JP2021069320A

JP2021069320A - ユーグレナの培養方法、油脂の製造方法及び下水処理プラント

Info

Publication number: JP2021069320A
Application number: JP2019197720A
Authority: JP
Inventors: 忠遠山; Tadashi Toyama; 森　一博; Kazuhiro Mori; 一博森; 田中　靖浩; Yasuhiro Tanaka; 靖浩田中; 正章森川; Masaaki Morikawa; 鈴木　秀幸; Hideyuki Suzuki; 秀幸鈴木; 康嗣山田; Yasutsugu Yamada; 鈴木　健吾; Kengo Suzuki; 健吾鈴木; 芳正山本; Yoshimasa Yamamoto
Original assignee: Hokkaido University NUC; Euglena Co Ltd; University of Yamanashi NUC
Current assignee: Hokkaido University NUC; Euglena Co Ltd; University of Yamanashi NUC
Priority date: 2019-10-30
Filing date: 2019-10-30
Publication date: 2021-05-06

Abstract

【課題】ユーグレナに対する増殖促進細菌を利用したユーグレナの培養方法及び油脂の製造方法を提供する。【解決手段】ユーグレナを増殖促進細菌と共に培養する第１培養工程と、前記第１培養工程で培養した前記ユーグレナを分離する分離工程と、前記分離工程で分離した前記ユーグレナを培養する第２培養工程と、を行うことを特徴とするユーグレナの培養方法及び油脂の製造方法である。このとき、第１培養工程及び第２培養工程が、下水処理水を含有する培養液中で行われると好適である。【選択図】図８Ａ

Description

本発明は、ユーグレナの培養方法、油脂の製造方法及び下水処理プラントに関し、特に、増殖促進細菌を利用したユーグレナの培養方法、油脂の製造方法及び下水処理プラントに関する。

微細藻類は、バイオ燃料の代替、再生可能、および持続可能な原料として広く認識されている。微細藻類培養の培地として下水処理水を使用することは、間違いなく微細藻類バイオマス生産の経済性と持続可能性を改善すると言える。下水処理水を使用した微細藻類バイオマスの生産は、施肥と灌漑のコストを削減する。微細藻類の生産と排水処理を組み合わせると、排水処理プラントがバイオリファイナリープラントに変換される。

単細胞の鞭毛状微細藻類であるユーグレナ・グラシリス（Ｅ. ｇｒａｃｉｌｉｓ）は、機能性食品およびバイオ燃料の微細藻類原料として最も有望な種の１つと見なされている。培養条件に応じて、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓは、ワックスエステル、パラミロン（β−１，３−グルカン）、β−カロテン、ビタミンＣおよびビタミンＥなどの様々な貴重な産物を合成および蓄積できる。これらの産物には多数の商業的応用がある。主にＣ１４：０飽和脂肪酸、ミリスチン酸、Ｃ１４：０飽和脂肪アルコール、ミリスチルアルコールで構成されるワックスエステルは、高価値のバイオ燃料と考えられている。Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓのこれらのワックスエステルは、バイオディーゼルの原料に適している。

Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓバイオマスの生産性の向上は、高効率のバイオ燃料生産システムを構築し、バイオ燃料の価格を下げるために重要である（非特許文献１）。Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓによるバイオマスと油脂の生産を高めるために、遺伝子組換え、選択的育種、増殖条件の最適化、および栄養素および植物ホルモンを含む添加物の補充が検討されてきた。しかし、高度に効率的なＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓのバイオ燃料生産システムを実現するには、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓの増殖をさらに強化するための相乗技術の開発が必要である。

自然の水生環境と微細藻類培養の両方で、特定の細菌は、例えば、栄養素、ビタミン、植物ホルモン、キレート剤、または揮発性有機化合物を供給することによって、好ましい微細環境を作り出すことで微細藻類の成長を促進することがわかっている（例えば、非特許文献２）。これらの細菌は、微細藻類の増殖促進細菌（以下、「ＭＧＰＢ」ともいう）として分類されている。ＭＧＰＢはさまざまな微細藻類について報告されている。たとえば、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｖｕｌｇａｒｉｓに対するＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓｂｒａｕｎｉｉに対するＲｈｉｚｏｂｉｕｍｓｐ．、Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓｓｔｒｉａｔａに対するＰｅｌａｇｉｂａｃａｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓおよびＳｔａｐｐｉａｓｐ．、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓｓｐ．、およびＢ．ｂｒａｕｎｉｉに対するＲｈｉｚｏｂｉｕｍｓｐ．が報告されている。

Suzuki K. Large-scale cultivation of Euglena. In: Schwartzhach SD, Shigeoka S, editors. Euglena: Biochemistry, Cell and Molecular Biology. Springer International Publishing; 2017 p. 285-293. Amin SA, Parker MS, Armbrust EV. Interactions between diatoms and bacteria. Microbiol Mol Biol Rev. 2012; 76:667-84.

微細藻類との共培養における接種剤としてのＭＧＰＢの使用は、微細藻類バイオマス生産を効果的に強化するための代替的で有望な戦略を提供するかもしれない。しかし、本発明者の知る限り、ユーグレナの増殖を促進するＭＧＰＢは特定されていない。さらに、固有細菌が存在する非滅菌培養条件下での下水処理水においてＭＧＰＢが微細藻類バイオマスの生産を促進することを示した事例はない。したがって、下水処理水中のユーグレナによるバイオマス／油脂生産を増強することができる新規のＭＧＰＢを得ることが求められていた。

したがって、（ｉ）ユーグレナに対して有効なＭＧＰＢを分離および特性評価すること、および（ｉｉ）分離されたＭＧＰＢが下水処理水培養システムでユーグレナによるバイオマスおよび油脂の生産を実際に高めることを実証することが課題となっていた。

本発明は、上記の課題に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、ユーグレナに対する増殖促進細菌を利用したユーグレナの培養方法、油脂の製造方法及び下水処理プラントを提供することにある。
また、本発明の他の目的は、下水処理水を用いた場合にもユーグレナに対する増殖促進作用を発揮することが可能な増殖促進細菌を利用したユーグレナの培養方法、油脂の製造方法及び下水処理プラントを提供することにある。

本発明者らは、鋭意研究した結果、Ｅｍｔｉｃｉｃｉａｓｐ．ＥＧ３株を見出し、ＥＧ３株が下水を用いた培養において著しくユーグレナの増殖を促進すること及び油脂の生産速度を向上させることを見出した。

したがって、前記課題は、本発明のユーグレナの培養方法によれば、ユーグレナを増殖促進細菌と共に培養する第１培養工程と、前記第１培養工程で培養した前記ユーグレナを分離する分離工程と、前記分離工程で分離した前記ユーグレナを培養する第２培養工程と、を行うこと、により解決される。

このとき、前記第１培養工程及び前記第２培養工程が、下水処理水を含有する培養液中で行われるとよい。
このとき、前記増殖促進細菌は、Ｅｍｔｉｃｉｃｉａｓｐ．ＥＧ３株（受領番号：ＮＩＴＥＡＰ−０３０５５）であるとよい。

また、前記課題は、本発明の油脂の製造方法によれば、ユーグレナを増殖促進細菌と共に培養する第１培養工程と、前記第１培養工程で培養した前記ユーグレナを分離する分離工程と、前記分離工程で分離した前記ユーグレナを培養する第２培養工程と、前記第２培養工程で得られる培養物から油脂を回収する油脂回収工程と、を行うこと、により解決される。

また、前記課題は、本発明の下水処理プラントによれば、ユーグレナを増殖促進細菌と共に培養する第１培養タンクと、前記第１培養タンクで培養した前記ユーグレナを培養する第２培養タンクと、を備え、前記第１培養タンク及び前記第２培養タンクには、下水処理水を含有する培養液が充填されること、により解決される。

本発明によれば、ユーグレナに対する増殖促進細菌を利用したユーグレナの培養方法、油脂の製造方法及び下水処理プラントを提供することができる。
また、本発明によれば、下水処理水を用いた場合にもユーグレナに対する増殖促進作用を発揮することが可能な増殖促進細菌を利用したユーグレナの培養方法、油脂の製造方法及び下水処理プラントを提供することができる。

本発明のユーグレナの培養方法、油脂の製造方法及び下水処理プラントの要点は、２段階培養である。大規模な培養タンクに増殖促進細菌を直接添加して、ユーグレナを培養することは、（１）増殖促進細菌を大量に生産しなければならず、そのコストが高くなってしまい、（２）増殖促進細菌が培養系の外部に流出する可能性もある。

これに対して、本発明の特徴である２段階培養では、まず１段階目の第１培養工程を、例えば、比較的小型で密閉度の高い培養タンク（第１培養タンク）で共培養することで行う。そして、活性の高まったユーグレナを分離して、２段階目の第２培養工程を、例えば、大型の開放系の培養タンク（第２培養タンク）に移して大量生産を行うことができる。

本実施形態に係るユーグレナの培養方法及び油脂の製造方法の手順を示すフロー図である。２ステップの強化されたＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓのバイオマス／油脂生産システムの概略設計。土着の生細菌あり（非滅菌排水、○）、土着の生細菌なし（オートクレーブ熱殺菌された排水、●）のＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓ−下水処理水培養液中のクロロフィルａ＋ｂ含有量の変化。値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）。増殖促進細菌としてＥｍｔｉｃｉｃｉａｓｐ．ＥＧ３株を用いた場合の２ステップのＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓ培養システムの２回目の培養におけるＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓの乾燥重量。増殖促進細菌としてＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍｓｐ．ＥＧ８株を用いた場合の２ステップのＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓ培養システムの２回目の培養におけるＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓの乾燥重量。増殖促進細菌としてＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓｓｐ．ＥＧ９株を用いた場合の２ステップのＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓ培養システムの２回目の培養におけるＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓの乾燥重量。様々な初期細胞密度（０（コントロール）、２×１０^６、８×１０^６、および４×１０^７ＣＦＵ／ｍＬ）のＥＧ３株にて、熱滅菌した下水処理水で７日間共培養したＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓの増殖に対するＥＧ３株の影響。ＥＧ３株と共培養したＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓのクロロフィルａ＋ｂ含有量の変化（初期細胞密度０（対照、▲）、２×１０^６ＣＦＵ／ｍＬ（◇）、８×１０^６ＣＦＵ／ｍＬ（□）、４×１０^７ＣＦＵ／ｍＬ（○））。初期細胞密度０（コントロール）、２×１０^６、８×１０^６、及び４×１０^７ＣＦＵ／ｍＬのＥＧ３株との７日間の共培養におけるＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓのバイオマス生産速度。値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）。＊コントロールとの有意差（ｐ＜０．０５）。加熱滅菌および非滅菌の下水処理水で７日間、初期ＥＧ３がＯＤ_６００＝０．１で共培養されたＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓの増殖に対するＥＧ３株の影響。加熱滅菌された排水中でＥＧ３株なし（■）およびＥＧ３株（□）で培養されたＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓのクロロフィルａ＋ｂ含有量の変化。非滅菌排水でＥＧ３株なし（●）およびＥＧ３株あり（○）で培養されたＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓのクロロフィルａ＋ｂ含有量の変化。７日間の加熱滅菌または非滅菌排水でＥＧ３株を使用または非使用で培養したＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓのバイオマス生産速度。値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）。＊コントロールとの有意差（ｐ＜０．０５）。２ステップのＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓ培養システムの２回目の培養におけるＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓのクロロフィルａ＋ｂ含有量とバイオマス（乾燥重量）濃度の経時変化。７日間の非滅菌排水におけるＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓのコントロール培養のクロロフィルａ＋ｂ含有量の変化。ＥＧ３株との共培養なし（●）およびＥＧ３株との共培養あり（○）。７日間の非滅菌排水におけるＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓのコントロール培養のバイオマス濃度の変化。ＥＧ３株との共培養なし（●）およびＥＧ３株との共培養あり（○）。値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）。２ステップのＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓバイオマス／油脂生産システムの最初の培養でのＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓとＥＧ３株の共培養の効果。第１ステップでＥＧ３株と共培養あり及び共培養なし（コントロール）で共培養した後のＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓの２ステップ培養でのＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓの２回目の培養におけるバイオマス生産速度。値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）。＊コントロールとの有意差（ｐ＜０．０５）。ＥＧ３株およびコントロールの共培養後の２ステップＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓ培養システムの２回目の培養におけるＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓの油脂含有率。値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）。＊コントロールとの有意差（ｐ＜０．０５）。ＥＧ３株およびコントロールの共培養後の２ステップＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓ培養システムの２回目の培養におけるＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓの油脂生産速度。値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）。＊コントロールとの有意差（ｐ＜０．０５）。Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ培養と排水処理のカップリング。増殖促進細菌ＥＧ３株を使用した２ステップＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓ培養システムによるバイオマスおよび油脂生産の強化。

以下、本発明の一実施形態（以下、本実施形態）について、図１乃至図９を参照しながら説明する。本実施形態は、ユーグレナの培養方法及び油脂の製造方法に関するものである。

（略語）
本明細書における略語は、以下の通りである。
・ＭＧＰＢ：微細藻類の増殖促進細菌（microalgae growth-promoting bacteria）
・ＴＯＣ：総有機炭素（total organic carbon）
・ＮＨ_４−Ｎ：アンモニウム態窒素
・ＮＯ_２−Ｎ：亜硝酸態窒素
・ＮＯ_３−Ｎ：硝酸態窒素
・ＰＯ_４−Ｐ：リン酸態リン
・ＣＦＵ：コロニー形成単位（colony forming units）
・ＯＤ：光学密度（optical density）
・ｒＲＮＡ：リボソームＲＮＡ（ribosomal ribonucleic acid）
・ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction）
・ＮＣＢＩ：国立生物工学情報センター（national center for biotechnology information）
・ＢＬＡＳＴ：基本的な局所配列検索ツール（basic local alignment search tool）
・ＤＤＢＪ：日本のＤＮＡデータバンク（DNA data bank of Japan）
・ＥＭＢＬ：欧州分子生物学研究所（European molecular biology laboratory）
・ＳＤ：標準偏差（standard deviation）

＜ユーグレナ＞
本実施形態において、「ユーグレナ」とは、分類学上、ユーグレナ属（Ｅｕｇｌｅｎａ）に分類される微生物、その変種、その変異種及びユーグレナ科（Ｅｕｇｌｅｎａｃｅａｅ）の近縁種を含む。ここで、ユーグレナ属（Ｅｕｇｌｅｎａ）とは、真核生物のうち、エクスカバータ、ユーグレノゾア門、ユーグレナ藻綱、ユーグレナ目、ユーグレナ科に属する生物の一群である。

ユーグレナ属に含まれる種として、具体的には、Ｅｕｇｌｅｎａｃｈａｄｅｆａｕｄｉｉ、Ｅｕｇｌｅｎａｄｅｓｅｓ、Ｅｕｇｌｅｎａｇｒａｃｉｌｉｓ、Ｅｕｇｌｅｎａｇｒａｎｕｌａｔａ、Ｅｕｇｌｅｎａｍｕｔａｂｉｌｉｓ、Ｅｕｇｌｅｎａｐｒｏｘｉｍａ、Ｅｕｇｌｅｎａｓｐｉｒｏｇｙｒａ、Ｅｕｇｌｅｎａｖｉｒｉｄｉｓなどが挙げられる。

ユーグレナとして、ユーグレナ・グラシリス（Ｅ. ｇｒａｃｉｌｉｓ），特に、ユーグレナ・グラシリス（Ｅ. ｇｒａｃｉｌｉｓ）ＮＩＥＳ−４８株、ユーグレナ・グラシリス（Ｅ. ｇｒａｃｉｌｉｓ）Ｚ株を用いることができるが、そのほか、ユーグレナ・グラシリス（Ｅ. ｇｒａｃｉｌｉｓ）Ｚ株の変異株ＳＭ−ＺＫ株（葉緑体欠損株）や変種のＥ. ｇｒａｃｉｌｉｓｖａｒ. ｂａｃｉｌｌａｒｉｓ、これらの種の葉緑体の変異株等の遺伝子変異株、Ａｓｔａｓｉａｌｏｎｇａ等のその他のユーグレナ類であってもよい。

ユーグレナ類は、池や沼などの淡水及び汽水、海水中に広く分布しており、これらから分離して使用しても良く、また、既に単離されている任意のユーグレナ類を使用してもよい。ユーグレナ類は、その全ての変異株を包含する。また、これらの変異株の中には、遺伝的方法、たとえば組換え、形質導入、形質転換等により得られたものも含有される。

＜増殖促進細菌（ＭＧＰＢ）＞
本実施形態において利用することができるユーグレナの増殖促進細菌（ＭＧＰＢ）は、ユーグレナの増殖を促進する細菌である。増殖促進細菌（ＭＧＰＢ）は、Ｅｍｔｉｃｉｃｉａ属に属する細菌、Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属に属する細菌（例えば、Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍｓｐ．ＥＧ８株、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属に属する細菌（例えば、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓｓｐ．ＥＧ９株）を含む群より選択される一種以上の細菌であると好ましいが、これらの属の細菌に限定されるものではない。

ユーグレナの増殖促進細菌（ＭＧＰＢ）として、Ｅｍｔｉｃｉｃｉａ属に属する細菌を用いることが好適であり、その中でも、Ｅｍｔｉｃｉｃｉａｓｐ．ＥＧ３株（受領機関名：独立行政法人製品評価技術基盤機構（特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ））、受領日：２０１９年１０月２８日、受領番号：ＮＩＴＥＡＰ−０３０５５）を用いることが特に好ましい。

本実施形態における増殖促進細菌（ＭＧＰＢ）は、野生の増殖促進細菌（ＭＧＰＢ）を用いることができるが、これに限定されるものではなく、ユーグレナを効率よく増殖するように改変された増殖促進細菌（ＭＧＰＢ）を用いてもよい。改変は公知の方法で行うことができ、例えば、遺伝子組換えにより改変することができる。

＜ユーグレナの培養方法及び油脂の製造方法＞
本実施形態のユーグレナの培養方法は、ユーグレナを増殖促進細菌と共に培養する第１培養工程（ステップＳ１）と、前記第１培養工程で培養した前記ユーグレナを分離する分離工程（ステップＳ２）と、前記分離工程で分離した前記ユーグレナを培養する第２培養工程と（ステップＳ３）、を行うことを特徴とするユーグレナの培養方法である（図１）。

また、本実施形態の油脂の製造方法は、ユーグレナを増殖促進細菌と共に培養する第１培養工程（ステップＳ１）と、前記第１培養工程で培養した前記ユーグレナを分離する分離工程（ステップＳ２）と、前記分離工程で分離した前記ユーグレナを培養する第２培養工程（ステップＳ３）と、前記第２培養工程で得られる培養物から油脂を回収する油脂回収工程（ステップＳ４）と、を行うことを特徴とする油脂の製造方法である（図１）。
以下、各工程について詳細に説明する。

（第１培養工程）
第１培養工程では、ユーグレナを増殖促進細菌（ＭＧＰＢ）と共に培養する（ステップＳ１）。
ここで、増殖促進細菌（ＭＧＰＢ）を含む培地を用いてユーグレナ細胞の培養を行うことを「共培養」という。

第１培養工程は、例えば、以下に示す培養条件で行うことができるが、以下の条件に限定されるものではない。

・ユーグレナの前培養
第１培養工程で用いるユーグレナを好気条件下で前培養する。ユーグレナの前培養の条件は、従来のユーグレナの培養法において知られたものを用いることができる。培養温度は、通常２０〜３４℃の範囲内とするのが効率的な生育のために好ましい。また、培地には空気をバブリングすることが好ましく、特にユーグレナはＣＯ_２を資化するため、１〜５％のＣＯ_２を含む空気を培地中にバブリングすることがより好ましい。好気的培養は光照射下（明条件下）で行うことが好ましく、明暗サイクル、特に概日リズムに準じた明暗サイクル条件下（例えば１２〜１６時間明暗サイクル）で行うことがより好ましい。明条件下における光強度は、３０〜２００μｍｏｌｍ^−２ｓ^−１の範囲とすることが好ましい。培地のｐＨは３〜１０の範囲とすることが好ましい。培養期間は３日間以上であり、特に５日間以上、１週間以上、さらに１０日間以上とすると好ましい。

前培養では、例えば、ＣＹＰ培地、Ｃ培地、Ｃｒａｍｅｒ−Ｍｙｅｒｓ培地（ＣＭ培地）、Ｈｕｔｎｅｒ培地、およびＫｏｒｅｎ−Ｈｕｔｎｅｒ培地、ＡＹ培地などの公知の培地の一部組成を変更した改変培地を用いることができる。

・培地の種類
第１培養工程におけるユーグレナと増殖促進細菌（ＭＧＰＢ）の共培養は、下水処理水を用いることが可能である。このとき、増殖促進細菌（ＭＧＰＢ）の初期細胞密度が２×１０^６〜４×１０^７ＣＦＵ／ｍＬ（ＯＤ_６００に換算すると０．０５〜０．２）、好ましくは、８×１０^６ＣＦＵ／ｍＬ以上（ＯＤ_６００に換算すると０．１以上）の初期細胞密度で培養液に接種するとよい。

・培地のｐＨ
培養液のｐＨは、ユーグレナの増殖に適した任意のｐＨ、例えば、ｐＨ５〜１０であればよく、ｐＨ６〜９であることが好ましく、ｐＨ６〜８であることがより好ましい。ｐＨ調整には、適当な無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、例えば、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム等を使用することができる。

・培養温度
培養温度は、増殖促進細菌（ＭＧＰＢ）の増殖及びユーグレナの増殖に適した温度、例えば、通常１５〜４０℃であり、２０〜３４℃であることが好ましく、特に２８〜３０℃であることが好適である。

・培養期間
培養期間は、増殖促進細菌（ＭＧＰＢ）によるユーグレナの増殖促進作用が十分に発揮されるようになる期間であれば特に限定されず、例えば、２〜１０日、好ましくは３〜８日、特に好ましくは５〜７日であればよい。

・培養方式及び培養装置
共培養は、太陽光を直接利用するオープンポンド方式、集光装置で集光した太陽光を光ファイバー等で送り、培養槽で照射させ光合成に利用する集光方式等により行ってもよい。
また、共培養は、例えば供給バッチ法を用いて行われ得るが、フラスコ培養や発酵槽を用いた培養、回分培養法、半回分培養法（流加培養法）、連続培養法（灌流培養法）等、いずれの液体培養法により行ってもよい。
共培養は、オープンポンド型、レースウェイ型、チューブ型等の公知の培養装置や、坂口フラスコ、三角フラスコ、試薬ビンなどの実験用の培養容器を用いて行うことができる。
共培養は、静置培養法、振盪培養法のいずれの方法によって行ってもよい。
各種培養の条件は、培養を通じて一定であってもよいが、培養期間に応じて各種培養条件を変化させることも可能である。

（分離工程）
分離工程（ステップＳ２）では、上記第１培養工程（ステップＳ１）で培養したユーグレナを分離する。具体的には、第１培養工程で得られたユーグレナの培養物を回収し、遠心分離等の公知の分離手段によりユーグレナ細胞を回収する。ユーグレナ細胞を蒸留水で洗浄し、増殖促進細菌（ＭＧＰＢ）の細胞を除去し、遠心分離によりユーグレナ細胞を回収する。

（第２培養工程）
第２培養工程（ステップＳ３）では、上記分離工程（ステップＳ２）で分離したユーグレナを培養する。第２ステップ培養は、ユーグレナの初期細胞密度が、例えば、５０ｍｇ〜１００ｍｇ乾燥重量／Ｌとなるように、培養液に接種して培養を行う。第２培養工程は、増殖促進細菌（ＭＧＰＢ）を接種しないことを除いては、上述の第１培養工程と同様の培養条件で行うことができるが、上述の条件に限定されるものではない。

第１培養工程は、例えば、比較的小型で密閉度の高い培養タンク（第１培養タンク）で共培養することで行うことが可能であるが、第１培養工程で活性の高まったユーグレナを分離して、第２培養工程を、例えば、第１培養工程における培養タンクよりも大型の開放系の培養タンク（第２培養タンク）に移して大量生産を行うことが好ましい。換言すると、第１培養工程で用いる第１培養タンクの容量は、第２培養工程で用いる第２培養タンクの容量よりも、小さいことが好ましい。このような構成によれば、容量の小さな第１培養タンクで増殖促進細菌（ＭＧＰＢ）によって効率よく、ユーグレナの増殖を促進しつつ、容量の大きな第２培養タンクで油脂の大量生産を行うことが可能となる。

（油脂回収工程）
油脂回収工程（ステップＳ４）では、上記第２培養工程（ステップＳ３）で得られる培養物（培養系）から油脂を回収する。
ここで、本工程における「培養物（培養系）」は、培地、ユーグレナ細胞を含む概念である。したがって、「培養物（培養系）から油脂を回収する」とは、ユーグレナ細胞を含む培地から油脂を回収すること、培養後のユーグレナ細胞から油脂を回収することを含む概念である。
回収される油脂は、ユーグレナの細胞中に含まれる油脂、具体的には、主にＣ１４：０飽和脂肪酸、ミリスチン酸、Ｃ１４：０飽和脂肪アルコール、ミリスチルアルコールで構成されるワックスエステルなどを含有する油脂である。

油脂回収工程には、適当な分離方法（例えば、遠心分離や、濾過、有機溶剤による抽出工程、高速液体クロマトグラフィーなどの組み合わせ）により油脂を分離して得る分離工程や、適切な分離カラムや再結晶によって油脂を精製する精製工程が含まれる。

＜下水処理プラント＞
本実施形態に係る下水処理プラントは、後述する図９に示されるように、ユーグレナを増殖促進細菌（ＭＧＰＢ）と共に培養する第１培養タンクと、第１培養タンクで培養したユーグレナを分離して培養する第２培養タンクと、を備え、第１培養タンク及び第２培養タンクには、下水処理水を含有する培養液が充填される。このとき、第１培養タンクを比較的小型で密閉度の高い培養タンクとし、第２培養タンクを第１培養タンクよりも大型の開放系の培養タンクとすることが好ましい。

以下、具体的実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

［１．試験方法］
（１．１Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ材料およびＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓの培養）
無菌のＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓ（ＮＩＥＳ−４８）は、筑波の国立環境研究所の微生物培養コレクションから入手した。Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓは、４００ｍｇ／Ｌの酵母エキスと６００ｍｇ／Ｌのポリペプトンを添加したＣ培地、つまりＣＹＰ培地で培養した。Ｃ培地は、１Ｌ当たり、１５０ｍｇＣａ（ＮＯ_３）_２・４Ｈ_２Ｏ、１００ｍｇＫＮＯ_３、５０ｍｇ β−Ｎａ_２グリセロホスフェート・５Ｈ_２Ｏ、４０ｍｇＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、５００ｍｇトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、０．１μｇビタミンＢ_１２、０．１μｇビオチン、１０μｇチアミンＨＣｌ、および３ｍＬＰＩＶ金属（１０００ｍｇ／ＬＮａ_２ＥＤＴＡ・Ｈ_２Ｏ、１９６ｍｇ／ＬＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ、３６ｍｇ／ＬＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ、１０．４ｍｇ／ＬＺｎＣｌ_２、４ｍｇ／ＬＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、２．５ｍｇ／ＬＮａ_２ＭｏＯ_４・Ｈ_２Ｏ）であった（表１）。ＮａＯＨを加えることによりｐＨを７．５に調整した。

無菌のＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓ培養物を増殖チャンバー（２８±１℃、蛍光灯、光合成光子束密度８０μｍｏｌｍ^−２ｓ^−１、１６時間の光周期）で１週間培養した。その後、毎週、新鮮なＣＹＰ培地にＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓ細胞を定期的に移すことにより、継代培養を開始した。Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓを遠心分離（３０００×ｇ、室温、５分）により回収し、滅菌Ｃ培地で洗浄し、一定量の滅菌Ｃ培地に再懸濁した。そのようなＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓ細胞懸濁液を各継代培養実験の接種材料として使用した。

（１．２下水処理水サンプル）
実験に使用した下水処理水を、日本の山梨県甲府市の下水処理場の最終沈殿池から収集した。処理水サンプルは、最初にガラスマイクロファイバーフィルター（ポアサイズ、１μｍ；ＧＦ／Ｂグレード、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＵＫＬｔｄ、バッキンガムシャー、イギリス）を通過し、次にメンブレンフィルター（ポアサイズ、０．８μｍ；混合セルロースエステル膜；ＭｅｒｃｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅＬｔｄ、Ｃｏｒｋ、アイルランド）は、微細な藻類を含む細菌よりも大きな浮遊固形物と有機物を下水処理水サンプルから除去した。したがって、下水処理水濾液には土着の細菌群集が含まれていた。以下の各実験では、新鮮な下水処理水サンプルを実験当日に収集して、使用した。

以下に示す表２は、下水処理水サンプルの初期の水質特性（全有機炭素［ＴＯＣ］、アンモニウム窒素［ＮＨ_４−Ｎ］、亜硝酸−Ｎ［ＮＯ_２−Ｎ］、硝酸−Ｎ［ＮＯ_３−Ｎ］、リン酸［ＰＯ_４−Ｐ］）および総細菌濃度を示している。ＴＯＣは、ＴＯＣ−ＬＣＳＨ（島津製作所、京都、日本）を使用して測定された。ＮＨ_４−Ｎには、インドフェノール法が使用された。ＮＯ_２−Ｎには、Ｎ−（１−ナフチル）エチレンジアミン法が使用された。ＮＯ_３−Ｎには、還元−Ｎ−（１−ナフチル）エチレンジアミン法とＵＶ吸着（２２０および２７５ｎｍ）法が使用された。ＰＯ_４−Ｐには、モリブデンブルー法が使用された。Ｒ２Ａ寒天プレート（０．５ｇ／Ｌペプトン、０．５ｇ／Ｌ酵母エキス、０．５ｇ／Ｌカザミノ酸、０．５ｇ／Ｌグルコース、０．５ｇ／Ｌ可溶性デンプン、０．３ｇ／ＬＫ_２ＨＰＯ₄、０．０５ｇ／ＬＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．３ｇ／Ｌピルビン酸ナトリウム；ｐＨ７．０；寒天１５ｇ／Ｌ）を使用して、排水中の総培養可能細菌を定量した。一部の実験では、加熱滅菌のために滅菌排水サンプルをオートクレーブ処理（１２１℃、２０分）して調整した。

（１．３下水処理水を用いたＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓの培養およびＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓのＭＧＰＢ候補の分離）
上記の方法で調製したＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓの細胞懸濁液（１０ｍＬ）を、２００ｍＬガラスフラスコ内の（滅菌されていない）下水処理水サンプル１００ｍＬに加えた。フラスコをグロースチャンバー（２８±１℃、８０μｍｏｌｐｈｏｔｏｎｓｍ^−２ｓ^−１の蛍光灯、１６時間光周期）で１０日間培養した後、この培養物約１０ｍＬを新しい下水処理水サンプル１００ｍＬが入った２００ｍＬフラスコに移し、さらに１０日間培養した。この培養物の移し替えと１０日間のバッチ培養増殖をもう一度繰り返した。３連続バッチ増殖期間の間、フラスコを１日３回、１分間振盪して、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓを分散および通気した。各フラスコのクロロフィル濃度を毎日測定した。Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓは、生きている土着細菌のない１００ｍＬのオートクレーブされた下水処理水サンプルでも培養された。この培養は、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓの増殖に対する下水処理水サンプル中の土着細菌の影響を評価するための対照実験として使用された。各培養の初期クロロフィルａ＋ｂ濃度は、約０．５μｇ／ｍＬに調整された。

３回目の１０日間のバッチ培養増殖期間の後、非滅菌の下水処理水サンプルで培養されたＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓ培養液２０ｍＬを５０ｍＬチューブに移し、最大速度で３分間ボルテックスし、１分間超音波処理（４０ｋＨｚ）し、再度ボルテックスすることでＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓと細菌細胞を分散させた。次に、サンプルをＧＦ／Ｂガラスマイクロファイバーフィルターで濾過して、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ細胞を除去した。細菌を含む濾液を連続希釈し、Ｒ２Ａ寒天プレートに広げて塗布した。次に、そのプレートを２８℃でインキュベートした。この分離培養によって、合計１０の細菌株が得られた。各菌株を純粋培養物し、その菌株をＲ２Ａ寒天プレート上で維持した。

（１．４ＭＧＰＢのスクリーニング）
分離した１０菌株のうち、６つの菌株がＲ２Ａ液体培地でよく増殖した。その６菌株を２８℃、２４時間Ｒ２Ａ液体培地でそれぞれ培養した。培養後に遠心分離（１０，０００×ｇ、室温、５分）により細胞を回収し、５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）で２回洗浄した。Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓを２００ｍＬのガラスフラスコに入れた１００ｍＬのオートクレーブ済み下水処理水サンプルに接種した。上記の通りに培養、回収した分離菌株の細菌細胞懸濁液を波長６００ｎｍの吸光度（ＯＤ６００）がＯＤ_６００＝０．０５となるような細菌細胞密度（初期細胞密度）でＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓ培養物に加えた。そのＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓと各分離株の共培養物を、増殖チャンバー（２８±１℃、８０μｍｏｌｐｈｏｔｏｎｓｍ^−２ｓ^−１および１６時間光周期の蛍光灯）で７日間培養した。７日目に、クロロフィルａ＋ｂの濃度が測定された。Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓを、細菌を接種せずにオートクレーブ処理した排水でも培養し、これを対照実験とした。分離菌株のＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓ増殖促進能力は、７日間の培養終了時のクロロフィルａ＋ｂ濃度を対照実験と比較することによって評価された。

（１．５ＥＧ３株の同定と特性評価）
分離された細菌株の中で、ＥＧ３株がスクリーニング試験で最高の増殖促進能力を示した。したがって、ＥＧ３株の生理学的および系統学的分析を行った。ＥＧ３株の生理学的特性評価は、製造元の指示（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘＪａｐａｎ、東京、日本）に従ってＡＰＩ２０ＮＥキットを使用して実行された。ＥＧ３株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列分析は、次のように実行された。１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の部分配列を増幅するプライマー８Ｆ（５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’）（配列番号１）［Edwards U, Rogall T, Blocker H, Emde M, Bottger EC. Isolation and direct complete nucleotide determination of entire genes. Characterization of a gene coding for 16S ribosomal RNA. Nucleic Acids Res. 1989; 17:7843-7853.］および１５１０Ｒ（５’−ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ−３’）（配列番号２）［Reysenbach AL, Wickham GS, Pace NR. Phylogenetic analysis of the hyperthermophilic pink filament community in Octopus Spring, Yellowstone National Park. Appl Environ Microbiol. 1994; 60:2113-2119.］を使用したＰＣＲによって、ＥＧ３株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の一部を増幅した。ＢＬＡＳＴ検索を使用し、ＮＣＢＩ−ＧｅｎＢａｎｋに登録されている標準菌株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列と、ＥＧ３株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列の類似性を評価して、ＥＧ３株の属レベルの同定を行った。ＥＧ３株の１６ＳｒＲＮＡ配列データ（１４３１ｂｐ）は、アクセッション番号ＬＣ４４１０３３でＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋデータベースに提出された（配列番号３）。

（１．６ＥＧ３株の培養条件と細胞懸濁液の調製）
ＥＧ３株は、１５０ｒｐｍで振盪しながら、２８℃で２４時間、Ｒ２Ａ液体培地で増殖させた。遠心分離（１０，０００×ｇ、室温、５分）により細胞を回収し、リン酸緩衝液で２回洗浄した後、リン酸緩衝液に懸濁した。ＥＧ３株の細胞懸濁液を以下の実験に使用するため、細胞密度の指標としてＯＤ６００を調整した。なお、ＯＤ_６００＝１．０のＥＧ３株は、約０．４５ｍｇ乾燥重量／ｍＬに相当した。９０℃で３時間乾燥した後、ＥＧ３株の細胞乾燥重量を測定した。また、０．０５、０．１、０．２のＯＤ_６００は、約２×１０^６、８×１０^６、４×１０^７ＣＦＵ／ｍＬに相当した。ＥＧ３株をＲ２Ａ寒天培地で培養し、ＥＧ３株のＣＦＵを求めた。本実施例では、ＥＧ３株の細胞密度としてＣＦＵ／ｍＬで表記した。

（１．７Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓとＥＧ３株との下水処理水サンプル中のいくつかの条件下での共培養）
Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓを２Ｌのガラス瓶に入れた１Ｌのオートクレーブ滅菌済み下水処理水サンプルに接種した。Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓの増殖に対するＥＧ３株の細胞密度の影響を決定するために、ＥＧ３株を２×１０^６、８×１０^６、および４×１０^７ＣＦＵ／ｍＬの初期細胞密度で滅菌下水処理サンプル中のＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓ培養液１Ｌに接種した。Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓとＥＧ３株の共培養は、増殖チャンバー（２８±１℃、８０μｍｏｌｐｈｏｔｏｎｓｍ^−２ｓ^−１および１６時間光周期の蛍光灯を使用）で７日間実施した。対照実験として、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓを上記条件下で１Ｌのオートクレーブ滅菌済み下水処理水サンプル中でＥＧ３株無しで培養した。

Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓの増殖を促進するＥＧ３株の能力に対する下水処理水中に共存する土着細菌の影響を調べるために、滅菌および非滅菌下水処理水サンプルの両方を培養実験に使用した。Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓは、２Ｌのガラス瓶で１Ｌの下水処理水サンプルに接種された。上記の検討でＥＧ３株の増殖促進能力が最も高くなった接種細胞密度８×１０^６ＣＦＵ／ｍＬで、ＥＧ３株をＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓ培養に接種した。Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓとＥＧ３株の共培養は、増殖チャンバー（２８±１℃、蛍光灯、８０μｍｏｌｐｈｏｔｏｎｓｍ^−２ｓ^−１、および１６時間光周期）で７日間実施した。

共培養実験中、クロロフィルａ＋ｂ濃度を毎日測定した。また、共培養７日後、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓの乾燥重量を測定した。実験は３回実施された。

（１．８下水処理水サンプル中において、ＥＧ３株で強化されたＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓによるバイオマスと油脂の生産を実証するための実験：２工程培養によるＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓのバイオマス／油脂生産システム）
本実施例のこの部分では、２工程培養によるＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓのバイオマス／油脂生産システムの可能性が評価された。第１培養工程は、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓの増殖を促進するためのＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓとＥＧ３株の共培養であった。この第１培養工程で増殖が促進されたＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓ細胞を、第２培養工程のＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓ接種材料として使用した。第２培養工程では、第１培養工程で増殖が促進されたＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓ接種材料によるバイオマスと油脂の生産を調べた（図２）。

第１培養工程でのＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓとＥＧ３株の共培養の実験方法は次のとおりだった。Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓは、内径約２９０ｍｍ、高さ約４３０ｍｍの１５Ｌのポリカーボネート培養容器で、滅菌されていない下水処理水サンプル５Ｌに接種された。ＥＧ３株を８×１０^６ＣＦＵ／ｍＬでＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓ培養に接種した。第１培養工程でのＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓとＥＧ３株の共培養は、増殖チャンバー（２８±１℃、８０μｍｏｌｐｈｏｔｏｎｓｍ^−２ｓ^−１の蛍光灯および１６時間の光周期）で７日間、０．５Ｌ／分の流量でエアポンプによって大気でバブリングされた条件で実施した。

第１培養工程の７日後、２〜４Ｌの培養物を回収し、低重力遠心分離（３０００×ｇ、１５分）によりＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓを回収した。Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ細胞を蒸留水で２回洗浄してＥＧ３株の細胞を除去し、遠心分離により回収した。収集したＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓペレットには、ＥＧ３株の細胞がほとんど含まれていないことを確認した。収集されたＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓペレットは、第２培養工程の培養の接種材料として使用された。Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓは、上記の条件下で５Ｌの下水処理水サンプルにＥＧ３株を加えずに培養し、この培養実験を対照実験として、収集したＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓペレットも第２培養工程の接種材料として使用した。

第２培養工程でのバイオマスと油脂の生産は、１５Ｌのポリカーボネート培養容器で行われた。１５Ｌのオートクレーブされていない下水処理水サンプルを培養容器に加えた。第１培養工程においてＥＧ３株で増殖が促進された、または第１培養工程の対照実験で培養したＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓのそれぞれの接種材料は、１５Ｌのオートクレーブされていない下水処理水サンプルに接種された。Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓの初期細胞密度は約８０ｍｇ乾燥重量／Ｌであった。第２培養工程のバイオマス／油脂生産培養は、増殖チャンバー（２８±１℃、８０μｍｏｌｐｈｏｔｏｎｓｍ^−２ｓ^−１および１６時間光周期の蛍光灯）で、１Ｌ／分の流量で大気をバブリングされた条件で7日間実施した。この間に、培養液のクロロフィルａ＋ｂとバイオマスは毎日測定された。また、第２培養工程の開始時と終了時にＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓの油脂含有量は、測定された。

（１．９Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ増殖の測定およびＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓ油脂の測定）
本実施例では、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓの増殖の指標としてクロロフィル濃度を測定した。クロロフィル濃度は、１００％メタノールで３０分間抽出した後、分光光度法で測定した。抽出物の吸光度は、分光光度計（ＵＶｍｉｎｉ−１２４０；島津製作所株式会社、京都、日本）で６６５ｎｍ（Ａ_６６５）および６５０ｎｍ（Ａ_６５０）で測定された。総クロロフィル（クロロフィルａ＋クロロフィルｂ：Ｃｈｌａ＋ｂ）濃度（μｇ／ｍＬ）は、次のように計算された。
Ｃｈｌａ＋ｂ（μｇ／ｍＬ）＝４×Ａ_６６５＋２５．５×Ａ_６５０（式１）

Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓのバイオマス（乾燥重量）は、次のように測定した。培養液５０ｍＬを収集し、３０秒間ボルテックスして、細菌および微細藻類細胞を均一に懸濁した。混合物を遠心分離し（３０００×ｇ、５分）、ペレットを２０ｍＬの蒸留水で洗浄した。その後、ペレットを２０ｍＬの蒸留水に懸濁した。懸濁液中のＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓ細胞を、事前に秤量したＧＦ／Ｂフィルター（孔径、１μｍ）で収集し、乾燥（９０℃、３時間）してから秤量した。この方法により、共存するＥＧ３株の細胞（乾燥重量）からの干渉がほとんどなく、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ細胞（乾燥重量）を収集できることが確認された。

Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ細胞の油脂含有量は、乾燥バイオマス中の油脂の割合で定量化された。Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓを遠心分離（３０００×ｇ、５分）で収穫し、蒸留水で洗浄し、乾燥させた後、粉末にした。Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ粉末（２０ｍｇ）をＢｉｏＭａｓｈｅｒ（タカラバイオ、草津、日本）で１ｍＬのｎ−ヘキサンと共に粉砕した。粉砕したＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓサンプルを５０ｍＬチューブに移し、９ｍＬのｎ−ヘキサンと６ｍＬイソプロパノールをチューブに加えた。チューブを２２５ｒｐｍで２４時間振盪した。次に、３０ｍＬの蒸留水をチューブに加えた。チューブを1分間振盪した後、遠心分離した（１０，０００×ｇ、５分）。油脂を含むｎ−ヘキサン層を、事前に計量したアルミニウムトレイに収集し、室温で一晩乾燥させた後、９０℃で３時間乾燥させた。最後に、収集した油脂の重量を測定した。

バイオマス生産速度（ｍｇ／Ｌ／日）および油脂生産速度（ｍｇ／Ｌ／日）は、次のように計算された。
バイオマス生産速度（ｍｇ／Ｌ／日）＝（最終バイオマス［ｍｇ／Ｌ］−初期バイオマス［ｍｇ／Ｌ］）／（培養時間［日］）（式２）
油脂生産速度（ｍｇ／Ｌ／日）＝（［バイオマス（ｍｇ／Ｌ）×油脂含有量（％）］最終−［バイオマス（ｍｇ／Ｌ）×油脂含有量（％）］初期）／培養時間（日）（式３）

（１．１０統計分析）
実験ごとに３つのサンプル（ｎ＝３回の繰り返し）の結果を統計分析に用いた。全ての結果は、平均値±標準偏差として表された。ＳＰＳＳＳｔａｔｉｓｔｉｃｓｖ．２２．０（ＩＢＭ、ニューヨーク州アーモンク）のｔ検定を使用して、有意性（ｐ＜０．０５）を分析した。

［２．試験結果］
（２．１Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓに対するＭＧＰＢとしてのＥｍｔｉｃｉｃｉａｓｐ．ＥＧ３株の分離と同定）
下水処理水サンプルに含まれる細菌がＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓの増殖を促進できるという仮説を検証するために、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓを、３連続バッチ培養実験において、生菌を含む（非滅菌下水処理水サンプル）または生菌なし（オートクレーブ加熱滅菌下水処理水サンプル）で培養した。各バッチ培養の２日後、クロロフィルａ＋ｂ濃度は、生菌を含まない培養よりも生菌を含むＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓ培養液の方が高かった（ｐ＜０．０５）（図３）。この結果は、下水処理水サンプル中にＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓに対するＭＧＰＢが存在することを示唆した。滅菌されていない下水処理水中のＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓ培養から、ＭＧＰＢの候補となる１０の細菌株が分離された。１０株のうち６株がＲ２Ａ培地で十分に増殖し、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓの増殖を促進する能力を調べた。その結果、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓの増殖を促進する４つの株が見つかった。その中で、ＥＧ３株は最高の増殖促進能力を示した。また、ＥＧ３株はＲ２Ａ液体培地で高いバイオマス収量を示した。図４Ａ〜図４Ｃに、ＥＧ３株（図４Ａ）を含む３つの株について、下水処理水を培養液とした２工程培養での増殖促進細菌の効果を示す。

Ｒ２Ａ寒天上のＥＧ３株のコロニーは、円形、滑らか、凸面、およびオレンジ色であった。ＥＧ３株は、オキシダーゼ、グルコース発酵、およびエスクリン加水分解に対して陽性を示したが、硝酸還元、インドール生成、アルギニンジヒドロラーゼ、ウレアーゼ、ゼラチナーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ活性に対して陰性を示した。ＥＧ３株は、唯一の炭素源としてグルコース、Ｄ−マンノース、またはマルトースを利用したが、Ｌ−アラビノース、Ｄ−マンニトール、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、グルコン酸塩、ｎ−カプリン酸塩、アジピン酸塩、Ｄ、Ｌ−リンゴ酸塩、クエン酸塩、またはフェニルアセテートは利用しなかった。

ＥＧ３株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のほぼ完全な配列（１４３１ｂｐ）は、Ｅｍｔｉｃｉｃｉａｆｏｎｔｉｓ株ＩＭＣＣ１７３１^Ｔ（９７．９％の配列類似性）、Ｅｍｔｉｃｉｃｉａｇｉｎｓｅｎｇｉｓｏｌｉ株Ｇｓｏｉｌ０８５^Ｔ（９７．６％）、Ｅｍｔｉｃｉｃｉａｓｏｌｉ株ＺＺ−４^Ｔ（９７．５％）、Ｅｍｔｉｃｉｃｉａｏｌｉｇｏｔｒｏｐｈｉｃａ株ＧＰＴＳＡ１００−１５^Ｔ（９４．４％）、Ｅｍｔｉｃｉｃｉａａｑｕａｔｉｃａ株ＨＭＦ２９２５^Ｔ（９３．９％）、Ｅｍｔｉｃｉｃｉａｓｅｄｉｍｉｎｉｓ株ＪＢＲ１２^Ｔ（９３．７％）、およびＥｍｔｉｃｉｃｉａａｑｕａｔｉｌｉｓ株ＴＨＧ−ＤＮ６．１４Ｔ（９３．７％）の類似配列と非常に類似していた。したがって、ＥＧ３株をＥｍｔｉｃｉｃｉａｓｐ．として同定した。

（２．２異なる細胞密度でのＥＧ３株によるＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓの増殖促進）
下水処理水サンプルでのＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓの増殖を促進するために必要なＥＧ３株の細胞密度を決定するために、ＥＧ３株をさまざまな細胞密度、０（コントロール）、２×１０^６、８×１０^６、および４×１０^７ＣＦＵ／ｍＬで接種してＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓと共培養した。その結果、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓのクロロフィルａ＋ｂ濃度とバイオマス生産速度（ｍｇ／Ｌ／日）は、ＥＧ３株を２×１０^６、８×１０^６、および４×１０^７ＣＦＵ／ｍＬの細胞密度で接種したＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓ培養でＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓ対照培養よりも有意に高かった（ｐ＜０．０５）（図５Ａ及び図５Ｂ）。ＥＧ３株の増殖促進効果は、２×１０^６ＣＦＵ／ｍＬよりも８×１０^６および４×１０^７ＣＦＵ／ｍＬの細胞密度で高かった。ＥＧ３株の初期接種細胞密度は、ＥＧ３株がＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓのバイオマス生産速度を大幅に高めたかどうかの重要な決定要因といえる。ＥＧ３株の初期接種８×１０^６と４×１０^７ＣＦＵ／ｍＬ間のＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓの増殖を促進する能力の差は有意ではなかったため、これ以降の実験ではＥＧ３株の初期接種８×１０^６ＣＦＵ／ｍＬを使用することにした。

（２．３Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓの増殖を促進するＥＧ３株の能力に対する下水処理水中の細菌の影響）
ＥＧ３株と共存する細菌の影響を調べるために、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓとＥＧ３株を熱殺菌または非殺菌の下水処理水サンプルで共培養した。Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ−ＥＧ３株共培養のクロロフィルａ＋ｂ濃度は、滅菌および非滅菌下水処理水の両方で、ＥＧ３株を含まないＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓ培養の濃度よりも有意に高かった（ｐ＜０．０５）（図６Ａ）。

７日間の培養実験中、ＥＧ３株と共培養されたＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓのバイオマス生産速度（ｍｇ／Ｌ／日）は、ＥＧ３株なしで培養されたＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓと比較して、滅菌および非滅菌下水処理水でそれぞれ３．７倍および３．１倍であった（図６Ｂ）。これらの結果は、ＥＧ３株が３．６±０．２×１０^５ＣＦＵ／ｍＬの複雑な細菌群集が存在する実際の下水処理水でもＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓの増殖を促進できることを明確に示している。

（２．４ＥＧ３株を使用した２工程培養システムにおけるＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓによるバイオマスと油脂の生産の向上）
Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓによるバイオマスと油脂の生産を高めるために、ＥＧ３株を使用した２工程のＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓ培養システムを運用した（図２）。まず、第１培養工程において、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓはＥＧ３株と共培養され、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓの増殖を促進した。この第１培養工程で生産されたＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓは、第２培養工程の培養システムの接種材料として使用され、１５Ｌの下水処理水中においてＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓによるバイオマスと油脂の生産が調べられた。対照培養では、第１培養工程でＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓをＥＧ３株なしで増殖させ、そのＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓを第２培養工程の接種材料として使用して、同様に１５Ｌの排水中においてＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓによるバイオマスと油脂の生産が調べられた。

第２培養工程において、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓのクロロフィルａ＋ｂ濃度とバイオマス（乾燥重量）濃度は、第１培養工程でＥＧ３株と共培養されたＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓを接種したシステムで、対照Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ培養を接種したシステムよりも有意に高かった（ｐ＜０．０５）（図７Ａ）。第１培養工程でＥＧ３株と共培養されたＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓを接種したシステムの第２培養工程では、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓのバイオマス濃度が、７日間の培養の終了時に最高レベルの７０２±２３ｍｇ／Ｌに達した（図７Ｂ）。

図８Ａ、図８Ｂ、図８Ｃは、第１培養工程でＥＧ３株と共培養されたＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓを接種したシステムおよび第１培養工程の対照Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ培養の第２培養工程でのバイオマス生産速度、油脂含有率および油脂生産速度を比較したものである。第１培養工程でＥＧ３株と共培養されたＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓを接種したシステムのＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓバイオマス生産速度（８７±２．８ｍｇ／Ｌ／日）は、対照Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ（２７±２．７ｍｇ／Ｌ／日）の３．２倍であった（図８Ａ）。第１培養工程でＥＧ３株と共培養されたＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓを接種したシステムのＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓの油脂含有率（２８．４％±０．７％）は、対照Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓの油脂含有率（３０．９％±０．８％）よりわずかに低いが有意に低かった（図８Ｂ）。第１培養工程でＥＧ３株と共培養されたＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓを接種したシステムのＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓの油脂生産速度（２５±０．８ｍｇ／Ｌ／日）は、対照Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ（８．５±０．８ｍｇ／Ｌ／日）の２．９倍であった（図８Ｃ）。

［３．結果の考察］
ＭＧＰＢの利用技術は、微細藻類のバイオマス生産性を向上させるものとして期待されている。例えば、「ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＰｈｙｃｏｓｏｃｉｕｓｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ」ＢＯＴＲＹＣＯ−２とＰ．ｂｅｒｍｕｄｅｎｓｉｓＫＣＴＣ１３０７３ＢＰは、Ｂ．ｂｒａｕｎｉｉとＴ．ｓｔｒｉａｔａによるバイオマス生産率をそれぞれ１．８倍と２倍増加させた結果が報告されている［Tanabe Y, Okazaki Y, Yoshida M, Matsuura H, Kai A, Shiratori T, Ishida K, Nakano S, Watanabe MM. A novel alphaproteobacterial ectosymbiont promotes the growth of the hydrocarbon-rich green alga Botryococcus braunii. Sci Rep. 2015; 5:10467、Park J, Park BS, Wang P, Patidar SK, Kim JH, Kim SH, Han MS. Phycospheric native bacteria Pelagibaca bermudensis and Stappia sp. ameliorate biomass productivity of Tetraselmis striata (KCTC1432BP) in co-cultivation system through mutualistic interaction. Front Plant Sci. 2017; 8:289］。このＭＧＰＢを利用した微細藻類のバイオマス生産性向上の戦略を成功させるには、宿主の微細藻類に適したＭＧＰＢを使用する必要がある。

したがって、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓのバイオマス／油脂生産性を高めるためには、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓのＭＧＰＢを分離し、その効果が発揮される利用技術を開発することが重要であった。申請者の研究グループのこれまでの調査から、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓの増殖を促進する細菌が一般的な下水処理水中に存在することが確認された［Toyama T, Kasuya M, Hanaoka T, Kobayashi N, Tanaka Y, Inoue D, Sei K, Morikawa M, Mori K. Growth promotion of three microalgae, Chlamydomonas reinhardtii, Chlorella vulgaris and Euglena gracilis, by in situ indigenous bacteria in wastewater effluent. Biotechnol Biofuels. 2018; 11:176］。そこで下水処理水中からＭＧＰＢの分離を試みたところ、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓに対するＭＧＰＢである、Ｅｍｔｉｃｉｃｉａｓｐ．ＥＧ３株が、分離された。ＥＧ３株は、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓの最初のＭＧＰＢである。Ｅｍｔｉｃｉｃｉａ属のメンバーは、淡水、湿地、海水、浅い河川の堆積物、土壌などのさまざまな環境から分離されている。Ｅｍｔｉｃｉｃｉａの生態学的役割とその産業利用の可能性は未だ明らかではないが、その役割の１つがＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓなどの微細藻類の増殖を促進する共生関係で機能することを示している。

ＥＧ３株を８×１０^６ＣＦＵ／ｍＬの接種密度でＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓと共培養すると、ＥＧ３株はＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓバイオマスの生産速度を、熱滅菌および非滅菌下水処理水での培養条件において、それぞれ３．７倍および３．１倍増加させた（図６Ｂ）。Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓに対するＥＧ３株の増殖促進効果は、これまでに報告されている他の微細藻類に対するＭＧＰＢの効果と同程度であった。

これまでの他の研究論文では、ＭＧＰＢの効果が他の細菌群集のない、単一ＭＧＰＢおよび単一微細藻類の無菌培養条件下で研究されてきた。一方、微細藻類の大型培養を含む野外条件では、他の細菌群集との競争のためにＭＧＰＢの有益な効果が十分に発揮されないことが考えられる。したがって、ＥＧ３株が他の複雑な微生物群集が存在する非滅菌下水処理水においてＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓのバイオマス生産性を著しく増加させたことは注目に値する。すわなち、ＥＧ３株のＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓの成長促進機能は、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ大型培養に利用できる価値が非常に高いと言える。

一部のＭＧＰＢは、微細藻類細胞の油脂、脂肪酸、デンプン、または炭化水素の含有量を増加させる可能性がある。Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅＣｄは、Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓの脂肪酸と油脂の蓄積を大幅に増加させる可能性がある。ただし、本実施例では、ＥＧ３株はＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓの油脂の蓄積にプラスの効果はなかった（図８Ｂ）。本実施例では、パラミロン、β−カロテン、デンプン、タンパク質などの他の細胞成分の生産、または油脂組成に対するＥＧ３株の影響は考慮されていない。これらの効果とＥＧ３株の増殖促進メカニズムの解明は、まだ検討されていない。

ＭＧＰＢの効果的な利用技術として、微細藻類とＭＧＰＢの共固定化が提案されている。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓはアルギン酸ビーズでＡ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅＣｄと共固定化されており、共生により、（１）固定化Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ単独と比較して合成排水中の栄養素除去が強化され、（２）バイオマス、油脂、合成培地でのデンプンの生産性が強化された研究が報告されている［Leyva LA, Bashan Y, Mendoza A, de-Bashan LE. Accumulation fatty acids of in Chlorella vulgaris under heterotrophic conditions in relation to activity of acetyl-CoA carboxylase, temperature, and co-immobilization with Azospirillum brasilense. Naturwissenschaften 2014; 101:819-830、Palacios OA, Choix FJ, Bashan Y, de-Bashan LE. Influence of tryptophan and indole-3-acetic acid on starch accumulation in the synthetic mutualistic Chlorella sorokiniana-Azospirillum brasilense system under heterotrophic conditions. Res Microbiol. 2016; 167:367-379、Palacios OA, Lopez BR, Bashan Y, de-Bashan LE. Early changes in nutritional conditions affect formation of synthetic mutualism between Chlorella sorokiniana and the bacterium Azospirillum brasilense. Microb Ecol. 2019; 77:980-992］。

本実施形態では、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓのバイオマス生産を強化するＭＧＰＢの別の利用技術として、２工程培養システムを提案した。第１培養工程では、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓの増殖を促進するために、ＥＧ３株と８×１０^６ＣＦＵ／ｍＬで共培養し、その増殖が促進されたＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓを第２培養工程の接種材料として使用した。第２培養工程では、下水処理水を用いてＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓのバイオマスと油脂の大量生産を７日間実施した。

第１培養工程で増殖が促進されたＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓを用いた第２培養工程では、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓは７日間にわたって高い速度で増殖した（図７Ａ）。７日間の培養期間中のバイオマスおよび油脂生産速度は、第１培養工程でＥＧ３株接種なしの対照Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓの培養と比較して、それぞれ３．２倍および２．９倍に高まった（図８Ａ及び図８Ｃ）。

この本実施形態は、ＭＧＰＢであるＥｍｔｉｃｉｃｉａｓｐ．ＥＧ３株を利用した2工程培養によるＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓのバイオマス／油脂生産の向上を実証した最初の研究である。Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓの増殖促進は、これまでに他の研究によって遺伝子工学または外因性栄養素、植物ホルモン、フェルラ酸の補充によって達成されている。小川ら［Ogawa T, Tamoi M, Kimura A, Mine A, Sakuyama H, Yoshida E, Maruta T, Suzuki K, Ishikawa T, Shigeoka S. Enhancement of photosynthetic capacity in Euglena gracilis by expression of cyanobacterial fructose-1,6-/sedoheptulose-1,7-bisphosphatase leads to increases in biomass and wax ester production. Biotechnol Biofuels. 2015; 8:80.］は、シアノバクテリアのフルクトース−１，６−／セドヘプツロース−１，７−ビスホスファターゼ遺伝子を過剰発現させることにより、高光および高ＣＯ_２条件下、ＣＭ培地でＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓバイオマス（乾燥重量）の生産速度を２倍に高めたが、これはカルバンサイクルに関与している。トランスジェニックＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓの最高バイオマス濃度は６３１．１±８９．９ｍｇ／Ｌであった。

Ｚｈｕらは［Zhu J, Wakisaka M. Growth promotion of Euglena gracilis by ferulic
acid from rice bran. AMB Express. 2018; 8:16.］は、米ぬかから作られたフェルラ酸を５００ｍｇ／Ｌ、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓの培地に加えることで、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓの細胞密度が２．５倍になり、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓのバイオマス（乾燥重量）の生産速度が２．２倍に上がると報告している。５００ｍｇ／Ｌフェルラ酸を含むＣＭ培地でのＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓの最大バイオマス濃度は６７０±４０ｍｇ／Ｌであった。Ｎｏｂｌｅら［Noble A, Kisiala A, Galer A, Clysdale D, Emery RJN. Euglena gracilis (Euglenophyceae) produces abscisic acid and cytokinins and responds to their exogenous application singly and in combination with other growth regulators. Eur J Phycol. 2014; 49:244-254.］は、外因性の植物ホルモンがＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓの増殖を刺激すると報告している。トランスゼアチン（１０^−７Ｍ）とアブシジン酸（１０^−９Ｍ）の組み合わせは、植物ホルモンを含まないＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓ培養と比較して、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓの増殖に最適な条件を生成し、増殖速度を約３倍増加させた。今回開発したＥＧ３株を利用した２工程培養によるＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓのバイオマス生産速度（３．２倍）と最高のバイオマス濃度（７０２±２３ｍｇ／Ｌ）は、これまでの研究による他の増強方法の結果と同等かそれ以上であった。

上記の他の研究では、合成培地を用いた無菌条件で検討しているのに対して、今回の実験では実際の利用条件に近い下水処理水を用いた非無菌条件である。そのため、今回の実験結果は下水処理水を用いたＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓのバイオマスと油脂の大規模生産システムにとって非常に価値のあるものである。

ＥＧ３株を利用した２工程培養によるＥ．ｇｒａｃｉｌｉｓのバイオマス／油脂の大量培養システムを下水処理プラントに導入した概略設計を図９に示す。２工程培養システムの最適化（培養槽の容量設計や滞留時間設定など）は、このシステムの実用化の次の課題である。

［４．まとめ］
Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓの増殖を促進することができるＥｍｔｉｃｉｃｉａｓｐ．ＥＧ３株を、下水処理水から分離した。ＥＧ３株は、他の細菌群集を含む下水処理水中でも、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓのバイオマス生産性を大幅に高めた。Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓのバイオマス／油脂生産性を大幅に高めることができるＥＧ３株を利用した２工程Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ培養システムを提案した。

ここで提案したＥＧ３株を利用した２工程Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ培養システムによって、ＥＧ３株を含まない培養と比較して、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓのバイオマスおよび油脂生産性がそれぞれ３．２倍および２．９倍高まった。この２工程Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ培養システムは、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓのバイオマス／油脂（バイオ燃料）の生産性を高める有望な新技術である。

Claims

ユーグレナを増殖促進細菌と共に培養する第１培養工程と、
前記第１培養工程で培養した前記ユーグレナを分離する分離工程と、
前記分離工程で分離した前記ユーグレナを培養する第２培養工程と、
を行うことを特徴とするユーグレナの培養方法。
前記第１培養工程及び前記第２培養工程が、下水処理水を含有する培養液中で行われることを特徴とする請求項１に記載のユーグレナの培養方法。
前記増殖促進細菌は、Ｅｍｔｉｃｉｃｉａｓｐ．ＥＧ３株（受領番号：ＮＩＴＥＡＰ−０３０５５）であることを特徴とする請求項１又は２に記載のユーグレナの培養方法。
ユーグレナを増殖促進細菌と共に培養する第１培養工程と、
前記第１培養工程で培養した前記ユーグレナを分離する分離工程と、
前記分離工程で分離した前記ユーグレナを培養する第２培養工程と、
前記第２培養工程で得られる培養物から油脂を回収する油脂回収工程と、
を行うことを特徴とする油脂の製造方法。
前記第１培養工程及び前記第２培養工程が、下水処理水を含有する培養液中で行われることを特徴とする請求項４に記載の油脂の製造方法。
前記増殖促進細菌は、Ｅｍｔｉｃｉｃｉａｓｐ．ＥＧ３株（受領番号：ＮＩＴＥＡＰ−０３０５５）であることを特徴とする請求項４又は５に記載の油脂の製造方法。
ユーグレナを増殖促進細菌と共に培養する第１培養タンクと、
前記第１培養タンクで培養した前記ユーグレナを培養する第２培養タンクと、を備え、
前記第１培養タンク及び前記第２培養タンクには、下水処理水を含有する培養液が充填されることを特徴とする下水処理プラント。