JP5463528B2 - Ｌ−システイン生産菌及びｌ−システインの製造法 - Google Patents

Description

本発明は、Ｌ−システイン又はその関連物質の製造法に関し、詳しくはＬ−システイン又はその関連物質の製造に好適な細菌、及びそれを用いたＬ−システイン又はその関連物質の製造法に関する。Ｌ−システイン及びその関連物質は、医薬品、化粧品及び食品分野で利用されている。

従来、Ｌ−システインは、毛髪、角、羽毛等のケラチン含有物質から抽出することにより、あるいはＤＬ−２−アミノチアゾリン−４−カルボン酸を前駆体とする微生物酵素変換により得られている。また、新規な酵素を用いた固定化酵素法によるＬ−システインの大量生産も計画されている。さらに、微生物を用いた発酵法によるＬ−システインの生産も試みられている。

Ｌ−システイン生産能を有する微生物としては、例えば、細胞内のセリンアセチルトランスフェラーゼ活性が上昇したコリネ型細菌（特許文献１）が知られている。また、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減された変異型セリンアセチルトランスフェラーゼを保持させることにより、Ｌ−システイン生産能を高める技術が知られている（特許文献２〜４）。

また、Ｌ−システイン分解系を抑制することによってＬ−システイン生産能が高められた微生物としては、シスタチオニン−β−リアーゼ（特許文献２）、トリプトファナーゼ（特許文献５）、Ｏ−アセチルセリン スルフヒドリラーゼＢ（特許文献６）の活性を低下又は欠失させたコリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌が知られている。

さらに、ＹｄｅＤタンパク質をコードするｙｄｅＤ遺伝子は、システイン経路の代謝産物の排出に関与していることが知られている（非特許文献１）。また、細胞に毒性の物質を排出するのに適したタンパク質をコードする遺伝子であるｍａｒ−座、ｅｍｒ−座、ａｃｒ−座、ｃｍｒ−座、ｍｅｘ−遺伝子、ｂｍｒ−遺伝子、ｑａｃＡ−遺伝子（特許文献７）、又はｅｍｒＡＢ、ｅｍｒＫＹ、ｙｏｊＩＨ、ａｃｒＥＦ、ｂｃｒもしくはｃｕｓＡ遺伝子（特許文献８）の発現を上昇させることによりＬ−システイン生産能を高める技術が知られている。

また、Ｌ−システイン生産菌として、ｃｙｓＢ遺伝子によりコードされるシステインレギュロンの正の転写制御因子の活性が上昇したエシェリヒア・コリ （特許文献９）が知られている。

dsbA（非特許文献２）は、下記に示すように、タンパク質のジスルフィド(S-S)結合の形成に関与することが知られているが、Ｌ−システイン生産との関連は知られていない。

一般に、ジスルフィド（S-S）結合をもつタンパク質は、細胞膜表層または細胞外に分泌されるものに多くみられる。細胞膜に包まれた細胞内部は物理的にも化学的にも比較的マイルドであるのに対し、細胞外はより過酷な環境であるため、タンパク質の構造をより頑強にする必要がある。その一つの戦略として、S-S結合がタンパク質に導入されている。

Anfinsenらは、S-S結合の形成を伴う蛋白質の酸化的フォールディングは、適度な酸化条件下で自発的に進行することを示した（非特許文献３）。しかしながら細胞の中では、
これがより迅速かつ正確に進行するよう、S-S結合形成に関わる巧妙なシステムが存在することが明らかとなっている（非特許文献４）。例えば、大腸菌のペリプラズムでは、Dsb (Disulfide bond: DsbA, DsbB, DsbC: 非特許文献２, DsbD: 非特許文献５, DsbG: 非特許文献６) 因子という一連のタンパク質群がジスルフィド結合を作り出し、多くの蛋白質に導入している。ペリプラズムでDsbA（Disulfide oxidoreductase）が、基質タンパク質（AmpC, DsbB, LivK, OstA, RcsF: 非特許文献７）を酸化し、還元型となったDsbAのシステインペアは内膜蛋白質DsbBにより再酸化される。DsbBが受け取った電子は呼吸鎖成分であるユビキノン (UQ) に受け渡され、最終的にはチトクロム酸化酵素を介して酸素が電子受容体となることが分かっている（非特許文献８）。

DsbAは、S-S結合導入酵素としては優れているが、導入すべきシステインペアを選択する能力は十分ではない。そこで大腸菌のペリプラズムには、誤ったS-S結合を組みかえる酵素DsbC（Disulfide isomerase）も存在することが分かっている。DsbCが異性化酵素として機能するためには、酸化酵素であるDsbAとは逆に、その活性部位は還元型に保たれていなければならない。その還元力の源は、細胞質に存在するチオレドキシンシステムに由来しており、チオレドキシンからの還元力は内膜タンパク質DsbDを介してDsbCへ受け渡されると考えられている（非特許文献９）。また、大腸菌には、より基質特異性の狭いDsbGというタンパク質も存在し、ジスルフィドオキシドレダクターゼ（Disulfide oxidoreductase）とジスルフィドイソメラーゼ（Disulfide isomerase）の両方の活性を持つとされている（非特許文献６）。

上記Dsbファミリーの応用に関しては、タンパク質のS-S結合を正しく形成させる効果を期待して以下のような知見がある。真核生物由来のタンパク質の多くはジスルフィド結合を有しており、強い還元条件下にある大腸菌の細胞質内で発現させたとき、本来の立体構造をとることは通常期待できない。したがって、このような真核生物由来のタンパク質の生産には、ジスルフィド結合の形成に好ましい酸化的環境にあるペリプラズムへの分泌発現が有効であると考えられている。しかしながら、異種タンパク質を大腸菌ペリプラズムへ分泌発現させる試みは多数報告されているが、いかなる異種タンパク質でも活性を有する形で発現させることができるわけではない。これは、ジスルフィド結合の数が多いタンパク質において、特に問題になっている。一方、大腸菌においては、ジスルフィド結合の形成に関与するDsbファミリータンパク質であるDsbA、DsbB、DsbCおよびDsbDの役割が、生化学的試験ならびにそれぞれの欠損株を用いた相補性試験により推定されている(非特許文献１０、 非特許文献１１、非特許文献１２)。そこで、目的タンパク質のペリプラズムへの分泌発現の改善を目指し、DsbAあるいはDsbCを目的タンパク質とともに過剰発現させる試みがこれまでにいくつかなされている（特許文献１０）。また、生理活性を有さないタンパク質の再賦活化剤としてDsbAが働くことも既に知られている（非特許文献１３, 特許文献１１）。しかしながら、これまでの報告では専らタンパク質の酸化について述べられているのみであり、アミノ酸のような低分子の酸化にDsb因子が関与する報告例は今までにない。したがって、Dsb因子がシステインのような低分子量のものを酸化してシスチンを形成するかどうかは全く不明であった。

特開２００２−２３３３８４ 特開平１１−１５５５７１号 米国特許出願公開第２００５０１１２７３１号 米国特許第６２１８１６８号 特開２００３−１６９６６８ 特開２００５−２４５３１１ 米国特許第５９７２６６３号 特開２００５−２８７３３３ 国際公開パンフレット第０１／２７３０７号 特開２０００−８３６７０ 特開平５−３３６９８６

Dabler et al., Mol. Microbiol. 36, 1101-1112 (2000) Shevchik VE, et al., EMBO J. 1994 Apr 15;13(8):2007-12 Givol D, et al., J. Biol. Chem. 1964 Sep;239:PC3114-16. Bardwell JC, et al., Cell, 1991 Nov 1;67(3):581-9. Missiakas D, et al., EMBO J. 1995 Jul 17;14(14):3415-24 Andersen CL, et al., Mol. Microbiol. 1997 Oct;26(1):121-32 Kadokura H, et al., Science, 2004 Jan 23;303(5657):534-7. Inaba K, et al.,J. Biol. Chem., 279, 6761-6768, (2004) Rietsch A, et al., J. Bacteriol. 1997 Nov;179(21):6602-8 Bardwell, J.C., Mol. Microbiol. 14, 199-205, (1994) Sone, M. et al., J. Biol. Chem., 272, 10349-10352, (1997) Rietsch, A. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 13048-13053 (1996) Akiyama Y, et al.., J. Biol. Chem. 1992 Nov 5;267(31):22440-5

本発明は、細菌のＬ−システイン生産能を向上させる新規な技術を開発し、Ｌ−システイン生産菌、及び同細菌を用いたＬ−システイン、Ｌ−シスチン、それらの誘導体もしくは前駆体、又はこれらの混合物の製造法を提供することを課題とする。

本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、dsbA遺伝子によりコードされるタンパク質の活性が増大するように細菌を改変することによってＬ−システイン生産能を向上させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は以下のとおりである。
（１）Ｌ−システイン生産能を有し、かつ、dsbA遺伝子によりコードされるタンパク質の活性が増大するように改変された腸内細菌科に属する細菌。
（２）前記dsbA遺伝子の発現量を増大させること、及び／または、dsbA遺伝子の翻訳量を増大させることにより、前記タンパク質の活性が増大した、前記細菌。
（３）dsbA遺伝子のコピー数を高めること、又は同遺伝子の発現調節配列を改変することにより、dsbA遺伝子の発現量が増大された、前記細菌。
（４）前記タンパク質が、下記（Ａ）または（Ｂ）に記載のタンパク質である前記細菌。
（Ａ）配列番号２、４、６、８、１０、又は１２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、又は１２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、細菌内の活性を増大させたときにＬ−システイン生産能が向上するタンパク質。
（５）前記dsbA遺伝子が、下記（ａ）または（ｂ）に記載のＤＮＡである、前記細菌。
（ａ）配列番号１、３、５、７、９、又は１１の塩基配列を含むＤＮＡ、または
（ｂ）配列番号１、３、５、７、９、又は１１の塩基配列の相補配列または同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、細菌内の活性を増大させたときにＬ−システイン生産能が向上するタンパク質をコードするＤ
ＮＡ。
（６）Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減された変異型セリンアセチルトランスフェラーゼを保持する（１）〜（５）のいずれかに記載の細菌。
（７）ｙｄｅＤ遺伝子によりコードされるタンパク質の活性が増大した、（１）〜（５）のいずれかに記載の細菌。
（８）セリンによるフィードバック阻害を受けない３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼを保持する、（１）〜（５）のいずれかに記載の細菌。
（９）ｙｄｅＤ遺伝子によりコードされるタンパク質の活性が増大した、（６）又は（８）に記載の細菌。
（１０）エシェリヒア属細菌である、前記細菌。
（１１）エシェリヒア・コリである、前記細菌。
（１２）前記細菌を培地中で培養し、該培地からＬ−システイン、Ｌ−シスチン、それらの誘導体又は前駆体、又はこれらの混合物を採取することを特徴とする、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、それらの誘導体又は前駆体、又はこれらの混合物の製造法。
（１３）前記Ｌ−システインの誘導体がチアゾリジン誘導体である、前記方法。
（１４）前記Ｌ−システインの前駆体がＯ−アセチルセリン又はＮ−アセチルセリンである、前記方法。

本発明により、細菌のＬ−システイン生産能を向上させることができる。また、本発明によれば、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、それらの誘導体又は前駆体、又はこれらの混合物を効率よく製造することができる。

dsbA欠損株のシステイン感受性と、dsbAプラスミドによる相補（生育回復）を示す図（写真）。 システインによるDsbAタンパク質の酸化・還元状態を示す図（電気泳動写真）。 システインによるOstAタンパク質の酸化・還元状態を示す図（電気泳動写真）。 DsbA強化システイン生産菌によるシステイン生産を示す図。

＜１＞本発明の細菌
本発明の細菌は、Ｌ−システイン生産能を有し、かつ、dsbA遺伝子によりコードされるタンパク質の活性が増大するように改変された腸内細菌科に属する細菌である。ここで、Ｌ−システイン生産能とは、本発明の細菌を培地中で培養したときに、培地中または菌体内にＬ−システインを生成し、培地中または菌体から回収できる程度に蓄積する能力をいう。また、Ｌ−システイン生産能を有する細菌とは、野生株または親株よりも多い量のＬ−システインを生産し培地に蓄積することができる細菌を意味し、好ましくは、０．０５ｇ／Ｌ以上、より好ましくは０．１ｇ／Ｌ以上、特に好ましくは０．２ｇ／Ｌ以上の量のＬ−システインを生産し培地に蓄積することができる微生物を意味する。

微生物が産生したＬ−システインは、培地中で、ジスルフィド結合によって一部がＬ−シスチンに変換することがある。特に本発明においては、後述するように、DsbA活性を強化すると、Ｌ−システインを高生産させた場合、DsbA-DsbB-UQ酸化システムによるＬ−システインからのＬ−シスチンの形成が促進すると考えられる。また、Ｌ−システインと培地に含まれるチオ硫酸との反応によってＳ−スルホシステインが生成することがある（Szczepkowski T.W., Nature, vol.182 (1958)）。さらに、細菌の細胞内で生成したＬ−システインは、細胞中に存在するケトン又はアルデヒド、例えばピルビン酸と縮合し、ヘミチオケタールを中間体としてチアゾリジン誘導体が生成することがある（特許第2992010号参照）。こられのチアゾリジン誘導体及びヘミチオケタールは、平衡混合物として存在することがある。したがって、Ｌ−システイン生産能とは、Ｌ−システインのみを培地中又は菌体内に蓄積する能力に限られず、Ｌ−システインに加えて、Ｌ−シスチン、又はそれらの誘導体もしくは前駆体、又はこれらの混合物を培地中に蓄積する能力も含まれる。前記Ｌ−システイン又はＬ−シスチンの誘導体としては、例えばＳ−スルホシステイン、チアゾリジン誘導体、及びヘミチオケタール等が挙げられる。また、Ｌ−システイン又はＬ−シスチンの前駆体としては、例えばＬ−システインの前駆体であるＯ−アセチルセリンが挙げられる。Ｌ−システイン又はＬ−シスチンの前駆体には、前駆体の誘導体も含まれ、例えばＯ−アセチルセリンの誘導体であるＮ−アセチルセリン等が挙げられる。

O−アセチルセリン（OAS）はL−システイン生合成の前駆体物質である。OASは細菌や植物の代謝物質であり、セリンアセチルトランスフェラーゼ（SAT）の酵素反応によりL−セリンのアセチル化によって生じる。OASは細胞内で更にL−システインへと変換される。

Ｌ−システイン生産能を有する細菌としては、本来的にＬ−システイン生産能を有するものであってもよいが、下記のような微生物を、変異法や組換えDNA技術を利用して、Ｌ−システイン生産能を有するように改変したものであってもよい。尚、本発明においてＬ−システインとは、特記しない限り、還元型Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、前記のような誘導体もしくは前駆体、またはこれらの混合物を指すことがある。

本発明に用いる細菌としては、エシェリヒア属、エンテロバクター属、パントエア属、クレブシエラ属、セラチア属、エルビニア属、サルモネラ属、モルガネラ属など、腸内細菌科に属する細菌であって、Ｌ−アミノ酸を生産する能力を有するものであれば、特に限定されない。具体的にはNCBI（National Center for Biotechnology Information）データベースに記載されている分類により腸内細菌科に属するものが利用できる（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347）。改変に用いる腸内細菌科の親株としては、中でもエシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌、パントエア属細菌、エルビニア属、エンテロバクター属、又はクレブシエラ属を用いることが望ましい。

エシェリヒア属細菌としては、特に限定されないが、具体的にはNeidhardtらの著書（Backmann, B. J. 1996. Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, p. 2460-2488. Table 1. In F. D. Neidhardt (ed.), Escherichia
coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.）に挙げられるものが利用できる。その中では、例えばエシェリヒア・コリが挙げられる。エシェリヒア・コリとしては具体的には、プロトタイプの野生株Ｋ１２株由来のエシェリヒア・コリ W3110 （ATCC 27325）、エシェリヒア・コリ MG1655 (ATCC 47076)等が挙げられる。

これらを入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所
12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る（http://www.atcc.org/参照）。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。

エンテロバクター属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter
agglomerans）、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)等、パントエア属細菌としてはパントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）が挙げられる。尚、近年、エンテロバクター・アグロメランスは、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パン
トエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）又はパントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）、パントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）に再分類されているものがある。本発明においては、腸内細菌科に分類されるものであれば、エンテロバクター属又はパントエア属のいずれに属するものであってもよい。

特に、パントエア属細菌、エルビニア属細菌、エンテロバクター属細菌は、γ−プロテオバクテリアに分類される細菌であり、分類学的に非常に近縁である（J Gen Appl Microbiol 1997 Dec;43(6) 355-361, International Journal of Systematic Bacteriology, Oct. 1997,p1061-1067）。近年、DNA-DNAハイブリダイゼーション実験等により、エンテロバクター属に属する細菌には、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）又はパントエア・ディスパーサ（Pantoea dispersa）等に再分類されているものがある（International Journal of Systematic Bacteriology, July 1989;39(3).p.337-345）。また、エルビニア属に属する細菌にはパントエア・アナナス（Pantoea ananas）、パントエア・スチューアルティに再分類されているものがある（International Journal of Systematic Bacteriology, Jan 1993;43(1), p.162-173 参照）。

エンテロバクター属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter
agglomerans）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）等が挙げられる。具体的には、欧州特許出願公開952221号明細書に例示された菌株を使用することが出来る。 エンテロバクター属の代表的な株として、エンテロバクター・アグロメランスATCC12287株が挙げられる。

パントエア属細菌の代表的な菌株として、パントエア・アナナティス、パントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）パントエア・アグロメランス、パントエア・シトレア（Pantoea citrea）が挙げられる。 パントエア・アナナティスとして具体的には、パントエア・アナナティスAJ13355株、SC17株が挙げられる。SC17株は、静岡県磐田市の土壌から、低pHでＬ−グルタミン酸及び炭素源を含む培地で増殖できる株として分離された株AJ13355（FERM BP-6614）から、粘液質低生産変異株として選択された株である（米国特許第6,596,517号）。 パントエア・アナナティスAJ13355株は、平成１０年２月１９日に、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（現名称、産業技術総合研究所特許生物寄託センター、住所 郵便番号305-8566 茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、受託番号FERM P-16644として寄託され、平成１１年１月１１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6614が付与されている。尚、同株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）と同定され、エンテロバクター・アグロメランスAJ13355として寄託されたが、近年16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）に再分類されている。

エルビニア属細菌としては、エルビニア・アミロボーラ、エルビニア・カロトボーラが挙げられ、クレブシエラ属細菌としては、クレブシエラ・プランティコーラが挙げられる。

以下、腸内細菌科に属する細菌にＬ−システイン生産能を付与する方法、又はこれらの細菌のＬ−システイン生産能を増強する方法について述べる。

細菌にＬ−システイン生産能を付与するには、栄養要求性変異株、アナログ耐性株又は代謝制御変異株の取得や、Ｌ−システインの生合成系酵素の発現が増強された組換え株の創製等、従来、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等の育種に採用されてきた方法を適用することができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、1986年5月30日初版発行、第77-100頁参照）。ここで、Ｌ−システイン生産菌の育種において、付与される栄養要
求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独でもよく、２種又は３種以上であってもよい。また、発現が増強されるＬ−システイン生合成系酵素も、単独であっても、２種又は３種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の増強が組み合わされてもよい。

Ｌ−システイン生産能を有する栄養要求性変異株、Ｌ−システインのアナログ耐性株、又は代謝制御変異株を取得するには、親株又は野生株を通常の変異処理、すなわちＸ線や紫外線の照射、またはN-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(NTG)もしくはエチルメタンスルフォネート（EMS）等の変異剤処理などによって処理し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、かつＬ−アミノ酸生産能を有するものを選択することによって得ることができる。

具体的には、Ｌ−システイン生産菌としては、フィードバック阻害耐性のセリンアセチルトランスフェラーゼ（SAT）をコードする複数種のcysEアレルで形質転換されたE. coli
JM15(米国特許第6,218,168号)、細胞に毒性の物質を排出するのに適したタンパク質をコードする過剰発現遺伝子を有するE. coli W3110 (米国特許第5,972,663号)、システインデスルフヒドラーゼ活性が低下したE. coli株 (特開平11-155571号公報)、cysB遺伝子によりコードされるシステインレギュロンの正の転写制御因子の活性が上昇したE. coli W3110 (WO01/27307)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。

E. coliでは、システインデスルフヒドラーゼ活性を有するタンパク質として、シスタチオニン−β−リアーゼ（metC産物、特開平11-155571号、Chandra et. al., Biochemistry, 21 (1982) 3064-3069））、トリプトファナーゼ（tnaA産物、特開2003-169668、（Austin Newton et. al., J. Biol. Chem. 240 (1965) 1211-1218））、Ｏ−アセチルセリン
スルフヒドリラーゼＢ（cysM遺伝子産物、特開2005-245311）、及び、malY遺伝子産物（特開2005-245311）が知られている。これらのタンパク質の活性を低下させることにより、−システイン生産能が向上する。 本発明において、「タンパク質の活性が低下する」とは、同タンパク質の活性が野生株又は親株等の非改変株に対して低下していることを意味し、活性が完全に消失していることを含む。

システインデスルフヒドラーゼ活性を有するタンパク質の活性を低下させるような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子の発現を低下させることによって達成される。具体的には例えば、染色体上の標的遺伝子のコード領域の一部又は全部を欠損させることによって、前記タンパク質の細胞内の活性を低下させることができる。標的遺伝子のプロモーターやシャインダルガルノ（SD）配列等の発現調節配列を改変したりすることなどによっても、発現を低下させることができる。また、発現調節配列以外の非翻訳領域の改変によっても、遺伝子の発現量を低下させることができる。さらには、染色体上の遺伝子の前後の配列を含めて、遺伝子全体を欠失させてもよい。また、染色体上の標的遺伝子のコード領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、また終始コドンを導入すること（ナンセンス変異）、あるいは一〜二塩基付加・欠失するフレームシフト変異を導入することによっても達成出来る（Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617（1997） Proceedings of the National Academy of Sciences,USA 95 5511-5515(1998),
Journal of Biological Chemistry 266, 20833-20839(1991)）。

また、標的タンパク質の活性が低下するような改変であれば、Ｘ線もしくは紫外線を照射、またはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異剤による通常の変異処理による改変であってもよい。

発現調節配列の改変は、好ましくは１塩基以上、より好ましくは２塩基以上、特に好ま
しくは３塩基以上である。また、コード領域を欠失させる場合は、標的タンパク質の機能が低下又は欠失するのであれば、欠失させる領域は、Ｎ末端領域、内部領域、Ｃ末端領域のいずれの領域であってもよく、コード領域全体であってよい。通常、欠失させる領域は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、欠失させる領域の上流と下流のリーディングフレームは一致しないことが好ましい。

標的遺伝子のコード領域に他の配列を挿入する場合も、遺伝子のいずれの領域であってもよいが、挿入する配列は長い方が、確実に遺伝子を不活化することができる。挿入部位の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。他の配列としては、コードされるタンパク質の機能を低下又は欠損させるものであれば特に制限されないが、例えば、抗生物質耐性遺伝子やＬ−システイン生産に有用な遺伝子を搭載したトランスポゾン等が挙げられる。

染色体上の標的遺伝子を上記のように改変するには、例えば、遺伝子の部分配列を欠失し、正常に機能するタンパク質を産生しないように改変した欠失型遺伝子を作製し、該遺伝子を含むＤＮＡで細菌を形質転換して、欠失型遺伝子と染色体上の遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の遺伝子を欠失型遺伝子に置換することによって達成できる。欠失型遺伝子によってコードされるタンパク質は、生成したとしても、野生型タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失する。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は既に確立しており、「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B.
L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner,
J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミド、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で複製起点を持たないスイサイドベクターを利用する方法などがある（米国特許第6303383号、または特開平05-007491号）。

標的遺伝子の転写量が低下したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を野生株、あるいは非改変株と比較することによって行うことが出来る。mRNAの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT−PCR等が挙げられる（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。

標的タンパク質の量が低下したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことが出来る（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold
spring Harbor (USA), 2001））。

本発明においては、Ｌ−システイン生産菌は、フィードバック阻害耐性の変異型SATを保持していることが好ましい。エシェリヒア・コリに由来する、フィードバック阻害耐性の変異型SATとして具体的には、２５６位のメチオニン残基がグルタミン酸残基に置換された変異型SAT（特開平11-155571）、２５６位のメチオニン残基がイソロイシン残基に置換された変異型SAT（Denk, D. and Boeck, A., J. General Microbiol., 133, 515-525 (1987)）、９７位のアミノ酸残基から２７３位のアミノ酸残基までの領域における変異、又は２２７位のアミノ酸残基からＣ末端領域の欠失を有する変異型SAT（WO97/15673号国際公開パンフレット、米国特許第6218168号）、野生型SATの８９〜９６位に相当するアミノ酸配列が１又は複数の変異を含み、かつ、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が脱感作されている、変異型SAT（米国特許公開第20050112731(A1)）等が知られている。実施例に記載した変異型SATをコードするcysE5は、野生型SATの９５位及び９６位のVal残基及びAsp残基が、各々Arg残基及びPro残基に置換されている。

SAT遺伝子は、エシェリヒア・コリの遺伝子に限られず、SAT活性を有するタンパク質をコードするものであれば、使用することができる。また、Ｌ−システインによるフィードバック阻害を受けないシロイヌナズナ由来のSATアイソザイムが知られており、これをコードする遺伝子を用いることもできる（FEMS Microbiol. Lett., 179 (1999) 453-459）。 細菌に変異型SATをコードする遺伝子を導入すれば、Ｌ−システイン生産能が付与される。細菌への変異型SAT遺伝子の導入は、通常のタンパク質発現に用いられる種々のベクターを用いることができる。このようなベクターとしては、pUC19、pUC18、pHSG299, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pBR322, pACYC184, pMW219等が挙げられる。

SAT遺伝子を含む組換えベクターを細菌に導入するには、D.A.Morrisonの方法（Methods
in Enzymology 68, 326 (1979)）あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M. and Higa,A.,J.Mol.Biol.,53,159(1970)）、エレクトロポーレーションによる方法等、細菌の形質転換に通常用いられている方法を用いることができる。

また、SAT遺伝子のコピー数を高めることによっても、SAT活性を上昇させるこができる。SAT遺伝子のコピー数を高めることは、上記のようなベクターを用いてSAT遺伝子を細菌に導入することによって、又は、SAT遺伝子を細菌の染色体DNA上に多コピー存在させることによって達成できる。細菌の染色体DNA上にSAT遺伝子を多コピーで導入するには、染色体DNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、SAT遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体DNA上に多コピー導入することも可能である。

また、YdeDタンパク質をコードするydeD遺伝子は、システイン経路の代謝産物の排出に関与していることが知られており、YdeDタンパク質の活性を高めることによっても、Ｌ−システイン生産能を向上させることができる（特開2002-233384）。YdeDタンパク質の活性を増大させるような改変は、例えば、ydeD遺伝子の発現を向上させることによって達成される。ydeD遺伝子の発現の向上は、後述する、dsbA遺伝子の発現を向上させる改変と同様にして行うことができる。エシェリヒア・コリのydeD遺伝子は、例えば、配列番号１３、１４示す塩基配列を有するプライマーを用いたPCRにより、エシェリヒア・コリ染色体ＤＮＡから取得することができる。

また、セリンによるフィードバック阻害を受けない３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ（PGD）を保持させることによっても、Ｌ−システイン生産能を向上させることができる。このような変異型PGDをコードする遺伝子としては、serA5遺伝子（米国特許第６,１８０,３７３号に記載）が知られている。

また、硫酸塩／チオ硫酸塩輸送系タンパク質群をコードするcysPTWAMクラスター遺伝子の発現が増強されるように改変されたエシェリヒア属に属するＬ−システイン生産菌（特開2005-137369号公報、EP1528108号明細書）を使用することもできる。

さらに、Ｌ−システイン生産能を有し、かつ、emrAB、emrKY、yojIH、acrEF、bcr又はcusA遺伝子の発現が上昇するように改変されたエシェリヒア属細菌を使用することもできる（特開2005-287333号公報）。

上記のようにして得られるＬ−システイン生産能を有する細菌のうち、本発明において好ましいのは、フィードバック阻害耐性の変異型SATを保持する細菌、YdeDタンパク質の活性が高められた細菌、又はセリンによるフィードバック阻害を受けないPGDタンパク質
を保持する細菌であり、より好ましいのは、フィードバック阻害耐性の変異型SATを保持し、かつ、YdeDタンパク質の活性が高められた細菌、フィードバック阻害耐性の変異型SATを保持し、かつ、セリンによるフィードバック阻害を受けないPGDタンパク質を保持する細菌、又は、YdeDタンパク質の活性が高められ、かつ、セリンによるフィードバック阻害を受けないPGDタンパク質を保持する細菌であり、特に好ましいのは、フィードバック阻害耐性の変異型SATを保持し、セリンによるフィードバック阻害を受けないPGDタンパク質を保持し、かつ、YdeDタンパク質の活性が高められた細菌である。

本発明の細菌は、上述したようなＬ−システイン生産能を有する腸内細菌科に属する細菌を、dsbA遺伝子によりコードされるタンパク質（以下、「DsbA」と記載することがある）の活性が増大するように改変することによって得ることができる。ただし、DsbAタンパク質の活性が低下するように改変を行った後に、Ｌ−システイン生産能を付与してもよい。 dsbA遺伝子は、ECK3852, b3860, dsf, iarA, ppfA遺伝子と同義である。

「dsbA遺伝子によりコードされるタンパク質の活性が増大する」とは、dsbA遺伝子によりコードされるDsbAタンパク質の活性が野生株又は親株等の非改変株に対して増大していることを意味する。DsbAタンパク質の活性とは、本来的には、ペリプラズムで基質タンパク質（AmpC, DsbB, LivK, OstA, RcsF）を酸化する活性である。そして、このDsbAタンパク質の活性を増大させることによって、Ｌ−システイン生産能が向上する。したがって、別の定義によれば、DsbAタンパク質の活性とは、細菌内の活性を増大させたときにＬ−システイン生産能が向上する活性を意味する。また、実施例に記載するように、dsbA遺伝子を欠損させるとＬ−システイン感受性となり、dsbA遺伝子欠損株をdsbA遺伝子で形質転換するとシステイン感受性から回復することが明らかとなった。したがって、他の定義によれば、DsbAタンパク質の活性とは、このようなシステイン耐性又は感受性に関与する性質を意味する。

dsbA遺伝子よりコードされるDsbAタンパク質の活性を増大させるような改変は、例えば、dsbA遺伝子の発現を増大させることによって達成される。

dsbA遺伝子の発現を増強するための改変は、例えば、遺伝子組換え技術を利用して、細胞中の遺伝子のコピー数を高めることによって行うことができる。例えば、dsbA遺伝子を含むＤＮＡ断片を、宿主細菌で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結して組換えDNAを作製し、これを細菌に導入して形質転換すればよい。前記ベクターとしては、宿主細菌の細胞内において自律複製可能なベクターを挙げることができる。エシェリヒア・コリ細胞内において自律複製可能なベクターとしては、pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pACYC184（pHSG、pACYCは宝バイオ社より入手可）、RSF1010、pBR322、pMW219（pMW219はニッポンジーン社より入手可）、pSTV29(宝バイオ社より入手可)等が挙げられる。

組換えDNAを細菌に導入するには、これまでに報告されている形質転換法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア・コリK-12について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してDNAの透過性を増す方法（Mandel,M.and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)）があり、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してDNAを導入する方法（Duncan, C. H.,Wilson, G. A. and Young, F. E., Gene, 1, 153 (1977)）がある。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、DNA受容菌の細胞を、組換えDNAを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えDNAをDNA受容菌に導入する方法（Chang, S. and Choen, S. N., Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, M. J., Ward, J. M. and Hopwood, O. A., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A., Hicks, J. B. and Fink, G. R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (197
8)）も応用できる。

一方、dsbA遺伝子のコピー数を高めることは、上述のようなdsbA遺伝子を細菌のゲノムDNA上に多コピー存在させることによっても達成できる。細菌のゲノムDNA上にdsbA遺伝子を多コピーで導入するには、ゲノムDNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。ゲノムDNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。また、ゲノム上に存在するdsbA遺伝子の横にタンデムに連結させてもよいし、ゲノム上の不要な遺伝子上に重複して組み込んでもよい。これらの遺伝子導入は、温度感受性ベクターを用いて、あるいはintegrationベクターを用いて達成することが出来る。

あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、dsbA遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させてゲノムDNA上に多コピー導入することも可能である。ゲノム上に遺伝子が転移したことの確認は、dsbA遺伝子の一部をプローブとして、サザンハイブリダイゼーションを行うことによって確認出来る。

さらに、dsbA遺伝子の発現の増強は、上記した遺伝子コピー数の増幅以外に、国際公開00/18935号パンフレットに記載した方法で、ゲノムDNA上またはプラスミド上のdsbA遺伝子の各々のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することや、各遺伝子の−35、−10領域をコンセンサス配列に近づけること、dsbA遺伝子の発現を上昇させるようなレギュレーターを増幅すること、又は、dsbA遺伝子の発現を低下させるようなレギュレーターを欠失または弱化させることによっても達成される。例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、tacプロモーター、araBAプロモーター、ラムダファージのPRプロモーター、PLプロモーター、tetプロモーター、T7プロモーター、φ10プロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。また、E.coliのスレオニンオペロンのプロモーターを使用することもできる。また、dsbA遺伝子のプロモーター領域、SD領域に塩基置換等を導入し、より強力なものに改変することも可能である。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)）等に記載されている。さらに、リボソーム結合部位（RBS）と開始コドンとの間のスペーサー、特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換がmRNAの翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することも可能である。dsbA遺伝子のプロモーター等の発現調節領域は、プロモーター検索ベクターやGENETYX等の遺伝子解析ソフトを用いて決定することも出来る。これらのプロモーター置換または改変によりdsbA遺伝子の発現が強化される。発現調節配列の置換は、例えば温度感受性プラスミドを用いた方法や、Redドリブンインテグレーション法(WO2005/010175)を使用することが出来る。

エシェリヒア・コリのdsbA遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１及び２に示す。細菌が属する種又は菌株によって、dsbA遺伝子の塩基配列に差異が存在することがあるため、改変するdsbA遺伝子は、配列番号１の塩基配列のバリアントであってもよい。DsbAのホモログは多数の細菌で知られており、データベースの検索により見つけることができる。配列情報からE. coli K-12株のDsbAタンパク質と相同性の高いタンパク質を探す場合には、例えばBLASTサーチ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi）にて検索することができる。また、キーワードからホモログを探す場合には、例えばEntrezのサーチエンジン（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/gquery）を用いてキーワードとして「dsbA」や「outer membrane channel protein」を入力すれば、候補となる配列が複数のデータベースから抽出される。これらの候補をよく精査し、目的のホモログ配列を見つけることができる。このような方法で見つけられた多数のDsbAホモログのうち、以下の細菌のDsbAホモログの遺伝子塩基配列及びアミノ酸配列を、配列番号３〜１２に示す。カッコ内はNCBI （National Center for Biotechnology Infor
mation）データベースのアクセション番号、及び配列番号２のアミノ酸配列との同一性（%）を示す。

シゲラ・フレクスネリ（Shigella flexneri） 301（serotype 2a）（KEGG Entry Name：SF3931、99.5%）
クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）subsp. pneumoniae MGH 78578（KEGG Entry Name：KPN_04170、81.2%）
エルシニア・エンテロコリティカ（Yersinia enterocolitica）subsp. enterocolitica
8081（KEGG Entry Name：YE0020、70.7%）
フォトルハブダス・ルミネセンス（Photorhabdus luminescens）subsp. laumondii TTO1（KEGG Entry Name：plu0381、60.1）
パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）PM70（KEGG Entry Name：PM1801、48.1％）

また、dsbA遺伝子は、上記のようなDsbAタンパク質又はDsbAホモログのアミノ酸配列、例えば配列番号２、６、８、１０、又は１２のアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。前記「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、具体的には好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜5個を意味する。上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加は、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換であり、保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、遺伝子が由来する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。

さらに、上記のような保存的変異を有する遺伝子は、コードされるアミノ酸配列全体に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有し、かつ、野生型DsbAタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。尚、本明細書において、「相同性」（homology）」は、「同一性」（identity）を指すことがある。

また、dsbA遺伝子は、公知の遺伝子配列から調製され得るプローブ、例えば前記dsbA遺伝子、又はdsbA遺伝子ホモログの塩基配列、例えば配列番号１、５、７、９、もしくは１１、又はそれらの相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、DsbAタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。ここで、「スト
リンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1% SDS、好ましくは、0.1×SSC、0.1% SDS、さらに好ましくは、68℃、0.1×SSC、0.1% SDSに相当する塩濃度、温度で、１回、より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。

プローブは、遺伝子の相補配列の一部であってもよい。そのようなプローブは、公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、これらの塩基配列を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。例えば、プローブとして、300 bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、50℃、2×SSC、0.1% SDSが挙げられる。

上記の遺伝子やタンパク質のバリアントに関する記載は、セリンアセチルトランスフェラーゼ、システインデスルフヒドラーゼ等の酵素やYdeDタンパク質、及びそれらをコードする遺伝子にも同様に適用される。

＜２＞本発明のＬ−システイン、Ｌ−シスチン、それらの誘導体もしくは前駆体、又はこれらの混合物の製造法
上記のようにして得られる本発明の細菌を培地中で培養し、該培地からＬ−システイン、Ｌ−シスチン、それらの誘導体もしくは前駆体、又はこれらの混合物を採取することにより、これらの化合物を製造することができる。Ｌ−システインの誘導体又は前駆体としては、前記したようなＳ−スルホシステイン、チアゾリジン誘導体、同チアゾリジン誘導体に相当するヘミチオケタール、Ｏ−アセチルセリン、又はＮ−アセチルセリン等が挙げられる。

使用する培地としては、炭素源、窒素源、イオウ源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地が挙げられる。

炭素源としては、グルコース、フラクトース、シュクロース、糖蜜やでんぷんの加水分解物などの糖類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。

窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。

イオウ源としては、硫酸塩、亜硫酸塩、硫化物、次亜硫酸塩、チオ硫酸塩等の無機硫黄化合物が挙げられる。

有機微量栄養源としては、ビタミンＢ１などの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じてリン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。

培養は好気的条件下で30〜90時間実施するのがよく、培養温度は２５℃〜３７℃に、培養中ｐＨは５〜８に制御することが好ましい。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。培養物からのＬ−システインの採取は通常のイオン交換樹脂法、沈澱法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。

上記のようにして得られるＬ−システインは、Ｌ−システイン誘導体の製造に用いることができる。システイン誘導体としては、メチルシステイン、エチルシステイン、カルボシステイン、スルホシステイン、アセチルシステイン等が含まれる。

また、Ｌ−システインのチアゾリジン誘導体が培地に蓄積した場合は、培地からチアゾリジン誘導体を採取し、チアゾリジン誘導体とＬ−システインとの間の反応平衡をＬ−システイン側に移動させることによって、Ｌ−システインを製造することができる。また、培地にＳ−スルホシステインが蓄積した場合、例えばジチオスライトール等の還元剤を用いて還元することによってＬ−システインに変換することができる。

以下、本発明をさらに具体的に説明する。以下の記載において、システインはＬ−体である。

（１）システイン感受性を示すクローンのスクリーニング
システイン耐性に関与する遺伝子を網羅的に探索するため、Keio collection（E. coli
BW25113の必須遺伝子を除く一遺伝子欠損ライブラリー；Baba, T, et al., 2006; Mol. Syst. Biol. 2:2006.0008）の中からシステインに対して感受性を示すクローンのスクリーニングを行った。

（１−１）Keioコレクションからのシステイン感受性を示すクローンのスクリーニング
Keio collection 3,985クローンを0.5 ml LB液体培地37℃、15時間培養した。この培養液を、異なる濃度（0, 15, 20, 25 mM）のシステインを含むLB寒天培地にスタンプし、37℃で一晩培養した。野生株のシステインによる生育阻害濃度以下（20 mM）で感受性になるクローンを目視で選抜した。具体的には、システイン15 mMを含むLBプレートでコロニーを形成しなかったクローンを候補として選抜した。これら候補の中から特に強く明確なシステイン感受性を示すものとして、dsbA遺伝子欠損株が取得された。
DsbAはペリプラズムに局在し、自身が持つ2つのシステイン残基の酸化状態（-S-S-）・還元状態（-SH/-SH）を利用して、基質タンパク質にジスルフィド結合（S-S結合）を形成させ、基質タンパク質のフォールディングを行うタンパク質である。基質タンパク質のS-S結合形成の際には、DsbAのシステイン残基は酸化型（-S-S-）から還元型（-SH/-SH）に変わる。こうしてできた還元型DsbAを酸化型にリサイクルするタンパク質としてDsbBが知られている。DsbBが受け取った電子は、呼吸鎖成分であるユビキノン (UQ) に受け渡され、最終的にはチトクロム酸化酵素を介して酸素が電子受容体となることが分かっている。従って、この一連のDsbA、DsbB、呼吸鎖のシステムは基質タンパク質上のシステイン残基同士の酸化的架橋反応の役割を担っている。このように、タンパク質中のシステイン残基を基質とすることは知られていたが、低分子であるシステインそのものの添加が同システムに何らかの影響を及ぼすことは意外性のあることであった。

（１−２）dsbA遺伝子欠損によるシステイン感受性
Keio CollectionスクリーニングによりdsbA欠損株が取得されたため、同遺伝子欠損株のシステインに対する感受性をより詳細に解析するため、異なる濃度のシステインを含有する寒天培地上での生育を観察した。また、既に同様の手法で取得され、欠損によりシステイン感受性を示すことが知られているtolC遺伝子（特願2008-040167、Wiriyathanawudhiwong, N. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. (2009) 81:903-913）についてもtolC欠損株を用いて同様に実験を行った。ここで用いたdsbA欠損株、及びtolC欠損株は、それぞれJW3832株、JW5503株（いずれもKeio collection）、それらの親株はBW25113株（Andreas Haldimann, A. and Wanner, B. L., J. Bacteriol. 2001 November; 183(21): 6384-6393）である。また、相補実験用のdsbA遺伝子及びtolC遺伝子が搭載されたプラスミドは
pDsbA、pTolC（ASKA clone;（Kitagawa, M, et al., 2005; DNA Res. 12:291-299））、それらのベースとなるベクターはpCA24（ASKA cloneのためのベクター;（Kitagawa, M, et al., 2005; DNA Res. 12:291-299））である。

各プラスミドを有する菌をL培地（10 g/L Bacto trypton, 5g/L Bacto Yeast extract, 5g/L NaCl）5 mlに植菌し、30℃で一晩培養したものを0.9%生理食塩水で10倍ずつ希釈した希釈系列（10^-2〜10^-6）を作成して、その希釈菌液を各種濃度（10, 15, 20mM）のシステインを含むL寒天培地（10 g/L Bacto trypton, 5g/L Bacto Yeast extract, 5g/L NaCl, 15g/L 寒天）にスポットし（5μl）、37℃で一晩培養し、dsbA欠損株及びtolC欠損株のシステイン培地での生育、及び、dsbAプラスミド及びtolCプラスミドによる相補（生育回復）試験を行った。その結果を図１に示す。対照株BW25113/pCA24に対して、dsbA欠損株JW3832/pCA24及びtolC欠損株JW5503/pCA24は顕著なシステイン感受性を示し、またプラスミドでdsbA及びtolC遺伝子を導入した場合（JW3832/pDsbA株、JW5503/pTolC株）にはその感受性から回復することから、DsbAがtolCと同様にシステイン耐性に関与していることがわかった。

（２）システインによる細胞への毒性とDsbAとの関連について
dsbA遺伝子の欠損によりシステイン感受性となることから、システインによる細胞への毒性とDsbAとの関連について実験を行った。

（２−１）システインによる還元型DsbAの蓄積
システインにより、DsbAタンパク質の酸化還元状態に何らかの影響が及ぼされているかを検討するため、システイン添加時もしくはシステイン排出因子であるYdeD高発現時のDsbAの酸化・還元状態の解析を行った。YdeDは細胞膜に局在する排出タンパク質であり、細胞質からペリプラズムへの輸送に関与することが知られている（Dasler, T. et al., Mol. Microbiol., 2000; 36:1101-1112）。従って、YdeDを高発現させた場合にはペリプラズムへのシステインの供給が高められると推測される。

本実験で用いた菌株は、野生型の親株としてE. coli BW25113株（Andreas Haldimann and Barry L. Wanner. J. Bacteriol. 2001 November; 183(21): 6384-6393.）、BW25113株由来のdsbA欠損株JW3832株、dsbB欠損株JW5182株（Baba, T, et al. (2006). Mol. Syst. Biol. 2:2006.0008）である。また、dsbB遺伝子を搭載したプラスミドはpDsbB（ASKA clone：Kitagawa, M et al., (2005). DNA Res. 12:291-9）を用いた。

YdeDを高発現させるためのydeD遺伝子搭載のプラスミドpYdeDは次の手順で構築した。E.coli MG1655株ゲノムDNAをテンプレートとして、P1（5'-CGCGGATCCAATGGTCATAAATGGCAGCGTAGCGC-3'）とP2（5'-CGCGGATCCGCAGGGCGTTGCGGAACAAAC-3'）をプライマーとして用いて、Pyrobest DNAポリメラーゼ（Takara社）添付のプロトコールに従いPCRを行い、ydeD遺伝子の上流約300bp下流約200bpを含む約1.5kbのydeD遺伝子断片を取得した。両プライマーにはBamHIサイトがデザインされている。PCR断片をBamHIで処理した後、pSTV29（Takara社）のBamHIサイトに挿入し、pSTV29ベクター上のlacZ遺伝子と同方向にydeD遺伝子断片が挿入されたプラスミドをpYdeDと命名した。PCRで増幅された部分のシークエンシングを行い変異が入っていないことを確認した。

DsbAタンパク質の酸化・還元状態を識別するため、AMS（4-アセタミド-4'-マレイメジル-スチルベン-2,2'ジスルフォネート）によりタンパク質の修飾を行った（Kadokura, H.
et al., 2004. Science. 303, 534-537.）。野性株、dsbA欠損株、dsbB欠損株、野生株+pYdeD、dsbB欠損株+pDsbBを各3 ml LB培地において30℃で一晩培養したものを前培養液として用いた。LB培地に前培養液を1%植菌し、OD₆₆₀が0.4〜0.5になるまで30℃で振とう培養した。そのとき、システインを最終濃度5 mMになるように添加し、菌体をシステインに
20分曝した。DsbAタンパク質の酸化還元状態は、Itoらの方法（Kobayashi, T, Kishigami, S, Sone, M, Inokuchi, H, Mogi, T and Ito K. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 94, 11857-11862.）で調べた。即ち、ストレス処理後、速やかに0.5 mlの培養液（OD₆₆₀ 0.5付近）に対し100μl TCA（トリクロロ酢酸、最終濃度16.7%）を加え攪拌後、氷上で20分静置し沈殿させ、遠心分離で菌体を集めた。次に得られた沈殿に700 μlのアセトンを加え攪拌後、氷上で20分静置し、再度遠心で菌体を集めた。沈殿を、使用直前に調製した1%
SDS, 50mM Tris-Cl (pH 6.8), 10mM 4-アセタミド-4'-マレイメジル-スチルベン-2,2'ジスルフォネート（AMS、インビトロジェン社）の溶液に溶かした。

標識されたタンパク質は、その後非還元状態のSDSゲル電気泳動（12.5%）で分離後、ウエスタンブロティングによって検出した。ブロッティング後のニトロセルロース膜をブロッキング液（3%スキムミルクを含むTTBS：0.05%(wt/vol) Tween 20, 200 mM Tris-HCl (pH7.5), 500 mM NaCl）中で1 hr振とうした。膜をTTBSで洗浄後、一次抗体（anti-DsbA血清（ウサギ）Kadokura, H. et al., 2004. Science. 303, 534-537.）溶液中で1 hr振とうした。TTBSで洗浄後、二次抗体（0.2% ペルオキシダーゼ標識抗ウサギIgG（GE Healthcare社）、3%アルブミンを含むTTBS）溶液中で1 hr振とうした。標識の検出は、ECL Plus Western Blotting Detection Reagents（Amersham）に従い行った。

結果を図２に示す。dsbA欠損株ではバンドが検出されず、またdsbB欠損株及びdsbB欠損株+pDsbBでのバンドの様子から、DsbAの酸化型と還元型が正しく検出されていることが確認された。システイン無添加の場合、野生株では酸化型DsbAしかみられないのに対し、システイン（還元ストレス）に曝すことで還元型DsbAが蓄積し、DsbA-DsbB複合体も著しく蓄積した。また、野生株にYdeDを高発現させることでも還元型DsbAが蓄積することがわかった。本来DsbA-DsbB-UQ酸化システムは、タンパク質へのジスルフィド結合形成を行うためのシステムであるが、システインが過剰に存在するとシスチンへの酸化に働き、還元型DsbAが蓄積することが判明した。

（２−２）システインによる還元型OstAタンパク質の蓄積
システイン（還元ストレス）により還元型DsbAが蓄積することが明らかとなったことから、システインの毒性とペリプラズムのタンパク質の酸化・還元状態を調べることとした。OstAタンパク質は、生育に必須なペリプラズムのタンパク質であり、DsbAによるジスルフィド結合が必要なタンパク質である。OstAタンパク質の酸化・還元状態を調べるために、野生型の親株としてE. coli BW25113株、BW25113株由来のdsbA欠損株JW3832株を用い、ここにMycタグを融合したOstAを発現させるためのプラスミドpmyc-OstA（Kadokura, H. et al., 2004. Science. 303, 534-537.）を導入した。先述のDsbAの酸化・還元状態の実験と同様の培養条件で、L-システイン添加（最終濃度5 mM）、及び、AMS（4-アセタミド-4'-マレイメジル-スチルベン-2,2'ジスルフォネート）によるタンパク質の修飾を行い、ウエスタンブロティングによりOstAタンパク質を検出した。ただし、ここでは抗体にanti-Myc（マウス）を使用した。

結果を図３に示す。DsbA欠損株ではシステイン添加の有無に限らずOstAタンパク質は全て還元型を示す。野生株ではシステインがない場合にはOstAタンパク質は正しくジスルフィド結合がかけられた酸化型を示すが、システインの添加により還元型が蓄積することがわかった。システイン（還元ストレス）により還元型DsbAが蓄積し、それに伴い必須タンパク質であるOstAタンパク質が正しく酸化されないことが、システインによる生育への毒性のひとつであることが明らかとなった。以上の考察から、システイン発酵生産のようなシステインが大量に存在する環境においてはDsbA強化が有効であると考えられた。

（３）システイン生産菌の構築
Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減された変異型セリンアセチルトランス
フェラーゼをコードする変異型cysE、YdeD遺伝子、及びＬ−セリンによるフィードバック阻害が低減された３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異型SerA遺伝子が１つのプラスミドに載ったpACYC-DESをE. coli BW25113に導入することでシステイン生産菌を構築した。pACYC-DESの構築はEP1528108B1に記載されている。さらに、DsbA過剰発現によるシステイン生産への効果を調べるため、pDsbAとその対照となる空のベクターpCA24Nをそれぞれ導入したシステイン生産菌を構築した。

E. coli BW25113は、エシェリヒア・コリ ジェネティックストックセンター（E. coli Genetic Stock Center）（830 Kline Biology Tower, Dept. of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, 266 Whitney Ave., PO box 208103, Yale University, New Haven, CT 06520-8103）から、CGSC#7636の番号で入手することができる。また、同株に代えて、E. coli W3110等の株を用いても、同様にＬ−システイン生産菌を構築することができる。E. coli K12 W3110は、ATCC27325として、ATCCから入手することができる。

（４）DsbAを強化したシステイン生産菌によるL-システイン生産
DsbAを強化したシステイン生産菌（E. coli BW25113/pACYC-DES/pDsbA株）とDsbAを強化していない対照株（E. coli BW25113/pACYC-DES/pCA24N株）をL培地（10 g/L Bacto trypton, 5g/L Bacto Yeast extract, 5g/L NaCl, テトラサイクリン (10μg/mL)、クロラムフェニコール (30μg/mL)）5 mlに植菌し、30℃で、一晩培養した（前培養）。
一晩培養した菌液を250μlとり、25 mlの新しい培地（SM1+10% L培地）に加え、30℃で、140 rpmで振とう培養した。このときプラスミドを保持させるためにテトラサイクリン (10 mg/mL)、クロラムフェニコール (30 μg/mL)を培地に添加した。経時的にサンプリングを行い、各時間でのシステイン、シスチン及びシステイン関連化合物の生産量を分析した。なお、培養に用いたSM1培地の組成は次に示すとおりである；0.1 M KH₂PO₄-K₂HPO₄ buffer (pH 7.0), 30 g/L glucose, 10g/L (NH₄)₂SO₄, 0.1 g/L NaCl, 7.2 μM FeSO₄・7H₂O, 0.6 μM Na₂MoO₄, 40.4 μM H₃BO₃, 2.9 μM CoCl₂, 1 μM CuSO₄, 8.1 μM MnCl₂, 1 mM MgSO₄, 0.1 mM CaCl₂（Dassler, T. et al., 2000. Mol. Microbiol. 36, 1101-1112.）。

システイン、シスチン及びシステイン関連化合物の定量は、Gaitondeの方法（Gaitonde, MK. 1967. Biochem. J. 104, 627-633.）に従い次のように行った。培養液100 μlにGaitonde試薬 (Ninhydrin 250 mg, 酢酸 6 ml, 塩酸 4 ml) 200μlを加え、100℃で5分間発色反応を行い、400μlの100% エタノールを加えOD₅₆₀ を測定した。図４に、培地中に蓄積したシステイン量（Gaitonde法による定量値）の変化を示す。図中、「Cys」は、シスチン及びシステイン関連化合物の合計量を表す。また、BW25113/pDESpDsbA、BW25113/pDESpCA24Nは、それぞれBW25113/pACYC-DES/pDsbA、BW25113/pACYC-DES/pCA24Nを示す。DsbA強化株ではシステイン量が顕著に増加していることがわかった。このようにDsbA強化はシステイン生産量を増加させる効果があることが明らかとなった。

（５）DsbB、DsbC、DsbD、及びDsbGを強化したシステイン生産菌によるシステイン生産
DsbBは、DsbAの再酸化を促進することから、DsbA強化と同じ効果が期待できる。またDsbA-DsbBのシステムと類似したDsbC-DsbDやDsbGの強化によっても、同様の効果が期待できる。DsbB、DsbC、DsbD、DsbGをシステイン生産菌にて強化することは、例えば、DsbA強化株と同様に各遺伝子のASKA cloneプラスミドをE. coli BW25113/pACYC-DES株に導入することで行うことができる。こうしてできた各システイン生産菌をDsbA強化株の実験で行った同じ手法で培養・分析することで、各遺伝子がシステイン生産を向上させる効果を持つことを示すことができる。

〔配列表の説明〕
配列番号１：E. coli dsbA遺伝子の塩基配列
配列番号２：E. coli DsbAのアミノ酸配列
配列番号３：Shigella flexneri dsbA遺伝子ホモログの塩基配列
配列番号４：Shigella flexneri DsbAホモログのアミノ酸配列
配列番号５：Klebsiella pneumoniae dsbA遺伝子ホモログの塩基配列
配列番号６：Klebsiella pneumoniae DsbAホモログのアミノ酸配列
配列番号７：Yersinia enterocolitica dsbA遺伝子ホモログの塩基配列
配列番号８：Yersinia enterocolitica DsbAホモログのアミノ酸配列
配列番号９：Photorhabdus luminescens dsbA遺伝子ホモログの塩基配列
配列番号10：Photorhabdus luminescens DsbAホモログのアミノ酸配列
配列番号11：Pasteurella multocida dsbA遺伝子ホモログの塩基配列
配列番号12：Pasteurella multocida DsbAホモログのアミノ酸配列
配列番号13：ydeD遺伝子増幅用プライマーP1
配列番号14：ydeD遺伝子増幅用プライマーP2

Claims (11)

1. Ｌ−システイン生産能を有し、かつ、ｄｓｂＡ遺伝子によりコードされるタンパク質の活性が増大するように改変された腸内細菌科に属する細菌を培地中で培養し、該培地からＬ−システイン、Ｌ−シスチン、それらの誘導体もしくは前駆体、又はこれらの混合物を採取することを特徴とする、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、それらの誘導体もしくは前駆体、又はこれらの混合物の製造法であって、
   前記誘導体はＳ-スルホシステイン、チアゾリジン誘導体、及びヘミチオケタールからなる群より選択され、前記前駆体はＯ-アセチルセリン及びＮ-アセチルセリンからなる群より選択されることを特徴とする方法。
2. 前記ｄｓｂＡ遺伝子の発現量を増大させること、及び／または、ｄｓｂＡ遺伝子の翻訳量を増大させることにより、前記タンパク質の活性が増大した請求項１に記載の方法。
3. ｄｓｂＡ遺伝子のコピー数を高めること、又は同遺伝子の発現調節配列を改変することにより、ｄｓｂＡ遺伝子の発現量が増大した、請求項２に記載の方法。
4. 前記タンパク質が、下記（Ａ）または（Ｂ）に記載のタンパク質である請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
   （Ａ）配列番号２、４、６、８、１０、又は１２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
   （Ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、又は１２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、細菌内の活性を増大させたときにＬ−システイン生産能が向上するタンパク質。
5. 前記ｄｓｂＡ遺伝子が、下記（ａ）または（ｂ）に記載のＤＮＡである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
   （ａ）配列番号１、３、５、７、９、又は１１の塩基配列を含むＤＮＡ、または
   （ｂ）配列番号１、３、５、７、９、又は１１の塩基配列と９０％以上の相同性を有し、
   かつ、細菌内の活性を増大させたときにＬ−システイン生産能が向上するタンパク質をコードするＤＮＡ。
6. 前記細菌がＬ−システインによるフィードバック阻害が低減された変異型セリンアセチルトランスフェラーゼを保持する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記細菌がセリンによるフィードバック阻害を受けない３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼを保持する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記細菌においてｙｄｅＤ遺伝子によりコードされるタンパク質の活性が増大した、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記細菌がエシェリヒア属細菌である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記細菌がエシェリヒア・コリである、請求項９に記載の方法。
11. 前記Ｌ−システインの誘導体がチアゾリジン誘導体である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。