JP6312117B2 - 疎水性の有機溶液と水性の培養培地との改善された分離方法 - Google Patents
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Description
α = C相1/C相2
により説明される。一つの特別な分配係数は、Kowであり、それはP値とも呼ばれ、オクタノール相と水相との間での化合物の分配平衡を特徴付けている:
Kow = P = Cオクタノール/C水
疎水性の相からの生成物の後処理のための更なる前提条件は、分配が上述の式によって記載される平衡状態に達したか、又はそれに少なくとも十分に近づいていることにある。その平衡の調整は、とりわけ、両方の相間の接触面の大きさという、生物工学的な方法の場合には一般に制約していない要素によって決定される。それというのも、前記接触面は、水性の培養培地と疎水性の有機溶液の通気及びその十分な撹拌などの、高密度の代謝活性な細胞を取得するにあたり必要となる措置によって既に高められているからである。
a)代謝活性な細胞を含む水性の培養培地を提供する工程と、
b)該水性の培養培地と、疎水性の有機溶液とを接触させる工程と、
c)疎水性の有機溶液と、水性の培養培地をと分離する工程と、
を含み、前記細胞が、その野生型に対して低減された活性の少なくとも1種の、脂肪酸のβ−酸化の反応の一つを触媒する酵素を有する前記方法によって解決される。
ラウリン酸メチルエステルからアミノラウリン酸メチルエステルへの生体内変化は、菌株W3110ΔFadE[alkB−alaD−TA]及びW3110[alkB−alaD−TA]を用いてDASGIP社製の8連の並列発酵システム(8-fach Parallelfermentationssystem)において行った。W3110[alkB−alaD−TA]は、WO2009077461に記載されるようなオキシドレダクターゼAlkB、アラニンデヒドロゲナーゼ及びトランスアミナーゼを含む酸化とアミノ基転移の系を有するpBR322系のプラスミドを含むE.コリW3110の菌株である。W3110ΔFadE[alkB−alaD−TA]は、前記菌株と同じであるが、FadEをコードする遺伝子が欠失されているので、アシルCoAデヒドロゲナーゼ活性を有さないという点で異なる。
生体内変化段階の間に、W3110ΔFadE[alkB−alaD−TA]の場合には、W3110[alkB−alaD−TA]の場合に匹敵し、それどころか少し高められた生成物ALSMEの形成において、より低い酸素消費が示される(図3及び図4を参照)。
実施例1と同様に、更なる実験を、
菌株W3110ΔfadL[alkB−alaD−TA]及び
菌株W3110ΔfadEΔfadL[alkB−alaD−TA]、並びに
菌株W3110ΔfadE[alkB−alaD−TA]及び
コントロールとして菌株W3110[alkB−alaD−TA]
を用いて実施した。
1. 以下の工程
a)代謝活性な細胞を含む水性の培養培地を提供する工程と、
b)該水性の培養培地と、疎水性の有機溶液とを接触させる工程と、
c)疎水性の有機溶液と、水性の培養培地をと分離する工程と、
を含む方法であって、前記細胞が、その野生型に対して低減された活性の少なくとも1種の、脂肪酸のβ−酸化の反応の一つを触媒する酵素を有する前記方法。
2. 1に記載の方法であって、前記の脂肪酸のβ−酸化の反応の一つを触媒する酵素が、FadA、FadB、FadD、FadE及びFadL並びにそれらの変異体を含む群からの一つの酵素、好ましくはFadE又はその変異体である前記方法。
3. 1又は2に記載の方法であって、有機溶液が、室温で液状の、置換された及び非置換のアルカン、シクロアルカン、シクロアルケン、アリール、脂肪酸、脂肪酸エステル、アルコール、ヘテロシクロアルカン、ヘテロシクロアルケン及びヘテロアリールを含む群からの少なくとも1種の溶剤を含む前記方法。
4. 3に記載の方法であって、有機溶液が、12個より多くの炭素原子を有する脂肪酸又はそのエステル、好ましくはオレイン酸、エルカ酸又はラウリン酸メチルエステルを含む前記方法。
5. 1から4までのいずれか1に記載の方法であって、細胞が、組み換え型のアルカンヒドロキシラーゼを有する前記方法。
6. 代謝活性の細胞であってその野生型に対して低減された活性の、脂肪酸のβ−酸化の反応の一つを触媒する酵素を、好ましくはFadA、FadB、FadD、FadE及びFadL並びにその変異体を含む群から選択される酵素を、好ましくはFadEを有する前記細胞を、疎水性有機溶液と、前記代謝活性な細胞を含む水性の培養培地との分離の改善のために用いる使用。
7. 脂肪酸のβ−酸化の反応の一つを触媒する酵素の、好ましくはFadA、FadB、FadD、FadE及びFadL並びにその変異体を含む群から選択される酵素の、より好ましくはFadEのノックアウトを、代謝活性な細胞の遺伝的構成の一部として、疎水性の有機溶液と、該代謝活性な細胞を含む水性の培養培地との分離の改善のために用いる使用。
8. 野生型に対して低減された活性の、脂肪酸のβ−酸化の反応の一つを触媒する酵素を有し、更に組み換え型のモノオキシゲナーゼを、好ましくはアルカンヒドロキシラーゼを含む細胞。
9. 8に記載の細胞であって、前記の脂肪酸のβ−酸化の反応の一つを触媒する酵素が、FadA、FadB、FadD、FadE及びFadL並びにそれらの変異体を含む群からの一つの酵素、より好ましくはFadE又はその変異体である前記細胞。
10. 代謝活性な細胞を有する水溶液と、疎水性の有機溶液とを含む反応混合物であって、前記細胞が、その野生型に対して低減された活性の、脂肪酸のβ−酸化の反応の一つを触媒する酵素を有する前記反応混合物。
11. 10に記載の反応混合物であって、前記の脂肪酸のβ−酸化の反応の一つを触媒する酵素が、FadA、FadB、FadD、FadE及びFadL並びにそれらの変異体を含む群からの一つの酵素、より好ましくはFadE又はその変異体である前記反応混合物。
12. 10又は11に記載の反応混合物であって、疎水性の有機溶液が、室温で液状の、置換された及び非置換のアルカン、シクロアルカン、シクロアルケン、アリール、脂肪酸、脂肪酸エステル、アルコール、ヘテロシクロアルカン、ヘテロシクロアルケン及びヘテロアリールを含む群からの少なくとも1種の溶剤を含む前記反応混合物。
13. 10から12までのいずれか1に記載の反応混合物であって、疎水性の有機溶液が、12個より多くの炭素原子を有する脂肪酸又はそのエステル、好ましくはオレイン酸、エルカ酸又はラウリン酸メチルエステルを含む前記反応混合物。
14. 1から5までのいずれか1に記載の方法、6もしくは7に記載の使用又は10から13までのいずれか1に記載の反応混合物であって、代謝活性な細胞が、組み換え型のアルカンヒドロキシラーゼ及びトランスアミナーゼを有し、好ましくは更にアルコールデヒドロゲナーゼ、アラニンデヒドロゲナーゼ及びラクタムヒドロラーゼを含む群からの少なくとも1種の酵素を有する細胞である、前記方法、使用又は反応混合物。
15. 1から5まで及び14に記載の方法、6もしくは7及び14に記載の使用又は10から14までのいずれか1に記載の反応混合物であって、細胞が、下等真核細胞又は原核細胞、好ましくはE.コリである、前記方法、使用又は反応混合物。
16. 1から5まで及び14もしくは15に記載の方法、6もしくは7及び14もしくは15に記載の使用又は10から15までのいずれか1に記載の反応混合物であって、細胞が、組み換え型の細胞である、前記方法、使用又は反応混合物。
17. 1から5まで及び14から16までのいずれか1に記載の方法、6もしくは7及び14から16までのいずれか1に記載の使用又は10から16までのいずれか1に記載の反応混合物であって、前記の疎水性の有機溶液が、疎水性の有機溶液と水性の培養培地の全容量の少なくとも5%、好ましくは少なくとも20%を成す、前記方法、使用又は反応混合物。
18. 1から5まで及び14から17までのいずれか1に記載の方法、6もしくは7及び14から17までのいずれか1に記載の使用又は10から17までのいずれか1に記載の反応混合物であって、水性の培養培地のpH値が、接触の時点で、5〜9であり、好ましくは6〜8である、前記方法、使用又は反応混合物。
Claims (24)
- 以下の工程
a)代謝活性な細胞を含む水性の培養培地を提供する工程と、
b)該水性の培養培地と、疎水性の有機溶液とを接触させる工程と、
c)疎水性の有機溶液と、水性の培養培地とを分離する工程と、
を含む、疎水性の有機溶液と水性の培養培地との分離を改善するための方法であって、
前記細胞が、その野生型に対して、脂肪酸のβ−酸化の反応の一つを触媒する少なくとも1種の酵素の活性を低下しており、かつalkBタイプの組み換え型のアルカンヒドロキシラーゼを含み、
前記酵素が、FadE、FadL及びそれらの変異体からなる群から選択され、
前記変異体が、相応する当初の野生型の核酸配列に対して、95%またはそれより高い同一性を有する核酸配列を示し、かつ野生型分子と同じ酵素活性を有する、
前記方法。 - 請求項1に記載の方法であって、有機溶液が、室温で液状の、アルカン、シクロアルカン、シクロアルケン、アリール、脂肪酸、脂肪酸エステル、アルコール、ヘテロシクロアルカン、ヘテロシクロアルケン及びヘテロアリールからなる群から選択される少なくとも1種の溶剤を含む、前記方法。
- 請求項1又は2に記載の方法であって、有機溶液が、12個より多くの炭素原子を有する脂肪酸又はそのエステルを含む、前記方法。
- 野生型に対して、脂肪酸のβ−酸化の反応の一つを触媒する少なくとも1種の酵素の活性を低下しており、かつalkBタイプの組み換え型のアルカンヒドロキシラーゼを含む代謝活性の細胞を、疎水性の有機溶液と前記代謝活性な細胞を含む水性の培養培地との分離の改善のために用いる使用であって、
前記酵素が、FadE、FadL及びそれらの変異体からなる群から選択され、
前記変異体が、相応する当初の野生型の核酸配列に対して、95%またはそれより高い同一性を有する核酸配列を示し、かつ野生型分子と同じ酵素活性を有する、
前記使用。 - 脂肪酸のβ−酸化の反応の一つを触媒する少なくとも1種の酵素のノックアウトを、代謝活性な細胞の遺伝的構成の一部として、疎水性の有機溶液と該代謝活性な細胞を含む水性の培養培地との分離の改善のために用いる使用であって、
前記酵素が、FadE、FadL及びそれらの変異体からなる群から選択され、
前記変異体が、相応する当初の野生型の核酸配列に対して、95%またはそれより高い同一性を有する核酸配列を示し、かつ野生型分子と同じ酵素活性を有し、
前記細胞が、alkBタイプの組み換え型のアルカンヒドロキシラーゼを含む、
前記使用。 - 野生型に対して、脂肪酸のβ−酸化の反応の一つを触媒する少なくとも1種の酵素の活性を低下しており、更にalkBタイプの組み換え型のアルカンヒドロキシラーゼを含む細胞であって、
前記酵素が、FadE、FadL及びそれらの変異体からなる群から選択される少なくとも1種の酵素であり、
前記変異体が、相応する当初の野生型の核酸配列に対して、95%またはそれより高い同一性を有する核酸配列を示し、かつ野生型分子と同じ酵素活性を有する、
前記細胞。 - 代謝活性な細胞を有する水溶液と、疎水性の有機溶液とを含む反応混合物であって、
前記細胞が、その野生型に対して、脂肪酸のβ−酸化の反応の一つを触媒する少なくとも1種の酵素の活性を低下しており、かつalkBタイプの組み換え型のアルカンヒドロキシラーゼを含み、
前記酵素が、FadE、FadL及びそれらの変異体からなる群から選択される少なくとも1種の酵素であり、
前記変異体が、相応する当初の野生型の核酸配列に対して、95%またはそれより高い同一性を有する核酸配列を示し、かつ野生型分子と同じ酵素活性を有する、
前記反応混合物。 - 請求項7に記載の反応混合物であって、疎水性の有機溶液が、室温で液状の、アルカン、シクロアルカン、シクロアルケン、アリール、脂肪酸、脂肪酸エステル、アルコール、ヘテロシクロアルカン、ヘテロシクロアルケン及びヘテロアリールからなる群から選択される少なくとも1種の溶剤を含む、前記反応混合物。
- 請求項7又は8に記載の反応混合物であって、疎水性の有機溶液が、12個より多くの炭素原子を有する脂肪酸又はそのエステルを含む、前記反応混合物。
- 請求項1から3までのいずれか1項に記載の方法であって、代謝活性な細胞が、トランスアミナーゼを有する細胞である、前記方法。
- 請求項4または5に記載の使用であって、代謝活性な細胞が、トランスアミナーゼを有する細胞である、前記使用。
- 請求項7から9までのいずれか1項に記載の反応混合物であって、代謝活性な細胞が、トランスアミナーゼを有する細胞である、前記反応混合物。
- 請求項1から3までのいずれか1項または請求項10に記載の方法であって、細胞が、下等真核細胞又は原核細胞である、前記方法。
- 請求項4、5または11に記載の使用であって、細胞が、下等真核細胞又は原核細胞である、前記使用。
- 請求項7から9までのいずれか1項または12に記載の反応混合物であって、細胞が、下等真核細胞又は原核細胞である、前記反応混合物。
- 請求項1から3までのいずれか1項、10または13に記載の方法であって、細胞が、組み換え型の細胞である、前記方法。
- 請求項4、5、11または14に記載の使用であって、細胞が、組み換え型の細胞である、前記使用。
- 請求項7から9までのいずれか1項、12または15に記載の反応混合物であって、細胞が、組み換え型の細胞である、前記反応混合物。
- 請求項1から3までのいずれか1項、10、13または16に記載の方法であって、前記の疎水性の有機溶液が、疎水性の有機溶液と水性の培養培地の全容量の少なくとも5%を成す、前記方法。
- 請求項4、5、11、14または17に記載の使用であって、前記の疎水性の有機溶液が、疎水性の有機溶液と水性の培養培地の全容量の少なくとも5%を成す、前記使用。
- 請求項7から9までのいずれか1項、12、15または18に記載の反応混合物であって、前記の疎水性の有機溶液が、疎水性の有機溶液と水性の培養培地の全容量の少なくとも5%を成す、前記反応混合物。
- 請求項1から3までのいずれか1項、10、13、16または19に記載の方法であって、水性の培養培地のpH値が、前記水性の培養培地と前記疎水性の有機溶液との接触の時点で、5〜9である、前記方法。
- 請求項4、5、11、14、17または20に記載の使用であって、前記水性の培養培地と前記疎水性の有機溶液との接触の時点での前記水性の培養培地のpH値が、5〜9である、前記使用。
- 請求項7から9までのいずれか1項、12、15、18または21に記載の反応混合物であって、前記水溶液と前記疎水性の有機溶液との接触の時点での前記水溶液のpH値が、5〜9である、前記反応混合物。
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