KR102123512B1 - 메타노트로프(Methanotroph)에서 유래한 신규 메타노트로프-대장균 셔틀 벡터 - Google Patents
메타노트로프(Methanotroph)에서 유래한 신규 메타노트로프-대장균 셔틀 벡터 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 메타노트로프(Methanotroph)와 대장균에서 자체 복제가 가능한 셔틀 벡터에 관한 것으로, 보다 상세하게는 메틸모나스 속(Methylomonas sp.) DH-1에서 유래한 플라스미드를 이용하여 메타노트로프(Methanotroph)와 대장균에서 자체 복제가 가능하도록 제조된 셔틀 벡터에 관한 것이다. 본 발명의 셔틀 벡터는 메타노트로프(Methanotroph)와 대장균에서 유전물질 또는 단백질 등을 안정적으로 발현시키는 효율성 높고 편리한 발현 시스템으로 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 메타노트로프(Methanotroph)와 대장균에서 자체 복제가 가능한 셔틀 벡터에 관한 것으로, 보다 상세하게는 메틸모나스 속(Methylomonas sp.) DH-1에서 유래한 플라스미드를 이용하여 메타노트로프(Methanotroph)와 대장균에서 자체 복제가 가능하도록 제조된 셔틀 벡터에 관한 것이다.
[과제고유번호] NRF-2017M3D3A1A01036923
[부처명] 과학기술정보통신부
[연구관리전문기관] 한국연구재단
[연구사업명] C1 가스 리파이너리 사업
[연구과제명] 메탄자화균을 이용한 고효율 메탄전환 숙신산 생산 균주 개발
[기여율] 50/100
[주관기관] 한국에너지기술연구원
[연구기간] 2017.04.01 ~ 2020.12.31
[과제고유번호] 20150581
[부처명] 해양수산부
[연구관리전문기관] 한국해양과학기술진흥원
[연구사업명] 해양 고세균 이용 바이오수소생산 실용화 기술 개발
[연구과제명] 고효율 수소 생산을 위한 고압 수성가스 전환 생물반응시스템 개발
[기여율] 30/100
[주관기관] 한국에너지기술연구원
[연구기간] 2015.12.01 ~ 2020.01.31
[과제고유번호] 20173010092460
[부처명] 산업통상자원부
[연구관리전문기관] 한국에너지기술평가원
[연구사업명] KETEP 신재생에너지기술개발사업
[연구과제명] 일산화탄소 기반 합성가스를 이용한 바이오알콜 생산기술 개발
[기여율] 20/100
[주관기관] 광주과학기술원
[연구기간] 2017.12.01 ~ 2020.11.30
메타노트로프(Methanotroph)는 메탄을 유일한 에너지원으로 생육할 수 있는 미생물로, 1906년에 Sohngen에 의해 처음으로 분리되었다. 그 후, 분류학적 연구로 세포의 형태, 정지기의 세포 또는 세포내막구조의 형태에 따라 메틸로모나스 속(Methylomonas), 메틸로박터 속(Methylobacter), 메틸로코커스 속(Methylococcus), 메틸로마이크로븀 속(Methylomicrobium), 메틸로스페라 속(Methylosphaera), 메틸로칼덤 속(Methylocaldum), 메틸로글로버스 속(Methyloglobus), 메틸로사르시나 속(Methylosarcina), 메틸로프로펀더스 속(Methyloprofundus), 메틸로썰머스 속(Methylothermus), 메틸로할로비우스 속(Methylohalobius), 메틸로게아 속(Methylogaea), 메틸로마리넘 속(Methylomarinum), 메틸로벌럼 속(Methylovulum), 메틸로마리노범 속(Methylomarinovum), 메틸로러브럼 속(Methylorubrum), 메틸로파라코커스 속(Methyloparacoccus), 메틸로시너스 속(Methylosinus), 메틸로시스티스 속(Methylocystis), 메틸로셀라 속(Methylocella), 메틸로캡사 속(Methylocapsa), 메틸로퍼룰라 속(Methylofurula), 메틸아시디필럼 속(Methylacidiphilum), 메틸아시디마이크로븀 속(Methylacidimicrobium)의 25종으로 분류되었다.
또한, 메탄산화세균은 모든 균종에 있어서 발달된 내막구조가 관찰되고, 이 세포내막의 차이에 따라 포개진 소포상의 내막이 세포전체에 분포하는 type I과 세포 주변을 따라 내막이 배열되어 있는 type II의 두가지 형태로 구분된다. 또한, 세포내막에는 지질을 구성하고 있는 지방산 조성에 차이가 있다고 보고되고 있으며, type I의 메탄산화세균은 16-탄소사슬의 지방산이 많고, type II의 메탄산화세균은 18-탄소사슬의 지방산이 많으며, 양쪽 타입 모두가 불포화 결합을 1개 함유하는 지방산을 갖는다. 이러한 메탄산화세균은 메탄 모노옥시게나아제(monooxygenases, MMO)라는 효소를 함유하고 있어 상온, 상압하에서도 용이하게 메탄을 메탄올로 전환할 수 있다. 메탄은 메탄 모노옥시게나아제에 의해 메탄올로 산화되고, 그 다음, 메탄올은 메탄올탈수소효소(methanol dehydrogenase, MDH)에 의해 포름알데히드(formaldehyde) 또는 포름산으로 산화되어 이산화탄소가 된다.
이러한 메탄으로부터 탄소화합물의 생합성은 리불로오스 일인산 회로(ribulose monophosphate cycle; RuMP cycle)와 세린 회로(serine cycle)에 의해 진행되고, 일반적으로 type I의 메탄산화세균은 리불로오스 일인산 회로를, type II의 메탄산화세균은 세린 회로를 이용하여 바이오매스를 합성한다고 알려져 있다(Biocatalytic Conversion of Methane to Methanol as a Key Step for Development of Methane-Based BiorefineriesJ. Microbiol. Biotechnol. In Yeub Hwang et al(2014), 24(12), 1597-605). 이러한 메탄산화세균이 갖는 생리학적 특성으로 인해, 메탄산화세균을 이용하여 메탄을 메탄올로 전환시켜, 유해한 메탄가스를 절감시키려는 노력과 에너지원으로 활용하려는 노력이 계속되어 왔다.
이러한 메타노트로프(Methanotroph)를 바이오공정에 이용하기 위해서는 메타노트로프(Methanotroph) 내에서 episomal하게 작동하는 벡터(vector)가 필요하나, 메타노트로프(Methanotroph)의 경우 대장균(E. coli)과 다르게 episomal하게 작동하는 벡터(vector)가 많이 알려져 있지 않다. 특히, 메탄산화세균 메틸로모나스 속(methylomonas sp.) DH-1 균주의 경우 유전공학(genetic engineering)에 사용될 수 있는 벡터(vector)가 전혀 알려지지 있지 않다.
본 발명은 메틸로모나스 속(Methylomonas sp). DH-1에서 유래한 플라스미드를 이용하여 메타노트로프(Methanotroph)와 대장균에서 자체 복제가 가능하도록 제조된 셔틀 벡터를 제공하자 한다.
본 발명의 일 실시 형태로는, 서열번호 1의 염기 서열로 이루어지는 셔틀 벡터 pDEKK-1을 들 수 있다.
상기 셔틀 벡터는 메타노트로프(Methanotroph) 및 대장균에서 동시에 벡터의 역할을 수행할 수 있으며, 도 1의 개열지도를 갖는다.
본 발명의 다른 실시형태로는 상기 셔틀 벡터에 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 삽입한 재조합 벡터를 들 수 있다.
한편, 본 발명의 또 다른 실시형태로는 셔틀 벡터 pDEKK-1로 형질전환된 형질전환체를 들 수 있다. 상기 형질전환체는 메타노트로프(Methanotroph) 또는 대장균일 수 있으며, 상기 메타노트로프(Methanotroph)는 메틸로모나스 속(Methylomonas sp.) DH-1인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 또 다른 실시형태는 형질전환 방법으로, 서열번호 1의 염기 서열로 이루어지는 셔틀 벡터 pDEKK-1를 제조하는 단계; 상기 셔틀 벡터 pDEEK-1에 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 삽입시켜 재조합 벡터를 제조하는 단계; 및 상기 재조합 벡터를 미생물에 도입하는 단계;를 포함한다.
본 발명의 셔틀 벡터는 메타노트로프(Methanotroph)와 대장균에서 유전물질 또는 단백질 등을 안정적으로 발현시키는 효율성 높고 편리한 발현 시스템으로 이용될 수 있다. 따라서 본 발명의 셔틀 벡터는 메타노트로프(Methanotroph)를 이용한 산업뿐만 아니라 다양한 분야에서 널리 활용될 것으로 기대된다.
도 1은 셔틀 벡터 pDEEK-1의 개열지도를 나타낸 도면이다.
도 2는 Methylomonas sp. DH-1의 플라스미드 서열과 다른 methylomonas strain들의 플라스미드 서열을 conservation한 결과이다.
도 3은 Methylomonas sp. DH-1의 putative origin 서열 주위의 단백질 암호화 유전자를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 pDEEK-1에 제한효소(Sac II, EcoR I/Pst I)를 처리한 후 전기 영동한 결과를 나타낸 사진이다.
도 5 및 6은 형질전환된 Methylomonas sp. DH-1에 colony PCR을 수행하고 전기 영동한 결과를 나타낸 사진이다.
도 2는 Methylomonas sp. DH-1의 플라스미드 서열과 다른 methylomonas strain들의 플라스미드 서열을 conservation한 결과이다.
도 3은 Methylomonas sp. DH-1의 putative origin 서열 주위의 단백질 암호화 유전자를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 pDEEK-1에 제한효소(Sac II, EcoR I/Pst I)를 처리한 후 전기 영동한 결과를 나타낸 사진이다.
도 5 및 6은 형질전환된 Methylomonas sp. DH-1에 colony PCR을 수행하고 전기 영동한 결과를 나타낸 사진이다.
이하 본 발명의 바람직한 실시 예를 통해 상세히 설명하기에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정하여 해석되어서는 아니 되며, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야 함을 밝혀둔다.
본 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 메타노트로프(Methanotroph)와 대장균에서 자체 복제가 가능한 셔틀 벡터에 관한 것으로, 보다 상세하게는 메틸로모나스 속(Methylomonas sp.) DH-1에서 유래한 플라스미드를 이용하여 메타노트로프(Methanotroph)와 대장균에서 자체 복제가 가능하도록 제조된 셔틀 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 셔틀 벡터 pDEKK-1은 서열번호 1의 염기 서열로 이루어진다. 상기 서열번호 1의 염기 서열은 7232 bp이며, 염기 서열 중 G+C의 비율은 52.6% 이다.
상기 셔틀 벡터 pDEKK-1은 메타노트로프(Methanotroph) 및 대장균에서 동시에 벡터의 역할을 수행할 수 있으며, 도 1에 나타난 개열지도를 갖는다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 형질전환체는 상기 셔틀 벡터 pDEKK-1로 로 형질전환된 형질전환체일 수 있다. 본 발명에 따른 셔틀 벡터는 메타노트로프(Methanotroph)와 대장균에서 자체 복제가 가능하다. 상기 형질전환체는 메타노트로프(Methanotroph) 또는 대장균일 수 있으며, 상기 메타노트로프(Methanotroph)는 메틸로모나스 속(Methylomonas sp.) DH-1일 수 있다.
본 발명에서는 상기 셔틀 벡터 pDEKK-1에 목적하는 단백질을 코딩하는 유전자를 삽입한 재조합 벡터를 제작하여 사용할 수도 있다.
또한, 본 발명은 셔틀 벡터를 이용하여 미생물을 형질전환 시키는 방법을 제공한다. 이러한 형질전환은 서열번호 1의 염기 서열로 이루어지는 셔틀 벡터 pDEKK-1를 제조하는 단계; 상기 셔틀 벡터 pDEEK-1에 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 삽입시켜 재조합 벡터를 제조하는 단계; 및 상기 재조합 벡터를 미생물에 도입하는 단계;를 포함할 수 있다.
상기 미생물은 메타노트로프(Methanotroph) 또는 대장균일 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 본 발명의 셔틀 백터 도입이 가능한 미생물이라면 제한 없이 사용 가능하다.
[
실시예
1: 플라스미드(
plasmid
)의 복제원점(replication origin) 탐색]
메틸로모나스 속(Methylomonas sp.) DH-1은 277 kb에 이르는 큰 episomal plasmid(GenBank: CP014361)를 보유하고 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 plasmid가 보유한 복제원점(replication origin)을 이용해 메타노트로프(Methanotroph)에서 사용할 수 있는 셔틀 벡터를 제작하기 위해, 상기 plasmid(GenBank: CP014361)의 복제원점(replication origin)을 탐색하였다.
Replication initiation proteins(repA, repB, etc.) 및 plasmid stabilization proteins(stbA)이 존재하는 위치 가까이에 plasmid의 복제원점 (oriV)이 존재할 가능성이 높기 때문에 단백질 annotation 정보를 활용하였다.
복제원점의 경우 유전체 및 plasmid 전체에서 AT 비율이 높게 유지되므로, Methylomonas sp. DH-1의 native vector (GenBank: CP014361)의 non-coding region의 GC ratio를 평가하였으며, oriV의 경우에는 iteron과 같은 repeat sequence가 존재하는 것으로 알려져 있어 repeat sequence 검색을 수행하고, oriT는 stem-loop 구조가 형성되는 것으로 알려져 있어 inverted repeat finder를 활용하여 검색하였다.
상기 검색 결과를 통해, Methylomonas sp. DH-1의 native vector (GenBank: CP014361)의 91,232 ~ 92,018 bp 서열에서, 전체 plasmid 평균(GC ratio 51.66%) 보다 낮은 GC ratio(37.61%)를 나타내며, internal repeat sequence가 존재하는 것을 알 수 있었다.
또한, Methylomonas sp. DH-1의 native vector (GenBank: CP014361)의 91,232 ~ 92,018 bp 서열을, 다른 Methylomonas 균주(M. methanica R-45363, M. Koyame R-49807, M. koyame R-45383)의 episomal plasmid 서열과 conservation하여 그 결과를 도 2에 나타내었다.
이러한 결과를 통해 Methylomonas sp. DH-1의 native vector (GenBank: CP014361)의 91,232 ~ 92,018 bp 서열이 복제원점(replication origin)으로 작동할 수 있는 서열임을 알 수 있었다. Methylomonas sp. DH-1의 native vector (GenBank: CP014361)의 91,232 ~ 92,018 bp의 염기 서열을 서열번호 2로 나타내었으며, 이를 DH-1의 putative origin 서열이라 명명하였다. 상기 DH-1의 putative origin 서열 주위의 단백질 암호화 유전자는 도 3에 도시된 것과 같다.
[
실시예
2: 셔틀 벡터
pDEEK
-1의 제작]
DH-1의 putative origin 서열(서열번호 2)을 이용하여 메타노트로프(Methanotroph) 및 대장균(E. coli)에서 동시에 사용 가능한 셔틀 벡터를 제작하였다.
대장균(E. coli)에서 작동하는 복제원점(replication origin)인 ColE1 origin 서열과 Methylomonas sp. DH-1에서 작동할 수 있는 DH-1의 putative origin 서열(서열번호 2)을 동시에 포함할 수 있도록 셔틀 벡터를 설계하였다.
구체적으로, eGFP 서열을 가지는 수정된 pAWP78 vector를 backbone으로 하여 DH-1의 putative origin 서열(서열번호 2)과 plasmid replication 에 관여할 수 있는 kfrA 유전자의 서열(서열번호 3)을 cloning하여 집어 넣어 셔틀 벡터를 제작하고, 제작된 셔틀 벡터를 pDEEK-1으로 명명하였다.
이와 같이 제작된 pDEEK-1에 제한효소(Sac II, EcoR I/Pst I)를 처리한 후 전기 영동 하고, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에서 확인 되듯이, pDEEK-1은 약 7250 bp의 크기를 갖는 것을 알 수 있었다. pDEEK-1를 DNA 서열분석 기기를 이용하여 분석한 결과, 전체 염기서열은 7232 bp의 길이를 갖는 것을 확인(서열번호 1)하였고, pDEEK-1의 유전자 개열지도는 도 1에 도시하였다.
[
실시예
3: 셔틀 벡터
pDEEK
-
1를
이용한 형질전환 및 미생물 내
pDEKK
-1 존재 확인]
메틸로모나스 속(Methylomonas sp.) DH-1은 KCTC 생물자원센터(정읍, 대한민국)에서 분양 받아 사용하였다(KCTC18400P). 전기천공법을 통해, pDEEK-1으로 Methylomonas sp. DH-1을 형질전환 하였다.
형질전환 된 Methylomonas sp. DH-1내에 pDEEK-1가 존재하는지 확인하기 위해, nitrate-mineral-salts(NMS)배지(liter당; 1 g MgSO4·7H2O, 1 g KNO3, 0.2 g CaCl2·H2O, 0.0038 g Fe-EDTA, 0.0005 g NaMo·4H2O)에 kanamycin을 50 ug/ml을 첨가하고 형질전환 된 Methylomonas sp. DH-1를 30℃에서 배양하였다.
배양 후, 프라이머 oriV of DH-1_F(5'-CGGAAAAGATCCGTCGACGACGGCCTCCATCAATTTG-3', 서열번호 4), 프라이머 KfrA_FP(5'-ACCGCGGTGGAGCTCCTGTTATCGCCTCCGAAGCAATTTC-3', 서열번호 5)를 이용하여 colony PCR 수행하였다. PCR product를 전기 영동 하고 그 결과를 도 5에 나타내었다(도 5의 Lane M은 Marker를 의미한다).
도 5에서 확인 되듯이, Methylomonas sp. DH-1내에 셔틀 벡터 pDEEK-1 존재 시 예상되는 3.9 kb 크기의 밴드를 Lane 1, 4, 5, 9에서 확인할 수 있었으며, Lane 2에서 miniprep을 통한 Methylomonas sp. DH-1내에 셔틀 벡터 pDEEK-1의 존재를 확인할 수 있었다.
또한, 형질전환 되어 배양된 Methylomonas sp. DH-1에 프라이머 pAW78_krfA_RP(5'-CAGGAGCTCCACCGCGGTATAAAC-3', 서열번호 6), 프라이머 KfrA_FP(5'-ACCGCGGTGGAGCTCCTGTTATCGCCTCCGAAGCAATTTC-3', 서열번호 5)를 이용하여 colony PCR 수행하였다. PCR product를 전기 영동 하고 그 결과를 도 6에 나타내었다(도 6의 Lane M은 Marker를 의미한다). 도 6의 lane 3은 NMS 배지에 cell culture 후 miniprep을 통해 분리된 pDEEK-1을 template로 하여 PCR을 수행한 결과이다.
도 6에서 확인 되듯이, Methylomonas sp. DH-1내에 셔틀 벡터 pDEEK-1 존재 시 예상되는 7.2 kb 크기의 밴드를 Lane 1, 2에서 확인할 수 있었으며, Lane 3에서 miniprep을 통한 Methylomonas sp. DH-1내에 셔틀 벡터 pDEEK-1의 존재를 확인할 수 있었다.
도 5 및 6의 결과를 통해, 형질전환된 Methylomonas sp. DH-1내에 셔틀 벡터 pDEEK-1가 존재하는 것을 확인할 수 있었다.
<110> Korea Institute of Energy Research
<120> A novel Methanotroph-E.coli shuttle vector from Methanotroph
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<160> 6
<170> KoPatentIn 3.0
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<211> 7232
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Shuttle vector pDEKK-1
<400> 1
tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc 60
cctgattctg tgggaattct gagctgttga caattaatca tcggctcgta taatgtgtgg 120
tctagagagc ggataacaat ttcacacata cactgttaaa ggagatctca tatggtgagc 180
aagggcgagg agctgttcac cggggtggtg cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta 240
aacggccaca agttcagcgt gtccggcgag ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg 300
accctgaagt tcatctgcac caccggcaag ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc 360
accctgacct acggcgtgca gtgcttcagc cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac 420
ttcttcaagt ccgccatgcc cgaaggctac gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac 480
gacggcaact acaagacccg cgccgaggtg aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc 540
atcgagctga agggcatcga cttcaaggag gacggcaaca tcctggggca caagctggag 600
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cagcagaaca cccccatcgg cgacggcccc gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc 780
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ggcatcaaat aaaacgaaag gctcagtcga aagactgggc ctttcgtttt atctgttttt 960
gtcggtgaac gctctctact agagtcacac tggctcacct tcgggtgggc ctttctgcgt 1020
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ctattcaacc gaaatcgaag gcaagcataa gcaagtcact ggtggcctgg ttctttcatt 1200
atttgtgtca ttcgtttttc actaatttga cactctttcc actttttgtg gcaaccgaca 1260
aatcaggatg gtgtgagatg tgaagcgtgg gaattaactt tctttcttac tttctttatt 1320
tcttttaata tgtcaaactc ctgccgtcgc agttgattcc gaatgggagt tcgccatgca 1380
agcagaagac tttgaatcca gtttgggtcg ccccgccgat attaccgacg accaaattat 1440
cgaagccggc aaggcgttga cgaaggcgaa tcggaatgtc accggatttg cgttacgcaa 1500
gctaaccggc ggcggcgatc cgaagcggct caaagaggtt tgggacaggc acaatgccac 1560
tcaagcggtg acaaattcgg agcccgtcgt cgagttgccg ctggaagtgg ccgaaagctt 1620
ggcggtgttg accaaggggt tggtcgacaa aattaacgtg ttagcgctgg aactgaatga 1680
cagagcggtc aaaacccaag agcggcgggt agctgatgtg ttgcgagcgg cgcgcgaaca 1740
gcaagtccaa tcagagcgcg agctggctga tgcctcgcag gcggtcgatg aattggagac 1800
catgctgacg gatgagaagg ccagggtggg ggagttgacc aaacgcttga ccgacgcgca 1860
ggccgcgaac cagttacagg cggttgagct agctaccttg cgcgaacgat tggaggcggt 1920
cgagaagaac gcgcaggcag caaccgaaca gcatgaagca gagcaagcca ggctgcggca 1980
acaggtgacg gctcagaaac aagccgccga atctatcgca gccgagcgag accaattgaa 2040
aacggagttg accaaactgc agaccaaagt ggaaaccgcg gaggaacagc gaaaggagga 2100
acgacaaaga gccgctgcgg aacttcaacg tatgggcgaa aagctgatta agctcgaagc 2160
tgaaacagat cgcgctaaaa cagaggctgg caacgcgcga gaacaggttg cgcttctaac 2220
aggccaatta acggccacga aaacacaggt cgaacagtta atgaaagcta ttggtaatta 2280
gttgtcggga agatgcgtga tctgatcctt caactcagca aaagttcgat ttattcaaca 2340
aagccgccgt cccgtcaagt cagcgtaatg ctctgccagt gttacaacca attaaccaat 2400
tctgattaga aaaactcatc gagcatcaaa tgaaactgca atttattcat atcaggatta 2460
tcaataccat atttttgaaa aagccgtttc tgtaatgaag gagaaaactc accgaggcag 2520
ttccatagga tggcaagatc ctggtatcgg tctgcgattc cgactcgtcc aacatcaata 2580
caacctatta atttcccctc gtcaaaaata aggttatcaa gtgagaaatc accatgagtg 2640
acgactgaat ccggtgagaa tggcaaaagc ttatgcattt ctttccagac ttgttcaaca 2700
ggccagccat tacgctcgtc atcaaaatca ctcgcatcaa ccaaaccgtt attcattcgt 2760
gattgcgcct gagcgagacg aaatacgcga tcgctgttaa aaggacaatt acaaacagga 2820
atcgaatgca accggcgcag gaacactgcc agcgcatcaa caatattttc acctgaatca 2880
ggatattctt ctaatacctg gaatgctgtt ttcccgggga tcgcagtggt gagtaaccat 2940
gcatcatcag gagtacggat aaaatgcttg atggtcggaa gaggcataaa ttccgtcagc 3000
cagtttagtc tgaccatctc atctgtaaca tcattggcaa cgctaccttt gccatgtttc 3060
agaaacaact ctggcgcatc gggcttccca tacaatcgat agattgtcgc acctgattgc 3120
ccgacattat cgcgagccca tttataccca tataaatcag catccatgtt ggaatttaat 3180
cgcggcctcg agcaagacgt ttcccgttga atatggctca taacacccct tgtattactg 3240
tttatgtaag cagacagttt tattgttcat gatgatatat ttttatcttg tgcaatgtaa 3300
catcagagat tttgagacac aacgtggctt tcgacttccg gcaagctata cgcgccctag 3360
aattgtcaat tttaatcctc tgtttatcgg cagttcgtag agcgcgccgt gcgtcccgag 3420
cgatactgag cgaagcaagt gcgtcgagca gtgcccgctt gttcctgaaa tgccagtaaa 3480
gcgctggctg ctgaaccccc agccggaact gaccccacaa ggccctagcg tttgcaatgc 3540
accaggtcat cattgaccca ggcgtgttcc accaggccgc tgcctcgcaa ctcttcgcag 3600
gcttcgccga cctgctcgcg ccacttcttc acgcgggtgg aatccgatcc gcacatgagg 3660
cggaaggttt ccagcttgag cgggtacggc tcccggtgcg agctgaaata gtcgaacatc 3720
cgtcgggccg tcggcgacag cttgcggtac ttctcccata tgaatttcgt gtagtggtcg 3780
ccagcaaaca gcacgacgat ttcctcgtcg atcaggacct ggcaacggga cgttttcttg 3840
ccacggtcca ggacgcggaa gcggtgcagc agcgacaccg attccaggtg cccaacgcgg 3900
tcggacgtga agcccatcgc cgtcgcctgt aggcgcgaca ggcattcctc ggccttcgtg 3960
taataccggc cattgatcga ccagcccagg tcctggcaaa gctcgtagaa cgtgaaggtg 4020
atcggctcgc cgataggggt gcgcttcgcg tactccaaca cctgctgcca caccagttcg 4080
tcatcgtcgg cccgcagctc gacgccggtg taggtgatct tcacgtcctt gttgacgtgg 4140
aaaatgacct tgttttgcag cgcctcgcgc gggattttct tgttgcgcgt ggtgaacagg 4200
gcagagcggg ccgtgtcgtt tggcatcgct cgcatcgtgt ccggccacgg cgcaatatcg 4260
aacaaggaaa gctgcatttc cttgatctgc tgcttcgtgt gtttcagcaa cgcggcctgc 4320
ttggcctcgc tgacctgttt tgccaggtcc tcgccggcgg tttttcgctt cttggtcgtc 4380
atagttcctc gcgtgtcgat ggtcatcgac ttcgccaaac ctgccgcctc ctgttcgaga 4440
cgacgcgaac gctccacggc ggccgatggc gcgggcaggg cagggggagc cagttgcacg 4500
ctgtcgcgct cgatcttggc cgtagcttgc tggaccatcg agccgacgga ctggaaggtt 4560
tcgcggggcg cacgcatgac ggtgcggctt gcgatggttt cggcatcctc ggcggaaaac 4620
cccgcgtcga tcagttcttg cctgtatgcc ttccggtcaa acgtccgatt cattcaccct 4680
ccttgcggga ttgccccgac tcacgccggg gcaatgtgcc cttattcctg atttgacccg 4740
cctggtgcct tggtgtccag ataatccacc ttatcggcaa tgaagtcggt cccgtagacc 4800
gtctggccgt ccttctcgta cttggtattc cgaatcttgc cctgcacgaa taccagctcc 4860
gcgaagtcgc tcttcttgat ggagcgcatg gggacgtgct tggcaatcac gcgcaccccc 4920
cggccgtttt agcggctaaa aaagtcatgg ctctgccctc gggcggacca cgcccatcat 4980
gaccttgcca agctcgtcct gcttctcttc gatcttcgcc agcagggcga ggatcgtggc 5040
atcaccgaac cgcgccgtgc gcgggtcgtc ggtgagccag agtttcagca ggccgcccag 5100
gcggcccagg tcgccattga tgcgggccag ctcgcggacg tgctcatagt ccacgacgcc 5160
cgtgattttg tagccctggc cgacggccag caggtaggcc tacaggctca tgccggccgc 5220
cgccgccttt tcctcaatcg ctcttcgttc gtctggaagg cagtacacct tgataggtgg 5280
gctgcccttc ctggttggct tggtttcatc agccatccgc ttgccctcat ctgttacgcc 5340
ggcggtagcc ggccagcctc gcagagcagg attcccgttg agcaccgcca ggtgcgaata 5400
agggacagtg aagaaggaac acccgctcgc gggtgggcct acttcaccta tcctgcccgg 5460
ctgacgccgt tggatacacc aaggaaagtc tacacgaacc ctttggcaaa atcctgtata 5520
tcgtgcgaaa aaggatggat ataccgaaaa aatcgctata atgaccccga agcagggtta 5580
tgcagcggaa aagatccgtc gacgacggcc tccatcaatt tgactgtgtg tatagtctag 5640
cacaaatcaa gaaattaagt aataaagaaa taaagaaata aagaaagtaa taaactaaac 5700
aagaaacaac gaaagaaaac aactataatg tcgagtgaca caaaaagtga aaagtgtcag 5760
ttctcaaaat tcatgaaatt tttctcacaa ttgtgaaatg aaatctcata attagtgaaa 5820
tgggctctgg attggttaac cgatggattt tttggctttg ggggaaatag gtcgcgggat 5880
agaagatttt gtctataagc atgcaaccct atgtgatggt gctgtctgct gaggcaaata 5940
atgtaaaact tctgtaaatg agattgattg ttatttgtcg ctgttaacgg gctgatgtgg 6000
gttagagcac gtcgagggcg tagcttattg aacagagagg atacagttgt cggataagac 6060
tgtaattcct atatgccctt tatggcgccc tcgggcgcca tttgcttttt gaatattgga 6120
attcattaaa aatgtaatca gggtggcgaa tacgaagagt ctcaggcaga tacaatctaa 6180
ttggctgctg cgagccggag aatcctacct acaaccagat gtcagcgtgt actttatagt 6240
gatgaactaa gttatgattc ccgacaaaaa gcgtgccaaa ttagtgaaaa actaatgaca 6300
caaataacca aaaattccga cagatatgga ataaagattg aataagttac atagtaagca 6360
ccgataaatt tagaactgtt gggtgctaat agctgacccg ctagggacgt gaagtcgatt 6420
ccttcgatgg ttagcaatca aagactcaga gtgctgtctg gagcgtgaat ctaacggtac 6480
gtatctcgat tgctcggtcg ctattcgcac tctgcgaaag ttcgtaccgc tcattcacta 6540
ggttgcgaat catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc 6600
ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct 6660
tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa 6720
ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gtccttctag 6780
tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc 6840
tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg 6900
actcaagacg atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca 6960
cacagcccag cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat 7020
gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg 7080
tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc 7140
ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc 7200
ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg cc 7232
<210> 2
<211> 787
<212> DNA
<213> Methylomonas sp.
<400> 2
gacggcctcc atcaatttga ctgtgtgtat agtctagcac aaatcaagaa attaagtaat 60
aaagaaataa agaaataaag aaagtaataa actaaacaag aaacaacgaa agaaaacaac 120
tataatgtcg agtgacacaa aaagtgaaaa gtgtcagttc tcaaaattca tgaaattttt 180
ctcacaattg tgaaatgaaa tctcataatt agtgaaatgg gctctggatt ggttaaccga 240
tggatttttt ggctttgggg gaaataggtc gcgggataga agattttgtc tataagcatg 300
caaccctatg tgatggtgct gtctgctgag gcaaataatg taaaacttct gtaaatgaga 360
ttgattgtta tttgtcgctg ttaacgggct gatgtgggtt agagcacgtc gagggcgtag 420
cttattgaac agagaggata cagttgtcgg ataagactgt aattcctata tgccctttat 480
ggcgccctcg ggcgccattt gctttttgaa tattggaatt cattaaaaat gtaatcaggg 540
tggcgaatac gaagagtctc aggcagatac aatctaattg gctgctgcga gccggagaat 600
cctacctaca accagatgtc agcgtgtact ttatagtgat gaactaagtt atgattcccg 660
acaaaaagcg tgccaaatta gtgaaaaact aatgacacaa ataaccaaaa attccgacag 720
atatggaata aagattgaat aagttacata gtaagcaccg ataaatttag aactgttggg 780
tgctaat 787
<210> 3
<211> 906
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> kfrA
<400> 3
atgcaagcag aagactttga atccagtttg ggtcgccccg ccgatattac cgacgaccaa 60
attatcgaag ccggcaaggc gttgacgaag gcgaatcgga atgtcaccgg atttgcgtta 120
cgcaagctaa ccggcggcgg cgatccgaag cggctcaaag aggtttggga caggcacaat 180
gccactcaag cggtgacaaa ttcggagccc gtcgtcgagt tgccgctgga agtggccgaa 240
agcttggcgg tgttgaccaa ggggttggtc gacaaaatta acgtgttagc gctggaactg 300
aatgacagag cggtcaaaac ccaagagcgg cgggtagctg atgtgttgcg agcggcgcgc 360
gaacagcaag tccaatcaga gcgcgagctg gctgatgcct cgcaggcggt cgatgaattg 420
gagaccatgc tgacggatga gaaggccagg gtgggggagt tgaccaaacg cttgaccgac 480
gcgcaggccg cgaaccagtt acaggcggtt gagctagcta ccttgcgcga acgattggag 540
gcggtcgaga agaacgcgca ggcagcaacc gaacagcatg aagcagagca agccaggctg 600
cggcaacagg tgacggctca gaaacaagcc gccgaatcta tcgcagccga gcgagaccaa 660
ttgaaaacgg agttgaccaa actgcagacc aaagtggaaa ccgcggagga acagcgaaag 720
gaggaacgac aaagagccgc tgcggaactt caacgtatgg gcgaaaagct gattaagctc 780
gaagctgaaa cagatcgcgc taaaacagag gctggcaacg cgcgagaaca ggttgcgctt 840
ctaacaggcc aattaacggc cacgaaaaca caggtcgaac agttaatgaa agctattggt 900
aattag 906
<210> 4
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer oriV of DH-1_F
<400> 4
cggaaaagat ccgtcgacga cggcctccat caatttg 37
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer KfrA_FP
<400> 5
accgcggtgg agctcctgtt atcgcctccg aagcaatttc 40
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer pAW78_krfA_RP
<400> 6
caggagctcc accgcggtat aaac 24
Claims (8)
- 서열번호 1의 염기 서열로 이루어지는 셔틀 벡터 pDEKK-1.
- 제1항에 있어서,
상기 셔틀 벡터는 메타노트로프(Methanotroph) 및 대장균에서 동시에 벡터의 역할을 수행할 수 있는 것을 특징으로 하는 셔틀 벡터 pDEKK-1.
- 제1항에 있어서,
상기 셔틀 벡터는 도 1의 개열지도를 갖는 것을 특징으로 하는 셔틀 벡터 pDEKK-1.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 셔틀 벡터에 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 삽입한 재조합 백터.
- 제1항의 셔틀 백터 pDEEK-1로 형질전환된 형질전환체.
- 제5항에 있어서,
상기 형질전환체는 메타노트로프(Methanotroph) 또는 대장균인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
- 제6항에 있어서,
상기 메타노트로프(Methanotroph)는 메틸로모나스 속(Methylomonas sp.) DH-1인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
- 서열번호 1의 염기 서열로 이루어지는 셔틀 벡터 pDEKK-1를 제조하는 단계;
상기 셔틀 벡터 pDEEK-1에 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 삽입시켜 재조합 벡터를 제조하는 단계; 및
상기 재조합 벡터를 미생물에 도입하는 단계;를 포함하는 형질전환 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020190028374A KR102123512B1 (ko) | 2019-03-12 | 2019-03-12 | 메타노트로프(Methanotroph)에서 유래한 신규 메타노트로프-대장균 셔틀 벡터 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020190028374A KR102123512B1 (ko) | 2019-03-12 | 2019-03-12 | 메타노트로프(Methanotroph)에서 유래한 신규 메타노트로프-대장균 셔틀 벡터 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR102123512B1 true KR102123512B1 (ko) | 2020-06-16 |
Family
ID=71141709
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020190028374A KR102123512B1 (ko) | 2019-03-12 | 2019-03-12 | 메타노트로프(Methanotroph)에서 유래한 신규 메타노트로프-대장균 셔틀 벡터 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102123512B1 (ko) |
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-
2019
- 2019-03-12 KR KR1020190028374A patent/KR102123512B1/ko active IP Right Grant
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