KR102113555B1 - 카르복실산 또는 디카르복실산 또는 이들의 모노에스테르로부터의 아민 및 디아민의 제조 - Google Patents

카르복실산 또는 디카르복실산 또는 이들의 모노에스테르로부터의 아민 및 디아민의 제조 Download PDF

Info

Publication number
KR102113555B1
KR102113555B1 KR1020157019188A KR20157019188A KR102113555B1 KR 102113555 B1 KR102113555 B1 KR 102113555B1 KR 1020157019188 A KR1020157019188 A KR 1020157019188A KR 20157019188 A KR20157019188 A KR 20157019188A KR 102113555 B1 KR102113555 B1 KR 102113555B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cell catalyst
whole cell
acid
recombinant
formula
Prior art date
Application number
KR1020157019188A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20150100752A (ko
Inventor
스테펜 샤퍼
자스민 코르탈스
미르야 베셀
한스-게오르크 헨네만
하랄트 해거
미하엘 폴란트
마틴 루스
Original Assignee
에보니크 오퍼레이션즈 게엠베하
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 에보니크 오퍼레이션즈 게엠베하 filed Critical 에보니크 오퍼레이션즈 게엠베하
Publication of KR20150100752A publication Critical patent/KR20150100752A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102113555B1 publication Critical patent/KR102113555B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/001—Amines; Imines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12N9/0016—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD or NADP as acceptor (1.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1096—Transferases (2.) transferring nitrogenous groups (2.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1288—Transferases for other substituted phosphate groups (2.7.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C12Y102/01—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.2.1)
    • C12Y102/01042—Hexadecanal dehydrogenase (acylating) (1.2.1.42), i.e. fatty acyl-CoA reductase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y104/00—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12Y104/01—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.4.1)
    • C12Y104/01001—Alanine dehydrogenase (1.4.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y113/00—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13)
    • C12Y113/11—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13) with incorporation of two atoms of oxygen (1.13.11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/08—Transferases for other substituted phosphate groups (2.7.8)
    • C12Y207/08007—Holo-[acyl-carrier-protein] synthase (2.7.8.7)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/582—Recycling of unreacted starting or intermediate materials

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Catalysts (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 재조합 α-디옥시게나제, 또는 재조합 지방산 리덕타제와 이 지방산 리덕타제를 포스포판테테이닐화하는 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제와의 조합을 발현하고, α-디옥시게나제 및/또는 지방산 리덕타제와 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제의 조합 이외에 트랜스아미나제를 발현하며, 여기서 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 및/또는 트랜스아미나제는 바람직하게는 재조합인 전세포 촉매에 관한 것이다. 본 발명은 또한 카르복실산 또는 디카르복실산 또는 이들의 모노에스테르를 포스포판테테이닐화 지방산 리덕타제 또는 α-디옥시게나제와 접촉시키는 단계 및 생성물을 트랜스아미나제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 카르복실산 또는 디카르복실산 또는 이들의 모노에스테르를 아민 또는 디아민으로 전환시키는 방법에 관한 것이다.

Description

카르복실산 또는 디카르복실산 또는 이들의 모노에스테르로부터의 아민 및 디아민의 제조 {PREPARATION OF AMINES AND DIAMINES FROM A CARBOXYLIC ACID OR DICARBOXYLIC ACID OR A MONOESTER THEREOF}
본 발명은 재조합 α-디옥시게나제, 및/또는 재조합 지방산 리덕타제와 이 지방산 리덕타제를 포스포판테테이닐화하는 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제와의 조합을 발현하고, 추가로 트랜스아미나제를 발현하며, 여기서 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 및/또는 트랜스아미나제는 바람직하게는 재조합인 전세포 촉매, 및 또한, 카르복실산 또는 디카르복실산 또는 이들의 모노에스테르를 포스포판테테이닐화 지방산 리덕타제 또는 α-디옥시게나제와 접촉시키는 단계 및 생성물을 트랜스아미나제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 카르복실산 또는 디카르복실산 또는 이들의 모노에스테르를 아민 또는 디아민으로 전환시키는 방법에 관한 것이다.
폴리아미드는 반복되는 아미드 기를 특징으로 하는 중합체의 한 부류이다. 화학적으로 관련된 단백질과는 대조적으로, 용어 "폴리아미드"는 보통 합성의 상업적으로 입수가능한 열가소성 중합체와 관련된다. 폴리아미드는 분해된 탄화수소를 통해 통상적으로 수득되는 1급 아민 또는 2급 아민으로부터 유도된다. 그러나, 중합체를 제조하기 위해 유도체, 보다 정확하게는 아미노카르복실산, 락탐 및 디아민을 사용하는 것이 또한 가능하다. 또한 재생가능한 원료로부터 출발하여 생명공학적 방법에 의해 수득할 수 있는 단쇄 기체상 알칸이 출발 물질로서 관심의 대상이다.
상기 아민 및 디아민의 통상적인 화학적-공업적 제조는 화석 원료의 공급에 의존적이고, 비효율적이며, 그 방법에서 다량의 바람직하지 않은 부산물이 생성되는데, 일부 합성 단계에서는 80%까지 생성된다. 이러한 방법의 예는 라우로락탐의 제조이다. 통상적으로, 이것은 낮은 수율을 전달할 뿐만 아니라 동시에 복잡한 기반구조의 제공을 필요로 하는 다중-단계 방법을 통해 수행된다.
상기 단점을 고려하여, 재생가능한 원료로부터 출발하여 생체촉매를 사용하여 아민 및 디아민을 수득하기 위한 방법이 개발되어 왔다. 적합한 재생가능한 원료는 특히 지방산의 공급원이며, 이는 평지씨 오일, 공엉겅퀴 오일, 팜핵 오일, 코코넛 오일, 해바라기핵 오일 및 다수의 생물학적 공급원으로부터의, 특히 식물로부터의 유사한 천연 생성물의 형태로 수득될 수 있다.
PCT/EP2008/067447은 일련의 적합한 효소 활성을 가지며 카르복실산을 상응하는 ω-아미노카르복실산으로 전환시킬 수 있는 세포를 사용하여 화학적으로 관련된 생성물, 보다 정확하게는 ω-아미노카르복실산을 제조하기 위한 생명공학적 시스템을 기재하고 있다. 이 방법은 효소 촉매 반응의 캐스케이드, 보다 특히 지방산의 말단 탄소 원자에서의 알데히드로의 산화, 및 트랜스아미나제 및 아민 공여자로서의 아미노산 (아미노산 데히드로게나제를 통해 재생성될 수 있음)을 사용한 후속 아미노화를 포함한다.
그러나, 이에 사용되는 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) GPO1로부터의 AlkBGT 옥시다제 시스템의 공지된 단점은 이것이 지방족 알칸의 1급 알콜로의 선택적 산화를 수행할 수 없다는 것이다. 오히려, 다수의 산화 생성물이 형성되는데, 특히 상응하는 알데히드, 케톤 또는 상응하는 카르복실산과 같은 보다 고도로 산화된 생성물의 비율이 반응 시간이 증가함에 따라 증가하며 (C. Grant, J. M. Woodley and F. Baganz (2011), Enzyme and Microbial Technology 48, 480-486), 이는 상응하게 목적 아민의 수율을 감소시킨다.
상대적으로 비선택적인 산화의 문제는 상응하는 산화 생성물이 구조적으로 매우 유사하다는 사실에 의해 악화된다. 이는 목적 산화 생성물로부터 그들을 효율적으로 및 유의한 수율 손실없이 분리 제거하는 것이 매우 어렵다는 것을 의미한다.
이 방법의 추가의 단점은 과산화된 부산물, 예를 들어 반응물로 사용된 지방산의 디카르복실산, PCT/EP2011/071491에 따라 수성 반응 혼합물로부터 생성물의 제거에 사용될 수 있는 소수성 용매 및 소수성 액체 양이온 교환체의 재순환이 공급원 이용에 있어서의 효율에 손상을 준다는 것이다.
이와 관련하여, PCT/EP2008/067447에 기재된 것과 같은 반응 캐스케이드를 갖는 생명공학적 시스템의 복잡성 (여기서 각각의 반응은 특정한 효소에 의해 촉매됨)이 반응 조건을 최적화하는 것을 어렵게 만든다는 것이 강조되어야 한다. 예를 들어, 생성물로서 근본적으로 반응성인 ω-아미노 지방산의 경우에, 세포의 내부에서 특정 임계 농도로부터 이들이 유기체의 필수 구성성분과 반응하여 그에 따라 독성 효과를 갖게 될 가능성이 있다. 이러한 경우에, 유기체의 성장 및 합성 능력은 줄곧 손상되어 세포 사멸에 이르게 되며, 이때 개발자는 독성을 즉시 인지할 수 없거나 심지어 이를 특정한 반응물, 중간 생성물 또는 생성물에 배정할 수도 없다. 어느 유기체가 어느 농도의 화학적 반응성 물질을 용인할 것인지는 마찬가지로 예측가능하지 않다.
또한 생성물 수율의 개선 및 부산물 발달의 감소와 관련하여, 통상의 기술자는 PCT/EP2008/067447에 기재된 것과 같은 시스템에서 제한 및 임계 인자를 통상적으로 확인할 수 없다. 생성물의 수율이 너무 낮다면, 이는 효소 중 하나가 과도하게 낮은 농도로 존재한다는 사실 때문일 수 있지만, 가능한 효소 중 어느 것이 이것인지 알 수 없으며, 즉 불충분한 합성능으로 인해 반응물이 의도된 기간 내에 또는 경쟁 효소에 의한 분해 전에 전환되지 않는다. 대안적으로, 효소는 사실상 세포에서 폴리펩티드의 형태로 검출가능하지만, 구체적으로 이 세포에서, 활성에 필수적인 폴딩을 가지고 있지 않거나 또는 지금까지 알려지지 않았지만 활성에 필수적인 보조인자가 결핍되어 있다는 것이 분명히 가능하다. 유사하게, 이미 언급된 바와 같이, 대사 산물이 세포에 대해 독성이거나 또는 분해될 수 있다. 마지막으로, 내인성 효소, 즉 전세포 촉매로서 사용된, 세포에 천연적으로 존재하는 효소와의 상호작용을 방해하는 것이 예상되어야 한다.
따라서, 효소 촉매 반응이 보다 선택적으로 진행되고 바람직하지 않은 부산물의 형성이 최소화되는, 지방산으로부터 알킬 모노아민 및 디아민을 제조하는 방법에 대한 필요성이 존재한다.
이러한 배경기술에 대하여, 본 발명의 목적은 수율, 탄소 및/또는 질소 균형 및/또는 순도와 관련하여 가능한 한 효율적인, 지방산으로부터 알킬 모노아민 및 디아민을 제조하는 생명공학적 방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 수율, 탄소 및/또는 질소 균형, 사용된 작용제의 재사용성 및/또는 생성물의 순도와 관련하여 가능한 한 효율적인, 지방산으로부터 알킬 모노아민 및 디아민을 제조하는 생명공학적 방법을 제공하는 것이다. 이와 관련하여, 효율적인 탄소 및/또는 질소 균형은 바람직하게는 카르복실산 또는 카르복실산 에스테르의 전환을 위해 적합한 기질의 형태로 세포에 공급되는 매우 높은 비율의 탄소 및/또는 질소가, 예를 들어 목적하는 생성물 이외의 다른 생성물로 전환되는 것 대신에, 목적하는 최종 생성물로 회수되는 것을 의미하는 것으로 이해된다.
또한 본 발명의 목적은, 특히 사용된 소수성 용매 및 액체 양이온 교환체의 후처리에 관련된 재사용성과 관련하여, 및 또한 수성 상 (여기서 카르복실산 또는 카르복실산 에스테르의 전환이 진행됨) 및 유기 상 (유기 용매 및/또는 액체 양이온 교환체를 함유함)을 포함하는 2상 시스템에서의 상 형성 및 분리와 관련하여, 후처리될 지방산으로부터 알킬 모노아민 및 디아민을 제조하는데 있어서 다중-상 반응 혼합물의 능력을 개선하는 것이다.
이들 및 추가의 목적은 본원의 대상에 의해 및 특히 또한 첨부된 독립항 (종속항은 본 발명의 실시양태를 구체화함)에 의해 달성된다.
제1 측면에서, 본 발명의 근본적인 목적은 재조합 α-디옥시게나제, 또는 재조합 지방산 리덕타제와 이 지방산 리덕타제를 포스포판테테이닐화하는 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제와의 조합을 발현하고, 추가로 트랜스아미나제를 발현하며, 여기서 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 및/또는 트랜스아미나제는 바람직하게는 재조합인 전세포 촉매에 의해 달성된다.
제1 측면의 제1 실시양태에서, 상기 목적은 바람직하게는 재조합인 아미노산 데히드로게나제를 추가로 발현하는 전세포 촉매에 의해 달성된다.
또한 제1 실시양태의 한 실시양태인 제2 실시양태에서, 상기 목적은 바람직하게는 재조합인 알칸 히드록실라제를 추가로 발현하는 전세포 촉매에 의해 달성된다.
또한 제1 내지 제2 실시양태의 한 실시양태인 제3 실시양태에서, 상기 목적은 바람직하게는 재조합인 AlkL 패밀리의 폴리펩티드를 추가로 발현하는 전세포 촉매에 의해 달성된다.
또한 제2 실시양태의 한 실시양태인 제4 실시양태에서, 상기 목적은 바람직하게는 재조합인 알콜 데히드로게나제를 추가로 발현하는 전세포 촉매에 의해 달성된다.
또한 제1 내지 제4 실시양태의 한 실시양태인 제5 실시양태에서, 상기 목적은 β-산화에 관여하는 적어도 하나의 효소의 활성이 전세포 촉매의 야생형에 비해 감소되는 것인 전세포 촉매에 의해 달성된다.
또한 제1 내지 제5 실시양태의 한 실시양태인 제6 실시양태에서, 상기 목적은 BioH 또는 그의 변이체의 활성이 전세포 촉매의 야생형에 비해 감소되거나 상승되는 것인 전세포 촉매에 의해 달성된다.
또한 제1 내지 제6 실시양태의 한 실시양태인 제7 실시양태에서, 상기 목적은 FadL 또는 그의 변이체의 활성이 전세포 촉매의 야생형에 비해 상승되는 것인 전세포 촉매에 의해 달성된다.
제2 측면에서, 본 발명의 근본적인 목적은
a) 카르복실산 또는 디카르복실산 또는 이들의 모노에스테르를 제공하며, 디카르복실산의 경우에, 바람직하게는 카르복실산을 알칸 히드록실라제 및/또는 알콜 데히드로게나제와 접촉시킴으로써 제공하는 단계,
b) 카르복실산 또는 디카르복실산 또는 이들의 모노에스테르를 포스포판테테이닐화 지방산 리덕타제 또는 α-디옥시게나제와 접촉시켜 알데히드 생성물을 형성하는 단계, 및
c) 단계 a)로부터의 생성물을 트랜스아미나제와 접촉시키는 단계
를 포함하는, 카르복실산 또는 디카르복실산 또는 이들의 모노에스테르를 아민 또는 디아민으로 전환시키는 방법에 의해 달성된다.
제2 측면에서, 본 발명의 근본적인 목적은 아미노산 데히드로게나제가 단계 c)에 존재하는 것인 방법에 의해 달성된다.
제2 측면의 제1 실시양태에서, 상기 목적은 포스포판테테이닐화 지방산 리덕타제, α-디옥시게나제, 트랜스아미나제, 아미노산 데히드로게나제 및 알칸 히드록실라제를 포함하는 군으로부터의 적어도 하나의 효소, 바람직하게는 상기 군으로부터의 사용되는 모든 효소가 본 발명의 제1 측면의 전세포 촉매의 형태로 제공되는 것인 방법에 의해 달성된다.
또한 제1 실시양태의 한 실시양태인 제2 실시양태에서, 상기 목적은 카르복실산 또는 디카르복실산 또는 이들의 모노에스테르가 하기 화학식 I의 화합물인 방법에 의해 달성된다.
<화학식 I>
R1 - A - COOR2
상기 식에서,
R1은 -H 및 COOR3을 포함하는 군으로부터 선택되고,
R2 및 R3은 각각 독립적으로 H, 메틸, 에틸 및 프로필을 포함하는 군으로부터 선택되며,
단 라디칼 R2 및 R3 중 적어도 하나는 H이고,
A는 적어도 4개의 탄소 원자를 갖는 비분지형, 분지형, 선형, 시클릭, 치환 또는 비치환된 탄화수소 기이다.
또한 제1 내지 제2 실시양태의 한 실시양태인 제3 실시양태에서, 상기 목적은 A가 화학식 -(CH2)n-을 가지며, 여기서 n은 적어도 4, 바람직하게는 적어도 10인 방법에 의해 달성된다.
제3 측면에서, 본 발명의 근본적인 목적은 지방산, ω-히드록시 지방산, ω-옥소 지방산 또는 이들의 모노에스테르를 아미노화하기 위한 제1 측면에 따른 전세포 촉매 또는 제2 측면에 따른 방법을 사용하여 달성된다.
제4 측면에서, 본 발명의 근본적인 목적은 수용액 중 제1 측면에 따른 전세포 촉매 및 또한 하기 화학식 I의 지방산, ω-히드록시 지방산, ω-옥소 지방산 또는 이들의 모노에스테르를 포함하는 반응 혼합물에 의해 달성된다.
<화학식 I>
R1 - A - COOR2
상기 식에서,
R1은 -H, -CHO, -OH 및 COOR3을 포함하는 군으로부터 선택되고,
R2 및 R3은 각각 독립적으로 H, 메틸, 에틸 및 프로필을 포함하는 군으로부터 선택되며,
단 라디칼 R2 및 R3 중 적어도 하나는 H이고,
A는 적어도 4개의 탄소 원자를 갖는 비분지형, 분지형, 선형, 시클릭, 치환 또는 비치환된 탄화수소 기, 바람직하게는 화학식 -(CH2)n-이며, 여기서 n은 적어도 4, 특히 바람직하게는 적어도 10이다.
본 발명은 지방산으로부터 아민 및 디아민을 제조하는데 사용되며 상응하는 효소 환경을 갖는 전세포 촉매에서 기능적으로 재조합인 지방산 리덕타제 또는 α-디옥시게나제가 놀랍게도 아민 및 디아민의 수율을 증가시킨다는 본 발명자에 의한 발견을 기초로 한다.
또한, 본 발명은 지방산으로부터 아민 및 디아민을 제조하는데 사용되며 상응하는 효소 환경을 갖는 전세포 촉매에서 기능적으로 재조합인 지방산 리덕타제 또는 α-디옥시게나제가 놀랍게도 간섭 부산물, 보다 특히 발생하는 생성물 중 디카르복실산 및 그의 에스테르 형태의 과산화 지방산의 농도를 감소시킨다는 본 발명자에 의한 발견을 기초로 한다.
또한, 본 발명은 지방산으로부터 아민 및 디아민을 제조하는데 사용되며 상응하는 효소 환경을 갖는 전세포 촉매에서 기능적으로 재조합인 지방산 리덕타제 또는 α-디옥시게나제가 전세포 촉매를 포함하는 발효 용액으로부터 아민 및 디아민을 제거하는데 사용되는 올레산과 같은 액체 양이온 교환체의 순도 및 재사용성을 개선한다는 본 발명자에 의한 발견을 기초로 한다.
본 발명은 카르복실산 또는 디카르복실산 또는 이들의 모노에스테르를 아민 또는 디아민으로 전환시키는 개선된 방법을 제공하며, 이 방법은 바람직하게는 전세포 촉매가 방법을 수행하는데 사용되는 경우에, 다양한 산화 단계를 통해 지방산을 아민으로 전달하는 것을 촉매하는 효소 이외에도, 지방산 리덕타제 또는 α-디옥시게나제가 또한 존재한다는 것이 주목할 만하다. 바람직한 실시양태에서, 본원에 사용된 용어 "지방산 리덕타제"는, 디카르복실산 또는 ω-카르복시 지방산으로도 지칭되는 ω-카르복실산이 ATP 및 NAD(P)H를 소모하면서 상응하는 ω-옥소 지방산으로 전환되는 것을 촉매하는 효소를 의미하는 것으로 이해된다. 선행 기술에서, 예를 들어 WO/2010/135624에서, ω-히드록시 지방산을 제조하기 위한 지방산 리덕타제가 기재되었지만, 이는 ω-아미노 지방산을 제조하기 위한 시스템의 일부로서가 아니다. 보다 더 바람직한 실시양태에서, 지방산 리덕타제는 아미노산 서열 YP_887275.1, ZP_11001941.1, ZP_06852401.1, NP_959974.1, YP_001070587.1, ZP_05217435.1, YP_882653.1, YP_639435.1, ZP_10800193.1, YP_006452763.1, YP_006730440.1, ZP_11196216.1, YP_005349252.1, ZP_05224908.1, YP_005338837.1, YP_006307000.1, YP_005343991.1, ZP_11001942.1, ZP_09979565.1, YP_005003162.1, YP_953393.1, YP_001850422.1, ZP_11011489.1, ZP_12689264.1, YP_905678.1, ZP_09976919.1, YP_004746059.1, NP_217106.1, YP_004525443.1, NP_337166.1, ZP_09685823.1, YP_978699.1, ZP_06437984.1, ZP_06514086.1, NP_856267.1, CAA19077.1, NP_301424.1, ZP_06522140.1, ZP_06518098.1, ZP_11008938.1, ZP_07432374.2, AAR91681.1, YP_006808747.1, YP_001851230.1, ZP_15327751.1, ZP_15455857.1, ZP_12874284.1, ZP_15332534.1, ZP_15512956.1, ZP_14244106.1, ZP_15470899.1, ZP_11439367.1, YP_001703694.1, ZP_15446742.1, YP_006808978.1, ZP_07964926.1, YP_006521379.1, ZP_10796908.1, ZP_15512957.1, ZP_12874283.1, YP_005350955.1, ZP_14243341.1, YP_001705436.1, ZP_15329649.1, YP_006522325.1, YP_006732197.1, YP_003658971.1, ZP_05227804.1, YP_001703695.1, YP_006308707.1, ZP_15342047.1, YP_006521380.1, ZP_15327752.1, YP_005340557.1, ZP_11439578.1, ZP_15392943.1, ZP_15514789.1, ZP_12996178.1, ZP_09412214.1, ZP_06849686.1, YP_889972.1, YP_006570321.1, ZP_15375693.1, YP_006308219.1, YP_006521600.1, YP_005340029.1, YP_005350457.1, ZP_11439836.1, ZP_12994664.1, ZP_14240588.1, ZP_14236860.1, ZP_09410830.1, YP_006731697.1, YP_005264225.1, YP_001704097.1, ZP_15328186.1, ZP_09402885.1, ZP_12690463.1, AFO59871.1, ZP_07966879.1, YP_118225.1, YP_001828302.1, YP_006566873.1, YP_003660169.1, ZP_15337407.1, ZP_08240521.1, ZP_10456477.1, YP_001537947.1, YP_004016539.1, ZP_07664024.1, ZP_14244107.1, ZP_09794557.1, ZP_09274211.1, ZP_05224899.1, ZP_15484175.1, AAA17105.1, ZP_11437924.1, ZP_15446621.1, YP_003646340.1, ZP_15382134.1, ZP_14237669.1, ZP_09165547.1, YP_004019203.1, ZP_14240225.1, YP_001220863.1, CBA74242.1, ZP_12994240.1, EIE27140.1, ZP_15354547.1, ZP_15432557.1, ZP_15500132.1, ZP_15478632.1, ZP_06846978.1, AAA17108.1, ZP_15333767.1, ZP_05217205.1, AAD44234.1, YP_005348984.1, YP_006306749.1, ZP_05224611.1, YP_005343772.1, YP_006730188.1, YP_882425.1, ZP_10799956.1, ZP_05045132.1, NP_960176.1, ZP_12398880.1, ZP_11192735.1, ZP_11440091.1, ZP_05217203.1, ZP_06846979.1, ZP_10800936.1, ZP_06523596.1, YP_882421.1, YP_006306748.1, YP_006522017.1, ZP_15432556.1, ZP_15354095.1, ZP_05227781.1, ZP_09684639.1, YP_006730187.1, YP_005343770.1, YP_005338616.1, YP_005348983.1, ZP_15472813.1, ZP_15457007.1, ZP_15421152.1, ZP_15488933.1, ZP_14240030.1, YP_001704825.1, ZP_15328982.1, YP_005911512.1, ZP_09411638.1, ZP_12876400.1, ZP_12995435.1, ZP_07667680.1, YP_001281387.1, EIE21044.1, ZP_15375054.1, NP_334518.1, 4DQV_A, ZP_06435375.1, YP_003030020.1, YP_976237.1, ZP_04926822.1, YP_004998149.1, YP_004743589.1, YP_005907921.1, NP_214615.1, YP_001286047.1, ZP_06515541.1, ZP_05139482.1, YP_888016.1, ZP_06452908.1, ZP_06519578.1, YP_004721827.1, CAJ77696.1, ZP_09680854.1, ZP_09686453.1, YP_884815.1, YP_884815.1, CAB55600.1, ZP_09081423.1, YP_006521568.1, ZP_11440626.1, ZP_15513309.1, ZP_09410778.1, ZP_15374248.1, ZP_15405954.1, YP_001704047.1, ZP_14236911.1, ZP_12873916.1, ZP_14242094.1, ZP_12994610.1, ZP_07664023.1, ZP_15446620.1, ZP_15484174.1, ZP_14240245.1, YP_005358845.1 및 XP_002669159.1, 보다 특히 YP_006731697.1, ZP_09839660.1, YP_001704097.1, YP_889972.1, ZP_05045132.1, ZP_09794557.1, ZP_08240521.1, NP_959974.1, ZP_10456477.1, YP_118225.1, NP_217106, YP_905678.1, YP_887275.1, ZP_11001941.1, YP_953393.1 및 YP_005349252.1 및 그의 변이체를 포함하는 지방산 리덕타제의 군으로부터 선택된다.
지방산 리덕타제는 그의 활성을 위해 포스포판테테이닐화, 즉 그 효소에 대한 포스포판테테이닐 보조인자의 공유 부착이 요구되는 효소의 군이다. 따라서, 본 발명에 따라 사용되는 지방산 리덕타제는 포스포판테테이닐화되고, 지방산 리덕타제를 발현하는 전세포 촉매는, 그의 내인성으로 발현되는 효소의 환경의 일부로서 또는 재조합 형태로, 상기 지방산 리덕타제를 포스포판테테이닐화하는 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제를 발현한다. 바람직한 실시양태에서, 본원에 사용된 용어 "포스포판테테이닐 트랜스퍼라제"는 포스포판테테이닐-CoA로부터 효소, 바람직하게는 지방산 리덕타제로 포스포판테테이닐 모이어티를 전달하는 효소를 의미하는 것으로 이해된다. 특히 바람직한 실시양태에서, 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제는 아미노산 서열 ABI83656.1, YP_006811024.1, YP_120266.1, YP_005265173.1, YP_004006671.1, ZP_08152482.1, ZP_11104141.1, ZP_14482198.1, YP_706581.1, ZP_10002626.1, ZP_09308410.1, YP_002783881.1, ZP_18276502.1, ZP_09271851.1, ZP_08204640.1, YP_002766085.1, ZP_09788717.1, ZP_09799863.1, ZP_10961877.1, YP_003273299.1, GAB86168.1, YP_006668875.1, ZP_08766535.1, ZP_09793386.1, ZP_09212827.1, ZP_09276344.1, ZP_09213870.1, ZP_09081490.1, ZP_10947586.1, YP_003658841.1, ZP_06852853.1, YP_953148.1, ZP_11011170.1, YP_639258.1, YP_886985.1, ZP_11194383.1, ZP_09681094.1, ZP_06455719.1, NP_337369.1, YP_004077819.1, NP_217310.1, YP_006452521.1, YP_005339056.1, ZP_05226335.1, ZP_07965127.1, ZP_07419314.2, NP_302077.1, YP_005003342.1, YP_005349465.1, ZP_10800435.1, ZP_06564430.1, YP_882860.1, YP_001135287.1, YP_001850220.1, ZP_05217634.1, YP_003646683.1, YP_004746246.1, ZP_15327906.1, ZP_09979035.1, YP_001703848.1, YP_906028.1, ZP_15395499.1, ZP_11438833.1, ZP_11005955.1, ZP_09410582.1, NP_961833.1, YP_001106197.1, ZP_14237113.1, YP_004085491.1, YP_003835595.1, ZP_12994399.1, YP_004523804.1, ZP_12690887.1, YP_003339468.1, ZP_06589331.1, YP_004801334.1, ZP_09974565.1, ZP_04608379.1, ZP_13037142.1, YP_712537.1, ZP_11236665.1, NP_630748.1, ZP_06527138.1, YP_003835167.1, CCH33620.1, ZP_10309401.1, ZP_08881396.1, YP_003102953.1, YP_003487252.1, ZP_08881565.1, YP_006263961.1, NP_822924.1, YP_004914569.1, ZP_09400366.1, AFV71333.1, ZP_07309518.1, ZP_09172171.1, ZP_06710898.1, CAN89630.1, ZP_06921116.1, ZP_08804003.1, ZP_19189663.1, ZP_10545589.1, YP_006248725.1, ZP_10455557.1, YP_004015869.1, ZP_08801530.1, ZP_10550999.1, YP_004492879.1, ZP_09958730.1, ZP_08286666.1, ZP_11212856.1, AAL15597.1, AAZ94407.1, ZP_19188802.1, AFF18625.1, ZP_06575404.1, AAK06801.1, ADC79635.1, YP_004080528.1, YP_004921314.1, ACY01405.1, YP_004584022.1, YP_003114157.1, YP_003203177.1, AFB69911.1, YP_006876460.1, ZP_08024798.1, YP_006269867.1, YP_006881814.1, CCK26150.1, ZP_07307765.1, ZP_07315112.1, YP_005466392.1, NP_824081.1, YP_003493882.1, ZP_06412387.1, ZP_10068239.1, ZP_08234258.1, YP_001822177.1, ZP_03979107.1, ZP_07979043.1, BAA22407.1, ZP_09402950.1, YP_003112617.1, NP_738483.1, YP_480609.1, EKX90208.1, BAE93744.1, BAB69186.1, ZP_04713061.1, YP_006881735.1, ZP_07274901.1, ZP_11379052.1, ZP_06581115.1, YP_006437406.1, ZP_12871839.1, NP_601186.1, ZP_08451808.1, YP_005057339.1, YP_005303909.1, ZP_07090824.1, YP_003783676.1, YP_004630011.1, ZP_06588772.1, AAX98203.1, AFK80329.1, ZP_08124665.1, ZP_03710365.1, AAB17877.1, ZP_07403633.1, ZP_11268660.1, ZP_07288841.1, ABV83217.1, ZP_16178576.1, AAG43513.1, ZP_09155938.1, YP_004605750.1, ZP_03918977.1, AAF71762.1, ZP_05007864.1, ZP_06836265.1, ZP_03934882.1, YP_001508477.1, ZP_06043756.1, ZP_05366306.1, YP_002835056.1, ZP_03933464.1, ZP_07469321.1, ZP_07713507.1, YP_005160553.1, NP_939820.1, AAU93794.1, ZP_14659796.1, ZP_14383679.1, YP_005058606.1, YP_001221073.1, ZP_08231568.1, YP_250920.1, ZP_11383249.1, YP_003916320.1, ZP_08681170.1, YP_001800249.1, YP_001157632.1, YP_166099.1, ZP_10088015.1, YP_004760065.1, ZP_07947675.1, YP_001603066.1, YP_003812683.1, YP_004403402.1, ZP_08292153.1, ZP_09471260.1, YP_004018108.1, ZP_05115352.1, AAD13565.1, ZP_09295321.1, YP_001535629.1, ZP_04607273.1, YP_006561753.1, ZP_00960958.1, YP_006571985.1, ZP_08862188.1, YP_002906426.1, CCK30433.1, ZP_13042493.1, ZP_09090153.1, YP_614397.1, ZP_11163860.1, YP_003983492.1, YP_004080668.1, ZP_09420475.1, ZP_05914565.1, ZP_01101149.1, ZP_14743088.1, YP_001239694.1, ZP_09127532.1, YP_003833873.1, ZP_08516197.1, ZP_10160483.1, ZP_01987188.1, ZP_01755304.1, ZP_08825027.1, ZP_05077116.1, YP_001444606.1, ZP_03392800.1, ZP_01057781.1, AFB69889.1, ZP_08815097.1 및 AAO17175.1 및 그의 변이체를 포함하는 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제의 군으로부터 선택된다. 특히 바람직한 실시양태에서, 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제는 데이터베이스 코드 ABI83656.1을 갖는 것 또는 그의 변이체이다.
지방산 리덕타제와 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제에 대한 대안으로 또는 그 이외에도, 전세포 촉매는 또한 α-디옥시게나제를 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본원에 사용된 용어 "α-디옥시게나제"는 카르복실산 및/또는 디카르복실산 또는 이들의 모노에스테르를, 산소 분자를 소모하고 이산화탄소를 제거하면서, 말단 ω-탄소 원자에 알데히드 기를 보유하고 반응물로서 사용된 카르복실산 및/또는 디카르복실산 또는 이들의 모노에스테르에 비해 말단 ω-탄소 원자에서 1개의 탄소 원자가 단축된 카르복실산 및/또는 디카르복실산 또는 이들의 모노에스테르로 전환시키는 것을 촉매하는 효소를 의미하는 것으로 이해된다. 특히 바람직한 실시양태서, α-디옥시게나제는 아미노산 서열 NP_001066718.1, EAY82977.1, BAH79993.1, ABG22011.1, BAJ90503.1, AFD04418.1, AFD04417.1, BAJ87736.1, AFW75180.1, ABG22012.1, XP_002311389.1, CAH05011.1, XP_002279884.1, CBI34957.3, AAG59584.1, NP_001234414.1, NP_001234410.1, XP_003553942.1, XP_002275161.1, XP_003553937.1, CBI34960.3, CAA07589.1, XP_003543402.1, XP_002517402.1, XP_002882184.1, NP_186791.1, AAK85133.1, CAN77070.1, XP_002529555.1, CAH64542.1, NP_001234061.1, XP_002281357.1, ADM21465.1, XP_002318527.1, NP_177509.1, CAN74266.1, XP_002888940.1, NP_001185393.1, XP_003631072.1, BAJ33800.1, XP_002517377.1, XP_003530944.1, BAJ34623.1, ABG22013.1, ABP02610.1, XP_001773135.1, XP_002960339.1, ABK95279.1, ABD73303.1, ABD73304.1, YP_001805721.1, ZP_08971815.1, ZP_08430366.1, YP_823013.1, ZP_05026427.1, ZP_11003953.1, YP_007064484.1, YP_007113008.1, YP_633369.1, ZP_18906570.1, ZP_09251410.1, ZP_10050808.1, ZP_01306662.1, YP_001516886.1, ZP_05042862.1, AAC49625.1, ZP_09648375.1, ZP_09792714.1, ZP_09788527.1, XP_001728273.1, AAC83355.1, YP_890542.1, ZP_11000891.1, XP_002605323.1, EGO58341.1, YP_006249145.1, YP_001507004.1, YP_001704637.1, ZP_12876141.1, ZP_11150830.1, ZP_14236257.1, ZP_09411385.1, ZP_14243118.1, EKD16664.1, ZP_15416799.1, ZP_15338016.1, ZP_10080295.1, ZP_11438929.1, ZP_12995210.1, ZP_10946648.1, YP_003409541.1, XP_001637870.1, YP_005451221.1, XP_001212758.1, ZP_07290489.1, ZP_05781329.1, ZP_19187748.1, ZP_06574534.1, XP_002605322.1, NP_822950.1, YP_006366425.1, EJP63377.1, EKD21217.1, XP_001795927.1, XP_003042615.1, ZP_06566152.1, EGU88116.1, EFY94417.1, XP_388327.1, EKJ68934.1, ZP_07290463.1, CCC10458.1, YP_001107201.1, XP_003348248.1, T49753, CAD31840.1, XP_001229975.1, CBN77040.1, YP_004813753.1, XP_002513273.1, XP_001627136.1, AFG52858.1, AFG52857.1, AEW08450.1, NP_841291.1, YP_004512343.1, ACG75701.1 및 ZP_03500906.1 및 그의 변이체를 포함하는 α-디옥시게나제의 군으로부터 선택된다. 특히 바람직한 실시양태에서, α-디옥시게나제는 데이터베이스 코드 NP_001066718.1을 갖는 것 또는 그의 변이체이다.
α-디옥시게나제 또는 지방산 리덕타제와 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제의 조합 이외에도, 본 발명에 따른 전세포 촉매는 말단 알데히드 기를 아미노화하는 트랜스아미나제를 가지고 있을 필요가 있다. 바람직한 실시양태에서, 본원에 사용된 용어 "트랜스아미나제"는 공여자 분자, 바람직하게는 아미노산으로부터 수용자 분자, 바람직하게는 α-케토카르복실산으로 α-아미노 기의 전달을 촉매하는 효소를 의미하는 것으로 이해된다. 특히 바람직한 실시양태에서, 트랜스아미나제는 아미노산 서열 3HMU_A, AAD41041.1, AAK15486.1, ABE03917.1, ADR60699.1, ADR61066.1, ADR62525.1, AEL07495.1, CAZ86955.1, EFW82310.1, EFW87681.1, EGC99983.1, EGD03176.1, EGE58369.1, EGH06681.1, EGH08331.1, EGH24301.1, EGH32343.1, EGH46412.1, EGH55033.1, EGH62152.1, EGH67339.1, EGH70821.1, EGH71404.1, EGH78772.1, EGH85312.1, EGH97105.1, EGP57596.1, NP_102850.1, NP_106560.1, NP_248912.1, NP_248990.1, NP_354026.2, NP_421926.1, NP_637699.1, NP_642792.1, NP_744329.1, NP_744732.1, NP_747283.1, NP_795039.1, NP_901695.1, XP_002943905.1, YP_001021095.1, YP_001059677.1, YP_001061726.1, YP_001066961.1, YP_001074671.1, YP_001120907.1, YP_001140117.1, YP_001170616.1, YP_001185848.1, YP_001188121.1, YP_001233688.1, YP_001268866.1, YP_001270391.1, YP_001345703.1, YP_001412573.1, YP_001417624.1, YP_001526058.1, YP_001579295.1, YP_001581170.1, YP_001668026.1, YP_001669478.1, YP_001671460.1, YP_001685569.1, YP_001747156.1, YP_001749732.1, YP_001765463.1, YP_001766294.1, YP_001790770.1, YP_001808775.1, YP_001809596.1, YP_001859758.1, YP_001888405.1, YP_001903233.1, YP_001977571.1, YP_002229759.1, YP_002231363.1, YP_002280472.1, YP_002297678.1, YP_002543874.1, YP_002549011.1, YP_002796201.1, YP_002801960.1, YP_002875335.1, YP_002897523.1, YP_002912290.1, YP_002974935.1, YP_003060891.1, YP_003264235.1, YP_003552364.1, YP_003578319.1, YP_003591946.1, YP_003607814.1, YP_003641922.1, YP_003674025.1, YP_003692877.1, YP_003755112.1, YP_003896973.1, YP_003907026.1, YP_003912421.1, YP_004086766.1, YP_004142571.1, YP_004147141.1, YP_004228105.1, YP_004278247.1, YP_004305252.1, YP_004356916.1, YP_004361407.1, YP_004378186.1, YP_004379856.1, YP_004390782.1, YP_004472442.1, YP_004590892.1, YP_004612414.1, YP_004676537.1, YP_004693233.1, YP_004701580.1, YP_004701637.1, YP_004704442.1, YP_108931.1, YP_110490.1, YP_168667.1, YP_237931.1, YP_260624.1, YP_262985.1, YP_271307.1, YP_276987.1, YP_334171.1, YP_337172.1, YP_350660.1, YP_351134.1, YP_364386.1, YP_366340.1, YP_369710.1, YP_370582.1, YP_426342.1, YP_440141.1, YP_442361.1, YP_468848.1, YP_521636.1, YP_554363.1, YP_608454.1, YP_610700.1, YP_614980.1, YP_622254.1, YP_625753.1, YP_680590.1, YP_751687.1, YP_767071.1, YP_774090.1, YP_774932.1, YP_788372.1, YP_858562.1, YP_928515.1, YP_983084.1, YP_995622.1, ZP_00948889.1, ZP_00954344.1, ZP_00959736.1, ZP_00998881.1, ZP_01011725.1, ZP_01037109.1, ZP_01058030.1, ZP_01076707.1, ZP_01103959.1, ZP_01167926.1, ZP_01224713.1, ZP_01442907.1, ZP_01446892.1, ZP_01550953.1, ZP_01625518.1, ZP_01745731.1, ZP_01750280.1, ZP_01754305.1, ZP_01763880.1, ZP_01769626.1, ZP_01865961.1, ZP_01881393.1, ZP_01901558.1, ZP_02145337.1, ZP_02151268.1, ZP_02152332.1, ZP_02167267.1, ZP_02190082.1, ZP_02242934.1, ZP_02360937.1, ZP_02367056.1, ZP_02385477.1, ZP_02456487.1, ZP_02883670.1, ZP_03263915.1, ZP_03263990.1, ZP_03400081.1, ZP_03452573.1, ZP_03456092.1, ZP_03517291.1, ZP_03529055.1, ZP_03571515.1, ZP_03572809.1, ZP_03587785.1, ZP_03588560.1, ZP_03697266.1, ZP_03697962.1, ZP_04521092.1, ZP_04590693.1, ZP_04890914.1, ZP_04891982.1, ZP_04893793.1, ZP_04902131.1, ZP_04905327.1, ZP_04941068.1, ZP_04944536.1, ZP_04945255.1, ZP_04959332.1, ZP_04964181.1, ZP_05053721.1, ZP_05063588.1, ZP_05073059.1, ZP_05077806.1, ZP_05082750.1, ZP_05091128.1, ZP_05095488.1, ZP_05101701.1, ZP_05116783.1, ZP_05121836.1, ZP_05127756.1, ZP_05637806.1, ZP_05742087.1, ZP_05783548.1, ZP_05786246.1, ZP_05843149.1, ZP_05945960.1, ZP_06459045.1, ZP_06487195.1, ZP_06492453.1, ZP_06493162.1, ZP_06703644.1, ZP_06731146.1, ZP_06839371.1, ZP_07007312.1, ZP_07266194.1, ZP_07374050.1, ZP_07662787.1, ZP_07778196.1, ZP_07797983.1, ZP_08099459.1, ZP_08138203.1, ZP_08141719.1, ZP_08142973.1, ZP_08177102.1, ZP_08185821.1, ZP_08186468.1, ZP_08208888.1, ZP_08266590.1, ZP_08402041.1, ZP_08406891.1, ZP_08522175.1, ZP_08527488.1, ZP_08631252.1, ZP_08636687 및 그의 변이체를 포함하는 트랜스아미나제의 군으로부터 선택된다.
본 발명에 따라 사용되는 지방산 리덕타제 및 바람직하게는 또한 본 발명에 따라 사용되는 다른 효소는 재조합 효소이다. 바람직한 실시양태에서, 본원에서 사용된 용어 "재조합"은 상응하는 효소를 코딩하는 핵산 분자가 천연 세포에서 발생하지 않고/거나 유전자 기술 방법을 사용하여 생산된 것을 의미하는 것으로 이해된다. 바람직한 실시양태에서, 용어 재조합 단백질은 상응하는 폴리펩티드가 재조합 핵산에 의해 코딩되는 경우에 사용된다. 바람직한 실시양태에서, 본원에 사용된 재조합 세포는 적어도 하나의 재조합 핵산 또는 재조합 폴리펩티드를 갖는 세포를 의미하는 것으로 이해된다. 재조합 분자 또는 세포를 생산하기에 적합한 방법은 예를 들어 문헌 [Sambrook/Fritsch/Maniatis (1989): Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd edition]에 기재된 방법과 같이 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 재조합 효소는 바람직하게는, 예를 들어 통상의 기술자에게 공지된 pET 또는 pGEX 벡터 시스템을 사용하여 과다발현된다.
유기체의 선택에 관하여, 본 발명에 따라 사용가능한 전세포 촉매는 유전자 기술 방법, 예를 들어 효소 활성을 약화시키는 방법, 예를 들어 녹아웃에 의해 도입될 수 있는 변형을 가능하게 하도록 배양가능하고, 안정하고, 처리가능하다면, 어떠한 제한에도 적용되지 않는다. 예를 들어, 세포는 동등하게 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있다. 진핵 세포의 경우에, 단세포 진핵생물, 특히 효모, 예컨대 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 및 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)가 특히 바람직하다. 원핵 세포의 경우에, 세포는 예를 들어 마그네토코쿠스(Magnetococcus), 마리프로푼두스(Mariprofundus), 아세토박터(Acetobacter), 아세토박테리움(Acetobacterium), 아시디필리움(Acidiphilium), 아피피아(Afipia), 아렌시아(Ahrensia), 아스티카카울리스(Asticcacaulis), 아우란티모나스(Aurantimonas), 아조리조비움(Azorhizobium), 아조스피릴룸(Azospirillum), 바실루스(Bacillus), 바르토넬라(Bartonella), 트리보코룸(tribocorum), 베이제린크키아(Beijerinckia), 브라디리조비움(Bradyrhizobium), 브레분디모나스(Brevundimonas), 서브비브리오이데스(subvibrioides), 브루셀라(Brucella), 카울로박터(Caulobacter), 켈라티보란스(Chelativorans), 시트레이셀라(Citreicella), 시트로미크로비움(Citromicrobium), 클로스트리디움(Clostridium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 디노로세오박터(Dinoroseobacter), 에리트로박터(Erythrobacter), 풀비마리나(Fulvimarina), 글루코나세토박터(Gluconacetobacter), 그라눌리박터(Granulibacter), 히르스키아(Hirschia), 호에플레아(Hoeflea), 히포미크로비움(Hyphomicrobium), 히포모나스(Hyphomonas), 케토굴로니시게니움(Ketogulonicigenium), 라브렌지아(Labrenzia), 로크타넬라(Loktanella), 마그네토스피릴룸(Magnetospirillum), 마리카울리스(Maricaulis), 마리티미박터(Maritimibacter), 메소리조비움(Mesorhizobium), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 메틸로시스티스(Methylocystis), 메틸로시누스(Methylosinus), 니트로박터(Nitrobacter), 노보스핀고비움(Novosphingobium), 오세아니불부스(Oceanibulbus), 오세아니카울리스(Oceanicaulis), 오세아니콜라(Oceanicola), 오크로박트룸(Ochrobactrum), 옥타데카박터(Octadecabacter), 올리고트로파(Oligotropha), 파라코쿠스(Paracoccus), 파르비바쿨룸(Parvibaculum), 파르불라르쿨라(Parvularcula), 펠라기바카(Pelagibaca), 파에오박터(Phaeobacter), 페닐로박테리움(Phenylobacterium), 폴리모르품(Polymorphum), 슈도비브리오(Pseudovibrio), 로도박터(Rhodobacter), 로도미크로비움(Rhodomicrobium), 로도슈도모나스(Rhodopseudomonas), 로도스피릴룸(Rhodospirillum), 로세이비움(Roseibium), 로세오박터(Roseobacter), 로세오모나스(Roseomonas), 로세오바리우스(Roseovarius), 루에게리아(Ruegeria), 사기툴라(Sagittula), 실리시박터(Silicibacter), 스핀고비움(Sphingobium), 스핀고모나스(Sphingomonas), 스핀고픽시스(Sphingopyxis), 스타르케야(Starkeya), 술피토박터(Sulfitobacter), 탈라시오비움(Thalassiobium), 크산트로박터(Xanthobacter), 지모모나스(Zymomonas), 아그로박테리움(Agrobacterium), 리조비움(Rhizobium), 시노리조비움(Sinorhizobium), 아나플라스마(Anaplasma), 에를리키아(Ehrlichia), 네오리케치아(Neorickettsia), 오리엔티아(Orientia), 리케치아(Rickettsia), 울바키아(Wolbachia), 보르데텔라(Bordetella), 부르크홀데리아(Burkholderia), 쿠프리아비두스(Cupriavidus), 타이와넨시스(Taiwanensis), 라우트로피아(Lautropia), 림노박터(Limnobacter), 폴리뉴클레오박터(Polynucleobacter), 랄스토니아(Ralstonia), 크로모박테리움(Chromobacterium), 에이케넬라(Eikenella), 코로덴스(corrodens), 바스피아(Basfia), 킨겔라(Kingella), 라리박터(Laribacter), 루티엘라(Lutiella), 네이세리아(Neisseria), 시몬시엘라(Simonsiella), 아크로모박터(Achromobacter), 아시도보락스(Acidovorax), 알리시클리필루스(Alicycliphilus), 아로마톨레움(Aromatoleum), 아조아르쿠스(Azoarcus), 코마모나스(Comamonas), 데클로로모나스(Dechloromonas), 델프티아(Delftia), 갈리오넬라(Gallionella), 헤르바스피릴룸(Herbaspirillum), 헤르미니모나스(Herminiimonas), 힐레모넬라(Hylemonella), 잔티노박테리움(Janthinobacterium), 레프토트릭스(Leptothrix), 메틸리비움(Methylibium), 메틸로바실루스(Methylobacillus), 메틸로필라레스(Methylophilales), 메틸로베르사틸리스(Methyloversatilis), 메틸로보루스(Methylovorus), 니트로소모나스(Nitrosomonas), 니트로소스피라(Nitrosospira), 옥살로박터(Oxalobacter), 파라수테렐라(Parasutterella), 폴라로모나스(Polaromonas), 폴라로모나스(Polaromonas), 푸실리모나스(Pusillimonas), 로도페락스(Rhodoferax), 루브리비박스(Rubrivivax), 시데록시단스(Sideroxydans), 수테렐라(Sutterella), 와즈워텐시스(wadsworthensis), 타일로렐라(Taylorella), 타우에라(Thauera), 티오바실루스(Thiobacillus), 티오모나스(Thiomonas), 바리오보락스(Variovorax), 베르미네프로박터(Verminephrobacter), 아나에로믹소박터(Anaeromyxobacter), 브델로비브리오(Bdellovibrio), 박테리오보루스(bacteriovorus), 빌로필라(Bilophila), 데술파르쿨루스(Desulfarculus), 데술파티바실룸(Desulfatibacillum), 데술포바카(Desulfobacca), 데술포박테리움(Desulfobacterium), 데술포불부스(Desulfobulbus), 데술포코쿠스(Desulfococcus), 데술포할로비움(Desulfohalobium), 데술피토박테리움(Desulfitobacterium), 데술포미크로비움(Desulfomicrobium), 데술포나트로노스피라(Desulfonatronospira), 데술포탈레아(Desulfotalea), 데술포비브리오(Desulfovibrio), 데술푸로모나스(Desulfuromonas), 게오박터(Geobacter), 할리안기움(Haliangium), 히페아(Hippea), 라우소니아(Lawsonia), 믹소코쿠스(Myxococcus), 펠로박터(Pelobacter), 플레시오시스티스(Plesiocystis), 소란기움(Sorangium), 스티그마텔라(Stigmatella), 신트로포박터(Syntrophobacter), 신트로푸스(Syntrophus), 아르코박터(Arcobacter), 카미니박터(Caminibacter), 캄필로박터(Campylobacter), 헬리코박터(Helicobacter), 니트라티프락토르(Nitratifractor), 니트라티루프토르(Nitratiruptor), 술푸리쿠르붐(Sulfuricurvum), 술푸리모나스(Sulfurimonas), 술푸로스피릴룸(Sulfurospirillum), 술푸로붐(Sulfurovum), 월리넬라(Wolinella), 부크네라(Buchnera), 블로크만니아(Blochmannia), 하밀토넬라(Hamiltonella), 레기엘라(Regiella), 리에시아(Riesia), 시트로박터(Citrobacter), 크로노박터(Cronobacter), 딕케야(Dickeya), 에드워드시엘라(Edwardsiella), 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 에스케리키아(Escherichia), 클레브시엘라(Klebsiella), 판토에아(Pantoea), 펙토박테리움(Pectobacterium), 프로테우스(Proteus), 프로비덴시아(Providencia), 라넬라(Rahnella), 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia), 시겔라(Shigella), 소달리스(Sodalis), 위글레스워티아(Wigglesworthia), 글로시나(Glossina), 크세노랍두스(Xenorhabdus), 예르시니아(Yersinia), 아시디티오바실루스(Acidithiobacillus), 아시네토박터(Acinetobacter), 아에로모나스(Aeromonas), 알카니보락스(Alcanivorax), 알칼릴림니콜라(Alkalilimnicola), 알로크로마티움(Allochromatium), 알테로모나달레스(Alteromonadales), 알테로모나스(Alteromonas), 바우만니아(Baumannia), 베기아토아(Beggiatoa), 베르마넬라(Bermanella), 카르소넬라(Carsonella), 루티아(Ruthia), 베시코미오소시우스(Vesicomyosocius), 카르디오박테리움(Cardiobacterium), 크로모할로박터(Chromohalobacter), 콜웰리아(Colwellia), 콘그레기박터(Congregibacter), 콕시엘라(Coxiella), 디켈로박터(Dichelobacter), 엔도리프티아(Endoriftia), 엔히드로박터(Enhydrobacter), 페리모나스(Ferrimonas), 프란시셀라(Francisella), 글라시에콜라(Glaciecola), 하헬라(Hahella), 할로모나스(Halomonas), 할로로도스피라(Halorhodospira), 할로티오바실루스(Halothiobacillus), 이디오마리나(Idiomarina), 칸기엘라(Kangiella), 레지오넬라(Legionella), 마리노박터(Marinobacter), 마리노모나스(Marinomonas), 메틸로박터(Methylobacter), 메틸로코쿠스(Methylococcus), 메틸로미크로비움(Methylomicrobium), 메틸로파가(Methylophaga), 모락셀라(Moraxella), 모리텔라(Moritella), 네프투니이박터(Neptuniibacter), 니트로코쿠스(Nitrococcus), 슈도알테로모나스(Pseudoalteromonas), 사이크로박터(Psychrobacter), 사이크로모나스(Psychromonas), 레이네케아(Reinekea), 리케치엘라(Rickettsiella), 사카로파구스(Saccharophagus), 슈와넬라(Shewanella), 숙시나티모나스(Succinatimonas), 테레디니박터(Teredinibacter), 티오알칼리미크로비움(Thioalkalimicrobium), 티오알칼리비브리오(Thioalkalivibrio), 티오미크로스피라(Thiomicrospira), 톨루모나스(Tolumonas), 비브리오날레스(Vibrionales), 악티노바실루스(Actinobacillus), 아그레가티박터(Aggregatibacter), 갈리박테리움(Gallibacterium), 헤모필루스(Haemophilus), 히스토필루스(Histophilus), 만헤이미아(Mannheimia), 파스테우렐라(Pasteurella), 아조토박터(Azotobacter), 셀비브리오(Cellvibrio), 슈도모나스(Pseudomonas), 알리비브리오(Aliivibrio), 그리몬티아(Grimontia), 포토박테리움(Photobacterium), 포토박테리움(Photobacterium), 비브리오(Vibrio), 슈도크산토모나스(Pseudoxanthomonas), 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas), 크산토모나스(Xanthomonas), 크실렐라(Xylella), 보렐리아(Borrelia), 브라키스피라(Brachyspira), 레프토스피라(Leptospira), 스피로카에타(Spirochaeta), 트레포네마(Treponema), 호지키니아(Hodgkinia), 푸니세이스피릴룸(Puniceispirillum), 리베리박터(Liberibacter), 펠라기박터(Pelagibacter), 오디셀라(Odyssella), 악쿠물리박터(Accumulibacter), 특히 비. 서브틸리스(B. subtilis), 비. 메가테리움(B. megaterium), 씨. 글루타미쿰(C. glutamicum), 이. 콜라이(E. coli), 슈도모나스 종(Pseudomonas sp.), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 슈도모나스 스투트제리(Pseudomonas stutzeri), 아시네토박터 종(Acinetobacter sp.), 부르크홀데리아 종(Burkholderia sp.), 부르크홀데리아 타이란덴시스(Burkholderia thailandensis), 시아노박테리아(cyanobacteria), 클레브시엘라 종(Klebsiella sp.), 클레브시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 살모넬라 종(Salmonella sp.), 리조비움 종(Rhizobium sp.) 및 리조비움 멜리로티(Rhizobium meliloti)를 포함하는 군으로부터 선택된 박테리아일 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, 세포는 엔테로박테리움(enterobacterium)이고, 가장 바람직하게는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)이다.
말단 알데히드 기의 아미노화 동안 트랜스아미나제에 의해 소모되는 알라닌을 무기 질소-함유 분자로부터 재생성시키기 위해, 본 발명에 따른 전세포 촉매가 지방산 리덕타제, 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 및 트랜스아미나제, 뿐만 아니라 알라닌 데히드로게나제를 함유하는 경우가 유리하다. 바람직한 실시양태에서, 본원에서 사용된 용어 "알라닌 데히드로게나제"는 물 및 NAD+를 소모하면서 L-알라닌을 피루베이트, 암모니아 및 NADH로 전환시키는 것 및 그의 역반응을 촉매하는 효소를 의미하는 것으로 이해된다. 특히 바람직한 실시양태에서, 알라닌 데히드로게나제는 다음 아미노산 서열: 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)로부터의 알라닌 데히드로게나제 (데이터베이스 코드 L20916), 리조비움 레구미노사룸(Rhizobium leguminosarum)로부터의 알라닌 데히드로게나제 (데이터베이스 코드 CP001622), 비브리오 프로테오리티쿠스(Vibrio proteolyticus)로부터의 알라닌 데히드로게나제 (데이터베이스 코드 AF070716), 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)로부터의 알라닌 데히드로게나제 (데이터베이스 코드 X63069), 엔테로박터 아에로게네스(Enterobacter aerogenes)로부터의 알라닌 데히드로게나제 (데이터베이스 코드 AB013821)의 아미노산 서열, EGR93259.1, YP_003654745.1, YP_003651439.1, YP_003637111.1, YP_003631815.1, YP_001327051.1, YP_001262560.1, YP_886996.1, YP_882850.1, YP_704410.1, YP_703508.1, ZP_08624689.1, YP_001230376.1, P17557.1, P17556.1, CCB94892.1, CCB73698.1, YP_001168635.1, YP_004668736.1, YP_004569425.1, YP_003513168.1, YP_004561169.1, ZP_08554945.1, YP_400777.1, ZP_08311476.1, ZP_08310170.1, ZP_08267322.1, ZP_08263846.1, ZP_07898723.1, YP_149301.1, YP_148605.1, YP_004340432.1, EFT09946.1, EFS80513.1, EFS51332.1, EFS42459.1, YP_003060895.1, YP_003059033.1, ZP_03305373.1, YP_847214.1, YP_004095847.1, YP_003338282.1, YP_003337256.1, YP_355846.1, YP_253131.1, ZP_08197563.1, ZP_08196283.1, ADW06447.1, YP_734091.1, NP_372233.1, NP_102173.1, ZP_08170259.1, EGD36706.1, EGD32748.1, ZP_08155540.1, YP_004142849.1, YP_002417649.1, YP_001301040.1, YP_002992892.1, YP_081348.1, YP_080482.1, YP_002476349.1, ZP_08115025.1, ZP_08114403.1, YP_003552869.1, YP_002358112.1, YP_575010.1, YP_477594.1, YP_474564.1, YP_130399.1, YP_129373.1, YP_123314.1, NP_810467.1, NP_646469.1, NP_626044.1, NP_391071.1 (서열 11에 의해 코딩됨), ZP_08086822.1, ZP_08084776.1, ZP_08083119.1, ZP_08020768.1, ZP_08013590.1, ZP_08011832.1, YP_003783744.1, YP_002781576.1, YP_002780533.1, ZP_02195873.1, NP_797482.1, ZP_07645051.1, ZP_07643260.1, ZP_06611917.1, AAT40119.1, ZP_07864946.1, YP_004068409.1, YP_002796203.1, YP_002774420.1, YP_003600348.1, YP_003599946.1, YP_003565624.1, YP_003565223.1, YP_335198.1, YP_423850.1, YP_155059.1, ZP_07843538.1, ZP_07841226.1, ZP_06928932.1, ZP_05692073.1, ZP_05687006.1, ZP_04867480.1, YP_775531.1, CBE70214.1, ZP_07721182.1, ZP_04302850.1, ZP_04298961.1, ZP_04287684.1, ZP_04277177.1, ZP_04248389.1, ZP_04235899.1, ZP_02159718.1, ZP_02152178.1, YP_003974610.1, YP_003546595.1, YP_002317127.1, ZP_07313778.1, ZP_07302778.1, ZP_07298850.1, CBK69442.1, YP_003413835.1, YP_003595089.1, ZP_06807811.1, YP_003582455.1, YP_003464731.1, YP_003496397.1, YP_003421918.1, CBL07274.1, CBK64956.1, YP_003508515.1, AAL87460.1, AAC23579.1, AAC23578.1, AAC23577.1, ACU78652.1, YP_003471439.1, YP_003452777.1, ZP_06384971.1, ACY25368.1, ABC26869.1, AAP44334.1, EEZ80018.1, ZP_05110458.1, 1PJB_A, ZP_04717201.1, ZP_04689103.1, CAO90307.1, CAM75354.1, CAA44791.1, BAA77513.1, EGR96638.1, EGL90046.1, YP_004510847.1, ZP_08450330.1, YP_003387804.1, YP_003058152.1, EFS74272.1, EFS67128.1, ZP_06844564.1, YP_826658.1, YP_001195249.1, YP_003095978.1, YP_469292.1, YP_004442054.1, YP_004461174.1, YP_004055616.1, YP_003576656.1, YP_003094537.1, YP_001295973.1, AEE71143.1, YP_004447480.1, YP_003761844.1, YP_040853.1, YP_003154888.1, YP_003142045.1, YP_002280953.1, NP_371963.1, NP_422368.1, EGC98966.1, EGC76398.1, YP_004263661.1, YP_004252039.1, YP_679036.1, YP_499973.1, ZP_08054972.1, ZP_08053009.1, ZP_04067276.1, ZP_03968868.1, ZP_03963857.1, ZP_03933079.1, ZP_03497046.1, ZP_06668924.1, ZP_06667106.1, ZP_06324464.1, ZP_06196777.1, ZP_05114159.1, ZP_05083968.1, ZP_05070370.1, ZP_05030022.1, ZP_04673064.1, ZP_03517011.1, ZP_03505783.1, XP_001310698.1, ABK27691.1 및 CAB59281.2 및 그의 변이체를 포함하는 알라닌 데히드로게나제의 군으로부터 선택된다. 알라닌 데히드로게나제에 의해 촉매되는 반응을 위해, 전세포 촉매로서 적합한 임의의 세포의 1차 대사의 일부로서 형성되는 피루베이트, 뿐만 아니라 암모늄의 존재가 요구된다. 후자는 전형적으로 무기 질소 염, 예를 들어 암모늄 염, 니트레이트 등의 형태로 제공된다. 바람직하게는, 암모늄 염, 예를 들어 염화암모늄이 수성 반응 매질에 첨가된다.
또한, 본 발명에 따른 전세포 촉매가 알칸 히드록실라제를 발현하고, 임의로 알칸 히드록실라제의 활성에 필수적인 추가의 효소를 발현하는 경우, 특히 단지 하나의 말단 카르복시 관능기를 갖는 지방산이 디아민을 생산하기 위한 기질로서 사용되는 경우가 유리하다. 알칸 히드록실라제 및/또는 추가로 발현되는 알콜 데히드로게나제는 말단 탄소 원자를 알데히드 기로 산화시키거나 (알데히드 기는 이후 트랜스아미나제에 의해 아미노화될 수 있음), 또는 카르복실 기로 산화시키며, 카르복실 기는 α-디옥시게나제 또는 지방산 리덕타제와 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제의 조합에 의해 말단 알데히드 기로 전환된다 (알데히드 기는 이후 트랜스아미나제에 의해 아미노화될 수 있음). 바람직한 실시양태에서, 본원에서 사용된 용어 "알칸 히드록실라제"는 적어도 6개, 바람직하게는 12개의 탄소 원자를 포함하는 비치환된 선형 알킬 라디칼의 히드록실화를 촉매하는 효소를 의미하는 것으로 이해된다.
본 발명에 따르면, 특히 PCT/EP2008/067447에 기재된 바와 같은 다수의 산화 시스템이 알칸 히드록실라제로서 적합하다. 바람직한 실시양태에서, 알칸 히드록실라제는 CYP153 패밀리의 시토크롬 P450 모노옥시게나제이다. 바람직한 실시양태에서, 용어 "CYP153 패밀리의 시토크롬 P450 모노옥시게나제"는 알칸 결합 부위, 및 알칸을 히드록실화할 수 있는 능력을 갖는, 페레독신 및 페레독신 리덕타제를 추가로 포함하는 3-성분 시스템의 일부인 시토졸 옥시다제를 의미하는 것으로 이해된다. 특히 바람직한 실시양태에서, 이는 알카니보락스 보르쿠멘시스(Alcanivorax borkumensis) SK2로부터의 CYP153 패밀리의 시토크롬 P450 모노옥시게나제 (데이터베이스 코드 YP_691921)에 대해 적어도 80, 바람직하게는 90, 가장 바람직하게는 95 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 효소이거나, 또는 알카니보락스 보르쿠멘시스 SK2로부터의 CYP153 패밀리의 시토크롬 P450 모노옥시게나제 (데이터베이스 코드 YP_691921)에 대해 적어도 80, 바람직하게는 90, 가장 바람직하게는 95 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하고, 또한 알칸히드록실라제 활성을 갖는 효소이다. 본원 전체에 걸쳐, 언급된 데이터베이스 코드는 NCBI (국립 생물 정보 센터, 미국 베데스다) 데이터베이스, 특히 2012년 11월 21일자 온라인으로 입수가능한 버전에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 용어 "CYP153 패밀리의 시토크롬 P450 모노옥시게나제"는 적어도 5개, 바람직하게는 12개의 탄소 원자를 포함하는 알칸, 비치환된 선형 알킬 라디칼, 또는 모노히드록실화 알칸에 대한 결합 부위, 및 모티프 LL(I/L)(V/I)GGNDTTRN을 포함하는 폴리펩티드 쇄를 포함하는 비-막-결합 옥시다제를 의미하는 것으로 이해된다. 바람직한 실시양태에서, 본원에 사용된 "CYP153 패밀리의 시토크롬 P450 모노옥시게나제"는 알카니보락스 보르쿠멘시스 SK2로부터의 CYP153 패밀리의 시토크롬 P450 모노옥시게나제 (데이터베이스 코드 YP_691921) 또는 그의 변이체로서, 바람직하게는 알칸 히드록실라제 활성을 갖는 것이다.
환원제, 바람직하게는 NADH로부터의 전자를 사용하여 CYP153 패밀리의 시토크롬 P450 모노옥시게나제를 최적으로 공급하기 위해, 알칸 히드록실라제가 그와 기능적으로 상호작용하는 페레독신 리덕타제, 및 그와 기능적으로 상호작용하는 페레독신과 함께 세포에서 발현되는 것이 바람직하다. 이들은 단리된 폴리펩티드이거나, 또는 전세포 촉매를 사용하는 경우에, 공발현된 폴리펩티드, 또는 N- 또는 C-말단 상에서 CYP153 패밀리의 시토크롬 P450 모노옥시게나제와 융합된 폴리펩티드일 수 있다. 통상의 기술자는, 환원제가 상기 3개 폴리펩티드 중 적어도 하나가 부재하는 경우보다 알칸 기질 및 상기 3개 폴리펩티드의 존재 하에서 보다 효율적으로 산화되는지의 여부에 의해, 페레독신 리덕타제 또는 페레독신이 소정의 CYP153 패밀리의 시토크롬 P450 모노옥시게나제와 서로 기능적으로 상호작용하는지의 여부를 용이하게 확립할 수 있다. 대안적으로, 문헌 [Scheps, D., Malca, H., Hoffmann, B., Nestl, B. M, and Hauer, B. (2011) Org. Biomol. Chem., 9, 6727]에 기재된 효소 검정을 사용하는 것이 가능하며, 이는 폴리펩티드가 기능적으로 상호작용하는 경우에, 반응 속도에서의 상당한 증가를 나타낸다. 특히 바람직한 실시양태에서, CYP153 패밀리의 시토크롬 P450 모노옥시게나제, 페레독신 및 페레독신 리덕타제는 동일한 유기체로부터 기원한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 이들은 알카니보락스 보르쿠멘시스 SK2로부터의 페레독신 리덕타제 (데이터베이스 코드 YP_691923) 또는 그의 변이체, 알카니보락스 보르쿠멘시스 SK2로부터의 페레독신 (데이터베이스 코드 YP_691920) 또는 그의 변이체, 및 알카니보락스 보르쿠멘시스 SK2로부터의 CYP153 패밀리의 시토크롬 P450 모노옥시게나제 (데이터베이스 코드 YP_691921) 또는 그의 변이체이다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 알칸 히드록실라제는 AlkB 모노옥시게나제이다. AlkB는 슈도모나스 푸티다 Gpo1의 AlkBGT 시스템으로부터 최초로 공지된 옥시도리덕타제이며, 이는 2개의 추가 폴리펩티드인 AlkG 및 AlkT에 의존성이다. AlkT는 NADH로부터 AlkG로 전자를 전달하는 FAD-의존성 루브레독신 리덕타제로서 특성화된다. AlkG는 철-함유 산화환원 단백질인 루브레독신이며, 이는 AlkB에 대한 직접적인 전자 공여자로서 기능한다. 바람직한 실시양태에서, 용어 "AlkB 모노옥시게나제"는 슈도모나스 푸티다 Gpo1의 AlkB (데이터베이스 코드: CAB54050.1; 이 데이터베이스 코드는 본원에서 사용된 모든 다른 것들과 같이 선행 기술, 즉 NCBI 데이터베이스, 보다 정확하게는 2012년 10월 15일자 온라인으로 입수가능하도록 공개된 것으로부터 기원함)의 서열에 대해 적어도 75, 80, 85, 90, 92, 94, 96, 98 또는 99% (증가하는 순서로 나타낸 것이 바람직함)의 서열 상동성을 가지고 알칸을 산화시키는 능력을 갖는 폴리펩티드를 의미한다. 특히 바람직한 실시양태에서, AlkB 모노옥시게나제는 슈도모나스 푸티다 Gpo1로부터의 AlkG (CAB54052.1) 및 AlkT (CAB54063.1) 폴리펩티드와 기능적으로 상호작용하고 알칸을 산화시키는 옥시도리덕타제이다. AlkB 알칸 히드록실라제에 전자를 최적으로 공급하기 위하여, 알칸 히드록실라제가 그와 기능적으로 상호작용하는 보조 단백질, 바람직하게는 AlkG 및/또는 AlkT 또는 각각의 변이체와 함께 세포에서 발현되는 것이 바람직하며, 특히 바람직한 실시양태에서 이들은 또 다시 슈도모나스 푸티다 Gpo1로부터의 AlkG (CAB54052.1) 및 AlkT (CAB54063.1) 폴리펩티드이다.
전세포 촉매를 사용하는 경우에, 목적하는 반응이 생성되도록 기질이 세포내 국재화된 효소와 접촉해야만 하는 문제가 발생할 수 있다. 장쇄 알칸 및 그의 유도체의 경우에, 전세포 촉매는 AlkL 패밀리의 폴리펩티드를 갖는 것이 바람직하다. AlkL은 장쇄 지방산 및 그의 유도체를 박테리아 세포 내로 유입할 수 있는 슈도모나스 푸티다로부터의 막 단백질이다. 바람직한 실시양태에서, 본원에 사용된 "AlkL 패밀리의 폴리펩티드"는 230개 연속 아미노산의 길이에 걸쳐 슈도모나스 푸티다로부터의 AlkL (데이터베이스 코드 CAB69081) 또는 슈도모나스 푸티다로부터의 AlkL의 변이체에 대해 적어도 80, 바람직하게는 90, 보다 바람직하게는 90%의 서열 동일성을 가지며, 바람직하게는 장쇄 알칸을 세포의 내부로 유입하는 것을 보조할 수 있는 능력을 갖는 폴리펩티드이다. 추가의 실시양태에서, 본원에 사용된 "AlkL 패밀리의 폴리펩티드"는 서열 모티프 DXWAPAXQ(V/A)GXR (여기서 X는 단백질생성 아미노산임)을 가지고 그람-음성 박테리아의 외부 막에 위치된 폴리펩티드이며, 바람직하게는 추가로 슈도모나스 푸티다로부터의 AlkL (데이터베이스 코드 CAB69081) 또는 그의 변이체이다. AlkL 패밀리의 구성원의 예는 슈도모나스 푸티다로부터의 AlkL (데이터베이스 코드 CAB69081), 마리노박터 아쿠아에올레이(Marinobacter aquaeolei) VT8로부터의 AlkL (데이터베이스 코드 YP_957722), 오세아니카울리스 알렉산드리(Oceanicaulis alexandrii) HTCC2633으로부터의 AlkL (데이터베이스 코드 ZP_00953584), 마리노박터 만가녹시단스(Marinobacter manganoxydans) MnI7-9로부터의 AlkL (데이터베이스 코드 ZP_09158756), 카울로박터 종 K31로부터의 AlkL (데이터베이스 코드 YP_001672217), 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans)로부터의 AlkL (데이터베이스 코드 Q00595), 및 그의 변이체를 포함한다.
본 발명의 교시는 본원에서 언급된 정확한 아미노산 또는 핵산 서열을 갖는 거대분자를 사용하는 것, 또는 본원에서 언급된 정확한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 활성이 해당 야생형에 비해 감소된 세포를 사용하는 것, 뿐만 아니라 하나 또는 하나 초과의 아미노산 또는 핵산의 결실, 부가 또는 치환에 의해 얻어질 수 있는 상기 거대분자의 변이체를 사용하거나, 또는 그와 같이 얻어질 수 있는 상기 폴리펩티드의 변이체의 활성이 해당 세포의 해당 야생형에 비해 감소된 세포를 사용함으로써 수행될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본원에 사용된 용어 "상동체"와 동의어로 및 상호교환적으로 이하에서 사용되는 용어 핵산 서열 또는 아미노산 서열의 "변이체"는, 상응하는 원래의 야생형 핵산 또는 아미노산 서열에 대해 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 96, 98, 99% 또는 그 초과의 상동성 (본원에서 동일성과 동의어로 사용됨)을 갖는 서열을 포함하거나 나타내는 또 다른 핵산 또는 아미노산 서열로서, 여기서 바람직하게는 촉매 활성 부위를 형성하는 아미노산 또는 구조나 폴딩에 필수적인 아미노산 이외의 아미노산은 결실되거나, 치환되거나, 예를 들어 아스파르테이트 대신에 글루타메이트 또는 발린 대신에 류신과 같이 단지 보존적으로 치환되는 것인 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 의미한다. 선행 기술, 예컨대 문헌 [Arthur Lesk (2008), Introduction to Bioinformatics, 3rd edition]에는 두 서열의 상동성 정도를 계산하는데 사용될 수 있는 알고리즘이 기재되어 있다. 본 발명의 추가의 보다 바람직한 실시양태에서, 아미노산 또는 핵산 서열의 변이체는, 바람직하게는 상기 언급된 서열 상동성 이외에 실질적으로 야생형 분자 및/또는 원래의 분자와 동일한 효소 활성을 갖는다. 예를 들어, 효소적으로 활성인 폴리펩티드 프로테아제의 변이체는 폴리펩티드 효소로서 동일하거나 또는 실질적으로 동일한 단백질분해 활성, 즉 펩티드 결합의 가수분해를 촉매할 수 있는 능력을 갖는다. 특정한 실시양태에서, 용어 "실질적으로 동일한 효소 활성"은 야생형 폴리펩티드의 기질과 관련하여, 명백하게 배경 활성보다 위에 있고/거나 야생형 폴리펩티드가 동일한 기질과 관련하여 나타내는 KM 및/또는 kcat 값과 3 자릿수 미만, 보다 바람직하게는 2 자릿수 미만, 보다 더 바람직하게는 1 자릿수로 상이한 활성을 의미한다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 용어 핵산 또는 아미노산 서열의 "변이체"는 상기 핵산 또는 아미노산 서열의 적어도 하나의 활성 부분 또는 활성 단편을 포함한다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 본원에 사용된 용어 "활성 부분"은 아미노산 서열의 전체 길이보다 더 작은 아미노산 서열을 갖는 아미노산 서열, 또는 아미노산 서열의 전체 길이보다 더 작은 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 의미하며, 여기서 야생형 아미노산 서열보다 더 작은 길이를 갖는 아미노산 서열 또는 코딩된 아미노산 서열은 야생형 폴리펩티드 또는 그의 변이체, 예를 들어 프로테아제와 실질적으로 동일한 효소 활성을 갖는다. 특정한 실시양태에서, 용어 핵산의 "변이체"는 그의 상보적 가닥이 바람직하게는 엄격한 조건 하에서 야생형 핵산에 결합하는 핵산을 포괄한다. 하이브리드화 반응의 엄격도는 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정되고, 일반적으로 프로브의 길이, 세척 온도 및 염 농도에 따라 달라진다. 일반적으로, 프로브의 길이가 길수록 하이브리드화 온도가 더 높게 요구되는 반면, 프로브의 길이가 짧을수록 더 낮은 온도에서 작동한다. 하이브리드화가 일어나는지의 여부는 일반적으로 변성된 DNA가 그의 환경, 구체적으로 융점 미만에서 존재하는 상보적인 가닥에 어닐링할 수 있는 능력에 따라 달라진다. 하이브리드화 반응 및 상응하는 조건의 엄격도는 문헌 [F M Ausubel (1995), Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc.]에 보다 상세히 기재되어 있다. 하이브리드화에 의한 DNA 서열의 확인에 대한 지침은 통상의 기술자에 의해, 특히 베링거 만하임 게엠베하(Boehringer Mannheim GmbH) (독일 만하임, 1993)로부터의 핸드북 ["The DIG System Users Guide for Filter Hybridization"] 및 문헌 [Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255-260 (1991))]에서 발견할 수 있다. 하이브리드화는 바람직한 실시양태에서 엄격한 조건 하에 일어나며, 즉 프로브 및 표적 서열, 즉 프로브로 처리된 폴리뉴클레오티드가 적어도 70% 동일한 하이브리드만이 형성된다. 세척 단계를 포함하는 하이브리드화의 엄격도는 완충제 조성, 온도 및 염 농도의 변화에 의해 영향을 받고/거나 결정된다는 것이 공지되어 있다. 하이브리드화 반응은 일반적으로 세척 단계와 비교하여 상대적으로 낮은 엄격도로 수행된다 (Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996). 하이브리드화 반응을 위해, 예를 들어 5x SSC 완충제에 상응하는 완충제가 약 50℃ - 68℃의 온도에서 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 프로브는 또한 프로브의 서열에 대해 70% 미만의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화될 수 있다. 이러한 하이브리드는 덜 안정하고, 엄격한 조건 하에서 세척에 의해 제거된다. 이는, 예를 들어 2x SSC 및 임의로 후속적으로 0.5x SSC (The DIG System User's Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany, 1995)로 염 농도를 낮춤으로써 달성될 수 있으며, 이러한 경우에 약 50℃ - 68℃, 약 52℃ - 68℃, 약 54℃ - 68℃, 약 56℃ - 68℃, 약 58℃ - 68℃, 약 60℃ - 68℃, 약 62℃ - 68℃, 약 64℃ - 68℃, 약 66℃ - 68℃의 온도 (증가하는 순서로 바람직함)가 확립된다. 약 64℃ - 68℃ 또는 약 66℃ - 68℃의 온도 범위가 바람직하다. 임의로 0.2 x SSC 또는 0.1 x SSC에 상응하는 농도로 염 농도를 감소시키는 것이 가능하다. 50℃ 내지 68℃의 단계에서 하이브리드화 온도를 약 1-2℃씩 단계적으로 증가시키는 것에 의해, 예를 들어 사용되는 핵산 분자의 서열에 대해 적어도 70% 또는 적어도 80% 또는 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성 (증가하는 순서로 바람직함)을 갖는 폴리뉴클레오티드 단편이 단리될 수 있다. 하이브리드화에 관한 추가의 지침은 소위 키트 (예를 들어, 독일 만하임 소재의 로슈 다이아그노스틱스 게엠베하(Roche Diagnostics GmbH)로부터의 DIG Easy Hyb, 카탈로그 번호 1603558)의 형태로 상업적으로 입수가능하다. 바람직한 실시양태에서, 본원에 사용된 용어 핵산의 "변이체"는 유전자 코드의 축중성의 맥락에서 원래의 핵산과 동일한 아미노산 서열 또는 이러한 아미노산 서열의 변이체를 코딩하는 임의의 핵산 서열을 포괄한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용된 세포는 지방산의 β-산화 반응 중 하나를 촉매하는 적어도 하나의 효소, 바람직하게는 지방산-CoA 리가제, 아실-CoA 데히드로게나제, 2,4-디에노일-CoA 리덕타제, 에노일-CoA 히드라타제 및 3-케토아실-CoA 티올라제, 지방산 유입체 또는 그의 변이체를 포함하는 군으로부터의 효소의 활성이 그의 야생형에 비해 감소된다. 지방산의 β-산화는 원핵 및 진핵 유기체가 동등하게 지방산을 산화하여 그 내부에 존재하는 화학 에너지를 대사에 이용가능하게 만드는 광범위한 대사 경로이다. 보다 넓은 의미에서, 이는 지방산의 세포 내로의 흡수에 의해 시작된다. 상황에 따라 필요한 경우, 지방산은 아실-CoA 데히드로게나제에 의해, 이. 콜라이의 경우 FadE에 의해 CoA 지방산 에스테르의 β-위치에서 먼저 산화된다. 대안적으로, 유사한 분자가 이중-불포화 지방산으로부터 2,4-디에노일-CoA 리덕타제에 의한, 이. 콜라이의 경우 FadH에 의한 환원에 의해 형성될 수도 있다. 이어서, 다기능성 효소, 에노일-CoA 히드라타제/3-히드록시아실-CoA 데히드로게나제, 이. 콜라이의 경우 FadB가 수화 및 2급 알콜의 형성 및 이후 그의 케톤으로의 산화를 촉매한다. 최종 단계에서, 3-케토아실-CoA 티올라제, 이. 콜라이의 경우 FadA는 케토아실-CoA의 절단을 촉매하며, 그 결과로 아세틸-CoA 및 출발 분자와 비교하여 탄소 원자 2개만큼 더 짧은 지방산의 CoA 에스테르가 유리된다. 후자가 마찬가지로 아세틸-CoA가 아니라면, 이는 다시 β-산화 사이클에 공급되고 산화를 통해 단축될 수 있다. 또한, 지방산의 분해에 필요한 유전자를 포함하는 Fad 오페론의 조절제인 FadR이 지방산의 β-산화를 조절하는데 관여하지만, FadR은 β-산화 반응을 촉매하는 것으로 보이지는 않는다. 바람직한 실시양태에서, 용어 "지방산의 β-산화 반응 중 하나를 촉매하는 효소"는 지방산 기질과 직접 상호작용하거나, 또는 아세틸-CoA로의 경로 상에서 상기 기질로부터 형성된 분자와 직접 상호작용하여 (바람직하게는 그를 기질로서 인식함), 그를 상기 분해 경로 상에서 아세틸-CoA와 보다 밀접하게 있는 대사 산물 (바람직하게는 지방산의 세포 내로의 흡수를 수행하는 지방산 유입체 포함)로 전환시키는 것을 촉매하는 임의의 효소를 의미하는 것으로 이해된다. 상기 정의에 따르면, 이들 효소에는 예를 들어 아실-CoA 데히드로게나제가 포함되는데, 이것이 지방산-CoA 에스테르와 상호작용하고, β-산화 대사 경로 상에서 지방산-CoA 에스테르보다 아세틸-CoA와 보다 밀접하게 있는 에노일-CoA로의 전환을 촉매하기 때문이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 본원에 사용된 용어 "지방산의 β-산화 반응 중 하나를 촉매하는 효소"는 이. 콜라이로부터의 유전자 생성물 FadA, FadB, FadD, FadL 및 FadE, 및/또는 다른 유기체로부터의 그의 변이체 또는 상동체를 포함하는 군으로부터의 임의의 효소를 의미하는 것으로 이해된다. 이. 콜라이로부터의 유전자 생성물 FadA, FadB, FadD, FadL 및 FadE, 뿐만 아니라 생명공학적으로 유용한 다수의 다른 유기체로부터의 변이체 및 상동체, 및 이들의 핵산 및 폴리펩티드 서열은 선행 기술에 기재되어 있으며, 예를 들어 등록 번호 AP009048.1 하의 FadA, 등록 번호 BAE77457.1 하의 FadB, 등록 번호 BAA15609.1 하의 FadD, 및 등록 번호 BAA77891.2 하의 FadE가 있다. 선행 기술, 예를 들어 문헌 [K Kameda & W D Nunn (1981) J. Biol. Chem. 256, 5702-5707, Hi Marrakchi, W E DeWolf, C Quinn, J West, B J Polizzi, C Y So et al. (2003) Biochem. J. 370, 1055-1062, Lobo et al. (2001) and X Yu, T Liu, F Zhu, and C Khosla (2011) PNAS, 인쇄 전 전자 공개]에는 지방산의 β-산화 반응 중 하나를 촉매하는 효소의 활성 측정에 특히 적합한 다수의 검정들이 개시되어 있다.
본 발명에 따른 전세포 촉매의 효율을 위해, 전환될 기질, 바람직하게는 카르복실산 또는 디카르복실산 또는 이들의 모노에스테르가, 본 발명에 따라 요구되며 전세포 촉매 내부에 위치하는 효소에 용이하게 진입하여 그와 접촉할 수 있는 경우가 유리하다. 따라서, 기질이 세포의 내부에 도달할 수 있는 것이 중요하다. 이를 촉진하기 위해, 전세포 촉매가 지방산 유입체를, 보다 특히 그람-음성 박테리아의 경우에 전세포 촉매가 특히 바람직하게는 지방산 유입체 FadL (데이터베이스 코드: BAA16205.1) 또는 변이체를, 바람직하게는 상응하는 전세포 촉매의 야생형의 활성과 비교하여 증가된 활성과 농도로 발현하는 것이 바람직하다. 통상의 기술자에게 일상적으로 접근가능한 다양한 경로를 통해, 예를 들어 프로모터에 기능적으로 연결된, 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 추가 카피의 혼입을 통해, 또는 천연 프로모터를 더 강한 프로모터로 교환하는 것을 통해, 세포의 야생형에 비해 폴리펩티드의 활성의 증가를 달성할 수 있다.
전세포 촉매에서 내인성으로 발현된 효소의 배경이 본 발명에 따른 방법의 반응물, 중간체 또는 생성물을 분해하는 내인성 효소의 활성을 감소시키거나 차단하는 방식으로 최적화되거나, 또는 본 발명에 따른 세포, 바람직하게는 대사 경로 상에서 ω-아미노카르복실산, ω-히드로카르복실산, ω-옥소카르복실산 및 디카르복실산의 메틸 에스테르를 사용하여 최적화되거나, 또는 다르게는 그들을 변형시켜 목적 생성물의 발달로부터 멀어지는 쪽으로 유도하는 경우에, 본 발명에 따른 아민 및 디아민이 보다 높은 수율 및 순도로 생산된다는 것이 발견되었다. 이러한 배경에 대해, 본 발명에 따른 전세포 촉매가 에스테라제 BioH [데이터베이스 코드 YP_492020.1] 또는 그의 변이체의 활성이 그의 야생형과 비교하여 감소된 세포인 경우가 유리할 수 있다. 이러한 감소된 BioH 활성을 갖는 세포, 그의 생산 및 활성을 측정하기 위한 검정은 유럽 특허 출원 EP 12007663.3에 기재되어 있다.
사용된 카르복실산, 디카르복실산 또는 이들의 모노에스테르가, 말단 카르복시 기가 높은 정도로, 바람직하게는 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 95 또는 99%의 정도로 존재하는 에스테르 형태의 화합물의 혼합물인 경우에, 예를 들어 이러한 기질의 보다 우수한 이용가능성 또는 유리 카르복실산 또는 디카르복실산의 독성 때문에, 완전히 에스테르화된 디카르복실산의 부분적 또는 완전한 가수분해에 의해 모노에스테르가 제공될 수 있고, 완전히 에스테르화된 카르복실산의 부분적 또는 완전한 가수분해에 의해 유리 카르복실산이 제공될 수 있다. 이 경우에, 적합한 에스테라제의 과다발현에 의한 에스테르 가수분해와 관련하여 세포의 용량을 증가시키는 것이 유리하다. 이러한 목적을 위해, 바람직한 실시양태에서, 에스테르 히드롤라제 BioH 또는 그의 변이체의 활성은 사용된 전세포 촉매의 야생형에 비해, 특히 바람직하게는 과다발현에 의해 증가된다. 이어서, 상응하는 모노에스테르 및/또는 비에스테르화 카르복실산 또는 디카르복실산이 계내에서 에스테르 가수분해에 의해 제공된다. 완전히 에스테르화된 디카르복실산의 부분적 또는 완전한 가수분해는 또한, 예를 들어 저 pH 수준에서 화학적으로 촉매된 가수분해에 의해 이루어질 수 있다.
본 발명에 따른 전세포 촉매는 바람직하게는 하기 화학식 I의 화합물인 카르복실산 또는 디카르복실산 또는 이들의 모노에스테르를 상응하는 아민 또는 디아민으로 전환시키는 방법에 사용될 수 있다.
<화학식 I>
R1 - A - COOR2
상기 식에서, R1은 -H 및 COOR3을 포함하는 군으로부터 선택되고, R2 및 R3은 각각 독립적으로 H, 메틸, 에틸 및 프로필을 포함하는 군으로부터 선택되며, 단 라디칼 R2 및 R3 중 적어도 하나는 H이고, A는 적어도 4개의 탄소 원자를 갖는 비분지형, 분지형, 선형, 시클릭, 치환 또는 비치환된 탄화수소 기이다. 바람직한 실시양태에서, A는 화학식 -(CH2)n-의 구조이며, 여기서 n은 바람직하게는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30이다. 바람직한 실시양태에서, 카르복실산 또는 디카르복실산은 라우르산 또는 ω-카르복실라우르산이다. 추가의 가장 바람직한 실시양태에서, 카르복실산은 화학식 CH3-(CH2)n-COOH의 카르복실산이며, 여기서 n은 바람직하게는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30, 바람직하게는 헥산산 또는 데칸산이다. 추가의 가장 바람직한 실시양태에서, 카르복실산 또는 디카르복실산은 화학식 HOOC-(CH2)n-COOH의 디카르복실산이며, 여기서 n은 바람직하게는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30, 바람직하게는 ω-카르복시헥산산 또는 ω-카르복시데칸산이다. 추가의 가장 바람직한 실시양태에서, 카르복실산 또는 디카르복실산은 ω-카르복시테트라데칸산이다. 따라서, 본 발명에 따라 제조된 아민 또는 디아민은 바람직하게는 화학식 CH3-(CH2)n-NH2 또는 NH2-(CH2)n-NH2의 화합물이며, 여기서 n은 각각의 경우에 바람직하게는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30이다.
카르복실산 또는 디카르복실산 또는 이들의 모노에스테르 및 본원에 기재된 임의의 화학적 화합물과 관련하여, 각각의 명시된 화학식은 각각의 화합물의 양성자화 또는 탈양성자화 염 모두를 포괄하는 것이 사실이다. 예를 들어, 라우르산은 양성자화 형태, 뿐만 아니라 모든 양이온을 갖는 라우레이트 염, 예를 들어 라우르산나트륨을 포괄한다.
본 발명에 따른 방법에 사용된, 임의로 본 발명에 따른 전세포 촉매 형태로 제공된 효소를 수용액에서 카르복실산 또는 디카르복실산 또는 이들의 모노에스테르와 접촉시켜야 한다는 것이 본 발명에 따른 방법의 요건이다. 바람직한 실시양태에서, 본원에 사용된 용어 "접촉시키는"은 특정한 효소와 그의 기질 사이에 물리적 장벽, 예컨대 불투과성 막 또는 이들 사이에 삽입되는 기타의 것들 없이 서로 직접적으로 접촉시키는 것을 의미하는 것으로 이해된다. 가장 단순한 경우에, 접촉은 효소 또는 전세포 촉매가 위치하고 있는 수용액에 기질을 첨가함으로써 일어난다.
수용액 중 본 발명에 따른 전세포 촉매 및 화학식 I (여기서, R1은 -H 및 COOR3을 포함하는 군으로부터 선택되고, R2 및 R3은 각각 독립적으로 H, 메틸, 에틸 및 프로필을 포함하는 군으로부터 선택되며, 단 라디칼 R2 및 R3 중 적어도 하나는 H이고, A는 적어도 4개의 탄소를 갖는 비분지형, 분지형, 선형, 시클릭, 치환 또는 비치환된 탄화수소 기, 바람직하게는 화학식 -(CH2)n- (여기서, n은 적어도 4, 특히 바람직하게는 적어도 10임)임)의 카르복실산 또는 디카르복실산 또는 이들의 모노에스테르를 포함하는 반응 혼합물이 본 발명에 따른 교시를 수행하는데 적합하다. 수용액은, 예를 들어 조성, pH 및 온도와 관련하여, 상기 용액이 적어도 특정 기간 동안 전세포 촉매의 생존율 또는 적어도 촉매 능력을 지지하는 그러한 성질을 가져야만 한다. 통상의 기술자는 수용액으로서 적합하고 세포, 보다 특히 생명공학적으로 중요한 세포를 유지하거나 또는 배양하는데 적합한 다수의 수성 배양 배지를 알고 있다. 이들은 동등하게, 완전한 배지, 예컨대 LB 배지, 최소 배지, 예컨대 M9 배지 및 또한 선택 배지, 예들 들어 높은 염 농도를 가져 유일하게 호염성 또는 적어도 내염성 유기체만을 성장시킬 수 있는 것들을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 본원에 사용된 용어 "수성 배양 배지"는 모든 관련 인자, 특히 pH, 염 함량 및 온도와 관련하여, 그에 존재하는 세포, 바람직하게는 미생물의 생존율을 유지하거나 또는 촉진하고 수성 배양 배지 및 소수성 유기 상이 둘 다 액체 형태로 존재하는 그러한 성질을 갖는 수계 반응 배지를 의미하는 것으로 이해된다. 생명공학적으로 중요한 다양한 세포의 온도 요건은 미생물학 및 분자 생물학 교과서, 예를 들어 [Fuchs/Schlegel, 2008]에서 찾을 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 접촉 시점의 수성 배양 배지의 pH는 4 내지 9, 보다 바람직하게는 4.5 내지 8.5, 가장 바람직하게는 6.5 내지 7.5이다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 온도는 0 내지 45℃, 보다 바람직하게는 15 내지 40℃, 가장 바람직하게는 20 내지 37℃이다. 반응 혼합물은 전형적으로 발효기에 존재한다. 멸균, 바람직하게는 오토클레이브될 수 있고 전세포 촉매의 배양, 통기 및 반응 조건의 제어, 예를 들어 산소 함량 및 온도의 제어를 가능하게 하는 임의의 반응 용기가 발효기로서 작용할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 반응 혼합물은 수용액 이외에 소수성 유기 상을 포함한다. 이는 수용액으로부터 ω-아미노 지방산을 제거하기 위한 유기 용매 및/또는 소수성 액체 양이온 교환체를 포함할 수 있다. 적합한 용매 및 양이온 교환체는 EP11191520.3에 기재되어 있다.
본 발명은 하기 도면 및 비-제한적인 실시예에 의해 보다 구체적으로 기재되며, 이로부터 본 발명의 추가의 특징, 실시양태, 측면 및 이점이 파악될 수 있다.
도 1: 21.75시간의 공정 시간 후에 균주 이. 콜라이 W3110 pACYC{Placuv5}[carA_Ms-npt_Noc] / pJ281_alaDH_B.s._TA_C.v.(ct)의 발효 브로쓰에서의 모노아민 및 디아민의 검출.
실시예 1
미코박테리움 스메그마티스로부터의 유전자 MSMEG_2956 및 노카르디아 종(Nocardia sp.)으로부터의 npt의 발현을 위한 발현 벡터의 생산
지방산 리덕타제 (YP_887275.1)를 코딩하는 미코박테리움 스메그마티스로부터의 MSMEG_2956 (carA, 서열 1) 및 이와 함께, 상기 지방산 리덕타제를 포스포판테테이닐화하는 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (ABI83656.1)를 코딩하는 노카르디아 종으로부터의 npt (서열 2)의 공발현을 위한 벡터를 생산하기 위해, 재조합 클로닝을 위한 상동성 영역을 삽입하면서 PCR에 의해 두 유전자를 증폭시켰다. 이와 관련하여, 유전자 MSMEG_2956의 증폭을 위한 공여자 유기체로부터의 게놈 DNA 및 유전자 npt의 증폭을 위한 합성 DNA 단편을 주형으로서 사용하였다. 유전자는 lacuv5 프로모터 (서열 3)의 제어 하에 있었으며, 이 프로모터도 마찬가지로 입수가능한 벡터로부터 출발하여 재조합 클로닝을 위한 상동성 영역을 삽입하면서 PCR에 의해 증폭시켰다.
이와 관련하여, 하기 올리고뉴클레오티드를 사용하였다:
Figure 112015068775014-pct00001
하기 파라미터를 Placuv5 및 유전자 npt의 증폭을 위한 PCR에 사용하였다: 1 x: 초기 변성, 98℃, 0:30분; 35 x: 변성, 98℃, 0:10분, 어닐링, 55℃, 0:20분; 신장, 72℃, 0:15분; 1 x: 말단 신장, 72℃, 10분. 유전자 MSMEG_2956의 증폭을 위해, 하기 파라미터를 사용하였다: 1 x: 초기 변성, 98℃, 0:30분; 35 x: 변성, 98℃, 0:10분, 어닐링, 65℃, 0:20분; 신장, 72℃, 1분; 1 x: 말단 신장, 72℃, 10분. 증폭을 위해, 뉴잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs) (프랑크푸르트)로부터의 퓨전(Phusion)™ 하이-피델리티 마스터 믹스(High-Fidelity Master Mix)를 제조업체의 권장사항에 따라 사용하였다. 이어서 각각의 경우에, 50 μl의 PCR 반응물을 1% 농도 TAE 아가로스 겔 상에서 분해하였다. PCR, 아가로스 겔 전기영동, DNA의 브로민화에티듐 염색 및 PCR 단편 크기의 결정을 통상의 기술자에게 공지된 방식으로 수행하였다. 모든 경우에서, 예상된 크기의 PCR 단편을 증폭할 수 있었다. 이들은 Placuv5에 대한 325개 염기 쌍, MSMEG_2956에 대한 3500개 염기 쌍 및 npt에 대한 718개 염기 쌍이었다. 아가로스 겔로부터 DNA를 단리하기 위해, 표적 DNA를 스칼펠을 사용하여 겔 밖으로 절단해내고, 퀴아퀵(QiaQuick) 겔 추출 키트를 사용하여 제조업체의 지침 (퀴아젠(Qiagen), 힐덴)에 따라 정제하였다. 정제된 PCR 생성물을 진아트(Geneart)® 심리스 클로닝 및 조립 키트를 사용하여 제조업체의 지침 (라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 미국 캘리포니아주 칼스배드)에 따라 재조합에 의해 EcoNI- 및 PacI-cut pACYCDuet-1 벡터 (머크(Merck), 다름슈타트) 내로 클로닝하였다. 화학적으로 적격인 이. 콜라이 DH10β (뉴잉글랜드 바이오랩스, 프랑크푸르트)를 통상의 기술자에게 공지된 방식으로 형질전환시켰다. 표적 유전자가 정확하게 삽입되었는지는 제한 분석으로 검사하였고, 삽입 유전자의 진위는 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 완성된 발현 벡터는 pACYC{Placuv5}[carA_Ms-npt_Noc] (서열 10)으로 지칭하였다.
실시예 2
바실루스 서브틸리스로부터의 유전자 ald 및 크로모박테리움 비올라세움(Chromobacterium violaceum)으로부터의 Cv2025의 공발현을 위한 발현 벡터의 생산
알라닌 데히드로게나제 (NP_391071.1)를 코딩하는 바실루스 서브틸리스로부터의 유전자 ald (서열 11) 및 트랜스아미나제 (NP_901695.1)를 코딩하는 크로모박테리움 비올라세움으로부터의 Cv _2025 (서열 12)를 위한 이. 콜라이 발현 벡터를 생산하기 위해, 바실루스 서브틸리스로부터의 유전자 ald를 바실루스 스파에리쿠스(Bacillus sphaericus)로부터의 유전자 ald를 대신하여 이. 콜라이 발현 벡터 pJ281_alaD_Bsp_TA_C.v.(ct) (서열 및 생산에 대해서 WO/2013/024114의 실시예 1 및 그 안에 열거된 서열 17 참조) 내로 클로닝하였다. 바실루스 서브틸리스로부터의 유전자 ald를 균주 바실루스 서브틸리스 균주 168로부터의 염색체 DNA로부터 PCR에 의해 증폭시켰다. 이와 관련하여, 하기 올리고뉴클레오티드를 사용하였다:
Figure 112015068775014-pct00002
하기 파라미터를 PCR에 사용하였다: 1 x: 초기 변성, 98℃, 0:30분; 35 x: 변성, 98℃, 0:10분, 어닐링, 65℃, 0:30분; 신장, 72℃, 0:20분; 1 x: 말단 신장, 72℃, 10분. 증폭을 위해, 뉴잉글랜드 바이오랩스로부터의 퓨전™ 하이-피델리티 마스터 믹스 (프랑크푸르트)를 제조업체의 권장사항에 따라 사용하였다. 이어서 각각의 경우에, 50 μl의 PCR 반응물을 1% 농도 TAE 아가로스 겔 상에서 분해하였다. PCR, 아가로스 겔 전기영동, DNA의 브로민화에티듐 염색 및 PCR 단편 크기의 결정을 통상의 기술자에게 공지된 방식으로 수행하였다. PCR 단편은 1137개 염기 쌍의 예상된 크기를 나타냈으며, 퀴아젠 (힐덴)으로부터의 퀵 PCR 정제 키트를 사용하여 제조업체로부터의 정보에 따라 PCR 부피로부터 정제하였다. 벡터에의 PCR 생성물의 라이게이션을 위해, 5'-포스페이트를 폴리뉴클레오티드 키나제 (뉴잉글랜드 바이오랩스, 프랑크푸르트)를 사용하여 PCR 생성물에 부착하였다. 이와 관련하여, 제조업체로부터의 권장사항을 따랐다.
벡터를 제한 엔도뉴클레아제 HindIII 및 NdeI에 의해 소화시키고, 그 결과, 존재하는 유전자인 바실루스 스파에리쿠스 ald를 제거하였다. 제한 소화 부피를 1% 농도 TAE 아가로스 겔 상에서 분해하였다. 5696 bp 및 1124 bp 크기의 2개 밴드를 확인할 수 있었다. 아가로스 겔로부터 벡터 DNA를 단리하기 위해, 5696 bp의 DNA 밴드를 스칼펠을 사용하여 겔로부터 단리하였으며, 퀴아젠 (힐덴)으로부터의 퀵 겔 추출 키트를 사용하여 제조업체로부터의 정보에 따라 정제하였다. 평활 말단을 생성하기 위해, 정제된 벡터 DNA의 5'-오버행을 DNA 폴리머라제 I의 클레나우(Klenow) 단편 (뉴잉글랜드 바이오랩스, 프랑크푸르트)을 사용하여 채웠다. 이와 관련하여, 제조업체로부터의 정보를 따랐다. 5'-포스페이트 잔기를 갖는 DNA 단편 바실루스 서브틸리스 ald를 평활 말단을 갖는 벡터 내로 라이게이션하였다. 완성된 이. 콜라이 발현 벡터를 pJ281_alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct) (서열 15)로 지칭하였다.
실시예 3
미코박테리움 스메그마티스로부터의 유전자 MSMEG_2956 및 노카르디아 종으로부터의 npt, 바실루스 서브틸리스로부터의 ald 및 크로모박테리움 비올라세움으로부터의 Cv2025를 과발현하는 이. 콜라이 균주의 생산
지방산 리덕타제 (YP_887275.1)를 코딩하는 미코박테리움 스메그마티스로부터의 유전자 MSMEG_2956 및 상기 지방산 리덕타제를 포스포판테테이닐화하는 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (ABI83656.1)를 코딩하는 노카르디아 종으로부터의 npt를, 알라닌 데히드로게나제 (NP_391071.1)를 코딩하는 바실루스 서브틸리스로부터의 유전자 ald 및 트랜스아미나제 (NP_901695.1)를 코딩하는 크로모박테리움 비올라세움으로부터의 Cv2025와 함께 공발현하는 이. 콜라이 균주를 생성하기 위해, 균주 이. 콜라이 W3110을 전기천공에 의해 플라스미드 pACYC{Placuv5}[carA_Ms-npt_Noc] (서열 10) 및 pJ281_alaDH_B.s._TA_C.v.(ct) (서열 15)로 형질전환시키고, 클로람페니콜 (50 μg/ml) 및 카나마이신 (50 μg/ml)을 함유하는 LB 한천 플레이트 상에 도말하였다. 형질전환체를 플라스미드 제조 및 분석적 제한 분석에 의해 정확한 플라스미드의 존재에 대해 검사하였다. 생성된 균주는 이. 콜라이 W3110 pACYC{Placuv5}[carA_Ms-npt_Noc] / pJ281_alaDH_B.s._TA_C.v.(ct)로 지칭하였다. 균주를 사용하여, 도데칸디오산에서 출발하여 도데칸디아민을 생산하는 그의 능력 및 도데칸산에서 출발하여 도데실아민을 생산하는 그의 능력을 조사하였다. 과다발현된 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 npt에 의해 활성화되는 지방산 리덕타제의 유전자 산물 CarA가 기질 도데칸산 또는 도데칸디오산을 각각 알데히드 또는 디알데히드로 전환시킨다. 유전자 산물 Cv_2505의 기능은 말단 (디)알데히드를 도데실아민 또는 도데칸디아민으로 전환시키는 것이다. 아미노화 반응에 요구되는 알라닌 아미노 공여자는 유전자 산물 ald에 의해 피루베이트로부터 제공된다.
실시예 4
미코박테리움 스메그마티스로부터의 유전자 MSMEG_2956 및 노카르디아 종으로부터의 유전자 npt에 대한 발현 벡터를 바실루스 서브틸리스로부터 유전자 ald 및 크로모박테리움 비올라세움으로부터의 유전자 Cv_2025에 대한 발현 벡터와 함께 함유하는 이. 콜라이 균주에 의한 도데칸디아민 및 도데실아민의 생산
실시예 3에서 생성된 균주를 사용하여, 도데실아민 및 도데칸디아민의 생산에 대한 그의 능력을 조사하였다. 도데칸산 및 도데칸디오산의 각각 도데실아민 및 도데칸디아민의로의 생체변환을 DASGIP로부터의 8-배 평행 발효 시스템에서 수행하였다. 이에 대한 절차는 다음과 같았다:
발효를 위해, 1L 반응기를 사용하였다. pH 프로브를 pH 4.0 및 pH 7.0의 측정 용액을 사용하는 2-포인트 보정에 의해 보정하였다. 반응기를 음용수 300 mL로 채우고, 멸균을 확실히 하기 위해 121℃에서 20분 동안 오토클레이브하였다. 이어서, pO2 프로브를 DASGIP 시스템 상에서 밤새 (적어도 6시간) 분극화하였다. 그 다음날 아침에, 물을 클린 벤치 하에서 제거하고, 50 mg/L 클로람페니콜 및 50 mg/L 카나마이신을 함유하는 300 mL의 고-세포-밀도 배지로 대체하였다. 이후, 단일-포인트 보정 (교반기: 400 rpm / 통기: 10 sL/h 공기) 및 공급을 사용하여 pO2 프로브를 보정하고, 교정제 및 유도제 경로를 클린-인-플레이스(clean-in-place)에 의해 세정하였다. 이를 위해, 호스를 70% 에탄올, 이어서 1M NaOH, 이어서 멸균 탈염수로 플러싱하고, 최종적으로 특정한 배지로 채웠다.
도데칸디아민 및 도데실아민을 생산하는 이. 콜라이 균주를 먼저, 상기 언급된 항생제를 함유하는 LB 배지 (100 mL 배플형 플라스크 내 25 mL)에서의 밤새 37℃ 및 200 rpm에서의 극저온 배양으로부터 약 18시간 동안 배양하였다. 이어서, 2 mL의 배양물을, 상기 언급된 항생제를 함유하는 고-세포-밀도 배지 (15 g/L 글루코스 (1% MgSO4*7H2O 및 2.2% NH4Cl을 함유하는 개별적으로 오토클레이브된 500 g/L 원액 30 mL/L), 1.76 g/L (NH4)2SO4, 19.08 g/L K2HPO4, 12.5 g/L KH2PO4, 6.66 g/L 효모 추출물, 2.24 g/L 시트르산삼나트륨 2수화물, 시트르산암모늄제2철 용액, 개별적으로 오토클레이브된 1% 농도 원액 17 mL/L, 미량 원소 용액, 개별적으로 오토클레이브된 원액 5 mL/L (36.50 g/L HCl (37%), 1.91 g/L MnCl2*4H2O, 1.87 g/L ZnSO4*7H2O, 0.84 g/L 에틸렌디아민테트라아세트산 2수화물, 0.30 g/L H3BO3, 0.25 g/L Na2MoO4*2H2O, 4.70 g/L CaCl2*2H2O, 17.80 g/L FeSO4*7H2O, 0.15 g/L CuCl2*2H2O)) (100 mL 배플형 플라스크 내 25 mL) 내로 접종하고, 37℃ / 200 rpm에서 추가 5.5시간 동안 인큐베이션하였다.
반응기에 적절한 부피의 예비-배양물을 광학 밀도 0.1로 접종하였고, 이때 예비-배양물을 5 ml 시린지에 채워 (멸균 조건 하) 70% 에탄올로 커버된 격벽을 통해 바늘로 반응기에 접종하였다.
하기 표준 프로그램을 사용했다:
Figure 112015068775014-pct00003
수행된 실험은 2 단계로 나누어질 수 있다: 세포가 특정 광학 밀도에 도달하는 동안의 성장, 및 기질인 도데칸산, 올레산 및 도데칸디오산의 첨가 후에 각각 도데실아민, 올레일아민 및 도데칸디아민으로의 전환이 발현 동안 형성된 효소에 의해 일어나는 후속 생체변환. pH 수준을 암모니아 (12.5%)를 사용하여 pH 6.8이 되도록 한쪽으로만 조정하였다. 성장 및 생체변환 동안, 배양물 중 용존 산소 (DO)를 교반기 속도 및 통기율에 의해 30%로 조정하였다. 발효를 유가식으로 수행하였고, 공급 개시시에 5 g/Lh 글루코스 공급 (1% MgSO4*7H2O 및 2.2% NH4Cl을 함유하는 500 g/L 글루코스)을 DO 피크를 통해 유발하였다. 공급 개시시에, 또한 온도를 이전 37℃에서 30℃로 낮추었다. 트랜스아미나제, 알라닌 데히드로게나제, 카르복실산 리덕타제 및 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제의 발현을 공급 개시 2시간 후에 1 mM IPTG의 자동화 첨가에 의해 유도하였다. 생체변환 개시 전에, 배양 브로쓰의 광학 밀도를 결정하였다.
생체변환 단계의 개시는 공급 개시 1시간 또는 12시간 후에 이루어졌다. 이를 위해, 도데칸산 또는 도데칸디오산 및 올레산의 혼합물 (공업용 등급 90%) 150 mL 또는 75 mL를 한 배치로 발효 브로쓰에 첨가하였다. 트랜스아미나제에 대한 아미노기 공여자를 제공하기 위해, 생체변환 개시 30분 전에 3M 황산암모늄 용액 5 mL를 발효 브로쓰에 첨가하였다. 샘플링을 위해, 발효 브로쓰 2 mL를 탱크로부터 제거하고, 그의 일부분을 80% 아세토니트릴, 20% 물 및 0.1% 포름산의 혼합물의 중에 1/20로 희석하고 추출하였다. 생체변환 개시 1.25시간, 2.75시간, 4.25시간, 18.25시간 및 21.75시간 후에 모든 반응기로부터 샘플을 취하였다. 발효 동안에 DASGIP 시스템 상에서의 폐기 가스 분석을 통해 산소에 대한 전환율 (OTR = 산소 전달률) 및 탄소에 대한 전환율 (CTR = 탄소 전달률)을 결정하였다. 생체변환 개시 21.75시간 후에 발효를 종결시켰다. 교반기, 통기 시스템, 온도 제어기 및 pH 제어기를 끄고, 탱크를 5-10분 동안 방해받지 않게 두었다.
HPLC-ESI/MS 스캔 방법
샘플을 스캔 모드에서의 고해상도 MS 검출과 커플링된 HPLC/MS에 의해 정성적으로 평가하였다.
하기 기기를 여기서 사용하였다:
● 오토샘플러, 4원 펌프, PDA 검출기 및 칼럼 오븐을 갖는 액셀라(Accela) HPLC 시스템 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific), 미국 매사추세츠주 월섬)
● ESI 공급원을 갖는 LTQ-FT 질량 분광계 (써모 사이언티픽, 미국 매사추세츠주 월섬)
● HPLC 칼럼: 키네텍스(Kinetex) C18, 100 x 2.1 mm, 입자 크기: 2.6 μm, 세공 크기 100 Å (페노메넥스(Phenomenex); 아샤펜부르크)
2 ml 반응 용기에 용매 (80% (v/v) 아세토니트릴, 20% 이중-증류 H2O (v/v), + 0.1% 포름산) 1950 μl 및 샘플 50 μl를 피펫팅하여 샘플을 제조하였다. 상기 혼합물을 약 10초 동안 볼텍싱한 후에 약 13,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 맑은 상청액을 피펫을 사용하여 제거하였다.
상기 언급된 HPLC 칼럼을 사용하여 HPLC 분리를 수행하였다. 주사 부피는 0.5 μL이고, 칼럼 온도는 40℃이고, 유량은 0.3 mL/분이었다. 이동 상은 용리액 A (0.02% 농도 (v/v) 수성 트리플루오로아세트산) 및 용리액 B (0.015% (v/v) 트리플루오로아세트산을 갖는 아세토니트릴)로 구성되었다. 하기 구배 프로파일을 사용하였다:
Figure 112015068775014-pct00004
ESI 공급원의 하기 파라미터를 사용하여 ESI-MS 분석을 양성 모드로 수행하였다:
● ESI 전압: 4kV
● 모세관 온도 300℃
● 시스 기체 유동 40
● 옥스 기체 유동 5
● 스위프 기체 유동 3
m/z = 100 내지 1000의 질량 범위 내에서 검출을 수행하였다. 질량 분광측정법 해상도는 R = 100,000이었다.
결과를 하기 표에 나타내었다.
Figure 112015068775014-pct00005
21.75시간의 처리 시간 후에 균주 이. 콜라이 W3110 pACYC{Placuv5}[carA_Ms-npt_Noc] / pJ281_alaDH_B.s._TA_C.v.(ct)의 발효 브로쓰에서의 모노아민 및 디아민의 정성적 검출 (n.d. = 검출가능하지 않음, LA = 라우르산, DDA = 도데칸디오산).
추가의 데이터가 도 1에 제시되어 있다.
1,12-도데칸디아민 및 도데실아민은 오르토-프탈디알데히드에 의한 유도체화 후에, HPLC/UV 측정에 의해 정량적으로 결정하였다. 메탄올 상청액을 측정하였다. 가장 중요한 크로마토그래피 파라미터가 하기 표에 요약되어 있다.
Figure 112015068775014-pct00006
결과가 하기 표에 제시되어 있다.
Figure 112015068775014-pct00007
21.75시간의 처리 시간 후에 균주 이. 콜라이 W3110 pACYC{Placuv5}[carA_Ms-npt_Noc] / pJ281_alaDH_B.s._TA_C.v.(ct)의 발효 브로쓰에서의 모노아민 및 디아민의 정량적 검출 (n.d. = 검출가능하지 않음, *) 검출 한계보다 낮음, DDA = 도데칸디오산, LA = 라우르산).
균주는 도데칸산, 도데칸디오산 및 올레산으로부터 각각 아민 도데실아민, 도데칸디아민 및 올레일아민을 생산할 수 있는 것으로 나타났다.
실시예 5
오리자 사티바로부터의 α-디옥시게나제를 코딩하는 유전자 αDOX의 발현을 위한 발현 벡터의 생산
α-디옥시게나제 (NP_001066718.1)를 코딩하는 오리자 사티바로부터의 αDOX (Os12g0448900, 서열 16)의 발현을 위한 벡터를 생산하기 위해, 유전자를 에스케리키아 콜라이에서의 발현을 위해 코돈-최적화하고, 합성하고, 동시에 상류 NdeI 제한 부위 및 하류 AvrII 제한 부위를 도입하였다. 합성된 DNA 단편을 제한 엔도뉴클레아제 NdeI 및 AvrII에 의해 소화시키고, 상응하게 유전자 carA_Ms 및 npt_Noc를 제거하면서 절단 벡터 pACYC{Placuv5}[carA_Ms-npt_Noc] (서열 10) 내로 라이게이션하였다. 벡터에 존재하는 lacuv5 프로모터 (서열 3)는 유지하였다. 완성된 벡터는 pACYC{Placuv5}[DOX_Os(co_Ec)] (서열 17)로서 지칭하였다. 벡터 pACYC는 클로람페니콜 내성을 매개하고, 또한 p15A 복제 기점을 보유하여, 적은 카피 수 (세포당 10-15개 카피)를 갖는 이. 콜라이 벡터이다.
실시예 6
오리자 사티바로부터의 유전자 αDOX, 바실루스 서브틸리스로부터의 ald 및 크로모박테리움 비올라세움으로부터의 Cv2025를 과다발현하는, 유전자 bioH에 결실을 갖는 이. 콜라이 균주의 생산
α-디옥시게나제 (NP_001066718.1)를 코딩하는 오리자 사티바로부터의 유전자 αDOX를 알라닌 데히드로게나제 (NP_391071.1)를 코딩하는 바실루스 서브틸리스로부터의 유전자 ald (서열 11) 및 트랜스아미나제 (NP_901695.1)를 코딩하는 크로모박테리움 비올라세움으로부터의 유전자 Cv2025 (서열 12)와 함께 공발현하는 이. 콜라이 균주를 생성하기 위해, 균주 이. 콜라이 W3110 ΔbioH (생산: EP12007663 실시예 1 참조)를 전기천공에 의해 플라스미드 pACYC{Placuv5}[DOX_Os(co_Ec)] (서열 17) 및 pJ281_alaDH_B.s._TA_C.v.(ct) (서열 15)로 형질전환시키고, 클로람페니콜 (50 μg/ml) 및 카나마이신 (50 μg/ml)을 함유하는 LB 한천 플레이트 상에 도말하였다. 형질전환체를 플라스미드 제조 및 분석적 제한 분석에 의해 정확한 플라스미드의 존재에 대해 검사하였다. 생성된 균주는 이. 콜라이 ΔbioH pACYC{Placuv5}[DOX_Os(co_Ec)] / pJ281_alaDH_B.s._TA_C.v.(ct)로서 지칭하였다.
균주를 사용하여, 메틸 도데칸디오에이트에서 출발하여 메틸 아미노운데카노에이트를 생산하는 그의 능력을 조사하였다.
실시예 7
오리자 사티바로부터의 유전자 αDOX에 대한 발현 벡터를 바실루스 서브틸리스로부터의 유전자 ald 및 크로모박테리움 비올라세움으로부터의 유전자 Cv_2025에 대한 발현 벡터와 함께 함유하는 이. 콜라이 균주에 의한, 메틸 도데칸디오에이트로부터 출발하는 메틸 아미노운데카노에이트의 생산
실시예 8에 기재된 균주를 사용하여 메틸 아미노운데카노에이트의 생산과 관련한 그의 능력을 조사하였다. 이에 대한 절차는 다음과 같았다:
조사 중인 균주를 먼저, 50 μg/ml 클로람페니콜 및 50 μg/ml 카나마이신을 함유하는 LB 한천 플레이트에 도포하고, 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 대조군으로서, 균주 이. 콜라이 W3110 ΔbioH를 항생제를 함유하지 않는 LB 한천 플레이트에 추가로 도포하였다. 이어서, 균주를 50 μg/ml 클로람페니콜 및 50 μg/ml 카나마이신을 함유하는 루리아-베르타니 브로쓰, 밀러 (머크, 다름슈타트) (플라스미드-보유 균주용)에서 각 경우 단일 콜로니로부터의 20 ml 예비-배양물로서 배양하였다. 본배양으로서, 처음에 50 μg/ml 클로람페니콜 및 50 μg/ml 카나마이신을 함유하는 LB 브로쓰 100 ml를 배플을 함유하는 500 ml 삼각 플라스크 내로 충전하고, 예비-배양물로부터의 2 ml를 접종하였다. 먼저 인큐베이터 진탕기에서 37℃ 및 200 rpm에서 배양을 수행하였다. 광학 밀도 (600 nm) 0.5 - 0.7의 달성시에, 1 mM IPTG를 첨가하여 유전자 발현을 유도하였다. 밤새 22℃ 및 200 rpm에서 추가의 배양을 수행하였다. 다음날, 4℃ 및 5525 x g에서 10분 원심분리에 의해 배양물을 수거하였다. 상청액을 폐기하고, 세포 펠릿을 200 mM 인산칼륨 완충제 (pH 7.5)에서 세척하였다. 마지막으로, 세포 펠릿을 50 mM 염화암모늄 및 0.5% (w/v) 글루코스를 함유하는 200 mM 인산칼륨 완충제 중에 녹여서, OD (600 nm) 20을 달성하였다. 에탄올 중 12.5 mM 메틸 도데칸디오에이트 (abcr, 카를스루에(Karlsruhe))를 세포 현탁액에 첨가하고, 30℃ 및 300 rpm에서 4시간 동안 온화하게 진탕하였다. 인큐베이션 동안, 샘플을 시간 0분, 60분, 120분, 180분 및 240분에 취하고, 80% 아세토니트릴, 20% 물 및 0.1% 포름산의 혼합물에 추출하였다. 상청액을 HPLC/MS 분석에 의해 분석하였다. 결과를 하기 표에 제시하였다.
Figure 112015068775014-pct00008
오리자 사티바로부터의 αDOX, 바실루스 서브틸리스로부터의 ald 및 크로모박테리움 비올라세움으로부터의 Cv_2025를 과다발현하는 이. 콜라이 W3110 ΔbioH의 메틸 아미노운데카노에이트의 생산. 피크 면적이 명시되어 있다 (n.d. = 검출가능하지 않음).
균주 이. 콜라이 W3110 ΔbioH pACYC{Placuv5}[DOX] / pJ281_alaDH_B.s._TA_C.v.(ct)는 메틸 도데칸디오에이트로부터 출발하여 메틸 아미노운데카노에이트를 형성할 수 있음을 제시할 수 있었다.
SEQUENCE LISTING <110> Evonik Industries AG <120> Herstellung von Aminen und Diaminen aus einer Carbons?re oder Dicarbons?re oder eines Monoesters davon <130> 2012000206 <160> 17 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 3507 <212> DNA <213> Mycobacterium smegmatis <400> 1 atgacgatcg aaacgcgcga agaccgcttc aaccggcgca ttgaccactt gttcgaaacc 60 gacccgcagt tcgccgccgc ccgtcccgac gaggcgatca gcgcggctgc cgccgatccg 120 gagttgcgcc ttcctgccgc ggtcaaacag attctggccg gctatgcgga ccgccctgcg 180 ctcggcaagc gcgccgtcga gttcgtcacc gacgaagaag gccgcaccac cgcgaagctc 240 ctgccccgct tcgacaccat cacctaccgt cagctcgcag gccggatcca ggccgtgacc 300 aatgcctggc acaaccatcc ggtgaatgcc ggtgaccgcg tggccatcct gggtttcacc 360 agtgtcgact acacgacgat cgacatcgcc ctgctcgaac tcggcgccgt gtccgtaccg 420 ctgcagacca gtgcgccggt ggcccaactg cagccgatcg tcgccgagac cgagcccaag 480 gtgatcgcgt cgagcgtcga cttcctcgcc gacgcagtcg ctctcgtcga gtccgggccc 540 gcgccgtcgc gactggtggt gttcgactac agccacgagg tcgacgatca gcgtgaggcg 600 ttcgaggcgg ccaagggcaa gctcgcaggc accggcgtcg tcgtcgagac gatcaccgac 660 gtactggacc gcgggcggtc actcgccgac gcaccgctct acgtgcccga cgagaccgac 720 ccgctgaccc ttctcatcta cacctccggc agcaccggca ctcccaaggg cgcgatgtac 780 cccgagtcca agaccgccac gatgtggcag gccgggtcca aggcccggtg ggacgagacc 840 ctcggcgtga tgccgtcaat caccctgaac ttcatgccca tgagtcacgt catggggcgc 900 ggcatcctgt gcagcacact cgccagcggc ggaaccgcgt acttcgccgc acgcagcgac 960 ctgtccacct tcctggagga cctcgccctc gtgcggccca cgcagctcaa cttcgttcct 1020 cgcatctggg acatgctgtt ccaggagtac cagagccgcc tcgacaaccg ccgcgccgag 1080 ggatccgagg accgagccga agccgcagtc ctcgaagagg tccgcaccca actgctcggc 1140 gggcgattcg tttcggccct gaccggatcg gctcccatct cggcggagat gaagagctgg 1200 gtcgaggacc tgctcgacat gcatctgctg gagggctacg gctccaccga ggccggcgcg 1260 gtgttcatcg acgggcagat ccagcgcccg ccggtcatcg actacaagct ggtcgacgtg 1320 cccgatctcg gctacttcgc cacggaccgg ccctacccgc gcggcgaact tctggtcaag 1380 tccgagcaga tgttccccgg ctactacaag cgtccggaga tcaccgccga gatgttcgac 1440 gaggacgggt actaccgcac cggcgacatc gtcgccgagc tcgggcccga ccatctcgaa 1500 tacctcgacc gccgcaacaa cgtgctgaaa ctgtcgcagg gcgaattcgt cacggtctcc 1560 aagctggagg cggtgttcgg cgacagcccc ctggtacgcc agatctacgt ctacggcaac 1620 agcgcgcggt cctatctgct ggcggtcgtg gtcccgaccg aagaggcact gtcacgttgg 1680 gacggtgacg aactcaagtc gcgcatcagc gactcactgc aggacgcggc acgagccgcc 1740 ggattgcagt cgtatgagat cccgcgtgac ttcctcgtcg agacaacacc tttcacgctg 1800 gagaacggcc tgctgaccgg tatccgcaag ctggcccggc cgaaactgaa ggcgcactac 1860 ggcgaacgcc tcgaacagct ctacaccgac ctggccgagg ggcaggccaa cgagttgcgc 1920 gagttgcgcc gcaacggagc cgaccggccc gtggtcgaga ccgtcagccg cgccgcggtc 1980 gcactgctcg gtgcctccgt cacggatctg cggtccgatg cgcacttcac cgatctgggt 2040 ggagattcgt tgtcggcctt gagcttctcg aacctgttgc acgagatctt cgatgtcgac 2100 gtgccggtcg gcgtcatcgt cagcccggcc accgacctgg caggcgtcgc ggcctacatc 2160 gagggcgaac tgcgcggctc caagcgcccc acatacgcgt cggtgcacgg gcgcgacgcc 2220 accgaggtgc gcgcgcgtga tctcgccctg ggcaagttca tcgacgccaa gaccctgtcc 2280 gccgcgccgg gtctgccgcg ttcgggcacc gagatccgca ccgtgctgct gaccggcgcc 2340 accgggttcc tgggccgcta tctggcgctg gaatggctgg agcgcatgga cctggtggac 2400 ggcaaggtga tctgcctggt gcgcgcccgc agcgacgacg aggcccgggc gcgtctggac 2460 gccacgttcg acaccgggga cgcgacactg ctcgagcact accgcgcgct ggcagccgat 2520 cacctcgagg tgatcgccgg tgacaagggc gaggccgatc tgggtctcga ccacgacacg 2580 tggcagcgac tggccgacac cgtcgatctg atcgtcgatc cggccgccct ggtcaatcac 2640 gtcctgccgt acagccagat gttcggaccc aatgcgctcg gcaccgccga actcatccgg 2700 atcgcgctga ccaccacgat caagccgtac gtgtacgtct cgacgatcgg tgtgggacag 2760 ggcatctccc ccgaggcgtt cgtcgaggac gccgacatcc gcgagatcag cgcgacgcgc 2820 cgggtcgacg actcgtacgc caacggctac ggcaacagca agtgggccgg cgaggtcctg 2880 ctgcgggagg cgcacgactg gtgtggtctg ccggtctcgg tgttccgctg cgacatgatc 2940 ctggccgaca cgacctactc gggtcagctg aacctgccgg acatgttcac ccgcctgatg 3000 ctgagcctcg tggcgaccgg catcgcgccc ggttcgttct acgaactcga tgcggacggc 3060 aaccggcagc gcgcccacta cgacgggctg cccgtggagt tcatcgccga ggcgatctcc 3120 accatcggct cgcaggtcac cgacggattc gagacgttcc acgtgatgaa cccgtacgac 3180 gacggcatcg gcctcgacga gtacgtggac tggctgatcg aggccggcta ccccgtgcac 3240 cgcgtcgacg actacgccac ctggctgagc cggttcgaaa ccgcactgcg ggccctgccg 3300 gaacggcaac gtcaggcctc gctgctgccg ctgctgcaca actatcagca gccctcaccg 3360 cccgtgtgcg gtgccatggc acccaccgac cggttccgtg ccgcggtgca ggacgcgaag 3420 atcggccccg acaaggacat tccgcacgtc acggccgacg tgatcgtcaa gtacatcagc 3480 aacctgcaga tgctcggatt gctgtaa 3507 <210> 2 <211> 672 <212> DNA <213> Nocardia sp. <400> 2 atgatcgaga caattttgcc tgctggtgtc gagtcggctg agctgctgga gtatccggag 60 gacctgaagg cgcatccggc ggaggagcat ctcatcgcga agtcggtgga gaagcggcgc 120 cgggacttca tcggggccag gcattgtgcc cggctggcgc tggctgagct cggcgagccg 180 ccggtggcga tcggcaaagg ggagcggggt gcgccgatct ggccgcgcgg cgtcgtcggc 240 agcctcaccc attgcgacgg atatcgggcc gcggcggtgg cgcacaagat gcgcttccgt 300 tcgatcggca tcgatgccga gccgcacgcg acgctgcccg aaggcgtgct ggattcggtc 360 agcctgccgc cggagcggga gtggttgaag accaccgatt ccgcactgca cctggaccgt 420 ttactgttct gcgccaagga agccacctac aaggcgtggt ggccgctgac cgcgcgctgg 480 ctcggcttcg aggaagcgca catcaccttc gagatcgaag acggctccgc cgattccggc 540 aacggcacct ttcacagcga gctgctggtg ccgggacaga cgaatgacgg tgggacgccg 600 ctgctttcgt tcgacggccg gtggctgatc gccgacgggt tcatcctcac cgcgatcgcg 660 tacgcctgat aa 672 <210> 3 <211> 153 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promotor <400> 3 ggcagtgagc gcaacgcaat taatgtaagt tagctcactc attaggcacc ccaggcttga 60 cactttatgc ttccggctcg tataatgtgt ggaattgtga gcggataaca ataacaattt 120 cacacaggat ctaggaacca aggagagtgg cat 153 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 ttatgcgact cctgctggct atggtgggat ttcc 34 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 gatcgtcata tgccactctc cttggttcc 29 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 tggcatatga cgatcgaaac gcgcg 25 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 tccttctctt acagcaatcc gagcatct 28 <210> 8 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 gctgtaagag aaggagttct atcatgatcg ag 32 <210> 9 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 gcagcctagg ttaatttatc aggcgtacgc gatcg 35 <210> 10 <211> 8047 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Vector <400> 10 attaacctag gctgctgcca ccgctgagca ataactagca taaccccttg gggcctctaa 60 acgggtcttg aggggttttt tgctgaaacc tcaggcattt gagaagcaca cggtcacact 120 gcttccggta gtcaataaac cggtaaacca gcaatagaca taagcggcta tttaacgacc 180 ctgccctgaa ccgacgaccg ggtcgaattt gctttcgaat ttctgccatt catccgctta 240 ttatcactta ttcaggcgta gcaccaggcg tttaagggca ccaataactg ccttaaaaaa 300 attacgcccc gccctgccac tcatcgcagt actgttgtaa ttcattaagc attctgccga 360 catggaagcc atcacagacg gcatgatgaa cctgaatcgc cagcggcatc agcaccttgt 420 cgccttgcgt ataatatttg cccatagtga aaacgggggc gaagaagttg tccatattgg 480 ccacgtttaa atcaaaactg gtgaaactca cccagggatt ggctgagacg aaaaacatat 540 tctcaataaa ccctttaggg aaataggcca ggttttcacc gtaacacgcc acatcttgcg 600 aatatatgtg tagaaactgc cggaaatcgt cgtggtattc actccagagc gatgaaaacg 660 tttcagtttg ctcatggaaa acggtgtaac aagggtgaac actatcccat atcaccagct 720 caccgtcttt cattgccata cggaactccg gatgagcatt catcaggcgg gcaagaatgt 780 gaataaaggc cggataaaac ttgtgcttat ttttctttac ggtctttaaa aaggccgtaa 840 tatccagctg aacggtctgg ttataggtac attgagcaac tgactgaaat gcctcaaaat 900 gttctttacg atgccattgg gatatatcaa cggtggtata tccagtgatt tttttctcca 960 ttttagcttc cttagctcct gaaaatctcg ataactcaaa aaatacgccc ggtagtgatc 1020 ttatttcatt atggtgaaag ttggaacctc ttacgtgccg atcaacgtct cattttcgcc 1080 aaaagttggc ccagggcttc ccggtatcaa cagggacacc aggatttatt tattctgcga 1140 agtgatcttc cgtcacaggt atttattcgg cgcaaagtgc gtcgggtgat gctgccaact 1200 tactgattta gtgtatgatg gtgtttttga ggtgctccag tggcttctgt ttctatcagc 1260 tgtccctcct gttcagctac tgacggggtg gtgcgtaacg gcaaaagcac cgccggacat 1320 cagcgctagc ggagtgtata ctggcttact atgttggcac tgatgagggt gtcagtgaag 1380 tgcttcatgt ggcaggagaa aaaaggctgc accggtgcgt cagcagaata tgtgatacag 1440 gatatattcc gcttcctcgc tcactgactc gctacgctcg gtcgttcgac tgcggcgagc 1500 ggaaatggct tacgaacggg gcggagattt cctggaagat gccaggaaga tacttaacag 1560 ggaagtgaga gggccgcggc aaagccgttt ttccataggc tccgcccccc tgacaagcat 1620 cacgaaatct gacgctcaaa tcagtggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag 1680 gcgtttcccc tggcggctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc tgcctttcgg tttaccggtg 1740 tcattccgct gttatggccg cgtttgtctc attccacgcc tgacactcag ttccgggtag 1800 gcagttcgct ccaagctgga ctgtatgcac gaaccccccg ttcagtccga ccgctgcgcc 1860 ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggaaagac atgcaaaagc accactggca 1920 gcagccactg gtaattgatt tagaggagtt agtcttgaag tcatgcgccg gttaaggcta 1980 aactgaaagg acaagttttg gtgactgcgc tcctccaagc cagttacctc ggttcaaaga 2040 gttggtagct cagagaacct tcgaaaaacc gccctgcaag gcggtttttt cgttttcaga 2100 gcaagagatt acgcgcagac caaaacgatc tcaagaagat catcttatta atcagataaa 2160 atatttctag atttcagtgc aatttatctc ttcaaatgta gcacctgaag tcagccccat 2220 acgatataag ttgtaattct catgttagtc atgccccgcg cccaccggaa ggagctgact 2280 gggttgaagg ctctcaaggg catcggtcga gatcccggtg cctaatgagt gagctaactt 2340 acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg 2400 cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ccagggtggt 2460 ttttcttttc accagtgaga cgggcaacag ctgattgccc ttcaccgcct ggccctgaga 2520 gagttgcagc aagcggtcca cgctggtttg ccccagcagg cgaaaatcct gtttgatggt 2580 ggttaacggc gggatataac atgagctgtc ttcggtatcg tcgtatccca ctaccgagat 2640 gtccgcacca acgcgcagcc cggactcggt aatggcgcgc attgcgccca gcgccatctg 2700 atcgttggca accagcatcg cagtgggaac gatgccctca ttcagcattt gcatggtttg 2760 ttgaaaaccg gacatggcac tccagtcgcc ttcccgttcc gctatcggct gaatttgatt 2820 gcgagtgaga tatttatgcc agccagccag acgcagacgc gccgagacag aacttaatgg 2880 gcccgctaac agcgcgattt gctggtgacc caatgcgacc agatgctcca cgcccagtcg 2940 cgtaccgtct tcatgggaga aaataatact gttgatgggt gtctggtcag agacatcaag 3000 aaataacgcc ggaacattag tgcaggcagc ttccacagca atggcatcct ggtcatccag 3060 cggatagtta atgatcagcc cactgacgcg ttgcgcgaga agattgtgca ccgccgcttt 3120 acaggcttcg acgccgcttc gttctaccat cgacaccacc acgctggcac ccagttgatc 3180 ggcgcgagat ttaatcgccg cgacaatttg cgacggcgcg tgcagggcca gactggaggt 3240 ggcaacgcca atcagcaacg actgtttgcc cgccagttgt tgtgccacgc ggttgggaat 3300 gtaattcagc tccgccatcg ccgcttccac tttttcccgc gttttcgcag aaacgtggct 3360 ggcctggttc accacgcggg aaacggtctg ataagagaca ccggcatact ctgcgacatc 3420 gtataacgtt actggtttca cattcaccac cctgaattga ctctcttccg ggcgctatca 3480 tgccataccg cgaaaggttt tgcgccattc gatggtgtcc gggatctcga cgctctccct 3540 tatgcgactc ctgctggcta tggtgggatt tcccttgctg aaatgggaga tccgatcatg 3600 ttcgagctct tattcaaata cactgctgtg ttggcggtaa gcgttctcga gcgcggccgc 3660 gcgatcgcac ctggtgttta aacggccggc ccctgcaggg gcagtgagcg caacgcaatt 3720 aatgtaagtt agctcactca ttaggcaccc caggcttgac actttatgct tccggctcgt 3780 ataatgtgtg gaattgtgag cggataacaa taacaatttc acacaggatc taggaaccaa 3840 ggagagtggc atatgacgat cgaaacgcgc gaagaccgct tcaaccggcg cattgaccac 3900 ttgttcgaaa ccgacccgca gttcgccgcc gcccgtcccg acgaggcgat cagcgcggct 3960 gccgccgatc cggagttgcg ccttcctgcc gcggtcaaac agattctggc cggctatgcg 4020 gaccgccctg cgctcggcaa gcgcgccgtc gagttcgtca ccgacgaaga aggccgcacc 4080 accgcgaagc tcctgccccg cttcgacacc atcacctacc gtcagctcgc aggccggatc 4140 caggccgtga ccaatgcctg gcacaaccat ccggtgaatg ccggtgaccg cgtggccatc 4200 ctgggtttca ccagtgtcga ctacacgacg atcgacatcg ccctgctcga actcggcgcc 4260 gtgtccgtac cgctgcagac cagtgcgccg gtggcccaac tgcagccgat cgtcgccgag 4320 accgagccca aggtgatcgc gtcgagcgtc gacttcctcg ccgacgcagt cgctctcgtc 4380 gagtccgggc ccgcgccgtc gcgactggtg gtgttcgact acagccacga ggtcgacgat 4440 cagcgtgagg cgttcgaggc ggccaagggc aagctcgcag gcaccggcgt cgtcgtcgag 4500 acgatcaccg acgtactgga ccgcgggcgg tcactcgccg acgcaccgct ctacgtgccc 4560 gacgagaccg acccgctgac ccttctcatc tacacctccg gcagcaccgg cactcccaag 4620 ggcgcgatgt accccgagtc caagaccgcc acgatgtggc aggccgggtc caaggcccgg 4680 tgggacgaga ccctcggcgt gatgccgtca atcaccctga acttcatgcc catgagtcac 4740 gtcatggggc gcggcatcct gtgcagcaca ctcgccagcg gcggaaccgc gtacttcgcc 4800 gcacgcagcg acctgtccac cttcctggag gacctcgccc tcgtgcggcc cacgcagctc 4860 aacttcgttc ctcgcatctg ggacatgctg ttccaggagt accagagccg cctcgacaac 4920 cgccgcgccg agggatccga ggaccgagcc gaagccgcag tcctcgaaga ggtccgcacc 4980 caactgctcg gcgggcgatt cgtttcggcc ctgaccggat cggctcccat ctcggcggag 5040 atgaagagct gggtcgagga cctgctcgac atgcatctgc tggagggcta cggctccacc 5100 gaggccggcg cggtgttcat cgacgggcag atccagcgcc cgccggtcat cgactacaag 5160 ctggtcgacg tgcccgatct cggctacttc gccacggacc ggccctaccc gcgcggcgaa 5220 cttctggtca agtccgagca gatgttcccc ggctactaca agcgtccgga gatcaccgcc 5280 gagatgttcg acgaggacgg gtactaccgc accggcgaca tcgtcgccga gctcgggccc 5340 gaccatctcg aatacctcga ccgccgcaac aacgtgctga aactgtcgca gggcgaattc 5400 gtcacggtct ccaagctgga ggcggtgttc ggcgacagcc ccctggtacg ccagatctac 5460 gtctacggca acagcgcgcg gtcctatctg ctggcggtcg tggtcccgac cgaagaggca 5520 ctgtcacgtt gggacggtga cgaactcaag tcgcgcatca gcgactcact gcaggacgcg 5580 gcacgagccg ccggattgca gtcgtatgag atcccgcgtg acttcctcgt cgagacaaca 5640 cctttcacgc tggagaacgg cctgctgacc ggtatccgca agctggcccg gccgaaactg 5700 aaggcgcact acggcgaacg cctcgaacag ctctacaccg acctggccga ggggcaggcc 5760 aacgagttgc gcgagttgcg ccgcaacgga gccgaccggc ccgtggtcga gaccgtcagc 5820 cgcgccgcgg tcgcactgct cggtgcctcc gtcacggatc tgcggtccga tgcgcacttc 5880 accgatctgg gtggagattc gttgtcggcc ttgagcttct cgaacctgtt gcacgagatc 5940 ttcgatgtcg acgtgccggt cggcgtcatc gtcagcccgg ccaccgacct ggcaggcgtc 6000 gcggcctaca tcgagggcga actgcgcggc tccaagcgcc ccacatacgc gtcggtgcac 6060 gggcgcgacg ccaccgaggt gcgcgcgcgt gatctcgccc tgggcaagtt catcgacgcc 6120 aagaccctgt ccgccgcgcc gggtctgccg cgttcgggca ccgagatccg caccgtgctg 6180 ctgaccggcg ccaccgggtt cctgggccgc tatctggcgc tggaatggct ggagcgcatg 6240 gacctggtgg acggcaaggt gatctgcctg gtgcgcgccc gcagcgacga cgaggcccgg 6300 gcgcgtctgg acgccacgtt cgacaccggg gacgcgacac tgctcgagca ctaccgcgcg 6360 ctggcagccg atcacctcga ggtgatcgcc ggtgacaagg gcgaggccga tctgggtctc 6420 gaccacgaca cgtggcagcg actggccgac accgtcgatc tgatcgtcga tccggccgcc 6480 ctggtcaatc acgtcctgcc gtacagccag atgttcggac ccaatgcgct cggcaccgcc 6540 gaactcatcc ggatcgcgct gaccaccacg atcaagccgt acgtgtacgt ctcgacgatc 6600 ggtgtgggac agggcatctc ccccgaggcg ttcgtcgagg acgccgacat ccgcgagatc 6660 agcgcgacgc gccgggtcga cgactcgtac gccaacggct acggcaacag caagtgggcc 6720 ggcgaggtcc tgctgcggga ggcgcacgac tggtgtggtc tgccggtctc ggtgttccgc 6780 tgcgacatga tcctggccga cacgacctac tcgggtcagc tgaacctgcc ggacatgttc 6840 acccgcctga tgctgagcct cgtggcgacc ggcatcgcgc ccggttcgtt ctacgaactc 6900 gatgcggacg gcaaccggca gcgcgcccac tacgacgggc tgcccgtgga gttcatcgcc 6960 gaggcgatct ccaccatcgg ctcgcaggtc accgacggat tcgagacgtt ccacgtgatg 7020 aacccgtacg acgacggcat cggcctcgac gagtacgtgg actggctgat cgaggccggc 7080 taccccgtgc accgcgtcga cgactacgcc acctggctga gccggttcga aaccgcactg 7140 cgggccctgc cggaacggca acgtcaggcc tcgctgctgc cgctgctgca caactatcag 7200 cagccctcac cgcccgtgtg cggtgccatg gcacccaccg accggttccg tgccgcggtg 7260 caggacgcga agatcggccc cgacaaggac attccgcacg tcacggccga cgtgatcgtc 7320 aagtacatca gcaacctgca gatgctcgga ttgctgtaag agaaggagtt ctatcatgat 7380 cgagacaatt ttgcctgctg gtgtcgagtc ggctgagctg ctggagtatc cggaggacct 7440 gaaggcgcat ccggcggagg agcatctcat cgcgaagtcg gtggagaagc ggcgccggga 7500 cttcatcggg gccaggcatt gtgcccggct ggcgctggct gagctcggcg agccgccggt 7560 ggcgatcggc aaaggggagc ggggtgcgcc gatctggccg cgcggcgtcg tcggcagcct 7620 cacccattgc gacggatatc gggccgcggc ggtggcgcac aagatgcgct tccgttcgat 7680 cggcatcgat gccgagccgc acgcgacgct gcccgaaggc gtgctggatt cggtcagcct 7740 gccgccggag cgggagtggt tgaagaccac cgattccgca ctgcacctgg accgtttact 7800 gttctgcgcc aaggaagcca cctacaaggc gtggtggccg ctgaccgcgc gctggctcgg 7860 cttcgaggaa gcgcacatca ccttcgagat cgaagacggc tccgccgatt ccggcaacgg 7920 cacctttcac agcgagctgc tggtgccggg acagacgaat gacggtggga cgccgctgct 7980 ttcgttcgac ggccggtggc tgatcgccga cgggttcatc ctcaccgcga tcgcgtacgc 8040 ctgataa 8047 <210> 11 <211> 1137 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 11 atgatcatag gggttcctaa agagataaaa aacaatgaaa accgtgtcgc attaacaccc 60 gggggcgttt ctcagctcat ttcaaacggc caccgggtgc tggttgaaac aggcgcgggc 120 cttggaagcg gatttgaaaa tgaagcctat gagtcagcag gagcggaaat cattgctgat 180 ccgaagcagg tctgggacgc cgaaatggtc atgaaagtaa aagaaccgct gccggaagaa 240 tatgtttatt ttcgcaaagg acttgtgctg tttacgtacc ttcatttagc agctgagcct 300 gagcttgcac aggccttgaa ggataaagga gtaactgcca tcgcatatga aacggtcagt 360 gaaggccgga cattgcctct tctgacgcca atgtcagagg ttgcgggcag aatggcagcg 420 caaatcggcg ctcaattctt agaaaagcct aaaggcggaa aaggcattct gcttgccggg 480 gtgcctggcg tttcccgcgg aaaagtaaca attatcggag gaggcgttgt cgggacaaac 540 gcggcgaaaa tggctgtcgg cctcggtgca gatgtgacga tcattgactt aaacgcagac 600 cgcttgcgcc agcttgatga catcttcggc catcagatta aaacgttaat ttctaatccg 660 gtcaatattg ctgatgctgt ggcggaagcg gatctcctca tttgcgcggt attaattccg 720 ggtgctaaag ctccgactct tgtcactgag gaaatggtaa aacaaatgaa acccggttca 780 gttattgttg atgtagcgat cgaccaaggc ggcatcgtcg aaactgtcga ccatatcaca 840 acacatgatc agccaacata tgaaaaacac ggggttgtgc attatgctgt agcgaacatg 900 ccaggcgcag tccctcgtac atcaacaatc gccctgacta acgttactgt tccatacgcg 960 ctgcaaatcg cgaacaaagg ggcagtaaaa gcgctcgcag acaatacggc actgagagcg 1020 ggtttaaaca ccgcaaacgg acacgtgacc tatgaagctg tagcaagaga tctaggctat 1080 gagtatgttc ctgccgagaa agctttacag gatgaatcat ctgtggcggg tgcttaa 1137 <210> 12 <211> 1380 <212> DNA <213> Chromobacterium violaceum <400> 12 atgcagaaac agcgtaccac ctctcagtgg cgtgaactcg atgcggcgca tcatctccat 60 ccgtttaccg ataccgcgag cctcaatcag gcgggtgcgc gtgtgatgac ccgtggcgaa 120 ggcgtgtatc tctgggatag cgaaggcaac aaaattattg atggcatggc gggcctctgg 180 tgcgtgaacg tgggctatgg ccgtaaagat tttgcggaag cggcgcgtcg tcagatggaa 240 gaactcccgt tttataacac cttctttaaa accacccatc cggcggtggt ggaactcagc 300 agcctcctcg ccgaagttac cccggcaggt tttgatcgtg tgttttatac caacagcggc 360 agcgaaagcg tggataccat gattcgtatg gtgcgtcgtt attgggatgt gcagggcaaa 420 ccggaaaaaa aaaccctcat tggccgttgg aacggctatc acggcagcac cattggcggt 480 gcgagcctcg gcggcatgaa atatatgcat gaacagggcg atctcccgat tccgggcatg 540 gcgcatattg aacagccgtg gtggtataaa catggcaaag atatgacccc ggatgaattt 600 ggcgtggttg cggcgcgttg gctcgaagaa aaaattctcg aaatcggcgc ggataaagtg 660 gcggcgtttg tgggcgaacc gattcagggt gcgggcggtg tgattgttcc gccggcaacc 720 tattggccgg aaattgaacg tatttgccgc aaatatgatg tgctcctcgt tgcggatgaa 780 gtgatttgcg gctttggccg taccggcgaa tggtttggcc atcagcattt tggctttcag 840 ccggacctct ttaccgcggc gaaaggcctc agcagcggct atctcccgat tggcgcggtg 900 tttgtgggca aacgtgttgc ggaaggtctc attgcgggcg gtgattttaa ccatggcttt 960 acctatagcg gccatccggt gtgtgcggcg gtggcgcatg cgaatgttgc ggcgctccgt 1020 gatgaaggca ttgtgcagcg tgtgaaagat gatattggcc cgtatatgca gaaacgttgg 1080 cgtgaaacct ttagccgttt tgaacatgtg gatgatgtgc gtggcgtggg catggtgcag 1140 gcgtttaccc tcgtgaaaaa caaagcgaaa cgtgaactct ttccggattt tggcgaaatt 1200 ggcaccctct gccgcgatat tttttttcgc aacaacctca ttatgcgtgc gtgcggcgat 1260 cacattgtgt ctgcaccgcc gctcgttatg acccgtgcgg aagtggatga aatgctcgcc 1320 gtggcggaac gttgcctcga agaatttgaa cagaccctca aagcgcgtgg cctcgcctaa 1380 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 13 atgatcatag gggttcctaa agag 24 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 14 ttaagcaccc gccacagatg 20 <210> 15 <211> 6866 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Vector <400> 15 atgatcatag gggttcctaa agagataaaa aacaatgaaa accgtgtcgc attaacaccc 60 gggggcgttt ctcagctcat ttcaaacggc caccgggtgc tggttgaaac aggcgcgggc 120 cttggaagcg gatttgaaaa tgaagcctat gagtcagcag gagcggaaat cattgctgat 180 ccgaagcagg tctgggacgc cgaaatggtc atgaaagtaa aagaaccgct gccggaagaa 240 tatgtttatt ttcgcaaagg acttgtgctg tttacgtacc ttcatttagc agctgagcct 300 gagcttgcac aggccttgaa ggataaagga gtaactgcca tcgcatatga aacggtcagt 360 gaaggccgga cattgcctct tctgacgcca atgtcagagg ttgcgggcag aatggcagcg 420 caaatcggcg ctcaattctt agaaaagcct aaaggcggaa aaggcattct gcttgccggg 480 gtgcctggcg tttcccgcgg aaaagtaaca attatcggag gaggcgttgt cgggacaaac 540 gcggcgaaaa tggctgtcgg cctcggtgca gatgtgacga tcattgactt aaacgcagac 600 cgcttgcgcc agcttgatga catcttcggc catcagatta aaacgttaat ttctaatccg 660 gtcaatattg ctgatgctgt ggcggaagcg gatctcctca tttgcgcggt attaattccg 720 ggtgctaaag ctccgactct tgtcactgag gaaatggtaa aacaaatgaa acccggttca 780 gttattgttg atgtagcgat cgaccaaggc ggcatcgtcg aaactgtcga ccatatcaca 840 acacatgatc agccaacata tgaaaaacac ggggttgtgc attatgctgt agcgaacatg 900 ccaggcgcag tccctcgtac atcaacaatc gccctgacta acgttactgt tccatacgcg 960 ctgcaaatcg cgaacaaagg ggcagtaaaa gcgctcgcag acaatacggc actgagagcg 1020 ggtttaaaca ccgcaaacgg acacgtgacc tatgaagctg tagcaagaga tctaggctat 1080 gagtatgttc ctgccgagaa agctttacag gatgaatcat ctgtggcggg tgcttaatta 1140 aggagatata atatgcagaa acagcgtacc acctctcagt ggcgtgaact cgatgcggcg 1200 catcatctcc atccgtttac cgataccgcg agcctcaatc aggcgggtgc gcgtgtgatg 1260 acccgtggcg aaggcgtgta tctctgggat agcgaaggca acaaaattat tgatggcatg 1320 gcgggcctct ggtgcgtgaa cgtgggctat ggccgtaaag attttgcgga agcggcgcgt 1380 cgtcagatgg aagaactccc gttttataac accttcttta aaaccaccca tccggcggtg 1440 gtggaactca gcagcctcct cgccgaagtt accccggcag gttttgatcg tgtgttttat 1500 accaacagcg gcagcgaaag cgtggatacc atgattcgta tggtgcgtcg ttattgggat 1560 gtgcagggca aaccggaaaa aaaaaccctc attggccgtt ggaacggcta tcacggcagc 1620 accattggcg gtgcgagcct cggcggcatg aaatatatgc atgaacaggg cgatctcccg 1680 attccgggca tggcgcatat tgaacagccg tggtggtata aacatggcaa agatatgacc 1740 ccggatgaat ttggcgtggt tgcggcgcgt tggctcgaag aaaaaattct cgaaatcggc 1800 gcggataaag tggcggcgtt tgtgggcgaa ccgattcagg gtgcgggcgg tgtgattgtt 1860 ccgccggcaa cctattggcc ggaaattgaa cgtatttgcc gcaaatatga tgtgctcctc 1920 gttgcggatg aagtgatttg cggctttggc cgtaccggcg aatggtttgg ccatcagcat 1980 tttggctttc agccggacct ctttaccgcg gcgaaaggcc tcagcagcgg ctatctcccg 2040 attggcgcgg tgtttgtggg caaacgtgtt gcggaaggtc tcattgcggg cggtgatttt 2100 aaccatggct ttacctatag cggccatccg gtgtgtgcgg cggtggcgca tgcgaatgtt 2160 gcggcgctcc gtgatgaagg cattgtgcag cgtgtgaaag atgatattgg cccgtatatg 2220 cagaaacgtt ggcgtgaaac ctttagccgt tttgaacatg tggatgatgt gcgtggcgtg 2280 ggcatggtgc aggcgtttac cctcgtgaaa aacaaagcga aacgtgaact ctttccggat 2340 tttggcgaaa ttggcaccct ctgccgcgat attttttttc gcaacaacct cattatgcgt 2400 gcgtgcggcg atcacattgt gtctgcaccg ccgctcgtta tgacccgtgc ggaagtggat 2460 gaaatgctcg ccgtggcgga acgttgcctc gaagaatttg aacagaccct caaagcgcgt 2520 ggcctcgcct aataatctag atcaacaact ctcctggcgc accatcgtcg gctacagcct 2580 cgggaattgc tgcaagtcga cggatcgccg gaattaattc tcatgtttga cagcttatca 2640 ctgatcagtg aattaatggc gatgacgcat cctcacgata atatccgggt aggcgcaatc 2700 actttcgtct ctactccgtt acaaagcgag gctgggtatt tcccggcctt tttgggccgg 2760 ccggatcccc ccacttcaga agttcctata cactagagaa taggaacttc actatagagt 2820 cgaataaggg cgacaccccc taattagccc gggcgaaagg cccagtcttt cgactgagcc 2880 tttcgtttta tttgatgcct ggcagttccc tactctcgca tggggagtcc ccacactacc 2940 atcggcgcta cggcgtttca cttctgagtt cggcatgggg tcaggtggga ccaccgcgct 3000 actgccgcca ggcaaacaag gggtgttatg agccatattc aggtataaat gggctcgcga 3060 taatgttcag aattggttaa ttggttgtaa cactgacccc tatttgttta tttttctaaa 3120 tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatatt 3180 gaaaaaggaa gaatatgagc catattcaac gggaaacgtc gaggccgcga ttaaattcca 3240 acatggatgc tgatttatat gggtataaat gggctcgcga taatgtcggg caatcaggtg 3300 cgacaatcta tcgcttgtat gggaagcccg atgcgccaga gttgtttctg aaacatggca 3360 aaggtagcgt tgccaatgat gttacagatg agatggtcag actaaactgg ctgacggaat 3420 ttatgccact tccgaccatc aagcatttta tccgtactcc tgatgatgca tggttactca 3480 ccactgcgat ccccggaaaa acagcgttcc aggtattaga agaatatcct gattcaggtg 3540 aaaatattgt tgatgcgctg gcagtgttcc tgcgccggtt gcactcgatt cctgtttgta 3600 attgtccttt taacagcgat cgcgtatttc gcctcgctca ggcgcaatca cgaatgaata 3660 acggtttggt tgatgcgagt gattttgatg acgagcgtaa tggctggcct gttgaacaag 3720 tctggaaaga aatgcataaa cttttgccat tctcaccgga ttcagtcgtc actcatggtg 3780 atttctcact tgataacctt atttttgacg aggggaaatt aataggttgt attgatgttg 3840 gacgagtcgg aatcgcagac cgataccagg atcttgccat cctatggaac tgcctcggtg 3900 agttttctcc ttcattacag aaacggcttt ttcaaaaata tggtattgat aatcctgata 3960 tgaataaatt gcagtttcat ttgatgctcg atgagttttt ctaaaagcgg cgcgccatcg 4020 aatggcgcaa aacctttcgc ggtatggcat gatagcgccc ggaagagagt caattcaggg 4080 tggtgaatat gaaaccagta acgttatacg atgtcgcaga gtatgccggt gtctcttatc 4140 agaccgtttc ccgcgtggtg aaccaggcca gccacgtttc tgcgaaaacg cgggaaaaag 4200 tggaagcggc gatggcggag ctgaattaca ttcccaaccg cgtggcacaa caactggcgg 4260 gcaaacagtc gttgctgatt ggcgttgcca cctccagtct ggccctgcac gcgccgtcgc 4320 aaattgtcgc ggcgattaaa tctcgcgccg atcaactggg tgccagcgtg gtggtgtcga 4380 tggtagaacg aagcggcgtc gaagcctgta aagcggcggt gcacaatctt ctcgcgcaac 4440 gcgtcagtgg gctgatcatt aactatccgc tggatgacca ggatgccatt gctgtggaag 4500 ctgcctgcac taatgttccg gcgttatttc ttgatgtctc tgaccagaca cccatcaaca 4560 gtattatttt ctcccatgag gacggtacgc gactgggcgt ggagcatctg gtcgcattgg 4620 gtcaccagca aatcgcgctg ttagcgggcc cattaagttc tgtctcggcg cgtctgcgtc 4680 tggctggctg gcataaatat ctcactcgca atcaaattca gccgatagcg gaacgggaag 4740 gcgactggag tgccatgtcc ggttttcaac aaaccatgca aatgctgaat gagggcatcg 4800 ttcccactgc gatgctggtt gccaacgatc agatggcgct gggcgcaatg cgcgccatta 4860 ccgagtccgg gctgcgcgtt ggtgcggata tctcggtagt gggatacgac gataccgaag 4920 atagctcatg ttatatcccg ccgttaacca ccatcaaaca ggattttcgc ctgctggggc 4980 aaaccagcgt ggaccgcttg ctgcaactct ctcagggcca ggcggtgaag ggcaatcagc 5040 tgttgccagt ctcactggtg aaaagaaaaa ccaccctggc gcccaatacg caaaccgcct 5100 ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctggcacg acaggtttcc cgactggaaa 5160 gcgggcagtg actcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt acgcgcgcgt cgttccactg 5220 agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt 5280 aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca 5340 agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac 5400 tgttcttcta gtgtagccgt agttagccca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac 5460 atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct 5520 taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg 5580 gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca 5640 gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt 5700 aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta 5760 tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc 5820 gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc 5880 cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa 5940 ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag 6000 cgagtcagtg agcgaggaag cggaaggcga gagtagggaa ctgccaggca tcaaactaag 6060 cagaaggccc ctgacggatg gcctttttgc gtttctacaa actctttctg tgttgtaaaa 6120 cgacggccag tcttaagctc gggccccctg ggcggttctg ataacgagta atcgttaatc 6180 cgcaaataac gtaaaaaccc gcttcggcgg gtttttttat ggggggagtt tagggaaaga 6240 gcatttgtca gaatatttaa gggcgcctgt cactttgctt gatatatgag aattatttaa 6300 ccttataaat gagaaaaaag caacgcactt taaataagat acgttgcttt ttcgattgat 6360 gaacacctat aattaaacta ttcatctatt atttatgatt ttttgtatat acaatatttc 6420 tagtttgtta aagagaatta agaaaataaa tctcgaaaat aataaaggga aaatcagttt 6480 ttgatatcaa aattatacat gtcaacgata atacaaaata taatacaaac tataagatgt 6540 tatcagtatt tattatgcat ttagaataaa ttttgtgtcg cccttattcg actcactata 6600 gaagttccta ttctctagta agtataggaa cttcacttca ttttggatcc ggccggcctg 6660 cagccccgca gggcctgtct cggtcgatca ttcagcccgg ctcatagata tgcgggcagt 6720 gagcgcaacg caattaatgt aagttagctc actcattagg caccccaggc ttgacacttt 6780 atgcttccgg ctcgtataat gtgtggaatt gtgagcggat aacaataaca atttcacaca 6840 ggatctagga accaaggaga gtggca 6866 <210> 16 <211> 1857 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 16 atgggttctg gtctgttcaa gccgcgtgtt cacccggatc tgcgtgacgt tttctctaaa 60 atgtctttct tcgacaaaat cggtttcctg ttcatccacg cgttcgacaa acgtaacctg 120 tggcacaaag ttccggttcc gatcggtctg ctgtacctga acacccgtcg taccctgctg 180 gaaaaataca atctgctggc cgttggtcgt tcttctcacg gtgcgctgtt cgacccaaaa 240 gaattcctgt accgtaccga agatggtaaa tacaatgacc cgcacaacgc ggaagccggc 300 tctcaaaaca ccttctttgg tcgcaacatg gagccggttg accagcagga cgaactgatg 360 tctccggacc cgttcgttgt tgcgaccaaa ctgctggcgc gtcgtgaata caaagacacc 420 ggcaaacagt tcaacatcct ggcggcagcg tggatccagt tcatggttca cgattggatg 480 gaccacatgg aggacaccgg tcaaattggt atcaccgcgc cgaaagaagt tgcgaacgaa 540 tgcccgctga aatctttcaa attccacccg acgaaagaac tgccgaccaa ctctgacggt 600 atcaaaatcg gtcactacaa catccgtacc gcgtggtggg acggttctgc ggtttacggt 660 aacaatgaag aacgtgcgga aaaactgcgt acctacgttg acggtaaact ggttatcggt 720 gatgacggtc tgctgctgca caaagaaaac ggtgttgcgc tgtctggtga catccgcaac 780 tcttgggcgg gcgtttctat cctgcaggct ctgttcgtta aagaacacaa cgcggtttgc 840 gacgcgatca aggaagaaca cccgaacctg tctgacgaag aactgtaccg ttacgcgaaa 900 ctggttacct ctgcggttat cgcgaaagtt cacaccatcg actggaccgt tgaactgctg 960 aagaccaaaa ccatgcgtgc ggcgatgcgt gcgaactggt acggcctgct gggtaaaaaa 1020 atcaaagaca cctttggcca catcggtggt ccgatcctgg gtggtctggt tggtctgaaa 1080 aaaccaaaca accacggtgt tccgtactct ctgactgaag aattcacctc tgtgtatcgt 1140 atgcactctc tgatcccgtc taccctgaaa ctgcgtgacc cgaccggtca gccggacgcg 1200 aataactctc cgccgtgcct ggaagacatc gacatcggtg agatgatcgg tctgaaaggt 1260 gaggaacagc tgtctaaaat tggcttcgaa aaacaggcgc tgtctatggg ttaccaggcg 1320 tgtggtgcgc tggaactgtg gaactacccg tctttcttcc gtaacctgat cccacagaac 1380 ctggacggta ccaatcgttc tgaccgtatc gacctggcgg cgctggaagt ttatcgtgac 1440 cgtgaacgtt ctgttccgcg ttacaacgaa ttccgtcgtc gtctgttcct gatcccgatc 1500 aaatcttggg aagacctgac ctctgacaaa gacgcgattg aaaccatccg tgcgatctac 1560 ggtgacgacg ttgaaaaact ggacctgctg gttggtctga tggcggaaaa gaaaatcaaa 1620 ggcttcgcga tctctgaaac cgcgttcaac atcttcatcc tgatggcttc tcgtcgtctg 1680 gaagcggacc gtttcttcac ctccaacttc aacgaagaga cgtacaccaa aaaaggtatg 1740 cagtgggtta aaaccaccga aggtctgcgc gacgttatca accgtcacta tccggaaatc 1800 accgcgaaat ggatgaaatc ttcttctgcg ttctctgttt gggacgcgga ctactag 1857 <210> 17 <211> 5704 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vector <400> 17 ctaggctgct gccaccgctg agcaataact agcataaccc cttggggcct ctaaacgggt 60 cttgaggggt tttttgctga aacctcaggc atttgagaag cacacggtca cactgcttcc 120 ggtagtcaat aaaccggtaa accagcaata gacataagcg gctatttaac gaccctgccc 180 tgaaccgacg accgggtcga atttgctttc gaatttctgc cattcatccg cttattatca 240 cttattcagg cgtagcacca ggcgtttaag ggcaccaata actgccttaa aaaaattacg 300 ccccgccctg ccactcatcg cagtactgtt gtaattcatt aagcattctg ccgacatgga 360 agccatcaca gacggcatga tgaacctgaa tcgccagcgg catcagcacc ttgtcgcctt 420 gcgtataata tttgcccata gtgaaaacgg gggcgaagaa gttgtccata ttggccacgt 480 ttaaatcaaa actggtgaaa ctcacccagg gattggctga gacgaaaaac atattctcaa 540 taaacccttt agggaaatag gccaggtttt caccgtaaca cgccacatct tgcgaatata 600 tgtgtagaaa ctgccggaaa tcgtcgtggt attcactcca gagcgatgaa aacgtttcag 660 tttgctcatg gaaaacggtg taacaagggt gaacactatc ccatatcacc agctcaccgt 720 ctttcattgc catacggaac tccggatgag cattcatcag gcgggcaaga atgtgaataa 780 aggccggata aaacttgtgc ttatttttct ttacggtctt taaaaaggcc gtaatatcca 840 gctgaacggt ctggttatag gtacattgag caactgactg aaatgcctca aaatgttctt 900 tacgatgcca ttgggatata tcaacggtgg tatatccagt gatttttttc tccattttag 960 cttccttagc tcctgaaaat ctcgataact caaaaaatac gcccggtagt gatcttattt 1020 cattatggtg aaagttggaa cctcttacgt gccgatcaac gtctcatttt cgccaaaagt 1080 tggcccaggg cttcccggta tcaacaggga caccaggatt tatttattct gcgaagtgat 1140 cttccgtcac aggtatttat tcggcgcaaa gtgcgtcggg tgatgctgcc aacttactga 1200 tttagtgtat gatggtgttt ttgaggtgct ccagtggctt ctgtttctat cagctgtccc 1260 tcctgttcag ctactgacgg ggtggtgcgt aacggcaaaa gcaccgccgg acatcagcgc 1320 tagcggagtg tatactggct tactatgttg gcactgatga gggtgtcagt gaagtgcttc 1380 atgtggcagg agaaaaaagg ctgcaccggt gcgtcagcag aatatgtgat acaggatata 1440 ttccgcttcc tcgctcactg actcgctacg ctcggtcgtt cgactgcggc gagcggaaat 1500 ggcttacgaa cggggcggag atttcctgga agatgccagg aagatactta acagggaagt 1560 gagagggccg cggcaaagcc gtttttccat aggctccgcc cccctgacaa gcatcacgaa 1620 atctgacgct caaatcagtg gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt 1680 cccctggcgg ctccctcgtg cgctctcctg ttcctgcctt tcggtttacc ggtgtcattc 1740 cgctgttatg gccgcgtttg tctcattcca cgcctgacac tcagttccgg gtaggcagtt 1800 cgctccaagc tggactgtat gcacgaaccc cccgttcagt ccgaccgctg cgccttatcc 1860 ggtaactatc gtcttgagtc caacccggaa agacatgcaa aagcaccact ggcagcagcc 1920 actggtaatt gatttagagg agttagtctt gaagtcatgc gccggttaag gctaaactga 1980 aaggacaagt tttggtgact gcgctcctcc aagccagtta cctcggttca aagagttggt 2040 agctcagaga accttcgaaa aaccgccctg caaggcggtt ttttcgtttt cagagcaaga 2100 gattacgcgc agaccaaaac gatctcaaga agatcatctt attaatcaga taaaatattt 2160 ctagatttca gtgcaattta tctcttcaaa tgtagcacct gaagtcagcc ccatacgata 2220 taagttgtaa ttctcatgtt agtcatgccc cgcgcccacc ggaaggagct gactgggttg 2280 aaggctctca agggcatcgg tcgagatccc ggtgcctaat gagtgagcta acttacatta 2340 attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa 2400 tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgccaggg tggtttttct 2460 tttcaccagt gagacgggca acagctgatt gcccttcacc gcctggccct gagagagttg 2520 cagcaagcgg tccacgctgg tttgccccag caggcgaaaa tcctgtttga tggtggttaa 2580 cggcgggata taacatgagc tgtcttcggt atcgtcgtat cccactaccg agatgtccgc 2640 accaacgcgc agcccggact cggtaatggc gcgcattgcg cccagcgcca tctgatcgtt 2700 ggcaaccagc atcgcagtgg gaacgatgcc ctcattcagc atttgcatgg tttgttgaaa 2760 accggacatg gcactccagt cgccttcccg ttccgctatc ggctgaattt gattgcgagt 2820 gagatattta tgccagccag ccagacgcag acgcgccgag acagaactta atgggcccgc 2880 taacagcgcg atttgctggt gacccaatgc gaccagatgc tccacgccca gtcgcgtacc 2940 gtcttcatgg gagaaaataa tactgttgat gggtgtctgg tcagagacat caagaaataa 3000 cgccggaaca ttagtgcagg cagcttccac agcaatggca tcctggtcat ccagcggata 3060 gttaatgatc agcccactga cgcgttgcgc gagaagattg tgcaccgccg ctttacaggc 3120 ttcgacgccg cttcgttcta ccatcgacac caccacgctg gcacccagtt gatcggcgcg 3180 agatttaatc gccgcgacaa tttgcgacgg cgcgtgcagg gccagactgg aggtggcaac 3240 gccaatcagc aacgactgtt tgcccgccag ttgttgtgcc acgcggttgg gaatgtaatt 3300 cagctccgcc atcgccgctt ccactttttc ccgcgttttc gcagaaacgt ggctggcctg 3360 gttcaccacg cgggaaacgg tctgataaga gacaccggca tactctgcga catcgtataa 3420 cgttactggt ttcacattca ccaccctgaa ttgactctct tccgggcgct atcatgccat 3480 accgcgaaag gttttgcgcc attcgatggt gtccgggatc tcgacgctct cccttatgcg 3540 actcctgctg gctatggtgg gatttccctt gctgaaatgg gagatccgat catgttcgag 3600 ctcttattca aatacactgc tgtgttggcg gtaagcgttc tcgagcgcgg ccgcgcgatc 3660 gcacctggtg tttaaacggc cggcccctgc aggggcagtg agcgcaacgc aattaatgta 3720 agttagctca ctcattaggc accccaggct tgacacttta tgcttccggc tcgtataatg 3780 tgtggaattg tgagcggata acaataacaa tttcacacag gatctaggaa ccaaggagag 3840 tggcatatgg gttctggtct gttcaagccg cgtgttcacc cggatctgcg tgacgttttc 3900 tctaaaatgt ctttcttcga caaaatcggt ttcctgttca tccacgcgtt cgacaaacgt 3960 aacctgtggc acaaagttcc ggttccgatc ggtctgctgt acctgaacac ccgtcgtacc 4020 ctgctggaaa aatacaatct gctggccgtt ggtcgttctt ctcacggtgc gctgttcgac 4080 ccaaaagaat tcctgtaccg taccgaagat ggtaaataca atgacccgca caacgcggaa 4140 gccggctctc aaaacacctt ctttggtcgc aacatggagc cggttgacca gcaggacgaa 4200 ctgatgtctc cggacccgtt cgttgttgcg accaaactgc tggcgcgtcg tgaatacaaa 4260 gacaccggca aacagttcaa catcctggcg gcagcgtgga tccagttcat ggttcacgat 4320 tggatggacc acatggagga caccggtcaa attggtatca ccgcgccgaa agaagttgcg 4380 aacgaatgcc cgctgaaatc tttcaaattc cacccgacga aagaactgcc gaccaactct 4440 gacggtatca aaatcggtca ctacaacatc cgtaccgcgt ggtgggacgg ttctgcggtt 4500 tacggtaaca atgaagaacg tgcggaaaaa ctgcgtacct acgttgacgg taaactggtt 4560 atcggtgatg acggtctgct gctgcacaaa gaaaacggtg ttgcgctgtc tggtgacatc 4620 cgcaactctt gggcgggcgt ttctatcctg caggctctgt tcgttaaaga acacaacgcg 4680 gtttgcgacg cgatcaagga agaacacccg aacctgtctg acgaagaact gtaccgttac 4740 gcgaaactgg ttacctctgc ggttatcgcg aaagttcaca ccatcgactg gaccgttgaa 4800 ctgctgaaga ccaaaaccat gcgtgcggcg atgcgtgcga actggtacgg cctgctgggt 4860 aaaaaaatca aagacacctt tggccacatc ggtggtccga tcctgggtgg tctggttggt 4920 ctgaaaaaac caaacaacca cggtgttccg tactctctga ctgaagaatt cacctctgtg 4980 tatcgtatgc actctctgat cccgtctacc ctgaaactgc gtgacccgac cggtcagccg 5040 gacgcgaata actctccgcc gtgcctggaa gacatcgaca tcggtgagat gatcggtctg 5100 aaaggtgagg aacagctgtc taaaattggc ttcgaaaaac aggcgctgtc tatgggttac 5160 caggcgtgtg gtgcgctgga actgtggaac tacccgtctt tcttccgtaa cctgatccca 5220 cagaacctgg acggtaccaa tcgttctgac cgtatcgacc tggcggcgct ggaagtttat 5280 cgtgaccgtg aacgttctgt tccgcgttac aacgaattcc gtcgtcgtct gttcctgatc 5340 ccgatcaaat cttgggaaga cctgacctct gacaaagacg cgattgaaac catccgtgcg 5400 atctacggtg acgacgttga aaaactggac ctgctggttg gtctgatggc ggaaaagaaa 5460 atcaaaggct tcgcgatctc tgaaaccgcg ttcaacatct tcatcctgat ggcttctcgt 5520 cgtctggaag cggaccgttt cttcacctcc aacttcaacg aagagacgta caccaaaaaa 5580 ggtatgcagt gggttaaaac caccgaaggt ctgcgcgacg ttatcaaccg tcactatccg 5640 gaaatcaccg cgaaatggat gaaatcttct tctgcgttct ctgtttggga cgcggactac 5700 tagc 5704

Claims (15)

  1. 재조합 α-디옥시게나제를 발현, 또는 재조합 지방산 리덕타제와 이 지방산 리덕타제를 포스포판테테이닐화하는 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제와의 조합을 발현하고, 추가로 트랜스아미나제를 발현하며, 상기 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 및 트랜스아미나제는 재조합인 것인, 박테리아인 전세포 촉매.
  2. 제1항에 있어서, 재조합인 아미노산 데히드로게나제를 추가로 발현하는 전세포 촉매.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 재조합인 알칸 히드록실라제를 추가로 발현하는 전세포 촉매.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 재조합인 AlkL 패밀리의 폴리펩티드를 추가로 발현하는 전세포 촉매.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 재조합인 알콜 데히드로게나제를 추가로 발현하는 전세포 촉매.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, β-산화에 관여하는 적어도 하나의 효소의 활성이 전세포 촉매의 야생형에 비해 감소되는 것인 전세포 촉매.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, BioH 또는 그의 변이체의 활성이 전세포 촉매의 야생형에 비해 감소되거나 상승되는 것인 전세포 촉매.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, FadL 또는 그의 변이체의 활성이 전세포 촉매의 야생형에 비해 상승되는 것인 전세포 촉매.
  9. a) 카르복실산 또는 디카르복실산 또는 이들의 모노에스테르를 제공하는 단계,
    b) 카르복실산 또는 디카르복실산 또는 이들의 모노에스테르를 포스포판테테이닐화 지방산 리덕타제 또는 α-디옥시게나제와 접촉시켜 알데히드 생성물을 형성하는 단계, 및
    c) 단계 b)로부터의 알데히드 생성물을 트랜스아미나제와 접촉시키는 단계
    를 포함하며,
    상기 포스포판테테이닐화 지방산 리덕타제, α-디옥시게나제, 및 트랜스아미나제는 제1항에 따른 전세포 촉매의 형태로 제공되는 것인,
    카르복실산 또는 디카르복실산 또는 이들의 모노에스테르를 아민 또는 디아민으로 전환시키는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 아미노산 데히드로게나제가 단계 c)에 존재하는 것인 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 카르복실산 또는 디카르복실산 또는 이들의 모노에스테르가 하기 화학식 I의 화합물인 방법.
    <화학식 I>
    R1 - A - COOR2
    상기 화학식 I에서,
    R1은 -H 및 COOR3을 포함하는 군으로부터 선택되고,
    R2 및 R3은 각각 독립적으로 H, 메틸, 에틸 및 프로필을 포함하는 군으로부터 선택되며,
    단 라디칼 R2 및 R3 중 적어도 하나는 H이고,
    A는 적어도 4개의 탄소를 갖는 비분지형, 분지형, 선형, 시클릭, 치환 또는 비치환된 탄화수소 기이다.
  12. 제9항 또는 제10항에 있어서, A가 화학식 -(CH2)n-을 가지며, 여기서 n은 적어도 4, 또는 적어도 10인 방법.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, 카르복실산 또는 디카르복실산 또는 이들의 모노에스테르를 아미노화하는데 사용하기 위한 전세포 촉매.
  14. 제9항 또는 제10항에 있어서, 카르복실산 또는 디카르복실산 또는 이들의 모노에스테르를 아미노화하는데 사용하기 위한 방법.
  15. 수용액 중 제1항 또는 제2항에 따른 전세포 촉매 및 하기 화학식 I의 카르복실산 또는 디카르복실산 또는 그의 모노에스테르를 포함하는 반응 혼합물.
    <화학식 I>
    R1 - A - COOR2
    상기 화학식 I에서,
    R1은 -H 및 COOR3을 포함하는 군으로부터 선택되고,
    R2 및 R3은 각각 독립적으로 H, 메틸, 에틸 및 프로필을 포함하는 군으로부터 선택되며,
    단 라디칼 R2 및 R3 중 적어도 하나는 H이고,
    A는 적어도 4개의 탄소를 갖는 비분지형, 분지형, 선형, 시클릭, 치환 또는 비치환된 탄화수소 기, 또는 화학식 -(CH2)n-이며, 여기서 n은 적어도 4, 또는 적어도 10이다.
KR1020157019188A 2012-12-21 2013-12-18 카르복실산 또는 디카르복실산 또는 이들의 모노에스테르로부터의 아민 및 디아민의 제조 KR102113555B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP12199048.5 2012-12-21
EP12199048.5A EP2746400A1 (de) 2012-12-21 2012-12-21 Herstellung von Aminen und Diaminen aus einer Carbonsäure oder Dicarbonsäure oder eines Monoesters davon
PCT/EP2013/077069 WO2014095986A1 (de) 2012-12-21 2013-12-18 Herstellung von aminen und diaminen aus einer carbonsäure oder dicarbonsäure oder eines monoesters davon

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20150100752A KR20150100752A (ko) 2015-09-02
KR102113555B1 true KR102113555B1 (ko) 2020-05-21

Family

ID=47563098

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020157019188A KR102113555B1 (ko) 2012-12-21 2013-12-18 카르복실산 또는 디카르복실산 또는 이들의 모노에스테르로부터의 아민 및 디아민의 제조

Country Status (14)

Country Link
US (1) US9725746B2 (ko)
EP (2) EP2746400A1 (ko)
JP (1) JP6556057B2 (ko)
KR (1) KR102113555B1 (ko)
CN (1) CN104937104B (ko)
BR (1) BR112015014778B1 (ko)
CA (1) CA2895867C (ko)
ES (1) ES2670143T3 (ko)
HK (1) HK1210226A1 (ko)
HU (1) HUE037548T2 (ko)
MX (1) MX356338B (ko)
MY (1) MY191294A (ko)
SG (2) SG11201504947WA (ko)
WO (1) WO2014095986A1 (ko)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2602328A1 (de) * 2011-12-05 2013-06-12 Evonik Industries AG Verfahren zur Oxidation von Alkanen unter Verwendung einer AlkB Alkan 1-Monooxygenase
US10039777B2 (en) 2012-03-20 2018-08-07 Neuro-Lm Sas Methods and pharmaceutical compositions of the treatment of autistic syndrome disorders
EP2647696A1 (de) 2012-04-02 2013-10-09 Evonik Degussa GmbH Verfahren zur aeroben Herstellung von Alanin oder einer unter Verbrauch von Alanin entstehenden Verbindung
EP2700448A1 (de) 2012-08-21 2014-02-26 Evonik Industries AG Verzweigte Fettsäuren als flüssige Kationenaustauscher
WO2022209763A1 (ja) 2021-03-30 2022-10-06 旭化成株式会社 カルボン酸還元活性を有する組換えポリペプチド
JPWO2022209994A1 (ko) 2021-03-30 2022-10-06
EP4353814A1 (en) 2021-05-19 2024-04-17 Asahi Kasei Kabushiki Kaisha Recombinant microorganism having diamine producing ability and method for manufacturing diamine

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009077461A1 (de) 2007-12-17 2009-06-25 Evonik Degussa Gmbh ω-AMINOCARBONSÄUREN, ω-AMINOCARBONSÄUREESTER ODER IHRE LACTAME HERSTELLENDE, REKOMBINANTE ZELLEN
WO2010135624A2 (en) 2009-05-22 2010-11-25 Codexis, Inc. Engineered biosynthesis of fatty alcohols
WO2011131420A1 (de) 2010-04-20 2011-10-27 Evonik Degussa Gmbh Biokatalytisches oxidationsverfahren mit alkl-genprodukt
WO2012025629A1 (de) 2010-08-26 2012-03-01 Symrise Ag Ganzzell-biotransformation von fettsäuren zu den um ein kohlenstoffatom verkürzten fettaldehyden

Family Cites Families (66)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9917733D0 (en) 1999-07-28 1999-09-29 Kvaerner Earl & Wright Thermal insulated pipelines
JP2001202371A (ja) 2000-01-19 2001-07-27 Sony Corp データ通信システムならびにそれに用いる受信装置
DE10054347A1 (de) 2000-11-02 2002-05-08 Degussa Verfahren zur katalytischen Hydrierung organischer Verbindungen und Trägerkatalysatoren hierfür
DE10142620A1 (de) 2001-08-31 2003-03-20 Degussa Ammoximation von Ketonen und Aufarbeitung durch Pervaporation/Dampfpermeation
DE10142621A1 (de) 2001-08-31 2003-03-20 Degussa Aufarbeitung der Ammoximationsprodukte von Ketonen durch Flüssig-Flüssig-Extraktion in einem ternären Lösemittelsystem
ATE422962T1 (de) 2002-05-31 2009-03-15 Evonik Degussa Gmbh Geträgerter rutheniumkatalysator und verfahren zur hydrierung eines aromatischen amins in gegenwart dieses katalysators
DE10231119A1 (de) 2002-07-10 2004-02-05 Degussa Ag Verfahren zur Selektivitätserhöhung der Hydrierung von 4,4'-Diaminodiphenylmethan zu 4,4'-Diaminodicyclohexylmethan in Gegenwart eines N-Alkyl-4,4'-Diaminodiphenylmethans
DE10247495A1 (de) 2002-10-11 2004-04-22 Degussa Ag Verfahren zur Epoxidierung cyclischer Alkene
EP1424332A1 (en) 2002-11-26 2004-06-02 Degussa AG Process for the purification of crude propene oxide
US6878836B2 (en) 2003-06-18 2005-04-12 Degussa Ag Process for the epoxidation of propene
DE10344469A1 (de) 2003-09-25 2005-04-14 Degussa Ag Coammoximierung von Ketonen
DE102005053071A1 (de) 2005-11-04 2007-05-16 Degussa Verfahren zur Herstellung von ultrafeinen Pulvern auf Basis Polymaiden, ultrafeinen Polyamidpulver sowie deren Verwendung
DE102006058190A1 (de) 2006-04-28 2007-10-31 Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von Amiden aus Ketoximen
DE102006022014A1 (de) 2006-05-10 2007-11-15 Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von Cyclododecatrien
EP2024501B1 (en) 2006-05-11 2016-11-16 Evonik Degussa GmbH Improved production of sphingoid bases using genetically engineered microbial strains
US7491854B2 (en) 2006-05-31 2009-02-17 Archer-Daniels-Midland Company Enzymatic method of making aldehydes from fatty acids
DE102006025821A1 (de) 2006-06-02 2007-12-06 Degussa Gmbh Ein Enzym zur Herstellung von Mehylmalonatsemialdehyd oder Malonatsemialdehyd
DE102007021199B4 (de) 2006-07-17 2016-02-11 Evonik Degussa Gmbh Zusammensetzungen aus organischem Polymer als Matrix und anorganischen Partikeln als Füllstoff, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung und damit hergestellte Formkörper
DE102008002090A1 (de) 2008-05-30 2009-12-03 Evonik Degussa Gmbh Ungesättigte Dicarbonsäuren aus ungesättigten cyclischen Kohlenwasserstoffen und Acrylsäure mittels Metathese, deren Verwendung als Monomere für Polyamide, Polyester, Polyurethane sowie weitere Umsetzung zu DIolen und Diaminen
DE102008002715A1 (de) 2008-06-27 2009-12-31 Evonik Röhm Gmbh 2-Hydroxyisobuttersäure produzierende rekombinante Zelle
DE102008040193A1 (de) 2008-07-04 2010-01-07 Evonik Röhm Gmbh Verfahren zur Herstellung freier Carbonsäuren
JP2012504963A (ja) * 2008-10-07 2012-03-01 エルエス９・インコーポレイテッド 脂肪アルデヒドを生産するための方法および組成物
DE102009000662A1 (de) 2009-02-06 2010-08-12 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von Aldehyden und Ketonen aus primären und sekundären Alkoholen
DE102009000661A1 (de) 2009-02-06 2010-08-12 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von 2,6-Dioxabicyclo-(3.3.0)-octan-4,8-dion[1S,5S]
DE102009009580A1 (de) 2009-02-19 2010-08-26 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung freier Säuren aus ihren Salzen
DE102009002371A1 (de) 2009-04-15 2010-10-21 Evonik Goldschmidt Gmbh Verfahren zur Herstellung von geruchlosen Polyetheralkoholen mittels DMC-Katalysatoren und deren Verwendung in kosmetischen und/oder dermatologischen Zubereitungen
DE102009002811A1 (de) 2009-05-05 2010-11-11 Evonik Degussa Gmbh Enzymatisches Verfahren zur Herstellung von Aldehyden
DE102009027611A1 (de) 2009-07-10 2011-01-13 Evonik Degussa Gmbh Formmasse auf Basis eines Terephthalsäure- sowie Trimethylhexamethylendiamin-Einheit enthaltenden Copolyamids
DE102009046623A1 (de) 2009-11-11 2011-05-12 Evonik Röhm Gmbh Verwendung eines zu einem MeaB-Protein homologen Proteins zur Erhöhung der enzymatischen Aktivität einer 3-Hydroxycarbonsäure-CoA-Mutase
DE102009046626A1 (de) 2009-11-11 2011-05-12 Evonik Degussa Gmbh Candida tropicalis Zellen und deren Verwendung
DE102010014680A1 (de) 2009-11-18 2011-08-18 Evonik Degussa GmbH, 45128 Zellen, Nukleinsäuren, Enzyme und deren Verwendung sowie Verfahren zur Herstellung von Sophorolipiden
DE102009046910A1 (de) 2009-11-20 2011-05-26 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Aufarbeitung eines Laurinlactam enthaltenen Stoffstroms für die Rückgewinnung aller enthaltene Wertstoffkomponenten durch Kombination von Kristallisation mit nachgeschalteter Destillation
BR122019001300B1 (pt) 2009-12-23 2020-03-03 Evonik Degussa Gmbh Processo para produção de adoçantes
DE102010029973A1 (de) 2010-06-11 2011-12-15 Evonik Degussa Gmbh Mikrobiologische Herstellung von C4-Körpern aus Saccharose und Kohlendioxid
DE102010026196A1 (de) 2010-06-25 2011-12-29 Evonik Degussa Gmbh Synthese von omega-Aminocarbonsäuren und deren Estern aus ungesättigten Fettsäurederivaten
DE102010032484A1 (de) 2010-07-28 2012-02-02 Evonik Goldschmidt Gmbh Zellen und Verfahren zur Herstellung von Rhamnolipiden
DE102011004465A1 (de) 2010-09-10 2012-03-15 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur direkten Aminierung sekundärer Alkohole mit Ammoniak zu primären Aminen
DE102010043473A1 (de) 2010-11-05 2012-05-10 Evonik Degussa Gmbh Carbon Nanotubes enthaltende Polyamid 12-Zusammensetzung
DE102010043470A1 (de) 2010-11-05 2012-05-10 Evonik Degussa Gmbh Zusammensetzung aus Polyamiden mit niedriger Konzentration an Carbonsäureamidgruppen und elektrisch leitfähigem Kohlenstoff
DE102011075162A1 (de) 2010-12-08 2012-06-14 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur homogen-katalysierte, hochselektiven direkten Aminierung von primären Alkoholen mit Ammoniak zu primären Aminen bei hohem Volumenverhältnis von Flüssig- zu Gasphase und/oder hohen Drücken
UA112980C2 (uk) 2011-02-16 2016-11-25 Евонік Дегусса Гмбх Рідкі катіоніти
CN103370302B (zh) 2011-02-21 2015-06-17 赢创德固赛有限公司 借助Xantphos催化剂体系用氨将醇直接胺化成伯胺的方法
DE102011015150A1 (de) 2011-03-25 2012-09-27 Evonik Degussa Gmbh Syntese von alpha, omega-Dicarbonsäuren und deren Estern aus ungesättigten Fettsäurederivaten
RU2579510C2 (ru) 2011-04-12 2016-04-10 Эвоник Дегусса Гмбх Непрерывный способ получения карбонильных соединений посредством содержащего нитроксильный радикал катализатора
EP2557176A1 (en) 2011-06-15 2013-02-13 Evonik Degussa GmbH Enzymatic amination
RU2014106109A (ru) 2011-07-20 2015-08-27 Эвоник Дегусса Гмбх Окисление и аминирование первичных спиртов
US20140308717A1 (en) 2011-08-05 2014-10-16 Evonik Degussa Gmbh Oxidation and amination of secondary alcohols
DE102011110945A1 (de) 2011-08-15 2013-02-21 Evonik Degussa Gmbh Biotechnologisches Syntheseverfahren von organischen Verbindungen mit alkIL-Genprodukt
DE102011110946A1 (de) 2011-08-15 2016-01-21 Evonik Degussa Gmbh Biotechnologisches Syntheseverfahren von omegafunktionalisierten Carbonsäuren und Carbonsäure-Estern aus einfachen Kohlenstoffquellen
DE102011110959A1 (de) 2011-08-18 2013-02-21 Evonik Degussa Gmbh Pichia ciferrii Zellen und deren Verwendung
DE102011084521A1 (de) 2011-10-14 2013-04-18 Evonik Industries Ag Verwendung einer Mehrschichtfolie mit Polyamid- und Polypropylenschichten für die Herstellung photovoltaischer Module
DE102011084518A1 (de) 2011-10-14 2013-04-18 Evonik Industries Ag Verwendung einer Mehrschichtfolie mit Polyamid- und Polyesterschichten fürdie Herstellung photovoltaischer Module
EP2602329A1 (de) 2011-12-05 2013-06-12 Evonik Degussa GmbH Biotechnologische Herstellung von 3-Hydroxyisobuttersäure
EP2602328A1 (de) 2011-12-05 2013-06-12 Evonik Industries AG Verfahren zur Oxidation von Alkanen unter Verwendung einer AlkB Alkan 1-Monooxygenase
EP2607490A1 (de) 2011-12-22 2013-06-26 Evonik Industries AG Verfahren zur verbesserten Abtrennung einer hydrophoben organischen Lösung von einem wässrigen Kulturmedium
DE102011090092A1 (de) 2011-12-29 2013-07-04 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung eines Formteils aus einer Polyamidformmasse mit verbesserter Hydrolysebeständigkeit
EP2620504A1 (en) 2012-01-25 2013-07-31 Evonik Industries AG Process for oxidizing alkenes employing the Pseudomonas putida GPo1 AlkB monooxygenase
EP2639308A1 (de) 2012-03-12 2013-09-18 Evonik Industries AG Enzymatische omega-Oxidation und -Aminierung von Fettsäuren
DE102012204181A1 (de) 2012-03-16 2013-09-19 Evonik Degussa Gmbh Elektrisch leitfähigen Kohlenstoff enthaltende Polyamidzusammensetzung
EP2647696A1 (de) 2012-04-02 2013-10-09 Evonik Degussa GmbH Verfahren zur aeroben Herstellung von Alanin oder einer unter Verbrauch von Alanin entstehenden Verbindung
EP2653538A1 (de) 2012-04-20 2013-10-23 Evonik Industries AG NADP-abhängige Alanindehydrogenase
EP2700448A1 (de) 2012-08-21 2014-02-26 Evonik Industries AG Verzweigte Fettsäuren als flüssige Kationenaustauscher
EP2730655A1 (de) 2012-11-12 2014-05-14 Evonik Industries AG Verfahren zur Umsetzung eines Carbonsäureesters unter Verwendung BioH-defizienter Zellen
EP2746397A1 (de) * 2012-12-21 2014-06-25 Evonik Industries AG Herstellung von Omega-Aminofettsäuren
DE102013203470A1 (de) 2013-03-01 2014-09-04 Evonik Industries Ag Verfahren zur Herstellung von Ketonen aus Epoxiden
EP2843043A1 (en) 2013-08-27 2015-03-04 Evonik Industries AG A method for producing acyl amino acids

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009077461A1 (de) 2007-12-17 2009-06-25 Evonik Degussa Gmbh ω-AMINOCARBONSÄUREN, ω-AMINOCARBONSÄUREESTER ODER IHRE LACTAME HERSTELLENDE, REKOMBINANTE ZELLEN
WO2010135624A2 (en) 2009-05-22 2010-11-25 Codexis, Inc. Engineered biosynthesis of fatty alcohols
WO2011131420A1 (de) 2010-04-20 2011-10-27 Evonik Degussa Gmbh Biokatalytisches oxidationsverfahren mit alkl-genprodukt
WO2012025629A1 (de) 2010-08-26 2012-03-01 Symrise Ag Ganzzell-biotransformation von fettsäuren zu den um ein kohlenstoffatom verkürzten fettaldehyden

Also Published As

Publication number Publication date
HK1210226A1 (en) 2016-04-15
CA2895867A1 (en) 2014-06-26
BR112015014778B1 (pt) 2022-05-03
KR20150100752A (ko) 2015-09-02
CN104937104B (zh) 2019-04-09
JP6556057B2 (ja) 2019-08-07
EP2746400A1 (de) 2014-06-25
CA2895867C (en) 2022-04-05
MX2015007922A (es) 2016-01-25
US20150307906A1 (en) 2015-10-29
SG10201704911PA (en) 2017-07-28
MX356338B (es) 2018-05-23
HUE037548T2 (hu) 2018-09-28
EP2935602A1 (de) 2015-10-28
BR112015014778A2 (pt) 2017-10-10
JP2016501031A (ja) 2016-01-18
MY191294A (en) 2022-06-14
CN104937104A (zh) 2015-09-23
EP2935602B1 (de) 2018-02-21
ES2670143T3 (es) 2018-05-29
SG11201504947WA (en) 2015-07-30
WO2014095986A1 (de) 2014-06-26
US9725746B2 (en) 2017-08-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102113555B1 (ko) 카르복실산 또는 디카르복실산 또는 이들의 모노에스테르로부터의 아민 및 디아민의 제조
KR102252150B1 (ko) ω―아미노 지방산의 제조
CN103898172B (zh) 转化羧酸酯的方法
JP6312117B2 (ja) 疎水性の有機溶液と水性の培養培地との改善された分離方法
JP6436778B2 (ja) アルコール及びその誘導体のバイオテクノロジーによる生産
TWI601819B (zh) 丙胺酸之需氧性製造方法或因消耗丙胺酸而產生之化合物的需氧性製造方法
WO2007140816A1 (en) Glycolic acid production by fermentation from renewable resources
CN103987727A (zh) 使用alkL基因产物合成有机化合物的生物技术方法
JP2014155455A (ja) 組換え細胞、並びに、クロトニルＣｏＡ又はクロチルアルコールの生産方法
US20220348935A1 (en) Novel genetically engineered microorganism capable of growing on formate, methanol, methane or co2
GARDNER Expression vectors for the methane-producing archaeon Methanococcus maripaludis (Under the Direction of WILLIAM B. WHITMAN) Methanogens are strict anaerobes that use one and two carbon compounds for methanogenesis. They contain many unusual cofactors and enzymes, and many of their
Major The role of the energy conserving hydrogenase B in autotrophy and the characterization of sulfur metabolism in Methanococcus maripaludis

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right