CN1580269A - 生物催化甲烷制备甲醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生物催化甲烷制备甲醇的方法。该方法采用甲烷氧化细菌细胞作为催化剂，在膜反应器中充入含有甲烷、二氧化碳和氧气的混合气体启动反应，32－40℃、0－1.2MPa反应后得到甲醇的水溶液。它解决了使用化学抑制剂造成的体系中辅酶NADH的消耗而导致的细胞活性降低，间歇式再生或添加其它外源电子给体所造成反应无法连续进行的问题，实现了辅酶NADH在反应体系中的原位再生。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物催化甲烷制备甲醇的方法，更具体地讲，本发明涉及一种由甲烷氧化细菌生物催化甲烷制甲醇的方法。
技术背景
甲烷选择氧化生成甲醇或其它物质，是引起研究者们极大兴趣的课题之一。甲烷可以用作有效的燃料和化工原料，并且储量丰富。若能有效利用，不仅可以减缓当今的能源危机，而且可减少环境污染，与当今的环保主题相符。到目前为止，还没有一种化学催化剂可一步直接氧化甲烷生成甲醇，这些催化反应不仅需要多步反应，而且要900℃高温，能量不合算，反应的选择性和转化率都很低。有的反应(Periana，R.A，Taube，D.J.et al.Science 1993，259：53)虽可在180℃下得到约43％收率，但它的汞催化体系对环境所造成的污染不容忽视。而生物催化具有反应条件温和、选择性强等特点，因而近年来许多公司和学术研究机构(Heme Proteins；Eichhorn，G.L.，Eds.；Elsevier：New York，1988，7Springer，B.A.；Sligar，S.G.；Olson，J.S.et al.Chem.Rew.1994，94：699 Iron-Sulfur Proteins；Spiro，T.G.，Ed.；Wiley and Sons：NewYork，1982，4)致力于生物催化甲烷制甲醇过程的研究。来源于甲烷氧化细菌(Methanotrophic bacteria)的甲烷单加氧酶(Methane monooxygenase，MMO)就是其中之一的生物催化剂，可在常温、常压下，将甲烷一步氧化为甲醇，反应如下：
但生物催化反应也为甲烷氧化制甲醇设置了一个难题：甲烷作为甲烷利用细菌的能源和碳源，被氧化为甲醇后，在细胞中会被继续氧化，最后生成CO2和H2O。若想累积甲醇，必须抑制它的继续氧化。目前，在这方面已取得初步进展。利用金属螯合剂(EDTA，邻二氮杂菲，双吡啶等)可部分抑制甲烷氧化细菌M.trichosporium11131的甲醇继续氧化(P.K.Mehta，S.Mishra，T.K Ghose.，Biotech，Appl Biochem.，1989，11：328)。但是阻断剂会不可避免地破坏细胞的生理结构降低了其活性和稳定性，并且这种损伤是不可恢复的。
发明内容
本发明的目的在于解决上述问题而提出一种生物催化甲烷制备甲醇的方法。
本发明的目的可由如下措施实现：
本发明以二氧化碳通过末端产物抑制甲烷氧化细菌细胞中甲醇深度氧化而造成甲醇的积累，同时部分甲醇继续深度氧化产生还原当量以供反应连续进行而不影响甲烷氧化细菌的生理活性，并且明显提高了操作稳定性的方法。
本发明首先对甲基单孢菌Methylomonas sp.GYJ3进行培养，然后将收获的细胞用含有磷酸盐的缓冲溶液悬浮，在膜反应器中充入含有甲烷、二氧化碳和氧气的混合气体启动反应，32-40℃、0-1.2MPa反应后得到含有产物甲醇的水溶液。
下式是由甲烷氧化细菌中甲烷单加氧酶催化完成的甲烷羟基化反应。
(注：NADH2，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；NAD+，氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；PQQ，氧化型吡咯并喹啉醌；PQQH2，还原型吡咯并喹啉醌；)
但是反应不会停留在甲醇这一步，而是在甲醇脱氢酶、甲醛脱氢酶和甲酸脱氢酶的作用下继续深度氧化生成二氧化碳。要想得到甲醇，必须抑制其深度氧化。利用金属螯合剂(EDTA，邻二氮杂菲，双吡啶等)可部分抑制甲烷氧化细菌M.trichosporium11131甲醇脱氢酶活性(P.K.Mehta，S.Mishra，T.K Ghose.，Biotech，Appl Biochem.，1989，11：328)。但是阻断剂会不可避免地破坏细胞的生理结构降低了其活性和稳定性，并且这种损伤是不可恢复的。由于还原型辅酶NADH的不断消耗和抑制剂的毒副作用导致细胞很快失活。
本发明将甲烷与二氧化碳按一定比例混合，实现了甲烷部分氧化成甲醇同时部分甲醇深度氧化产生辅酶NADH，解决了甲烷氧化细菌催化甲烷制备甲醇的需要添加外源性电子给体的关键性问题。
一种生物催化甲烷制备甲醇的方法，其特征在于采用甲烷氧化细菌细胞甲基单孢菌Methylomonas sp.GYJ3细胞作为催化剂，在膜反应器中充入含有甲烷、二氧化碳和氧气的混合气体启动反应，在反应介质的存在下，32-40℃、0-1.2MPa反应后得到甲醇的水溶液。
本发明的甲基单孢菌Methylomonas sp.GYJ3细胞的浓度为5-40毫克/毫升。
本发明采用的二氧化碳、甲烷、氧气的体积比为1∶0.5∶0.3-1∶1.5∶2.0。
本发明采用的反应介质为含有0-200毫摩尔/升的磷酸氢二钠，0-200毫摩尔/升的磷酸二氢钠，2-8毫摩尔/升的氯化镁的磷酸盐缓冲溶液，pH＝6.5-7.5。
本发明有如下特点：
i.采用生物催化的方法在温和的条件下以甲烷为底物、二氧化碳为末
端产物抑制剂反应得到甲醇；
ii.采用一定比例的二氧化碳甲烷氧气混合气体同时反应，实现了辅酶
NADH的原位再生，使反应得以连续进行，解决了甲烷间歇式再生导
致反应无法连续进行的问题。
iii.采用甲烷作为外源性电子给体，与甲酸钠等相比，反应成本更低廉，
而且不用间断反应，更符合将来工业化的要求。
iv.采用膜反应器作为反应容器，利用一定压力，直接得到含有甲醇的
水溶液。
具体实施方式
现进一步通过最佳实施例来阐述发明的实现方式。
实施例1：
培养甲基单孢菌Methylomonas sp.GYJ3，收获后离心，将其添加到20毫升含有下列成分的反应液的100mL锥形瓶中，甲基单孢菌Methylomonas sp.GYJ3的细胞在该反应液中的浓度为(5-40)毫克/毫升：
浓度为0-200毫摩尔/升的磷酸氢二钠，
浓度为0-200毫摩尔/升的磷酸二氢钠，
浓度为2-8毫摩尔/升的氯化镁，
pH＝6.5-7.5。
其中一个瓶子密封后抽出60mL空气，加入20mL甲烷和20mL氧气，用氮气平衡剩余的气相，作为对照；一个瓶子密封后抽出空气60mL，加入18mL甲烷、24mL二氧化碳和18mL氧气；一个瓶子加入浓度为2毫摩尔/升的乙二胺四乙酸(EDTA)，密封后抽出60mL空气，加入20mL甲烷和20mL氧气，用氮气平衡剩余的气相；32℃，150r/min摇床反应；甲醇的检测和定量分析在气相色谱仪上进行。每隔2h用注射器抽取0.5mL反应液，8000r/min，4min，取上清。色谱条件为：SE-54弹性石英毛细管柱(25m×0.25mm i.d.)，载气N2，检测器FID，分流进样。进样器、检测器温度分别控制在180℃、200℃，柱温120℃，进样体积1μL，外标法定量。结果如表1所示：
比较发现，反应体系中不添加任何抑制剂时没有甲醇积累。反应体系中含有一定量二氧化碳时有甲醇积累，并且甲醇积累随时间增加而增加；反应体系中添加EDTA时有甲醇积累，并且甲醇积累随时间增加而降低。
实施例2：
其它同实施例1，32℃，0.6Mpa，将甲烷、氧气、二氧化碳按体积比3∶3∶4混合充入膜反应器反应，每次批式反应5-7h，反应完毕后回收细胞继续进行下一批反应。每批从膜反应器中取0.5mL溶液，用气相色谱检测产物甲醇，然后比较其产量变化趋势。结果见表2：
比较发现反应体系中含有一定量二氧化碳时有甲醇积累，并且甲醇积累量维持在一个高而稳定的水平；用乙二胺四乙酸(EDTA)作为阻断剂可以造成甲醇积累，但是细胞的操作稳定性迅速下降；造成这一结果的原因是细胞内还原当量还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH2)的迅速消耗，并且这一消耗在此反应体系中是不可恢复的。
Claims (4)
1.一种生物催化甲烷制备甲醇的方法，其特征在于采用甲烷氧化细菌细胞甲基单孢菌Methylomonas sp.GYJ3细胞作为催化剂，在膜反应器中充入含有甲烷、二氧化碳和氧气的混合气体启动反应，在反应介质的存在下，32-40℃、0-1.2MPa反应后得到甲醇的水溶液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于甲基单孢菌Methylomonas sp.GYJ3细胞的浓度为5-40毫克/毫升。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于二氧化碳、甲烷、氧气的体积比为1∶0.5∶0.3-1∶1.5∶2.0。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于反应介质为含有0-200毫摩尔/升的磷酸氢二钠，0-200毫摩尔/升的磷酸二氢钠，2-8毫摩尔/升的氯化镁的磷酸盐缓冲溶液，pH＝6.5-7.5。
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Cited By (3)
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|---|---|---|---|---|
| CN1329506C (zh) * | 2005-09-06 | 2007-08-01 | 清华大学 | 一种具有颗粒状甲烷单加氧酶活性的重组菌及其应用 |
| KR20170026084A (ko) * | 2015-08-31 | 2017-03-08 | 경희대학교 산학협력단 | 신규한 메틸로모나스 속(Methylomonas sp.) 균주 및 이의 용도 |
| CN114686530A (zh) * | 2022-03-09 | 2022-07-01 | 国家纳米科学中心 | 一种利用甲烷制备甲醇的方法和复合催化剂 |
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| KR20170026084A (ko) * | 2015-08-31 | 2017-03-08 | 경희대학교 산학협력단 | 신규한 메틸로모나스 속(Methylomonas sp.) 균주 및 이의 용도 |
| KR101714967B1 (ko) | 2015-08-31 | 2017-03-09 | 경희대학교 산학협력단 | 신규한 메틸로모나스 속(Methylomonas sp.) 균주 및 이의 용도 |
| CN114686530A (zh) * | 2022-03-09 | 2022-07-01 | 国家纳米科学中心 | 一种利用甲烷制备甲醇的方法和复合催化剂 |
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