KR20170026084A

KR20170026084A - 신규한 메틸로모나스 속(Methylomonas sp.) 균주 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20170026084A
Application number: KR1020160041147A
Authority: KR
Inventors: 이은열; 허동훈; 황인엽; 전영찬
Original assignee: 경희대학교 산학협력단
Priority date: 2015-08-31
Filing date: 2016-04-04
Publication date: 2017-03-08
Also published as: KR101714967B1

Abstract

본 발명은 신규한 균주 메틸로모나스 속(Methylomonas sp.) DH-1 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 본 발명은 메탄으로부터 메탄올을 합성하는, 기탁번호 KCTC18400P로 기탁된 메틸로모나스 속(Methylomonas sp.) DH-1 균주, 상기 균주의 배양물을 포함하는 메탄올 합성용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 메탄올 합성용 키트, 및 상기 균주를 이용한 메탄올의 생산방법에 관한 것이다.
본 발명의 메틸로모나스 속 DH-1 균주를 이용하면, 보다 신속하게 메탄올의 대량생산을 달성할 수 있을 뿐만 아니라, 생산된 메탄올을 이용함으로써 생분해성 플라스틱생산, 메탄올 연료전지, 가솔린엔진 등의 바이오연료로의 응용에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

신규한 메틸로모나스 속(Methylomonas sp.) 균주 및 이의 용도{Novel Methylomonas species strain and use thereof}

본 발명은 신규한 균주 메틸로모나스 속(Methylomonas sp.) DH-1 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 본 발명은 메탄올을 합성하는 기탁번호 KCTC18400P로 기탁된 메틸로모나스 속(Methylomonas sp.) DH-1 균주, 상기 균주 또는 상기 균주의 배양물을 포함하는 메탄올 합성용 조성물, 상기 균주 또는 상기 조성물을 포함하는 메탄올 합성용 키트, 및 상기 균주를 이용한 메탄올의 생산방법에 관한 것이다.

메탄가스는 천연가스와 셰일가스의 주성분이며 온실효과를 일으키는 원인 물질로 알려져 있다. 석유로 대표되는 액체 탄화수소와는 달리 메탄은 그 자체만으로는 기체이기 때문에 고부가가치 산물로의 전환이 어렵고 연료로서의 사용 또한 어렵다고 평가된다. 그에 따라 메탄가스를 액상의 화합물로 전환하고자 하는 노력이 계속되어 왔다. 메탄을 이용하여 생산할 수 있는 대표적인 화합물에는 메탄올을 예로 들 수 있다. 메탄올은 디메틸에테르(dimethyl ether)와 바이오디젤(biodiesel)등의 생성에 사용되는 반응 중간체이며, 그 외 여러 분야에서 기초적인 화합물질로서 사용되고 있다. 현재 상용화 되어있는 메탄을 이용한 메탄올 생산 공정은 메탄을 수소와 일산화탄소의 혼합물인 합성가스(syngas)로 전환한 후에 고온과 고압의 조건을 거쳐 메탄올을 합성하는 공정으로 이루어져 있다. 그러나 이와 같은 화학공정은 고온, 고압 조건을 필요로 하기 때문에 안정성의 문제가 제시되고 있으며, 높은 공정비용과 낮은 수율 또한 큰 문제로 대두되고 있다. 그에 따라 환경보전적이며 경제적인 바이오공정을 통해 메탄올을 합성하려는 연구가 진행되어 왔다. 바이오공정은 기존의 화학공정에 비하여 에너지소모가 적으며 더욱 선택적으로 반응하고, 안정적이라는 장점이 있어 많은 화학공정을 바이오공정으로 대체하여 메탄으로부터 메탄올을 합성하려는 노력이 계속되고 있다.

메탄자화균(Methanotrophic bacteria)은 메탄을 유일한 에너지원으로 생육할 수 있는 미생물로, 1906년에 Sohngen에 의해 처음으로 분리되었다. 그 후, 분류학적 연구로 세포의 형태, 정지기의 세포 또는 세포내막구조의 형태에 따라 메틸로모나스 속(Methylomonas), 메틸로박터 속(Methylobacter), 메틸로코커스 속(Methylococcus), 메틸로마이크로븀 속(Methylomicrobium), 메틸로스페라 속(Methylosphaera), 메틸로칼덤 속(Methylocaldum), 메틸로글로버스 속(Methyloglobus), 메틸로사르시나 속(Methylosarcina), 메틸로프로펀더스 속(Methyloprofundus), 메틸로썰머스 속(Methylothermus), 메틸로할로비우스 속(Methylohalobius), 메틸로게아 속(Methylogaea), 메틸로마리넘 속(Methylomarinum), 메틸로벌럼 속(Methylovulum), 메틸로마리노범 속(Methylomarinovum), 메틸로러브럼 속(Methylorubrum), 메틸로파라코커스 속(Methyloparacoccus), 메틸로시너스 속(Methylosinus), 메틸로시스티스 속(Methylocystis), 메틸로셀라 속(Methylocella), 메틸로캡사 속(Methylocapsa), 메틸로퍼룰라 속(Methylofurula), 메틸아시디필럼 속(Methylacidiphilum), 메틸아시디마이크로븀 속(Methylacidimicrobium)의 25종으로 분류되었다. 또한, 메탄산화세균은 모든 균종에 있어서 발달된 내막구조가 관찰되고, 이 세포내막의 차이에 따라 포개진 소포상의 내막이 세포전체에 분포하는 type I과 세포 주변을 따라 내막이 배열되어 있는 type II의 두가지 형태로 구분된다. 또한, 세포내막에는 지질을 구성하고 있는 지방산 조성에 차이가 있다고 보고되고 있으며, type I의 메탄산화세균은 16-탄소사슬의 지방산이 많고, type II의 메탄산화세균은 18-탄소사슬의 지방산이 많으며, 양쪽 타입 모두가 불포화 결합을 1개 함유하는 지방산을 갖는다. 이러한 메탄산화세균은 메탄 모노옥시게나아제(monooxygenases, MMO)라는 효소를 함유하고 있어 상온, 상압하에서도 용이하게 메탄을 메탄올로 전환할 수 있다. 메탄은 메탄 모노옥시게나아제에 의해 메탄올로 산화되고, 그 다음, 메탄올은 메탄올탈수소효소(methanol dehydrogenase, MDH)에 의해 포름알데히드(formaldehyde) 또는 포름산으로 산화되어 이산화탄소가 된다. 이러한 메탄으로부터 탄소화합물의 생합성은 리불로오스 일인산 회로(ribulose monophosphate cycle; RuMP cycle)와 세린 회로(serine cycle)에 의해 진행되고, 일반적으로 type I의 메탄산화세균은 리불로오스 일인산 회로를, type II의 메탄산화세균은 세린 회로를 이용하여 바이오매스를 합성한다고 알려져 있다(Biocatalytic Conversion of Methane to Methanol as a Key Step for Development of Methane-Based BiorefineriesJ. Microbiol. Biotechnol. In Yeub Hwang et al(2014), 24(12), 1597-605). 이러한 메탄산화세균이 갖는 생리학적 특성으로 인해, 메탄산화세균을 이용하여 메탄을 메탄올로 전환시켜, 유해한 메탄가스를 절감시키려는 노력과 에너지원으로 활용하려는 노력이 계속되어 왔다.

하지만, 실질적으로 메탄산화세균을 통한 바이오공정은, 미생물 반응이기 때문에 반응속도가 느리다는 점, 미생물의 대량생산이 어렵다는 점, 장기간 안정적인 배양이 곤란하다는 점, 생성물을 효율적으로 회수할 수 없다는 등의 문제점으로 인해 바이오공정을 통한 메탄올의 대량생산은 곤란한 실정이다. 보고된 바에 따르면, 종래의 메탄산화세균의 일종인 메틸로시너스 트리코스포리움 OB3b를 이용한 메탄올 합성에 있어서, 그 생산능력이 30μmol/min/g 건조균제 정도로, 상업적으로 이용하기에는 양이 충분하지 않아 실질적으로 대량생산에 이어지지 못하고 있다(Optimization of Methanol Biosynthesis by Methylosinus trichosporium OB3b, M. Tak eguti et al, Applied Biochemistry and Biotechnology vol68, 143-152 1997, 한국특허공개 제2002-0073376호).

이러한 문제점을 해결하기 위한 방안으로, 메탄을 메탄올로 산화시키는 메탄산화효소의 작용을 유지 또는 향상시키거나, 메탄올탈수소효소의 작용을 선택적으로 저해할 수 있다면 상온 및 상압 조건에서 고수율로 메탄올의 합성을 유도할 수 있을 것으로 생각된다.

이러한 배경하에, 본 발명자들은 메탄가스를 이용하여 메탄올을 보다 효율적으로 생산할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 예의노력한 결과, 메탄가스가 지속적으로 생성되는 하수 슬러지로부터 신규 균주인 메탄산화세균 메틸로모나스 속(Methylomonas sp.) DH-1 균주를 분리동정하였고, 상기 DH-1 균주가 신속하게 고수율로 메탄올을 생산하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 기탁번호 KCTC18400P로 기탁된 메틸로모나스 속(Methylomonas sp.) DH-1 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 DH-1 균주 또는 상기 균주의 배양물을 포함하는, 메탄올 합성용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 DH-1 균주 또는 상기 조성물을 포함하는, 메탄올 합성용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 DH-1 균주 또는 이의 배양산물을 메탄을 포함하는 반응용기에서 반응하는 단계를 포함하는, 메탄올의 생산방법을 제공하는 것이다.

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 기탁번호 KCTC18400P로 기탁된 메틸로모나스 속(Methylomonas sp.) DH-1 균주를 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "메틸로모나스 속(Methylomonas sp.) DH-1 균주"란, 하수슬러지로부터 유래되고, 종래에 보고되지 않았던 메틸로모나스 속(Methylomonas sp.)에 속하는 균주로서, 2015년 8월 27일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하고, 기탁번호 KCTC18400P를 부여받은 균주를 의미한다.

본 발명에 있어서, 본 발명자들은 미생물을 이용한 메탄올 생산에 적합한 균주를 발굴하기 위하여, 메탄가스가 지속적으로 발생하는 하수슬러지에 주목하여 새로운 메탄산화세균인 메틸로모나스 속 균주를 분리동정하는데 성공하였다.

상기 균주는 이에 제한되지 않지만, 하수슬러지 뿐만 아니라, 구체적인 예로 지하수, 지표수, 공업용수, 오수, 폐수 및 하수로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상으로부터 유래된 것일 수 있다.

상기 분리한 균주의 성상특성을 분석한 결과, 주사전자현미경을 통해 1x1.5 ㎛의 크기를 갖는 간균임을 확인하였고, 투사현미경을 통해 내부에 만입세포막(intracytoplasmic membrane, ICM)구조를 갖는 type I의 메탄산화세균임을 확인하였다(도 1a, 도 1b).

상기 균주는 서열번호 3으로 기재된 16S rDNA 유전자 및 서열번호 6으로 기재된 pmoA 유전자를 갖는다.

본 발명에서 사용되는 용어, '16S rDNA'란, 16S 리보솜 DNA(16S ribosomal DNA)라고도 불리며, 원핵생물 리보솜의 30S 소단위체를 구성하고 있는 rDNA를 의미한다. 상기 rDNA의 서열은 동종(同種)간에는 다양성이 거의 없는 반면에, 타종(他種)간에는 다양성이 나타나므로 생물동정에 사용되며, 배양이 불가능하거나 어려운 생물, 또는 보고된 적이 없는 생물의 동정 및 분류에 특히 유용하게 사용된다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 16S rDNA 유전자를 증폭시켜 염기서열을 결정한 후 분자 계통학적으로 분석한 결과, 메틸로모나스 속에 속하는 다른 균주와 99%의 유사도를 보여 상기 균주가 메틸로모나스 속에 속하는 신규한 균주임을 알 수 있었다(도 2a).

본 발명에서 사용되는 용어, "미립자 메탄 모노옥시게나제(particulate methane monooxygenase, pMMO)"란, 모든 메탄산화세균이 함유하고 있는 메탄을 메탄올로 산화시키는 화학반응을 촉매하는 효소를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "미립자 메탄 모노옥시게나제 알파 소단위체 (particulate methane monooxygenase alpha subunit, pmoA)"란, 미립자 메탄 모노옥시게나제의 세가지 소단위체 중 하나인 알파 소단위체를 의미하며, 구체적으로 미립자 메탄 모노옥시게나제 알파 소단위체를 발현하는 유전자를 의미한다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 균주의 pmoA 유전자를 분자계통학적으로 분석한 결과, Methylomonas koyamae Fw12E-Y 균주의 pmoA 유전자와 98% 이상의 유사도를 나타내어 상기 균주가 메틸로모나스 속에 속하는 신규한 균주임을 알 수 있었다(도 2b). 이에, 상기 균주를 "메틸로모나스 속(Methylomonas sp.) DH-1"으로 명명하고, 이를 2015년 8월 27일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하여 기탁번호 KCTC18400P를 부여받았다.

본 발명의 상기 균주의 형태학적 및 생화학적 특징을 분석한 결과, 그람음성의 미생물로, 항생물질인 클로람페니콜(Cam), 테트라사이클린(Tet), 리팜피신(Rif)에 대해 저항성을 가지며, 배양에 있어서 적절한 온도는 30℃이며, 적절한 구리이온의 농도는 10 μM이며, 공기:메탄의 비율이 7:3인 조건에서 잘 생육하는 것을 확인하였다(표 1). 추가로, 상기 균주는 메탄, 메탄올, 메틸아민(methylamine), 에스큘린(esculin)의 탄소원에서 잘 생육하는 것을 알 수 있었다(표 2).

또한, 상기 균주는 30 내지 70%의 메탄, 구체적으로 40%의 메탄이 존재하는 조건; 6 내지 8의 pH 조건, 구체적으로 pH 7의 조건; 0.6 내지 2.4g 건조균체량/L, 구체적으로 2.4g 건조균체량/L이 존재하는 조건; 20 내지 200 mM의 포름산나트륨, 구체적으로 40 mM의 포름산나트륨이 존재하는 조건; 0.3 내지 5 mM의 EDTA, 구체적으로 0.5 mM의 EDTA가 존재하는 조건에서 메탄올 생산 능력이 최대가 됨을 확인하였고(도 3a 내지 도 3e), 아울러 반응 4시간 이내에 메탄올 생산 능력이 최대가 되며, 이러한 메탄올 합성 능력은 최대 12시간까지 유지됨을 확인하였다(도 4).

또한, 상기 DH-1 균주는 다른 메탄산화세균인 메틸로시너스 트리코스포리움 속 OB3b 균주(Methylosinus trichosporium OB3b) 또는 메틸로셀라 실베스트리스 속 BL2 균주 (Methylocella silvestirs BL2)와 비교하였을 때, 각각 130% 또는 230% 높은 메탄올 생산 능력을 나타냄을 확인하였다(도 5). 이는, 본 발명의 메틸로모나스 속 DH-1 균주는 다른 메탄산화세균에 비하여 빠른 반응 시간 내에 고수율로, 메탄으로부터 메탄올을 생산할 수 있음을 시사하는 것이며, 따라서 메탄올을 이용한 바이오연료 또는 여러 화학공정의 재료로서의 응용에 널리 활용될 수 있음을 시사하는 것이다.

한국특허공개 제2002-0073376호에 공지된 바에 따르면, 메탄산화세균인 메틸로시너스 트리코스포리움 OB3b 균주는 0.6 mg 건조균체량/mL에서 반응 40시간 후에 14 mM의 메탄올을 생산하는 것이 개시되어 있다. 또한, 기존 문헌(Biotechnology and Bioprocess Engineering 15: 476-480, 2010. Hee Gon Kim)에 공지된 바에 따르면, 상기 OB3b 균주는 0.6 mg 건조균체량/mL에서 반응 12시간 후에 13.2 mM의 메탄올을 생성하는 것이 개시되어 있으나, 본 발명의 DH-1 균주는 4시간 이내에 41.5 mM의 메탄올을 생산할 수 있으므로, 기존의 메탄산화세균에 비하여 본 발명의 DH-1 균주가 훨씬 빠르게 많은 양의 메탄올을 생산할 수 있음을 시사하는 것이고, 메탄올 합성에 더욱 유용하게 사용될 수 있음을 시사하는 것이다. 또한, 본 발명의 DH-1 균주는 기존의 미생물을 이용한 메탄올 생산의 문제점으로 제시되어 왔던 느린 반응 속도와 대량생산의 어려움 등의 문제점을 극복하기 위한 해결책이 될 수 있음을 시사한다.

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 메틸로모나스 속 DH-1 균주 또는 상기 균주의 배양물을 포함하는 메탄올 합성용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 제공하는 메틸로모나스 속 DH-1 균주는 메탄올을 합성할 수 있으므로, 상기 조성물에 포함된 메틸로모나스 속 DH-1 균주의 배양산물은 메탄올을 합성할 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 구체적인 예로는 상기 균주의 배양물, 배양상등액, 파쇄물, 이들의 분획물 등이 될 수 있다. 이때, 상기 배양상등액은 메틸로모나스 속 DH-1 균주의 배양물을 원심분리하여 수득할 수 있고, 상기 파쇄물은 메틸로모나스 속 DH-1 균주를 물리적으로 또는 초음파처리하여 수득할 수 있으며, 상기 분획물은 상기 배양물, 배양상등액, 파쇄물 등을 원심분리, 크로마토그래피 등의 방법에 적용하여 수득할 수 있다.

또한, 본 발명의 메탄올 합성용 조성물은 상기 메틸로모나스 DH-1 균주 이외에, 메탄올 생산량 증진 또는 메탄올 생산속도를 증가시킬 수 있는 다른 균주를 추가로 포함 할 수 있다. 상기 추가로 포함될 수 있는 균주는 특별히 이에 제한되지 않으나 바람직하게는 메탄을 메탄올로 산화할 수 있는, 메탄산화세균인 메틸로모나스 속(Methylomonas), 메틸로박터 속(Methylobacter), 메틸로코커스 속(Methylococcus), 메틸로마이크로븀 속(Methylomicrobium), 메틸로스페라 속(Methylosphaera), 메틸로칼덤 속(Methylocaldum), 메틸로글로버스 속(Methyloglobus), 메틸로사르시나 속(Methylosarcina), 메틸로프로펀더스 속(Methyloprofundus), 메틸로썰머스 속(Methylothermus), 메틸로할로비우스 속(Methylohalobius), 메틸로게아 속(Methylogaea), 메틸로마리넘 속(Methylomarinum), 메틸로벌럼 속(Methylovulum), 메틸로마리노범 속(Methylomarinovum), 메틸로러브럼 속(Methylorubrum), 메틸로파라코커스 속(Methyloparacoccus), 메틸로시너스 속(Methylosinus), 메틸로시스티스 속(Methylocystis), 메틸로셀라 속(Methylocella), 메틸로캡사 속(Methylocapsa), 메틸로퍼룰라 속(Methylofurula), 메틸아시디필럼 속(Methylacidiphilum), 메틸아시디마이크로븀 속(Methylacidimicrobium) 등을 조합하여 포함할 수 있다.

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 메탄올 합성용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트는 상기 조성물을 포함하여 메탄올을 합성하는데 사용될 수 있는데, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 반응에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있고, 구체적인 예로 상기 조성물에 포함된 메틸로모나스 속 DH-1 균주 배양용 배지, 메탄올 합성에 사용되는 완충액, 상기 메탄올 합성을 수행하기 위한 반응용기, 상기 메탄올 합성을 수행하기 위한 온도 조절기, 상기 메탄올 합성 반응을 수행하기 위한 타이머 등이 포함될 수 있다.

더 구체적인 예로, 본 발명의 메탄올 합성용 키트는 메틸로모나스 속 DH-1 균주, 상기 균주 배양용 배지, 메탄올 합성에 사용되는 완충액 및 메탄올 합성에 사용되는 항온 반응용기를 포함할 수 있다.

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 메틸로모나스 속 DH-1 균주 또는 이의 배양산물을 메탄을 포함하는 반응용기에서 반응하는 단계를 포함하는, 메탄올의 생산방법을 제공한다.

본 발명에서, 상기 반응용기 내 기체는 메탄을 30 내지 70%(v/v), 구체적으로 40%(v/v)로 포함할 수 있고; 상기 반응용기 내 pH는 6.0 내지 8.0, 구체적으로 pH 7.0일 수 있고; 상기 균주는 0.6 내지 2.4g 건조균체량/L, 구체적으로 2.4g 건조균체량/L로 포함될 수 있고; 상기 반응용기는 20 내지 200 mM의 포름산나트륨, 구체적으로 40 mM의 포름산나트륨을 추가로 포함할 수 있고; 상기 반응용기는 0.3 내지 5 mM의 EDTA, 구체적으로 0.5 mM의 EDTA를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 반응용기에 40%의 메탄, pH 7의 인산나트륨, 2.4g 건조균체량/L, 40 mM의 포름산나트륨, 0.5 mM의 EDTA를 포함시켜 반응을 수행하였을 때, 다른 조건에 비하여 메탄올 생산 능력이 최대가 됨을 확인하였다(도 3a 내지 도 3e).

본 발명의 메틸로모나스 속 DH-1(KCTC18400P) 균주는 메탄올을 합성할 수 있으므로, 생분해성 플라스틱생산, 메탄올 연료전지, 가솔린엔진 등의 바이오연료로의 응용에 널리 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 본 발명의 DH-1 균주를 현미경을 통해 관찰한 이미지로서, 도 1a는 주사전자현미경, 도 1b는 투사전자현미경으로 관찰한 결과를 보여준다.
도 2는 본 발명의 DH-1 균주의 분자생물학적 계통분류도로서, 도 2a는 16S rDNA 유전자 염기서열을 이용한 계통분류도, 도 2b는 미립자 메탄 모노옥시게나제 알파 소단위체(particulate methane monooxygenase alpha subunit, pmoA)유전자의 염기서열을 이용한 계통분류도이다.
도 3은 본 발명의 DH-1 균주의 다양한 조건에서의 메탄올 합성 능력을 나타내는 그래프로서, 도 3a는 메탄 농도, 도 3b는 pH, 도 3c는 DH-1 균주의 건조균체량, 도 3d는 포름산나트륨(Sodium formate) 농도, 도 3e는 EDTA 농도에 따른 DH-1 균주의 메탄올 합성 능력을 보여준다.
도 4는 본 발명의 DH-1 균주의 메탄올 생산 최적 조건에서의 메탄올 합성 능력을 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 DH-1 균주와 다른 메탄산화세균인 메틸로시너스 트리코스포리움 속 OB3b 균주(Methylosinus trichosporium OB3b), 메틸로셀라 실베스트리스 속 BL2 균주(Methylocella silvestirs BL2)간의 메탄올 합성 능력을 비교한 그래프로서, 본 발명에서 최적화한 메탄올 생산 조건에서 반응을 수행하였다.

이하, 본 발명은 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 하수슬러지로부터 메탄산화세균의 분리

하수슬러지로부터 메탄산화세균을 분리하기 위한 방법은 다음과 같다. 채취한 하수슬러지를 nitrate-mineral-salt(NMS)배지(liter당; 1 g MgSO₄·7H₂O, 1 g KNO₃, 0.2 g CaCl₂·H₂O, 0.0038 g Fe-EDTA, 0.0005 g NaMo·4H₂O)에 trace elements solution (1x) 1 mL (liter당; 500 mg FeSO₄·7H₂O, 400 mg ZnSO₄·7H₂O, 20 mg MnCl₂·7H₂O, 50 mg CoCl₂·6H₂O, 10 mg NiCl₂·6H₂O, 15 mg H₃BO₃, 250 mg EDTA), phosphate stock solution (1x) 10 mL (liter당; 26 g KH₂PO₄, 62 g Na₂HPO₄·7H₂O), vitamin stock (1x) 2 mL (liter당; 2 mg Biotin, 2 mg Folic acid, 5 mg Thimine HCl, 5 mg Ca pantothenate, 0.1 mg Vitamin B12, 5 mg Riboflavin, 5 mg Nicotinamide)이 담겨있는 시험관에 첨가한 후, 시험관을 고무마개와 절연테이프를 이용하여 밀봉하였다. 그 다음, 주사기를 이용하여 공기를 30% 제거하고, 메탄가스를 주입하여 시험관내의 메탄가스의 최종농도가 30%가 되도록 조정하였다. 그 다음, 30℃, 230 rpm에서 배양하였다. 배지에 미생물이 충분히 배양되면 고체 NMS agar에 미생물을 도말하였다. 도말된 고체 NMS agar를 진공 데시케이터 안에 넣어 공기와 메탄의 비율이 7:3으로 유지되도록 밀봉한 후, 30℃에서 수일간 배양하였다. 수일 후, 생성된 균락을 채취하여 2 내지 3회 정도 계대배양함으로써 단일균주를 분리하였다.

분리한 메탄산화세균의 외형을 관찰하기 위해 주사전자현미경과 투사전자현미경을 이용해 관찰하여 그 결과를 도 1a, b에 나타내었다. 도 1a, b에 나타내는 바와 같이 주사현미경을 통해 1x1.5 ㎛의 크기를 갖는 간균임을 확인하였으며, 투사현미경을 통해 내부에 만입세포막(intracytoplasmic membrane, ICM)구조를 갖는 type I 메탄산화세균임을 확인하였다.

실시예 2: 신규한 메틸로모나스 속 균주의 동정 및 명명

상기 실시예 1에서 분리한 메탄산화세균을 동정하기 위해 16S rDNA 유전자의 염기서열분석을 하기와 같이 실시하였다. 16S rDNA 유전자 증폭을 위해 서열번호 1 및 서열번호 2로 기재된 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭한 후, 증폭한 PCR 산물을 시퀀싱(sequencing) 반응을 통해 염기서열을 분석하였다.

정방향 프라이머 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'): (서열번호: 1)

역방향 프라이머 1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'): (서열번호: 2)

상기 분석한 균주의 염기서열을 NCBI(National Center for Biotechnology Information: 미국 국립생물정보센터)의 BLAST를 이용하여 미생물 상동성을 조사한 결과, 본 발명에서 분리한 균주의 염기서열은 Methylomonas koyamae Fw12E-Y 균주와 99% 이상의 유사도를 나타내었다. 상기 균주의 16S rDNA염기서열의 분석결과를 서열번호 3으로 기재하였으며, 상기 분석한 염기서열을 이용한 계통학적 결과는 Kimura 2-parameter 모델과 neighbor-joining 방법으로 염기서열 간의 진화적 거리와 계통도를 추론하였다(도 2a).

또한, 상기 균주의 미립자 메탄 모노옥시게나제 알파 소단위체(particulate methane monooxygenase alpha subunit, pmoA) 유전자의 염기서열을 분석하기 위해 서열번호 4 및 서열번호 5에 기재된 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭한 후, 증폭된 PCR 산물을 시퀀싱(sequencing)반응을 통해 염기서열을 분석하였다.

정방향 프라이머 A189F(5'-GGNGACTGGGACTTCTGG-3'): (서열번호: 4)

역방향 프라이머 mb661R(5'-CCGGMGCAACGTCYTTACC-3'): (서열번호: 5)

상기 분석한 균주의 염기서열을 NCBI(National Center for Biotechnology Information: 미국 국립생물정보센터)의 BLAST를 이용하여 미생물 상동성을 조사한 결과, 상기 균주의 pmoA 유전자는 Methylomonas koyamae Fw12E-Y 균주의 pmoA 유전자와 98% 이상의 유사도를 나타내었다. 상기 균주의 pmoA 유전자의 염기서열을 서열번호 6으로 기재하였으며, 상기 분석한 염기서열을 이용한 계통학적 결과는 Kimura 2-parameter 모델과 neighbor-joining 방법으로 염기서열 간의 진화적 거리와 계통도를 추론하였다(도 2b).

상기 결과를 토대로, 본 발명에서 분리한 미생물이 메탄을 메탄올로 산화하는 미생물로 널리 알려진 메탄산화세균 메틸로모나스 속(Methylomonas sp.)임을 확인하였다.

이에, 본 발명자들은 상기 균주를 "메틸로모나스 속(Methlyomonas sp.) DH-1"으로 명명하고, 이를 2015년 8월 27일자로 한국생명공학연구원 생물자원세터에 기탁하여 기탁번호 KCTC18400P를 부여받았다.

실시예 3: DH -1 균주의 형태학적 및 생화학적 특성

주사전자현미경(Scanning Electron Microscope, SEM) 및 투사전자현미경(Transmission Electron Microscope, TEM)을 통해 메틸로모나스 속 DH-1 균주의 형태학적 특성을 관찰하였다(도 1). 도 1에서 나타내는 바와 같이, DH-1 균주는 메탄산화세균의 전형적인 형태인 막대 형태를 보였고, 고체배지에서 점차적으로 Light Yellow -> Yellow -> Orange -> Brown의 콜로니 색깔을 나타냄을 알 수 있었다.

또한, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 생화학적 특성으로는 본 상기 DH-1 균주는 그람음성의 미생물로, 항생물질인 클로람페니콜(Cam), 테트라사이클린(Tet), 리팜피신(Rif)에 대해 저항성을 가지고, 배양에 있어서 적절한 온도는 30℃이며, 적절한 구리이온의 농도는 10 μM이며, 공기:메탄의 비율이 7:3인 조건에서 잘 배양되는 것을 확인하였다.

실시예 4: DH -1 균주의 기질 이용능력

상기 실시예 1 및 실시예 2에서 분리동정한 메틸로모나스 속 DH-1 균주의 기질 이용능력을 조사하였으며, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

상기 표 2에서 나타내는 바와 같이, 상기 DH-1 균주는 메탄, 메탄올, 메틸아민(Methylamine) 또는 에스큘린(Esculin)의 탄소원에서 잘 생육하는 것을 알 수 있었다.

실시예 5: 다양한 메탄산화세균과 DH -1 균주의 지방산 조성의 비교

메탄산화세균의 type Ⅰ의 메틸로모나스 속(Methylosinus), 메틸로박터 속(Methylobacter), 메틸로마이크로비움 속(Methylomicarobium) 및 메틸로코커스 속(Methylococcus)과, DH-1 균주의 지방산 조성에 대해 비교하였으며, 그 결과를 표 3에 나타내었다.

상기 표 3에서 14:0은 탄소개수 14개이며 포화되어 있는 지방산을 의미한다. 표에서 16:1ω8c는 탄소개수 16개이며 8번 탄소에 cis 구조의 이중결합이 존재하는 불포화 지방산을 의미한다.

또한, 상기 표 3에서 나타내는 바와 같이, DH-1 균주의 포화 지방산 14:0이 23.59%를 나타내어 메틸로모나스 속과 지방산 조성에 있어서 유사한 결과를 나타내었다. 하지만, 불포화 지방산인 16:1ω8c, 16:1ω7c, 16:1ω6c, 16:1ω5c 및 16:1ω8t는 메틸로모나스 속과 다른 지방산 조성을 나타내었고, 16:1ω7c(31.82%), 16:1ω6c(3.52%)는 메틸로코커스 속과 지방산 조성에 있어서 유사한 결과를 나타내었다.

실시예 6: DH-1 균주의 메탄올 합성의 최적화 조건 확립

상기 실시예 1 및 실시예 2에서 분리, 동정한 메틸로모나스 속 DH-1 균주의 메탄올 합성능력을 분석하기 위해, 하기 실시예 6-1 내지 6-5를 통해 생육조건을 달리한 반응용액에서의 메탄올 생산량을 측정함으로써 메탄올 생성의 최적 조건을 확인하였다.

실시예 6-1: 메탄 농도에 따른 메탄올 생산량 분석

20 mM 인산나트륨 완충용액(pH 6.3), 0.6 g 건조균체량/L의 DH-1 균주, 0.5 mM EDTA, 및 40 mM 포름산나트륨을 포함하는 반응 용액 1 ml을 부피 24 ml인 반응용기에 넣어 상부의 메탄 농도를 10 내지 90 %로 다양하게 설정한 후, 30℃에서 230 rpm으로 12시간 동안 메탄올 생성반응을 수행하였다. 반응이 종료된 후, 생성된 메탄올의 양을 측정하였다. 이때, 메탄올의 생산량은 반응시킨 반응 용액을 90℃ 히팅블락(heating block)에서 30분 방치하여 반응 종결 후, 13000 rpm으로 원심분리하여 상층액을 얻은 다음, GC분석을 통하여 반응용액의 메탄올 생산량을 측정하였다.

그 결과, 도 3a에서 나타내는 바와 같이, 30 내지 70%의 메탄을 제공하였을 때 메탄올 합성 능력이 우수함을 확인하였고, 특히, 40%의 메탄을 제공하였을 때 0.706 g/L의 메탄올을 생산하여, 다른 농도에 비하여 메탄올 합성 능력이 최대가 됨을 확인하였다.

실시예 6-2: pH에 따른 메탄올 생산량 분석

4 내지 10의 pH를 갖는 20 mM 인산나트륨 완충용액, 0.6 g 건조균체량/L의 DH-1 균주, 0.5 mM EDTA, 및 40 mM 포름산나트륨을 포함하는 반응 용액 1 ml을 부피 24 ml인 반응용기에 넣어 상부의 메탄 농도를 40%로 설정한 후, 30℃에서 230 rpm으로 4시간 동안 메탄올 생성반응을 수행하였다. 반응이 종료된 후, 상기 실시예 6-1에 따른 방법으로 생성된 메탄올의 양을 측정하였다.

그 결과, 도 3b에서 나타내는 바와 같이, 6 내지 8의 pH조건에서 메탄올 합성 능력이 우수함을 확인하였고, 특히, pH 7.0의 인산나트륨 완충용액을 반응 용액으로 사용하였을 때 0.302 g/L의 메탄올을 생산하여, 다른 pH 조건에 비하여 메탄올 합성 능력이 최대가 됨을 확인하였다.

실시예 6-3: 건조균체량에 따른 메탄올 생산량 분석

20 mM 인산나트륨 완충용액(pH 7.0), 0.15 내지 4.8 g 건조균체량/L의 DH-1 균주, 0.5 mM EDTA, 및 40 mM 포름산나트륨을 포함하는 반응 용액 1 ml을 부피 24 ml인 반응용기에 넣어 상부의 메탄 농도를 40%로 설정한 후, 30℃에서 230 rpm으로 1시간 동안 메탄올 생성반응을 수행하였다. 반응이 종료된 후, 상기 실시예 6-1에 따른 방법으로 생성된 메탄올의 양을 측정하였다.

그 결과, 도 3c에서 나타내는 바와 같이, 0.6 내지 2.4g 건조균체량/L의 조건에서 메탄올 합성 능력이 우수함을 확인하였고, 특히, 2.4 g 건조균체량/L의 DH-1 균주가 존재할 때 0.256 g/L의 메탄올을 생산하여, 다른 건조균체량 조건에 비하여 메탄올 합성 능력이 최대가 됨을 확인하였다.

실시예 6-4: 포름산나트륨 농도에 따른 메탄올 생산량 분석

20 mM 인산나트륨 완충용액(pH 7.0), 2.4 g 건조균체량/L의 DH-1 균주, 0.5 mM EDTA, 및 0 내지 200 mM 포름산나트륨을 포함하는 반응 용액 1 ml을 부피 24 ml인 반응용기에 넣어 상부의 메탄 농도를 40%로 설정한 후, 30℃에서 230 rpm으로 12시간 동안 메탄올 생성반응을 수행하였다. 반응이 종료된 후, 상기 실시예 6-1에 따른 방법으로 생성된 메탄올의 양을 측정하였다.

그 결과, 도 3d에서 나타내는 바와 같이, 20 내지 200 mM 포름산나트륨의 조건에서 메탄올 합성 능력이 우수함을 확인하였고, 특히 40 mM 포름산나트륨이 존재할 때 0.785 g/L의 메탄올을 생산하여, 다른 포름산나트륨 농도에 비하여 메탄올 합성 능력이 최대가 됨을 확인하였다.

실시예 6-5: EDTA 농도에 따른 메탄올 생산량 분석

20 mM 인산나트륨 완충용액(pH 7.0), 2.4 g 건조균체량/L의 DH-1 균주, 0 내지 15 mM EDTA, 및 40 mM 포름산나트륨을 포함하는 반응 용액 1 ml을 부피 24 ml인 반응용기에 넣어 상부의 메탄 농도를 40%로 설정한 후, 30℃에서 230 rpm으로 12시간 동안 메탄올 생성반응을 수행하였다. 반응이 종료된 후, 상기 실시예 6-1에 따른 방법으로 생성된 메탄올의 양을 측정하였다.

그 결과, 도 3e에서 나타내는 바와 같이, 0.3 내지 5 mM EDTA의 조건에서 메탄올 합성 능력이 우수함을 확인하였고, 특히 0.5 mM EDTA가 존재할 때 0.809 g/L의 메탄올을 생산하여, 다른 EDTA 농도에 비하여 메탄올 합성 능력이 최대가 됨을 확인하였다.

실시예 7: DH-1 균주의 최대 메탄올 합성 능력 확인

상기 실시예 1 및 실시예 2에서 분리, 동정한 메틸로모나스 속 DH-1 균주의 메탄올 합성능력을 분석하기 위해, 상기 실시예 6을 통해 확립한 최적의 생육 조건에서 DH-1 균주를 반응시켰다.

구체적으로, 전체 반응 용액 대비, 40 mM 포름산나트륨, 0.5 mM EDTA, 및 20 mM 인산나트륨(pH 7.0)을 포함하는 반응용매 1 ml에 2.4 g 건조균체량/L의 DH-1 균주, 0.5 mM EDTA, 및 40 mM 포름산나트륨을 부피 24 ml인 반응용기에 넣어 상부의 메탄 농도를 40%로 설정한 후, 30℃에서 230 rpm으로 0 내지 24시간 동안 메탄올 생성반응을 수행하였다. 반응이 종료된 후, 상기 실시예 6-1에 따른 방법으로 생성된 메탄올의 양을 측정하였다.

그 결과, 도 4에서 나타내는 바와 같이, 아무것도 첨가하지 않거나, 포름산나트륨만 첨가하는 경우에 비하여, 적절한 농도의 포름산나트륨 및 EDTA가 포함된 상기 조건에서 배양할 경우, 반응 4시간 이내에 메탄올 생산 능력이 최대가 됨을 확인하였고, DH-1 균주의 메탄올 합성 능력은 최대 12시간까지 유지됨을 확인하였다.

실시예 8: 메탄산화세균간의 메탄올 합성 능력 비교

상기 실시예 1 및 실시예 2에서 분리, 동정한 메틸로모나스 속 DH-1 균주의 메탄올 합성 능력을 분석하기 위해, 다른 메탄산화세균과 메탄올 합성 능력을 비교 분석하였다.

구체적으로, 상기 실시예 6을 통해 확립한 최적의 생육 조건으로 DH-1 균주, 메틸로시너스 트리코스포리움 속 OB3b 균주(Methylosinus trichosporium OB3b), 메틸로셀라 실베스트리스 속 BL2 균주(Methylocella silvestirs BL2)를 각각 4시간 동안 반응시켰다.

그 결과, 도 5에서 볼 수 있듯이, DH-1 균주는 다른 메탄산화세균인 OB3b 균주와 BL2 균주 대비 각각 130%, 230% 높은 메탄올 생산 능력을 보임을 확인할 수 있었다. 상기 결과를 통해, 본 발명의 메틸로모나스 속 DH-1 균주는 메탄으로부터 메탄올을 빠른 반응 시간 내에 고수율로 생산할 수 있음을 알 수 있었다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

한국생명공학연구원

KCTC18400P

20150827

<110> University Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> Novel Methylomonas. species strain and use thereof <130> KPA150889-KR-P1 <150> KR 10-2015-0123067 <151> 2015-08-31 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 27F primer <400> 1 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1492R primer <400> 2 ggttaccttg ttacgactt 19 <210> 3 <211> 1464 <212> DNA <213> Methylomonas sp. DH-1 <400> 3 gctcagattg aacgctggcg gtatgcttaa cacatgcaag tcgaacgctg ataaggtgct 60 tgcacctttg atgagtggcg gacgggtgag taatgcatag gaatctgcct attagtgggg 120 gacaacgtgg ggaaactcac gctaataccg catacgatct acggatgaaa gcaggggacc 180 ttcgggcctt gcgctaatag atgagcctat gtcggattag ctagttggtg gggtaaaggc 240 ctaccaaggc gacgatccgt agctggtctg agaggatgat cagccacact gggactgaga 300 cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tggacaatgg gcgaaagcct 360 gatccagcaa taccgcgtgt gtgaagaagg cctgagggtt gtaaagcact ttcaatggga 420 aggaacacct atcggttaat acccggtaga ctgacattac ccatacaaga agcaccggct 480 aactccgtgc cagcagccgc ggtaatacgg agggtgcaag cgttaatcgg aattactggg 540 cgtaaagcgt gcgtaggcgg ttgtttaagt cagatgtgaa agccctgggc ttaacctggg 600 aactgcattt gatactgggc aactagagtt gagtagaggg gagtggaatt tcaggtgtag 660 cggtgaaatg cgtagagatc tgaaggaaca ccagtggcga aggcggctcc ctggactcaa 720 actgacgctg aggtacgaaa gcgtgggtag caaacaggat tagataccct ggtagtccac 780 gccgtaaacg atgtcaacta actgttgggt tctttaagaa cttagtagtg gagctaacgt 840 attaagttga ccgcctgggg agtacggccg caaggctaaa actcaaatga attgacgggg 900 gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgatgca acgcgaagaa ccttacctac 960 ccttgacatc ctcggaactt gtcagagatg acttggtgcc ttcgggaacc gagagacagg 1020 tgctgcatgg ctgtcgtcag ctcgtgttgt gaaatgttgg gttaagtccc gtaacgagcg 1080 caacccttat ccttagttgc cagcgagtaa tgtcgggaac tctagggaga ctgccggtga 1140 taaaccggag gaaggtgggg acgacgtcaa gtcatcatgg cccttatggg tagggctaca 1200 cacgtgctac aatggccggt acagagggca gcgaaaccgt gaggtcaagc aaatcccaca 1260 aagccggtcc cagtccggat tgcagtctgc aactcgactg catgaagtcg gaatcgctag 1320 taatcgcgga tcagaatgcc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc 1380 acaccatggg agtgggttgc aaaagaagta ggtagtttaa ccttcgggag ggcgcttacc 1440 actttgtgat tcatgactgg ggtg 1464 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A189F primer <400> 4 ggngactggg acttctgg 18 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mb661R primer <400> 5 ccggmgcaac gtcyttacc 19 <210> 6 <211> 471 <212> DNA <213> Methylococcus sp. DH-1 <400> 6 accgactgga aagatagacg tctgtgggta accgtagctc ctatcgtttc tattactttc 60 cctgcggctg ttcaagcttg cttgtggtgg agataccgtt tgccaatcgg cgcaaccatt 120 tctgttgttg ctctgatgat tggtgagtgg atcaaccgtt acatgaactt ctggggttgg 180 acttacttcc cagtaaacat ttgcttccca tctaaccttc tgccaggcgc tatcgttctt 240 gatgtgatcc tgatgttggg taacagcatg accttgactg ctgttttggg tggtttggct 300 tacggtttgt tgttctaccc aggcaactgg ccggtaattg ctcctcttca cgttcctgta 360 gagtacaacg gcatgatgat gaccctggct gacttgcaag gttaccacta tgttcgtacc 420 ggtacacctg agtacatccg tatggttgag aaaggtacat taagaacttt c 471

Claims

기탁번호 KCTC18400P로 기탁된 메틸로모나스 속(Methylomonas sp.) DH-1 균주.
제1항에 있어서, 상기 균주는 서열번호 3으로 표시되는 16S rDNA 유전자를 갖는 것을 특징으로 하는, 균주.
제1항에 있어서, 상기 균주는 서열번호 6으로 표시되는 미립자 메탄모노옥시게나제 알파 소단위체(particulate methane monooxygenase alpha subunit, pmoA ) 유전자를 갖는 것을 특징으로 하는, 균주.
제1항에 있어서, 상기 균주는 하수 슬러지로부터 분리된 것인, 균주.
제1항에 있어서, 상기 균주는 메탄으로부터 메탄올을 합성하는 것인, 균주.
제1항의 메틸로모나스 속 DH-1 균주 또는 상기 균주의 배양산물을 포함하는, 메탄올 합성용 조성물.
제6항에 있어서, 상기 배양산물은 메틸로모나스 속 DH-1 균주의 배양물, 배양상등액, 파쇄물 및 이들의 분획물로 구성된 군으로부터 선택되는 조성물.
제1항의 메틸로모나스 속 DH-1 균주 또는 제6항의 조성물을 포함하는 메탄올 합성용 키트.
제1항의 균주 또는 이의 배양산물을 메탄을 포함하는 반응용기에서 반응하는 단계를 포함하는, 메탄올의 생산방법.
제9항에 있어서, 상기 반응용기 내 공기는 메탄을 30 내지 70%(v/v) 포함하는 것인, 메탄올의 생산방법.
제9항에 있어서, 상기 반응용기 내 pH는 6.0 내지 8.0인 것인, 메탄올의 생산방법.
제9항에 있어서, 상기 균주는 0.6 내지 2.4g 건조균체량/L로 포함되는 것인, 메탄올의 생산방법.
제9항에 있어서, 상기 반응용기는 20 내지 200 mM의 포름산나트륨을 추가로 포함하는 것인, 메탄올의 생산방법.
제9항에 있어서, 상기 반응용기는 0.3 내지 5 mM의 EDTA를 추가로 포함하는 것인, 메탄올의 생산방법.