BR112012012915B1

BR112012012915B1 - método para produção de l-cisteína, l-cistina, um derivado das mesmas, ou uma mistura das mesmas

Info

Publication number: BR112012012915B1
Application number: BR112012012915-5A
Authority: BR
Inventors: Gen Nonaka
Original assignee: Ajinomoto Co., Inc.
Priority date: 2009-11-30
Filing date: 2010-11-26
Publication date: 2020-12-01
Also published as: US20120288902A1; JPWO2011065469A1; JP5817529B2; BR112012012915A2; CN102639691B; EP2508594A4; US8647847B2; EP2508594B1; CN102639691A; EP2508594A1; ES2646165T3; WO2011065469A1

Abstract

BACTÉRIA PERTENCENTE À FAMÍLIA ENTEROBACTERIACEAE, E, MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE LCISTEÍNA, L-CISTINA, UM DERIVADO DAS MESMAS, OU UMA MISTURA DAS MESMAS. Uma nova técnica para melhorar a habilidade de produção de L-cisteína de uma bactéria é desenvolvida. Então, são divulgados: Uma bactéria produtora de Lcisteína; e um processo para produção de um composto como a L-cisteína usando a bactéria. L-cisteína, L-cistina, ou um derivado das mesmas podem ser produzidos pela cultura de uma bactéria que é capaz de produzir L-cisteína, pertencente a família enterobacteriaceae e foi modificada de maneira que a atividade de uma proteína codificada por um gene yci W (por exemplo, uma proteína mencionada no item (A) ou (B)) é reduzida, em um meio de cultura, e coletando qualquer um dos compostos ou uma mistura dos mesmo dos meio de cultura. (A) uma proteína que possui a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 2. (B) uma proteína que possui a sequência de aminoácidos produzida pela substituição, eliminação, inserção, ou adição de um ou alguns resíduos de aminoácidos na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2, e que possui uma propriedade característica em que a habilidade de produção de (...).

Description

MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE L-CISTEÍNA, L-CISTINA, UM DERIVADO DAS MESMAS, OU UMA MISTURA DAS MESMAS

Campo técnico

A presente invenção refere-se a um método para a produção de L-cisteína ou uma substância relacionada com a mesma. Mais precisamente, a presente invenção refere-se a uma bactéria adequada para a produção de L-cisteína ou a uma substância relacionada com a mesma, e a um método para a produção de L-cisteína ou uma substância relacionada com a mesma utilizando a bactéria. A L-cisteína e substâncias relacionadas com a mesma são usadas nos campos de drogas, cosméticos, e alimentos.

Fundamentos da técnica

A L-cisteína é convencionalmente obtida pela extração de substâncias contendo queratina, tais como cabelos, chifres e penas, ou convertendo o precursor ácido DL-2-amino- tiazolina-4-carboxílico usando uma enzima microbiana. É também planejado produzir L-cisteína em larga escala por um método de enzima imobilizada utilizando uma enzima nova. Além disso, é também tentado produzir-se a L- cisteína por fermentação, utilizando um microrganismo.

Como microrganismos tendo habilidade para produzir a L-cisteína, são conhecidos, por exemplo, uma bactéria corineforme na qual a atividade intracelular de serina acetiltransferase é aumentada (documento de patente 1). É também conhecida uma técnica de aumentar-se a habilidade de produção de L-cisteína pela incorporação de um mutante da serina acetiltransferase na qual a inibição de resposta pela L-cisteína é atenuada (documentos de patente 2 a 4).

Além disso, como microrganismos nos quais a habilidade de produção de L-cisteína é aumentada através da eliminação do sistema que age para decompor a L-cisteína, são conhecidos a bactéria corineforme ou a bactéria Escherichia na qual a atividade da cistationina-P-liase (documento de patente 2), triptofanase (documento de patente 5) ou O-acetilserina sulfidrilase B (documento de patente 6) é atenuada ou eliminada.

Alem disso, sabe-se que o gene ydeD codificando para a proteína YdeD participa na secreção de produtos metabólicos da via da L-cisteína (documento não de patente 1). Além disso, são também conhecidas técnicas para se aumentar a habilidade de produção da L-cisteína através do aumento da expressão do locus mar, locus emr, locus acr, locus cmr, gene mex, gene bmr oi gene gacA (documento de patente 7), ou dos genes emrAB, emrKY, yojIH, acrEF, bcr ou cusA (documento de patente 8), cujo código do genes/loci para proteínas é adequado para a secreção de uma substância citotóxica das células.

Além disso, como uma bactéria produtora de L-cisteína, é também conhecida a Escherichia coli, na qual a atividade do fator de controle transcripcional positivo do régulo de cisteína codificado pelo gene cysB é aumentada (documento de patente 9).

Alem disso, é conhecido um mutante serA codificando para 3-fosfoglicerato desidrogenase no qual a inibição de resposta pela serina é atenuada, e é sugerido o uso do mesmo para a produção de L-cisteína pela Escherichia coli (documentos de patente 10 e 11).

Apesar do yciW ser registrado na base de dados EcoCyc como um gene codificando para uma oxidoredutase prevista (documento não de patente 2), as funções reais do mesmo são desconhecidas, e não é conhecida a relação do mesmo com a produção de L-cisteína.

Além disso, apesar de ser relatado que o gene yciW é super-regulado pela eliminação da fonte de enxofre (documento não de patente 3), furfural (documento não de patente 4), e tensão oxidativa (documento não de patente 5), em todos os documentos ele é mencionado somente como um de um grande número de genes que mostram variação de expressão em experiências de micro-conjuntos, e não tem sido sugerida a relação do mesmo com a produção de L-cisteína.

Referências à técnica anterior Documentos de patente

Documento de patente 1: Patente japonesa em aberto (Kokai) nr 2002-233384
documento de patente 2: Patente japonesa em aberto (Kokai) nr. 11-155571
Documento de patente 3: Solicitação de patente americana publicada de número 20050112731
Documento de patente 4: Patente americana de número 6.218.168
Documento de patente 5: Patente japonesa em aberto (Kokai) número 2003 - 169668
Documento de patente 6: Patente japonesa em aberto (Kokai) n° 2005 -245311
Documento de patente 7: Patente Americana de número 5.972.663
Documento de patente 8: Patente japonesa em aberto (Kokai) de número 2005 - 287333
Documento de patente 9: Publicação de patente internacional WO 01/27307
Documento de patente 10: Patente americana de número 5.856.148
Documento de patente 11: Solicitação publicada de patente número 20050009162
Documentos não de patente
Documento não de patente 1: Dabler et al., Mol. Microbiol., 36, 1101-1112(2000)
Documento não de patente 2: BioCyc Home Page, Escherichia coli, Gene: K-12-substr. MG1655 :yciW [ pesquisado em 14 de outubro de 2009 ], Internet URL <http://biocyc.org/ECOLI/NEW IMAGE?type=GENE&obj ect=G6640>
Documento não de patente 3: Gyaneshwar, P. et al., J. Bacteriol., 187: 1074 - 1090 (2005)
Documento não de patente 4 : Elliot N., Miller, E.N., et al., Appl. Envir. Microbiol., 10.1128-/AEM.01187-09 (2009)
Documento não de patente 5: Wang, S. et al., Appl. Envir. Microbiol., 10.1128/AEM. 00914-09 (2009)

Descrição da invenção Objetivo a ser alcançado pela invenção

Um objetivo da presente invenção é produzir uma bactéria produtora de L-cisteína, e um método para a produção de L- cisteína, L-cistina, um derivado da mesma, ou uma mistura dos mesmos, pelo desenvolvimento de uma técnica nova para melhorar a habilidade de uma bactéria produtora de L-cisteína.

O inventor da presente invenção executou várias pesquisas para conseguir o objetivo mencionado anteriormente, e como resultado, descobriu que a habilidade de uma bactéria produtora de L-cisteína poderia ser aumentada modificando- se a bactéria de forma que é reduzida a atividade de uma proteína codificada pelo gene yciW, e portanto é completada a presente invenção.

Isto é, a presente invenção pode ser composta como se segue:
(1) uma bactéria que pertence à cepa Enterobacteriaceae, que tem a habilidade de produção de cisteína e é modificada de forma que a atividade de uma proteína codificada pelo gene yciW é reduzida.
(2) A bactéria, conforme mencionado acima, onde a atividade da proteína é reduzida pela redução da quantidade expressada do gene yciW, ou pelo rompimento do gene.
(3) A bactéria, conforme mencionado acima, onde a proteína é uma proteína definida nos seguintes ( A) ou (B):

(A) uma proteína tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2,
(B) uma proteína tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID: 2, mas incluindo a substituição, eliminação, inserção, ou adição de um ou vários resíduos de aminoácidos, nos quais a redução de atividade na bactéria resulta na melhoria da habilidade de produção de cisteína.

(4) a bactéria, conforme mencionado acima, onde o gene yciW é um DNA definido nos (a) ou (b) seguintes:

(a) um DNA constituído pela sequência de nucleotídeos das posições 301 a 1428 na sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1,
(b) Um DNA hibridizável com uma sequência complementar da sequência de nucleotídeos das posições 301 a 1428 na sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1 ou um sonda que pode ser preparado a partir da sequência de nucleotídeos sob condições rigorosas, e a codificação para uma proteína, cuja redução de atividade na bactéria resulta na melhoria da habilidade de produção de L-cisteína.

(5) A bactéria, conforme mencionado acima, que além disso tem pelo menos uma das seguintes características:

i) ela é modificada de forma que a atividade da serina acetiltransferase é aumentada,
ii) ela é modificada de forma que a expressão do gene ydeD é aumentada,
iii) ela é modificada de forma que a atividade de 3-fosfoglicerato desidrogenase é aumentada.

(6) A bactéria conforme mencionado acima, que é uma bactéria Escherichia.
(7) A bactéria conforme mencionado acima, que é a Escherichia coli.
(8) Um método para a produção de L-cisteína, L-cistina, um derivado das mesmas, ou uma mistura das mesmas, que é constituído pela cultura da bactéria conforme mencionado acima em um meio, e a coleta de L-cisteína ,L-cistina, um derivado das mesmas ou uma mistura das mesmas a partir do meio.
(9) O método conforme mencionado acima, onde o derivado de L-cisteína é um derivado de tiazolidina. Efeito da invenção

De acordo com a presente invenção, a habilidade de uma bactéria produtora de L-cisteína pode ser melhorada.

Alem disso, de acordo com a presente invenção, podem ser produzidas com eficiência a L-cisteína, L-cistina, um derivado das mesmas, ou uma mistura das mesmas.

Modos de execução da invenção <1> bactéria da presente invenção

A bactéria da presente invenção é uma bactéria que pertence à cepa Enterobacteriaceae, que tem a habilidade de produção de L-cisteína e é modificada de forma que a atividade da proteína codificada pelo gene yciW é reduzida. A habilidade de produção de L-cisteína referida aqui m significa uma habilidade da bactéria da presente invenção de produzir a L-cisteína em um meio ou nas células da bactéria e acumular a mesma em uma quantidade tal que a L-cisteína possa ser coletada do meio ou das células, quando a bactéria é culturada no meio. Uma bactéria tendo a habilidade de produção de L-cisteína significa uma bactéria que pode produzir e acumular L-cisteína em um meio em uma quantidade maior, comparada com uma cepa do tipo selvagem ou uma cepa parente, de preferência, uma bactéria que pode produzir e acumular L-cisteína em um meio em uma quantidade de 0,05 g/L ou mais, mais de preferência, 0,1 g/L ou mais, especialmente, de preferência, 0,2 g/L ou mais.

Uma porção de L-cisteína produzida pela bactéria pode ser convertida em L-cisteína no meio, pela formação de uma ligação de disulfeto. Além disso, a S-sulfocisteína pode ser gerada pela reação de cisteína e tiosulfato contido no meio ( Szczepkowski T. W., Nature, vol. 182 (1958)) conforme descrito posteriormente. Além disso, a cisteína gerada nas células bacterianas pode ser condensada com uma cetona ou aldeído, por exemplo, ácido pirúvico, que está presente nas células, para produzir um derivado de tiazolidina através de um hemitioquetal como um intermediário (fazer referência à patente japonesa de número 2992010). Estes derivados de tiazolidina e hemitioquetal podem existir como uma mistura equilibrada. Assim sendo, a habilidade de produção de cisteína não é limitada à habilidade de acumular somente cisteína em um meio ou em células, mas também inclui uma habilidade para acumular, alem de L-cisteína, a L-cistina, um derivado das mesmas como S-sulfocisteína, um derivado de tiazolidina, ou um hemitioquetal, ou uma mistura dos mesmos no meio. Além disso, a cisteína é usada como um material inicial na biossíntese de γ-glutamilcisteína, glutationa, cistationa, homocisteina, metionina, S-adenosilmetionina, e assim por diante. Assim sendo, usando- se uma bactéria tendo uma habilidade para produzir qualquer destes compostos, além da habilidade de produzir a L-cisteína, podem ser produzidos estes compostos. Assim sendo, a habilidade de produção de L-cisteína também incluiu uma habilidade para acumular outro composto a ser produzido através da L-cisteína.

A bactéria tendo a habilidade de produção de L-cisteína pode ter a habilidade inerente de produção de L-cisteína, ou ela pode ser obtida pela modificação de uma bactéria como aquelas descritas abaixo, por intermédio de mutagenese ou uma técnica de DNA recombinante de forma que ela adquira a habilidade de produção de L-cisteína. No caso da presente invenção, a não ser que seja mencionado especificamente, o termo L-cisteína pode ser usado para referir-se ao tipo L-cisteína, L-cistina reduzido, como um derivado conforme aqueles mencionados acima, ou uma mistura dos mesmos.

A bactéria usada para a presente invenção não é especialmente limitada, desde que a bactéria pertença à cepa Enterobacteriaceae como aquelas dos gêneros Escherichia, Enterobacter, Pantoea, Klebsiella, Serratia, Erwinia, Salmonella e Morganella, e tenha a habilidade de produzir um aminoácido L. Especificamente, podem ser usadas aquelas classificadas na cepa Enterobacteriaceae de acordo com a taxonomia usada no banco de dados da NCBI (National Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi7id = 91347) . Como uma cepa parente pertencendo à cepa Enterobacteriaceae usada para a modificação, é desejável utilizar-se, especialmente, uma bactéria do gênero Escherichia, Enterobacter, Pantoea, Erwinia, Enterobacter ou Klebsiella.

Apesar da bactéria Escherichia não ser especialmente limitada, podem ser usadas especificamente aquelas descritas no trabalho de Neidhardt et al. (Backmann B. J., 1996, Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, p. 2460 - 2488, Tabela 1, in F. D. Neidhardt (ed.), Escherichia coli and salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.). Entre elas, por exemplo, pode ser usada a Escherichia coli. Exemplos específicos de Escherichia coli incluem a Escherichia coli W3110 (ATCC 27325), Escherichia coli MG 1655 (ATCC 47076), e assim por diante, que são derivadas do protótipo da cepa do tipo selvagem, cepa K12.

Estas a cepas são disponíveis, por exemplo, da “American Type Culture Collection” (endereço: 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, P.O. Box 1549 ,Manassas, VA 20108, United States of America). Isto é, para cada cepa são dados números de registro, e as cepas podem ser encomendadas usando-se estes números de registro (fazer referência à http://www.atcc.org/). Os números de registro das cepas são listados no catálogo da “American Type Culture Collection”.

Exemplos da bactéria Enterobacter incluem Enterobacter agglomerans, Enterobacter aerogenes, e assim por diante, e exemplos da bactéria Pantoea incluem a Pantoea ananatis. Algumas Enterobacter agglomerans foram recentemente reclassificadas em Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis ou Pantoea stewartii com base na análise de sequência de nucleotídeos de 16s rRNA, etc. Na presente invenção, pode ser usada uma bactéria que pertence a qualquer dos gêneros Enterobacter ou Pantoea, desde que a bactéria seja classificada na cepa Enterobacteriaceae.

Especialmente, a bactéria Pantoea, a bactéria Erwinia, e a bactéria Enterobacter são bactérias classificadas como proteobactérias γ, e elas são taxonomicamente muito próximas umas das outras (J. Gen. Appl. Microbiol., Dec. 1997, 43,(6), 55-361: International Journal of Systematic Bacteriology, Oct. 1997, 1061-1067). Em anos recentes, algumas bactérias que pertencem ao gênero Enterobacter foram reclassificadas em Pantoea agglomerans, Pantoea dispersa, ou semelhantes, com base nas experiências de hibridização DNA-DNA, etc (International Journal of Systematic Bacteriology, July 1989, 39 (3), 337 - 345). Além disso, algumas bactérias que pertencem ao gênero Erwinia foram reclassificadas em Pantoea ananas ou Pantoea stewartii (fazer referência ao International Journal of Systematic Bacteriology, Jan. 1993, 43 (1), 162 - 173).

Exemplos de bactérias Enterobacter incluem Enterobacter agglomerans, Enterobacter aerogenes, e assim por diante. Especificamente, podem ser usadas as cepas exemplificadas na patente europeia em aberto de número 952221.

Uma cepa típica do gênero Enterobacter inclui a cepa Enterobacter agglomerans ATCC 12287.

Cepas típicas da bactéria Pantoea incluem a Pantoea ananatis, Pantoea stewartii, Pantoea agglomerans, e Pantoea citrea.

Exemplos específicos de pantoea ananatis incluem a cepa Pantoea ananatis AJ 13355 e a cepa SC17. A cepa SC17 é uma cepa escolhida como uma cepa mutante de produção de pouca flegma da cepa AJ13355 ((FERM BP-6614) isolada de detritos em Iwata-shi, Shizuoka-ken, Japão como uma cepa que pode proliferar em um meio de pH baixo contendo ácido L-glutâmico e uma fonte de carbono (patente Americana de número 6.596.517).

A cepa Pantoea ananatis AJ13355 foi depositada no “National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and industry” (atualmente, “National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary”, Endereço: Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japão) em 19 de fevereiro de 1998 e atribuído com um número de acesso FERM P-16644. A cepa foi então transferida para um depósito internacional, de acordo com o estipulado pelo Tratado de Budapeste em 11 de janeiro de 1999 e designado com um número de acesso FERM BP-6614. Esta cepa foi identificada como Enterobacter agglomerans quando ela foi isolada e depositada como a cepa Enterobacter agglomerans AJ13355. No entanto, a cepa foi recentemente reclassificada como Pantoea ananatis, com base na análise de sequência de nucleotídeos de 16S rNA, e assim por diante.

A cepa Pantoea ananatis SC17 foi depositada em 4 de fevereiro de 2009 no “National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depository” (Endereço: Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japão), e recebeu um número de acesso FERM BP-11091.

Exemplos de bactéria Erwinia incluem Erwinia amylovora e Erwinia carotovora, e exemplos da bactéria Klebsiella incluem a Klebsiella planticola.

Daqui por diante, são descritos os métodos para criar a habilidade de produção de L-cisteína em bactérias que pertencem à cepa Enterobacteriaceae, ou métodos para aumentar a habilidade de produção de L-cisteína por essas bactérias.

Para criar a habilidade de produção de L-cisteína em uma bactéria, podem ser usados métodos os usados convencionalmente na cultura da bactéria corineforme, bactéria Escherichia, e assim por diante. Tais métodos incluem a aquisição da cepa mutante auxotrófica, uma cepa resistente a análogo, ou uma cepa mutante de controle metabólico, ou a construção de uma cepa recombinante na qual uma enzima de biossíntese L-cisteína é superexpressada, e assim por diante (ver “Fermentação de aminoácido”, Gakkai Shuppan Center (Ltd.), 1st Edition, publicada em 30 de maio de 1986, pag. 77 -100). Na cultura da bactéria produtora de L-cisteína, podem ser criados um, dois, três ou mais tipos de propriedades descritas acima, tais como auxotrofla, resistência análoga, e mutação de controle metabólico. Além disso, a criação de tais propriedades, como auxotrofia, resistência a análogo, e mutação de controle metabólico, podem ser combinadas com a melhoria de uma enzima de biossíntese.

Uma cepa mutante auxotrófica, uma cepa resistente ao análogo de L-cisteína, ou uma cepa mutante de controle metabólico tendo a habilidade de produção de L-cisteína podem ser obtidas submetendo-se uma cepa parente ou uma cepa do tipo selvagem à metagênese convencional, como exposição a raios X ou irradiação UV, ou um tratamento com um mutageno como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) ou etil metanosulfonato (EMS), e então escolhendo uma cepa que exibe autotrofia, resistência análoga, ou uma mutação de controle metabólico tendo a habilidade de produção de L-aminoácido a partir das cepas mutantes obtidas.

A habilidade de produção de L-cisteína ou de uma bactéria, pode ser melhorada melhorando-se a atividade de uma enzima da via da biossíntese de L-cisteína ou de uma enzima envolvida na geração de um composto que age como um substrato na via, como L-serina, por exemplo, 3-fosfoglicerato desidrogenase e serina acetiltransferase. Como a 3-fosfoglicerato desidrogenase é inibida pela inibição da resposta pela serina, a atividade enzimática desta enzima pode ser aumentada pela incorporação de um gene mutante do tipo serA de codificação para uma 3-fosfoglicerato desidrogenase mutante na qual a inibição de resposta é atenuada ou é eliminada em uma bactéria.

Além disso, a serina acetiltransferase é inibida pela inibição de resposta pela L-cisteína. Assim sendo, a atividade enzimática desta enzima pode ser aumentada pela incorporação de um gene mutante do tipo cysE de codificação para uma serina acetiltransferase na qual a inibição de resposta é atenuada ou eliminada em uma bactéria.

A habilidade de produção de L-cisteína também pode ser aumentada aumentando-se a expressão dos genes ydeD de codificação para a proteínaYdeD (Dabler et al., Mol. Microbiol., 36, 1101-1112 (2000)) ou o gene yfiK de codificação para a proteína YfiK (patente japonesa em aberto (Kokai número 2004 - 49237 ).

Uma modalidade da bactéria da presente invenção é uma bactéria tendo pelo menos uma das seguintes características:

i) ela é modificada de forma que a atividade da serina acetiltransferase seja aumentada,
ii) ela é modificada de forma que a expressão do gene ydeD seja aumentada, e
iii) ela é modificada de forma que a atividade da 3-fosfoglicerato desidrogenase seja aumentada.

Além disso, a habilidade de produção de L-cisteína também pode ser melhorada aumentando-se a atividade do sistema de transporte de sulfato/tiosulfato. As proteínas do sistema de transporte de sulfato/tiosulfato são codificadas pelo aglomerado de genes cys PTWAM (patente japonesa em aberto (Kokai) de número 2005 - 137369, patente europeia de número 1528108).

A habilidade de produção de L-cisteína de uma bactéria também pode ser melhorada aumentando-se a expressão do gene yeaS (patente europeia em aberto de número 1016710).

Exemplos específicos de bactérias de produção de L-cisteína incluem, mas não são limitados a cepas que pertencem ao gênero Escherichia, tais como a cepa E. coli JM15 transformada com tipos múltiplos de alelos cysE de codificação de serina acetiltransferase (SAT) resistentes à inibição de resposta (patente americana de número 6.218.168), cepa E. coli W3110 tendo um gene sobre expressado de codificação de uma proteína adequada para a secreção de uma substância citotóxica (patente americana de número 5.972.663), cepa E. coli na qual a atividade da cisteína desulfidrase é reduzida (patente japonesa em aberto (Kokai) de número 11 - 155571), e cepas E. coli W3110 na qual a atividade do fator de controle transcricional positivo do regulon de cisteína codificado pelo gene cysB é aumentada (WO 01/27307), E. coli tendo o plasmídeo pACYC-DES (patente japonesa em aberto (Kokai) de número 2005 - 137369 (solicitação de patente americana publicada de número 2005 0124049 (A1), patente europeia em aberto de número 1528108 (A1))) contendo o gene ydeD, um gene cysE mutante, e um gene serA5 mutante, e assim por diante. O pACYC-DES é um plasmídeo obtido pela inserção dos três tipos de genes no pACYC184, e a expressão de cada um dos genes é controlada pelo promotor PompA.

Como proteínas tendo a atividade cisteína desulfidrase de E. coli, são conhecidas a cistationina-P-liase (produto metC, patente japonesa em aberto de número 11-155571, Chandra et al., Biochemistry, 21 (1982) 3064 - 3069) triptofanase (produto tnaA, patente japonesa em aberto (Kokai) de número 2003 - 169668, Austin Newton et al., J. Biol. Chem., 240 (1965 ) 1211 - 1218)), O-acetilserina sulfidrilase B (produto do gene cysM, patente japonesa em aberto (Kokai) de número 2005 - 245311), e o produto de gene malY (patente japonesa em aberto (Kokai) de número 2005 - 245311). Reduzindo-se as atividades destas proteínas, é melhorada a habilidade de produção de L-cisteína.

Na presente invenção, a bactéria produtora de L-cisteína, de preferência, tem um mutante SAT que é resistente à inibição de resposta. Como o mutante SAT que é derivado de Escherichia coli é resistente à inibição de resposta, são especificamente conhecidos o mutante SAT no qual o resíduo de metionina na posição 256 é substituído pelo resíduo de glutamato (patente japonesa em aberto de número 11 - 155571), ou mutante SAT no qual o resíduo de metionina na posição 256 é substituído pelo resíduo de isoleucina (Denk, D and Boeck, A., J. General Microbiol., 133, 515 - 525 (1987 )), o mutante SAT tendo uma mutação na região do resíduo de aminoácido na posição 97 pelo resíduo de aminoácido na posição 273 ou a eliminação da região terminal-C do resíduo de aminoácido na posição 227 (publicação de patente internacional WO 97/15.673, patente americana de número 6.218.168), o mutante SAT no qual a sequência de aminoácidos correspondente às posições 89 a 96 do SAT do tipo selvagem contém uma ou mais mutações, e o qual é desensibilizado em relação à inibição da resposta pela L-cisteína (solicitação de patente americana publicada de número 2005 -112731 (A1))), o mutante SAT no qual o resíduo Val e o resíduo ASP nas posições 95 e 96 SAT são substituídos com pelo resíduo Arg e o resíduo Pro, respectivamente (nome do gene mutante: cysE5, WO2005/007841), a mutação pela qual o resíduo de treonina na posição 167 é substituído pelo resíduo alanina (patente americana de número 6.218.168, solicitação publicada de patente americana de número 2005/0112731 (A1)), e assim por diante.

O gene SAT não é limitado ao gene de Escherichia coli, e pode ser usado qualquer gene de codificação para uma proteína tendo a atividade de SAT. Uma isozima SAT conhecida de Arabidopsis thaliana desensibilizado para a inibição de resposta por L-cisteína, e o gene de codificação desta isozima também pode ser usado (FEEMS Microbiol. Lett., 179, 453 -459(1999 )).

Se um gene codificando um mutante SAT é introduzido em uma bactéria, é criada a habilidade para a produção de L-cisteína.

Para a introdução de um gene em uma bactéria, podem ser utilizados vários vetores utilizados para a expressão usual de proteína. Exemplos desses vetores incluem pUC19, pUC18, pHSG299, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pBR322, pACYC184, pMW219, e assim por diante.

Para introduzir um vetor recombinante em uma bactéria, podem ser utilizados os métodos usualmente usados para a transformação de bactéria, como o método de D.A. Morrison (Methods in Enzymology, 68, 326 (1979 )), pode ser usado um método de tratamento de células recipientes com cloreto de cálcio, para aumentar a permeabilidade das células para DNA (Mandei, M. e Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)) e um método com base em eletroporação.

Além disso, a atividade de uma proteína como SAT também pode ser aumentada, aumentando-se o número de cópias de um gene codificando para a proteína. O número de cópias de um gene pode ser aumentado pela introdução do gene em uma bactéria usando-se um vetor como aqueles descritos acima, ou pela introdução de muitas cópias do gene no DNA cromossômico de uma bactéria. Muitas cópias do gene são introduzidas por recombinação homóloga usando-se a sequência atual sobre o DNA cromossômico em um número múltiplo de cópias como objetivo. Um DNA repetitivo ou o inverso repetido presente nas extremidades de um transposon pode ser usado como a sequência presente em um DNA cromossômico em um grande número de cópias. Altemativamente, conforme apresentado na patente japonesa em aberto (Kokai) de número 2-109985, podem ser introduzidas muitas cópias de um gene em um DNA cromossômico através da incorporação dos mesmos em um transposon e a transferência do mesmo.

A habilidade para produzir compostos bio-sintetisados a partir de L-cisteína como um material inicial, tais γ-glutamilcisteína, glutationa, cistationina, homocisteína, metionina, e S-adenosilmetionina, também podem ser criada ou melhorada através da melhoria da atividade de uma enzima da via de biossíntese de um composto objetivo, ou através da redução da atividade de uma enzima de uma via, criando ramificações a partir da via de biossíntese, de um composto objetivo, ou de uma enzima que decompõe o composto objetivo.

Por exemplo, a habilidade para produzir γ-glutamilcisteína pode ser aumentada aumentando-se a atividade da γ-glutamilcisteína sintetase, e/ou reduzindo-se a atividade da glutationa sintetase. Além disso, a habilidade para produzir glutationa pode ser criada ou melhorada melhorando-se a atividade da γ-glutamilcisteína sintetase e/ou a atividade da glutationa sintetase. Além disso, usando-se um mutante de γ-glutamilcisteína sintetase resistente à inibição da resposta pela glutationa, a habilidade de se produzir γ-glutamilciste- ína ou glutationa pode ser aumentada. A produção de glutationa é descrita em detalhes no artigo de Li et al. (Yin Li, Gongyuan Wei, Jian Chen, Appl. Microbiol. Biotechnol., 66:233-242 (2004).

A habilidade para produzir L-metionina pode ser criada ou aumentada pela criação de L-treonina auxotrofia ou resistência norleucina (patente japonesa em aberto (Kokai) de número 2000 - 139471). Na E. coli, os genes de enzimas envolvidas na biossíntese de L-treonina existem como treonina operon (thcABC), e uma cepa de L-treonina auxotrófica que perdeu a habilidade de biossíntese para a L-homoserina e os seguintes compostos podem ser obtidos, por exemplo, eliminando-se o radical thrBC. Em uma cepa resistente a norleucina, a atividade de S-adenosilmetionina sintetase é atenuada, e a habilidade para produzir L- metionina é criada ou aumentada. Na E. coli, a S-adenosilmetionina sintetase é codificada pelo gene metK .A habilidade para produzir L-metionina também pode ser criada ou aumentada eliminando-se o repressor de metionina ou melhorando-se a atividade de uma enzima envolvida na biossíntese de L-metionina, como homoserina transsuccinilase, cistationina γ-sintase e aspartoquinase-homoserina desidrogenase II (patente japonesa em aberto (Kokai) de número 2000 -139471). Na E. coli, o repressor de metionina é codificado pelo gene MetJ, a homoserina transsuccinilase é codificada pelo gene metA, a cistationina γ-sintase é codificada pelo gene metB, e a aspartoquinase- homoserina desidrogenase II é codificada pelo gene metL. Além disso, usando-se um mutante de homoserina transsuccinilase resistente à inibição de resposta pela L- metionina, a habilidade para produzir L-metionina também pode ser criada ou aumentada (patente japonesa em aberto (Kokai) de número 2000 -139471, a solicitação publicada de patente americana de número 20090029424).Como a L- metionina é bio-sintetisada através da L-cisteína como um intermediário, a habilidade para produzir L-metionina também pode ser melhorada, melhorando-se a habilidade de produção de L-cisteína (patente japonesa em aberto (Kokai) de número 2000 - 139471, solicitação publicada de patente americana de número 20080311632). Assim sendo, para se criar ou melhorar a habilidade de produção de L-metionina, é também efetivo criar-se ou melhorar-se a habilidade de produção de L-cisteína.

Exemplos específicos de bactérias de produção de L-metionina e cepas parentes usadas para a construção dos mesmos, incluem as cepas de E. coli como AJ11539 (NRRL B-12399), AJ11540 (NRRL B-12400), AJ11541 (NRRL B-12401), AJ11542 (NRRL B-12402) ( patente britânica de número 2075055), cepa 218 resistente a norleucina, que é um análogo de L-metionina (VKPMB-8125, patente russa de número 2209248), e a cepa 73 (VKPM, B-8126, patente russa de número 2215782).

Alem disso, como bactéria de produção de L-metionina ou de uma cepa parente para a construção da mesma, podem ser usadas a AJ13425 derivada de E. coli W3110 (FERM P-16808, patente japonesa em aberto (Kokai) de número 2000 - 139471).

A AJ13425 é uma cepa auxotrófica de L-treonina na qual é eliminado o repressor de metionina, é atenuada a atividade intracelular de S-adenosilmetionina, e são aumentadas as atividades intercelulares de homoserina transsuccinilase, cistationina γ-sintase, e a atividade da aspartoquinase-homoserina desidrogenase II. A AJ13425 foi depositada em 14 de maio de 1998 no “National Institute of Bioscience and Human Technology, Ministry of International Trade and Industry (atualmente, “National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depository, Endereço: Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japão), e recebeu urn número de acesso FERM P-16808.

Como a cistationina e a homocisteína são intermediários da via da biossíntese de L-metionina, é efetivo o uso parcial dos métodos mencionados anteriormente para melhorar a habilidade de produção de L-metionina, para aumentar a habilidade de produção destas substâncias. Como métodos específicos para o aumento da habilidade de produção de cistationina, é conhecido um método utilizando-se a cepa do mutante auxotrófico de metionina (solicitação de patente japonesa de número 2003 -010654) e um método de adição da cisteína (ou matéria-prima para a biossíntese da mesma) e/ou homoserina (ou matéria-prima para a biossíntese da mesma) para um meio de fermentação (patente japonesa em aberto (Kokai) de número 2005 - 168422). Como a homocisteína é produzida utilizando-se cistationina como um precursor, os métodos mencionados anteriormente para melhorar a habilidade de produção de cistationina também são efetivos para o aumento da habilidade para a produção de homocisteína.

Como L-metionina é o precursor de S-adenosilmetionina, para aumentar a habilidade de produção de L-L-adenosilmetionina, ela é efetiva para utilizar parcialmente os métodos mencionados anteriormente para o aumento da habilidade de produção de L-metionina. Por exemplo, a habilidade de produção de L-L-adenosilmetionina pode ser criada ou melhorada aprimorando a metionina adenosiltransferase (patente europeia em aberto de número 0647712 e 1457569) ou aumentando-se o fator de secreção MdfA (patente aAmericana de número 7.410.789).

A bactéria da presente invenção pode ser obtida por modificação de uma bactéria que pertence a cepa Enterobacteriaceae e tendo a habilidade de produção de L-cisteína, conforme mencionado acima, de forma que a atividade da proteína codificada pelo gene yciW (daqui por diante também referido como “YciW”) seja reduzida. Altemativamente, depois que uma bactéria que é modificada de forma que a atividade da proteína YciW seja reduzida, pode ser criada a habilidade de produção de L-cisteína.

O termo yciW é sinônimo de ECK 1282 e JW5200.

A expressão “a atividade da proteína codificada pelo gene yciW é reduzida” significa que aquela atividade da proteína YciW codificada pelo gene yciW é reduzida, comparada com aquela de uma cepa não modificada, como uma cepa do tipo selvagem ou uma cepa parente, e inclui quando a atividade desapareceu completamente.

Tal modificação em que a atividade do proteína YciW é reduzida, é obtida, por exemplo, reduzindo-se a expressão do gene yciW. Especificamente, por exemplo, a atividade intracelular da proteína pode ser reduzida eliminando-se uma parte ou toda a região de codificação do gene yciW sobre um cromossomo. A atividade da proteína YciW também pode ser reduzida pela redução da expressão do gene yciW, através da modificação de uma sequência de controle de expressão como o promotor e a sequência Shine-Dalgamo (SD) do gene yciW, e assim por diante. Além disso, a quantidade expressada do gene também pode ser reduzida modificando-se uma região de não translação diferente daquela da sequência de controle de expressão. Além disso, o gene inteiro, incluindo as sequências em ambos os lados do gene sobre um cromossomo, pode ser descartado. Além disso, isto também pode ser feito pela introdução de uma substituição de aminoácido (mutação não sinônima), um codom de parada (mutação sem sentido), ou uma mutação de troca de carcaça que adiciona ou elimina um ou dois nucleotídeos, na região de codificação do gene yciW em um cromossomo (Journal of Biological Chemistry, 272:8611 - 8617 (1997); “Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 95 5511 - 5515 (1998); Journal of Biological Chemistry, 266, 20.833 - 20.839 (1991)). Além disso, a expressão do gene também pode ser reduzida por manipulação de um fator envolvido no controle da expressão (moléculas pequenas envolvidas no controle de transcrição ou translação (indutor, inibidor, etc.), proteínas (fator de transcrição, etc.), ácidos nucleicos (sRNA, etc) e assim por diante).

Além disso, a modificação pode ser uma modificação causada por metagênese convencional baseada em irradiação por raios X ou ultravioleta ou o uso de um mutagene como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina, desde que ele seja uma modificação tal que a atividade da proteína YciW é reduzida.

Uma modificação de uma sequência de controle de expressão é executada, preferencialmente, para um ou mais nucleotídeos, mais de preferência, dois ou mais nucleotídeos, especialmente de preferência, três ou mais nucleotídeos. Quando uma região de codificação é eliminada, a região a ser eliminada pode ser qualquer de uma região N-terminus, uma região interna, ou uma região terminal-C, ou mesmo pode ser toda a região de codificação, desde que a função da proteína YciW seja reduzida ou eliminada. A eliminação de uma região mais longa usualmente pode inativar com mais certeza um gene. Além disso, é preferível que os quadros de leitura a montante e a jusante da região a ser eliminada não sejam os mesmos.

Além disso, uma modificação para reduzir a atividade da proteína YciW também pode ser executada através da inserção de outra sequência na região de codificação do gene yciW. Quando outra sequência é inserida na região de codificação do gene yciW, essa sequência pode ser inserida em qualquer região do gene, e a inserção de uma sequência mais longa pode inativar com mais certeza o gene. É preferível que os quadros de leitura a montante e a jusante do local da inserção não sejam os mesmos. A outra sequência não é especialmente limitada, desde que seja escolhida a sequência de cada inserção que reduz ou elimina função da proteína YciW proteína, e exemplos incluem um transposon contendo um gene de resistência antibiótica ou um gene útil para a produção de L-cisteína, e assim por diante.

O gene yciW no cromossomo pode ser modificado, conforme descrito acima, por exemplo, preparando-se um gene do tipo de eliminação no qual é eliminada uma sequência parcial do gene de forma que o gene do tipo de eliminação não produza a proteína YciW que funciona normalmente, e a transformação de uma bactéria com um gene do tipo de eliminação contendo DNA para provocar a recombinação homologa entre o gene do tipo de eliminação e o gene no cromossomo, e dessa forma substitui o gene do tipo de eliminação pelo gene no cromossomo. A proteína YciW codificada pelo gene do tipo de eliminação tem uma conformação diferente daquela da proteína do tipo selvagem, se ela é mesmo produzida, e portanto a função é reduzida ou é eliminada. Tal rompimento do gene com base na substituição do gene utilizando recombinação homologa já foi estabelecida, e existe um método chamado de “Integração acionada por vermelho” (Datsenko, K. A., and Wanner, B. L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 6640 - 6645 (2000)), um método usando um DNA linear como o método que utiliza o “Red driven integration” em combinação com um sistema de excisão derivado de um fágio λ (Cho, E.H., Gumport, R.I., Gardner, J.F., J.Bacteriol., 184: 5200 -5203)) (fazer referência à WO 2005/010175), um método que utiliza um plasmídeo contendo uma origem de replicação sensível a temperatura, um método usando um plasmídeo capaz de transferência conjugativa, um método que utiliza um vetor suicida não tendo origem de replicação em um hospedeiro (patente americana de número 6.303.383, patente japonesa em aberto número 05-007491), e assim por diante.

A redução da quantidade de transcrição do gene yciW pode ser confirmada por comparação da quantidade de mRNA transcrita do gene com aquela observada em uma cepa do tipo selvagem ou uma cepa não modificada. Exemplos do método para a avaliação da quantidade de mRNA incluem a hibridização nortista, RT-PCR (clonagem molecular, Cold Spring Elarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, USA, 2001), e assim por diante.

A redução da quantidade de proteína YciW pode ser confirmada pelo “Western blotting” usando anticorpos (clonagem molecular, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, USA, 2001).

O gene yciW da cepa Escherichia coli K12 corresponde a uma sequência complementar da sequência nas posições 1347004 a 1348131 na sequência do genoma registrada no banco de dados NCBI como acesso Genbank NC 000913 (VERSÃO NC 000913.2 GI: 49175990). A proteína YciW também está registrada como acesso GenBank NP 415803 (versão NP 415803.2GI: 90111242, locus taq =“bl287”). A sequência de nucleotídeos contendo o gene yciW, e 300 bp das regiões a montante e a jusante do mesmo, e a sequência de aminoácidos codificada por este gene, são mostrados como SEQ ID NOS: 1 e 2, respectivamente.

Como a sequência de nucleotídeos dos genes yciW pode ser diferente, dependendo do gênero, espécies, ou cepas a qual pertence a bactéria, o gene yciW a ser modificado pode ser uma variante da sequência de nucleotídeos das posições 301 a 1428 na sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1. Uma variante do gene yciW pode ser pesquisada usando-se BLAST (http://blast.genoma.jp/) ou semelhante com referência à sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:l. Além disso, a variante do gene yciW inclui homólogos dos genes, como genes que podem ser amplificados por PCR usando, por exemplo, um cromossomo de tal microrganismo como bactéria que pertence à cepa de bactérias Enterobacteriaceae e coryneform como um gabarito e oligonucleotídeos sintéticos preparados com base na sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1.

Exemplos de homólogos do gene yciW de bactérias diferentes de Escherichia coli incluem os genes yciW das seguintes bactérias. Na tabela 1, Identidade (%) indica a identidade entre a proteína YciW da cepa Kl2 de Escherichia coli e o homólogo de cada bactéria determinado por BLAST. Os números de acesso são os números de acesso do banco de dados NCBI.

O gene yciW também pode ser um gene de codificação para uma proteína tendo a sequencia de aminoácido de proteína YciW conforme mencionado acima, mas incluindo a substituição, eliminação, inserção, adição, ou semelhante, de um ou vários resíduos de aminoácido em uma ou várias posições, desde que ele modifique a proteína, cuja redução de atividade na bactéria resulta em melhoria da habilidade de produção de L-cisteína. Apesar do significado do número pelo termo “um ou vários” poder ser diferente, dependendo das posições dos resíduos de aminoácidos na estrutura de três dimensões da proteína ou dos tipos de resíduos de aminoácidos, especificamente, é preferível que sejam, 1 a 20, mais de preferência, 1 a 10, ainda mais de preferência, 1 a 5. A substituição, eliminação, inserção, ou adição de um ou vários resíduos de aminoácidos acima é uma mutação conservativa que mantém uma função normal da proteína. A mutação conservativa tipicamente é uma substituição conservativa. A substituição conservativa é uma mutação onde a substituição acontece mutuamente entre Phe, Trp e Tyr, se o sítio de substituição é um aminoácido aromático; entre Leu, Ile e Vai, se ele é um aminoácido hidrófobo; entre Gin e Asn, se ele é um aminoácido polar; entre Lys, Arg e HBis, se eles são um aminoácido básico; entre Asp e Glu, se ele é um aminoácido acidulado; e entre Ser e Thr, se ele é um aminoácido tendo um grupo hidroxila. Exemplos específicos de substituições conservativas incluem: substituição de Ser ou Thr por Ala; substituição de Gln, His ou Lys por Arg; substituição de Glu, Gln, Lys, His ou Asp por Asn; substituição de Asn, Glu, ou Gln por Asp; substituição de Ser ou Ala por Cys; substituição de Asn, Glu, Lys, His, Asp ou Arg por Gln; substituição de Gly, AsnGln, Lys ou Asp por Glu; substituição de Pro por Gly; substituição de Asn, Lys, Gln, Arg ou Tyr por His; substituição de Leu, Met Val ou Phe por Ile; substituição a de Ile, Met, Val ou Phe por Leu; substituição de Asn, Glu, Gln, His ou Arg por Lys; substituição de Ile, Leu, Val ou Phe por Met; substituição de Trp, Tyr, Met, Ile ou Leu por Phe; substituição de Thr ou Ala por Ser; substituição de Ser ou Ala por Thr; substituição de Phe ou Tyr por Trp; substituição de His, Phe ou Trp por Tyr; e substituição de Met, Ile ou Leu por Val. A substituição, eliminação, inserção, adição, inversão, etc, mencionados acima podem ser o resultado de mutação por ocorrência natural (mutante ou variante) devido a uma diferença individual, uma diferença de espécies, ou semelhante, de uma bactéria do qual o gene é derivado.

Alem disso, o gene yciW pode ser um DNA que é capaz de hibridizar com um sonda que pode ser preparado a partir de uma sequência conhecida de gene, como a sequência de gene mencionada inicialmente ou uma sequência complementar da mesma, sob condições rigorosas, e códigos para uma proteína tendo uma função equivalente àquela da proteína YciW. As “condições rigorosas” referem-se às condições nas quais é formado o assim chamado híbrido específico. Exemplos de condições rigorosas incluem aquelas nas quais DNAs altamente homólogos hibridizam uns com os outros, por exemplo, DNAs não menos do que 80% homólogos, de preferência, não menos de 90% homólogos, mais de preferência, não menos do que 95% homólogos, ainda mais de preferência, não menos do que 97% homólogos, especialmente, de preferência, não menos do que 99% homólogos, hibridizam uns com os outros, e DNAs menos homólogos do que os acima não hibridizam uns com os outros, ou as condições de lavagem de hibridização sulina típica, i.e., condições de lavagem uma vez, de preferência, duas ou três vezes, em uma concentração salina e temperatura correspondente à 1 x SSC, 0,1% SDS a 60°C, de preferência, 0,1 x SSC, 0,1% SDS a 60°C, mais de preferência, 0,1 x SSC, 0,1% SDS a 68°C.

A sonda pode ser uma parte de uma sequência complementar no gene. Tal sonda pode ser preparada por PCR usando-se oligonucleotídeos preparados com base em uma sequência de genes conhecida como iniciadores e um fragmento de DNA contendo a sequência de nucleotídeos como um gabarito. Por exemplo, quando um fragmento de DNA tendo um comprimento de cerca de 300 bp é usado como A sonda, as condições de lavagem da hibridização podem ser, por exemplo,50°C, 2 x SSC e 0,1 %SDS.

A explicação mencionada anteriormente das variantes dos genes e proteínas são também aplicadas da mesma forma em enzimas, tais como serina acetiltransferase e 3-fosfoglicerato desidrogenase e a proteína YdeD, assim como os códigos de genes para os mesmos.

Método para a produção de L-cisteína, L-cistina, derivado dos mesmos, ou misturas dos mesmos da presente invenção.

Fazendo-se a cultura da bactéria da presente invenção obtida conforme descrito acima em um meio e coletando-se a L- cisteína ,L-cistina, um derivado das mesmas, ou uma mistura das mesmas do meio, estes compostos podem ser produzidos. Exemplos de derivados de L-cisteína incluem S-sulfocisteína, derivados de tiazolidina, hemitioquetais que correspondem aos derivados de tiazolidina, e assim por diante, conforme mencionado acima, γ-glutamilcisteína, glutationa, cistationa, homocisteína, metionina, S-adenosilmetionina, e assim por diante, que são biossintetisados a partir de L-cisteína como o material inicial, também podem ser produzidos da mesma forma.

Podem ser mencionados como o meio a ser usado, um meio normal contendo uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, uma fonte de enxofre, íons, e outros componentes orgânicos, conforme sejam requeridos.

Como a fonte de carbono, podem ser utilizados sacarídeos, como glicose, frutose, sacarose, melaços, e hidrolizado de amido, e ácidos orgânicos, tais como o ácido fumárico, o ácido cítrico, e o ácido succínico.

Como a fonte de nitrogênio, podem ser usados sais de amónio inorgânicos, tais como sulfato de amônio, cloreto de amônio, e fosfato de amônio, nitrogênio orgânico como hidrolizado de soja, gás de amônia, amônia aquosa, e assim por diante.

Como a fonte de enxofre, podem ser mencionados os compostos de enxofre inorgânicos, como sulfatos, sulfitos, sulfetos, hiposulfitos, e tiosulfatos.

Como nutrientes em quantidades de traços orgânicos, é desejável adicionar-se as substâncias requeridas, como vitamina B1, extrato de levedo, e assim por diante, em quantidades apropriadas. Além destes, fosfato de potássio, sulfato de magnésio, íons de ferro, íons de manganês, e assim por diante, são adicionados em pequenas quantidades conforme o requerido.

A cultura, de preferência, é feita sob condições aeróbicas durante 30 a 90h. A temperatura da cultura, de preferência, é controlada para ser de 25°C a 37°C, e o pH, de preferência, é controlado para ser 5 a 8 durante a cultura. Para o ajuste de pH, podem ser usadas substâncias inorgânicas ou orgânicas aciduladas ou alcalinas, gás de amônia, e assim por diante. A coleta de L-cisteína do mosto da cultura pode ser feita por uma combinação de método de resina de troca de íons comum, precipitação, e outros métodos conhecidos.

A L-cisteína obtida conforme descrito acima pode ser usada para a produção de derivados de L-cisteína. Os derivados de L-cisteína incluem metilcisteína, etilcisteína, carbocisteína, sulfocisteína, acetilcisteína, e assim por diante.

Alem disso, quando um derivado de tiazolidina de L- cisteína é acumulado no meio, a L-cisteína pode ser produzida coletando-se o derivado de tiazolidina do meio e quebrando-se o equilíbrio da reação entre o derivado de tiazolidina e L-cisteína, de forma que a L-cisteína seja produzida em excesso.

Alem disso, quando a S-sulfocisteína é acumulada no meio, ela pode ser convertida em L-cisteína por redução, utilizando-se um agente redutor como ditiotreitol.

Exemplo

Daqui por diante, a presente invenção será explicada mais especificamente com referência a um exemplo.

1) Construção da cepa deficiente no gene yciW

A eliminação do yciW foi feita pelo método chamado de “Integração acionada por vermelho”, desenvolvido primeiramente por Datsenko e Wanner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, No. 12, pp. 6640 - 6645). De acordo com o método “Integração acionada por vermelho”, utilizando-se um produto PCR obtido com oligonucleotídeos sintéticos nos quais uma parte de um gene visado é designada no lado 5', e uma parte do gene de resistência a antibióticos é designada no lado 3', respectivamente, como iniciadores, uma cepa com gene rompido pode ser construída em uma etapa. Um método para a eliminação de um gene de E. coli usando este “Integração acionada por vermelho” e o sistema de excisão derivado do fago λ é descrito em detalhes na patente japonesa em aberto (Kokai) nr. 2005-058227 (solicitação publicada de patente americana de número 2006154344), WO2007/119880A1, e assim por diante. Uma cepa deficiente em gene yciW foi obtida pelo mesmo método que estes métodos.

Um fragmento de DNA que é composto por sequências de homólogos de ambas as extremidades dos genes yciW e um gene de resistência a antibiótico (gene de resistência a Canamicina (Kmr)) entre os mesmos foi obtido por PCR. Os métodos experimentais e os materiais específicos são os mesmos descritos na patente japonesa em aberto (Kokai) de número 2005 -058227 (solicitação publicada de patente americana de número 2006154344) exceto que DyciWec-FW (SEQ ID NO: 3, ATGGAACAACGCCACATCACCGGCAAAAGCCACTGGTATCATGAAACGCATGAAGCCTGCTTTTTTATACTAAGTTGGCA), E DyciWec-RV (SEQ ID NO: 4, CCCATTGGTTAATTTCATTTTCGCCCTTGCGCATAAGGGTGCTGATTTTTCGCTCAAGTTAGTATAAAAAAGCTGAACGA) foram usados como a “INICIADORES”, e um fragmento e de DNA contendo oVattL-Kmr-VattR) (WO 2006/09 3322 A2) foi usados como iniciadores, e um fragmento de DNA contendo a sequencia λattL-Kmr-λattR derivada de pMWl 18-(λattL-Kmr-λttR) (WO2006/093322A2) foi usada como um gabarito.

Por este método, uma cepa deficiente no gene yciW, MG 1655△yciW::Kmr, foi obtida da cepa de E. coli MG1655 (ATCC 47076).

Alem disso, o gene Kmr incorporado na cepa com gene yciW rompido pode ser removido usando-se o sistema de excisão derivado do fago λ.

(2) Construção da bactéria produtora de L-cisteína.

pACYC-DES, um plasmídeo sozinho no qual um mutante CysE de codificação para um mutante de serina acetiltransferase do qual foi reduzida a inibição de resposta pela L-cisteína (solicitação publicada de patente americana de número 20050112731 (A1)), o código do gene ydeD para um fator de secreção de L-cisteína (patente americana de número 5.972.663), e o código do mutante de gene serA para 3-fosfoglicerato desidrogenase do qual foi reduzida a inibição de resposta pela L-serina (patente americana de número 6.180.373) foram integrados, foi introduzida na cepa de E. coli MG 1655 e das cepas MG 1655 DyciW::Kmr. No mutante mencionado inicialmente de serina acetiltransferase, o resíduo de treonina na posição 167 foi substituído pelo resíduo de alanina. Além disso, na 3-fosfoglicerato desidrogenase mencionada inicialmente, foi eliminado o resíduo de tirosina na posição 410. A construção de pACYS-DES é descrita na patente japonesa em aberto (Kokai) de número 2005 - 137369 (solicitação publicada de patente americana de número 20050124049 (A1), patente europeia em aberto de número 1528108 (A1)).

(3) Cultura de produção de L-cisteína

Para investigar o efeito da eliminação do gene yciW na produção de L-cisteína e compostos relacionados à L- cisteína por fermentação, a bactéria de E. coli de produção de L-cisteína mencionada inicialmente, MG 1655/pACYS-DES e MG 1655DyciW::Kmr/pACYC-DES (deficiente em yciW), foram culturadas para a produção por fermentação, e foram comparadas as quantidades de produção de L-cisteína e de compostos relacionados com L-cisteína. Para a cultura, foi utilizado um meio de produção de cisteína tendo a seguinte composição. Como fonte de enxofre para a produção de L-cisteína, foram utilizados sulfato (sulfato de amônio) e tiosulfato (tiosulfato de sódio). A cultura que usava somente o sulfato foi feita sem a adição do componente 6 (tiosulfato de sódio) mencionado na seguinte composição do meio. Além disso, a cultura usando o tiosulfato foi feita usando-se todos os componentes seguintes do meio.

[Meio de produção de L-cisteína] (as concentrações dos componentes são as concentrações finais)
Componente 1:
(NH4)2SO4 15 g/l
KH2PO4 1,5 g/l
MgSO4.7H2O 1 g/l
Cloridrato de tiamina 0,1 mg/l
Componente 2:
FeSO4.7H2O 1,7 mg/l
Na2MoO4.2H2O 0,15 mg/l
CoC12.6H2O 0,7 mg/l
MnC1.4H2O 1,6 mg/l
ZnSO4.7H2O 0,3 mg/l
CuSO4.5H2O 0,25 mg/l
Componente 3:
Triptona 0,6 g/l
Extrato de levedo 0,3 g/l
NaCl 0,6 g/l
Componente 4:
Carbonato de cálcio 20 g/l
Componente 5:
Monoidrato de cloridratos de histidina-L 135 mg/l
Componente 6:
Tiosulfato de sódio 4 g/l
Componente 7:
cloridrato de piridoxina 2 mg/l
Componente 8:
glicose 40 g/l

Para estes componentes, foram preparadas soluções de estoque com concentração dez vezes maior (Componente 1), concentração 1000 vezes maior (Componente 2), concentração 100/6 vezes maior (Componente 3), concentração 100 vezes maior (Componente 5), concentração 350/4 vezes maior (Componente 6), concentração 1000 vezes maior (Componentes 7), e concentração dez vezes maior (Componente 8), e eles foram misturados no momento do uso, e o volume definido foi obtido com água esterilizada para se atingir as concentrações finais. A esterilização foi executada por autoclave a 110°C durante 30 minutos (Componentes 1, 2, 3, 5, e 8), esterilização por calor a seco a 180°C durante 5h ou mais tempo (Componente 4), ou esterilização por filtro (Componentes 6 e 7).

A cultura da produção de L-cisteína foi executada como se segue. Cada cepa da produção foi espalhada no meio de agar LB para a execução da pré-cultura durante a noite a 37°C., e então as células correspondendo a cerca de 7 cm no prato foram raspadas com uma alça de inoculação com tamanho de 10 microlitros (alça azul NUNC) três vezes (três alças), e inoculadas em 2 ml de meio de produção de L- cisteína contido em um tubo de teste grande (diâmetro interno: 23 mm, comprimento: 20 cm) para produzir quantidades de células para ambas as cepas que no momento do início da cultura eram substancialmente as mesmas. A cultura foi executada a 32°C com agitação, e terminada depois de 25h. A L-cisteína (incluindo compostos relacionados com L cisteína) produzida no meio foi quantificada pelo método descrito por Gaitonde, M.K. (Biochem. J., 104 (2): 627 -33, agosto de 1967). A experiência foi executada quatro vezes para cada cepa, e as quantidades produzidas de L-cisteína (médias) e desvios standard, e os rendimentos de L-cisteína para a glicose consumida são mostrados na Tabela 2. Na Tabela 2, a cepa do tipo selvagem significa a cepa MG1655/pACYC-DES, e a cepa de eliminação de yciW significa a cepa MG1655DuciW::Kmr/pACYC-DES. Foi revelado que a eliminação do gene yciW tinha um efeito de aumentar o acúmulo de L-cisteína para ambas as fontes de enxofre.

Claims

Método para produção de L-cisteína, L-cistina, um derivado das mesmas, ou uma mistura das mesmas, caracterizado pelo fato de que compreende:
cultivar uma bactéria pertencente à família Enterobacteriaceae; e
coletar L-cisteína, L-cistina, um derivado das mesmas, ou uma mistura das mesmas do meio,
em que a bactéria possui a habilidade de produção de L-cisteína,
em que a bactéria é modificada de maneira que a atividade da proteína YciW é reduzida pelo rompimento do gene yciW, e
em que a bactéria é uma bactéria Escherichia.
Método de acordo com as reivindicações 1, caracterizado pelo fato de que a proteína YciW é uma proteína tendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO:2.
Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato do gene yciW ser um DNA compreendendo a sequência de nucleotídeos das posições 301 a 1428 na sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1.
Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a bactéria possui ainda pelo menos uma das seguintes características:
- i) ela é modificada de forma que a atividade da serina-acetil-transferase é aumentada a partir da inativação/atenuação do gene cysE mutante que apresenta uma substituição do resíduo de treonina, na posição 167, por um resíduo de alanina,
- ii) ela é modificada de forma que a expressão do gene ydeD é aumentada,
- iii) ela é modificada de forma que a atividade da 3-fosfoglicerato-desidrogenase é aumentada a partir da inativação/atenuação do gene serA mutante em que o resíduo de tirosina, na posição 410, foi deletado.
Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a bactéria é a Escherichia coli.
Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o derivado de L-cisteína é um derivado de tiazolidina.