JPWO2011065469A1 - L−システイン生産菌及びl−システインの製造法 - Google Patents
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Abstract
Description
すなわち本発明は以下のとおりである。
(1)L−システイン生産能を有し、かつ、yciW遺伝子によりコードされるタンパク質の活性が低下するように改変された腸内細菌科に属する細菌。
(2)前記yciW遺伝子の発現量を低下させること、又は同遺伝子を破壊することにより、前記タンパク質の活性が低下した、前記細菌。
(3)前記タンパク質が、下記(A)または(B)に記載のタンパク質である前記細菌。
(A)配列番号2に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
(B)配列番号2に示すアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、細菌内の活性を低下させたときにL−システイン生産能が向上するタンパク質。
(4)前記yciW遺伝子質が、下記(a)または(b)に記載のDNAである、前記細菌。
(a)配列番号1の301〜1428位の塩基配列を含むDNA、または
(b)配列番号1の301〜1428位の塩基配列の相補配列または同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、細菌内の活性を低下させたときにL−システイン生産能が向上するタンパク質をコードするDNA。
(5)さらに、下記の性質の少なくともいずれかを有する前記細菌。
i)セリンアセチルトランスフェラーゼ活性が上昇するように改変されている。
ii)ydeD遺伝子の発現が上昇するように改変されている。
iii)3−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ活性が上昇するように改変されている。
(6)前記細菌がエシェリヒア属細菌である、前記細菌。
(7)前記細菌がエシェリヒア・コリである、前記細菌。
(8)前記細菌を培地中で培養し、該培地からL−システイン、L−シスチン、もしくはそれらの誘導体、又はこれらの混合物を採取することを特徴とする、L−システイン、L−シスチン、もしくはそれらの誘導体、又はこれらの混合物の製造法。
(9)前記L−システインの誘導体がチアゾリジン誘導体である、前記方法。
本発明の細菌は、L−システイン生産能を有し、かつ、yciW遺伝子によりコードされるタンパク質の活性が低下するように改変された腸内細菌科に属する細菌である。ここで、L−システイン生産能とは、本発明の細菌を培地中で培養したときに、培地中または菌体内にL−システインを生成し、培地中または菌体から回収できる程度に蓄積する能力をいう。また、L−システイン生産能を有する細菌とは、野生株または親株よりも多い量のL−システインを生産し培地に蓄積することができる細菌を意味し、好ましくは、0.05g/L以上、より好ましくは0.1g/L以上、特に好ましくは0.2g/L以上の量のL−システインを生産し培地に蓄積することができる細菌を意味する。
エンテロバクター属の代表的な株として、エンテロバクター・アグロメランスATCC12287株が挙げられる。
パントエア・アナナティスとして具体的には、パントエア・アナナティスAJ13355株、SC17株が挙げられる。SC17株は、静岡県磐田市の土壌から、低pHでL−グルタミン酸及び炭素源を含む培地で増殖できる株として分離された株AJ13355(FERM BP-6614)から、粘液質低生産変異株として選択された株である(米国特許第6,596,517号)。
パントエア・アナナティスAJ13355株は、平成10年2月19日に、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所(現名称、産業技術総合研究所特許生物寄託センター、住所 郵便番号305-8566 茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6)に、受託番号FERM P-16644として寄託され、平成11年1月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6614が付与されている。尚、同株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランス(Enterobacter agglomerans)と同定され、エンテロバクター・アグロメランスAJ13355として寄託されたが、近年16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティス(Pantoea ananatis)に再分類されている。
パントエア・アナナティスSC17株は、平成21年2月4日に、産業技術総合研究所特許生物寄託センター(住所 郵便番号305-8566 茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6)に国際寄託され、受託番号FERM BP-11091が付与されている。
i)セリンアセチルトランスフェラーゼ活性が上昇するように改変されている。
ii)ydeD遺伝子の発現が上昇するように改変されている。
iii)3−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ活性が上昇するように改変されている。
細菌に変異型SATをコードする遺伝子を導入すれば、L−システイン生産能が付与される。
また、L−メチオニン生産菌やそれを構築するために用いられる親株としては、E. coli W3110由来のAJ13425 (FERM P-16808)(特開2000-139471号)を用いることができる。AJ13425は、メチオニンリプレッサーを欠損し、細胞内のS−アデノシルメチオニンシンセターゼ活性が弱化し、細胞内のホモセリントランスサクシニラーゼ活性、シスタチオニンγ−シンターゼ活性、及びアスパルトキナーゼ−ホモセリンデヒドロゲナーゼII活性が増強されたL−スレオニン要求株である。AJ13425は、平成10年5月14日より、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所(現名称、産業技術総合研究所特許生物寄託センター、住所 郵便番号305-8566 茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6)に寄託され、受託番号FERM P-16808が付与されている。
yciW遺伝子は、ECK1282、JW5200と同義である。
エシェリヒア・コリ以外の細菌のyciW遺伝子ホモログの例として、以下の細菌のyciW遺伝子が挙げられる。表1中、同一性(%)は、エシェリヒア・コリK12株のYciWタンパク質と、各細菌のホモログとの、BLASTによる同一性を示す。アクセション番号は、NCBIデータベースのアクセション番号を示す。
上記のようにして得られる本発明の細菌を培地中で培養し、該培地からL−システイン、L−シスチン、もしくはそれらの誘導体、又はこれらの混合物を採取することにより、これらの化合物を製造することができる。L−システインの誘導体としては、前記したようなS−スルホシステイン、チアゾリジン誘導体、同チアゾリジン誘導体に相当するヘミチオケタール等が挙げられる。また、L−システインを出発物質として生合成されるγ−グルタミルシステイン、グルタチオン、シスタチオニン、ホモシステイン、メチオニン、S−アデノシルメチオニン等も同様に製造することができる。
また、培地にS−スルホシステインが蓄積した場合、例えばジチオスライトール等の還元剤を用いて還元することによってL−システインに変換することができる。
yciW遺伝子の欠失は、DatsenkoとWannerによって最初に開発された「Red-driven integration」と呼ばれる方法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, No. 12, p6640-6645)によって行った。「Red-driven integration」方法によれば、目的とする遺伝子の一部を合成オリゴヌクレオチドの5'側に、抗生物質耐性遺伝子の一部を3'側に、それぞれデザインした合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて得られたPCR産物を用いて、一段階で遺伝子破壊株を構築することができる。この「Red-driven integration」とラムダファージ由来の切り出しシステムによってE. coliの遺伝子を欠損させる方法が特開2005-058227A(US2006154344)やWO2007/119880A1等に詳細に記述されている。yciW遺伝子の欠損株の取得も、これらの方法と同じ方法で行った。
この手法により、E. coli MG1655株 (ATCC 47076)からyciW遺伝子欠損株であるMG1655ΔyciW::Kmrを取得した。
L−システインによるフィードバック阻害が低減された変異型セリンアセチルトランスフェラーゼをコードする変異型cysE(US20050112731(A1))、L−システイン排出因子をコードするydeD遺伝子(US5972663A)、及びL−セリンによるフィードバック阻害が低減された3−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異型serA遺伝子(US6180373)が1つのプラスミドに載ったpACYC-DESを、E. coli MG1655及びMG1655DyciW::Kmrに導入した。前記変異型セリンアセチルトランスフェラーゼは、167位のスレオニン残基がアラニン残基に置換されている。また、前記3−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼは、410位のチロシン残基が欠失されている。pACYC-DESの構築は、特開2005-137369(US20050124049(A1)、EP1528108(A1))に記載されている。
yciW遺伝子の欠損がL−システイン及びL−システイン関連化合物の発酵生産に及ぼす効果を調べるため、先述のE. coliL−システイン生産菌MG1655/pACYC-DES及びMG1655DyciW::Kmr/pACYC-DES(yciW欠損)の発酵生産培養を行い、L−システイン及びL−システイン関連化合物の生産量を比較した。培養には下記組成のL−システイン生産培地を使用した。なお、L−システイン生産のための硫黄源として硫酸塩(硫酸アンモニウム)及びチオ硫酸塩(チオ硫酸ナトリウム)を用いた。硫酸塩のみを使用した培養では下記培地組成の中の成分6(チオ硫酸ナトリウム)を添加せず行った。また、チオ硫酸塩を使用した培養では下記培地成分の通りに行った。
成分1:
(NH4)2SO4 15g/L
KH2PO4 1.5g/L
MgSO4・7H2O 1g/L
チアミン塩酸塩 0.1mg/L
成分2:
FeSO4・7H2O 1.7mg/L
Na2MoO4・2H2O 0.15mg/L
CoCl2・6H2O 0.7mg/L
MnCl・4H2O 1.6mg/L
ZnSO4・7H2O 0.3mg/L
CuSO4・5H2O 0.25mg/L
成分3:
トリプトン 0.6g/L
イーストエクストラクト 0.3g/L
NaCl 0.6g/L
成分4:
炭酸カルシウム 20g/L
成分5:
L−ヒスチジン塩酸塩一水和物 135mg/L
成分6:
チオ硫酸ナトリウム 4g/L
成分7:
ピリドキシン塩酸塩 2mg/L
成分8:
グルコース 40g/L
Claims (9)
- L−システイン生産能を有し、かつ、yciW遺伝子によりコードされるタンパク質の活性が低下するように改変された腸内細菌科に属する細菌。
- 前記yciW遺伝子の発現量を低下させること、又は同遺伝子を破壊することにより、前記タンパク質の活性が低下した、請求項1に記載の細菌。
- 前記タンパク質が、下記(A)または(B)に記載のタンパク質である請求項1又は2に記載の細菌。
(A)配列番号2に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
(B)配列番号2に示すアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、細菌内の活性を低下させたときにL−システイン生産能が向上するタンパク質。 - 前記yciW遺伝子が、下記(a)または(b)に記載のDNAである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の細菌。
(a)配列番号1の301〜1428位の塩基配列を含むDNA、または
(b)配列番号1の301〜1428位の塩基配列の相補配列または同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、細菌内の活性を低下させたときにL−システイン生産能が向上するタンパク質をコードするDNA。 - さらに、下記の性質の少なくともいずれかを有する請求項1〜4のいずれか一項に記載の細菌。
i)セリンアセチルトランスフェラーゼ活性が上昇するように改変されている。
ii)ydeD遺伝子の発現が上昇するように改変されている。
iii)3−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ活性が上昇するように改変されている。 - 前記細菌がエシェリヒア属細菌である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の細菌。
- 前記細菌がエシェリヒア・コリである、請求項6に記載の細菌。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載の細菌を培地中で培養し、該培地からL−システイン、L−シスチン、もしくはそれらの誘導体、又はこれらの混合物を採取することを特徴とする、L−システイン、L−シスチン、もしくはそれらの誘導体、又はこれらの混合物の製造法。
- 前記L−システインの誘導体がチアゾリジン誘導体である、請求項8に記載の方法。
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