸序列的基因的甲烷营养菌表达载体经由接合交配引入至荚膜甲基球菌巴斯内。所述酶对于荚膜甲基球菌是天然的。游离型表达质粒(含有编码复制起点、转移起点、耐药性标记(卡那霉素)和多克隆位点的序列)用于克隆工程化IPTG-可诱导(LacIq)甲醇脱氢酶(MDH)启动子的这些多核苷酸序列下游的每一个。将携带含途径基因的质粒(在相同表达系统中的一种非相关基因)或携带不具有所述启动子构建体的质粒的接合-感受态大肠杆菌菌株(S-17)(供体菌株)的菌落接种在含有卡那霉素的液体LB(30μg/mL)中,并且在37℃下生长过夜。将一份液体供体培养物接种在100份含有卡那霉素(30μg/mL)的新鲜LB内持续3-5小时,之后它们用于与受体甲烷营养菌株交配。将甲烷营养型(受体)菌株用约40mL甲烷接种在液体MM-W1培养基内(Pieja等,2011,Microbial Ecology 62:564-573)1-2天,之后交配直至它们到达对数生长期(OD600为约0.3)。
两亲交配通过制备一定体积的受体和供体菌株进行,使得OD600比率为1:1(如OD600为1.5的1mL甲烷营养菌和OD600为1.5的1mL供体)。然后通过以13.2k rpm离心60秒收集这些细胞。去除上清液,并将细胞沉淀轻轻重新悬浮于500μL MM-W1内。对于大肠杆菌供体菌株,将离心和重新悬浮再重复2次以确保去除抗生素。然后将等体积的重新悬浮的受体和供体菌株细胞合并并通过轻轻吸打混合。将交配组合物以13.2k rpm离心60秒,并且尽可能多地去除上清液。然后将细胞沉淀轻轻混合并作为单液滴沉积在交配琼脂(含有无菌0.5%酵母提取物的完全MM-W1培养基)上。将交配板在含有甲烷和空气(以1:1比率)的密封室内在37℃下孵育48小时。在48小时的孵育时期后,将来自交配板的细胞通过添加1mL MM-W1培养基至板上并转移混悬的细胞至2mL Eppendorf管收集。将细胞通过离心沉淀并用100μL新鲜MM-W1重新悬浮,之后涂铺至选择板(含有卡那霉素7.5μg/mL的完全MM-W1琼脂培养基)上以选择稳定维持构建体的细胞。在42℃下孵育约1周后,携带质粒的甲烷营养菌出现在这些板上。然后将菌落在42℃下在振荡孵育器中生长于含有1:1甲烷与空气比率的密封容器内的2.5ml液体培养基(MMS1)中。在24小时后,添加IPTG至5mM的最终浓度以诱导靶基因的表达。在另外72小时后,使用实施例9所述的方法测定培养物的氨基酸产生。表5提供菌株的概述。
表5.菌株概述
结果呈现于图1中,其是为菌株函数的胞外L-赖氨酸浓度(如异源表达指定基因的菌株的细胞上清液内所检测)除以培养物的光密度(OD600nm)的图。基因型关键34和1067是空质粒对照和在相同的启动子背景下表达非相关基因(编码绿色荧光蛋白)的对照。所述条表示一至八种样品的平均值(一些克隆不生长)。所述图表明指定基因的过表达导致胞外L-赖氨酸增加超过空质粒对照(基因型关键34)10至16倍且增加超过不相关基因对照(基因型关键1067)1.2至2.1倍。所述结果证明由于指定的L-氨基酸生物合成酶-编码核酸表达导致的胞外L-赖氨酸产生增加,这是在外源性启动子的控制下。
实施例5
在荚膜甲烷球菌巴斯中编码高L-赖氨酸含量的蛋白质(贮存蛋白质)的基因的克
隆和表达
为了创建在细胞相关的生物质内过产生氨基酸L-赖氨酸的甲烷营养型细菌菌株,将含有编码具有升高的L-赖氨酸含量的蛋白质氨基酸序列的若干种基因变体之一的甲烷营养菌表达载体(S9A家族肽酶在此指定为HighK(SEQ ID NO:152))经由接合交配引入荚膜甲基球菌巴斯。游离型表达质粒(含有编码复制起点、转移起点、耐药性标记(卡那霉素)和多克隆位点的序列)用于克隆工程化IPTG-可诱导(LacIq)甲醇脱氢酶(MDH)启动子的HighK多核苷酸序列(SEQ ID NO:151、153、155、157、159、161、163和165,各自是荚膜甲基球菌巴斯的不同经密码子优化序列)下游。将携带含实验基因的质粒或没有所述启动子-基因构建体的“阴性对照”质粒的接合-感受态大肠杆菌菌株(S-17)(供体菌株)的菌落接种在含有卡那霉素(30μg/mL)的液体LB中并且在37℃下生长过夜。将一份液体供体培养物接种在100份含有卡那霉素(30μg/mL)的新鲜LB内持续3-5小时,之后它们用于与受体甲烷营养菌株交配。将甲烷营养型(受体)菌株用约40mL甲烷接种在液体MM-W1培养基内(Pieja等,2011,Microbial Ecology 62:564-573)1-2天,之后交配直至它们到达对数生长期(OD600为约0.3)。
两亲交配通过制备一定体积的受体和供体菌株进行,使得OD600比率为1:1(如OD600为0.3的5mL甲烷营养菌和OD600为0.3的5mL供体)。然后通过以13.2k rpm离心60秒收集这些细胞。去除上清液,并将细胞沉淀轻轻重新悬浮于500μL MM-W1内。对于大肠杆菌供体菌株,将离心和重新悬浮再重复2次以确保去除抗生素。然后将等体积的重新悬浮的受体和供体菌株细胞合并并通过轻轻吸打混合。将交配组合物以13.2k rpm离心60秒,并且尽可能多地去除上清液。然后将细胞沉淀轻轻混合并作为单液滴沉积在交配琼脂(含有无菌0.5%酵母提取物的完全MM-W1培养基)上。将交配板在含有甲烷和空气(以1:1比率)的密封室内在37℃下孵育48小时。在48小时的孵育时期后,将来自交配板的细胞通过添加1mL MM-W1培养基至板上并转移混悬的细胞至2mL Eppendorf管收集。将细胞通过离心沉淀并用100μL新鲜MM-W1重新悬浮,之后涂铺至选择板(含有卡那霉素7.5μg/mL的完全MM-W1琼脂培养基)上以选择稳定维持构建体的细胞。在42℃下孵育约1周后,携带质粒的甲烷营养菌出现在这些板上。然后将菌落在42℃下在振荡孵育器中生长于含有1:1甲烷与空气比率的密封容器内的2.5ml液体培养基(MMS1)中。在24小时后,添加IPTG至5mM的最终浓度以诱导靶基因的表达。在指定的时间段(另外48或72小时,取决于培养条件)后,使用实施例9所述的方法测定培养物的氨基酸产生。表6提供菌株的概述。
表6.菌株的概述
基因型ID | 掺入的核酸SEQ ID NO: | 核酸名称 |
34 | 空pMS3对照 | 空pMS3对照 |
1115 | 151 | HighK |
1116 | 153 | HighK |
1117 | 155 | HighK |
1118 | 157 | HighK |
1119 | 159 | HighK |
1120 | 161 | HighK |
1121 | 163 | HighK |
1122 | 165 | HighK |
在异源性表达指定基因的菌株的细胞生物质样品中检测到的细胞相关的L-赖氨酸的浓度描述于图2中。基因型关键34是空质粒对照。所述条表示每个实验基因型中的八个克隆的平均值。所有基因编码相同的S9A家族肽酶(HighK)蛋白质,但每一种具有对应于改变的密码子使用的不同序列。所述图表明指定基因的表达产生各种细胞-相关的L-赖氨酸内含物。基因型关键1122显示该值相对于对照(34)没有增加,而基因型关键1115显示超过对照53%增加。
实施例6
在荚膜甲烷球菌巴斯中二氢吡啶羧酸合酶和贮存蛋白质的克隆和共表达
为了创建过产生氨基酸L-赖氨酸的甲烷营养型细菌菌株,将含有编码酶二氢吡啶二羧酸合酶(dapA)的氨基酸序列(SEQ ID NO:121)的基因和编码具有升高的赖氨酸含量的蛋白质的氨基酸序列的若干基因变体之一的甲烷营养菌表达载体(S9A家族肽酶在此指定为HighK(SEQ ID NO:152))经由接合交配引入荚膜甲基球菌巴斯。游离型表达质粒(含有编码复制起点、转移起点、耐药性标记(卡那霉素)和多克隆位点的序列)用于克隆工程化IPTG-可诱导(LacIq)甲醇脱氢酶(MDH)启动子的dapA(SEQ ID NO:121)和HighK多核苷酸序列(SEQ ID NO:151、153、155、157、159、161、163和165,各自是荚膜甲基球菌巴斯的不同经密码子优化序列)下游。将携带含实验基因的质粒或没有所述启动子-基因构建体的“阴性对照”质粒的接合-感受态大肠杆菌菌株(S-17)(供体菌株)的菌落接种在含有卡那霉素(30μg/mL)的液体LB中并且在37℃下生长过夜。将一份液体供体培养物接种在100份含有卡那霉素(30μg/mL)的新鲜LB内持续3-5小时,之后它们用于与受体甲烷营养菌株交配。将甲烷营养型(受体)菌株用约40mL甲烷接种在液体MM-W1培养基内(Pieja等,2011,MicrobialEcology 62:564-573)1-2天,之后交配直至它们到达对数生长期(OD600为约0.3)。
两亲交配通过制备一定体积的受体和供体菌株进行,使得OD600比率为1:1(如OD600为0.3的5mL甲烷营养菌和OD600为0.3的5mL供体)。然后通过以13.2k rpm离心60秒收集这些细胞。去除上清液,并将细胞沉淀轻轻重新悬浮于500μL MM-W1内。对于大肠杆菌供体菌株,将离心和重新悬浮再重复2次以确保去除抗生素。然后将等体积的重新悬浮的受体和供体菌株细胞合并并通过轻轻吸打混合。将交配组合物以13.2k rpm离心60秒,并且尽可能多地去除上清液。然后将细胞沉淀轻轻混合并作为单液滴沉积在交配琼脂(含有无菌0.5%酵母提取物的完全MM-W1培养基)上。将交配板在含有甲烷和空气(以1:1比率)的密封室内在37℃下孵育48小时。在48小时的孵育时期后,将来自交配板的细胞通过添加1mL MM-W1培养基至板上并转移混悬的细胞至2mL Eppendorf管收集。将细胞通过离心沉淀并用100μL新鲜MM-W1重新悬浮,之后涂铺至选择板(含有卡那霉素7.5μg/mL的完全MM-W1琼脂培养基)上以选择稳定维持构建体的细胞。在42℃下孵育约1周后,携带质粒的甲烷营养菌出现在这些板上。然后将菌落在42℃下在振荡孵育器中生长于含有1:1甲烷与空气比率的密封容器内的2.5ml液体培养基(MMS1)中。在24小时后,添加IPTG至5mM的最终浓度以诱导靶基因的表达。在指定的时间段(另外48或72小时,取决于培养条件)后,测定培养物的氨基酸产生。表7提供菌株的概述。
表7.菌株概述
基因型ID | 掺入的核酸SEQ ID NO. | 核酸名称 |
1067 | 绿色荧光报告基因 | 绿色荧光报告基因 |
1186 | 151,121 | HighK,dapA |
1187 | 153,121 | HighK,dapA |
1188 | 155,121 | HighK,dapA |
1189 | 157,121 | HighK,dapA |
1190 | 159,121 | HighK,dapA |
1191 | 161,121 | HighK,dapA |
1192 | 163,121 | HighK,dapA |
1193 | 165,121 | HighK,dapA |
结果描述于下表8及如下文所述的图3和4中。
表8.由异源表达基因dapA和HighK蛋白质编码基因的荚膜甲基球菌巴斯进行的胞外L-赖氨酸产生
*%RSD(相对标准偏差)
在异源表达指定基因的菌株的培养物中测定的细胞相关的L-赖氨酸的浓度描绘于图3中。在图中,基因型关键1067是在相同的启动子背景下表达不相关基因(荧光报告基因)的对照。所述条表示每个实验基因型的八个克隆的平均值。实验菌株(1186-1193)含有dapA以及编码富L-赖氨酸蛋白质(指定为HighK)的基因。所有HighK基因编码相同的氨基酸序列,但具有不同的密码子使用。预期各种密码子使用将调节产生的HighK多肽的量。所述图说明指定基因的表达导致各种细胞相关的L-赖氨酸;基因型关键1186显示了该值相对于对照(1067)增加18%,而基因型关键1188显示了超过对照(1067)的36%增加。
在异源表达指定基因的菌株的培养物上清液样品中检测到的胞外L-赖氨酸的浓度描绘于图4中。如在图3中,基因型关键1067是在相同的启动子背景下表达不相关基因(荧光报告基因)的对照。所述条表示每个实验基因型的八个克隆的平均值。所述图说明基于每组克隆的平均值,指定基因的表达导致胞外L-赖氨酸超过对照(基因型关键1067)增加8至23倍。
图3和4中表示的结果表明胞外L-赖氨酸和细胞相关的L-赖氨酸产生增加由于指定的外源核酸序列表达导致。
实施例7
在用于产生L-赖氨酸的荚膜甲烷球菌巴斯中氨基酸生物合成操纵子的基因的克
隆和共表达
为了创建过产生氨基酸L-赖氨酸的甲烷营养型细菌菌株,将含有编码来自荚膜甲基球菌巴斯和/或大肠杆菌氨基酸生物合成途径的酶的氨基酸序列的不同基因组合(“操纵子”)的各种甲烷营养菌表达载体构建并经由接合交配引入荚膜甲基球菌巴斯。这些操纵子含有以下基因:
操纵子A:天冬氨酸激酶I(thrA;SEQ ID NO:135);二氢吡啶二羧酸合酶(dapA;SEQID 121);二氨基庚二酸脱羧酶(lysA;SEQ ID NO:123)
操纵子B:天冬氨酸激酶II(metL;SEQ ID NO:137);二氢吡啶二羧酸合酶(dapA;SEQ ID NO:121);二氨基庚二酸脱羧酶(lysA;SEQ ID NO:123)
操纵子C:天冬氨酸激酶III(lysC;SEQ ID NO:139);高丝氨酸脱氢酶(hom;SEQ IDNO:141);二氢吡啶二羧酸合酶(dapA;SEQ ID NO:121);二氨基庚二酸脱羧酶(lysA;SEQ IDNO:123)
操纵子D:高丝氨酸O-琥珀酰转移酶(metA;SEQ ID NO:143);O-琥珀酰-L-高丝氨酸硫化氢解酶(metZ;SEQ ID NO:145);高半胱氨酸转甲基酶(metE;SEQ ID NO:147);甲硫氨酸合酶(metH;SEQ ID NO:149)
操纵子F:天冬氨酸激酶II(metL;SEQ ID NO:137);高丝氨酸O-琥珀酰转移酶(metA;(SEQ ID NO:143);高半胱氨酸转甲基酶(metE;SEQ ID NO:147)
操纵子G:天冬氨酸激酶III(lysC;SEQ ID NO:139);高丝氨酸脱氢酶(hom;SEQ IDNO:141);高丝氨酸O-琥珀酰转移酶(metA;SEQ ID NO:143);高半胱氨酸转甲基酶(metE;SEQ ID NO:147)
游离型表达质粒(含有编码复制起点、转移起点、耐药性标记(卡那霉素)和多克隆位点的序列)用于克隆工程化IPTG-可诱导(LacIq)甲醇脱氢酶(MDH)启动子的操纵子(上文指定)下游的多核苷酸序列。将携带含操纵子的质粒或携带不具有所述启动子-操纵子构建体的质粒的接合-感受态大肠杆菌菌株(S-17)(供体菌株)的菌落接种在含有卡那霉素的液体LB(30μg/mL)中,并且在37℃下生长过夜。将一份液体供体培养物接种在100份含有卡那霉素(30μg/mL)的新鲜LB内持续3-5小时,之后它们用于与受体甲烷营养菌株交配。将甲烷营养型(受体)菌株用约40mL甲烷接种在液体MM-W1培养基内(Pieja等,2011,MicrobialEcology 62:564-573)1-2天,之后交配直至它们到达对数生长期(OD600为约0.3)。
两亲交配通过制备一定体积的受体和供体菌株进行,使得OD600比率为1:1(如OD600为0.3的5mL甲烷营养菌和OD600为0.3的5mL供体)。然后通过以13.2k rpm离心60秒收集这些细胞。去除上清液,并将细胞沉淀轻轻重新悬浮于500μL MM-W1内。对于大肠杆菌供体菌株,将离心和重新悬浮再重复2次以确保去除抗生素。然后将等体积的重新悬浮的受体和供体菌株细胞合并并通过轻轻吸打混合。将交配组合物以13.2k rpm离心60秒,并且尽可能多地去除上清液。然后将细胞沉淀轻轻混合并作为单液滴沉积在交配琼脂(含有无菌0.5%酵母提取物的完全MM-W1培养基)上。将交配板在含有甲烷和空气(以1:1比率)的密封室内在37℃下孵育48小时。在48小时的孵育时期后,将来自交配板的细胞通过添加1mL MM-W1培养基至板上并转移混悬的细胞至2mL Eppendorf管收集。将细胞通过离心沉淀并用100μL新鲜MM-W1重新悬浮,之后涂铺至选择板(含有卡那霉素7.5μg/mL的完全MM-W1琼脂培养基)上以选择稳定维持构建体的细胞。在42℃下孵育约1周后,携带质粒的甲烷营养菌出现在这些板上。然后将菌落在42℃下在振荡孵育器中生长于含有1:1甲烷与空气比率的密封容器内的2.5ml液体培养基(MMS1)中。在24小时后,添加IPTG至5mM的最终浓度以诱导靶基因的表达。在指定的时间段(另外48或72小时,取决于培养条件)后,测定培养物的氨基酸产生。
表9的结果表明胞外L-赖氨酸产生增加由于指定的外源核酸序列表达导致。
表9.由异源表达参与氨基酸生物合成的基因的荚膜甲基球菌巴斯进行的胞外L-赖氨酸产生
对于表9中的每条序列,列出了推定含有指定序列的克隆组的最高检测测定值。指定重组细胞具有增加的赖氨酸产生的下限被设定为比未改变的对照(即阴性对照菌株)的测定值高2-倍浓度的胞外赖氨酸。在测试的克隆组推定含有相同的异源基因组合的若干种情况下,观察到胞外赖氨酸浓度相对于对照没有增加。已证明荚膜甲基球菌巴斯的生长受到甚至低浓度的胞外氨基酸的影响(Eroshin,Harwood和Pirt,1968,J.appl.Bact.,31,560-567),表明了氨基酸生物合成改变将可能对正常细胞生长不利。尽管不希望受到任何理论束缚,据信天然氨基酸生物合成活性的改变诱导对表达细胞的高选择性压力以突变或另外失活引入的基因。因此,缺乏高于阈值的活性可由包括核酸序列突变或质粒丢失的多种因素因素引起(其在鉴定为低于检测阈值的若干个克隆中观察到),并且不提供在那种情况下存在或不存在酶功能的决定性证据。
实施例8
用于产生L-甲硫氨酸的荚膜甲烷球菌巴斯中的氨基酸生物合成操纵子的基因的
克隆和共表达
为了创建过产生氨基酸L-甲硫氨酸的甲烷营养型细菌菌株,将含有编码来自荚膜甲基球菌巴斯和/或大肠杆菌氨基酸生物合成途径的酶的氨基酸序列的四种不同基因组合(“操纵子”)的各种甲烷营养菌表达载体构建并经由接合交配引入荚膜甲基球菌巴斯。这些操纵子含有以下基因:
操纵子B:天冬氨酸激酶II(metL;SEQ ID NO:137);二氢吡啶二羧酸合酶(dapA;SEQ ID NO:121);二氨基庚二酸脱羧酶(lysA;SEQ ID NO:123)
操纵子D:高丝氨酸O-琥珀酰转移酶(metA;SEQ ID NO:143);O-琥珀酰-L-高丝氨酸硫化氢解酶(metZ;SEQ ID NO:145);高半胱氨酸转甲基酶(metE;SEQ ID NO:147);甲硫氨酸合酶(metH;SEQ ID NO:149)
操纵子F:天冬氨酸激酶II(metL;SEQ ID NO:137);高丝氨酸O-琥珀酰转移酶(metA;SEQ ID NO:143);高半胱氨酸转甲基酶(metE;SEQ ID NO:147)
操纵子G:天冬氨酸激酶III(lysC;SEQ ID NO:139);高丝氨酸脱氢酶(hom;SEQ IDNO:141);高丝氨酸O-琥珀酰转移酶(metA;SEQ ID NO:143);高半胱氨酸转甲基酶(metE;SEQ ID NO:147)
游离型表达质粒(含有编码复制起点、转移起点、耐药性标记(卡那霉素)和多克隆位点的序列)用于克隆工程化IPTG-可诱导(LacIq)甲醇脱氢酶(MDH)启动子的这些操纵子(参见上文)下游的多核苷酸序列。将携带含操纵子的质粒或携带不具有所述启动子-操纵子构建体的质粒的接合-感受态大肠杆菌菌株(S-17)(供体菌株)的菌落接种在含有卡那霉素的液体LB(30μg/mL)中,并且在37℃下生长过夜。将一份液体供体培养物接种在100份含有卡那霉素(30μg/mL)的新鲜LB内持续3-5小时,之后它们用于与受体甲烷营养菌株交配。将甲烷营养型(受体)菌株用约40mL甲烷接种在液体MM-W1培养基内(Pieja等,2011,Microbial Ecology 62:564-573)1-2天,之后交配直至它们到达对数生长期(OD600为约0.3)。
两亲交配通过制备一定体积的受体和供体菌株进行,使得OD600比率为1:1(如OD600为0.3的5mL甲烷营养菌和OD600为0.3的5mL供体)。然后通过以13.2k rpm离心60秒收集这些细胞。去除上清液,并将细胞沉淀轻轻重新悬浮于500μL MM-W1内。对于大肠杆菌供体菌株,将离心和重新悬浮再重复2次以确保去除抗生素。然后将等体积的重新悬浮的受体和供体菌株细胞合并并通过轻轻吸打混合。将交配组合物以13.2k rpm离心60秒,并且尽可能多地去除上清液。然后将细胞沉淀轻轻混合并作为单液滴沉积在交配琼脂(含有无菌0.5%酵母提取物的完全MM-W1培养基)上。将交配板在含有甲烷和空气(以1:1比率)的密封室内在37℃下孵育48小时。在48小时的孵育时期后,将来自交配板的细胞通过添加1mL MM-W1培养基至板上并转移混悬的细胞至2mL Eppendorf管收集。将细胞通过离心沉淀并用100μL新鲜MM-W1重新悬浮,之后涂铺至选择板(含有卡那霉素7.5μg/mL的完全MM-W1琼脂培养基)上以选择稳定维持构建体的细胞。在42℃下孵育约1周后,携带质粒的甲烷营养菌出现在这些板上。然后将菌落在42℃下在振荡孵育器中生长于含有1:1甲烷与空气比率的密封容器内的2.5ml液体培养基(MMS1)中。在24小时后,添加IPTG至5mM的最终浓度以诱导靶基因的表达。在指定的时间段(另外48或72小时,取决于培养条件)后,测定培养物的氨基酸产生。
表10中呈现的结果表明胞外L-甲硫氨酸产生增加由于指定的外源核酸序列表达导致。
表10.由异源表达参与氨基酸生物合成的基因的荚膜甲基球菌巴斯进行的胞外L-甲硫氨酸产生
对于表10中的每条序列,列出了推定含有指定序列的克隆组的最高检测测定值。指定重组细胞具有增加的L-甲硫氨酸产生的下限被设定为比未改变的对照(即阴性对照菌株)的测定值高2-倍浓度的胞外赖氨酸。在测试的克隆组推定含有相同的异源基因组合的若干种情况下,观察到胞外赖氨酸浓度相对于对照没有增加。已证明荚膜甲基球菌巴斯的生长受到甚至低浓度的胞外氨基酸的影响(Eroshin,Harwood和Pirt,1968,J.appl.Bact.,31,560-567),表明了氨基酸生物合成改变将可能对正常细胞生长不利。尽管不希望受到任何理论束缚,据信天然氨基酸生物合成活性的改变诱导对表达细胞的高选择性压力以突变或另外失活引入的基因。因此,缺乏高于阈值的活性可由包括核酸序列突变或质粒丢失的多种因素因素引起(其在鉴定为低于检测阈值的若干个克隆中观察到),并且不提供在那种情况下存在或不存在酶功能的决定性证据。
实施例9
用于由荚膜甲烷球菌巴斯产生L-赖氨酸和L-甲硫氨酸的测定
获得含有具有IPTG-可诱导(LacIq)启动子-dapA构建体的载体或不具有此类构建体的载体(这两者在5mM IPTG的存在下生长)的荚膜甲基球菌巴斯菌株的培养物样品。将这些样品以13.2k rpm离心1.5分钟,并且测定上清液和细胞沉淀的氨基酸产生。在用氯甲酸甲酯衍生化后,通过GC-MS分析不含细胞的上清液(参考Sue等)。为了评估生物质内的氨基酸组成,将细胞沉淀在6N HCl中在100℃下在持续搅动下消化24小时,然后中和、用氯甲酸甲酯衍生化及随后进行GC-MS分析。定量分析使用Agilent 6890/5972GC-MS系统进行。GC装配有0.25mm x 30m x 0.25μm维数的HP-5MS毛细管柱且以1mL/min的流速接受氦载体气体。箱温程序在55℃下开始3分钟、以20℃/min的速率上升至325℃并保持2分钟。使用Hamilton10μL自动进样器注射器注射1μL样品。样品入口被维持在250℃、具有15:1的分流比且用塞满玻璃丝的Restek Sky精密低压液滴入口衬作内衬。
L-赖氨酸衍生物在11.51分钟时从柱洗脱并且使用142m/z特征离子定量。化合物鉴定通过在88m/z和26%丰度下相对于靶离子监测定量离子验证。校准标准物从于去离子水中的L-赖氨酸二盐酸盐制备。用于L-赖氨酸的校准曲线使用1/x2加权线性回归拟合。
L-甲硫氨酸在9.954分钟时从柱洗脱并且使用61m/z特征离子定量。化合物鉴定通过监测115m/z(52%相对丰度)和147m/z(34%相对丰度)处的定量离子验证。校准标准物从于去离子水中的纯甲硫氨酸制备。用于L-甲硫氨酸的校准曲线使用1/x2加权线性回归拟合。
实施例10
来源于C
1
代谢微生物的生物质和产物的稳定碳同位素分布
显示产生升高水平的氨基酸(特别是L-赖氨酸(实施例1))的荚膜甲基球菌巴斯的工程化菌株的甲烷-来源的生物质使用耦合至Thermo Delta IRMS的Costech元素分析仪,经由元素分析仪/持续流体同位素比质谱(IRMS)分析碳(13C)稳定同位素比。将在血清瓶中培养的甲烷营养型生物质的样品离心、在去离子水中洗涤一次、在去离子水中重新悬浮,并将对应于0.2-2mg碳(约0.5-5mg干细胞重量)的体积转移至5x 9mm锡胶囊(CostechAnalytical Technologies,Inc.,Valencia,CA)且在80℃下干燥至少60小时。作为对照,将野生型荚膜甲基球菌巴斯和表达荧光蛋白-编码核酸序列的工程化荚膜甲基球菌巴斯菌株的样品平行培养、洗涤且重新悬浮于去离子水中、转移至5x 9mm锡胶囊且在80℃下干燥至少60小时。获得可靠的样品δ13C值,从而在IRMS检测窗内提供~100至10,000mV的响应。分析的生物质样品的IRMS响应范围在3195至8827mV的范围内。一式两份分析每个样品且平均碳(13C)稳定同位素比率报告于表11中。
同位素比率以"δ"标记(‰)表达,其中物质的同位素组成相对于标准物的同位素组成(在百万分之一偏差的基础上)通过δ13C=(R样品/R标准物-1)x 1,000给出,其中R是重(13C)与轻(12C)同位素形式的分子比率。碳标准物是Vienna Pee Dee Belemnite(V-PDB)。同位素分析由Βeta Analytic Inc.(Miami,FL)在严格的保管链和质量对照下(ISO/IEC17025:2005测试认证;PJLA证书#59423)进行。IRMS针对NIST-8541(石墨:-15.90+/-0.25‰)和NIST-8542(蔗糖:-10.47+/-0.13‰)校准。针对这些NIST标志物(乙酰苯胺:-33.4+/-0.3‰)校准的工作标准在测量未知数之前和之后运行。在空白修正后,针对二级标准测量的值是-33.22‰和-33.22‰。然后进行归一化,从而将结果调整0.2‰以使结果系统化为主要NIST参考。将+/-0.3‰(绝对)的保守误差指定给结果以解释不定误差。尽管检测器内的再现性由制造商引用在0.02‰内,单个允许之间的偏离可变化0.3-0.5‰,且因此ΒetaAnalytics Inc.引用结果至最近的第10个而非第100个并指定+/-0.3‰的绝对误差。
将用于可诱导表达dapA或绿色荧光蛋白编码核酸(参见表11)构建的单独荚膜甲基球菌巴斯菌株生长在含有补充50ug/mL卡那霉素的110mL限定培养基MMS1.0的0.5L血清瓶内的甲烷上。卡那霉素在用于培养野生型荚膜甲基球菌巴斯的培养基中省略。将来自在供应了甲烷和空气的大约1:1(v/v)混合物(如60mL甲烷至含有75mL空气的顶部空间)的相同培养基中生长的25mL血清瓶分批培养物的菌株接种。所述培养基MMS1.0的组成如下:0.8mM MgSO4*7H2O、30mM NaNO3、0.14mM CaCl2、1.2mM NaHCO3、2.35mM KH2PO4、3.4mMK2HPO4、20.7μM Na2MoO4*2H2O、6μM CuSO4*5H2O、10μM FeIII-Na-EDTA和1mL/升的微量金属溶液(每L含有:500mg FeSO4*7H2O、400mg ZnSO4*7H2O、20mg MnCl2*7H2O、50mg CoCl2*6H2O、10mg NiCl2*6H2O、15mg H3BO3、250mg EDTA)。在将培养基高压灭菌和冷却后,添加磷酸盐、碳酸氢盐和FeIII-Na-EDTA。培养基的最终pH为7.0±0.1。将血清瓶内的110mL体积培养物接种至初始0.1的OD600,用橡胶套塞密封且经由注射器通过无菌0.45μm过滤器和无菌27G针注射添加的120mL甲烷气体(99%纯度;2.0级,由Alliance Gas,San Carlos,CA供应的Praxair)。将培养物在42℃下在250rpm的旋转振荡下垂直孵育,并且通过取出1mL样品测定OD600测量生长。当培养物达到至少0.6的OD600时,排空瓶并将顶部空间用60mL甲烷和120mL浓氧(至少85%纯度)替代。将顶部空间以这种方式每8至12小时替代。当达到1.6的OD600(大约48小时生长)时,通过添加过滤器-灭菌的IPTG至5mM的最终浓度诱导所有培养物以开始靶基因产物的过表达。将培养物用如上指定替换的顶部空间气体再生长48小时。最终生物质样品通过离心(8,000rpm,10分钟)收集并制备以用于如上所述的13C稳定同位素分析。
表11提供过表达dapA的荚膜甲基球菌巴斯的工程化菌株(允许L-赖氨酸产生(基因型ID 1057)产生增加)以及表达编码Dasher荧光蛋白(基因型ID 1067)的基因的对照菌株及野生型亲本菌株的稳定碳同位素分布(δ13C值)的概述。所述结果显示δ13C值是高度负的且表明在来自经工程化用于过表达氨基酸、荧光蛋白的菌株以及荚膜甲基球菌巴斯野生型菌株的生物质和产物中12C高度富集。
表11.荚膜甲基球菌巴斯的工程化和对照菌株的菌株描述和其甲烷-来源的生物质的稳定碳同位素分布
以上所述的各种实施方案可经合并以提供另外的实施方案。本说明书提及和/或申请数据页所列的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非-专利公开,包括但不限于2014年1月16日提交的美国临时申请No.61/928,401通过引用以其整体并入本文。
通常,在以下权利要求中,所用的术语不应理解为将权利要求限制为说明书和权利要求所公开的特定实施方案,但应被理解为包括所有可能的实施方案连同授予此类权利要求的全范围等效形式。因此,所述权利要求不由本公开限制。
Claims (23)
1.一种重组C1代谢微生物,其包含第一外源核酸,所述第一外源核酸选自由编码L-氨基酸生物合成酶的外源核酸和编码可操作地连接至编码天然L-氨基酸生物合成酶的核酸的表达控制序列的外源核酸组成的组,其中所述重组C1代谢微生物能够将天然气来源的碳原料转化为所需的L-氨基酸,并且其中所述重组C1代谢微生物的δ13C低于-30‰。
2.如权利要求1所述的重组C1代谢微生物,其中所述第一外源核酸编码L-氨基酸生物合成酶。
3.如权利要求1-2中任一项所述的重组C1代谢微生物,其中所述微生物还包含编码贮存多肽的第二外源核酸。
4.如权利要求1-3中任一项所述的重组C1代谢微生物,其中所述天然气来源的原料是天然气。
5.如权利要求1-3中任一项所述的重组C1代谢微生物,其中所述天然气来源的原料是甲烷。
6.如权利要求1-5中任一项所述的重组C1代谢微生物,其中重组甲烷营养型微生物包含比由天然C1代谢微生物产生的水平大至少约10%的水平产生所需的L-氨基酸的能力。
7.如权利要求1-6中任一项所述的重组C1代谢微生物,其中所述C1代谢微生物是甲烷营养菌。
8.如权利要求1-7中任一项所述的重组C1代谢微生物,其中所述第一外源核酸编码选自由赖氨酸生物合成酶、色氨酸生物合成酶、甲硫氨酸生物合成酶、半胱氨酸生物合成酶及苏氨酸生物合成酶组成的组的L-氨基酸生物合成酶。
9.如权利要求8所述的重组C1代谢微生物,其中所需的L-氨基酸是赖氨酸,且其中所述第一外源核酸编码选自由以下组成的组的赖氨酸生物合成酶:赖氨酸-敏感性天冬氨酸激酶III(lysC)、天冬氨酸激酶、天冬氨酸-半醛脱氢酶(asd)、二氢吡啶二羧酸合酶(dapA)、二氢吡啶二羧酸还原酶(dapB)、2,3,4,5-四氢吡啶-2,6-甲酸N-琥珀酰转移酶(dapD)、乙酰鸟氨酸/琥珀酰二氨基庚二酸氨基转移酶(argD)、琥珀酰-二氨基庚二酸脱琥珀酰酶(dapE)、琥珀酰二氨基庚二酸转氨酶、二氨基庚二酸差向异构酶(dapF)及二氨基庚二酸脱羧酶(lysA)。
10.如权利要求9所述的重组C1代谢微生物,其中所述第一外源核酸编码二氢吡啶二羧酸合酶(dapA)。
11.如权利要求8所述的重组C1代谢微生物,其中所需的L-氨基酸是L-甲硫氨酸,且其中所述第一外源核酸编码选自由以下组成的组的甲硫氨酸生物合成酶:高丝氨酸O-琥珀酰转移酶(metA)、胱硫醚γ-合酶(metB)、蛋白质MalY、胱硫醚β-裂解酶(metC)、B12-依赖性甲硫氨酸合酶(metH)及5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸-高半胱氨酸S-甲基转移酶(metE)。
12.如权利要求8所述的重组C1代谢微生物,其中所述L-氨基酸是L-半胱氨酸,且其中所述第一外源核酸编码选自由以下组成的组的半胱氨酸生物合成酶:丝氨酸乙酰转移酶(CysE)、半胱氨酸合酶A及半胱氨酸合酶B。
13.如权利要求8所述的重组C1代谢微生物,其中所需的L-氨基酸是L-苏氨酸,并且其中所述第一外源核酸编码选自由以下组成的组的苏氨酸生物合成酶:天冬氨酸转氨酶、PLP-依赖性氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、天冬氨酸激酶、天冬氨酸-半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶及苏氨酸合酶。
14.如权利要求8所述的重组C1代谢微生物,其中所需的L-氨基酸是L-色氨酸,且其中所述第一外源核酸编码选自由以下组成的组的色氨酸生物合成酶:分支酸-丙酮酸裂解酶(ubiC)、邻氨基苯甲酸合酶组分I(trpE)、邻氨基苯甲酸合酶组分II(trpG)、邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶(trpD)、磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶(trpC)、色氨酸生物合成蛋白质(trpC)、N-(5'-磷酸核糖基)邻氨基苯甲酸异构酶(trpF)、吲哚-3-甘油磷酸合酶、色氨酸合酶α链(trpA)及色氨酸合酶β链(trpB)。
15.如权利要求1-7中任一项所述的重组C1代谢微生物,其中所述第一外源核酸编码具有与选自由以下组成的组的参考序列至少90%同一性的氨基酸序列的L-氨基酸生物合成酶:SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148和150。
16.如权利要求1和3-7中任一项所述的重组C1代谢微生物,其中所述第一外源核酸编码可操作地连接至编码天然L-氨基酸生物合成酶的核酸的表达控制序列。
17.如权利要求1-16中任一项所述的重组C1代谢微生物,其中所述第一外源核酸的序列为了从所述重组C1代谢微生物最佳表达经密码子优化。
18.如权利要求3-16中任一项所述的重组C1代谢微生物,其中所述第二外源核酸的序列为了从所述重组C1代谢微生物最佳表达经密码子优化。
19.如权利要求1-7中任一项所述的重组C1代谢微生物,其中所述第一外源核酸编码L-氨基酸生物合成酶,并且其中所述第一外源核酸包含具有与选自由以下组成的组的参考序列至少85%同一性的核酸序列:SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147和149。
20.如权利要求1-19中任一项所述的重组C1代谢微生物,其中所述微生物展现低于-35‰的δ13C。
21.一种生物质,其来源于如权利要求1-20中任一项所述的重组C1代谢微生物的培养物。
22.如权利要求21所述的生物质,其中所述生物质的δ13C低于-30‰。
23.如权利要求21所述的生物质,其中所述生物质的δ13C低于-35‰。
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