KR20030034166A - 고성장율의 메탄영양요구성 박테리아 균주 메틸로모나스16ａ - Google Patents

고성장율의 메탄영양요구성 박테리아 균주 메틸로모나스16ａ Download PDF

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마테우스 콥파스
제임스 엠. 오덤
안드레아스 스켄즐
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이 아이 듀폰 디 네모아 앤드 캄파니
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Abstract

본원에서는, C1 탄소 기질에서 성장할 수 있는 고성장율의 메탄영양요구성 박테리아 균주를 단리하고 특성화하였다. 상기 균주는 유일한 탄소원으로서 메탄 및 메탄올을 둘 다 이용할 수 있는 독특한 능력을 갖고 있으며, 기능적 엠덴-마이어호프 탄소이동 경로를 갖는 것으로 증명되었다. 상기 경로의 존재는 본원의 균주에 에너지 측면의 잇점을 제공하며, C1 탄소원을 사용한 생물량의 생산에 사용되는 생산기저로서 특히 적합하게 한다.

Description

고성장율의 메탄영양요구성 박테리아 균주 메틸로모나스 16Ａ {High Growth Methanotrophic Bacterial Strain Methylomonas 16A}
본 출원은 2000년 9월 1일에 출원된 미국 가출원 제60/229,858호를 우선권으로 주장한다.
메탄영양요구성 박테리아는 유일한 탄소원 및 에너지원으로서 메탄을 이용하는 능력에 의해 정의된다. 메탄올은 메탄의 산화과정 중 필수 중간산물이나, 메탄올의 독성으로 인하여, 절대 메탄영양요구성 균주들의 메탄올만을 이용한 배양 능력은 매우 다양하다(Green, Peter. Taxonomy of Methylotrophic Bacteria. In: Methane and Methanol Utilizers(Biotechnology Handbooks 5) J. Colin Murrell and Howard Dalton eds. 1992 Pleanum Press NY, pp.23-84). 메탄 모노옥시게나제는 메탄 활성화의 1차 단계에 필요한 효소이며, 상기 반응으로 메탄올이 생성된다(Murrell et al.,Arch. Microbiol.(2000), 173(5-6), 325-332). 상기 반응은 상온 및 대기압 상태에서 발생하지만, 메탄의 메탄올로의 화학적 전환은 수백도의 온도 및 높은 압력을 필요로 한다(Grigoryan,E.A.,Kinet. Catal.(1999), 40(3), 350-363; WO 2000007718; 미국특허 제5750821호). 주변환경 조건 하에서 메탄을 전환하는 상기 능력과 메탄의 풍부함으로 인해, 메탄의 생물변환은 잠재적으로 특이하고 유익한 방법이 된다.
상업적으로 이용되는 메탄의 생물변환은, 역사적으로 크게 3개의 범주로 나뉘어 진다: 1) 단세포 단백질의 생산,(Sharpe D.H. BioProtein Manufacture(1989). Ellis Horwood series in applied science and industrial technology. New York: Halstead Press), (Villadsen, John,Recent Trends Chem. React. Eng., [Proc. Int. Chem. React. Eng. Conf.], 2nd(1987), Volume 2, 320-33. Editor(s): Kulkarni, B.D.; Mashelkar, R.A.; Sharma, M.M. Publisher: Wiley East., New Delhi, India; Naguib, M., Proc. OAPEC Symp. Petroprotein, [Pap.](1980), Meeting Date 1979, 253-77 Publisher: Organ. Arab Pet. Exporting Countries, Kuwait, Kuwait); 2) 화학물질 제조를 위한 알켄의 에폭시화 반응(미국특허 제4,348,476호); 및 3) 염소 처리된 오염물질의 생분해(Tsien et al.,Gas, Oil, Coal, Environ. Biotechnol. 2, [Pap. Int. IGT Symp.Gas, Oil, Coal, Environ. Biotechnol.], 2nd(1990), 83-104. Editor(s): Akin, Cavit; Smith, Jared. Publisher: Inst. Gas Technol., Chicago, IL.; WO 9,633,821; Merkley et al.,Biorem. Recalcitrant Org., [Pap. Int.In SituOn-Site Bioreclam. Symp.], 3rd(1995), 165-74. Editor(s): Hinchee, Robert E; Anderson, Daniel B.;Hoeppel, Ronald E. Publisher: Battelle Press, Columbus, OH.: Meyer et al.,Microb. Releases(1993), 2(1), 11-22). 낮은 생산률과 산물의 독성 및 생산에 필요한 세포량 과다로 인해, 단지 알켄의 에폭시화 반응만이 상업적으로 조금 성공했을 뿐이다.
단세포 단백질(SCP)로 정의된, 메탄을 이용한 대규모 단백질 생산은 기술적으로 실현 가능하게 되었고 대규모로 상업화되었다(Villadsen, 상기문헌). 그러나 미생물 단백질 생산은 농업에 의한 단백질(즉, 콩 단백질) 생산에 비해 상대적으로 높은 비용을 필요로 하기 때문에, SCP는 경제적으로 바람직하지 못하였다. 단세포 단백질은 상대적으로 저급 산물이기 때문에, 높은 생물공정 비용으로 인해 경제적으로 생산을 할 수 없다. 상기 이유로 인하여, 메탄영양요구성 균주의 수율은 공정 전반의 경제성에 결정적인 요인일 수 있다. 메탄영양요구성 박테리아에 의한 미생물 생체량은 전형적으로 단백질 함량이 매우 높아서(약 70-80 중량％), 상기 단백질을 동물사료의 한 형태로 직접 사용하는 것을 제한할 수도 있다.
전통적인 화학합성 공정에 의해 C1 화합물을 C-C 결합의 복합 분자로 전환하는 것은 어렵고 자본 집약적인 방법이다. 전통적으로, 메탄은 우선 합성가스(수소, 일산화탄소 및 이산화탄소의 혼합물)로 전환되고, 상기 합성가스는 다른 저분자량 공업제품 전구체의 제조에 사용된다. 전형적으로 상기 전구체는 아세테이트, 포름알데히드 또는 메탄올과 같은 "일용품" 형태의 화학물질이다. 화학적 수단에 의한 메탄 분자의 활성화는 열역학적으로 매우 달성하기 어렵다는 근본적인 문제점이 있다. "활성화"는 화학적으로 비반응성인 메탄 분자를 더 반응성있게 만드는과정을 의미한다.
메탄영양요구성 박테리아는 상온 및 대기압 조건 하에서 메탄을 활성화시킬 수 있는 효소(메탄 모노옥시게나제)를 함유하고 있다. 메탄의 활성화는 메탄에 산소가 부가되어, 세포 내에서 더 복잡한 분자로 더욱 쉽게 대사되는 메탄올을 형성하는 것으로 구성되어 있다. 메탄영양요구성 박테리아에서 두 종류의 메탄 모노옥시게나제가 발견되었다. 미립자형 메탄 모노옥시게나제(pMMO)는 기질 특이성의 범위가 좁고, 더 복잡한 분자에 산소를 부가할 수 없다. 전부는 아니지만, 일부 메탄영양요구성 균주는 가용성 메탄 모노옥시게나제(sMMO)도 함유할 수 있다. 상기 효소는, 다양한 지방족 및 방향족 분자를 산소화 또는 관능화할 수 있어서 많은 연구 및 특허 청구의 주제가 되었다. 상기 특성은, 메탄영양요구성 균주가 sMMO에 의해 전환되는 메탄 및 더 복잡한 분자 모두를 섭취하는 공-대사적 생산 과정에 이용되었다. 메탄과, 전형적으로 석유에서 파생된 공급원료(예를 들면, 톨루엔, 나프탈렌 또는 데칸) 모두를 요구하는 공정에서 sMMO를 이용하는 다수의 예들이 보고되었다. 그러나 당업계에서는 메탄영양요구성 균주를 이용한 메탄으로부터의 화학물질 순합성에 관하여 상기 공-대사적 전환과 달리 활발치 않다. 순합성에서는, 원하는 화학물질을 생산하기 위하여 균주의 유전자를 조작하는 능력과 함께 단지 저비용의 메탄만이 요구된다.
메탄영양요구성 세포는 메탄의 산화 산물(즉, 메탄올 및 포름알데히드)을 사용하여 단백질, 탄수화물 및 지질과 같은 더 복잡한 분자를 합성할 수 있다. 예를 들면, 특정한 조건 하에서 메탄영양요구성 균주가 세포외 다당류를 생산하는 것이알려져 있다(Ivanova et al.,Mikrobiologiya(1988), 57(4), 600-5; Kilbane, John J., IIGas, Oil, Coal, Environ. Biotechnol. 3, [Pap. IGT's Int. Symp.], 3rd(1991), Meeting Date 1990, 270-26. Editor(s): Akin, Cavit; Smith, Jared. Publisher: IGT, Chicago, IL). 이와 유사하게, 메탄영양요구성 균주가 이소프레노이드 화합물과, 다양한 탄소 길이의 카로티노이드 색소를 모두 축적하는 것이 알려져 있다(Urakami et al.,J. Gen. Appl. Microbiol.(1986), 32(4), 317-41). 상기 화합물을 메탄영양요구성 균주 내에서 확인하였음에도 불구하고, 상기 균주의 매우 미발달된 유전자 시스템으로 인해 화학물질 생산을 위한 대사 조작이 제한되어, 미생물을 상기 화합물의 생산 수단으로서 이용하지 못하였다.
메탄영양요구성 균주의 대사 조작의 필요조건으로서, 최대 배양 및(또는) 산물의 수율을 위한 탄소 대사과정의 완전한 이해와 최적화가 필요하다. 절대-메탄영양요구성 균주는 전형적으로, 케토-데옥시포스포글루코네이트 알돌라제 효소를 이용하는 엔트너-도우도로프 경로(Entner-Douderoff)를 통하여, 메탄의 탄소를 유용한 산물과 에너지로 전달하는 것으로 알려져 있다(Dijkhuizen, L., P. R. Levering, G.E. DeVries 1992. In: Methane and Methanol Utilizers(Biotechnology Handbooks 5) J. Colin Murrell and Howard Dalton eds. 1992 Pleanum Press NY pp149-181). 상기 경로는 엠덴-마이어호프(Embden-Meyerhof) 경로와 달리, 에너지 수율이 낮다. 따라서, 엔트너-도우도로프 경로의 이용은, 엠덴-마이어호프 경로를 이용하는 미생물에 비해 세포 생산 수율이 낮고, 대부분의 탄소 산물이 이산화탄소 형태이다. 따라서, 에너지 효율이 더 높은 탄소 대사경로는, 메탄영양요구성 균주를 이용한 물질 생산에서 상업적 실행 가능성을 크게 증가시킬 것이다.
상기한 바와 같이, 메탄영양요구성 박테리아는 단세포 단백질, 세포외 다당류 및 장쇄 탄소분자(예를 들면, 이소프레노이드와 카로티노이드 색소)와 같은 물질의 생산을 위한 상업적으로 효과적인 생산 방법이 될 수 있는 가능성을 갖고 있다. 그러나 메탄영양요구성 균주의 상대적으로 낮은 성장율, 메탄의 대체 기질로서의 메탄올에 대한 제한된 허용도, 유전자 조작의 어려움, 메탄영양요구성 균주의 다양한 탄소 동화경로 역할에 대한 낮은 이해도, 및 메탄과 같이 완전히 포화된 기질의 산소 요구량에 기인하는 잠재적 고비용을 비롯한 여러가지 제약으로 인해, 더 넓은 범위의 화합물들을 생산하기 위한 메탄영양요구성 균주의 유용성이 제한된다. 따라서, 표준 유전자 조작과정을 통한 외래 유전자 도입이 가능한, 빠르게 성장하고수율이 높은 메탄영양요구성 균주를 개발하는 것이 해결해야 할 문제점이다. 주요 탄소경로에 대한 완전하고 신속한 문제해결은 새로운 산물을 위한 대사경로 조작과 탄소이동 조절을 가능하게 하는 데에 필수적이다.
본원의 출원인은, 탄소기질로서 메탄올 또는 메탄을 효율적으로 이용할 수 있는 메탄영양요구성 박테리아 균주를 제공하여 상기 문제점을 해결하였다. 또한 상기 균주는 포름알데히드의 탄소를 3-탄소 단위체로 혼입시키는 것에 있어 다양한 경로를 갖는다는 점에서 대사적으로 융통성이 있다. 상기 균주에서 포스포프럭토키나제와 프럭토스 1,6 비스포스페이트 알돌라제의 발견은, 상기 균주가 엔트너-도우도로프 경로 외에 에너지 측면에서 더 바람직한 엠덴-마이어호프 경로를 이용할 수 있음을 암시하고 있다. 본원의 균주는 단세포 단백질 이상으로 탄수화물, 색소, 터페노이드 화합물 및 방향족 화합물을 포함하는 다양한 물질의 생산에 유용한 것으로 나타났다. 상기 균주에 의해 메탄 또는 메탄올로부터 다량의 탄수화물을 생성할 수 있다. 상기 특징은 놀라운 것이며, 또한 상기 균주가 전형적인 탄수화물 또는 당 발효 최종 산물(예를 들면, 알콜, 산 및 케톤)의 생산에 이용되는 것을 가능하게 한다. 본원의 균주는 또한, 박테리아 접합으로 알려진 표준 유전방법을 통하여 대장균(E.coli)과 같은 공여 종과 유전자 교환이 가능한 것으로 나타났다. 이러한 방법으로, 상기 균주는 메탄을 이용한, 자연적으로 생산되는 산물이 아닌 새로운 종류의 산물을 생산하는 순합성을 위해 조작될 수 있다.
발명의 개요
본 발명은 C1 탄소기질 상에서 배양할 수 있는 메탄영양요구성 박테리아 균주를 제공한다. 또한 본원의 박테리아 균주는 유일한 탄소원으로서 메탄올 또는 메탄을 이용하여 신속하고 효과적으로 배양할 수 있는 능력을 갖고 있다. 상기 효율은 작동하는 엠덴-마이어호프 경로 내에, 피로포스페이트가 결합된 포스포프럭토키나제가 존재하기 때문이다. 이것은 메탄영양요구성 박테리아에 있어서 새롭게 관찰된 것이다. 기능적으로는, 엔트너-도우도로프 경로 반응 대신 엠덴-마이어호프 경로와 피로포스페이트를 이용하면, 높은 수율과 높은 탄소전환 효율 및 높은 성장율로서 명확히 나타나는 매우 유리한 세포 에너지 이용도를 얻는다.
또한 본원의 균주는 질산염 또는 아질산염을 환원시켜 산화질소가스를 생성할 수 있는 효소 시스템을 갖고 있다. 이러한 능력은 쓰레기 매립지, 폐수 처리 시스템, 또는 메탄, 산소 및 질산염이 존재하는 임의의 환경조건과 같은 메탄-함유환경조건에서 질산염과 아질산염을 제거하는 것 이외에 산소 요구량을 줄이는 것에도 유용하다.
녹말, 폴리글루코스 및(또는) 세포외 다당류의 형태로 다량의 탄수화물을 생성하는 능력은 탄수화물-기재의 산물 생산에도 유용하다. 또한 메틸로모나스 16a(Methylomonas16a)는 단지 메탄 또는 메탄올 상에서만 성장하고 인체 내에서는 증식하지 않으므로 완전히 무해하고 비병원성이다. 이러한 특성으로 상기 균주는, 다양한 탄수화물/단백질 비율의 동물 사료를 포함하는 광범위한 산물의 생산에 매우 유용하다.
상기 균주는 유전자 교환 및 외래 유전자 발현이 가능한 것으로 나타났다. 또한 본원의 균주는 서열 81에 기재된 특징적 16sRNA 서열에 의해 구분될 수 있다.
또한 본 발명은 단세포 단백질, 탄수화물 및 카로티노이드 색소, 또는 단백질, 색소 및 탄수화물의 고급 혼합물을 제조하는 방법을 제공한다. 또한 본원의 균주는 메탄 또는 메탄올을 탄소원으로 사용하여, 질산염 또는 아질산염을 산화질소로 전환시키는 탈질소화제로서 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은
(A) 메탄 및 메탄올로 구성된 군에서 선택된 C1 탄소기질을 사용하여 성장하며;
(B) (a) 서열 6에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 단리된 핵산 분자;
(b) 65 ℃에서 0.1X SSC, 0.1 ％ SDS로 혼성화시키고 순차적으로 2X SSC, 0.1 ％ SDS 및 0.1X SSC, 0.1 ％ SDS로 세척하는 혼성화 조건 하에서 상기 (a)의핵산 분자와 혼성화되는 단리된 핵산 분자;
(c) 서열 6에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드와 비교할 때, 스미스-워터만 (Smith-Waterman) 정렬 방법에 기초하여 63 ％ 이상의 동일성을 갖는 437 개 이상의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자; 및
(d) (a), (b) 또는 (c)에 상보적인 단리된 핵산 분자
로 구성된 군에서 선택된, 피로포스페이트-의존성 포스포프럭토키나제 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 기능적 엠덴-마이어호프 탄소경로를 포함하는
고성장율의 메탄영양요구성 박테리아 균주를 제공한다.
임의로, 본원의 균주는 기능적 엠덴-마이어호프 탄소경로 내의 프럭토스 비스포스페이트 알돌라제 효소를 코딩하는 1 종 이상의 유전자를 포함할 수 있다. 또한 본원의 균주는 임의로, 기능적 엔트너-도우도로프 탄소경로를 포함할 수 있으며, 상기 엔트너-도우도로프 탄소경로는 케토-데옥시 포스포글루코네이트 알돌라제를 코딩하는 1 종 이상의 유전자를 포함한다.
한 실시양태에서 본원의 균주는, 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12, 서열 14, 서열 16, 서열 18 및 서열 20으로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드를 코딩하는 다른 탄소이동(carbon flux) 유전자를 임의로 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서 본원의 균주는, 서열 40, 서열 42, 서열 44, 서열 46, 서열 48, 서열 50, 서열 52, 서열 54, 서열 56, 서열 58 및 서열 60으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 코딩 유전자를 임의로 포함할 수 있는탈질소화 경로를 갖을 수 있다.
또 다른 실시양태에서 본원의 균주는, 서열 22, 서열 24, 서열 26, 서열 28, 서열 30, 서열 32, 서열 34, 서열 36 및 서열 38로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 세포외 다당류 합성 효소 군을 포함할 수 있다.
더 특정한 실시양태에서 본원의 균주는, 서열 62, 서열 64, 서열 66, 서열 68, 서열 70, 서열 72, 서열 74, 서열 86 및 서열 78로 구성된 군에서 선택된 이소프레노이드 합성 효소를 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다.
한 바람직한 실시양태에서 본 발명은
(A) 단세포 단백질이 발현되고 축적되기에 충분한 시간 동안 적절한 배지에서, 본원의 고성장율의 메탄영양요구성 박테리아 균주를 메탄 및 메탄올로 구성된 군에서 선택된 C1 탄소기질과 접촉시키고
(B) 임의로는, 단세포 단백질을 회수하는 것
을 포함하는 단세포 단백질의 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 추가적인 목적은, 암모니아, 질산염, 아질산염 및 질소가스로 구성된 군에서 선택된 질소 함유 화합물 존재하에, 상기 질소 함유 화합물의 생물변환이 일어나기에 충분한 시간동안 적절한 배지에서 본원의 고성장율의 메탄영양요구성 박테리아 균주를 메탄 및 메탄올로 구성된 군에서 선택된 C1 탄소기질과 접촉시키는 것을 포함하는, 질소 함유 화합물의 생물변환 방법을 제공하는 것이다.
유사하게, 본 발명의 목적은
(A) 식용 산물이 발현되고 축적되기에 충분한 시간 동안 적절한 배지에서,본원의 고성장율의 메탄영양요구성 박테리아 균주를 C1 탄소기질과 접촉시키는 단계; 및
(B) 임의로는, 식용 산물을 회수하는 단계
를 포함하는, 단백질, 탄수화물 및 색소를 포함하는 식용 산물의 제조 방법을 제공하는 것이다.
임의로는, 단백질, 탄수화물 및 색소의 상대적 조성을, 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9, 서열 11, 서열 13, 서열 15, 서열 17, 서열 19, 서열 21, 서열 23, 서열 25, 서열 27, 서열 29, 서열 31, 서열 33, 서열 35, 서열 37, 서열 39, 서열 41, 서열 43, 서열 45, 서열 47, 서열 49, 서열 51, 서열 53, 서열 55, 서열 57, 서열 59, 서열 61, 서열 63, 서열 65, 서열 67 및 서열 69로 구성된 군에서 선택된 단백질 코딩 유전자 중 어느 1 개의 유전자를 상향조절 또는 하향조절하여 변경시킨다.
본 발명의 한 바람직한 실시양태에서는,
(a) 고성장율의 메탄영양요구성 박테리아 균주를 포함하는 것으로 추측되는 시료를, 유일한 탄소원으로서 메탄의 존재 하에 적절한 배양 배지에서 배양하는 단계;
(b) 단계 (a)의 조건 하에서 배양된 콜로니(colony)를 동정하는 단계;
(c) 단계 (b)에서 동정된 콜로니에 피로포스페이트 의존성 포스포프럭토키나제 활성이 존재하는지 분석하는 단계
를 포함하는, 고성장율의 메탄영양요구성 박테리아 균주의 동정 방법을 제공한다.
본 발명은 미생물학 분야에 관한 것이다. 더 자세하게는, 본 발명은 상업적으로 유용한 제품을 더 효과적으로 생산하기 위해 주 탄소 대사경로를 이용할 수 있는, 신규 메탄영양요구성 박테리아 균주에 관한 것이다.
도 1은 동일한 배양 조건 하에서, 메틸로코커스 캡술라터스(Methylococcus capsulatus)의 성장과 비교한 메틸로모나스 16a의 성장을 나타낸다.
도 2는 메탄올만을 사용하여 배양된 메틸로모나스 16a의 배양액에 대한 흡광도와 메탄올 농도와의 관계를 도시한 것이다.
도 3은 마이크로어레이(microarray) 발현 결과를 발현수준이 감소하는 순서로 나열한, 메틸로모나스 16a의 엔트너-도우도로프 및 엠덴-마이어호프 경로에 대한 개략도를 나타낸다.
도 4는 산소 소비량 검출을 위하여, 임의의 단위로서 메틸로모나스 16a의 세포 현탁액에 의한 산소 소비를 나타낸다.
도 5는 배양액에 아질산나트륨을 주입하기 전과 후의 산소 소비량 검출을 위하여, 임의의 단위로서 메틸로모나스 16a의 세포 현탁액에 의한 산소 소비를 나타낸다.
도 6은 통기 조건 하에서 단위 시간당 방출되는 O2및 N2O 농도와, 메틸로모나스 16a의 현탁 세포 배양액 내의 O2농도의 관계를 도시한 것이다.
서열의 설명 및 미생물 기탁
본 발명은 하기 상세한 설명과, 본원의 한 부분을 형성하고 있는 첨부된 서열의 설명에 의해 더 완전하게 이해될 수 있다.
본원에 첨부된 하기 서열의 설명과 서열 목록은 37 C.F.R. §1.821-1.825에기재된, 특허 출원에서의 뉴클레오티드 및(또는) 아미노산 서열 개시에 관한 규칙에 따른 것이다. 서열의 설명은, 이 거명을 통해 본원에 참고문헌으로 포함된 문헌 [Nucleic Acids Research 13:3021-3030(1985)] 및 [Biochemical Journal 219(No.2):345-373(1984)]에 기재된 IUPAC-IYUB 표준에 적합하게 정의된, 뉴클레오티드 서열 문자의 1자 코드와 아미노산의 3자 코드를 포함한다. 뉴클레오티드 및 아미노산의 서열 자료에 사용된 기호와 양식은 37 C.F.R.§1.822에 기재된 규칙에 따른 것이다.
본원의 출원인은 특허절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약에 따라, 하기 미생물 기탁을 하였다.
기탁자 식별 표시 국제 기탁 명칭 기탁 날짜
메틸로모나스 16a ATCC PTA 2402 2000년 8월 21일
본 발명은 단백질, 탄수화물 및 색소를 포함하는 생물자원의 생산에 유용한, 고성장율의 메탄영양요구성 박테리아 균주의 단리 및 특성화에 관한 것이다. 본원의 균주는 메틸로모나스 종의 16sRNA에 의해 분류되어, 본원에서는 메틸로모나스 16a로 명명하였다. 또한, 상기 균주는 동물사료의 생산을 위한 단백질, 탄수화물 및 색소들의 혼합물을 생산하는 것에 유용할 수 있다. 상기 균주는 피로포스페이트-의존성 포스포프럭토키나제 유전자를 갖는 활동적 엠덴-마이어호프 탄소이동 경로를 포함하는 잇점이 있으며, 상기 경로는 다양한 물질 및 생물자원의 생산 기반으로서의 상기 균주에 특정한 에너지적 잇점을 제공한다. 또한 상기 균주는, 상기 균주 고유의 색소를 생산하기 위한 활성화된 이소프레노이드 경로를 갖고 있다. 본원의 개시 내용에 있어서, 많은 용어와 약어가 사용되었다. 이들의 정의는 다음과 같다.
용어 "엠덴-마이어호프 경로"는 글루코스 및 프럭토스와 같은 6탄당을, 글리세르알데히드-3-포스페이트, 디히드록시아세톤 포스페이트, 포스포페놀피루베이트 및 피루베이트와 같은 중요한 세포내 3-탄소 중간체로 전환시키기 위한 일련의 생화학적 반응을 말한다. 상기 반응은 전형적으로, ATP 형태의 생화학적으로 유용한 에너지의 순생산을 동반한다. 상기 엠덴-마이어호프 경로에서 독특한 주요 효소로는 포스포프럭토키나제와 프럭토스-1,6 비스포스페이트 알돌라제가 있다.
용어 "엔트너-도우도로프 경로"는 생화학적으로 유용한 에너지의 순생산 없이, 글루코스 또는 프럭토스와 같은 6탄당을 피루베이트 및 글리세르알데히드-3-포스페이트와 같은 중요한 세포내 3-탄소 중간체로 전환시키기 위한 일련의 생화학적 반응을 말한다. 상기 엔트너-도우도로프 경로에서 독특한 주요 효소로는 6-포스포글루코네이트 데히드라타제와 케토데옥시포스포글루코네이트 알돌라제가 있다.
경로 내에 특정 유전자가 존재하는 것과 관련된 용어 "특징적인(diagnostic)" 은, 그런 활성을 갖는 유전자가 동정되는 것이 관련 경로의 존재에 대한 증거가 됨을 의미한다. 본 발명과 관련하여, 피로포스페이트-의존성 포스포프럭토키나제를 코딩하는 유전자의 존재는 엠덴-마이어호프 탄소경로의 존재에 "특징적인" 것이며, 케토데옥시포스포글루코네이트 알돌라제를 코딩하는 유전자의 존재는 엔트너-도우도로프 탄소경로의 존재에 "특징적인" 것이다.
본원에서 용어 "수율"은 대사되는 탄소기질의 단위 g당 생산되는 세포량으로 정의한다.
용어 "탄소전환 효율"은 세포량으로 동화된 탄소량의 척도이며, 생물자원의 조성을 CH2O0.5N0.25로 가정하여 계산한다.
용어 "고성장율의 메탄영양요구성 박테리아 균주"는 유일한 탄소원 및 에너지원으로서 메탄 또는 메탄올을 이용하여 성장할 수 있고, 기능적 엠덴-마이어호프 탄소이동 경로를 갖고 있어서, 대사되는 C1 기질 단위 g당 세포량 1의 수율을 얻을 수 있는 박테리아를 의미한다. 본원에 기재된 특정 "고성장율의 메탄영양요구성박테리아 균주"는 "메틸로모나스 16a" 또는 "16a"를 말하며, 상기 용어들은 상호 교환하여 사용되었다.
용어 "C1 탄소기질"은 탄소-탄소 결합이 없는 임의의 탄소-함유 분자를 말한다. 예컨대, 메탄, 메탄올, 포름알데히드, 포름산, 메틸화된 아민 및 메틸화된 티올이 있다.
용어 "기능적인 탈질소화의 효소적 경로"는 질산염 또는 아질산염을 산화질소, 아산화질소 또는 최종적인 질소가스와 같은 더 환원된 산물로 순차적으로 환원시키는 일련의 효소를 말한다. 상기 과정에서는 에너지가 생성될 수도, 또는 생성되지 않을 수도 있다.
용어 "탈질소화"는 질산염 또는 아질산염을 질소가스 또는 그 외 산화질소가스로 전환시키는 과정을 말한다. 탈질소화의 용이함을 위해 본원의 균주는, 아질산염(NO2)이 산화질소로 환원되는 것을 촉매하는 아질산염 환원효소를 코딩하는nir유전자(nirD, nirF, nirG, nirH, nirJ, nirL및nirS)와, 질산염(NO3)이 아질산염(NO2)으로 환원되는 것을 촉매하는 질산염 환원효소를 코딩하는nasA유전자, 및 산화질소(NO)가 아산화질소(N2O)로 환원되는 것을 촉매하는 산화질소 환원효소를 코딩하는nor유전자(norB, norC또는norZ)를 비롯한, 탈질소화 경로의 다수 효소를 코딩하는 유전자를 포함한다.
용어 "이소프레노이드 화합물"은 이소펜테닐 피로포스페이트가 개시물질인 경로를 통해 파생되고, 5, 10, 15, 20, 30 또는 40개의 탄소 길이를 갖을 수 있는이소프렌 단위체의 머리-꼬리(head to tail) 축합 반응에 의해 형성되는 임의의 화합물을 말한다. 용어 "이소프레노이드 색소"는 전형적으로 강한 흡광능을 갖고, 5, 10, 15, 20, 25, 30 또는 40개 탄소의 이소프렌 쇄를 머리-꼬리 축합 반응시켜 파생된 화합물 군을 말한다. 상기 이소프렌 쇄는 최종적으로 이소펜테닐 피로포스페이트에서 파생된다. 이소프레노이드 생합성 경로를 코딩하는 다수의 유전자 및 유전자 산물이 본원의 균주와 관련되어 있으며, 그 예로는 1-데옥시크실룰로스-5-포스페이트 신타제를 코딩하는dxs유전자, 1-데옥시크실룰로스-5-포스페이트 리덕토이소머라제를 코딩하는dxr유전자, 2C-메틸-D-에리쓰리톨 시티딜트렌스퍼라제 효소를 코딩하는 "ispD"유전자, 4-디포스포시티딜-2-C-메틸에리쓰리톨 키나제를 코딩하는 "ispE"유전자, 2C-메틸-D-에리쓰리톨 2,4-시클로디포스페이트 신타제를 코딩하는 "ispF"유전자, CTP 신타제를 코딩하는 "pyrG" 유전자, 게라닐트렌스퍼라제 또는 파네실 디포스페이트 신타제를 코딩하는 "ispA" 유전자, 및 디아포피토엔 데히드로게나제를 코딩하는 "ctrN" 및 "ctrN1" 유전자가 포함된다.
용어 "단세포 단백질"은 "SCP"로 약기하였고, 단세포 상태로 존재하는 유기체에서 파생된 단백질을 말한다. 상기 유기체에는 단세포 박테리아, 효모, 진균류, 또는 원충류와 같은 진핵성 단세포 유기체가 포함된다.
용어 "세포외(extracellular) 다당류" 또는 "세포외부(exocellular) 다당류"는 "ESP"로 약기하였고, 전형적으로 교차결합된 탄수화물 중합체로서의 탄수화물 "주쇄" 중합체를 포함하는, 메탄영양요구성 박테리아에 의해 생산되는 다당류를 말한다. 상기 중합체는 미생물 세포의 외부로 분비되고, 표면 부착 기능 또는 환경스트레스에 대한 반응으로서 작용할 수 있다. 본원의 균주는 세포외 다당류 합성에서의 다양한 단계를 코딩하는 다수의 유전자를 포함하며, 상기 유전자로는 UDP-글루코스 피로포스포릴라제를 코딩하는 "ugp" 유전자, 글리코실트렌스퍼라제를 코딩하는 "gumD" 및 "waaE" 유전자, 다당류 분비 단백질을 코딩하는 "wza" 및 "epsB" 유전자, 다당류 생합성 관련 단백질을 코딩하는 "epsM" 유전자, 및 당 트렌스퍼라제를 코딩하는 "epsV" 유전자가 포함된다.
용어 "탄수화물"은 임의의 당 함유 성분, 특히 글리코겐 또는 녹말 및 세포외 다당류와 같은 저장형태의 당 함유 성분을 말한다.
용어 "발효 생산물"은, 메탄 또는 메탄올을 이용하는 메탄영양요구성 박테리아에 의해 생성된 임의의 탄수화물을 발효시킴으로써 파생되는 생산물을 말한다.
용어 "미립자형 메탄 모노옥시게나제"는 "pMMO"로 약기하였고, 효소 기질에 산소를 부가하는 막-결합 메탄 모노옥시게나제를 말한다.
용어 "가용성 메탄 모노옥시게나제"는 "sMMO"로 약기하였고, 세포질 내에 위치한 가용성 또는 세포질 메탄 모노옥시게나제를 말한다.
본원에 사용된 "단리된 핵산 단편"은 합성된 뉴클레오티드 염기, 인위적인 뉴클레오티드 염기 또는 변형된 뉴클레오티드 염기를 임의로 포함하는, 단일- 또는 이중-가닥 RNA 또는 DNA의 중합체이다. DNA 중합체 형태로서의 단리된 핵산 단편은 cDNA, 게놈 DNA 또는 합성 DNA의 1개 이상의 절편을 포함할 수 있다.
"유전자"는 특정 단백질을 발현하고, 코딩 서열 앞(5' 비-코딩 서열)과 뒤(3' 비-코딩 서열)의 조절 서열을 포함하는 핵산 단편을 말한다. "본래의 유전자"는 자신의 조절 서열을 갖고, 자연적으로 발견되는 유전자를 말한다. "키메라 유전자"는 자연적으로 발견되지 않는 조절 서열 및 코딩 서열을 포함하는, 본래의 유전자가 아닌 임의 유전자를 말한다. 따라서, 키메라 유전자는 다른 공급원에서 유래한 조절 서열과 코딩 서열을 포함하거나, 또는 같은 공급원에서 유래하였으나 자연적으로 발견되는 것과는 다른 방식으로 정렬된 조절 서열과 코딩 서열을 포함할 수 있다. "내재 유전자"는 생물체 게놈 내의 원 위치에 존재하는 본래의 유전자를 말한다. "외래" 유전자는 숙주 생물체에서 일반적으로 발견되지 않고, 유전자 전이에 의해 숙주 생물체에 도입된 유전자를 말한다. 외래 유전자는 본래의 생물체가 아닌 것에 삽입된 본래의 유전자, 또는 키메라 유전자를 포함할 수 있다. "전이유전자"는 형질전환 방법에 의해 게놈 내에 도입된 유전자를 말한다.
용어 "퍼센트 동일성"은 당업계에 알려진 바와 같이, 2 이상의 폴리펩티드 서열 또는 2 이상의 폴리뉴클레오티드 서열간의 관계를 말하며, 상기 서열들을 비교하여 결정한다. 당업계에서 "동일성"은 또한, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열간의 서열 관련성 정도를 의미하며, 이것은 상기 서열 가닥을 상호 비교하여 결정할 수 있다. "동일성"과 "유사성"은, 문헌 [Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, NY (1988); Biocomputing : Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, NY (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.) Humana Press, NJ (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987); 및 Sequence AnalysisPrimer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Stockton Press, NY (1991)]등을 비롯한 공지의 방법에 의해 용이하게 계산될 수 있다. 동일성을 결정하는 바람직한 방법은 시험하는 서열간의 최적의 일치를 얻을 수 있도록 디자인된다. 동일성과 유사성을 결정하는 방법은 공개적으로 입수 가능한 컴퓨터 프로그램에 암호화되어 있다. 서열 정렬과 퍼센트 동일성 계산은, 레이저진 생물정보학 컴퓨터 프로그램 패키지(DNASTAR Inc., Madison, WI)의 메그얼라인(Megalign) 프로그램을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 서열의 다중 정렬은, 기초 매개변수 (GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=10)를 사용한 클러스탈(Clustal) 정렬 방법(Higgins and Sharp (1989)CABIOS. 5: 151-153)으로 수행되었다. 클러스탈 방법을 이용한 쌍 정렬의 기초 매개변수는 KTUPLE 1, GAP PENALTY=3, WINDOW=5 및 DIAGONALS SAVED=5의 값이었다.
적절한 핵산 단편(본 발명에서 단리한 폴리뉴클레오티드)은, 본원에 기재된 아미노산 서열과 70 ％ 이상 동일한, 바람직하게는 80 ％ 이상 동일한 폴리펩티드를 코딩한다. 바람직한 핵산 단편은, 본원에 기재된 아미노산 서열과 약 85 ％ 동일한 아미노산 서열을 코딩한다. 더 바람직한 핵산 단편은, 본원에 기재된 아미노산 서열과 약 90 ％ 동일한 아미노산 서열을 코딩한다. 더욱 더 바람직한 핵산 단편은, 본원에 기재된 아미노산 서열과 약 95 ％ 동일한 아미노산 서열을 코딩한다. 적절한 핵산 단편은 상기한 상동성을 가질뿐만 아니라, 전형적으로 50 개 이상의 아미노산, 바람직하게는 100 개 이상의 아미노산, 더 바람직하게는 150 개 이상의 아미노산, 더욱 더 바람직하게는 200 개 이상의 아미노산, 가장 바람직하게는 250개 이상의 아미노산을 갖는 폴리펩티드를 코딩한다.
핵산 분자는 cDNA, 게놈 DNA 또는 RNA와 같은 다른 핵산 분자와 "혼성화"할 수 있으며, 적절한 온도 및 용액 이온강도의 조건 하에서 단일 가닥 형태의 핵산분자를 다른 핵산분자와 어닐링시킬 수 있다. 혼성화 및 세척 조건은 공지되어 있고, 문헌[Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. Molec㎕ar Cloning : A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989)]에 잘 예시되어 있다 (특히 상기 문헌의 11 장 및 11장의 테이블 11.1, 이 거명을 통해 그 전문이 본원에 참고문헌으로서 포함됨). 온도 및 이온강도 조건이 혼성화의 "엄격도(stringency)"를 결정한다. 엄격도 조건은 연관도가 낮은 생물체의 상동 서열과 같이 적당히 유사한 단편과, 연관도가 높은 생물체로부터 기능적 효소를 복제하는 유전자와 같이 매우 유사한 단편을 스크리닝하도록 조정될 수 있다. 혼성화 후 세척은 엄격도 조건을 결정한다. 바람직한 한 세트의 조건으로, 실온에서 15 분 동안 6X SSC, 0.5 ％ SDS로 우선 세척하고, 45 ℃에서 30 분 동안 2X SSC, 0.5 ％ SDS로 세척하고, 50 ℃에서 30 분 동안 0.2X SSC, 0.5 ％ SDS로 2 회 세척하는 순차적 단계를 이용한다. 더 바람직한 엄격도 조건의 세트로서, 보다 높은 온도를 이용하고 여기서 0.2X SSC, 0.5 ％ SDS로 30 분 동안 2 회 세척하는 마지막 단계의 온도를 60 ℃로 높이는 것을 제외하고는 상기 단계와 동일한 조건을 사용한다. 또 다른 바람직한 고엄격 조건의 세트로서, 2 회의 최종 세척 단계에서 65 ℃, 0.1X SSC, 0.1 ％ SDS를 사용한다. 추가적으로 바람직한 엄격도 조건으로는, 65 ℃에서 0.1X SSC, 0.1 ％ SDS로 혼성화하고, 순차적으로 2XSSC, 0.1 ％ SDS 및 0.1X SSC, 0.1 ％ SDS를 사용하여 세척하는 것을 포함한다.
혼성화에서는 상보적 서열을 포함하는 2 개의 핵산이 필요하고, 혼성화의 엄격도에 따라 다르지만, 염기들 간의 불일치(mismatch)가 일어날 수 있다. 핵산의 혼성화를 위한 적절한 엄격도는 핵산 길이와 상보성에 따라 달라지며, 다양한 변형법이 당업계에 공지되어 있다. 뉴클레오티드 서열 간의 유사성 또는 상동성 정도가 클수록, 상기 서열의 핵산을 혼성화하기 위한 Tm 값은 더 커진다. 핵산 혼성화의 상대적 안정도(높은 Tm 값에 해당함)는 RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA의 순서대로 감소한다. 뉴클레오티드 100 개보다 긴 길이를 갖는 뉴클레오티드의 혼성화를 위해 Tm 값의 계산 수식을 유도하였다(Sambrook et al., 상기 문헌, 9.50-9.51 참고). 짧은 핵산, 즉 올리고뉴클레오티드의 혼성화를 위해서는, 불일치의 위치가 더 중요하고, 올리고뉴클레오티드의 길이가 혼성화의 특이성을 결정한다(Sambrook et al., 상기 문헌, 11.7-11.8 참고). 한 실시양태에서, 혼성화할 수 있는 핵산의 길이는 뉴클레오티드 약 10 개 이상이다. 혼성화할 수 있는 핵산의 최소 길이는 바람직하게는 뉴클레오티드 약 15 개 이상이고, 더 바람직하게는 뉴클레오티드 약 20 개 이상이고, 가장 바람직하게는 뉴클레오티드 30 개 이상이다. 또한 당업계의 숙련자는 프로브(probe) 길이와 같은 인자에 의해, 온도 및 세척 용액의 염 농도가 조정될 수 있음을 알고 있을 것이다.
용어 "서열 분석 소프트웨어"는, 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 분석에 유용한 임의의 컴퓨터 연산법 또는 소프트웨어 프로그램을 말한다. "서열 분석 소프트웨어"는 상업적으로 입수 가능하거나 또는 독립적으로 개발될 수 있다. 전형적인 서열 분석 소프트웨어에는, GCG 프로그램 패키지(Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI), BLASTP, BLASTN, BLASTX(Altschul et al.,J. Mol. Biol.215: 403-410 (1990))와 DNASTAR(DNASTAR, Inc. 1228 S. Park St. Madison, WI 53715 USA)와 스미스-워터만 연산법을 포함한 FASTA 프로그램(W. R. Pearson,Comput. Methods Genome Res., [Proc. Int. Symp.] (1994), Meeting Date 1992,111-20. Editor(s): Suhai, Sandor. Publisher : Plenum, New York, NY) 등이 포함된다. 본원의 내용에 있어서, 서열 분석 소프트웨어가 분석에 사용되고, 별도 기재가 없는 한 분석 결과는 인용된 상기 프로그램의 "기본 값"을 사용하였음을 알 것이다. 본원에 사용된 "기본 값"은 최초 설정된 소프트웨어의 값 또는 매개변수를 말한다.
본원에 사용된 표준 재조합 DNA와 분자 클로닝 기술은 당업계에 공지되어 있으며, 문헌 [Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., Molec㎕ar Cloning : A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)(이 후 "마니아티스(Maniatis)"로 언급함); and by Silhavy, T. J., Bennan, M. L. and Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Cold Press Spring Harbor, NY (1984); and by Ausubel, F. M. et al., Current Protocol in Molecular Biology, published by Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987)]에 기재되어 있다.
본 발명은 메탄 및 메탄올과 같은 C1 탄소원으로부터 다양한 물질을 생산하는데 유용한, 독특한 메탄영양요구성 박테리아 균주를 제공한다. 본원에서 상기 균주는 메틸로모나스 16a로 언급하며 빠른 증식시간과 높은 수율 및, 엔트너-도우도로프 탄소경로뿐만 아니라 엠덴-마이어호프경로를 코딩하는 유전자를 포함하여 탄소이동 조절 및 높은 탄소 혼입이 가능한 특징을 갖는다. 상기 균주는 단세포 단백질, 세포외 다당류 및 전분과 같은 다양한 식품 및 사료 생산물을 생산한다. 상기 균주는 동일 생물체 내에서 단백질, 탄수화물 및 전분을 다양한 농도로 조작할 수 있기 때문에, 식품 및 사료 물질 생산이 특히 높은 값을 갖는다. 이러한 능력으로 상기 균주를 특정 식품 및 사료의 응용생산에 독특하게 조작할 수 있다. 또한, 상기 균주는 색소 및 중합체성 물질의 단량체로서 유용한 터페노이드 및 카로티노이드 화합물의 생산에 사용될 수 있다.
메틸로모나스 16a의 단리
연못 퇴적물에서 메틸로모나스 16a를 포함하는 최초 자연환경 시료를 얻었다. 연못 퇴적물을 공기 중 25 ％ 메탄 하에서, 규정 미네랄 배지에 접종하였다. 유일한 탄소원 및 에너지원으로 메탄을 사용하였다. 660 nm에서의 흡광도가 일정할 때까지 배양시킨 후, 상기 배양액을 새로운 배지에 접종하여 1:100으로 희석되도록 하였다. 유일한 탄소원 및 에너지원으로 메탄을 사용한 연속적인 3 회 접종 후, 상기 배양액을 규정 최소 배지 아가(agar)에 플레이팅하고, 공기 중 25 ％ 메탄 하에서 인큐베이션시켰다. 많은 메탄영양요구성 박테리아를 상기 방법으로 단리하였다. 그러나, 빠른 콜로니(colony)의 성장, 큰 콜로니 크기, 최소 배지에서의 성장능, 및 카로티노이드의 활성화된 생합성 경로를 표지하는 분홍 색소화의 특징을 갖는 메틸로모나스 16a를 연구용 생물체로서 선택하였다.
탄소 혼입 방법, 외형, GC 함량％ 및 특정 주요 효소의 존재 유무에 기초하여, 메탄영양요구성 균주를 3 개 그룹으로 분류할 수 있다("유형 I", "유형 X" 또는 "유형 II"). 실시예 4의 표 2에서, 메탄영양요구성 균주의 3 개 주요 그룹과 관련하여 메틸로모나스 16a를 결정할 수 있는 주요 특징을 나타내었다. 질소 고정을 제외한 모든 특성을 고려하였을 때, 상기 균주는 분명하게 유형 I 그룹에 포함된다. 일반적으로 상기 생물체는 질소를 고정할 수 없다고 알려져 있다. 따라서, 메틸로모나스 16a는 상기 질소 대사의 관점에서 독특함을 나타낸다.
상기 균주에서 추출한 16SrRNA의 서열을 분석하여 다른 미생물의 공지 16SrRNAs와 비교하였다. 비교 결과, 메틸로모나스 종 KSP III 및 메틸로모나스 종 LW13 균주의 서열과 96 ％ 서열 동일성을 나타내었다. 상기 결과와 표 2(실시예 4)에 기재된 생리학적 특성에 기초하여, 상기 균주는 메틸로모나스 속에 포함되는 것을 확인하였다.
메틸로모나스 16a의 대사적 및 생리학적 특성
탄소 대사
본원의 메탄영양요구성 박테리아 균주인 메틸로모나스 16a는 탄소 이용의 1차 단계로서 메탄 모노옥시게나제를 이용하여 메탄을 메탄올로 전환시킨다. 상기 균주에 존재하는 메탄 모노옥시게나제는 가용성 모노옥시게나제가 아닌 미립자형이다. 미립자형 메탄 모노옥시게나제(pMMO)는 당업계에 공지되어 있고(Murrell et al.,Arch. Microbiol. (2000), 173 (5-6), 325-332), 다수의 상기 효소가 단리되고 서열이 분석되었다. pMMO는 sMMO의 넓은 기질 특이성과 달리, 좁은 기질 특이성을 나타낸다. sMMO는 특정 생산물의 효율적 생산에 필요한 다수의 화학적 중간체의 변형이 필요하기 때문에, 상기 이유로 인하여 pMMO 효소가 대량의 화학물질 생산에 적합하다.
공개적으로 입수 가능한 테이타베이스의 서열과 상동성 비교에 기초하여, 본원의 균주에서 단리된 pMMO의 유전자 및 유전자 산물을 서열 분석하고 기능을 확인하였다. 상기 서열은 메틸로코커스 켑술라터스(GenBank B57266)에서 단리한 서열과 매우 높은 상동성을 나타내었다.
본원의 균주는 탄소 이용 경로에서 많은 예외를 지니고 있다. 예를 들면 게놈 서열 테이타에 기초하여, 상기 균주는 6 탄당 대사의 2 개 경로에 사용되는 유전자를 지니고 있다. 상기 균주에는 케토-데옥시 포스포글루코네이트 알돌라제 효소를 이용하는 엔트너-도우도로프 경로가 존재한다. 상기 경로는 절대 메탄영양요구성 균주에서의 효과적인 경로로서 공지되어 있다. 또한, 프럭토스 비스포스페이트 알돌라제 효소를 이용하는 엠덴-마이어호프 경로도 존재한다. 상기 경로는 절대 메탄영양요구성 균주에서 존재하지 않거나 비효과적인 경로로 공지되어 있다. 에너지 측면에서 상기 엠덴-마이어호프 경로가 가장 바람직하고 생물학적으로 유용한 에너지를 고수율로 얻을 수 있으며, 궁극적으로 메틸로모나스 16a의 세포량 및 다른 세포량-의존성 생산물의 고수율을 야기한다. 본원의 16a 균주에 존재하는 상기 경로의 활성은 마이크로어레이 테이타와, ATP 환원을 측정한 생화학적 증거를 통해 확인하였다. 상기 16a 균주는 엠덴-마이어호프와 엔트너-도우도로프 경로의효소를 모두 포함하지만, 상기 테이타는 엠덴-마이어호프 경로의 효소가 엔트너-도우도로프 경로의 효소보다 더 강하게 발현되는 것을 나타내었다. 상기 결과는, 메탄영양요구성 박테리아의 당 분해 대사에 관한 기존의 생각과 상반되는 놀라운 것이다. 본 발명의 출원인은 메틸로모나스 클라라(Methylomonas clara) 및 메틸로시너스 스포리움(Methylosinus sporium)과 같은, 다른 메탄영양요구성 박테리아가 상기 특징을 갖고 있음을 발견하였다. 메탄영양요구성 균주에서의 상기 활성은, 대부분의 박테리아 시스템에서 효소에 전형적으로 인산기를 공여하는 ATP에 대한 효소활성의 결여로 발견되지 않았다.
본원의 균주 16a에서 상기 엠덴-마이어호프 경로의 특히 새롭고 유용한 특징은, 주요 포스포프럭토키나제 단계가 ATP에 의존적이지 않고 피로포스페이트에 의존적인 것이다. 상기 특징은 ATP 대신 피로포스페이트를 사용하여 경로의 에너지 수율을 높인다(실시예 6). 이것은 균주에 에너지 측면의 잇점을 제공하는 중요한 것으로서, 탄소이동 경로에서의 상기 유전자는 본원의 균주에 특징적인 것이다.
스미스-워터만 정렬 연산법(W. R. Pearson,Comput. Methods Genome Res., [Proc. Int. Symp.] (1994), Meeting Date 1992,111-20. Editor(s): Suhai, Sandor. Publisher: Plenum, New York, NY)을 사용하여, 피로포스페이트 의존성 포스포프럭토키나제의 유전자 서열 (서열 5)과 공개 테이타베이스에서 추론된 아미노산 서열 (서열 6)을 비교한 결과, 가장 유사한 기존 서열이 본원에 기재된 437 개의 아미노산 서열과 약 63 ％ 동일함을 나타내었다. 더 바람직한 아미노산 단편은 본원의 서열과 약 80 ％ 내지 90 ％ 이상 동일하다. 가장 바람직한 아미노산 단편은 본원의 서열에 약 95 ％ 동일하다. 이와 유사하게, 바람직한 피로포스페이트 의존성 포스포프럭토키나제의 코딩 유전자에 해당하는 핵산 서열은 활성 단백질을 코딩하고, 상기 서열은 본원에 기재된 핵산 서열과 80 ％ 이상 동일하다. 더 바람직한 피로포스페이트 의존성 포스포프럭토키나제 핵산 단편은 본원의 서열과 90 ％ 이상 동일하다. 가장 바람직한 피로포스페이트 의존성 포스포프럭토키나제 핵산 단편은 본원에 기재된 핵산 서열과 95 ％ 이상 동일하다.
따라서 본 발명은,
(A) 메탄 및 메탄올로 구성된 군에서 선택된 C1 탄소기질을 사용하여 성장하며;
(B) (a) 서열 6에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 단리된 핵산 분자;
(b) 65 ℃에서 0.1X SSC, 0.1 ％ SDS로 혼성화시키고 순차적으로 2X SSC, 0.1 ％ SDS 및 0.1X SSC, 0.1 ％ SDS로 세척하는 혼성화 조건 하에서 상기 (a)의 핵산 분자와 혼성화되는 단리된 핵산 분자;
(c) 서열 6에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드와 비교할 때, 스미스-워터만 (Smith-Waterman) 정렬 방법에 기초하여 63 ％ 이상의 동일성을 갖는 437 개 이상의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자; 및
(d) (a), (b) 또는 (c)에 상보적인 단리된 핵산 분자
로 구성된 군에서 선택된, 피로포스페이트-의존성 포스포프럭토키나제 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 기능적 엠덴-마이어호프 탄소경로를 포함하는
고성장율의 메탄영양요구성 박테리아 균주를 제공한다.
메탄 및 메탄올은 메틸로모나스 16a가 성장할 수 있는 유일한 기질이다. 상기 균주는 복합 성장인자의 첨가 없이 규정 배지에서 성장한다. 메탄올 이용은 전형적으로 "적응"이 필요하고, 또한 0.1 ％ 내지 3 ％ 범위의 메탄올 농도에서의 성장은 배양하는 "가변적인" 것으로 알려져 있다. 메틸로모나스 16a는, 메탄올 600 mM (2.4 ％)의 고농도에서 적응 없이 높은 수율로 성장함이 밝혀졌다.(도 2).
메탄영양요구성 박테리아에서, 메탄은 리불로스 모노포스페이트 경로 또는 RuMP 회로로 알려진 회로적 반응 세트를 통해 생분자로 전환된다. 상기 경로는 3 개의 단계를 포함하고, 각각의 단계는 일련의 효소적 단계를 지닌다. 제1 단계는, C-1 (포름알데히드)가 5 탄당에 "고정" 또는 부가되어 6 탄당 또는 6 개 탄소의 당을 형성한다. 상기 반응은 5 개 탄소의 당(5 탄당)과 포름알데히드 사이의 축합 반응을 통해 발생하고, 헥술로스 모노포스페이트 신타제에 의해 촉매된다. 제2 단계는, "분할"이라 불리우며, 6 탄당을 2 개의 3 탄소 분자로 분리한다. 상기 3 탄소 분자 중 1 개 분자는 RuMP 경로를 통해 재순환되고, 다른 3 탄소 단편은 세포 의 성장에 사용된다. 메탄영양요구성 균주와 메틸영양요구성 균주에 있어서, 상기 RuMP 경로는 3 개의 변형된 경로 중 1 개의 경로로서 발생할 수 있다. 그러나, 일반적으로 3 개의 변형된 경로 중 단지 2 개의 경로(FBP/TA(프럭토스 비스포스포타제/트렌스알돌라제) 또는 KDPG/TA(케토 데옥시 포스포글루코네이트/트렌스알돌라제) 경로)만이 발견된다(Dijkhuizen L., G. E. Devries. The physiology and Biochemistry of aerobic methanol-utilizing gram negative and gram positivebacteria. In: Methane and Methanol Utilizers 1992, ed. Colin Murrell and Howard Dalton. Plenum Press, NY).
본원의 균주는, 주요 중간체로서 프럭토스 비스포스페이트를 통한 상기 전환을 수행하는 경로의 유전자로서 "분할" 단계를 조정하는 방법에서 특이적이다. 프럭토스 비스포스페이트 알돌라제 및 트렌스알돌라제의 유전자는, 1 개의 DNA 상에 함께 모여있다. 또다른 경로에서, 케토 데옥시 포스포글루코네이트 중간체가 관여된 다른 변형 경로의 유전자도 함께 모여있다. 문헌에는, 상기 생물체(메틸영양요구성 균주 및 메탄영양요구성 균주)가 단지 KDPG 경로에 의존적이며, FBP-의존성 고정 경로는 통성 메틸영양요구성 균주에 의해 이용된다고 기재되어 있다(Dijkhuizen et al., 상기 문헌). 따라서 KDPG 경로의 이용이 아닌, FBP-의존성 고정 경로의 이용이 기대된다. 절대 메탄 이용 박테리아에서의 FBP 유전자 발견은 놀라운 것이고 이용도에 암시적인 것이다. FBP 경로에서는, KDPG 경로에서 사용되는 에너지(ATP)보다 적은 에너지가 사용되기 때문에 숙주 미생물의 에너지 측면에서 바람직하다. 따라서, FBP 경로를 이용하는 생물체는, KDPG 경로를 이용하는 생물체보다 에너지 측면의 잇점 및 성장에서의 잇점을 갖는다. 상기 잇점은 또한 본원의 균주에서의 에너지 소요 생산 경로에 유용할 수 있다. 상기 경로를 이용함으로써, 특정 메탄 이용 박테리아는 단세포 단백질 또는 임의의 다른 생산물의 생산 기저가 RuMP 경로를 통한 탄소이동에서 유래하기 때문에 다른 메탄 이용 생물체보다 잇점을 가질 수 있다.
따라서 본 발명은, 서열 1-20에 기재된 유전자 및 유전자 산물을 포함하고,피로포스페이트 의존성 포스포프럭토키나제 피로포스페이트와 케토-데옥시 포스포글루코네이트(KDPG) 알돌라제를 코딩하는, 2 개의 뚜렷한 탄소이동 경로를 지닌 메틸로모나스를 제공한다. 스미스-워터만 정렬 연산법(W. R. Pearson, 상기 문헌)을 사용한, KDPG 알돌라제 유전자 서열 (서열 19)과 공개 테이타베이스에서 추론된 아미노산 서열 (서열 20)을 비교한 결과, 가장 유사한 공지 서열이 본원에 기재된 212 개의 아미노산 서열과 약 59 ％ 동일한 것으로 밝혀졌다. 더 바람직한 아미노산 단편은 본원의 서열과 약 80 ％ 내지 90 ％ 이상 동일하다. 가장 바람직한 핵산 단편은 본원에 기재된 아미노산 단편과 95 ％ 이상 동일하다. 이와 유사하게, 본원 유전자에 해당하는 바람직한 KDPG 알돌라제 코딩 핵산 서열은 활성 단백질을 코딩하는 서열이며, 본원에 기재된 뉴클레오티드 서열과 80 ％ 이상 동일한 서열이다. 더 바람직한 KDPG 알돌라제 핵산 단편은 본원의 서열과 90 ％ 이상 동일하다. 가장 바람직한 KDPG 알돌라제 핵산 단편은 본원에 기재된 핵산 단편과 95 ％ 이상 동일하다.
따라서, 본 발명의 목적은, 메탄 또는 메탄올에서만 성장할 수 있고, 피로포스페이트 의존성 포스포프럭토키나제 효소를 코딩하는 유전자와,
(a) 서열 20에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 단리된 핵산 분자;
(b) 65 ℃에서 0.1X SSC, 0.1 ％ SDS로 혼성화시키고, 순차적으로 2X SSC, 0.1 ％ SDS 및 0.1X SSC, 0.1 ％ SDS로 세척하는 혼성화 조건 하에서 상기 (a)의 핵산 분자와 혼성화되는 단리된 핵산 분자;
(c) 서열 20에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드와 비교할 때, 스미스-워터만정렬 방법에 기초하여 59 ％ 이상의 동일성을 갖는 212 개 이상의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자; 및
(d) (a), (b) 또는 (c)에 상보적인 단리된 핵산 분자
로 구성된 군에서 선택된, 케토-데옥시 포스포글루코네이트 알돌라제 효소를 코딩하는 1 종 이상의 유전자를 포함하는 기능적 엠덴-마이어호프 탄소경로를 포함하는고성장율의 메탄영양요구성 박테리아 균주를 제공하는 것이다.
피로포스페이트 의존성 포스포프럭토키나제 효소 및 케토-데옥시 포스포글루코네이트 알돌라제 효소 이외에, 상기 균주는 FBP 알돌라제, 포스포글루코뮤타제, 피로포스페이트 의존성 포스포프럭토키나제 피로포스페이트, 6-포스포글루코네이트 데히드라타제 및 글루코스-6 포스페이트-1 데히드로게나제를 비롯한 다른 탄소이동 유전자를 포함한다. 상기 포스포글루코뮤타제는 글루코스-6-포스페이트와 글루코스-1-포스페이트를 상호 전환시키고, 이것은 엔트너-도우도로프 또는 엠덴-마이어호프 탄소이동 경로에 공급된다. 도 3에 나타낸 것과 같이, 프럭토스-6-포스페이트는 글루코스 포스페이트 이소머라제에 의해 글루코스-6-포스페이트로 전환(엔트너-도우도로프)되거나, 또는 포스포프럭토키나제에 의해 프럭토스-1,6-비스포스페이트(FBP)로 전환(엠덴-마이어호프)될 수 있다. 엠덴-마이어호프 경로 이후에, FBP는 FBP 알돌라제에 의해 2 개의 3-탄소 잔기(디히드록시아세톤 및 3-포스포글리세르알데히드)로 전환된다. 엔트너-도우도로프 시스템으로 돌아와서, 글루코스-6-포스페이트는 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제에 의해 6-포스포글루코네이트로 전환된 후, 6 포스포글루코네이트 데히드라타제에 의해 2-케토-3-데옥시-6-포스포글루코네이트(KDPG)로 전환된다. 그 후, 상기 KDPG는 KDPG 알돌라제에 의해 2 개의 3-탄소 잔기(피루베이트 및 3-포스포글리세르알데히드)로 전환된다. 따라서, 엠덴-마이어호프 및 엔트너-도우도로프 경로는 3-포스포글리세르알데히드 수준에서 재결합된다.
고성장율의 메탄영양요구성 박테리아의 동정
비록 본원의 16a 균주는 우연히 단리되었지만, 본원의 방법으로 유사 균주의 일반적 동정 및 단리가 가능할 수 있다. 예를 들면, 본원의 고성장율 균주의 주요 특징은, 상기 균주가 유일한 탄소원으로 메탄 또는 메탄올만을 사용하는 절대 메탄영양요구성 균주이고, 기능적 엠덴-마이어호프 경로, 특히 피로포스페이트 의존성 포스포프럭토키나제를 코딩하는 유전자를 갖는다는 것이다. 메탄영양요구성 균주의 단리 방법은 당업계에서 일반적이고 공지되어 있다(예를 들면, Thomas D. Brock in Biotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology, Second Edition (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA., or Deshpande, Mukund V.,Appl. Biochem. Biotechnol., 36,227, (1992) 참고). 이와 유사하게, 피로포스페이트 의존성 포스포프럭토키나제는 포유류 시스템에서 잘 기술되어 있고, 분석 방법도 잘 개발되어 있다(예를 들면, Schliselfeld et al. Clin. Biochem. (1996), 29 (1), 79-83; Clark et al.,J.'Mol. Cell. Cardiol.(1980), 12 (10), 1053-64) 참고). 현재의 미생물학자는 본원의 고성장율 균주를 동정하기 위하여 상기 기술을 이용할 수 있을 것이다.
본 발명의 특정 균주는, 서열 6에 기재된 아미노산 서열을 갖는 특정 피로포스페이트 의존성 포스포프럭토키나제를 지닌다. 본원의 균주는 메탄영양요구성 박테리아 균주에서, 상기 효소를 코딩하는 유전자의 존재를 분석함으로써 더 특성화될 수 있다.
따라서, 본 발명의 목적은,
(a) 고성장율의 메탄영양요구성 박테리아 균주를 포함하는 것으로 추측되는 시료를, 유일한 탄소원으로서 메탄의 존재 하에 적절한 배양 배지에서 배양하는 단계;
(b) 단계 (a)의 조건 하에서 배양된 콜로니(colony)를 동정하는 단계;
(c) 단계 (b)에서 동정된 콜로니에 피로포스페이트 의존성 포스포프럭토키나제 활성이 존재하는지 분석하는 단계
를 포함하는, 제1항에 따른 고성장율의 메탄영양요구성 박테리아 균주를 동정하는 방법을 제공하는 데 있다.
성장 특징
메탄영양요구성 박테리아에서 상기 탄소이동 특성의 존재는 기존에 알려져 있지 않았으며, 상기 특성으로 인하여 상기 균주 및 상기 경로를 지닌 다른 균주가 상기 경로를 갖지 않는 균주보다 빠른 배양 속도와 증가된 탄소전환 효율을 지닐 수 있다. 본원의 메틸로모나스 16a는 메탄에서 단지 2.5 h의 배증시간(doubling time)으로 성장할 수 있음이 밝혀졌다. 이것은 매우 빠른 성장속도이며, 균주 개발에서 수행되는 유전자 조작뿐만 아니라 상업적 이용에도 분명한 잇점을 나타낸다. 또한, 메틸로모나스는 효모 추출물 또는 다른 비싼 발효 첨가물과 같은 유기성장 인자를 필요로 하지 않는다. 상기 균주는 최적의 배양에 단지 메탄 또는 메탄올, 무기물, 산소 및 물만을 요구하기 때문에, 본원의 균주는 저비용으로 대규모 배양을 할 수 있는 잇점을 갖는다.
특히 주목할 만한 것은 본원 균주의 고수율이다. 본원에서 수율은 대사되는 탄소기질 1 g 당 생산되는 세포량을 말한다. 본원의 균주는, 대사되는 메탄 1 g 당 0.8 g 초과의 세포량, 바람직하게는 1.0 g 초과의 세포량을 생산하는 것으로 밝혀졌다. 이와 유사하게, 본원의 균주는 대사되는 메탄올 1 g 당 0.3 g 초과, 바람직하게는 0.45 g 초과, 더 바람직하게는 0.5 g 초과의 세포량을 생산하는 것으로 밝혀졌다.
탄소전환 효율은 세포량으로 동화된 탄소의 양에 대한 또다른 측정치이다. 탄소전환 효율은 g/mol 생체량 당 g/mol 메탄(1 g 건중량/g 메탄)의 단위로 나타낼 수 있다. 탄소전환 효율은 생물자원의 조성을 CH2O0.5N0.25로 가정하여 계산한 것이다. 본원의 균주는, 일반적으로 효율이 40 초과의, 바람직하게는 50 초과의, 더 바람직하게는 65 초과의, 특히 바람직하게는 70 초과의 특히 높은 탄소전환 효율을 가질 것이다.
메탄올 이용도
메틸로모나스 16a는 600 mM의 높은 메탄올 농도에서 성장한다. 전형적으로 상기 농도의 메탄올은 몇몇 메탄영양요구성 박테리아에 독성을 나타낼 수 있다. 메틸로모나스 16a는, 메탄영양요구성 박테리아에 대해 공지된 메탄올 내성 스펙트럼의 상한선인 약 2.4 ％까지의 메탄올에 내성을 나타낼 수 있다(Green, Peter, Taxonomy of Methylotrophic Bacteria. In : Methane and Methanol Utilizers (Biotechnology Handbooks 5) J. Colin Murrell and Howard Dalton eds., 1992 Pleanum Press NY, pp 23-84). 상기 특성은 또한, 메탄올에 대한 허용도가 높아서 필요한 혼합 포트의 수가 적기 때문에, 반응조 설계에서 더 낮은 비용으로 설계할 수 있다(즉, 낮은 설비 비용). 상기 문제점(메탄올 독성을 극복하기 위한 혼합으로 소요되는 높은 반응조 설계 비용)은 메탄영양요구성 박테리아를 메탄올에서 배양하는 데에 있어서 주요 장애요소이다.
글리코겐 생산
메틸로모나스 16a는 메탄올에서 활발하게 성장하는 동안 상기 균주 중량의 50 ％나 되는 글리코겐을 생산하고, 메탄에서 활발하게(자극이 관련되지 않은) 성장하는 동안 상당량의 글리코겐을 생산하는 것으로 밝혀졌다. 상기 특성은, 유일한 생산물로서 단지 단백질만을 생산하는 다른 절대 메탄영양요구성 균주와 비교하였을 때, 다양한 동물 사료의 영양적 요구를 충족시킬 수 있는 단백질과 탄수화물의 혼합물 생산에 유용하다. 또한, 상기 특성은 메탄 또는 메탄올에서 글리코겐을 생산하는 숙주 균주로서의 메틸로모나스 16a를 가능하게 한다. 또한, 메틸로모나스 16a에서는 세포내 6 탄당 대사가 분명히 존재한다. 따라서 상기 생물체는, 전형적으로 탄수화물 대사에 의해서만 생산되는 것으로 여겨지는 화학적 산물의 생산에서 숙주로 이용될 수 있다. 따라서 본 발명은 약 20 ％ 내지 약 40 ％의 글리코겐의 생산이 전형적인 메탄올을 이용한 배양에서, 글리코겐을 세포량의 50 ％나 되게 생산할 수 있는 메틸로모나스 균주를 제공한다.
색소 및 터페노이드 생산
본원의 메틸로모나스 균주는 다양한 색소, 특히 이소프레노이드 색소를 생산하는 데 유용하다. 상기 종류의 색소는 강한 흡광능을 지니는 것으로 알려져 있고, 5, 10, 15, 20, 25, 30 또는 40 개의 탄소 이소프렌 쇄의 머리-꼬리 축합으로 생성된다. 본원의 균주에서 발견된 특정 색소로서 C-30 카로티노이드가 있다. 세포내의 상기 색소 함량은 매우 높고, 이것은 이소프레노이드 경로를 통한 기본적으로 높은 탄소이동을 나타낸다. 상기 특징은 이소프레노이드 경로가 이소프레노이드-유래 생산물을 위한 "골격 생산 경로"임을 보여주는 기초를 제공한다. 예를 들면, 아스타크산틴, β-카로틴, 칸타크산틴 및 루테인과 같은 고가치의 카로티노이드가 상기 생물체에서 생산될 수 있음을 예상할 수 있다.
또한 본원의 균주는 다양한 이소프레노이드 화합물의 생산능을 가질 것으로 기대된다. 이소프레노이드는 이소펜테닐 디포스페이트(IPP)로 알려진 단일 대사 전구체에 기초한 일반적 생합성 기원을 갖는, 매우 크고 다양한 천연 산물의 그룹이다. 이소프레노이드로 알려진 천연 산물 그룹은 생합성에 의해 5-탄소 화합물 이소펜테닐 디포스페이트에서 유래한 모든 물질을 포함한다. 이소프레노이드 화합물은 또한 "터펜" 또는 "터페노이드"로 언급되며, 이 용어는 상기 예의 다양한 종류를 지칭하는데 사용된다(Spurgeon and Porter, Biosynthesis of Isoprenoid Compound, pp 3-46, A Wiley Interscience Publication (1981)). 이소프레노이드는모든 생명체에서 발견되는 화합물이다. 공지된 이소프레노이드의 예로 몇 가지를 들면, 스테로이드(트리터펜), 카로티노이드(테트라터펜) 및 스쿠알렌이 있다.
상기 화합물의 생합성에는, 전형적으로 이소펜테닐 피로포스페이트 효소가 관여하며, 5, 10, 15, 20, 30 또는 40 개 탄소 길이의 이소프렌 단위의 머리-꼬리 축합반응에 의해 생성된다.
리모넨, 멘톨 및 게라니올과 같은, 관련된 고리형의 다른 소 분자는 적절한 식물-유래 터펜 신타제의 도입을 통해 본원의 균주에서 생산될 수 있다. 따라서, 이소프레노이드 경로는 메탄 또는 메탄올을 사용하여 복합 고리 분자 및 불포화 분자를 생산하는 기저 경로로 볼 수 있다. 상기 능력은 생물학에서 독특한 것이며, 순수 화학적 방법으로는 C-1 화합물을 임의의 특이성을 갖는 고리형 분자로 전환할 수 없다.
이소프레노이드 경로의 많은 단계들이 알려져 있다. 예를 들면, 교차 경로의 최초 단계는 3-탄소 분자(피루베이트와 C1 알데히드 기, D-글리세르알데히드 3-포스페이트)의 축합으로 5-탄소 화합물(D-1-데옥시크실룰로스-5-포스페이트)을 생산하는 것을 포함한다. 루이스 등(Lois et al)은, 대장균에서 D-1-데옥시크실룰로스-5-포스페이트의 합성을 촉매하는 D-1-데옥시크실룰로스-5-포스페이트 신타제(DXS)의 코딩 유전자dxs에 대해 보고하였다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 2105-2110 (1998)).
다음 단계에서는, 불특정 환원 과정으로 D-1-데옥시크실룰로스-5포스페이트의 분자 내부적 재배열이 발생하여 2-C-메틸-D-에리쓰리톨-4-포스페이트가 생성된다. 상기 환원과정에 관여하는 효소로서 D-1-데옥시크실룰로스-5-포스페이트 리덕토이소머라제(DXR)가 있다. 타까하시 등(Takahashi et al.)은, 대장균에서 교차 경로내의 2-C-메틸-D-에리쓰리톨-4-포스페이트 생성을 촉매하는dxr유전자에 대해 보고하였다(Proc. Natl. Acad. Sci.USA 95: 9879-9884 (1998)).
2-C-메틸-D-에리쓰리톨-4-포스페이트를 이소펜테닐 모노포스페이트로 전환시키는 단계는 잘 밝혀져 있지 않고, 일부 단계만 알려져 있을 뿐이다. 시토신 3-포스페이트(CTP) 의존성 반응에서, 2C-메틸-d-에리쓰리톨 시티딜일트렌스퍼라제를 코딩하는 비-주석의(non-annotated) 유전자ygbP에 의해 코딩되는 효소를 이용하여 2-C-메틸-D-에리쓰리톨-4-포스페이트가 4-디포스포시티딜-2C-메틸-D-에리쓰리톨로 전환된다. 론디히 등(Rondich et al.)은 상기 반응을 촉매하는 대장균 내에서의 YgbP 단백질에 대해 보고하였다(Proc. Natl. Acad. Sci.USA 96: 11758-11763 (1999)). 최근에ygbP유전자는isp유전자 군의 일부로서ispD로 재명명되었다. 4-디포스포시티딜-2C-메틸-D-에리쓰리톨의 제2 위치 히드록시기는 ATP 의존성 반응에서,ychB유전자에 의해 코딩되는 4-디포스포시티딜-2-C-메틸에리쓰리톨 키나제에 의해 인산화될 수 있다. 루트겐 등(Luttgen et al.)은 대장균에서 4-디포스포시티딜-2C-메틸-D-에리쓰리톨을 인산화시켜 4-디포스포시티딜-2C-메틸-D-에리쓰리톨 2-포스페이트를 생성하는 YchB 단백질에 대해 보고하였다(Proc. Natl. Acad. Sci.USA 97: 1062-1067 (2000)). 최근에 상기ychB유전자는isp유전자 군의 일부로서ispE로 재명명되었다.
허츠 등(Herz et al.)은 대장균에서의ygbB유전자 산물(2C-메틸-d-에리쓰리톨 2,4-시클로디포스페이트 신타제)가 CTP-의존성 반응에서, 4-디포스포시티딜-2C-메틸-D-에리쓰리톨 2-포스페이트를 2C-메틸-D-에리쓰리톨 2,4-시클로디포스페이트로 전환시키는 것에 대해 보고하였다. 2C-메틸-D-에리쓰리톨 2,4-시클로디포스페이트는 카로티노이드 생합성 경로를 통하여 카로티노이드로 더 전환될 수 있다(Proc. Natl. Acad. Sci.USA 97: 2486-2490 (2000)). 최근에ygbB유전자는isp유전자 군의 일부로서ispF로 재명명되었다.
YgbB 및 YgbP 효소에 의해 촉매되는 상기 2 개의 반응은 CTP 의존성 방법으로 수행된다. 따라서, CTP 신타제는 이소프레노이드 경로에서 중요한 역할을 한다. 대장균의pyrG유전자에 의해 코딩되는 PyrG는 CTP 신타제를 코딩하는 것으로 밝혀졌다(Weng et al.,J. Biol. Chem., 261: 5568-5574 (1986)).
이소펜테닐 모노포스페이트 생성 이후의 몇몇 반응은 아직 밝혀지지 않았다. 이소펜테닐 모노포스페이트는ipk유전자에 의해 코딩되는 이소펜테닐 모노포스페이트 키나제 효소를 이용하여 이소펜테닐 디포스페이트(IPP)로 전환된다(Lange and Croteau,Proc. Natl. Acad. Sci.USA 96: 13714-13719 (1999)).
프레닐트렌스퍼라제는 이소펜테닐 디포스페이트(IPP)의 연속적인 축합을 촉매하여, 쇄 길이가 다양한 프레닐 디포스페이트를 형성하는 광범위한 효소 군을 구성한다. 프레닐 트렌스퍼라제의 상동성 유전자는 그들의 아미노산 서열에서 매우 보존된(conserved) 부분을 갖는다. 오또 등(Ohto et al.)은 시아노 박테리아인 시네코코커스 엘롱가투스(Synechococcus elongatus)에 존재하는 3 개의 프레닐 트렌스퍼라제 유전자에 대해 보고하였다(Plant Mol. Biol.40: 307-321 (1999)). 상기프레닐 트렌스퍼라제로는 게라닐게라닐(C20) 디포스페이트 신타제, 파네실(C15) 디포스페이트 신타제(ispA), 및 다양한 길이를 갖는 5 개의 프레닐 디포스페이트의 합성을 촉매하는 다른 프레닐트렌스퍼라제가 있다.
이소프레노이드 생합성 경로의 더 아래쪽 반응에 있어서, 특정 이소프레노이드의 합성에 더 많은 유전자가 관여한다. 상기 예로서는, 헬리오바실러스 모빌리스(Heliobacillus mobilis)에서 발견되었고, 카로티노이드 생합성 경로의 일부인 디아포피토엔 데히드로게나제를 코딩하는crtN유전자가 있다(Proc. Natl. Acad. Sci.USA 95: 14851-14856 (1998))
이소프레노이드 경로에 관여하는 몇몇의 유전자가 공지되어 있지만, 메틸로모나스 종의 이소프레노이드 경로에 관여하는 유전자의 존재는 거의 알려져 있지 않다. 따라서 본원의 균주에서 상기한 모든 유전자(서열 61-서열 78)를 발견한 것은 놀라운 것이다. 따라서 본원의 균주는 다양한 터페노이드의 생산에 유용할 것이다. 본 발명은 서열 61 내지 서열 78에 기재된, D-1-데옥시크실룰로스-5-포스페이트 신타제, D-1-데옥시크실룰로스-5-포스페이트 리덕토이소머라제, 2C-메틸-d-에리쓰리톨 2,4-시클로디포스페이트 신타제, 2C-메틸-d-에리쓰리톨 시티딜일트렌스퍼라제, CTP 신타제, 게라닐트렌스트렌스퍼라제(또한 파네실-디포스페이트 신타제), 4-디포스포시티딜-2-C-메틸에리쓰리톨 키나제 및 디아포피토엔 데히드로게나제를 코딩하는 유전자 및 유전자 산물을 갖는 메틸로모나스 균주를 제공한다.
단세포 단백질의 생산
본원의 균주는 식품 및 사료 산업에 있어서 가치있는 단세포 단백질(SCP)의생산에 유용하다. SCP 생산에서 생산 기저로서의 메탄영양요구성 균주 이용은 당업계에 공지되어 있다(예를 들면, 미국특허 제4,795,708호; Shojaosadati et al.,Amirkabir(1996), 8 (30), 33-41 참고). 본원의 균주는, 탄소이동에서의 잇점과 질소원 존재 하에서의 낮은 산소 소비로 인하여 상기 이용에 적합하다. 상기 균주는 또한 호기적 또는 혐기적 조건 하에서 단세포 단백질의 생산에 적합하다.
본원의 균주는 약 1.3 g 단백질/건중량/g 메탄 및 약 0.45 g 단백질/건중량/g 메탄올을 생산하여 공지의 다른 균주보다 유리하다.
세포외 다당류의 생산
다당류는 식품 및 비-식품 산업에서 증점제로서 널리 사용되는 당 중합체이다(Sanford et al.Pure ＆ Appl. Chem.56: 879-892 (1984); Sutherland,Trends Biotechnol, 16 (1) : 41-6 (1998)). 상기 다당류는 셀러드 드레싱, 잼, 냉동 식품, 제빵 제품, 캔 식품 및 건조 식품과 같은 식료품에서 발견할 수 있다. 상기 다당류는 살충제의 현탁화제, 페인트 및 기타 코딩제를 비롯한 많은 용도에 사용된다. 상기 다당류는 응집제, 결합제, 피막형성제, 윤활제 및 마찰감소제로서 작용할 수 있다. 또한 세포외 다당류는 유전에서 오일 회수를 위해 일반적으로 사용된다.
전통적으로, 원충류 및 식물 자원을 이용하여 산업적으로 유용한 다당류를 생산하였다. 지난 10 년 동안 미생물에서 유래한 다당류의 사용이 크게 증가하였다 (Sanford et al.Pure ＆ Appl. Chem.56: 879-892 (1984); Sutherland,Trends Biotechnol, 16 (1) : 41-6 (1998)).
세포외 다당류의 생합성에 관여하는 많은 유전자들이 다른 생물체에서 밝혀지고 서열 분석되었다.epsB유전자는, EPS의 중합반응 및(또는) 분비에 관여하는 것으로 생각되는 EpsB 단백질을 코딩하고, 랄스토니아 솔라(Ralstonia sola)에서 서열 분석되었다(Huang et al,Mol. Microbiol.16: 977-989 (1995)). EspM 단백질을 코딩하는espM유전자는 스크렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus)에서의esp유전자 군에서 발견되었다(Stingele et al,J. Bacteiol.178: 1680-1690 (1996)). 또다른 다당류 분비 단백질로 추정되는 WZA는 대장균에서 발견되었다(Blattner et al.,Science277: 1453-1474 (1997)). 마지막으로epsV유전자는, 당을 다당류 중간체에 전달하는 트렌스퍼라제로서의 EpsV 단백질을 코딩하고, 스트렙토코커스 써모필러스에서 서열분석되었다(Bourgoin et al.,Plasmid40 : 44-49 (1998); Bourgoin, F., et al.,Gene233: 151-161 (1999)).
미생물 세포외 다당류를 코딩하는 유전자에 대한 많은 정보가 있음에도 불구하고, 메틸로모나스와 같은 C1-이용 생물체에서 상기 경로에 관여하는 유전자가 단리 또는 특성화된 것은 없었다. 상기한 바와 같이 미생물 세포외 다당류는 많은 용도를 지니며, 메탄과 같이 풍부하고 저렴한 탄소원으로부터 상기 물질을 합성하는 것이 잇점이다.
놀랍게도, 본원의 메틸로모나스 16a는 세포외 다당류를 다량 생산하는 것으로 밝혀졌다. 상기 다당류 합성 경로를 코딩하는 유전자를 단리 및 특성화하였고, 상기 유전자 산물을 서열 21 내지 서열 38에 기재하였다.
따라서, 본 발명은 세포외 다당류를 생산할 수 있고, 미생물 다당류 생합성과 관련된ugp, gumD, wza, epsB, epsM, waaE, epsV, gumH유전자와 글리코실 트렌스퍼라제 단백질을 코딩하는 유전자를 갖는 메틸로모나스 균주를 제공한다.
탈질소화
절대 메탄영양요구성 균주에서의 탈질소화 효소의 존재는 알려지지 않았다. 본원의 균주는 서열 39 내지 서열 60에 기재된 유전자 및 유전자 산물을 포함하는 경로를 지닌다. 본원의 메틸로모나스 16a는, 메탄 또는 메탄올에서 유래한 등가물의 환원을 위해 추가적인 "전자 싱크(sink)"로서의 질소원을 낮은 산소압에서 이용할 수 있는 신규 특성을 갖는다. 질소원은 아질산염, 질산염, 암모늄 및 질소가스를 포함하나 여기에 제한되지는 않는다. 상기 균주는 질산염 또는 아질산염을 가스상 최종 생성물인 일산화질소로 환원시킨다. 상기 과정은, 질산염이 매우 가용성일 뿐만 아니라 저렴하고, 질산염의 사용으로 용존 산소를 유지하기 위한 높은 에너지 요구도가 완화되어 유용하다. 사실상 질산염은 폐수 처리 시스템에서 부수적인 산화제로서 사용된다(Koch, Gerhard; Siegrist, Hansruedi Verbandsber.-Verb. Schweiz. Abwasser-Gewaesserschutzfachleute (1998), 522 (Optimierungs-massnahmen bei Stark Belasteten Belebungsanlagen), 33-48).
비-메탄영양요구성 탈질소화 미생물에 있어서, 탈질소화로 공지된 미생물 방법은 하는 일련의 효소에 의해 촉매되어 질산염을 환원시켜 질소가스로 전환시킨다. 상기 과정의 단계 및 중간체를 효소 명칭과 함께 하기하였고, 유전자 명칭은 고려되는 과정의 범위를 규정한다.
1. N03→ N02; 호흡 질산염 환원효소 (nar유전자).
2. NO2→ NO ; 호흡 아질산염 환원효소 (nir유전자)
3. NO →N20 ; 산화질소 환원효소 (nor유전자)
4. N2O → N2; 일산화질소 환원효소 (nos유전자)
생태학적으로, 상기 과정의 결과로 토양에서 질소가 제거된다(탈질소화). 또한, 질산염은 산소에 대한 추가적 또는 선택적 산화제로 볼 수 있다. 이것은 탈질소 과정의 매우 높은 산화환원 전위에 기인한다.
제2의 주요 미생물 과정은 질소화이고, 이것은 하기의 반응, 효소 및 유전자의 세트를 포함한다.
1. NH4→ NH2OH ; 암모니아 모노옥시게나제 (amo유전자)
2. NH2OH → N02; 하이드록실아민 산화환원효소
3. NO2→ NO3; 아질산염 산화효소
질소화는 토양에서 질산염을 생성하는 산화적 과정인 반면, 탈질소화는 토양에서 질산염을 고갈시키는 환원적 과정이다.
절대 메탄영양요구성 박테리아가 질소화 박테리아 군에 포함되는 것은 공지되어 있다. 이것은, 모든 절대 메탄영양요구성 균주에서 발견되는 메탄 모노옥시게나제가, 암모니아 모노옥시게나제의 반응과 동일하고 메탄올을 생성하는 메탄 산소화와 유사한 반응으로, 암모니아를 산소화시켜 하이드록실아민을 생성하기 때문이다. 상기 하이드록실아민은 효소적으로 더 대사되어 아질산염으로 전환된다. 아질산염이 질산염으로 산화되는 것은 효소적으로, 또는 공기 중의 화학적 산화를 통해 자발적으로 발생할 수 있다. 그러나 메탄영양요구성 박테리아는 하이포미크로비움(Hyphomicrobium) 종과 같은 탈질소 박테리아와 함께, 간접적으로 탈질소화에 관련되어 있다(Amaral, J. A. Archambault, C. S. R. Richards, R. Knowles 1995.FEMS Microbiology Ecology18 289-298). 상기 호흡 과정은, 세포 동화를 위한 질산염 또는 아질산염의 환원과 구별된다. 호흡 과정은 에너지 생산 과정인 반면, 동화 과정은 질소를 세포체에 혼입시킨다. 상기 동화 과정은 피리딘 뉴클레오티드가 연결된 질산염 또는 아질산염 환원효소에 의존한다. 상기 효소는 메탄영양요구성 박테리아를 비롯하여 자연계에서 많이 발견된다. 생합성에서 질산염을 유일한 질소원으로하여 성장하는 메탄영양요구성 균주는 기존의 문헌 [Hanson R. S. A. I. Netrusov, K. Tsuji. 1992. The obligate methanotrophic bacteria Methylococcus, Methylomonas, and Methylosinus. In : The Prokaryotes 2nded. Ch 18. Pp 2350-2363, A. Balows, H. G. Truper, M. Dworkin, W. Harder, K-H Schleifer eds. Springer Verlag]에 잘 알려져 있다.
본원에 기재된 유전자(서열 39 내지 서열 60)의 기능은, 호흡적 환원으로 질산염 또는 아질산염을 N20 가스로 전환시키는 것에 있다. 상기 반응에 필요한 모든 유전자의 존재를, 서열 분석과 질소를 포함하는 화합물의 생리적 환원으로 메틸로모나스 16a에서 확인하였다. 또한, 암모니아의 생물변환(질소화)에 필요한 효소를 코딩하는 유전자도 존재하였다.
상기 탈질소 능력을 갖는 절대 메탄영양요구성 균주는 적어도 하기 2 가지의 잇점이 있다.
1. 질산염은 성장에 필요한 전자 수용체로서 산소를 대체하거나 또는 추가될 수 있다. 이것은 과량 산소가 필요하여 산소 가스를 용액에 대량으로 투입함으로써 고비용이 소요되는 고환원 동물사료의 대규모 저비용 생산에서 유리할 수 있다.
2. 메탄영양요구성 균주에 의한 탈질소화는 물에 용해되어 있는 질산염을 제거하기 위해 사용되거나, 질산염 또는 다른 산소화된 질소 유도체가 문제되는 과정에서 사용될 수 있다.
메틸로모나스 16a는 본 발명에 기재된 바와 같이 아질산염을 일산화질소로 전환시키고 암모니아를 아질산염으로 전환시킬 수 있어서, 상기 메틸로모나스 16a 및 아질산염을 효과적으로 환원시킬 수 있는 다른 메탄영양요구성 균주는 공정수, 폐수, 자연수 또는 농업폐수를 정화 및 해독하기 위하여 암모니아를 제거하는 작용제로서 이용될 수 있다.
메틸로모나스 16a로의 유전자 전이
메틸로모나스 16a는 대장균 및 효모를 비롯한 다른 생물체로부터 유전자를 받아들이고 발현할 수 있다. 유전자 공여 생물체에서 유전자를 전이시키고, 메틸로모나스 16a에서의 상기 유전자 발현을 용이하게 하는 몇몇 플라스미드 벡터가 발견되었다. 따라서, 상기 균주는 유전공학적으로 조작될 수 있다.
식품 및 사료물질 생산
본원의 메틸로모나스 16a 균주는 단백질 이외에, 다당류 및 색소를 개별적으로 생산할 수 있으나, 특정 수량 및 상기 물질의 바람직한 혼합물을 포함하는 특정 식품 또는 사료물질을 생산하기 위해서 조작될 수 있다. 본원 균주의 상기 특성은 상업적으로 중요한 가치를 지닌다.
예를 들면, 서로 다른 가축은 단백질과 탄수화물의 상대적 비율로서의 영양 요구도가 서로 다를 수 있다. 예를 들면, 많은 육식성 어류는 높은 단백질 요구도를 지닌다. 반면에, 반추동물은 고섬유질 및 고탄수화물의 사료를 필요로 한다. 메틸로모나스 16a는 특정 조건 하에서 항상 생산되는 세포 단백질 뿐만 아니라, 다량의 탄수화물도 생산할 수 있다. 글루코네오제네시스(gluconeogenesis)(글리코겐 생성) 또는 글리코겐 분해와 관련된 유전자를 변형 또는 조절시켜 글리코렌 함량을 감소시키거나 증가시킬 수 있다. 따라서, 조 세포량의 조성은 고단백(낮은 탄수화물 함량) 사료 시장 또는 반대로 고탄수화물-저단백 사료 시장에 맞추어 조절될 수 있다. 미생물의 상기 조성을 조작할 수 있는 능력은, 외부 첨가로 단백질/탄수화물 비율을 인위적으로 조작할 필요성을 배제시킨다.
카로티노이드 색소는 항산화적 잇점 뿐만 아니라, 많은 어류 및 갑각류에서의 채색을 제공하는 역할을 한다(Nelis H. J., De Leenheer 1991.J. Appl. Bacteriol.70: 181-191). 상업적으로 이용되는 많은 메탄영양요구성 균주 (즉, 메틸로코커스 캡술라터스)와 달리 메틸로모나스 16a는 천연 카로티노이드 색소 생산 경로를 갖고 있어서, 아스타크산틴과 같은 고급 카로티노이드와 유사하지만 구조적으로 동일하지 않은 분홍색 색소를 높은 수준으로 생산한다. 아스타크산틴 또는 고급 카로티노이드 합성의 최종 단계에 관여하는 유전자를 부가하여 상기 경로를 변형시켜서, 본원의 균주가 상기 카로티노이드를 생산할 수 있다. 메틸로모나스 16a는 상기 방법에 의해 단백질/탄수화물/색소의 비율을 특정한 영양 요구도에 맞게 조절할 수 있는 동물 사료 생산균주로서 유용하다. 상기 방법으로 메틸로모나스는 고급 성분 식물 단백질 또는 탄수화물의 다른 공급원에 전달하는 방법으로서 이용될 수 있고, 따라서 상기 식물이 보다 높은 가치의 특성을 갖기 위하여 유전자를 조작해야 하는 문제점을 피할 수 있다.
유전 경로를 조작하는 방법은 일반적이고 당업계에 잘 알려져 있다. 특정 경로에서 선택된 유전자는 다양한 방법으로 상향조절 또는 하향조절될 수 있다. 따라서, 유전자 붕괴 및 유사한 방법에 의해 생물체 내의 경쟁적 경로를 제거하거나 또는 순화시킬 수 있다.
주요 유전경로를 발견하고 서열을 분석하면, 경로의 산물을 증가시키기 위하여 특정 유전자를 상향조절시킬 수 있다. 예를 들면, 표적 유전자의 추가적인 복제 유전자는 pBR322과 같은 다수 카피의 플라스미드에 의해 숙주 세포에 도입될 수 있다. 또한 표적 유전자가 비-자연적 프로모터에 의해 조절되도록 조작할 수 있다. 세포주기 중 특정 순간에 작동하거나 발효 과정 중에 작동하는 경로에서, 자연적인 프로모터를 대신하여 조절 또는 유도할 수 있는 프로모터를 사용하는 것이 바람직하다. 이와 유사하게, 몇몇의 경우에서 자연적인 또는 내재하는 프로모터는 유전자 발현을 증가시키기 위해 변형될 수 있다. 예를 들면, 내재하는 프로모터는 돌연변이, 결실 및(또는) 치환에 의해 세포내에서 변경될 수 있다(Kmiec, 미국특허제5,565,350호; Zarling et al., PCT/US93/03868 참고).
다른 방법으로는 표적 경로 또는 경쟁 경로에서, 에너지 또는 탄소에 대한 경쟁적인 싱크(sink)로서의 특정 유전자의 발현을 감소 또는 제거시킬 필요가 있다. 상기 목적으로 유전자를 하향조절하는 방법은 개발되어 있다. 붕괴시킬 유전자의 서열이 알려져 있는 경우 가장 효율적인 유전자 하향조절 방법은, 구조적 유전자 내로 외래 DNA를 삽입하여 전사를 방해하는 표적 유전자 붕괴(targeted gene disruption) 방법이다. 상기 방법은, 붕괴될 유전자의 일부분과 매우 유사한 서열의 양끝이 삽입(주로 유전자 마커)된 DNA를 포함하는 유전 카세트(cassette)의 생성에 의해 효과를 나타낼 수 있다. 상기 카세트를 숙주 세포에 도입하여, 외래 DNA를 상기 세포의 복제 기작에 의해 구조 유전자에 삽입할 수 있다(예를 들면, Hamilton et al. (1989)J. Bacteriol.171: 4617-4622; Balbas et al. (1993)Gene136: 211-213; Gueldener et al. (1996)Nucleic Acids Res.24: 2519-2524; 및 Smith et al. (1996)Methods Mol. Cell. Biol. 5: 270-277 참고).
안티센스(antisense) 기술은 표적 유전자의 서열이 알려진 경우 상기 유전자를 하향조절하는 또다른 방법이다. 상기 방법을 위해, 원하는 유전자에서 핵산 절편을 클로닝하고 RNA의 안티센스 가닥이 전사될 수 있게 프로모터에 연결한다. 상기 작제물을 숙주 세포에 도입하여 RNA의 안티센스 가닥을 생성한다. 안티센스 RNA는 원하는 단백질을 코딩하는 mRNA의 축적을 방해하여 유전자의 발현을 하향조절한다. 당업계의 숙련자는 특정 유전자의 발현을 감소시키기 위하여, 안티센스 기술의 사용과 관련하여 특정 주의가 필요함을 알 것이다. 예를 들면, 안티센스유전자의 적절한 수준의 발현은, 당업계의 숙련자에게 알려진 상이한 조절요소를 이용하는 상이한 키메라 유전자의 사용이 필요할 수 있다.
표적 유전자의 붕괴 및 안티센스 기술은 서열이 알려진 유전자의 하향조절 수단으로서 효과적이지만, 서열에 기초하지 않은 다른 비특이적 방법도 개발되었다. 예를 들면, 세포를 UV 조사에 노출시켜 원하는 표현형으로 단리해낼 수 있다. 화학물질을 사용한 돌연변이도 또한 돌연변이체를 발생시키는 효과적인 방법이며, 프레임쉬프트(frameshift) 돌연변이를 발생시키는 것으로 알려진 아크리딘 염료와 같이 복제 DNA에 영향을 주는 물질 뿐만 아니라, HNO2및 NH2OH와 같이 비복제 DNA에 영향을 주는 화학 물질을 비롯한 물질을 일반적으로 사용한다. 조사 또는 화학 물질을 이용한 돌연변이체 생산의 특정 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들면, Thomas D. Brock in Biotechnology :A Textbook of Industrial Microbiology, Second Edition (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA., or Deshpande, Mukund V.,Appl. Biochem. Biotechnol., 36,227, (1992) 참고).
또다른 비특이적 유전자 붕괴 방법으로서, 전위 요소(transposable element) 또는 트렌스포손(transposone)을 사용하는 것이있다. 트렌스포손은 DNA 상에 무작위로 삽입되고, 그 후 삽입이 발생한 위치를 결정하기 위해서는 서열에 근거하여 검색해야 하는 유전자 요소이다. 생체내 및 시험관내 전위 방법은 공지되어 있다. 상기 2 개의 방법은 트렌스포자제(transposase) 효소와 함께 전위 요소의 사용을 포함한다. 트렌스포자제의 존재 하에서 전위 요소 또는 트렌스포손이 핵산 단편과접촉하였을 때, 전위 요소는 핵산 단편에 무작위적으로 삽입된다. 상기 기술은 붕괴된 유전자를 전위 요소의 서열에 근거하여 확인할 수 있어서, 무작위 돌연변이 및 유전자 단리에 유용하다. 시험관내 전위를 위한 키트는 시판 중이다(예를 들면, <The Primer Island Transposition Kit, Perkin Elmer Applied Biosystems, Branchburg, NJ, 효모 트렌스포손 Ty1 사용>, < The Genome Priming System, New England Biolabs, Beverly, MA; 박테리아 트렌스포손 Tn7 사용>, 및 <the EZ::TN transposon Insertion Systems, Epicentre Technologies, Madison, WI, 박테리아 트렌스포손 Tn5 사용> 참고).
본 발명의 내용에 있어서, 발견된 생합성 경로의 발현을 조절하는 것이 유용할 수 있다. 예를 들면, 본원의 메틸로모나스 16a는 엔트너-도우도로프와 엠덴-마이어호프 탄소이동 경로를 모두 코딩하는 유전자를 포함한다. 엠덴-마이어호프 경로가 더 에너지 측면에서 효과적이므로, 상기 경로의 유전자를 과발현시키는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 엔트너-도우도로프 경로는 경쟁적 경로이고 상기 경로의 하향조절은 엠덴-마이어호프 시스템의 에너지 효율을 증가시킬 수 있다. 상기 방법은, 엔트너-도우도로프 시스템에서의 케토-데옥시 포스포글루코네이트 알돌라제(서열 9) 또는 임의의 다른 구성요소를 코딩하는 서열에 상기한 유전자 하향조절 방법을 선택적으로 사용하고, 엠덴-마이어호프 시스템에서의 프럭토스 비스포스파타제 알돌라제를 코딩하는 유전자(서열 5 또는 7)를 선택적으로 상향조절시켜 실행될 수 있다. 상기 방법으로 본원의 메틸로모나스 16a의 탄소이동을 최적화할 수 있다. 또한, 단량체 생산을 위한 방향족 화합물과 같은 특정 유기 물질을 생산하기위해 유전자가 조작된 경우, 탄소이동 경로의 최적화로 상기 물질의 증가된 수율을 얻을 수 있다.
유사한 방법으로, 이소프레노이드 또는 색소 합성에 관여하는 주요 효소를 코딩하는 유전자를 조절할 수 있다. 예를 들면, 본 발명은 색소 및 작은 이소프레노이드 화합물을 생산하는 터페노이드 경로에서의 주요 효소를 코딩하는 많은 유전자를 제공한다. 단리된 유전자는dxs및dsr유전자,ispA, D, E, F, G유전자,pyrG유전자, 및crtN유전자를 포함한다. 특히, 3-탄소 분자(피루베이트와 C1 알데히드기, D-글리세르알데히드 3-포스페이트)의 최초 축합반응을 상향조절시켜,dxs유전자에 의한 5-탄소 화합물(D-1-데옥시크실룰로스 5-포스페이트)를 생산하는 것이 유용할 수 있다. 또한 색소를 포함하지 않은 특정 이소프레노이드를 생산하기 위해서는, 상기 경로의 말단에 위치한 다양한 유전자를 붕괴시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면 상기 경로의 원하는 산물이 경로 상부의 작은 터페노이드일 때,crtN유전자(디아포피토엔 데히드로게나제를 코딩함)의 유전자 붕괴 또는 안티센스 저해 방법을 사용하는 것이 바람직하다.
상기한 바와 같이, 본원의 균주는 다당류를 대량 생산할 수 있다. 상기 과정은ugp유전자,gumD및gumH유전자,epsB,epsM및epsV유전자 및waaD유전자를 포함하는 유전자 세트에 의해 조절된다. 상기 경로에서 다당류의 중합반응 및(또는) 분비에 관여하는espB유전자, 또는 당을 다당류 중간체에 전달하는 것을 조절하는epsV유전자를 상향조절시키는 것이 특히 중요할 수 있다.
상기 방법에 의해 본원의 균주 또는 유사 균주는 특정 조성의 물질을 생산하거나, 식품 및 사료 제품으로서 사용되는 단백질, 다당류 및 색소의 특정 혼합물을 생산하기 위해 조작될 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에서 보다 상세히 정의된다. 이들 실시예는 본 발명의 바람직한 실시양태를 나타내는 것이며, 본 발명을 예시하기 위한 것으로 이해해야 한다. 상기 논의 및 이들 실시예로부터, 당업자는 본 발명의 본질적인 특성을 확인할 수 있으며, 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 용도 및 조건에 다양한 변화 및 변형을 적용시킬 수 있다.
일반적인 방법
실시예에서 이용된 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당업계에 잘 공지되어 있으며, 문헌 [Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. Molecular Cloning : A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, (1989) (Maniatis) and by T. J. Silhavy, M. L. Bennan, and L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984)] 및 [Ausubel, F. M. et al., Current Protocol in Molecular Biology, pub. by Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987)]에 기재되어 있다.
박테리아 배양의 유지 및 배양에 적합한 재료 및 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 하기 실시예에서 이용하기 적합한 기술은 문헌 [Manual of Methods for General Bacteriology, Phillipp Gerhardt, R. G. E. Murray, Ralph N. Costilow,Eugene W. Nester, Willis A. Wood, Noel R. Krieg and G. Briggs Philips, eds, American Society for Microbiology, Washington, DC. (1994)] 또는 [Thomas D. Brock in Biotechnology : A Textbook of Industrial Microbiology, Second Edition, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1989)]에서 찾아볼 수 있다. 박테리아 세포의 배양 및 유지에 사용된 모든 시약, 제한효소 및 재료는, 달리 언급하지 않는 한 알드리치 케미칼스(Aldrich Chemicals; Milwaukee, WI), DIFCO 레버러토리즈(DIFCO Laboratories; Detroit, MI), GIBCO/BRL(Gaithersburg, MD) 또는 시그마 케미칼 컴퍼니(Sigma Chemical Company; St. Louis, MO)에서 얻은 것이다.
약어의 의미는 하기와 같다: "h"는 시간을 의미하고, "min"은 분을 의미하고, "sec"는 초를 의미하고, "d"는 일을 의미하고, "㎖"은 밀리리터를 의미하며, "L"는 리터를 의미한다.
미생물 배양 및 세포 현탁액의 제조, 및 관련 분석
메틸로모나스 16a는, 총 부피 160 ㎖의 꼭지달린 휘튼(Wheaton) 혈청 용기 (Wheaton Scientific, Wheaton IL) 중에서 8:1 이상의 기체/액체 비율의 배지(즉, 20 ㎖의 질산염 액체 배지)를 사용하여 통상적으로 배양하였다. 배양의 표준 가스상은 공기 중의 25 ％ 메탄을 함유하였다. 이 조건은 배양 조건을 포함하며, 이 세포를 "성장 중인 세포(growing cells)"라 칭한다. 모든 경우, 달리 언급하지 않는 한, 배양액을 랩-라인(Lab-Line) 회전 진탕기에서 일정하게 진탕하면서 30 ℃에서 배양하였다.
실험 목적으로 얻은 세포를 최대 광학 밀도(O.D. 660이 약 1.0)로 배양하였다. 세포를 소발(Sorbal) RC-5B 원심분리기에서 SS-34 로터를 이용하여 6000 rpm으로 20분 동안 원심분리하여 수확하였다. 이들 세포 펠릿을 pH 7의 50 mM HEPES 완충액에 재현탁하였다. 이 세포 현탁액을 "세척된 휴지기 세포(washed, resting cell)"라 칭한다.
모든 실험에서의 미생물 성장은, 1 cm 광로(light path) 큐벳을 이용하여 울트로스펙(Ultrospec) 2000 UV/Vis 분광기(Pharmacia Biotech, Cambirdge England)에서 배양액의 660 nm에서의 광학 밀도를 측정함으로써 평가하였다. 별법으로, 미생물 성장은 상기 기재된 바와 같이 배양 배지로부터 원심분리에 의해 세포를 수확하고, 이 세포를 증류수에 재현탁한 후, 다시 원심분리하여 배지의 염을 제거한 상태로 평가하였다. 그 후, 세척된 세포를 건조 오븐에서 105℃로 밤새 건조시켜 건중량을 측정하였다.
메탄 농도는, 이 거명을 통해 본 명세서에 참고로 포함되는 문헌 [Emptage et al., 1997 Env. Sci. Technol. 31: 732-734]에 기재된 바와 같이 측정하였다.
메틸로모나스 16A를 위한 질산염 배지
"규정 배지(defined medium)"라고도 불리우는 질산염 액체 배지는 하기 기재된 용액 1과 혼합된 다양한 염을 포함하며, 달리 언급된 경우에는 질산염을 15 mM 염화암모늄으로 대체하였다.
용액 1미량 무기물의 100 배 농도의 원액 조성물
분자량 농도(mM) g/L
니트릴로아세트산 191.1 66.9 12.8
CuCl2×2H2O 170.48 0.15 0.0254
FeCl2×4H2O 198.81 1.5 0.3
MnCl2×4H2O 197.91 0.5 0.1
CoCl2×6H2O 237.9 1.31 0.312
ZnCl2 136.29 0.7. 0.1
H3BO3 61.83 0.16 0.01
Na2MoO4×2H2O 241.95 0.04 0.01
NiCl2×6H2O 237.7 0.77 0.184
900 ㎖의 H2O에 상기 기재된 g양을 혼합하고, pH를 7로 조정한 후, H2O를 첨가하여 최종 부피 1 ℓ로 만들었다. 냉장 보관하였다.
질산염 액체 배지
분자량 농도(mM) g/ℓ
NaNO3 84.99 10 0.85
KH2PO4 136.09 3.67 0.5
Na2SO4 142.04 3.52 0.5
MgCl2×6H2O 203.3 0.98 0.2
CaCl2×2H2O 147.02 0.68 0.1
1 M HEPES (pH 7) 238.3 50 ㎖
용액 1 10 ㎖
900 ㎖의 H2O에 용해시켰다. pH를 7로 조정하고, H2O를 첨가하여 1 ℓ로 만들었다.아가 플레이트용: 배지 1 ℓ에 아가로스 15 g을 첨가하고, 멸균 후, 50℃로 냉각시키고, 혼합하여, 플레이트에 부었다.
질산염 및 아질산염 분석법
세포 배양액 샘플 1 ㎖를 취하여 0.2 ㎛ 아크로디스크(Acrodisc) 필터를 통해 여과하여 세포를 제거하였다. 이 단계로부터의 여액은 분석될 아질산염 또는 질산염을 함유하고 있다. 이 분석은 AS3500 자동 샘플 공급기가 장착된 디오넥스(Dionex) 이온 크로마토그래피 500 시스템 (Dionex, Sunnyvale CA)에서 수행하였다. 사용된 컬럼은 AG-AC 가드 컬럼 및 ATC 트랩 컬럼을 구비한 4 mm 이온-팩(Ion-Pac) AS11-HC 단리 컬럼이었다. 모든 컬럼은 디오넥스에서 제공된 것이다.
이동상은 1 내지 50 mM의 수산화칼륨을 12 분의 시간 간격으로 구배한 수산화칼륨이었다. 셀의 온도는 35 ℃였으며, 유속은 1 ㎖/min이었다.
유전자 단리 및 특성화
특정 동정 효소를 코딩하는 다수의 유전자를 메틸로모나스 16a로부터 단리하여 서열분석하였다. 상기 유전자는 엔트너-도우도로프 탄소이동 경로와 엠덴-마이어호프 탄소이동 경로에서 발견되는 특정 유전자, 탈질소화 경로를 코딩하는 유전자, 이소프레노이드 합성 경로를 코딩하는 유전자 및 세포외 다당류 합성 경로를 코딩하는 유전자를 포함한다. 상기 유전자를 서열분석하였고, 하기 방법에 따라 이들의 개별적 서열을 핵산 및 단백질 공개 데이타베이스의 정보와 비교하여 기능적으로 특성화시켰다.
표준 프로토콜을 사용하여 게놈 DNA를 메틸로모나스 16a에서 단리하였다. 게놈 DNA 및 라이브러리 구축은 출판된 프로토콜(Fraser et al The Minimal Gene Complement ofMycoplasma genitalium;Science270, 1995). 세포 펠렛을 100 mM Na-EDTA pH 8.0, 10 mM tris-HCl pH 8.0, 400 mM NaCl 및 50 mM MgCl2를 포함하는 용액에 재현탁시켰다
게놈 DNA 준비
재현탁 후, 세포를 10％ SDS에서 서서히 용해시키고 , 55 ℃에서 30 분 동안인큐베이션시켰다. 실온에서 인큐베이션시킨 후, 프로티나제 K 100 ㎍/㎖을 첨가하고 37 ℃에서 상기 현탁액이 투명할때까지 인큐베이션시켰다. DNA를 트리스-평형 페놀로 2 회 추출하고 클로로포름으로 2 회 추출하였다. 70 ％ 에탄올로 DNA를 침전시킨 후, 10 mM 트리스-HCl 및 1 mM Na-EDTA(TE) pH 7.5를 포함하는 용액에 재현탁시켰다. 상기 DNA 용액에 RNAase 혼합물을 처리한 후, 트리스-평형 페놀로 2 회 추출하고 클로로포름으로 2 회 추출하였다. 그 후, 에탄올에서 침전시키고 TE에 재현탁시켰다.
라이브러리 구축
염색체 DNA 200 내지 500 ㎍을 300 mM 나트륨 아세테이트, 10 mM 트리스-HCl, 1 mM Na-EDTA 및 30 ％ 글리세롤의 용액에 재현탁시키고, 에어로미스트 다운드래프트 네불라이저 쳄버(Aeromist Downdraft Nebulizer chamber)(IBI Medical Products, Chicago, IL)에서 60 초 동안 12 psi로 절단하였다. 상기 DNA를 침전시킨 후 재현탁시키고 Bal31 뉴클레아제를 처리하였다. 크기 분류 후, 단편(2.0 kb, 또는 5.0 kb)을 오려내고, 정제한 후 2 단계 라이게이션(ligation) 방법을 사용하여 99 ％ 초과의 단일 인서트(insert)를 지닌 고-역가의 라이브러리를 제작하였다.
서열분석
샷건(shotgun) 서열분석 방법을 사용하여 전체 미생물 게놈 서열분석에 사용하였다 (Fleischmann, Robert et al Whole-Genome Random sequencing and assembly ofHaemophilus influenzaeRdScience, 269: 1995).
염료 종결 기술(dye terminator technology)(미국특허 제5366860호, 유럽특허 제272007호)을 사용한 ABI 자동 서열분석장치에, 벡터 및 인서트-특정 프라이머의 조합을 사용하여 서열을 분석하였다. 서열 편집은 DNAStar(DNA Star Inc.) 또는 위스콘신 GCG 프로그램(Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group(GCG), Madison, WI) 및 CONSED 패키지(버전 7.0)를 사용하였다. 모든 서열은 양방향에서 2 배수 이상의 포함범위를 나타내었다.
유전자 발현의 마이크로어레이
DNA 마이크로 어레이 구축을 위한 DNA 부분의 증폭
메틸로모나스 종 균주 16a 중의 특정 ORF의 개별 단백질을 증폭하기 위하여 특정 프라이머 쌍을 사용하였다. 게놈 DNA(10-30 ng)를 주형으로 사용하였다. HotStart TaqTM DNA 폴리머라제(Qiagen, Valencia, CA)와 dNTPs(Gibco BRL Life Science Technologies, Gaithersberg, MD)의 존재 하에서 PCR 반응을 수행하였다. 95 ℃에서 30 초 동안 35 주기로 변성시키고, 55 ℃에서 30 초 동안 어닐링시키고, 72 ℃에서 2 분 동안 합성시켰다. PCR 반응의 품질을 1 ％ 아가로스 겔에서 전기영동시켜 확인하였다. 상기 DNA 샘플을 퀴아젠(Qiagen)의 대량 PCR 정제 키트를 사용하여 정제하였다.
증폭된 ORF의 배열
배열 전에, 384-웰 마이크로타이터 플레이트(384-well microtiter plates)에서 동일 부피의 DMSO(10 ㎕) 및 DNA(10 ㎕) 샘플을 혼합하였다. 제너레이션 II DNA 스파터(generation II DNA spotter)(Molec㎕ar Dynamics, Sunnyvale, CA)를 사용하여 코팅된 유리 슬라이드에 샘플을 배열하였다. 각각의 PCR 산물을 개별 슬라이드에 중복하여 배열하였다. UV로 교차결합시킨 후, 상기 슬라이드를 실온에서 진공의 데시케이터(desiccator)에 보관하였다.
RNA 단리
메틸로모나스 16a를 공기 중 25％ 메탄하에서 암모늄 또는 질산염(10 mM)을 질소원으로 사용하는 규정 배지로 배양하였다. A600에서의 O.D. 값이 0.3(대수배양단계)일 때 최소 배지 배양액의 샘플을 수확하였다. 배양 세포를 신속히 수확하여 RLT 완충액(Qiagen RNeasy Mini Kit, Valencia, CA)에서 비드-비터(beads-beater)(Bio101, Vista, CA)를 사용하여 파열시켰다. 4 ℃에서 14,000x g로 3 분 동안 원심분리시켜 세포잔해(debris)를 침전시켰다. 상기 키트에 제공된 프로토콜을 사용하여 RNA를 단리시켰다. 컬럼 상에서 DNAase를 처리한 후, RNA를 RNAase-비함유 용액 50-100 ㎕로 용출시켰다. 수득한 RNA를 -20 ℃ 또는 -80 ℃에서 냉동보관하였다.
전체 RNA를 사용한 형광 cDNA 합성
RNA 샘플(7 내지 15 ㎍)과 임의 헥사머(hexamer) 프라이머(6 ㎍; Gibco BRL Life Science Technologies)를 RNAase-비함유 물로 희석하여 부피를 25 ㎕로 만들었다. 상기 샘플을 70 ℃에서 10 분 동안 변성시킨 후, 얼음에서 30 초 동안 냉각시켰다. 14 ㎕의 표지(labeling) 혼합물을 첨가한 후, 실온에서 10 분 동안 정치하여 어닐링시켰다. 상기 표지 혼합물은 5x 효소 완충액 8 ㎕, DTT(0.1 M) 4 ㎕, 및 20x 염료 혼합물 2㎕를 포함하였다. 상기 염료 혼합물은 dATP, dGTP 및 dTTP각각 2mM, dCTP 1 mM, Cy3-dCTP 또는 Cy5-dCTP 1 mM로 구성되었다. 수퍼스크립트 II 역전사 효소(SuperScript II reverse transcriptase) 1 내지 1.5 ㎕(200 units/㎖, Life Technologies inc., Gaithersburg, MD)를 첨가한 후, 42 ℃에서 2 시간 동안 cDNA를 합성하였다. NaOH(2.5 N) 2 ㎕를 상기 반응에 첨가하여 RNA를 제거하였다. 37 ℃에서 10 분 동안 정치시킨 후, HEPES(2 M) 10 ㎕를 사용하여 pH를 조절하였다. 표지된 cDNA를 PCR 정제 키트(Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 정제하였다. 표지 효율은 A550으로 Cy3 혼입을 확인하거나, 또는 A650으로 Cy5 혼입을 확인하였다.
게놈 DNA의 형광 표지
게놈 DNA를 네불라이저(Nebulizer)로 분무시켜 2 kb 단편으로 절단하였다. 물 15 ㎕에, 게놈 DNA(0.5 내지 1 pg)와 임의 헥사머 프라이머(Gibco BRL Life Science Technologies) 6 ㎍을 혼합하였다. 상기 혼합물을 끓는 물에 5 분 동안 정치시켜 변성시켰다. 그 후, 얼음에서 30 초 동안 어닐링시키고 실온에서 정치시켰다. 그 후, 5x Buffer 2(Gibco BRL) 2 ㎕와 염료 혼합물 2 ㎕를 첨가하였다. 염료 혼합물의 조성과 표지 과정은, DNA 폴리머라제 I의 클레나우(Klenow) 단편(5 ㎍/㎕, Gibco BRL Life Science Technologies)을 효소로 사용한 것을 제외하고 RNA 표지 과정에서 기재된 바와 같다. 37 ℃에서 2 시간 동안 정치시킨 후, 표지된 DNA 프로브를 PCR 정제 키트((Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 정제하였다.
혼성화 및 세척
슬라이드를 먼저 3.5x SSC(BRL, Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD), 0.1 ％ SDS(BRL, Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD), 1 ％ 소 혈청 알부민(BSA, Fraction V, Sigma, St. Louis, MO)을 포함하는 예비혼성화 (prehybridization) 용액에 인큐베이션시켰다. 예비혼성화 후, 표지된 프로브를 포함한 혼성화 용액(Molecular Dynamics)을 슬라이드에 첨가하고 커버 슬립(cover slip)으로 덮었다. 상기 슬라이드를 42 ℃ 인큐베이터 내의 습윤 쳄버에 인큐베이션시켰다. 밤새 혼성화시킨 후, 슬라이드를 먼저 1x SSC, 0.1 ％ SDS와 0.1x SSC, 0.1 ％ SDS를 포함하는 세척 용액으로 실온에서 5 분 동안 세척하였다. 그 후, 상기 슬라이드를 동일한 용액으로 65 ℃에서 10 분씩 3 회 세척하였다. 세척 후, 상기 슬라이드를 질소 가스로 건조시켰다.
데이타 수집 및 분석
레이저 스케너를 사용하여 개별 슬라이드에서 발생한 신호를 정량하였다 (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA). 상기 이미지를 어레이비전(ArrayVision) 4.0 소프트웨어(Imaging Research, Inc., Ontario, Canada)를 사용하여 분석하였다. 개별 스팟(spot)의 조 형광 강도는 배경 강도를 감하여 조정하였다. 상기 값을 스프레드시트(spreadsheet)로 옮겨 향후 분석에 사용하였다.
표 1은 메틸로모나스 16a에서 발견되고 명명된 유전자에 대한 설명이다. 상기 표는 서열의 ％ 유사성, ％ 동일성 및 주요 탄소 대사, 탈질소화, 세포외 다당류 합성 및 이소프레노이드 생합성에서의 주요 유전자에 대한 기대값을 나타낸다.
표 1은 상기 서열과 당업계에 공지된 서열간의 관계를 설명한다. 모든 서열을 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool ; Altschul, S. F., et al., (1993)J. Mol. Biol.215: 403-410; 또한 www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/ 참고)로 탐색하여, BLAST "nr" 테이타베이스(모든 비중복 GenBank CDS 번역, Brookhaven Protein Data Bank 3 차 구조에서 유래한 서열, SWISS-PROT 단백질 서열 데이타베이스, EMBL 및 DDBJ 데이타베이스 포함)내의 서열에 대한 유사성을 동정하였다. 국립 생명공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI)에서 제공된 BLASTN 연산법을 사용하여, "nr" 데이타베이스 내의 공개된 모든 DNA 서열에 대한 상기 서열의 유사성을 분석하였다. 모든 리딩 프레임(reading frame)에서 DNA 서열을 번역(translation)하여, NCBI에서 제공한 BLASTX 연산법 (Gish, W. and States, D. J. (1993)Nature Genetics3: 266-272)을 사용한 "nr" 데이타베이스 내의 공개된 단백질 서열에 대한 유사성을 비교하였다. 모든 비교는 BLASTNnr 또는 BLASTXnr 연산법을 사용하여 수행되었다. BLAST 비교 결과를 하기 표 1에 기재하여 가장 유사한 서열을 정리하였다. 표 1은 BLASTXnr 연산법에 기초한 데이타와 기대 값을 나타낸다. 상기 기대값은 주어진 값으로 동일한 부분의 갯수를 특정짓는 동일 부분의 통계적 중요성을 나타내며, 상기 서열 크기에 대한 데이타베이스 탐색에서 전적으로 우연히 결정된다.
실시예 1: 메틸로모나스 16A의 단리
연못 퇴적물에서 단리체를 포함하는 최초 자연환경 시료를 얻었다. 공기 중의 25 ％ 메탄 하에서 상기 연못 퇴적물을, 암모늄을 질소원으로 사용한 규정 배지에 직접 접종하였다. 유일한 탄소원 및 에너지원으로 메탄을 사용하였다. 660 nm에서의 흡광도가 일정할 때까지 배양시킨 후, 상기 배양액을 새로운 배양액에 접종하여 1:100으로 희석하였다. 유일한 탄소원 및 에너지원으로 메탄을 사용한 연속적인 3 회 접종 후, 상기 배양액을 암모늄을 질소원으로 하는 배양 아가(agar)에 플레이팅하고, 공기 중의 25 ％ 메탄 하에서 인큐베이션시켰다. 많은 메탄영양요구성 박테리아를 상기 방법으로 단리하였다. 그러나, 빠른 콜로니(colony)의 성장, 큰 콜로니 크기, 최소 배지에서의 성장능, 및 카로티노이드의 활성화된 생합성 경로를 표지하는 분홍 색소화의 특징을 갖는 메틸로모나스 16a를 연구용 생물체로서 선택하였다.
실시예 2: 최소 배지에서 메탄을 이용한 빠른 배양
메틸로모나스 16a를 공기 중 메탄 하에서, 단지 최소 염만으로 구성된 규정 배지에서 배양하였다. 배양에 필요한 메탄의 농도는 전형적으로 배양 환경 부피의 5-50 ％이다. 효모 추출물 또는 비타민과 같은 유기물을 추가하지 않고, 도 1의 성장을 획득하였다. 도 1은 동일한 배양조건, 즉 기질로서의 공기 중 25 ％ 메탄과 최소 배양액에서의 16a 성장과 메틸로코커스 캡술라터스(Methylococcus capsulatus) 성장을 비교한 것이다. 상기 데이타는, 메탄을 기질로하여 메틸로코커스 캡술라터스가 매 3.5 시간마다 배증되는 반면, 메틸로모나스 16a는 매 2-2.5 시간마다 배증되는 것을 나타내었다. 메탄올을 기질로 사용한 경우, 메탄올에서의 배증 시간은 메틸로모나스 16a의 경우 2.5-3 시간이고, 메틸로코커스 캡술라터스의 경우 4.5-5 시간이었다. 메탄을 사용한 배양에서 메틸로모나스 16a의 세포 밀도또한 매우 높았다. 메틸로코커스 캡술라터스는 실험용 및 상업 목적으로 널리 이용되는 메탄영양요구성 균주이다.
실시예 3: 메탄올 내성
질산염을 유일한 질소원으로 사용하고, 메탄올을 유일한 탄소원으로 사용하여 메틸로모나스 16a를 규정 배지에서 배양하였다. 최대 흡광도 또는 혼탁도를 얻기에 전형적으로 충분한 36 시간 동안 배양을 확인하였다. 도 2는 메탄올 농도 600 mM 이하에서 36 시간 내에 최대 배양 및 혼탁도를 얻을 수 있음을 명확히 보여준다. 그러나, 800 mM에서는 성장하지 않았다. 따라서 상기 균주는 메탄올 2.4 부피/부피％에서 성장함을 나타내었다.
실시예 4: 메틸로모나스 16a의 특징 및 분류
표 2는 메틸로모나스 16a의 다양한 성질을 나타낸다. 표 2에 기재된 항목은 물리적 및 효소적 성질에 기초하여, 유형 I, 유형 II 또는 유형 X로서의 균주 형을 결정하기 위해 전형적으로 사용되는 것이다. 상기 표는, 유전자의 존재와 유전자 경로를 나타내는 게놈 데이타 이외에 효소에 대한 직접적인 효소적 분석을 사용하여 개발되었다. 이러한 범주화는 기능에 근거하였고, 상기 균주가 탄소를 혼입할 때 에너지 측면에서 가장 효율적인 리불로스 모노포스페이트 또는 "RuMP" 경로를 이용하는 것을 나타내고 있다. 게놈 데이타는 RuMP 경로의 주요 효소가 존재함을 명확히 나타내고 있다. 내막 구조 또한 유형 I의 생리학적 특징이다. 본원의 균주에서 특이적인 것은 메틸로모나스 16a의 질소 고정 유전자를 발견한 것이다. 상기 균주는 효모 추출물 또는 비타민 없이 성장할 수 있다. 질산염, 암모늄 이온또는 질소가스는 생합성에서 질소원으로서 사용될 수 있다. 이러한 기능적 데이타는 다른 메틸로모나스 균주와 비교했을 때, 16s rRNA의 유사성과 완전히 일치한다. 다른 메틸로모나스 종과 16a 균주의 16s RNA(서열 81)를 비교한 결과, 메틸로모나스 16a가 메틸로모나스 종 KSPIII 균주(Hanada, S et al.,J. Ferment. Bioeng.86,539-544 (1998))와 메틸로모나스 종 LW13 균주(Costello, A. M. and Lidstrom, M. E.Appl Environ. Microbiol.65 (11), 5066-5074 (1999))의 16s RNA에 대해 96 ％의 동일성을 나타내었다. 따라서, 메틸로모나스 16a는 유형 I의 RuMP를 이용하는 메틸로모나스 종으로 분류되었다.
특성 유형 I 메틸로모나스 16a 유형 X 유형 II
GC ％ 불충분 불충분 불충분 충분
Ribmp 회로 불완전 불완전 불완전 완전
RuBP 카르복실라제 － － ＋ ＋
온도 범위 <45 <42 <45 <40
니트로게나제 － ＋ ＋ ＋
G6P 데히드로게나제 NADP ＋ ＋ ＋ －
이소시트레이트 데히드로게나제 NAD/NADP ＋ ＋ － －
효모 추출물 － － － －
비타민 － － － －
색소 가변 ＋ 가변 가변
질산염 동화 ＋ ＋ ＋ ＋
효소적 분석 방법
니트로게나제는 분석되지 않았지만, 게놈 서열 분석에 기초하여 유전자가 존재할 경우 양성으로 간주하였다.
글루코스 6 포스페이트 데히드로게나제
10 mM NADP 100 ㎕, 10 mM 글루코스 100 ㎕, 100 mM HEPES pH 7 완충액 700 ㎕ 및 효소 추출물 100 ㎕ 이하를 포함하는 반응 혼합물 1 ㎖를 만들었다. 효소활성은 분광 광도계를 사용하여, NADP가 NADPH로 환원되는 것을 340 nm에서 관찰하여 측정되었다.
이소시트레이트 데히드로게나제
10 mM 나트륨 이소시트레이트 100 ㎕, 10 mM NADP 100 ㎕, 100 mM pH 7 HEPES 완충액 700 ㎕ 및 효소 추출물 100 ㎕ 이하를 포함하는 반응 혼합물 1 ㎖를 만들었다. 효소활성은, NADPH가 생성되는 것을 340 nm에서 관찰하여 측정하였다.
질산염 동화는, 유일한 질소원으로 질산염을 사용하여 성장하는 것에 기초하였다.
효소적 분석 결과를 표 2에 나타내었다.
실시예 5: 엠덴-마이어호프 경로와 비교한 엔트너-도우도로프 경로에서의 유전자 발현 수준 비교
실시예 5에서는, 16a 균주의 엠덴-마이어호프 경로 이용에 대한 마이크로어레이 증거를 나타내었다.
도 3에서는 엔트너-도우도로프 경로 및 엠덴-마이어호프 경로에서의 상대적인 유전자 발현 수준을 나타내었다. 개별 유전자의 상대적인 전사 활성은, 기존 문헌(Wei, et al., 2001.Journal of Bacteriology. 183: 545-556)과 같이 DNA 마이크로어레이를 사용하여 측정되었다.
특히, 메틸로모나스 종 균주 16a의 4000 개 ORF(오픈 리딩 프레임)를 포함하는 하나의 DNA 마이크로어레이를, 게놈 DNA 및 전체 RNA에서 제작된 프로브와 혼성화시켰다. 16a의 상기 게놈 DNA는 DNA 폴리머라제의 클레나우 단편 및 형광염료 Cy-5를 사용하여 표지시키고, 전체 RNA는 역전사효소 및 Cy-3를 사용하여 표지시켰다. 혼성화 후, 어레이 개별 스팟에서 Cy-3 및 Cy-5의 신호강도를 측정하였다. Cy-3와 Cy-5의 강도비율은 수식 [(유전자 비율/모든 비율의 합) X 100]으로 개별 전사체의 부분(퍼센트로 표시)을 계산하는데 이용되었다. 결과 값은 개별 유전자의 mRNA의 상대적 양을 반영한다. 따라서, 어레이로 밝혀진 모든 유전자의 전사 활성은, 개별 유전자의 상대적인 mRNA 양에 기초하여 감소 순으로 나열될 수 있다. 예를 들면, 상기 생물체가 유일한 탄소원으로 메탄을 사용하여 성장할 경우 메탄 모노옥시게나제의 유전자가 최고의 전사 활성을 갖기 때문에 상기 효소에 대한 mRNA 양은 순서 1번을 차지한다(도 3).
엔트너-도우도로프에서의 "특징적"인 유전자는, 6 포스포글루코네이트 데히드라타제 및 2 케토-3-데옥시-6포스포글루코네이트 알돌라제의 유전자이다. 포스포프럭토키나제 및 프럭토스 비스포스페이트 알돌라제는 엠덴-마이어호프 서열에서 "특징적"인 것이다. 도 3에서 개별 단계 옆의 숫자는 해당 효소의 상대적인 발현수준을 나타낸다. 예를 들면, 상기 세포내에서 가장 발현이 많은 효소는 메탄 모노옥시게나제이다(순서 1번). 그 다음으로 가장 많이 발현되는 효소는 메탄올 데히드로게나제이다(순서 2번). 포스포프럭토키나제(순서 232번) 및 프럭토스 비스포스페이트 알돌라제(순서 65번)의 mRNA 전사체는, 글루코스 6 포스페이트 데히드로게나제(순서 717번), 6 포스포글루코네이트 데히드라타제(순서 763번) 또는 2-케토-3-데옥시-6 글루코네이트 알돌라제의 mRNA 전사체보다 많은 양을 갖는다. 상기 데이타는 엠덴-마이어호프 경로의 효소가 엔트너-도우도로프 경로의 효소보다 더 많이 발현되는 것을 나타낸다. 상기 결과는 놀라운 것이며, 메탄영양요구성 박테리아의 주 대사과정에 대한 기존의 학설에 상반되는 것이다(참고문헌, The physiology and biochemistry of aerobic methanol-utilizing gram-negative and gram-positive bacteria In : Methane and Methanol Utilizers, Biotechnology Handbooks 5.1992. Eds: Colin Murrell, Howard Dalton. Pp 149-157).
실시예 6: 피로포스페이트-연결 포스포프럭토키나제에 대한 직접적인 효소적 증거
실시예 6에서는, 본원의 균주에서 엠덴-마이어호프 경로의 기능성을 확인시켜주는 피로포스페이트-연결 포스포프럭토키나제 효소의 존재에 대한 증거를 나타내었다.
하기한 결합 효소 분석(coupled enzyme assay)을 이용하여, 메틸로모나스 16a에서 포스포프럭토키나제 활성의 존재를 확인하였다. 분석 조건을 하기 표 3에 나타내었다. 상기 분석은 표 4에 기재된 다수의 메탄영양요구성 박테리아에서의 상기 활성을 분석하는데 더 사용되었다. 표 4의 데이타는 공지의 ATCC 균주에서, ATP 또는 포스포릴기 공여체로서의 피로포스페이트를 사용한 포스포프럭토키나제 활성을 실험한 것이다. 상기 생물체는 유형 I 또는 유형 X의 리불로스 모노포스페이트 이용 균주, 또는 유형 II의 세린 이용 균주로서 분류되었다.
결합 분석 반응
포스포프럭토키나제 반응을 결합 효소 분석을 사용하여 측정하였다. 포스포프럭토키나제 반응을 프럭토스 1,6, 비스포스페이트 알돌라제와 결합시킨 후 트리오스포스페이트 이소머라제와 결합시켰다. 상기 효소활성을 NADH의 감소로 측정하였다.
특히 포스포프럭토키나제 효소는, 프럭토스 6 포스페이트 및 피로포스페이트를 프럭토스 1,6 비스포스페이트 및 오르토포스페이트로 전환시키는 주반응을 촉매한다.
프럭토스-1,6-비스포스페이트는 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌라제에 의해 3-포스포글리세르알데히드 및 디히드록시아세톤포스페이트로 분리된다.
디히드록시아세톤포스페이트는 트리오스포스페이트 이소머라제에 의해 3 포스포글리세르알데히드로 이성화된다.
글리세롤 포스페이트 데히드로게나제와 NADH 및 3-포스포글리세르알데히드가 반응하여 알콜 글리세롤-3-포스페이트 및 NAD가 생산된다.
분광 광도계를 사용하여 340 nm에서 NADH 감소를 관찰하였다(UltraSpec 4000, Pharmacia Biotech).
분석 프로토콜
시약 원액(mM) 전체반응부피 1㎖ 당 부피(㎕) 최종 분석농도(mM)
Tris-HCl pH7.5 1000 100 100
MgCl2·2H2O 100 35 3.5
Na4P2O7·10H2O 또는 ATP 100 20 2
프럭토스-6-포스페이트 100 20 2
NADH 50 6 0.3
프럭토스 비스포스페이트 알돌라제 100(단위/㎖) 20 2 (단위)
트리오스포스페이트이소머라제/글리세롤포스페이트 데히드로게나제 7.2 (단위/㎕)0.5 (단위/㎕) 3.69 27 (단위)1.8 (단위)
KCl 1000 50 50
H2O 최종 1㎖로 맞춤
조 추출물 0-50
상이한 메탄영양요구성 박테리아에서의 피로포스페이트-연결 및 ATP-연결 포스포프럭토키나제 활성 비교
균주 유형 동화경로 ATP-PFK μmol NADH/min/㎎ Ppi-PFK μmol NADH/min/㎎
메틸로모나스 16aATCC PTA 2402 I 리불로스 모노포스페이트 0 2.8
메틸로모나스 아길레ATCC 35068 I 리불로스 모노포스페이트 0.01 3.5
메틸로박터 휘텐버리ATCC 51738 I 리불로스 모노포스페이트 0.01 0.025
메틸로모나스 클라라ATCC 31226 I 리불로스 모노포스페이트 0 0.3
메틸로미크로비움 알부스ATCC 33003 I 리불로스 모노포스페이트 0.02 3.6
메틸로코커스 캡술라터스ATCC 19069 X 리불로스 모노포스페이트 0.01 0.04
메틸로시너스 스포리움ATCC 35069 II 세린 0.07 0.4
상기 데이타로부터 몇개의 결론을 얻을 수 있다. 첫째, ATP(포스포프럭토키나제에 대한 전형적인 포스포릴기 공여체)는 메탄영양요구성 균주의 포스포프럭토키나제 반응에 있어서 근본적으로 비효율적이다. 실험된 모든 메탄영양요구성 균주에 있어서, 단지 무기 피로포스페이트만이 상기 반응을 유지시켰다. 둘째, 모든 메탄영양요구성 균주들이 상기 활성을 지니는 것은 아니다. 상기 활성은 근본적으로 메틸로박터 휘텐버리(Methylobacter whittenbury) 및 메틸로코커스 캡술라터스 (Methylococcus capsulatus)에서는 없었다. 상기 데이타는 많은 메탄영양요구성 균주가 본원에 기재되지 않은 포스포프럭토키나제 활성을 갖을 수 있음을 나타낸다. 이것으로, 상기 활성을 지닌 메탄영양요구성 균주가 활동적인 엠덴-마이어호프 경로를 갖는다는 것을 유추할 수 있다.
실시예 7: 메틸로모나스 16a에 의한 성장율 및 탄소전환
메틸로모나스 16a와 메틸로코커스 켑술라터스에서 성장율 및 탄소전환 효율을 비교하였다. 16a는 높은 수준의 포스포프럭토키나제를 지니고, 엠. 켑술라터스는 근본적으로 상기 효소의 활성이 없기 때문에 상기 균주를 선택하였다.
만약 메틸로모나스 16a가 에너지 측면에서 더 바람직한 엠덴-마이어호프 경로를 이용할 수 있고, 메틸로코커스 켑술라터스가 단지 엔트너-도우도로프 경로만을 이용할 수 있다면, 상기 메틸로모나스 16a의 우월한 에너지 효율이 세포 수율 및 탄소전환 효율에서 나타날 수 있다. 이러한 에너지 효율에서의 차이는 단지 에너지-제한조건 하에서만 분명하게 나타난다. 본 실험에서는, 각각의 배양에서 산소량을 20 부피/부피％(도 1 및 표 9에서의 배양 조건) 대신 10 부피/부피％로 제한시켜 상기 조건을 달성하였다. 상기 산소 제한조건 하에서는, 메탄의 호기적 호흡으로 대부분의 에너지를 생산하는 상기 균주가 더 많은 세포량을 생산할 것이다.
세포를 500 ㎖의 꼭지달린 휘튼(Wheaton) 혈청 용기에서 배양액 200 ㎖로 배양하였다. 배양 기체상을 25 ％ 메탄 및 10 ％ 산소로 조절하였다. 상기 두 경우의 규정 배지 조성은 동일하다.
산소 제한 하에서 메틸로모나스 16a 세포 대 메틸로코커스 캡술라터스 세포 의 수율
균주 YCH4 g 건중량/mol G 건중량/g CH4 탄소전환효율(CCE)％
메틸로모나스 16a 16.7 ±0.5 1.04 64
메틸로코커스 캡술라터스 10.3 ±0.3 0.64 40
수율 결정
산소제한 하에서 암모늄을 질소원으로 하는 규정 배지를 사용하여 500 ㎖ 용기에서 3 중 배양하여 수율을 측정하였다. 상기 방법은, 질소에 대한 25 ％ 메탄 및 10 ％ 산소의 배양 기체상 300 ㎖와 배양액 300 ㎖를 사용하여 수행하였다. 배양이 끝난 후(즉, 정체기), 배양 기체상의 남아있는 메탄을 가스 크로마토그래피를 사용하여 측정하였다. 배양된 세포를 원심분리하여 모으고 증류수로 세척하고 건조 오븐에서 밤새 건조시킨 후 중량을 측정하였다.
탄소전환 효율은 세포량으로 동화된 탄소량의 척도이다. 이것은 생물자원의 조성을 CH2O0.5N0.25로 가정하여 계산된다.
메틸로모나스 16a : 16 g/mol 메탄 X (1 g 건중량/g 메탄)/25 g/mol 생체량.
엠.캡술라터스 : 16 g/mol 메탄 X (0.64 g 건중량/g 메탄)/25 g/mol 생체량.
상기 데이타(표 5)는, 온도를 제외한 동일조건 하에서 메틸로코커스 켑술라터스 균주보다 메틸로모나스 16a가 훨씬 더 많은 세포량을 생산하는 것을 나타낸다. 메틸로코커스 켑술라터스는 45 ℃에서 최적으로 성장하는 반면, 메틸로모나스는 33 ℃에서 최적으로 성장한다. 상기 데이타로부터, 에너지 수율이 더 높은 엠덴-마이어호프 경로의 존재가 메틸로모나스 16a에 성장 상의 잇점을 부여한다고 추측할 수 있다.
표 6에서는, 모든 경우에서 탄소 생산을 피루베이트로 표준화시킨 탄소동화 경로의 함수로 ATP 수율을 나타내는 이론적 계산치를 기재하였다(호기성 메탄올-이용 그람-음성 및 그람-양성 박테리아의 생리학 및 생화학. 문헌[Methane and Methanol Utilizers, Biotechnology Handbooks 5.1992. Eds:Colin Murrell, Howard Dalton. Pp. 149-157]). 표 6은 세린 회로, 크실로스 모노포스페이트 회로 및 리불로스 모노포스페이트 회로 경로에서의 탄소(포름알데히드 또는 이산화탄소) 3 개 분자마다 생산 또는 소비되는 ATP의 양을 나타낸다. 상기 리불로스 모노포스페이트 회로 경로는 기재한 바와 같이, 전형적으로 2-케토-3 데옥시-6-포스포글루코네이트/트렌스알돌라제(KDPGA/TA) 변형체로서 존재하는 것으로 생각된다. 상기 데이타는, 사실상 메탄영양요구성 균주에서 프럭토스 비스포스페이트 알돌라제/트렌스알돌라제(FBPA/TA) 변형체가 존재할 수 있음을 나타낸다. 이것에 의한 에너지 측면의 반향으로, 메탄영양요구성 균주가 ATP-연결 포스포프럭토키나제를 갖고 있을 경우 추가적인 1 ATP를 순 생산하고, 피로포스페이트-연결 효소를 갖고 있을 경우 추가적인 2 ATPs를 순 생산하게 된다. 따라서 메틸로모나스 16a는 동화된 3 개의 탄소 당 추가적인 2 ATP를 사용하는 것으로 추측할 수 있고, 이것으로 메틸로코커스 캡술라터스에 대한 상기 균주의 높은 수율 및 탄소 효율이 설명될 수 있다.
상이한 탄소 동화 기작을 사용하는 메탄영양요구성 박테리아의 에너지론
생물체 회로 고정되는 C1 단위 산물 변형체 ATP NADPH
박테리아 RuMP 3CH2O 피루베이트 FBPA/TA ＋1 ＋1
메틸로모나스 RuMP/세린 3CH2O 피루베이트 FBPA/TA ＋1(＋2†) ＋1
박테리아 RuMP 3CH2O 피루베이트 KDPGA/TA 0 ＋1
메틸로코커스 RuMP/RuBP 3CH2O 피루베이트 KDPGA/TA 0 ＋1
†PPi 의존성 포스포프럭토키나제의 경우
실시예 8: 산소 절약의 질산염/아질산염
도 4에서는 메틸로모나스 16a의 세포 현탁액에 의한 산소 소비를, 오리온 (Orion) 산소 프로브(probe)를 사용하여 상대적인 검출기 단위로 나타내었다. 산소는 질산염이 존재하거나 또는 존재하지 않고, 전자 공여체 및 탄소원으로서의 메탄올이 존재하는 조건에서, 시간에 대한 함수로 측정되었다. 메틸로모나스 16a 세포를 pH 7 HEPES 완충액에 현탁시켜 인큐베이션시켰다. 측정시간 3 분 때에, 메탄올을 최종 농도가 약 100 mM이 되도록 상기 2 개의 배양액에 주입하였다. 메탄올 주입 후, 예상한 바와 같이 질산염이 없는 배양액에서의 산소 소비가 급증하였다(도 4). 그러나, 질산염이 존재하는 경우에서의 산소 소비 속도는 질산염이 존재하지 않는 경우에서의 산소 소비 속도에 근접하지 않았다. 따라서 상기 데이타는, 메탄올을 탄소원으로 사용했을 때 질산염이 산소 소비를 줄일 수 있다는 발견을 뒷받침한다.
메틸로모나스 16a 세포를 pH 7 HEPES 완충액에 재현탁시키고, 오리온 산소프로브가 장착된 물자켓 쳄버(water jacketed chamber)에서 인큐베이션시켰다. 상기 인큐베이션을 30 ℃에서 수행하였다. 측정시간 1분 때에 메탄올을 배양액에 주입하였다. 그러나, 1 개의 배양액에는 아질산나트륨(25 mM)을 23 분 후 배양액에 주입하였다. 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에서와 같이, 아질산염 첨가 후 산소 소비 속도가 감소하였다. 상기 데이타는 또한 아질산염 및 간접적으로 질산염이 전자 싱크(sink)의 대용으로 사용될 수 있고 배양액에서 적은 산소 소비를 초래한다는 주장을 명확히 뒷받침한다.
공기 중의 25 ％ 메탄 하의 규정 배지를 사용한 메틸로모나스 16a 세포 현탁액의 사각공간(dead-space)에서 산소 및 N2O를 동시에 관찰하였다. 유일한 질소원으로서 아질산염 100 mM을 첨가하였다. 상기 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6은 사각공간(dead-space)에서 N2O 발생이 산소 결핍과 동시에 일어남을 나타내고 있다. 도시된 숫자는 각각 N2O 및 산소의 생성 또는 소멸 속도이다. 산소 소멸 속도가 낮은 값으로 줄어들 때(배양 기체상의 O2농도가 낮기 때문) N2O 생산이 증가하여 상기 생물체를 통한 전체 전자흐름에서 상당한 부분을 차지한다.
실시예 9: 임의 메탄영양요구성 균주와 메틸로모나스 16a에 의한 질산염 또는 아질산염 환원
ATCC(American Type Culture Collection)에서 이용할 수 있는 모든 메탄영양요구성 균주를 사용하여, 아질산염 또는 질산염으로부터 N2O를 생산하는 상기 균주의 능력을 시험하였다. 모든 균주를 규정 배지에서 배양하였고, 660 nm에서의 흡광도가 1.0이 되었을 때 수확하였다. 상기 세포 현탁액을 원심분리하여 모으고 질산염 또는 아질산염을 유일한 질소원으로 하는 규정 배지 5 ㎖에 재현탁시켰다. 하기 표 7의 테이타는 30 ℃에서 인큐베이션시킨 10 ㎖ 분석 병의 배양 기체상에 N2O가 축적(농도단위 μM)되는 것을 나타낸다. 상기 결과는, 메틸로모나스 16a가 실험한 균주들 중에서 질산염을 N2O로 전환시키는 데에 있어 독특한 능력을 갖고 있음을 나타내고 있다. 또한 상기 테이타는 2 종의 다른 메틸로모나스 균주가 아질산염을 N2O로 전환시키는 데에 있어 유사한 능력을 갖고 있음을 나타내고 있다.
균주 NO3/NO2μM NO2/N2O μM
메틸로모나스 16a 28.3 30
메틸로모나스 알부스 1.2 22
메틸로모나스 클라라 2.5 1.5
메틸로모나스 아길레 0.6 17
메틸로박터 휘텐버리 0.3 0.04
메틸로코커스 캡술라터스 0.3 1.9
메틸로박터 루테스 0.1 6.5
메틸로시너스 스포리움 0.2 0.07
실시예 10: 글리코겐 생산
메틸로모나스 16a는 메탄 또는 메탄올을 사용하여 배양했을 때 다량의 글리코겐을 축적한다. 메틸로모나스 세포에서 녹말 분석 키트(Sigma Chemical Co. St Louis MO)를 사용하여 글리코겐을 분석하였다. 상기 분석은 녹말 또는 글리코겐에 특이적이며, 결과적으로 메틸로모나스 16a에서의 글리코겐 존재를 나타낸다. 세포를일반적 방법에서 약술한 조건에 따라 배양하였다. 세포를 30 ℃에서 100 mM 메탄올 또는 배양 기체상의 25 ％ 메탄을 사용한 규정 배지로 배양한 후 수확하였다. 배양 샘플을, 성장곡선에서의 중간-대수적 성장(O.D.6600.3)과 정체기(O.D.6601.0)의 2 싯점에서 추출하였다. 상기 샘플을, 제조사의 지시에 따라 녹말 분석 키트로 즉시 분석하였다. 하기 표 8에 기재한 결과는, 메탄올을 사용하여 배양했을 때 엄청난 양의 저장 중합체가 생성되고, 메탄을 사용하여 배양했을 때 메탄올의 경우보다 적지만 상당한 양의 글리코겐이 생성됨을 나타내고 있다.
성장 단계(OD660) 메탄(글리코겐 중량/중량％) 메탄올(글리코겐 중량/중량％)
중간-대수기(0.3) 6 ％ 25 ％
정체기(1.0) 7 ％ 40 ％
또한, 메탄올을 사용하여 배양했을 때 세포내에 과립(granule)이 존재함을 주사전자현미경으로 관찰하였고, 상기 과립은 녹말과 다당류-특이적 염료를 포함하는 것으로 측정되었다.
실시예 11: 생체량에서의 단백질 생산
규정 배지에서 메틸로모나스 16 및 메틸로코커스 캡술라터스(단백질 생산에서의 비교용 균주)를 O.D.660값이 더 이상 증가하지 않을 때 까지 배양하였다. 가스 크로마토그래피(HP-Plot Molecular sieve column; Hewlett Packard 5890 series II gas chromatograph)를 사용하여, 소비된 메탄 또는 메탄올의 전체 양을 계산할 수 있도록 성장곡선 전반의 메탄 또는 메탄올 소비를 관찰하였다. GC 사용조건; 오븐온도:40 ℃, 초기 온도:40 ℃, 초기 시간:3 min, 속도:0 deg/min, 최종 온도:40 ℃, 최종 시간:O, 주입A 온도:100 ℃, 분리A 온도:125 ℃, 및 평형 시간:0.
상기 세포를 원심분리로 모으고 105 ℃ 건조오븐에서 밤새 건조시켰다. 표 9의 테이타는, 소비된 메탄 또는 메탄올의 1 g 당 생산된 세포의 건중량 g 수를 나타낸다.
생물체 g 건중량/g CH4 g 건중량/g CH4OH
메틸로모나스 16a 0.90-1.3(2-2.5 hr) 0.30-0.45(2.5-3.0 hr)
메틸로코커스 캡술라터스 0.67-1.2(3-4 hr) 0.25-0.45(4-5 hr)
표 9의 테이타에서와 같이 본원의 균주는, 메탄 또는 메탄올을 사용하여 배양했을 때, 상기 과정에서 선택된 상업적 메탄영양요구성 균주보다 더 높은 단백질 생산 속도를 갖는다.
실시예 12: 세포 밖 다당류 생산
메틸로모나스 16a 세포를 30 ℃, 25 ％ 메탄 및 규정 배지를 사용한 회분배양 200 ㎖에서 배양하였다. 초기 산소 농도는, 질소로 세척한 용기에 순수한 산소를 주입하여 변화시켰다. 세포를 정체기 또는 흡광도 약 1.0으로 배양하였다. 그 후, 상기 배양약을 6000x g에서 30 분 동안 원심분리시켜 세포와 세포외 다당류를 침전시켰다. 상기 원심분리로 얻은 침천물은 2 개 층으로 구성되어 있다. 바닥 쪽에는 세포가 침전되고, 그 위에 맑은 점성물질로서의 세포외 다당류(EPS)가 침전된다. 상기 EPS 층을 씻어내고, 세포로부터 더 분리시키기 위해 다시 침전시켰다.또한 상기 세포 펠렛(pellet)을 건조시키고 중량을 측정하였다. 상기 EPS를 50 ％ 에탄올에 재현탁시키고, 원심분리하여 다시 침전시켰다. 마지막으로, 상기 물질을 건조시키고 중량을 측정하였다. 거의 대기 중의 산소농도에서, EPS는 상기 배양액 전체 건중량의 50 ％만큼을 차지하였다. 이것은 상기 배양액을 10,000x g에서 30 분 동안 원심분리시켜 결정되었다. 상기 결과의 펠렛은 하부 적색상(압착된 세포)과 세포외 다당류의 상부 투명상으로 구성되어 있다. 상기 EPS를 스페툴라 (spatula)를 사용하여 선택적으로 제거하고 105 ℃에서 밤새 건조시켰다. 상기 세포 펠렛을 제거하고 105 ℃에서 밤새 건조시켰다. 원심분리하여 얻은 상층액을 차가운 이소프로판올(1:1, 부피:부피)과 혼합하였다. 상기 단계에서 침전된 EPS를 원심분리(10,000x g, 30 분)로 모으고, 상기 펠렛을 105 ℃에서 밤새 건조시킨 후 중량을 측정하였다. EPS의 화학적 분석을 통해, 상기 물질이 주로 폴리글루코스(약 70 ％)임을 밝혔다. EPS 샘플을 문헌 [Ciucanu, I., F. Kerek. 1984.Carbohydrafe Research131: 209-217]에 기재된 방법으로 메틸화시켰다. 상기 메틸화된 샘플을 121 ℃에서 2 시간 동안 2 M TFA로 가수분해시키고, 상기 가수분해된 탄수화물을 실온에서 보로듀테리드(borodeuteride) 나트륨을 사용하여 환원시켰다. 상기 생산물을 Sp2330 수펠코(Supelco) 칼럼을 사용한 GC-MS로 아세틸화시켰다. 환원단계 이전에, 미국 표준의 미오-이노시톨(myo-inositol)을 각각의 샘플에 첨가하였다.

Claims (31)

  1. (A) 메탄 및 메탄올로 구성된 군에서 선택된 C1 탄소기질을 사용하여 성장하며;
    (B) (a) 서열 6에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 단리된 핵산 분자;
    (b) 65 ℃에서 0.1X SSC, 0.1 ％ SDS로 혼성화시키고 순차적으로 2X SSC, 0.1 ％ SDS 및 0.1X SSC, 0.1 ％ SDS로 세척하는 혼성화 조건 하에서 상기 (a)의 핵산 분자와 혼성화되는 단리된 핵산 분자;
    (c) 서열 6에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드와 비교할 때, 스미스-워터만 (Smith-Waterman) 정렬 방법에 기초하여 63 ％ 이상의 동일성을 갖는 437 개 이상의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자; 및
    (d) (a), (b) 또는 (c)에 상보적인 단리된 핵산 분자
    로 구성된 군에서 선택된, 피로포스페이트-의존성 포스포프럭토키나제 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 기능적 엠덴-마이어호프(Embden-Meyerhof) 탄소경로를 포함하는
    고성장율의 메탄영양요구성 박테리아 균주.
  2. 제1항에 있어서, 상기 균주가 기능적 엔트너-도우도로프(Entner-Douderoff) 탄소경로를 임의로 포함하는 고성장율의 메탄영양요구성 박테리아 균주.
  3. 제1항에 있어서, 프럭토스 비스포스페이트 알돌라제 효소를 코딩하는 1 종 이상의 유전자를 갖는 박테리아 균주.
  4. 제3항에 있어서, 상기 1 종 이상의 유전자가 서열 16 및 서열 18로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 프럭토스 비스포스페이트 알돌라제 효소를 코딩하는 것인 박테리아 균주.
  5. 제2항에 있어서, 케토-데옥시 포스포글루코네이트 알돌라제를 코딩하는 1 종 이상의 유전자를 갖는 박테리아 균주.
  6. 제5항에 있어서, 케토-데옥시 포스포글루코네이트 알돌라제 효소를 코딩하는 1 종 이상의 유전자가,
    (a) 서열 20에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 단리된 핵산 분자;
    (b) 65 ℃에서 0.1X SSC, 0.1 ％ SDS로 혼성화시키고, 순차적으로 2X SSC, 0.1 ％ SDS 및 0.1X SSC, 0.1 ％ SDS로 세척하는 혼성화 조건 하에서 상기 (a)의 핵산 분자와 혼성화되는 단리된 핵산 분자;
    (c) 서열 20에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드와 비교할 때, 스미스-워터만 정렬 방법에 기초하여 59 ％ 이상의 동일성을 갖는 212 개 이상의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자 ; 및
    (d) (a), (b) 또는 (c)에 상보적인 단리된 핵산 분자
    로 구성된 군에서 선택된 것인 박테리아 균주.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12, 서열 14, 서열 16, 서열 18 및 서열 20으로 구성된 군에서 선택된, 탄소이동(carbon flux)과 관련된 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 갖는 박테리아 균주.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 탈질소 효소 경로를 임의로 포함하는 박테리아 균주.
  9. 제8항에 있어서, 탈질소 경로의 효소가 서열 40, 서열 42, 서열 44, 서열 46, 서열 48, 서열 50, 서열 52, 서열 54, 서열 56, 서열 58 및 서열 60으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인 박테리아 균주.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 22, 서열 24, 서열 26, 서열 28, 서열 30, 서열 32, 서열 34, 서열 36 및 서열 38로 구성된 군에서 선택된 세포외 다당류 합성 효소를 코딩하는 유전자를 갖는 박테리아 균주.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 62, 서열 64, 서열 66, 서열 68, 서열 70,서열 72, 서열 74, 서열 86 및 서열 78로 구성된 군에서 선택된 이소프레노이드 합성 효소를 코딩하는 유전자를 갖는 박테리아 균주.
  12. 제1항에 있어서, 상기 균주가 메틸로모나스 종(Methylomonas sp.)인 박테리아 균주.
  13. 제12항에 있어서, 서열 81에 기재된 16s RNA 프로필을 갖는 박테리아 균주.
  14. 제1항에 있어서, C1 탄소기질이 메탄올일 때, 상기 균주가 글리코겐을 생체량 중의 약 50 건중량％ 이상 생산하는 박테리아 균주.
  15. 제1항 또는 제14항에 있어서, 배지 중 메탄올 농도가 약 2.5 부피/부피％인 박테리아 균주.
  16. 제1항 또는 제2항에 있어서, 소비되는 메탄 1 g 당 세포량 1.0 g 초과의 수율을 갖는 박테리아 균주.
  17. 제1항 또는 제2항에 있어서, 소비되는 메탄 1 g 당 세포량 0.5 g 초과의 수율을 갖는 박테리아 균주.
  18. 제1항 또는 제2항에 있어서, 생체량 1 g/mol 당 메탄 40 g/mol 초과의 탄소전환 효율을 갖는 박테리아 균주.
  19. 제1항 또는 제2항에 있어서, 생체량 1 g/mol 당 메탄 65 g/mol 초과의 탄소전환 효율을 갖는 박테리아 균주.
  20. 제1항 또는 제2항에 있어서, 생체량 1 g/mol 당 메탄 70 g/mol 초과의 탄소전환 효율을 갖는 박테리아 균주.
  21. 메탄올 및 메탄으로 구성된 군에서 선택된 C1 탄소기질을 사용하여 성장하고, 서열 81에 기재된 16s RNA 서열을 포함하며, 피로포스페이트 의존성 포스포프럭토키나제 효소를 코딩하는 1 종 이상의 유전자를 갖는 고성장율의 메탄영양요구성 박테리아 균주.
  22. 제20항에 있어서, 케토-데옥시 포스포글루코네이트 알돌라제를 코딩하는 1 종 이상의 유전자를 임의로 갖는 고성장율의 메탄영양요구성 박테리아 균주.
  23. ATCC 지정번호 PTA 2402를 갖는 고성장율의 메탄영양요구성 박테리아 균주.
  24. (a) 단세포 단백질이 발현되고 축적되기에 충분한 시간 동안 적절한 배지에서, 제1항, 제2항, 제3항, 제5항 및 제18항 중 어느 한 항의 박테리아 균주를 메탄 및 메탄올로 구성된 군에서 선택된 C1 탄소기질과 접촉시키고;
    (b) 임의로는, 단세포 단백질을 회수하는 것
    을 포함하는 단세포 단백질의 생산 방법.
  25. 제23항에 있어서, C1 탄소 기질이 혐기적 조건 하에서 박테리아 균주와 접촉되는 것인 방법.
  26. 제23항에 있어서, C1 탄소 기질이 호기적 조건 하에서 박테리아 균주와 접촉되는 것인 방법.
  27. 암모니아, 질산염, 아질산염 및 질소가스로 구성된 군에서 선택된 질소 함유 화합물의 존재 하에, 상기 질소함유 화합물의 생물변환이 일어나기에 충분한 시간동안 적절한 배지에서, 제8항 또는 제9항의 박테리아 균주를 메탄 및 메탄올로 구성된 군에서 선택된 C1 탄소기질과 접촉시키는 것을 포함하는, 질소함유 화합물의 생물변환 방법.
  28. (a) 식용 산물이 발현되고 축적되기에 충분한 시간 동안 적절한 배지에서, 제1항, 제2항, 제3항, 제5항 및 제18항 중 어느 한 항의 박테리아 균주를 C1 탄소기질과 접촉시키는 단계; 및
    (b) 임의로는, 식용 산물을 회수하는 단계
    를 포함하는, 단백질, 탄수화물 및 색소를 포함하는 식용 산물의 제조 방법.
  29. 제28항에 있어서, 단백질, 탄수화물 및 색소의 상대적 조성을, 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9, 서열 11, 서열 13, 서열 15, 서열 17, 서열 19, 서열 21, 서열 23, 서열 25, 서열 27, 서열 29, 서열 31, 서열 33, 서열 35, 서열 37, 서열 39, 서열 41, 서열 43, 서열 45, 서열 47, 서열 49, 서열 51, 서열 53, 서열 55, 서열 57, 서열 59, 서열 61, 서열 63, 서열 65, 서열 67 및 서열 69로 구성된 군에서 선택된 단백질 코딩 유전자 중 어느 1 개의 유전자를 상향조절 또는 하향조절하여 변경시키는 방법.
  30. (a) 고성장율의 메탄영양요구성 박테리아 균주를 포함하는 것으로 추측되는 시료를, 유일한 탄소원으로서 메탄의 존재 하에 적절한 배양 배지에서 배양하는 단계;
    (b) 단계 (a)의 조건 하에서 배양된 콜로니(colony)를 동정하는 단계;
    (c) 단계 (b)에서 동정된 콜로니에 피로포스페이트 의존성 포스포프럭토키나제 활성이 존재하는지 분석하는 단계
    를 포함하는, 제1항에 따른 고성장율의 메탄영양요구성 박테리아 균주를 동정하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 단계 (b)의 콜로니에
    (a) 서열 6에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 단리된 핵산 분자;
    (b) 65 ℃에서 0.1X SSC, 0.1 ％ SDS로 혼성화시키고, 순차적으로 2X SSC, 0.1 ％ SDS 및 0.1X SSC, 0.1 ％ SDS로 세척하는 혼성화 조건 하에서 상기 (a)의 핵산 분자와 혼성화되는 단리된 핵산 분자;
    (c) 서열 6에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드와 비교할 때, 스미스-워터만 정렬 방법에 기초하여 63 ％ 이상의 동일성을 갖는 437 개 이상의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자; 및
    (d) (a), (b) 또는 (c)에 상보적인 단리된 핵산 분자
    로 구성된 군에서 선택된 유전자가 존재하는지 추가적으로 분석하는 방법.
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