CN104884609A - 重组细胞、以及异戊二烯的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明要解决的问题在于,提供一种用于由甲醇等生产异戊二烯的一系列的技术。提供一种重组细胞,其通过将编码异戊二烯合成酶的基因导入作为甲基营养菌的宿主细胞中而得到,该基因在所述宿主细胞内表达,所述重组细胞能够由选自甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛及甲酰胺中的至少1种C1化合物生产异戊二烯。作为甲醛的固定化途径,优选选自丝氨酸途径、核酮糖单磷酸途径及木酮糖单磷酸途径中的至少1种C1碳同化途径。也提供一种使用了该重组细胞的异戊二烯的生产方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种能够由甲醇等生产异戊二烯的重组细胞、及使用该重组细胞的异戊二烯的生产方法。
背景技术
异戊二烯为合成聚异戊二烯的单体原料,特别是在轮胎业界中为重要的原材料。近年来,由依赖于石油的基础化学品的生产工艺向来自植物资源等可再生资源的生产工艺转换的技术的开发和实用化正在平稳地进行。关于异戊二烯,例如已知有以糖为原料的重组大肠杆菌的生产技术(专利文献1、2、非专利文献1)。
另一方面,在C1化合物中,甲醇由合成气体等廉价地制造,所述合成气体为由天然气体及生物质或城市垃圾等废弃物得到的一氧化碳、二氧化碳及氢的混合气体。天然气体在化石资源中也大量地存在,且CO2的产生量比较少,因此,作为新一代能量源备受关注,由现有的石油向天然气体的转移正在进行。甲醇在水中为可溶等、操作或贮藏容易、而且作为微生物培养的碳源也适合。
甲基营养菌(Methylotroph)是指将分子内不具有C-C键的碳化合物、例如甲烷、甲醇、甲胺、二甲胺、三甲胺等用作唯一的碳源、能量源的C1化合物利用性微生物的总称名。被称为甲烷氧化菌(Methanotroph)、甲烷氧化细菌、甲醇利用性细菌、甲醇利用性酵母、甲醇利用性微生物等的微生物全部属于甲基营养菌。
甲基营养菌在将甲醇转变为甲醛之后,进行以将甲醛转变为具有C-C键的有机物的反应为主的代谢。如图1所示,作为经由甲醛的碳同化代谢途径,已知有丝氨酸途径、核酮糖单磷酸途径(RuMP途径)及木酮糖单磷酸途径(XuMP途径)。被分类为细菌的甲基营养菌(甲基营养菌细菌)具有丝氨酸循环或RuMP途径。另一方面,被分类为酵母的甲基营养菌(甲基营养菌酵母)具有XuMP途径。
另外,甲基营养菌细菌根据甲醇要求性的不同,被分类为专性甲基营养菌(obligate methylotroph)和可以利用其它碳化合物的兼性甲基营养菌(facultative methylotroph)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开第2009/076676号
专利文献2:国际公开第2009/132220号
非专利文献
非专利文献1:Yang J.,et al.,PLoSOne 2012,7(4),e33509
发明内容
发明所要解决的问题
关于来自可再生资源的生产工艺,其现有技术的大部分包含上述异戊二烯生产技术,是依赖于有机物、特别是糖、甘油或油成分等并利用微生物的生产方法。但是,为了供应来自石油的众多的基础化学品的世界生产量,就来自植物资源等的、现状可使用的糖质、甘油或油成分的量而言,作为微生物的碳源必定不足。即,依赖于糖质或油成分的、利用微生物的基础化学品的生产量在将来也是有限的。另外,这种工艺也有可能产生与食物的竞争。
作为上述甲基营养菌的应用例,可列举来自甲醇的SCP(单细胞蛋白(single cell protein))、生物分解性塑料、氨基酸等的生产技术。但是,还没有出现被应用于制造异戊二烯等来自石油的基础化学品的例子。如上所述,通用高分子材料制品中使用的单体化合物目前全部依赖于石油,永久且廉价地供给与目前的石油品质相同的石油的可能性非常低,当务之急是开发新的有效的代替工艺。需要说明的是,在确保用于利用微生物生产化学品的碳源的目的下,也正在研究对含有纤维素、半纤维素及木质素等的硬生物质进行糖化的技术,但需要用于糖化的酶处理等,在成本方面存在很大的问题。
鉴于上述现状,本发明的目的在于,提供一种用于由甲醇等生产异戊二烯的一系列的技术。
用于解决问题的技术方案
用于解决上述的问题的本发明的1个方式为一种重组细胞,其通过将编码异戊二烯合成酶的基因导入宿主细胞中而得到,所述宿主细胞为甲基营养菌,该基因在所述宿主细胞内表达,所述重组细胞能够由选自甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛及甲酰胺中的至少1种C1化合物生产异戊二烯。
异戊二烯合成酶(异戊二烯合成酶,isoprene synthase)具有将作为异戊烯基二磷酸(IPP)的异构体即二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)转变为异戊二烯的作用。异戊烯基二磷酸和二甲基烯丙基二磷酸间的结构转变中异戊烯基二磷酸异构酶进行催化。异戊烯基二磷酸异构酶存在于全部的生物中。
而且,本方式的重组细胞,是通过将编码异戊二烯合成酶的基因导入宿主细胞中而得到,所述宿主细胞为甲基营养菌,且该基因在所述宿主细胞内表达。而且,能够由选自甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛及甲酰胺中的至少1种C1化合物生产异戊二烯。本方式的重组细胞可以将在细胞内合成的二甲基烯丙基二磷酸及异戊烯基二磷酸通过异戊二烯合成酶的作用转变为异戊二烯。即,根据本方式的重组细胞,可以由所述的C1化合物生产异戊二烯。
优选作为甲醛的固定化途径,包括选自丝氨酸途径、核酮糖单磷酸途径及木酮糖单磷酸途径中的至少1种C1碳同化途径。
优选进一步导入编码3-己酮糖-6-磷酸合成酶的基因和编码6-磷酸-3-己酮糖异构酶的基因,该基因在宿主细胞内表达。
根据所述的构成,基于核酮糖单磷酸途径的甲醛固定化能力被赋予或增强。
优选所述宿主细胞为细菌或酵母。
优选所述酵母毕赤酵母(Pichia)属、汉逊(Hansenula)酵母属或假丝酵母菌(Candida)属。
用于解决同样问题的本发明的其它方式为一种重组细胞,其通过将下列基因导入宿主细胞中而得到:赋予将甲醇和/或甲酸转变为甲醛的功能的基因、赋予甲醛固定化能力的基因和编码异戊二烯合成酶的基因,该基因在宿主细胞内表达,所述重组细胞能够由选自甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛及甲酰胺中的至少1种C1化合物生产异戊二烯。
本方式的重组细胞通过将“赋予将甲醇和/或甲酸转变为甲醛的功能的基因”、“赋予甲醛固定化能力的基因”及“编码异戊二烯合成酶的基因”导入宿主细胞中而得到,这些基因在宿主细胞内表达。而且,能够由选自甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛及甲酰胺中的至少1种C1化合物生产异戊二烯。
即,由于本方式的重组细胞导入了“赋予将甲醇和/或甲酸转变为甲醛的功能的基因”和“赋予甲醛固定化能力的基因”,因此,具有与甲基营养菌同样的特性。而且,由于导入有“编码异戊二烯合成酶的基因”,因此,可以在细胞内表达异戊二烯合成酶。其结果,可以将在细胞内合成的异戊烯基二磷酸转变为异戊二烯。即,利用本方式的重组细胞,可以由所述的C1化合物生产异戊二烯。
优选作为甲醛的固定化途径,包括选自丝氨酸途径、核酮糖单磷酸途径及木酮糖单磷酸途径中的至少1种C1碳同化途径。
解决用于同样问题的本发明的其它方式为一种重组细胞,其通过将下列基因导入具有核酮糖单磷酸途径的宿主细胞中:赋予将甲醇和/或甲酸转变为甲醛的功能的基因和编码异戊二烯合成酶的基因,该基因在宿主细胞内表达,所述重组细胞能够由选自甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛及甲酰胺中的至少1种C1化合物生产异戊二烯。
本方式相当于例如具有核酮糖单磷酸途径的非甲基营养菌为宿主细胞的实施方式。
优选赋予将甲醇转变为甲醛的功能的基因为编码甲醇脱氢酶或醇氧化酶的基因,赋予将甲酸转变为甲醛的功能的基因为编码甲醛脱氢酶的基因。
甲醇脱氢酶(methanol dehydrogenase)和醇脱氢酶(alcoholdehy drogenase)均具有使甲醇转变为甲醛的作用。另外,甲醛脱氢酶(formaldehydedehydrogenase)具有使甲酸转变为甲醛的作用。这些酶均为属于细菌的甲基营养菌中的甲烷代谢酶之一。另一方面,属于酵母的甲基营养菌不具有甲烷氧化活性,具有通过醇氧化酶(Alcohol oxidase)使甲醇转变为甲醛的作用。酵母也具有将甲酸转变为甲醛的酶活性。
优选进一步导入赋予将甲烷转变为甲醇的功能的基因,该基因在宿主细胞内表达。
优选赋予将甲烷转变为甲醇的功能的基因为编码甲烷单加氧酶的基因。
甲烷单加氧酶(methane monooxygenase)具有将甲烷转变为甲醇的作用。甲烷单加氧酶为甲基营养菌中的甲烷代谢酶之一。
优选进一步导入编码3-己酮糖-6-磷酸合成酶的基因和编码6-磷酸-3-己酮糖异构酶的基因,该基因在宿主细胞内表达。
优选所述宿主细胞为细菌或酵母。
优选宿主细胞具有基于甲羟戊酸途径的异戊烯基二磷酸合成能力,所述重组细胞进一步导入编码在甲羟戊酸途径中发挥作用的至少1种酶的基因、和/或编码在非甲羟戊酸途径中发挥作用的酶群的基因,该基因在宿主细胞内表达。
根据所述的构成,作为DMAPP供给源的IPP的合成能力增强,有效地进行IPP及DMAPP的供给。其结果,本方式的重组细胞成为异戊二烯生产能力更高的重组细胞。
优选编码在甲羟戊酸途径中发挥作用的至少1种酶的基因来自放线菌。
优选宿主细胞具有基于非甲羟戊酸途径的异戊烯基二磷酸合成能力,进一步导入编码在甲羟戊酸途径中发挥作用的酶群的基因、和/或编码在非甲羟戊酸途径中发挥作用的至少1种酶的基因,该基因在宿主细胞内表达。
根据所述的构成,成为DMAPP的供给源的IPP的合成能力增强,有效地进行IPP及DMAPP的供给。其结果,本方式的重组细胞成为异戊二烯生产能力更高的重组细胞。
优选编码在非甲羟戊酸途径中发挥作用的至少1种酶的基因来自宿主细胞以外。
优选所述异戊二烯合成酶来自植物。
优选编码所述异戊二烯合成酶的基因编码下述(a)、(b)或(c)的蛋白质。
(a)由序列号2表示的氨基酸序列构成的蛋白质;
(b)由在序列号2表示的氨基酸序列中,缺失、取代或添加1~20个氨基酸而得到的氨基酸序列构成、且具有异戊二烯合成酶的活性的蛋白质;
(c)具有与序列号2表示的氨基酸序列显示60%以上的同源性的氨基酸序列、且具有异戊二烯合成酶的活性的蛋白质。
优选进一步导入编码异戊烯基二磷酸异构酶的基因,该基因在宿主细胞内表达。
由于异戊二烯合成酶的直接的基质为二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP),因此,通过增强异戊烯基二磷酸异构酶活性,从IPP向DMAPP的转变也增强,异戊二烯的生产效率提高。
优选进行了抑制牻牛儿基二磷酸合成酶、橙花基二磷酸合成酶、或法呢基二磷酸合成酶的表达量的处理的重组细胞。
IPP可以转变为牻牛儿基二磷酸(GPP)、橙花基二磷酸(NPP)、或法呢基二磷酸(FPP)。而且,本方式的重组细胞进行了抑制牻牛儿基二磷酸(GPP合成酶)、橙花基二磷酸合成酶(NPP合成酶)、或法呢基二磷酸合成酶(FPP合成酶)的表达量的处理。根据所述的构成,可抑制作为DMAPP供给源的IPP的浪费,异戊二烯生产能力更高。
用于解决同样问题的本发明的其它方式为一种重组细胞,其通过将赋予将甲醇和/或甲酸转变为甲醛的功能的基因和赋予甲醛固定化能力的基因导入具有异戊二烯合成酶的宿主细胞中而得到,该基因在宿主细胞内表达,可以由选自甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛及甲酰胺中的至少1种C1化合物生产异戊二烯。
本方式的重组细胞将“赋予将甲醇和/或甲酸转变为甲醛的功能的基因”及“赋予甲醛固定化能力的基因”导入具有异戊二烯合成酶的宿主细胞中,该基因在宿主细胞内表达。而且,可以由选自甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛及甲酰胺中的至少1种C1化合物生产异戊二烯。
即,由于本方式的重组细胞导入了“赋予将甲醇和/或甲酸转变为甲醛的功能的基因”和“赋予甲醛固定化能力的基因”,因此,具有与甲基营养菌同样的特性。而且,由于宿主细胞自身具有异戊二烯合成酶,因此,可以通过异戊二烯合成酶的作用将二甲基烯丙基二磷酸及异戊烯基二磷酸转变为异戊二烯。即,利用本方式的重组细胞,可以由所述的C1化合物生产异戊二烯。
优选赋予将甲醇转变为甲醛的功能的基因为编码甲醇脱氢酶或醇氧化酶的基因,赋予将甲酸转变为甲醛的功能的基因为编码甲醛脱氢酶的基因。
优选进一步导入赋予将甲烷转变为甲醇的功能的基因,该基因在宿主细胞内表达。
优选赋予将甲烷转变为甲醇的功能的基因为编码甲烷单加氧酶的基因。
优选作为甲醛的固定化途径,有选自由丝氨酸途径、核酮糖单磷酸途径及木酮糖单磷酸途径中的至少1种C1碳同化途径。
优选进一步导入编码3-己酮糖-6-磷酸合成酶的基因和编码6-磷酸-3-己酮糖异构酶的基因,该基因在宿主细胞内表达。
优选所述宿主细胞为细菌或酵母。
优选宿主细胞具有基于甲羟戊酸途径的异戊烯基二磷酸合成能力,进一步导入编码在甲羟戊酸途径中发挥作用的至少1种酶的基因、和/或编码在非甲羟戊酸途径中发挥作用的酶群的基因,该基因在宿主细胞内表达。
优选编码在甲羟戊酸途径中发挥作用的至少1种酶的基因来自放线菌。
优选宿主细胞具有基于非甲羟戊酸途径的异戊烯基二磷酸合成能力,进一步导入编码在甲羟戊酸途径中发挥作用的酶群的基因、和/或编码在非甲羟戊酸途径中发挥作用的至少1种酶的基因,该基因在宿主细胞内表达。
优选编码在非甲羟戊酸途径中发挥作用的至少1种酶的基因来自宿主细胞以外。
优选进一步导入编码异戊二烯合成酶的基因,该基因在宿主细胞内表达。
根据所述的构成,宿主细胞内的异戊二烯合成酶的表达量增强,异戊二烯生产能力更高。
优选所述异戊二烯合成酶来自植物。
优选编码所述异戊二烯合成酶的基因编码下述(a)、(b)或(c)的蛋白质。
(a)由序列号2表示的氨基酸序列构成的蛋白质;
(b)由在序列号2表示的氨基酸序列中,缺失、取代或添加1~20个氨基酸而得到的氨基酸序列构成、且具有异戊二烯合成酶的活性的蛋白质;
(c)具有与序列号2表示的氨基酸序列显示60%以上的同源性的氨基酸序列、且具有异戊二烯合成酶的活性的蛋白质。
优选进一步导入编码异戊烯基二磷酸异构酶的基因,该基因在宿主细胞内表达。
优选进行了抑制牻牛儿基二磷酸合成酶、橙花基二磷酸合成酶、或法呢基二磷酸合成酶的表达量的处理的重组细胞。
本发明的其它方式为一种异戊二烯的生产方法,其中,使用选自甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛及甲酰胺中的至少1种C1化合物作为碳源对上述的重组细胞进行培养,使该重组细胞生产异戊二烯。
本方式涉及一种异戊二烯的生产方法。本方式中,通过将选自甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛及甲酰胺中的至少1种C1化合物作为碳源来对上述的重组细胞进行培养,使该重组细胞生产异戊二烯。根据本方式,可以由甲醇等生产异戊二烯。
本发明的其它方式为一种异戊二烯的生产方法,其包括:使选自甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛及甲酰胺中的至少1种C1化合物与上述的重组细胞接触,使该重组细胞由所述C1化合物生产异戊二烯。
本方式中,使选自甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛及甲酰胺中的至少1种C1化合物与上述的重组细胞接触,由该C1化合物生产异戊二烯。根据本方式,也可以由甲醇等生产异戊二烯。
发明的效果
根据本发明的重组细胞,可以由甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛或甲酰胺生产异戊二烯。
关于本发明的异戊二烯的生产方法也同样,可以由甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛或甲酰胺生产异戊二烯。
附图说明
图1是表示经由甲醛的碳同化代谢途径的说明图。
具体实施方式
以下,对本发明的实施方式进行说明。需要说明的是,本发明中“基因”这样的术语可以全部置换为“核酸”或“DNA”这样的术语。
本发明的1个方式为一种重组细胞,其通过将编码异戊二烯合成酶的基因导入作为甲基营养菌的宿主细胞中而得到,该基因在所述宿主细胞内表达,所述重组细胞能够由选自甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛及甲酰胺中的至少1种C1化合物生产异戊二烯。
另外,本发明的其它方式为一种重组细胞,其通过将下列基因导入宿主细胞中而得到:赋予将甲醇和/或甲酸转变为甲醛的功能的基因、赋予甲醛固定化能力的基因和编码异戊二烯合成酶的基因,该基因在宿主细胞内表达,所述重组细胞能够由选自甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛及甲酰胺中的至少1种C1化合物生产异戊二烯。
如上所述,甲基营养菌是指将分子内不具有C-C键的碳化合物、例如甲烷、甲醇、甲胺、二甲胺、三甲胺等用作唯一的碳源、能量源的C1化合物利用性微生物。一般而言,甲基营养菌本来具有经由甲醛的碳同化代谢途径,具体而言,本来具有将甲醇和/或甲酸转变为甲醛的功能(途径)和甲醛固定化能力(甲醛的固定化途径)。
作为甲醛的固定化途径,可列举图1所示的丝氨酸途径、核酮糖单磷酸途径(RuMP途径)、木酮糖单磷酸途径(XuMP途径)。一般而言,甲基营养菌具有丝氨酸途径、RuMP途径或XuMP途径作为经由甲醛的碳同化代谢途径。
在此,对各自的甲醛固定化途径(图1)进行说明。
通过丝氨酸途径进行的甲醛固定中重要的反应为:利用丝氨酸羟甲基转移酶(serine hydroxymethyltransferase),由甘氨酸和5,10-亚甲基-四氢叶酸反应生成丝氨酸。5,10-亚甲基-四氢叶酸通过甲醛与四氢叶酸的键合而产生。在丝氨酸途径中,由1分子的甲醛直接生成1分子的乙酰CoA。
通过RuMP途径进行的甲醛固定中重要的反应为:利用3-己酮糖-6-磷酸合成酶(3-hexulose-6-phosphate synthase、以下有时简称为“HPS”),由木酮糖-5-磷酸(Ru5P)和甲醛反应生成D-阿拉伯3己酮糖6磷酸;和利用6-磷酸-3-己酮糖异构酶(6-phosphate-3-hexuloisomerase、以下有时简称为“PHI”),由D-阿拉伯3己酮糖6磷酸生成果糖6磷酸(F6P)。
本途径中生成的F6P等也供于糖分解体系,然后,生成乙酰CoA、甘油醛-3-磷酸(G3P)及丙酮酸。F6P的情况下,1分子转变为2分子的G3P,接着,经由2分子的丙酮酸生成2分子的乙酰CoA。
通过XuMP途径进行的甲醛固定中重要的反应为:利用二羟丙酮合成酶(dihydroxyacetone synthase),由木酮糖-5-磷酸(Xu5P)和甲醛生成二羟丙酮(DHA)及甘油醛-3-磷酸(G3P)的生成反应。本途径中生成的G3P也供于糖分解体系,转变为丙酮酸和乙酰CoA。二羟丙酮通过磷酸化供于糖分解体系,可以转变为G3P、丙酮酸及乙酰CoA。
本发明的重组细胞可以由选甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛及甲酰胺中的至少1种C1化合物生产异戊二烯。例如,在具有甲醇脱氢酶或醇氧化酶的重组细胞的情况下,可以将甲醇转变为甲醛。
另外,除甲醇脱氢酶或醇氧化酶外还具有甲烷单加氧酶的重组细胞的情况下,可以将甲烷转变为甲醇,接着将甲醇转变为甲醛。
而且,在具有甲醛脱氢酶的重组细胞的情况下,可以将甲酸转变为甲醛。
一般而言,由于分类为细菌的甲基营养菌(甲基营养菌细菌)具有甲烷单加氧酶和甲醇脱氢酶,因此,可以由甲烷或甲醇合成甲醛。另外,由于分类为酵母的甲基营养菌(甲基营养菌酵母)具有醇氧化酶,因此,可以由甲醇合成甲醛。另外,甲基营养菌具有甲醛脱氢酶,可以将甲酸转变为甲醛。
上述甲醇脱氢酶中,含有革兰氏阴性细菌的甲基营养菌中发现的吡咯并喹啉醌(PQQ:pyrroloquinoline quinone)依赖型甲醇脱氢酶、革兰氏阳性细菌的甲基营养菌中发现的NAD(P)依赖型甲醇脱氢酶及醇脱氢酶、革兰氏阳性细菌的甲基营养菌中发现的DMNA(N,N-二甲基-4-亚硝基苯胺(N,N’-dimethyl-4-nitrosoaniline))依赖型甲醇氧化还原酶(ParkH.etal.,Microbiology2010,156,463-471),利用酵母由甲醇向甲醛进行的转变通常利用作为氧依赖型的醇氧化酶进行催化。
另外,在具有胺氧化酶(amine oxidase)或甲胺脱氢酶(methylaminedehydrogenase)的重组细胞的情况下,可以将甲胺转变为甲醛。关于这些酶,已知一部分甲基营养菌、节杆菌(Arthrobacter)属细菌(Anthony C.,TheBiochemistry of Methylotroph,1982,Academic Press Inc.)具有这些酶。
另外,在一部分微生物中发现了将甲酰胺转变为甲醛的酶(Anthony C.,The Biochemistry of Methylotroph,1982,Academic Press Inc.)。
而且,可以经由甲醛生产异戊二烯。
作为用作宿主细胞的甲基营养菌的种类,没有特别限定,可以采用例如被分类为细菌或酵母的甲基营养菌。
作为甲基营养菌细菌,可列举例如属于Methylacidphilum属、甲基弯曲菌(Methylosinus)属、甲基胞囊菌(Methylocystis)属、甲基杆菌(Methylobacterium)属、甲基胞菌(Methylocella)属、甲基球菌(Methylococcus)属、甲基单胞(Methylomonas)属、甲基杆状菌(Methylobacter)属、甲基小杆菌(Methylobacillus)属、嗜甲基菌(Methylophilus)属、甲基娇养杆菌(Methylotenera)属、食甲基菌(Methylovorus)属、甲基微菌(Methylomicrobium)属、噬甲基菌(Methylophaga)属、噬甲基菌科(Methylophilaceae)属、甲基营养菌(Methyloversatilis)属、分枝杆菌(Mycobacterium)属、节杆菌(Arthrobacter)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、贝日阿托氏菌(Beggiatoa)属、伯克霍尔德氏菌(Burkholderia)属、颗粒杆菌(Granulibacter)属、生丝微菌(Hyphomicrobium)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、无色小杆菌(Achromobactor)属、副球菌(Paracoccus)属、泉发菌(Crenothrix)属、细枝发菌(Clonothrix)属、红细菌(Rhodobacter)属、红环菌科(Rhodocyclaceae)属、硅杆菌(Silicibacter)属、硫微螺菌(Thiomicrospira)属、疣微菌(Verrucomicrobia)属等的细菌。
作为甲基营养菌酵母,可列举例如属于毕赤酵母(Pichia)属、假丝酵母菌(Candida)属、酵母菌(Saccharomyces)属、汉逊酵母(Hansenula)属、球拟酵母亚科球拟酵母(Torulopsis)属、克勒克酵母(Kloeckera)属等的酵母。作为毕赤酵母(Pichia)属酵母的实例,可列举毕赤酵母盐藻(P.haplophila)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、喜海藻糖毕赤酵母(P.trehalophila)、P.lindnerii、等。作为假丝酵母菌(Candida)属酵母的实例,可列举近平滑假丝酵母菌属(C.parapsilosis)、甲醇毕赤酵母(C.methanolica)、博伊丁假丝酵母(C.boidinii)、(C.alcomigas)等。作为酵母(Saccharomyces)属酵母的实例,可列举Saccharomycesmetha-nonfoams等。作为汉逊酵母(Hansenula)属酵母的实例,可列举H.wickerhamii、碎囊汉逊酵母(H.capsulata)、H.glucozyma、H.henricii、H.minuta、H.nonfermentans、H.philodendra、多形汉逊酵母(H.polymorpha)等。作为球拟酵母(Torulopsis)属酵母的实例,可列举T.methanolovescens、光滑球拟酵母菌(T.glabrata、T.nemodendra)、T.pinus、T.methanofloat、T.enokii、T.menthanophiles、T.methanosorbosa、T.methanodomercqii等。
在宿主细胞为非甲基营养菌的情况下,未必具有将甲醇等转变为甲醛的途径,因此,需要至少赋予“将甲醇和/或甲酸转变为甲醛的功能”。而且,优选赋予“将甲烷转变为甲醇的功能”。这些功能赋予可以通过将编码上述酶的基因导入宿主细胞中来实现。
例如,作为赋予将甲醇转变为甲醛的功能的基因,可以使用编码甲醇脱氢酶(例如,EC1.1.1.244,EC1.1.2.7)的基因或醇氧化酶(例如EC1.13.13)的基因。另外,作为赋予将甲酸转变为甲醛的功能的基因,可以使用编码甲醛脱氢酶(例如,EC1.2.1.46)的基因。而且,作为赋予将甲烷转变为甲醇的功能的基因,可以使用编码甲烷单加氧酶的基因。
另外,已知赋予甲醇利用性的质粒。例如,甲醇芽孢杆菌(Bacillusmethanolicus)的甲醇利用性依赖于编码与甲醇代谢有关的酶群的质粒(Brautaset T.et al.,J.Bacteriology 2004,186(5),1229-1238)。通过将这种质粒导入近缘的非甲基营养菌中,可以赋予甲醇营养能力。而且,通过改变这种质粒,也可以对各种非甲基营养菌赋予甲醇利用性。
如上所述,通过对非甲基营养菌赋予“将甲醇和/或甲酸转变为甲醛的功能”,进一步赋予“甲醛的固定化能力”,可以对非甲基营养菌与甲基营养菌同样地进行操作。甲醛固定化能力的赋予可以通过例如将编码在上述的丝氨酸途径、RuMP途径、或XuMP途径中发挥作用的酶的基因导入非甲基营养菌中来实现。
以赋予RuMP途径的情况为例,进一步进行说明。RuMP途径的赋予可以通过导入例如上述的3-己酮糖-6-磷酸合成酶(HPS;例如EC4.1.2.43)基因和6-磷酸-3-己酮糖异构酶(PHI;例如EC5.3.1.27)基因来实现。即,作为基于HPS/PHI的甲醛固定化反应的基质或生成物即核酮糖-5-磷酸(Ru5P)和果糖-6-磷酸(F6P)作为戊糖磷酸途径及卡尔文循环的代谢中间体普遍地存在于全部的生物中。因此,通过HPS/PHI的导入,可以对以大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草菌(Bacillus subtilis)及酵母等为主的全部生物赋予甲醛固定化能力。
可以在原来具有RuMP途径的宿主细胞中导入HPS基因和PHI基因。由此,可以增强基于RuMP途径的甲醛固定化能力。例如,如枯草菌,通过在原来具有RuMP途径或与其具有相同性质的途径的微生物中,导入编码例如甲醇脱氢酶(例如EC1.1.1.244,EC1.1.2.7)等醇脱氢酶、3-己酮糖-6-磷酸合成酶(HPS;例如EC4.1.2.43)、6-磷酸-3-己酮糖异构酶(PHI;例如EC5.3.1.27)等酶的基因,可以赋予将甲醇转变为甲醛的功能(即甲醇利用性),同时,可以增强甲醛固定化能力。
需要说明的是,可以在作为甲基营养菌的宿主细胞中导入HPS基因和PHI基因。即,通过向具有丝氨酸途径、RuMP途径或XuMP途径的甲基营养菌导入HPS/PHI,可以增强基于RuMP途径的甲醛固定化能力。其结果,可以提高重组细胞的甲醛耐性,结果,可以提高对甲醇或甲酸的耐性及利用能力。由此,可以提高重组细胞的培养效率或异戊二烯的生产效率。
另一方面,在赋予基于丝氨酸途径的甲醛固定化能力的情况下,可以使用上述的丝氨酸羟甲基转移酶(例如EC2.1.2.1)基因。例如,通过在非甲基营养菌中导入甲醇脱氢酶等醇脱氢酶基因、5,10-亚甲基四氢叶酸(5,10-methylenetetrahydrofolate)(CH2=H4F)合成酶基因及丝氨酸羟甲基转移酶(例如EC2.1.2.1)基因等,可以赋予甲醇利用性和基于丝氨酸途径的甲醛固定化能力。
接着,对异戊二烯合成酶进行说明。作为异戊二烯合成酶,只要可以在重组细胞内发挥其酶活性,就没有特别限定。对编码异戊二烯合成酶的基因也同样,只要在重组细胞内正常地转录、翻译,就没有特别限定。
异戊二烯合成酶在许多植物中被发现。作为异戊二烯合成酶的具体例,可列举来自黑杨(Populus nigra)的异戊二烯合成酶(GenBank Accession No.:AM410988.1)。此外,可列举来自枯草菌(Bacillus subtilis)的异戊二烯合成酶(Sivy TL.etal.,Biochem.Biophys.Res.Commu.2002,294(1),71-5)。
序列号1表示与编码上述来自白杨的异戊二烯合成酶的基因(DNA)的碱基序列对应的氨基酸序列,序列号2仅表示氨基酸序列。具有序列号1表示的碱基序列的DNA为编码异戊二烯合成酶的基因的一个例子。
而且,在编码异戊二烯合成酶的基因中至少含有编码下述(a)、(b)或(c)的蛋白质的基因。
(a)由序列号2表示的氨基酸序列构成的蛋白质;
(b)由在序列号2表示的氨基酸序列中,缺失、取代或添加1~20个氨基酸而得到的氨基酸序列构成、且具有异戊二烯合成酶的活性的蛋白质;
(c)具有与序列号2表示的氨基酸序列显示60%以上的同源性的氨基酸序列、且具有异戊二烯合成酶的活性的蛋白质。
需要说明的是,关于(c)中的氨基酸序列的同源性,更优选为80%以上,进一步优选为90%以上,特别优选为95%以上。
在本发明的重组细胞中,除编码异戊二烯合成酶的基因等之外,可以进一步导入其它基因。作为导入的基因,可列举例如以下说明的异戊间二烯的生物合成途径中发挥作用的酶的基因。
包含本发明的重组细胞的全部的生物具有由甲羟戊酸途径(也称为MVA途径)或非甲羟戊酸途径(也称为MEP途径)构成的异戊间二烯的生物合成途径,并可以合成异戊烯基二磷酸(IPP)。
甲羟戊酸途径是真核生物具有的途径,将乙酰CoA作为原材料。作为在甲羟戊酸途径中发挥作用的酶,从上游依次可列举:乙酰CoA乙酰转移酶、HMG-CoA合成酶、HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、5-磷酸甲羟戊酸激酶、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶、异戊烯基二磷酸异构酶。
另一方面,非甲羟戊酸途径是原核生物或叶绿体/色素体所具有的途径,并将甘油醛-3-磷酸和丙酮酸作为原材料。作为在非甲羟戊酸途径中发挥作用的酶,从上游依次可列举:DOXP合成酶、DOXP还原异构酶、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇合成酶、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇激酶、2-C-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环二磷酸合成酶、HMB-PP合成酶、HMB-PP还原酶。
在1个实施方式中,在宿主细胞具有基于甲羟戊酸途径的IPP合成能力的情况下,进一步导入(i)编码在甲羟戊酸途径中发挥作用的至少1种酶的基因、和/或(ii)编码在非甲羟戊酸途径中发挥作用的酶群的基因。通过导入(i)的基因,基于甲羟戊酸途径的IPP合成能力增强。另外,通过导入(ii)的基因,由甲羟戊酸途径和非甲羟戊酸途径这两种途径合成IPP,IPP合成能力增强。而且,由于IPP合成能力增强,结果,更有效地进行异戊二烯生产。
在其它实施方式中,在宿主细胞具有基于非甲羟戊酸途径的IPP合成能力的情况下,进一步导入(iii)编码在甲羟戊酸途径中发挥作用的酶群的基因、和/或(iv)编码在非甲羟戊酸途径中发挥作用的至少1种酶的基因。通过导入(iii)的基因,由甲羟戊酸途径和非甲羟戊酸途径这两种途径合成IPP,IPP合成能力增强。另外,通过导入(iv)的基因,基于非甲羟戊酸途径的IPP合成能力增强。而且,通过IPP合成能力增强,结果,更有效地进行异戊二烯生产。
如上所述,作为在甲羟戊酸途径中发挥作用的酶群,可列举:乙酰CoA乙酰转移酶、HMG-CoA合成酶、HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、5-磷酸甲羟戊酸激酶、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶、异戊烯基二磷酸异构酶。
在导入(i)的基因的情况下,例如,选择导入的基因,使选自乙酰CoA乙酰转移酶、HMG-CoA合成酶、HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、5-磷酸甲羟戊酸激酶、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶及异戊烯基二磷酸异构酶中的1种或2种以上的酶在宿主细胞内表达即可。例如,从这些酶群中选择1种或2种以上的酶、将编码该酶的基因导入宿主细胞中即可。
在导入(iii)的基因的情况下,例如,选择导入的基因,使HMG-CoA合成酶、HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、5-磷酸甲羟戊酸激酶、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶及异戊烯基二磷酸异构酶构成的酶群在宿主细胞内表达即可。
如上所述,作为在非甲羟戊酸途径中发挥作用的酶群,可列举:DOXP合成酶、DOXP还原异构酶、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇合成酶、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇激酶、2-C-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环二磷酸合成酶、HMB-PP合成酶、HMB-PP还原酶。
在导入(ii)的基因的情况下,选择导入的基因,使例如,DOXP合成酶、DOXP还原异构酶、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇合成酶、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇激酶、2-C-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环二磷酸合成酶、HMB-PP合成酶、及HMB-PP还原酶构成的酶群在宿主细胞内表达即可。
在导入(iv)的基因的情况下,选择导入的基因,使例如选自DOXP合成酶、DOXP还原异构酶、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇合成酶、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇激酶、2-C-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环二磷酸合成酶、HMB-PP合成酶、及HMB-PP还原酶中的1种或2种以上的酶在宿主细胞内表达即可。例如,从这些酶群中选择1种或2种以上的酶、将编码该酶的基因导入宿主细胞中即可。
需要说明的是,甲羟戊酸途径虽然是全部的真核生物所具有的途径,但在真核生物以外的生物中也被发现。作为真核生物以外的、具有甲羟戊酸途径的生物,可列举作为放线菌的链霉菌属菌菌株CL190(Streptomycessp.StrainCL190)(Takagi M.et al.,J.Bacteriol.2000,182(15),4153-7)、灰色孢链霉菌MF730-N6(Streptomyces griseolosporeus)MF730-N6(Hamano Y.etal.,Biosci.Biotechnol.Biochem.2001,65(7),1627-35)。细菌可列举:瑞士乳杆菌(Lactobacillus helvecticus)(Smeds A et al.,DNA seq.2001,12(3),187-190)、无枝菌酸棒杆菌(Corynebacterium amycolatum)、海分枝杆菌(Mycobacteriummarinum)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、屎肠球菌(Enterococcus faecalis)、无乳链球菌(Streptococuss agalactiae)、橙黄色黏球菌(Myxococcus Xanthus)等(Lombard J.et al.,Mol.Biol.Evol.2010,28(1),87-99)。古生菌可列举气火菌属(Aeropyrum)、硫化叶菌属(Sulfolobus)、脱硫古球菌属(Desulfurococcus)、热变形菌属(Thermoproteus)、盐古杆菌属(Halobacterium)、甲烷热球菌属(Methanococcus)、火球菌属(Thermococcus)、热火球古菌属(Pyrococcus)、甲烷嗜热菌属(Methanopyrus)、热原体属(Thermoplasma)等(Lombard J.et al.,Mol.Biol.Evol.2010,28(1),87-99)。例如,作为上述(i)或(iii)的基因,可以使用来自上述生物的基因。
另外,作为用于强化细菌的IPP合成的实例,优选在避免抑制宿主的基因表达的目的下,导入细菌本来不具有的甲羟戊酸途径酶群。
另外,(ii)或(iv)的基因所编码的在非甲羟戊酸途径中发挥作用的酶优选来自宿主细胞以外。根据所述的构成,可以避免基于反应生成物的反应抑制。
具有丝氨酸途径的宿主细胞的情况下,为了从作为甲醛固定途径的丝氨酸途径直接生成乙酰CoA,特别优选将甲羟戊酸途径酶群基因作为外来基因导入。
关于在(i)~(iv)的基因所编码的甲羟戊酸途径或非甲羟戊酸途径中发挥作用的这些酶,除天然中存在的酶之外,可以为各酶的修饰体。例如,可以为各酶的氨基酸取代变异体,或者为各酶的部分片段且具有同样的酶活性的多肽。
由于异戊二烯合成酶的直接的基质为烯丙基二磷酸二甲酯(DMAPP),因此,通过增强异戊烯基二磷酸异构酶活性,从IPP向DMAPP的转变也在增强,异戊二烯的生产效率提高。因此,可以进一步导入作为外来基因的异戊烯基二磷酸异构酶基因。作为此时的异戊烯基二磷酸异构酶基因的来源,优选来自与宿主生物相同或近缘种的基因。
对于重组体,通过进行了抑制牻牛儿基二磷酸合成酶(GPP合成酶)、橙花基二磷酸合成酶(NPP合成酶)、或法呢基二磷酸合成酶(FPP合成酶)的表达量的处理,可以进一步提高异戊二烯生产能力。即,通过该处理,从IPP向GPP、NPP、或FPP的转变得到抑制,作为DMAPP的供给源的IPP的浪费得到抑制。
作为该处理,可列举对编码GPP合成酶、NPP合成酶、或FPP合成酶的基因的各种处理,例如向基因导入变异(密码子的改变、敲除等)、启动子的改变、SD序列的改变等。
本发明的进一步其它方式为一种重组细胞,其通过在具有异戊二烯合成酶的宿主细胞中导入赋予将甲醇和/或甲酸转变为甲醛的功能的基因和赋予甲醛固定化能力的基因而得到,该基因在宿主细胞内表达,可以由选自甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛及甲酰胺中的至少1种C1化合物生产异戊二烯。
作为具有本方式中可以采用的异戊二烯合成酶的宿主细胞,可列举例如美国专利第5849970号中记载的属于芽孢杆菌(Bacillus)属、不动杆菌(Acinetobacter)属、土壤杆菌(Agrobacterium)属、欧文氏菌(Erwinia)属、假单胞菌(Pseudomonas)属等的细菌。
在本方式中,可以直接应用上述的全部的实施方式。例如,在本方式中,关于赋予“将甲醇和/或甲酸转变为甲醛的功能”的基因和“赋予甲醛固定化能力的基因”,可以直接应用上述的例子。即,可以将编码甲醇脱氢酶、醇氧化酶、甲醛脱氢酶、甲烷单加氧酶等的各基因导入宿主细胞中。
另外,在本方式中,可以进一步导入编码3-己酮糖6磷酸合成酶(HPS)的基因和编码6-磷酸-3-己酮糖异构酶(PHI)的基因。
而且,在本方式中,可以在宿主细胞中导入在异戊间二烯的生物合成途径中发挥作用的酶的基因。例如,可以将使用了上述的(i)~(iv)的基因的实施方式应用于本方式。
在本方式中,可以在宿主细胞中进一步导入编码异戊二烯合成酶的基因。根据本实施方式,除宿主细胞本来具有的异戊二烯合成酶之外,可合成外来的异戊二烯合成酶,因此,异戊二烯生产能力进一步升高。作为被导入的异戊二烯合成酶基因,没有特别限定,可以使用例如来自上述的黑杨的异戊二烯合成酶基因。当然,可以进一步导入来自宿主的异戊二烯合成酶基因。
而且,在本方式中,对于重组体,可以进行抑制牻牛儿基二磷酸合成酶(GPP合成酶)、橙花基二磷酸合成酶(NPP合成酶)、或法呢基二磷酸合成酶(FPP合成酶)的表达量的处理。
作为在宿主细胞中导入基因的方法,没有特别限定,根据宿主细胞的种类等适当选择即可。例如,可以使用能够表达可导入宿主细胞中、且被插入的基因的载体。
例如,在宿主细胞为细菌等原核生物的情况下,作为该载体,可以使用如下载体:其在宿主细胞中独立复制或可以插入于染色体中,且在能够转录被插入的上述基因的位置上含有启动子。例如,优选使用所述载体,在在宿主细胞内,构建一系列结构:其由启动子、核糖体键合序列、上述基因及转录终结序列构成。
例如,作为向甲基营养菌细菌的染色体进行插入的方法,可以举出以下例子:以具有核酮糖单磷酸途径的鞭毛甲基小杆菌(Methylobacillus flagellatus)、或具有丝氨酸途径的扭托甲基杆菌(Methylobacterium extorquencs),通过目的基因的破坏操作来进行(Chistoserdova L.et al.,Microbiology 2000,146,233-238;Chistoserdov AY.,et al.,J.Bacteriol 1994,176,4052-4065)。这些方法为向使用了环状DNA的染色体组导入基因的方法,但在嗜甲基菌(Methylophilus)属细菌等中,也开发了向使用了直链状DNA的染色体组导入基因的方法(日本特开2004-229662号公报)。一般而言,用于重组的DNA难以受到宿主细胞引起的分解情况下利用直链状DNA的染色体组重组的方法比利用环状DNA的染色体组重组的方法更为有效。另外,通常同源重组法优选如逆向重复序列(inverted-repeatsequence)等那样将在染色体组上多拷贝存在的基因作为标靶。另外,作为多拷贝基因导入染色体组的方法,除同源重组以外,也有搭载于转位子的方法。作为通过质粒向甲基营养菌细菌导入基因的方法,例如有作为广宿主域载体的pAYC32(Chistoserdov AY.,et al.,Plasmid 1986,16,161-167)、pRP301(Lane M.,et al.,Arch.Microbiol.1986,144(1),29-34)、pBBR1、pBHR1(Antoine R.et al.,Molecular Microbiology 1992,6,1785-1799)、pCM80(Marx CJ.et al.,Microbiology 2001,147,2065-2075)等。
作为甲基营养菌酵母中的基因导入方法,主要在毕赤酵母菌(Pichiapastoris)中被确立,市售有pPIC3.5K、pPIC6、pGAPZ、pFLD(Invitrogen株式会社)等载体。
向芽孢杆菌(Bacillus)属细菌的基因导入中,作为可以使用的质粒,就枯草芽孢杆菌斯氏亚种(Bacillus subtilis)而言,有pMTLBS72(Nquyen HD.Et al.,Plasmid 2005,54(3),241-248)、pHT01(Funakoshi株式会社)、pHT43(Funakoshi株式会社)等,在Bacillus megaterium中,有p3STOP1623hp(Funakoshi株式会社)、pSPYocHhp(Funakoshi株式会社)等,就短短芽孢杆菌(Bacillus brevis)而言,有pNI DNA(TAKARA BIO株式会社)等。
另外,使用载体将多种的基因导入宿主细胞中的情况下,既可以将各基因插入1个载体中,也可以插入分别的载体中。而且,在1个载体中插入多个基因的情况下,既可以使各基因在共同的启动子下表达,也可以在各自的启动子下表达。作为导入多种的基因的实例,在宿主细胞为甲基营养菌的情况下,除“编码异戊二烯合成酶的基因”之外,可列举导入上述(i)~(iv)的基因或HPS/PHI基因的实施方式。
如上所述,示出了可以在甲基营养菌等中使用的已知的载体,但可以根据目的对与启动子、终止子等转录控制、复制区域等有关的区域进行改变。作为改变方法,可以变更为各宿主细胞、或其近缘种中的天然的其它基因序列,另外,可以变更为人工的基因序列。
另外,除以上的基因导入引起的改变之外,通过对突然变异、染色体组重组等变异方法进行组合,可以进一步提高异戊二烯的生产性。
在本发明的异戊二烯的生产方法的1个方式中,使用上述的重组细胞将选自甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛及甲酰胺中的至少1种C1化合物作为碳源进行培养,使该重组细胞生产异戊二烯。关于用作碳源的这些C1化合物,既可单独使用1种,也可以组合使用2种以上。另外,这些C1化合物优选作为主要碳源使用,更优选为唯一的碳源。
需要说明的是,专性甲基营养菌的情况下,基本上使用以C1化合物为唯一的碳源的合成培养基,其中,通过少量加入酵母提取物、玉米浆、肉提取物等天然培养基或维生素类,促进细菌的增殖。作为兼性甲基营养菌的情况下,在菌体增殖阶段,可以将糖质、脂质等C1化合物以外的物质作为碳源,在异戊二烯生产阶段,将碳源变更为上述C1化合物即可。作为微生物的培养法,可以根据目的在需氧、微需氧、或厌氧条件下进行培养。另外,可以为间歇培养、分批补料式培养(Fed-batch culture)培养、连续培养中的任一种方法。
使用例如甲醇作为碳源的情况下,通常,细菌的情况下,使用1.0%(v/v)浓度,酵母的情况下,使用3.0%(v/v)浓度以下,人为地对它们的耐性进行改良的情况下,即使在上述以上的浓度也可以培养。
在本发明的异戊二烯的生产方法的其它方式中,使选自甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛及甲酰胺中的至少1种C1化合物与上述的重组细胞接触,使该重组细胞由上述C1化合物生产异戊二烯。即,不管是否伴随细胞分裂(细胞增殖),都可以使上述的C1化合物与重组细胞接触,生产异戊二烯。例如,可以将上述的C1化合物连续地供给于进行了固定化的重组细胞,连续地生产异戊二烯。
在本方式中,关于这些C1化合物,既可以使用单独1种,也可以组合使用2种以上。
所生产的异戊二烯被蓄积在细胞内,或被放出至细胞外。例如,通过回收被放出至细胞外的异戊二烯并进行分离精制,可以取得被纯化的异戊二烯。
以下,根据实施例,更具体地说明本发明,但本发明并不仅限定于这些实施例。
实施例1
向具有XuMP途径的甲基营养菌导入异戊二烯合成酶基因和使用了重组体由甲醇生产异戊二烯
本实施例中,作为具有XuMP途径的甲基营养菌,使用甲醇利用性酵母毕赤酵母菌(Pichia pastolis)GS115株(Invitrogen株式会社)。
将来自黑杨(Populus nigra)的叶的全RNA作为模板,通过使用了序列号3和序列号4表示的引物的RT-PCR,对编码来自黑杨的异戊二烯合成酶(IspS)的基因(来自黑杨的IspS基因、序列号1、GenBank Genbank登录号:AM410988.1)进行扩增。将得到的扩增DNA片段克隆至pT7-BlueT载体(TAKARA BIO株式会社),构建pT7IS。用BamHI对pT7IS进行酶切并回收IspS基因。将回收的IspS基因导入pPIC3.5K(Invitrogen株式会社)的BamHI酶切部位,构建导入有异戊二烯合成酶基因的载体pPCIPS。
利用pPCIPS向毕赤酵母菌(Pichia pastolis)GS115株导入异戊二烯合成酶基因按照Invitrogen株式会社指南“Version D 032002/25-0156”进行。为了得到多拷贝的基因导入体,购入1.5mg/mL浓度的遗传霉素(Geneticin)(Invitrogen株式会社)耐性株。由此,构建保持多拷贝的外来的异戊二烯合成酶基因夺甲醇利用性酵母GS115IPS株。另外,作为对照株,也得到在1.5mg/mL浓度的Geneticin中具有耐性的、仅导入有pPIC3.5K的GS11535K株。
将GS115IPS株及GS11535K株分别在以甲醇为唯一的碳源的20mL的合成A培养基(1L含有H3PO418g、K2SO414.28g、KOH3.9g、CaSO4·2H2O0.9g、MgSO4·7H2O11.7g、CuSO4·5H2O8.4mg、KI1.1mg、MnSO4H2O4.2mg、NaMoO4·2H2O0.3mg、H3BO30.03mg、CoCl2·6H2O0.7mg、ZnSO4·7H2O28mg、FeSO4·7H2O91mg、生物素0.28mg、甲醇20mL。)中,在30℃下需氧培养64小时。回收菌体后,将各自的被回收的菌体用丁基橡胶栓在密封的125mL容量的玻璃瓶中、在45mL的合成A培养基中、进一步在30℃下振动培养16小时。培养结束后,利用GC/MS分析气相成分。其结果,在GS11535K株中没有检测到异戊二烯,但在GS115IPS株中检测到异戊二烯。由以上的情况得知:根据本实施例,可以经由作为甲醇利用途径的1种的XuMP途径,利用真核微生物(酵母)生产异戊二烯。
实施例2
向非甲基营养菌导入甲醇脱氢酶、HPS基因、PSI基因及异戊二烯合成酶基因、和利用重组体由甲醇生产异戊二烯
本实施例中,使用枯草菌(Bacillus subtilis)作为非甲基营养菌。
(各种基因的制备)
将序列号5的NADP依赖型甲醇脱氢酶(MDH)基因按照甲醇芽孢杆菌(Bacillus methanolicus)(NCIMB13114)的染色体组DNA,通过使用序列号7及序列号8的引物的PCR而扩增。将进行了扩增的DNA片段克隆至pT7Blue-T载体,构建pT7BMmdh。
将序列号9的3-己酮糖-6-磷酸合成酶(HPS)基因按照Methylomonasaminofaciens的染色体组DNA,通过使用序列号11及序列号12的引物的PCR而扩增。将进行了扩增的DNA片段克隆至pT7Blue-T载体,构建pT7MAhps。
将序列号13的6-磷酸-3-己酮糖异构酶(PHI)基因按照Methylomonoasaminofaciens的染色体组DNA,通过使用序列号15及序列号16的引物的PCR而扩增。将进行了扩增的DNA片段克隆至pT7Blue-T载体,构建pT7MAphi。
将实施例1中制备的具有异戊二烯合成酶(IspS)基因的pT7IS作为模板,使用序列号17及序列号18的引物进行PCR。将进行了扩增的DNA片段克隆至pT7Blue-T载体,构建pT7IS2。
(各种表达载体的构建)
通过用BglII及BamHI对克隆载体pT7Mahps进行酶切而切出hps基因。将该hps基因导入至枯草菌(Bacillus subtilis)用表达载体pHT01(MoBiTec株式会社)的BamHI位点来制备pHTh。
通过用BglII及BamHI对克隆载体pT7Maphi进行酶切而切出PHI基因。将该PHI基因导入至pHTh的BamHI位点来制备pHThp。
通过用BglII及BamHI对克隆载体pT7BMmdh进行酶切而切出MDH基因。将该MDH基因导入至pHThp的BamHI位点来制备pHThpm。
而且,通过用BamHI及SmaI对pT7IS2进行酶切而切出IspS基因。将该IspS基因导入至pHThpm的BamHI/SmaI位点,构建pHThpmIS。表达载体pHThpmIS具有操纵子,其在pHT01的启动子下游按照顺序配置有HPS基因、PHI基因、MDH基因及IspS基因。
作为对照,与上述类似地操作,制备仅具有HPS基因、PHI基因及IspS基因的表达载体pHThpIS。类似地,制备仅具有HPS基因、PHI基因及MDH基因的表达载体pHThpm。
按照MoBiTec株式会社指南“枯草菌(Bacillus subtilis)表达载体(Bacillussubtilis Expression Vectors)”,将各表达载体导入枯草菌(Bacillus subtilis),制备重组体(重组细胞)。由此,分别制备具有表达载体pHThpmIS的BShpmIS株、具有表达载体pHThpIS的BShpIS株、及具有表达载体pHThpm的BShpm株。
将各重组体在20mL的甲醇利用诱导培养基(在1L的自来水中含有甲醇10mL、磷酸铵3g、氯化钾1g、硫酸镁·7水合物0.1g、酵母提取物0.5g、0.01mMIPTG及氯霉素5mg。)中,在37℃下需氧地进行培养。培养液的OD600为1.0-1.2的时刻,回收菌体。在上述同样的甲醇利用诱导培养基45mL(其中,将IPTG浓度设为0.1mM。)中,加入回收的总菌体,用丁基橡胶栓在密封的125mL容量的玻璃瓶中,在37℃下振动培养24小时。培养结束后,利用GC/MS分析气相成分。
首先,培养的结果,BShpmIS株和BShpm株充分地生长,但不具有MDH的BShpIS株几乎不生长。
关于异戊二烯的生产,对BShpmIS株检测到异戊二烯。BShpmIS株中,由被利用的甲醇转变为异戊二烯的转变效率为14%。在BShpm株中,虽然仅检测到异戊二烯,但是由被利用的甲醇转变为异戊二烯的转变效率为0.3%左右。
由以上的情况得知:通过在作为非甲基营养菌的枯草菌(Bacillus subtilis)中导入MDH基因、HPS基因及PHI基因,可以在以甲醇为主要碳源的培养基中有效地生长,且通过导入IspS基因,有效地生成异戊二烯。
实施例3
导入了MVA途径基因及异戊二烯合成酶基因且具有丝氨酸途径的甲基营养菌的制备、和利用重组体由甲醇生产异戊二烯
本实施例中,作为具有丝氨酸途径的甲基营养菌,通过使用扭托甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)(ATCC55366)、向本株导入IspS基因及来自放线菌的甲羟戊酸途径基因簇,制备异戊二烯生产株。
将实施例1中制备的pT7IS作为模板,使用序列号19和序列号20表示的引物,对含有来自黑杨的IspS基因的DNA片段进行扩增。将该DNA片段克隆至pT7-BlueT载体,构建pT7IS3。
将放线菌灰色孢链霉菌(Streptomyces griseolosporeus)(Kitasatosporagriseola)的染色体组DNA作为模板,通过使用了序列号21和序列号22表示的引物的PCR,对含有编码S.griseolosporeus的甲羟戊酸途径酶群的基因的DNA片段(序列号23)进行扩增。在该DNA片段中,含有编码甲羟戊酸激酶(Mevalonate kinase)、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(Mevalonate diphosphatedecarboxylase)、磷酸甲羟戊酸激酶(Phosphomevalonate kinase)、IPP异构酶(isomerase)、3-羟基3-甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶(HMG-CoA(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A)reductase(HMGR))、及HMG-CoA 合酶(synthase)的基因簇。将得到的扩增DNA片段克隆至pT7-BlueT载体,构建pT7SMV。
利用BamHI及KpnI对pT7IS3进行酶切,得到IspS基因。将该IspS基因导入至作为广宿主域载体的pCM80(Marx CJ.Et al.,Microbiology 2001,147,2065-2075)的BamHI/KpnI位点,制备pC80IS。用KpnI对pT7SMV进行酶切,得到含有放线菌MVA途径基因及终止子序列的片段。将该片段导入至pC80IS的KpnI位点,构建pC80ISMV。表达载体pC80ISMV在启动子下游具有IspS基因及放线菌MVA途径酶基因组。
将表达载体pC80IS利用电穿孔法导入于扭托甲基杆菌(M.extorquens),得到ME-IS株。将表达载体pC80ISMV利用电穿孔法导入于扭托甲基杆菌(M.extorquens),得到ME-ISMV株。作为对照,将表达载体pCM80利用电穿孔法导入于扭托甲基杆菌(M.extorquens),得到ME-CM80株。
将ME-IS株、ME-ISMV株或ME-CM80株在以甲醇为唯一的碳源的合成B培养基(1L含有H3PO418g、K2SO414.28g、KOH3.9g、CaSO4·2H2O0.9g、MgSO4·7H2O11.7g、CuSO4·5H2O8.4mg、KI1.1mg、MnSO4H2O4.2mg、NaMoO4·2H2O0.3mg、H3BO30.03mg、CoCl2·6H2O0.7mg、ZnSO4·7H2O28mg、FeSO4·7H2O91mg、生物素0.28mg、甲醇5mL及四环素10mg。)20mL中好气性地在30℃下进行培养。在培养液的OD600为1.0-1.2的时刻,回收菌体。在上述相同的合成B培养基45mL中加入回收的总菌体,在利用丁基橡胶栓密封的125mL容量的玻璃瓶中在30℃下振动培养16小时。培养结束后,利用GC/MS分析气相成分。
其结果,在ME-IS株和ME-ISMV株中检测到异戊二烯。就由被利用的甲醇转变为异戊二烯的转变效率而言,在ME-IS株中为8%,在ME-ISMV株中为27%。需要说明的是,在ME-CM80株中没有检测到异戊二烯。
由以上的情况显示:通过向具有丝氨酸途径的甲基营养菌导入MVA途径基因及异戊二烯合成酶基因,可以进行由甲醇有效地生产异戊二烯。
实施例4
向具有RuMP途径的甲基营养菌导入异戊二烯合成酶基因、和使用重组体由甲醇生产异戊二烯
本实施例中,作为具有RuMP途径的甲基营养菌,使用甲基营养性嗜甲基菌(Methylophilus methylotrophus)(ATCC 53528),通过将IspS基因导入本株,制备生产异戊二烯的菌株。
将实施例1中制备的pT7IS作为模板,通过使用序列号19和序列号24的引物的PCR,对含有IspS基因的DNA片段进行扩增。将该DNA片段克隆至pT7Blue-T载体,制备pT7IspS4。通过利用BamHI及KpnI对pT7IspS4进行酶切,得到含有IspS基因及终止子序列的DNA片段。将该DNA片段导入至pCM80(实施例3)的BamHI/KpnI位点,构建IspS的表达载体pM80IS。将pM80IS利用电穿孔法导入于甲基营养性嗜甲基菌(M.methylotrophus),得到MM-80IS株。
另外,将含有大肠杆菌IDI(异戊烯基二磷酸异构酶)基因和黑杨IspS基因的基因簇(序列号25)导入至pCM80的BamHI/KpnI位点,构建pC80IDIS。将pC80IDIS利用电穿孔法导入于甲基营养性嗜甲基菌(M.methylotrophus),得到MM-80IDIS株。
作为对照,将pCM80利用电穿孔法导入于甲基营养性嗜甲基菌(M.methylotrophus),得到MM-80株。
将MM-80IS株、MM-80IDIS株或MM-80株在以实施例3中使用的甲醇为唯一的碳源的合成B培养基(其中,利用甲醇浓度1%(v/v))的20mL,在37℃下需氧地进行培养。在培养液的OD600为1.0-1.2的时刻,回收菌体。在上述相同的合成B培养基45mL中加入回收的总菌体,利用丁基橡胶栓在密封的125mL容量的玻璃瓶中、在37℃下振动培养16小时。培养结束后,利用GC/MS分析气相成分。
其结果,在MM-80IS株和MM-80IDIS株中检测到异戊二烯。就从被利用的甲醇转换为异戊二烯的转变效率而言,在MM-80IS株中为12%,在MM-80IDIS株中为19%。另一方面,在MM-80株中没有检测到异戊二烯。
由以上的情况显示:通过向具有RuMP途径的甲基营养菌导入异戊二烯合成酶基因,可以由甲醇有效地生产异戊二烯。另外得知:通过导入IDI基因而促进异戊二烯合成。
实施例5
向大肠杆菌导入甲醇脱氢酶(MDH)基因、HPS基因、PHI基因及IspS基因、和利用重组体由甲醇生产异戊二烯
将实施例2中制备的表达载体pHThpmIS作为模板,通过使用序列号26及27的引物的PCR,对含有HPS基因、PHI基因、MDH基因及IspS基因的DNA片段(hpmIS)进行扩增。将该扩增DNA片段克隆至pT7Blue-T载体,制备pT7hpmIS。用NcoI及BamHI对pT7hpmIS进行酶切,回收含有hpmIS基因的DNA片段。将该DNA片段导入至pET23d(Novagen株式会社)的NcoI/BamHI位点,构建大肠杆菌中的表达载体pThpmIS。将表达载体pThpmIS导入大肠杆菌Rosetta(DE3)(Novagen株式会社),得到大肠杆菌RHPMI株。
将实施例2中制备的表达载体pHThpIS作为模板,通过使用序列号26及27的引物的PCR,对含有HPS基因、PHI基因及IspS基因的DNA片段(hpIS)进行扩增。将该扩增DNA片段克隆至pT7Blue-T载体,制备pT7hpIS。用NcoI及BamHI对pT7hpIS进行酶切,回收含有hpIS基因的DNA片段。将该DNA片段导入至pET23d(Novagen株式会社)的NcoI/BamHI位点,构建大肠杆菌中的表达载体pThpIS。将表达载体pThpIS导入于大肠杆菌Rosetta(DE3),得到大肠杆菌RHPI株。
将实施例2中制备的表达载体pHThpm作为模板,通过使用序列号26及28的引物的PCR,对含有HPS基因、PHI基因及MDH基因的DNA片段(hpm)进行扩增。将该扩增DNA片段克隆至pT7Blue-T载体,制备pT7hpm。用NcoI及BamHI对pT7hpm进行酶切,回收含有hpm基因的DNA片段。将该DNA片段导入至pET23d(Novagen株式会社)的NcoI/BamHI位点,构建大肠杆菌中的表达载体pThpm。将表达载体pThpm导入大肠杆菌Rosetta(DE3),得到大肠杆菌RHPM株。
将各自的重组大肠杆菌在含有0.05mM浓度的IPTG的甲醇营养合成C培养基(1L含有H3PO418g、K2SO414.28g、KOH 3.9g、CaSO4·2H2O 0.9g、MgSO4·7H2O 11.7g、CuSO4·5H2O 8.4mg、KI 1.1mg、MnSO4H2O 4.2mg、NaMoO4·2H2O 0.3mg、H3BO30.03mg、CoCl2·6H2O 0.7mg、ZnSO4·7H2O 28mg、FeSO4·7H2O 91mg、生物素0.28mg、甲醇5mL、氯霉素34mg及氨必西林100mg。)20mL中,在37℃下需氧地进行培养。在培养液的OD600为1.0-1.2的时刻,回收菌体。在上述相同组成的合成C培养基中加入回收的总菌体45mL,在利用丁基橡胶栓密封的125mL容量的玻璃瓶中、在37℃下振动培养24小时。培养结束后,利用GC/MS分析气相成分。
其结果,仅在RHPMI株中检测到异戊二烯。RHPMI中的由被利用的甲醇转换为异戊二烯的转变效率为14%。需要说明的是,RHPI株完全不能生长。RHPM株虽然生长,但是不能检测到异戊二烯的生成。
Claims (39)
1.一种重组细胞,其通过将编码异戊二烯合成酶的基因导入宿主细胞中而得到,所述宿主细胞为甲基营养菌,
该基因在所述宿主细胞内表达,
所述重组细胞能够由选自甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛及甲酰胺中的至少1种C1化合物生产异戊二烯。
2.如权利要求1所述的重组细胞,其具有选自丝氨酸途径、核酮糖单磷酸途径及木酮糖单磷酸途径中的至少1种C1碳同化途径作为甲醛的固定化途径。
3.如权利要求1或2所述的重组细胞,其进一步导入编码3-己酮糖-6-磷酸合成酶的基因和编码6-磷酸-3-己酮糖异构酶的基因,该基因在宿主细胞内表达。
4.如权利要求1~3中任一项所述的重组细胞,其中,所述宿主细胞为细菌或酵母。
5.如权利要求4所述的重组细胞,其中,所述酵母属于毕赤酵母(Pichia)属、汉逊酵母(Hansenula)属或假丝酵母菌(Candida)属。
6.一种重组细胞,其通过将下列基因导入宿主细胞而得到:赋予将甲醇和/或甲酸转变为甲醛的功能的基因、赋予甲醛固定化能力的基因和编码异戊二烯合成酶的基因,
该基因在宿主细胞内表达,
所述重组细胞能够由选自甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛及甲酰胺中的至少1种C1化合物生产异戊二烯。
7.如权利要求6所述的重组细胞,其具有选自丝氨酸途径、核酮糖单磷酸途径及木酮糖单磷酸途径中的至少1种C1碳同化途径作为甲醛的固定化途径。
8.一种重组细胞,其通过将下列基因导入具有核酮糖单磷酸途径的宿主细胞而得到:赋予将甲醇和/或甲酸转变为甲醛的功能的基因和编码异戊二烯合成酶的基因,
该基因在宿主细胞内表达,
所述重组细胞能够由选自甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛及甲酰胺中的至少1种C1化合物生产异戊二烯。
9.如权利要求6~8中任一项所述的重组细胞,其中,赋予将甲醇转变为甲醛的功能的基因为编码甲醇脱氢酶或醇氧化酶的基因,赋予将甲酸转变为甲醛的功能的基因为编码甲醛脱氢酶的基因。
10.如权利要求6~9中任一项所述的重组细胞,其进一步导入赋予将甲烷转变为甲醇的功能的基因,该基因在宿主细胞内表达。
11.如权利要求10所述的重组细胞,其中,赋予将甲烷转变为甲醇的功能的基因为编码甲烷单加氧酶的基因。
12.如权利要求6~11中任一项所述的重组细胞,其进一步导入编码3-己酮糖-6-磷酸合成酶的基因和编码6-磷酸-3-己酮糖异构酶的基因,该基因在宿主细胞内表达。
13.如权利要求6~12中任一项所述的重组细胞,其中,所述宿主细胞为细菌或酵母。
14.如权利要求1~13中任一项所述的重组细胞,其中,宿主细胞具有基于甲羟戊酸途径的异戊烯基二磷酸合成能力,所述重组细胞进一步导入编码在甲羟戊酸途径中发挥作用的至少1种酶的基因、和/或编码在非甲羟戊酸途径中发挥作用的酶群的基因,该基因在宿主细胞内表达。
15.如权利要求14所述的重组细胞,其中,编码在甲羟戊酸途径中发挥作用的至少1种酶的基因来自放线菌。
16.如权利要求1~13中任一项所述的重组细胞,其中,宿主细胞具有基于非甲羟戊酸途径的异戊烯基二磷酸合成能力,所述重组细胞进一步导入编码在甲羟戊酸途径中发挥作用的酶群的基因、和/或编码在非甲羟戊酸途径中发挥作用的至少1种酶的基因,该基因在宿主细胞内表达。
17.如权利要求16所述的重组细胞,其中,编码在非甲羟戊酸途径中发挥作用的至少1种酶的基因来自宿主细胞以外。
18.如权利要求1~17中任一项所述的重组细胞,其中,所述异戊二烯合成酶来自植物。
19.如权利要求1~18中任一项所述的重组细胞,其中,编码所述异戊二烯合成酶的基因编码下述(a)、(b)或(c)的蛋白质:
(a)由序列号2表示的氨基酸序列构成的蛋白质;
(b)由在序列号2表示的氨基酸序列中,缺失、取代或添加1~20个氨基酸而得到的氨基酸序列构成,且具有异戊二烯合成酶的活性的蛋白质;
(c)具有与序列号2表示的氨基酸序列显示60%以上的同源性的氨基酸序列,且具有异戊二烯合成酶的活性的蛋白质。
20.如权利要求1~19中任一项所述的重组细胞,其进一步导入编码异戊烯基二磷酸异构酶的基因,该基因在宿主细胞内表达。
21.如权利要求1~20中任一项所述的重组细胞,其进行了抑制牻牛儿基二磷酸合成酶、橙花基二磷酸合成酶、或法呢基二磷酸合成酶的表达量的处理。
22.一种重组细胞,其通过将下列基因导入具有异戊二烯合成酶的宿主细胞中而得到:赋予将甲醇和/或甲酸转变为甲醛的功能的基因和赋予甲醛固定化能力的基因,
该基因在宿主细胞内表达,
所述重组细胞能够由选自甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛及甲酰胺中的至少1种C1化合物生产异戊二烯。
23.如权利要求22所述的重组细胞,其中,赋予将甲醇转变为甲醛的功能的基因为编码甲醇脱氢酶或醇氧化酶的基因,赋予将甲酸转变为甲醛的功能的基因为编码甲醛脱氢酶的基因。
24.如权利要求22或23所述的重组细胞,其进一步导入赋予将甲烷转变为甲醇的功能的基因,该基因在宿主细胞内表达。
25.如权利要求24所述的重组细胞,其中,赋予将甲烷转变为甲醇的功能的基因为编码甲烷单加氧酶的基因。
26.如权利要求22~25中任一项所述的重组细胞,其具有选自丝氨酸途径、核酮糖单磷酸途径及木酮糖单磷酸途径中的至少1种C1碳同化途径作为甲醛的固定化途径。
27.如权利要求22~26中任一项所述的重组细胞,其进一步导入编码3-己酮糖-6-磷酸合成酶的基因和编码6-磷酸-3-己酮糖异构酶的基因,该基因在宿主细胞内表达。
28.如权利要求22~27中任一项所述的重组细胞,其中,所述宿主细胞为细菌或酵母。
29.如权利要求22~28中任一项所述的重组细胞,其中,宿主细胞具有基于甲羟戊酸途径的异戊烯基二磷酸合成能力,所述重组细胞进一步导入编码在甲羟戊酸途径中发挥作用的至少1种酶的基因、和/或编码在非甲羟戊酸途径中发挥作用的酶群的基因,该基因在宿主细胞内表达。
30.如权利要求29所述的重组细胞,其中,编码在甲羟戊酸途径中发挥作用的至少1种酶的基因来自放线菌。
31.如权利要求22~28中任一项所述的重组细胞,其中,宿主细胞具有基于非甲羟戊酸途径的异戊烯基二磷酸合成能力,所述重组细胞进一步导入编码在甲羟戊酸途径中发挥作用的酶群的基因、和/或编码在非甲羟戊酸途径中发挥作用的至少1种酶的基因,该基因在宿主细胞内表达。
32.如权利要求31所述的重组细胞,其中,编码在非甲羟戊酸途径中发挥作用的至少1种酶的基因来自宿主细胞以外。
33.如权利要求22~32中任一项所述的重组细胞,其进一步导入编码异戊二烯合成酶的基因,该基因在宿主细胞内表达。
34.如权利要求33所述的重组细胞,其中,所述异戊二烯合成酶来自植物。
35.如权利要求33或34所述的重组细胞,其中,编码所述异戊二烯合成酶的基因编码下述(a)、(b)或(c)的蛋白质:
(a)由序列号2表示的氨基酸序列构成的蛋白质;
(b)由在序列号2表示的氨基酸序列中,缺失、取代或添加1~20个氨基酸而得到的氨基酸序列构成、且具有异戊二烯合成酶的活性的蛋白质;
(c)具有与序列号2表示的氨基酸序列显示60%以上的同源性的氨基酸序列,且具有异戊二烯合成酶的活性的蛋白质。
36.如权利要求22~35中任一项所述的重组细胞,其进一步导入编码异戊烯基二磷酸异构酶的基因,该基因在宿主细胞内表达。
37.如权利要求22~36中任一项所述的重组细胞,其进行了抑制牻牛儿基二磷酸合成酶、橙花基二磷酸合成酶、或法呢基二磷酸合成酶的表达量的处理。
38.一种异戊二烯的生产方法,该方法包括:使用选自甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛及甲酰胺中的至少1种C1化合物作为碳源,对权利要求1~37中任一项所述的重组细胞进行培养,使该重组细胞生产异戊二烯。
39.一种异戊二烯的生产方法,该方法包括:使选自甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛及甲酰胺中的至少1种C1化合物与权利要求1~37中任一项所述的重组细胞接触,使该重组细胞由所述C1化合物生产异戊二烯。
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