CN102639691B

CN102639691B - 生产l-半胱氨酸的细菌以及生产l-半胱氨酸的方法

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Publication number: CN102639691B
Application number: CN201080054191.XA
Authority: CN
Inventors: 野中源
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
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Filing date: 2010-11-26
Publication date: 2014-04-16
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Abstract

本发明提供一种生产L-半胱氨酸的细菌以及一种使用所述细菌生产L-半胱氨酸等的方法，通过开发新的技术用于改善细菌的L-半胱氨酸生产能力。通过在培养基中培养属于肠杆菌科的细菌，所述细菌具有L-半胱氨酸生产能力并且经过修饰从而使得由yciW基因编码的蛋白质如以下(A)或(B)定义的蛋白质的活性降低，并且从所述培养基中收集L-半胱氨酸、L-胱氨酸、所述氨基酸的衍生物或上述物质的混合物，生产出这些化合物：(A)具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质，(B)具有SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列但包含一个或数个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加，并且在所述细菌中的活性降低时导致L-半胱氨酸生产能力改善的蛋白质。

Description

生产L-半胱氨酸的细菌以及生产L-半胱氨酸的方法

技术领域

本发明涉及一种生产L-半胱氨酸或其相关物质的方法。更具体地，本发明涉及适于生产L-半胱氨酸或其相关物质的细菌、以及使用该细菌生产L-半胱氨酸或其相关物质的方法。L-半胱氨酸及其相关物质可以在药物、化妆品以及食品领域中使用。

背景技术

L-半胱氨酸通常通过从例如毛发、角和羽毛等含有角蛋白质的物质中提取而获得，或者使用微生物酶转化前体DL-2-氨基噻唑啉-4-羧酸通过而获得。此外，还计划使用新型酶通过固定化酶方法大规模生产L-半胱氨酸。此外，还尝试通过使用微生物的发酵来生产L-半胱氨酸。

作为具有生产L-半胱氨酸能力的微生物，已知有例如胞内丝氨酸乙酰转移酶活性增加的棒状杆菌型细菌(专利文献1)。还已知一种通过并入削弱了L-半胱氨酸反馈抑制的突变型丝氨酸乙酰转移酶增加L-半胱氨酸生产能力的技术(专利文献2至4)。

此外，作为通过抑制起分解L-半胱氨酸作用的系统来提高L-半胱氨酸生产能力的微生物，已知削弱或缺失了胱硫醚-β-裂合酶(专利文献2)、色氨酸酶(专利文献5)或O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶B(专利文献6)的活性的棒状杆菌型细菌或埃希氏菌属(Escherichia)细菌。

此外，已知编码YdeD蛋白的ydeD基因参与了L-半胱氨酸途径代谢产物的分泌(非专利文献1)。此外，还已知通过增加mar基因座、emr基因座、acr基因座、cmr基因座、mex基因、bmr基因或qacA基因(专利文献7)，或emrAB、emrKY、yojIH、acrEF、bcr或cusA基因的表达来提高L-半胱氨酸生产能力(专利文献8)的技术，这些基因座/基因编码适于从细胞分泌细胞毒性物质的蛋白质。

此外，作为L-半胱氨酸生产细菌，还已知cysB基因编码的半胱氨酸调节子的正向转录调控因子的活性增加的大肠杆菌(Escherichia coli)(专利文献9).

此外，还已知削弱了丝氨酸反馈抑制的编码3-磷酸甘油酸脱氢酶的突变型serA，并且提出通过将该突变型serA用于通过大肠杆菌进行的L-半胱氨酸生产(专利文献10和11)。

尽管yciW作为编码预测的氧化还原酶的基因登录入数据库EcoCyc(非专利文献2)，但是其实际功能是未知的，并且其与L-半胱氨酸生产的关系也未知晓。

此外，尽管已经报道了通过消除硫源(非专利文献3)、糠醛(非专利文献4)和氧化性应激(非专利文献5)来上调yciW基因，但是在所有这些文献中仅将其作为在微阵列实验中显示出表达变化的大量基因中的一员，并且尚未提示其与L-半胱氨酸生产的关系。

现有技术参考

专利文献

专利文献1：日本特开2002-233384号公报

专利文献2：日本特开平11-155571号公报

专利文献3：美国专利申请公开20050112731

专利文献4：美国专利6,218,168

专利文献5：日本特开2003-169668号公报

专利文献6：日本特开2005-245311号公报

专利文献7：美国专利5,972,663

专利文献8：日本特开2005-287333号公报

专利文献9：国际专利公开WO01/27307

专利文献10：美国专利5,856,148

专利文献11：美国专利申请公开20050009162

非专利文献

非专利文献1：Dabler等,Mol.Microbiol.,36,1101-1112(2000)

非专利文献2：BioCyc主页，Escherichia coli K-12-substr.MG1655 Gene：yciW[2009年10月14日检索]，网络超链接<http：//biocyc.org/ECOLI/NEW-IMAGE?type=GENE&object=G6640>

非专利文献3：Gyaneshwar,P.等，J.Bacteriol.,187：1074-1090(2005)

非专利文献4：Elliot N.,Miller,E.N.,等，Appl.Envir.Microbiol.,10.1128-/AEM.01187-09(2009)

非专利文献5：Wang,S.,等，Appl.Envir.Microbiol.,10.1128/AEM.00914-09(2009)

发明内容

发明所要解决的问题

本发明的目的是通过开发提高细菌的L-半胱氨酸生产能力的新型技术，提供一种生产L-半胱氨酸的细菌以及一种生产L-半胱氨酸、L-胱氨酸、所述氨基酸的衍生物或上述物质的混合物的方法。

解决问题的手段

本发明的发明人为了解决上述问题进行了各种研究，结果发现通过修饰细菌从而降低yciW基因编码的蛋白质的活性可以提高细菌的L-半胱氨酸生产能力，从而完成了本发明。

即，本发明可以如下实施。

(1)一种属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的细菌，其具有L-半胱氨酸生产能力，并且经过修饰从而降低了yciW基因编码的蛋白质的活性。

(2)如上所述的细菌，其中所述蛋白质的活性是通过降低yciW基因的表达量或通过破坏所述基因而降低的。

(3)如上所述的细菌，其中所述蛋白质为下述(A)或(B)中限定的蛋白质：

(A)具有SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的蛋白质，

(B)具有SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列但包含一个或数个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加，并且在所述细菌中的活性降低时导致L-半胱氨酸生产能力改善的蛋白质。

(4)如上所述的细菌，其中所述yciW基因为下述(a)或(b)中限定的DNA：

(a)包含核苷酸序列SEQ ID NO：1中第301至1428位的核苷酸序列的DNA，

(b)能够与核苷酸序列SEQ ID NO：1中第301至1428位的核苷酸序列的互补序列或由所述核苷酸序列制备的探针在严格条件下杂交，并且编码在所述细菌中的活性降低时导致L-半胱氨酸生产能力改善的蛋白质的DNA。

(5)如上所述的细菌，其还具有下述特性中的至少一种：

i)经过修饰从而提高了丝氨酸乙酰转移酶活性，

ii)经过修饰从而提高了ydeD基因的表达，

iii)经过修饰从而提高了3-磷酸甘油酸脱氢酶活性。

(6)如上所述的细菌，其为埃希氏菌属(Escherichia)的细菌。

(7)如上所述的细菌，其为大肠杆菌(Escherichia coli)。

(8)一种L-半胱氨酸、L-胱氨酸、所述氨基酸的衍生物、或上述物质的混合物的生产方法，该方法包括在培养基中培养上述细菌，并从所述培养基中收集L-半胱氨酸、L-胱氨酸、所述氨基酸的衍生物或上述物质的混合物。

(9)如上所述的方法，其中所述L-半胱氨酸的衍生物为噻唑烷衍生物。

发明效果

根据本发明可以提高细菌的L-半胱氨酸生产能力。此外，根据本发明可以高效地制备L-半胱氨酸、L-胱氨酸、所述氨基酸的衍生物或上述物质的混合物。

本发明的具体实施方式

<1>本发明的细菌

本发明的细菌为属于肠杆菌科的细菌，其具有L-半胱氨酸生产能力，并且经过了修饰从而降低了yciW基因编码的蛋白质的活性。L-半胱氨酸生产能力在本文中是指，当在培养基中培养本发明的细菌时，该细菌在培养基中或细菌的细胞中生成L-半胱氨酸，并且积累达到可以从该培养基中或者该细胞中回收的量的能力。具有L-半胱氨酸生产能力的细菌是指，与野生株或者亲本株相比可以在培养基中生产并积累更大量的L-半胱氨酸的细菌，优选可以在培养基中能够生产并积累0.05g/L以上、更优选0.1g/L以上、特别优选0.2g/L以上的量的L-半胱氨酸的细菌。

通过所述细菌生产的一部分L-半胱氨酸可以通过二硫键(disulfide bond)的形成在培养基转化成L-胱氨酸。此外，S-磺基半胱氨酸可以如下文所述通过培养基中所含的L-半胱氨酸与硫代硫酸盐的反应生成(Szczepkowski T.W.,Nature,vol.182(1958))。此外，在细菌细胞中生成的L-半胱氨酸可以与存在于细胞中的酮或醛如丙酮酸缩合，从而经由作为中间体的硫代半缩醛(hemithioketal)生成噻唑烷衍生物(参见日本特许第2992010号)。这些噻唑烷衍生物和硫代半缩醛可以作为平衡的混合物存在。因此，L-半胱氨酸生产能力并不局限于在培养基或细胞中仅积累L-半胱氨酸的能力，而是也包括在培养基中积累除了L-半胱氨酸之外的L-胱氨酸、所述氨基酸的衍生物如S-磺基半胱氨酸、噻唑烷衍生物或硫代半缩醛或前述物质的混合物的能力。此外，L-半胱氨酸用作γ-谷氨酰半胱氨酸、谷胱甘肽、胱硫醚、高半胱氨酸、甲硫氨酸、S-腺苷甲硫氨酸等的生物合成中的起始原料。因此，通过使用除了具有生产L-半胱氨酸的能力之外还具有生产任何上述化合物的能力的细菌可以制备这些化合物。因此，L-半胱氨酸生产能力还包括经由L-半胱氨酸积累待生产的其他化合物的能力。

具有L-半胱氨酸生产能力的细菌可以本来具有L-半胱氨酸生产能力，或者其可以通过用诱变或重组DNA技术修饰细菌，如下文所述的细菌，从而使该细菌获得L-半胱氨酸生产能力而获得。在本发明中，如果没有具体说明，术语L-半胱氨酸可用于指还原型L-半胱氨酸、L-胱氨酸、或者上述那样的衍生物、或者前述物质的混合物。

对本发明中使用的细菌没有特殊限制，只要是属于如埃希氏菌属、肠杆菌属(Enterobacter)、泛菌属(Pantoea)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙雷氏菌属(Serratia)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙门氏菌属(Salmonella)和摩根氏菌属(Morganella)等的肠杆菌科，并且具有生产L-氨基酸的能力的细菌即可。具体地，可以使用按照NCBI(美国国家生物技术信息中心，National Center forBiotechnology Information)数据库中使用的分类归入肠杆菌科的细菌(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347)。作为用于修饰的属于肠杆菌科的亲本株，期望使用特别是埃希氏菌属细菌、肠杆菌属细菌、泛菌属细菌、欧文氏菌属细菌、肠杆菌属细菌、或克雷伯氏菌属细菌。

尽管对于埃希氏菌属细菌没有特别限制，但是具体而言，可以使用Neidhardt等的著作(Backmann,B.J.1996.Derivations and Genotypes of somemutant derivatives of Escherichia coli K-12,p.2460-2488.Table 1.In F.D.Neidhardt(ed.),Escherichia coli and Salmonella Cellular and MolecularBiology/Second Edition,American Society for Microbiology Press,Washington,D.C.)中记载的细菌。在这些细菌中，例如可使用大肠杆菌。大肠杆菌的具体实例包括源自原型野生型K12菌株的大肠杆菌W3110(ATCC 27325)和大肠杆菌MG1655(ATCC 47076)等。

这些菌株可从例如美国典型培养物保藏中心(地址12301 ParklawnDrive,Rockville,Maryland 20852 P.O.Box 1549,Manassas,VA 20108,UnitedStates of America)获得。即，对每种菌株都给予了登录号，并且可以使用这些登录号订购菌株(参考http：//www.atcc.org/)。美国典型培养物保藏中心的目录中列出了各菌株的登录号。

肠杆菌属细菌的实例可以包括成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)和产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)等，泛菌属细菌的实例包括Pantoeaananatis。近年来，一些成团肠杆菌根据其16S rRNA的核苷酸序列的分析等重新分类为成团泛菌(Pantoea agglomerans)、Pantoea ananatis或斯氏泛菌(Pantoea stewartii)。在本发明中，只要是被分类为肠杆菌科的细菌，无论是属于肠杆菌属或者泛菌属中任一属的细菌均可使用。

特别地，泛菌属细菌、欧文氏菌属细菌和肠杆菌属细菌是分类为γ-变形细菌(γ-proteobacteria)的细菌，它们在分类学上的彼此非常接近(J Gen ApplMicrobiol 1997 Dec；43(6)355-361、International Journal of SystematicBacteriology，Oct.1997，p1061-1067)。近年来，依据DNA-DNA杂交实验等，一些属于肠杆菌属的细菌被重新分类为成团泛菌(Pantoea agglomerans)或Pantoea dispersa等(International Journal of Systematic Bacteriology,July1989；39(3).p.337-345)。此外，一些属于欧文氏菌属的细菌被重新分类为菠萝泛菌(Pantoea ananas)或斯氏泛菌(Pantoea stewartii)(参考InternationalJournal of Systematic Bacteriology，Jan 1993；43(1).p.162-173)。

肠杆菌属细菌的实例包括成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)和产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)等。具体地，可以使用欧州专利申请公开952221号说明书示例的菌株。

典型的肠杆菌属的菌株包括成团肠杆菌ATCC12287株。

典型的泛菌属细菌的菌株包括Pantoea ananatis、斯氏泛菌(Pantoeastewartii)、成团泛菌、柠檬泛菌(Pantoea citrea)。

Pantoea ananatis的具体实例包括Pantoea ananatis AJ13355株、SC17株。SC17株是以作为低pH下能够在含L-谷氨酸和碳源的培养基中增殖的菌株从静冈县磐田市的土壤中分离出来的菌株AJ13355(FERM BP-6614)为起始，作为粘液质低生产突变株选择出来的菌株(美国专利第6,596,517号)。

Pantoea ananatis AJ13355株已于平成10年(1998年)2月19日保藏于通产省工业技术院生命工学工业技术研究所(现名称为产业技术综合研究所专利生物保藏中心，地址：邮政编码305-8566茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)，保藏号为FERM P-16644，并于平成11年(1999年)1月11日转为基于布达佩斯条约的国际保藏，并给予保藏号FERM BP-6614。而且，该菌株在分离时被鉴定为成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)，并当作成团肠杆菌AJ13355进行了保藏。但是，近年来，基于16S rRNA核苷酸序列分析等，其被重新分类为Pantoea ananatis。

Pantoea ananatis SC17株已于平成21年(2009年)2月4日保藏于产业技术综合研究所专利生物保藏中心(地址：邮政编码305-8566茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)，并给予保藏号FERM ABP-11091。

欧文氏菌属细菌的实例包括解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)；克雷伯氏菌属细菌的实例包括植生克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)。

下面，对于给属于肠杆菌科的细菌赋予L-半胱氨酸生产能力的方法，或增强这些细菌的L-半胱氨酸生产能力的方法进行描述。

为了向细菌赋予L-半胱氨酸生产能力，可以使用在棒状杆菌型细菌或埃希氏菌属细菌等的选育中常规使用的方法。这些方法包括获取营养缺陷型突变株、类似物抗性菌株或代谢调节突变株，或创建L-半胱氨酸生物合成系统酶过表达的重组菌株等等(参见《アミノ酸発酵》，(株)学会出版中心，1986年5月30日第一版发行，第77-100页)。这里，在L-半胱氨酸生产细菌的选育中，可以赋予上述性质例如营养缺陷性、类似物抗性和代谢调节突变中的一种、两种或者三种以上。此外，表达被增强的L-半胱氨酸生物合成系统酶可以是单独一种，也可以是两种或三种以上。另外，可以将例如营养缺陷性、类似物抗性和代谢调节突变等性质的赋予与生物合成系统酶的增强组合进行。

具有L-半胱氨酸生产能力的营养缺陷突变体菌株、L-半胱氨酸类似物抗性菌株或代谢调节突变株可如下获得：对亲本菌株或野生型菌株施以常规诱变处理，例如暴露于X-射线或UV照射或用诱变剂例如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或者甲磺酸乙酯(EMS)等处理；其后，从所得的突变株中选择显示营养缺陷性、类似物抗性或代谢调节突变并且还具有L-氨基酸生产能力的菌株。

通过增强L-半胱氨酸生物合成途径的酶，或，与生成如L-丝氨酸等作为该途径的底物的化合物相关的酶，例如，3-磷酸甘油酸脱氢酶或丝氨酸乙酰转移酶等的活性，可以提高细菌的L-半胱氨酸生产能力。因为3-磷酸甘油酸脱氢酶受到丝氨酸的反馈抑制，所以通过使细菌携带有编码该反馈抑制被削弱或消除了的突变型3-磷酸甘油酸脱氢酶的突变型serA基因，可以增强该酶的酶活性。

此外，丝氨酸乙酰转移酶受到L-半胱氨酸的反馈抑制。因此，通过使细菌携带有编码该反馈抑制被削弱或消除了的丝氨酸乙酰转移酶的突变型cysE基因，可以增强该酶的酶活性。

L-半胱氨酸生产能力还可以通过提高编码YdeD蛋白的ydeD基因(Dabler等,Mol.Microbiol.,36,1101-1112(2000))或者编码YfiK蛋白的yfiK基因(Japanese Patent Laid-open(公开)No.2004-49237)的表达而增强。

本发明的一个实施方案为具有以下特性中的至少一种：

i)经修饰从而提高了丝氨酸乙酰转移酶活性，

ii)经修饰从而提高了ydeD基因的表达，

iii)经修饰从而提高了3-磷酸甘油酸脱氢酶活性。

此外，通过增强硫酸盐/硫代硫酸盐输送系统的活性，也可以提高L-半胱氨酸的生产能力。硫酸盐/硫代硫酸盐输送系统的蛋白质由cysPTWAM基因簇编码(特开2005-137369号公报，EP1528108号说明书)。

通过提高yeaS基因的表达，也可以提高细菌的L-半胱氨酸生产能力(欧洲专利申请公开第1016710号说明书)。

L-半胱氨酸生产细菌的实例可以列举出、但不限于下述属于埃希氏菌属的菌株，如用编码反馈抑制抗性的丝氨酸乙酰转移酶(SAT)的多种cysE等位基因转化的大肠杆菌JM15菌株(美国专利第6,218,168号)；具有编码适于分泌细胞毒性物质的蛋白质的过表达基因的大肠杆菌W3110菌株(美国专利第5,972,663号)；半胱氨酸脱巯基酶(cysteine desulfohydrase)活性减少的大肠杆菌菌株(日本特开平11-155571号公报)；和由cysB基因编码的半胱氨酸调节子的正向转录调控因子活性增加的大肠杆菌W3110菌株(WO01/27307)；含ydeD基因，突变型cysE基因和突变型serA5基因的具有质粒pACYC-DES的大肠杆菌(日本特开2005-137369号公报(美国专利公开申请20050124049(A1)、欧洲专利公开1528108(A1)))等。pACYC-DES为通过将上述三种基因插入pACYC184所得到的质粒，每个基因的表达通过PompA启动子调控。

作为具有大肠杆菌的半胱氨酸脱巯基酶活性的蛋白质，已知胱硫醚-β-裂合酶(metC产物，日本特开平11-155571号公报，Chandra等,Biochemistry,21(1982)3064-3069)、色氨酸酶(tnaA产物，日本特开2003-169668号公报，Austin Newton等,J.Biol.Chem.,240(1965)1211-1218))、O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶B(cysM基因产物，日本特开2005-245311号公报)和malY基因产物(日本特开2005-245311)。通过降低这些蛋白质的活性提高了L-半胱氨酸生产能力。

在本发明中，L-半胱氨酸生产细菌优选具有对反馈抑制有抗性的突变型SAT。作为衍生自大肠杆菌的且对反馈抑制有抗性的突变型SAT，具体已知用谷氨酸残基取代第256位的甲硫氨酸的突变型SAT(日本特开平11-155571号公报)、用异亮氨酸残基取代第256位的甲硫氨酸残基的突变型SAT(Denk,D.and Boeck,A.,J.general Microbiol.,133,515-525(1987))、在第97位氨基酸残基至第273位氨基酸残基的区域具有突变或者缺失从第227位的氨基酸残基开始的C端区域的突变型SAT(国际专利公开WO97/15673，美国专利6,218,168)、对应于野生型SAT第89至96位的氨基酸序列含有一个或多个突变并且对L-半胱氨酸的反馈抑制脱敏的突变型SAT(美国专利公开申请20050112731(A1))、SAT第95和96位的Val残基和Asp残基分别用Arg残基和Pro残基取代的突变型SAT(突变型基因的名称：cysE5,WO2005/007841)、在第167位的苏氨酸残基用丙氨酸残基取代的突变(美国专利公开6,218,168，美国专利公开申请20050112731(A1))，等等。

SAT基因不限于大肠杆菌的基因，而是可以使用编码具有SAT活性的蛋白质的任何基因。已知对L-半胱氨酸的反馈抑制脱敏的拟南芥(Arabidopsis thaliana)的SAT同工酶不敏感，也可以使用编码该同工酶的基因(FEMS Microbiol.Lett.,179,453-459(1999))。

如果将编码突变型SAT的基因引入细菌中，则赋予了L-半胱氨酸生产能力。

为了将基因引入细菌中，可以使用各种用于常见蛋白表达的载体。这种载体的实例包括pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pBR322、pACYC184、pMW219等。

为了将重组载体引入细菌中，可以使用常用于细菌转化的方法，如D.A.Morrison的方法(Methods in Enzymology,68,326(1979))，用氯化钙处理受体细胞以增加细胞对DNA的渗透性的方法(Mandel,M.and Higa,A.,J.Mol.Biol.,53,159(1970))，和基于电穿孔的方法。

此外，蛋白质如SAT的活性还可以通过增加编码该蛋白质的基因的拷贝数来增加。基因的拷贝数可以通过使用如上所述的载体将该基因引入细菌中来增加，或者通过将该基因的多个拷贝引入细菌的染色体DNA中来增加。通过同源重组使用在染色体DNA上以多个拷贝数存在的序列作为靶标引入基因的多个拷贝。在转座子末端存在的重复DNA或倒置的重复可以用作染色体DNA上以多个拷贝数存在的序列。或者，如在特开平2-109985号公报中记载的，可以通过将多个拷贝的基因纳入转座子并将其转移而引入染色体DNA中。

生产从L-半胱氨酸作为起始材料生物合成的化合物如γ-谷氨酰半胱氨酸、谷胱甘肽、胱硫醚、高半胱氨酸、甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸的能力，还可以通过提高目标化合物的生物合成途径的酶的活性或者通过减少从目标化合物的生物合成途径分支出的途径的酶或分解目标化合物的酶的活性而赋予或得到提高。

例如，通过提高γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性和/或通过降低谷胱甘肽合成酶活性可以提高生产γ-谷氨酰半胱氨酸的能力。此外，可以通过提高γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性和/或谷胱甘肽合成酶活性来赋予或提高生产谷胱甘肽的能力。此外，通过使用对谷胱甘肽的反馈抑制有抗性的突变型γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶，可以提高生产γ-谷氨酰半胱氨酸或谷胱甘肽的能力。在Li等(Yin Li,Gongyuan Wei,Jian Chen,Appl.Microbiol.Biotechnol.,66：233-242(2004))的综述中详细记载了谷胱甘肽的生产。

生产L-甲硫氨酸的能力可以通过赋予L-苏氨酸营养缺陷性或正亮氨酸抗性而赋予或提高(日本特开2000-139471号)。在大肠杆菌中，L-苏氨酸的生物合成中涉及的酶的基因作为苏氨酸操纵子(thrABC)存在，并且丧失了L-高丝氨酸生物和下述化合物合成能力的L-苏氨酸营养缺陷型菌株可以通过例如缺失thrBC部分而获得。在正亮氨酸抗性菌株中，削弱了S-腺苷甲硫氨酸合成酶活性，并且赋予或提高了生产L-甲硫氨酸的能力。在大肠杆菌中，S-腺苷甲硫氨酸合成酶是由metK基因编码的。生产L-甲硫氨酸的能力还可以通过缺失甲硫氨酸阻抑物或通过提高L-甲硫氨酸生物合成中涉及的酶如高丝氨酸转琥珀酰基酶、胱硫醚γ-合成酶和天冬氨酸激酶-高丝氨酸脱氢酶II的活性而赋予或提高(特开2000-139471)。在大肠杆菌中，甲硫氨酸阻抑物是由metJ基因编码的，高丝氨酸转琥珀酰基酶是由metA基因编码的，胱硫醚γ-合成酶是由metB基因编码的，天冬氨酸激酶-高丝氨酸脱氢酶II是由metL基因编码的。此外，通过使用对L-甲硫氨酸的反馈抑制有抗性的突变型高丝氨酸转琥珀酰基酶，还可以赋予或提高生产L-甲硫氨酸的能力(特开2000-139471号、US20090029424)。由于经由L-半胱氨酸作为中间体生物合成L-甲硫氨酸，生产L-甲硫氨酸的能力还可以通过提高生产L-半胱氨酸的能力得以提高(特开2000-139471号，US20080311632)。因此，对于赋予或提高生产L-甲硫氨酸的能力，赋予或增强生产L-半胱氨酸的能力也是有效的。

L-甲硫氨酸生产菌和用于构建它们的亲本株的具体实例包括如下的大肠杆菌，如AJ11539(NRRL B-12399)、AJ11540(NRRL B-12400)、AJ11541(NRRL B-12401)、AJ11542(NRRL B-12402)(英国专利2075055)，对作为L-甲硫氨酸类似物的正亮氨酸有抗性的218菌株(VKPM B-8125，俄罗斯专利2209248)，和73菌株(VKPM B-8126，俄罗斯专利2215782)。

此外，作为L-甲硫氨酸生产菌或用于构建该菌的亲本株，也可以使用源自大肠杆菌W3110的AJ13425(FERM P-16808，特开2000-139471号)。AJ13425是一种L-苏氨酸营养缺陷型菌株，其中缺失了甲硫氨酸阻抑物，削弱了胞内S-腺苷甲硫氨酸合成酶活性，且提高了胞内高丝氨酸转琥珀酰基酶活性、胱硫醚γ-合成酶活性和天冬氨酸激酶-高丝氨酸脱氢酶II活性。AJ13425已于1998年5月14日保藏于通产省工业技术院生命工学工业技术研究所(现名：产业技术综合研究所专利生物保藏中心，地址：邮政编码305-8566茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6，日本)，并给予保藏号FERM P-16808。

由于胱硫醚和高半胱氨酸是L-甲硫氨酸生物合成途径的中间体，部分使用上述用于提高生产L-甲硫氨酸能力的方法用于提高生产这些物质的能力是有效的。作为具体的提高生产胱硫醚能力的方法，已知有使用甲硫氨酸-营养缺陷型菌株(日本特愿2003-010654)的方法和将半胱氨酸(或用于其生物合成的原料)和/或高丝氨酸(或用于其生物合成的原料)添加至发酵培养物的方法(日本特开2005-168422)。由于通过使用胱硫醚作为前体生产了高半胱氨酸，因此上述用于提高生产胱硫醚能力的方法对于提高生产高半胱氨酸的能力也是有效的。

由于L-甲硫氨酸是S-腺苷甲硫氨酸的前体，对于提高生产L-腺苷甲硫氨酸的能力，部分使用上述用于提高生产L-甲硫氨酸的能力的方法是有效的。例如，生产L-腺苷甲硫氨酸的能力可以通过提高甲硫氨酸腺苷基转移酶(欧洲专利公开0647712和1457569)或者通过提高分泌因子MdfA(美国专利7,410,789)而赋予或提高。

本发明的细菌可以通过修饰这种如上所述的属于肠杆菌科并具有L-半胱氨酸生产能力的细菌从而降低yciW基因编码的蛋白质(下文也称为“YciW”)的活性而得到。或者，在修饰细菌以降低YciW蛋白的活性后，可以赋予L-半胱氨酸生产能力。

术语yciW基因与ECK1282和JW5200同义。

表述“降低yciW基因编码的蛋白质的活性”表示yciW基因编码的YciW蛋白的活性与未经修饰的菌株如野生型菌株或亲本株的活性相比是降低的，并且包括活性完全丧失的情形。

这种降低YciW蛋白的活性的修饰通过例如降低yciW基因的表达而实现。具体地，例如，蛋白质的胞内活性可以通过缺失染色体上部分或全部的yciW基因的编码区而降低。YciW蛋白的活性还可以通过经由修饰表达调控序列如yciW基因的启动子和Shine-Dalgarno(SD)序列等来降低yciW基因的表达而降低。此外，基因的表达量还可以通过修饰除表达调控序列之外的非翻译区来降低。此外，可以缺失包括在染色体上所述基因两侧的序列的整个基因。此外，这还可以通过在染色体上yciW基因的编码区中引入氨基酸取代(错义突变)、终止密码子(无义突变)或添加或缺失一个或两个核苷酸的移码突变来实现(Journal of Biological Chemistry,272：8611-8617(1997)；Proceedings of the National Academy of Sciences,USA,955511-5515(1998)；Journal ofBiological Chemistry,266,20833-20839(1991))。此外，基因的表达还可以通过操作涉及表达调控的因子来减少(涉及转录或翻译调控的低分子(诱导剂、抑制剂等)、蛋白质(转录因子等)、核酸(sRNA等)，等)。

此外，该修饰可以为通过基于X射线或紫外照射或使用如N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍等诱变剂的常规诱变所引起的修饰，只要其为降低YciW蛋白活性的修饰即可。

表达调控序列的修饰是对优选一个或多个核苷酸、更优选两个或更多个核苷酸、特别优选三个或更多个核苷酸进行的。当编码区域缺失时，待缺失的区域可以为N端区域、内部区域或C端区域中的任意区域，或者甚至可以为整个编码区，只要降低或缺失了YciW蛋白的功能即可。较长区域的缺失通常可以更加确定地失活基因。此外，优选待缺失区域的上游或下游的读码框不相同。

此外，降低YciW蛋白活性的修饰还可以通过将另一序列插入yciW基因的编码区来实现。当将另一序列插入yciW基因的编码区中时，该序列可以插入该基因的任何区域，并且插入较长的序列可以更确定地失活该基因。优选的是插入位点的上游或下游的读码框不相同。对另一序列没有特别限定，只要选择其插入会降低或缺失YciW蛋白的功能的序列即可，并且实例包括携带抗生素抗性基因的转座子或用于生产L-半胱氨酸的基因，等等。

染色体上的yciW基因可以如上文所述进行修饰，通过例如制备缺失型基因，在该缺失型基因中缺失了基因的部分序列，使得该缺失型基因不生产正常发挥功能的YciW蛋白，并且用含有该缺失型基因的DNA转化细菌以引起该缺失型基因和染色体上的基因之间的同源重组，并由此用该缺失型基因取代染色体上的基因。由缺失型基因编码的YciW蛋白即使得到了生产也具有不同于野生型蛋白质的构型，并由此降低或缺失了该功能。这种基于使用同源重组的基因取代的基因破坏已经确立，并存在称为“Red-driven整合”的方法(Datsenko,K.A,and Wanner,B.L.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97：6640-6645(2000))、使用线性DNA的方法如使用Red driven整合并结合衍生自λ噬菌体的切除系统的方法(Cho,E.H.,Gumport,R.I.,Gardner,J.F.,J.Bacteriol.,184：5200-5203(2002))(参见WO2005/010175)、使用含温度敏感复制起点的质粒的方法、使用能够接合转移的质粒的方法、使用在宿主中不具有复制起点的自杀载体的方法(美国专利6,303,383，日本特开平05-007491号)，等等。

yciW基因的转录量的降低可以通过比较该基因转录的mRNA的量与在野生型菌株或未经修饰的菌株中观察到的量得到确认。评估mRNA量的方法的实例包括Northern杂交、RT-PCR(Molecular Cloning,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,USA,2001)，等等。

YciW蛋白量的降低可以通过使用抗体的Western印迹得到确认(Molecular cloning,Cold spring Harbor Laboratory Press,Cold spring Harbor,USA,2001)。

大肠杆菌K12菌株的yciW基因对应于在NCBI数据库中作为GenBank登录号NC_000913(版本NC_000913.2 GI：49175990)登记的基因组序列中第1347004至1348131位序列的互补序列。同样地，YciW蛋白作为GenBank登录号NP_415803(版本NP_415803.2 GI：90111242，基因座标签(locus_tag)="b1287")登记。含yciW基因的核苷酸序列及其上游区和下游区的300bp和由该基因编码的氨基酸序列分别显示为SEQ ID NOS：1和2。

由于yciW基因的核苷酸序列会由于细菌所属的属、种或菌株而不同，所以待修饰的yciW基因可以为SEQ ID NO：1的核苷酸序列中第301至1428的核苷酸序列的变体。yciW基因的变体可以通过使用BLAST(http：//blast.genome.jp/)等参照SEQ ID NO：1的核苷酸序列进行检索。此外，yciW基因的变体包括该基因的同源物，例如，可以使用例如微生物如属于肠杆菌科的细菌和棒状杆菌型细菌的染色体作为模板和基于SEQ ID NO：1的核苷酸序列制备的合成寡核苷酸通过PCR扩增的基因。

除了大肠杆菌外的细菌的yciW基因同源物的实例包括下列细菌的yciW基因。在表1中，同一性(%)表示由BLAST确定的大肠杆菌K12菌株的YciW蛋白和各细菌同源物之间的同一性。登录号为NCBI数据库的登录号。

表1

yciW基因还可以为编码具有如上所述的YciW蛋白氨基酸序列但是包括在一个或数个位置处的一个或数个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加等的蛋白质的基因，只要其编码在细菌中的活性减少会改善L-半胱氨酸生产能力的蛋白质即可。尽管由术语“一个或数个”表示的数可能依赖于氨基酸残基在蛋白质三维结构中的位置或者氨基酸残基的类型而有差异，但是具体地，该数优选为1至20，更优选1至10，仍更优选1至5。上述一个或数个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加为保持该蛋白质正常功能的保守突变。保守突变通常为保守取代。保守取代是在Phe、Trp和Tyr之间互相发生取代的突变，如果取代位点为芳族氨基酸的话；在Leu、Ile和Val之间互相发生取代的突变，如果取代位点为疏水性氨基酸的话；在Gln和Asn之间互相发生取代的突变，如果取代位点为极性氨基酸的话；在Lys、Arg和His之间互相发生取代的突变，如果取代位点为碱性氨基酸的话；在Asp和Glu之间互相发生取代的突变，如果取代位点为酸性氨基酸的话；以及在Ser和Thr之间互相发生取代的突变，如果取代位点为具有羟基的氨基酸的话。保守取代的具体实例包括：Ser或Thr取代Ala；Gln、His或Lys取代Arg；Glu、Gln、Lys、His或Asp取代Asn；Asn、Glu或Gln取代Asp；Ser或Ala取代Cys；Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg取代Gln；Gly、Asn、Gln、Lys或Asp取代Glu；Pro取代Gly；Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr取代His；Leu、Met、Val或Phe取代Ile；Ile、Met、Val或Phe取代Leu；Asn、Glu、Gln、His或Arg取代Lys；Ile、Leu、Val或Phe取代Met；Trp、Tyr、Met、Ile或Leu取代Phe；Thr或Ala取代Ser；Ser或Ala取代Thr；Phe或Tyr取代Trp；His、Phe或Trp取代Tyr；以及Met、Ile或Leu取代Val。上述氨基酸取代、缺失、插入、添加、倒置等可以为由于所述基因自其衍生的细菌的个体差异、种差异等引起的天然存在的突变(突变体或变体)所致的结果。

此外，具有如上所述的此种保守突变的基因可以为编码与所编码蛋白的全部氨基酸序列具有80%以上、优选90%以上、更优选95%以上、仍更优选97%以上、特别优选99%以上同源性并且功能与野生型YciW蛋白等同的蛋白质的基因。在本说明书中，“同源性”可以表示“同一性”。

此外，yciW基因可以为能够与可以从已知基因序列如上述基因序列或其互补序列制备的探针在严格条件下杂交并且编码具有等同于YciW蛋白的功能的蛋白质的DNA。所述“严格条件”是指形成所谓的特异性杂合体并且不形成非特异性杂合体的条件。严格条件的实例包括如下的条件，在该条件下，高度同源的DNA彼此杂交，例如，不低于80%同源的、优选不低于90%同源的、更优选不低于95%同源的、仍更优选不低于97%同源的、特别优选不低于99%同源的DNA彼此杂交，并且同源性比上述低的DNA彼此不杂交，或者典型Southern杂交的洗涤条件，即，在对应于1xSSC,0.1%SDS在60°C、优选0.1xSSC,0.1%SDS在60°C、更优选0.1x SSC,0.1%SDS在68°C的盐浓度和温度下洗涤1次、优选2或3次的条件。

探针可以为与基因互补的序列的一部分。这种探针可以使用基于已知的基因序列制备的寡核苷酸作为引物和含有该核苷酸序列的DNA片段作为模板通过PCR制备。例如，当使用长度约300bp的DNA片段作为探针时，杂交的洗涤条件可以为例如50°C,2xSSC和0.1%SDS。

关于基因和蛋白质的变体的上述解释也类似地适用于酶如丝氨酸乙酰转移酶和3-磷酸甘油酸脱氢酶和YdeD蛋白，以及编码它们的基因。

<2>本发明的生产L-半胱氨酸、L-胱氨酸、所述氨基酸的衍生物、或上述物质的混合物的方法

通过在培养基中培养如上所述获得的本发明细菌并从培养基中收集L-半胱氨酸、L-胱氨酸、所述氨基酸的衍生物、或上述物质的混合物，可以生产这些化合物。L-半胱氨酸衍生物的实例包括如上所述的S-磺基半胱氨酸、噻唑烷衍生物、对应于噻唑烷衍生物的硫代半缩醛等。从作为起始原料的L-半胱氨酸生物合成的γ-谷氨酰半胱氨酸、谷胱甘肽、胱硫醚、高半胱氨酸、甲硫氨酸、S-腺苷甲硫氨酸等也可以类似的方式生产。

作为待使用的培养基，可以提到含有碳源、氮源、硫源、无机离子和视需要的其他有机成分的培养基。

作为碳源，可以使用糖类如葡萄糖、果糖、蔗糖、糖蜜和淀粉水解产物，和有机酸如富马酸、柠檬酸和琥珀酸。

作为氮源，可以使用无机铵盐如硫酸铵、氯化铵和磷酸铵，有机氮如大豆水解产物、氨气、氨水，等。

作为硫源，可以提及无机硫化合物如硫酸盐、亚硫酸盐、硫化物、次硫酸盐和硫代硫酸盐。

作为有机痕量营养物，有利的是以合适量添加所需物质如维生素B1、酵母提取物等。除此之外，可以根据以少量添加磷酸钾、硫酸镁、铁离子、锰离子等。

所述培养优选在厌氧条件下进行30至90小时。培养期间培养温度优选控制为25°C至37°C，且pH值优选控制为5至8。为了调节pH值，可以使用无机或有机的酸性或碱性物质、氨气等。从培养液中收集L-半胱氨酸可以通过常规离子交换树脂方法、沉淀以及其他已知方法的组合来实现。

如上所述得到的L-半胱氨酸可以用于生产L-半胱氨酸衍生物。L-半胱氨酸衍生物包括半胱氨酸甲酯、半胱氨酸乙酯、羧甲司坦、磺基半胱氨酸、乙酰半胱氨酸，等。

此外，当L-半胱氨酸的噻唑烷衍生物在培养基中累积时，L-半胱氨酸可以通过从培养基中收集噻唑烷衍生物并破坏噻唑烷衍生物与L-半胱氨酸之间的反应平衡以过量生产L-半胱氨酸来生产。

此外，当S-磺基半胱氨酸在培养基中累积时，其可以通过使用还原剂如二硫苏糖醇进行还原而转化成L-半胱氨酸。

实施例

下面将参考实施例更具体地解释本发明。

(1)yciW基因缺陷型菌株的构建

yciW基因的缺失通过称为“Red-driven整合”的方法进行，该方法首先由Datsenko和Wanner(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,vol.97,No.12,pp.6640-6645)开发。根据“Red-driven整合”方法，通过使用以分别将一部分靶向基因设计在5′侧和将一部分抗生素抗性基因设计在3′侧的合成寡核苷酸作为引物得到的PCR产物，能够在一步中构建基因-破坏的菌株。使用所述“Red-driven整合”和衍生自λ噬菌体的切除系统缺失大肠杆菌的基因的方法详细地记载于日本2005-058227(US2006154344)、WO2007/119880A1等中。yciW基因缺陷型菌株通过与这些方法相同的方法得到。

通过PCR得到包含yciW基因两端的同源序列和在它们之间的抗生素抗性基因(卡那霉素抗性基因(Km^r))的DNA片段。具体的实验方法和材料与日本特开2005-058227(US 2006154344)中的记载相同，除了使用DyciWec-FW(SEQ ID NO ： 3,ATGGAACAACGCCACATCACCGGCAAAAGCCACTGGTATCATGAAACGCATGAAGCCTGCTTTTTTATACTAAGTTGGCA)和DyciWec-RV (SEQID NO ： 4,CCCATTGGTTAATTTCATTTTCGCCCTTGCGCATAAGGGTGCTGATTTTTCGCTCAAGTTAGTATAAAAAAGCTGAACGA)作为引物，和含有衍生自pMW118-(λattL-Km^r-λattR)的λattL-Km^r-λattR序列的DNA片段作为模板.

通过该方法，从大肠杆菌MG1655菌株(ATCC 47076)获得了yciW基因缺陷型菌株，MG1655ΔyciW::Kmr。

此外，并入yciW基因破坏菌株的Km^r基因可以通过使用衍生自λ噬菌体的切除系统除去。

(2)生产L-半胱氨酸的细菌的构建

将pACYC-DES，一种整合了编码L-半胱氨酸反馈抑制降低的突变体丝氨酸乙酰转移酶的突变体cysE(US20050112731(A1))、编码L-半胱氨酸分泌因子的ydeD基因(US 5,972,663)和编码L-丝氨酸反馈抑制降低的3-磷酸甘油酸脱氢酶的突变体serA基因(US 6,180,373)的单质粒，引入大肠杆菌MG1655菌株和MG1655DyciW::Kmr菌株中。在上述突变体丝氨酸乙酰转移酶中，将第167位的苏氨酸残基用丙氨酸残基取代。此外，在上述的3-磷酸甘油酸脱氢酶中，将第410位的酪氨酸残基缺失。pACYC-DES的构建记载于日本特开2005-137369(UA 20050124049(A1)、EP 1528108(A1))中。

(3)L-半胱氨酸生产培养基

为了研究yciW基因的缺失对通过发酵生产L-半胱氨酸和L-半胱氨酸相关化合物的影响，将上述生产L-半胱氨酸的大肠杆菌细菌MG1655/pACYC-DES和MG1655DyciW::Kmr/pACYC-DES(yciW缺陷型)培养用于通过发酵生产，并比较了L-半胱氨酸和L-半胱氨酸相关化合物的生产量。对于所述培养，使用具有下述组成的半胱氨酸生产培养基。作为用于L-半胱氨酸生产的硫源，使用硫酸盐(硫酸铵)和硫代硫酸盐(硫代硫酸钠)。仅使用硫酸盐的培养在不加入下列培养基组成中提到的组分6(硫代硫酸钠)的条件下进行。此外，使用硫代硫酸钠的培养通过使用所有下列组分进行。

[L-半胱氨酸生产培养基](各组分的浓度为终浓度)

组分1：

组分2：

组分3：

胰蛋白胨 0.6g/L

酵母提取物 0.3g/L

NaCl 0.6g/L

组分4：

碳酸钙 20g/L

组分5：

L-组氨酸盐酸盐一水合物 135mg/L

组分6：

硫代硫酸钠 4g/L

组分7：

吡哆素盐酸盐2mg/L

组分8：

葡萄糖 40g/L

对于这些组分，制备了10倍浓度(组分1)、1000倍浓度(组分2)、100/6倍浓度(组分3)、100倍浓度(组分5)、350/4倍浓度(组分6)、1000倍浓度(组分7)和10倍浓度(组分8)的储备溶液，在使用时将它们混合，使用灭菌水得到所限定的体积以实现终浓度。灭菌通过通过在110°C高压灭菌30分钟(组分1、2、3、5和8)、在180°C干热灭菌5小时以上(组分4)或过滤灭菌(组分6和7)进行。

L-半胱氨酸的生产培养如下进行：将各生产菌株涂布在LB琼脂培养基上以在37°C预培养过夜，然后对板上的相应于约7cm的细胞使用10-μl大小的接种环(NUNC Blue Loop)刮擦三次(三环)，并接种至装在大试管(内径：23mm，长：20cm)中的2ml L-半胱氨酸生产培养基中，从而使得两种菌株的细胞量在培养开始时基本相同。在32°C振荡条件下进行培养，并在25小时后终止。培养基中生产的L-半胱氨酸(包括L-半胱氨酸相关化合物)通过Gaitonde,M.K.(Biochem.J.,104(2)：627-33,Aug.1967)所记载的方法定量。对每个菌株一式四份进行实验，并且将生产的L-半胱氨酸量(平均)和标准偏差以及对于消耗的葡萄糖的L-半胱氨酸产率示于表2中。在表2中，野生型菌株指MG1655/pACYC-DES菌株，而yciW缺失菌株指MG1655DyciW::Kmr/pACYC-DES菌株。揭示了yciW基因的缺失对于两种硫源而言均有增加L-半胱氨酸积累的作用。

表2

Claims

1.一种属于大肠杆菌(Escherichia coli)的细菌，其具有L-半胱氨酸生产能力，并且经过修饰从而降低了yciW基因编码的蛋白质的活性，其中所述蛋白质的活性是通过缺失yciW基因而降低的。

2.根据权利要求1所述的细菌，其中所述蛋白质为由SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列组成的蛋白质。

3.根据权利要求1所述的细菌，其中所述yciW基因为由核苷酸序列SEQ ID NO：1中第301至1428位的核苷酸序列组成的DNA。

4.根据权利要求1所述的细菌，其还具有下述特性中的至少一种：

i)经过修饰从而提高了丝氨酸乙酰转移酶活性，

ii)经过修饰从而提高了ydeD基因的表达，

iii)经过修饰从而提高了3-磷酸甘油酸脱氢酶活性。

5.一种L-半胱氨酸、L-胱氨酸、所述氨基酸的衍生物、或上述物质的混合物的生产方法，该方法包括在培养基中培养根据权利要求1至4中任一项所述的细菌，并从所述培养基中收集L-半胱氨酸、L-胱氨酸、所述氨基酸的衍生物或上述物质的混合物，其中所述衍生物是S-磺基半胱氨酸或硫代半缩醛或前述物质的混合物。