KR102000317B1

KR102000317B1 - 수성 배양 배지로부터 소수성 유기 용액을 분리하는 개선된 방법

Info

Publication number: KR102000317B1
Application number: KR1020147016716A
Authority: KR
Inventors: 한스-게오르그 헨네만; 스테펜 샤퍼; 미르야 베셀; 토마스 하스; 야스민 코르탈스; 카타리나 베르세; 사빈 하프케마이어; 마르쿠스 푀터; 프랑크 에르하르트; 마리온 슈이벨후트
Original assignee: 에보니크 데구사 게엠베하
Priority date: 2011-12-22
Filing date: 2012-12-18
Publication date: 2019-07-15
Also published as: WO2013092547A1; MX339910B; EP2607491A1; EP2794898B1; EP2794898A1; JP2013132295A; US20130164797A1; US9249435B2; KR20140111653A; EP2607490A1; CN108358800B; CA2799883C; JP6312117B2; MX2012015064A; CN108358800A; ES2688295T3; CN103254089A; CA2799883A1; SG11201403495QA; BR112014015202A8

Abstract

본 발명은 대사 활성 세포를 포함하는 수성 배양 배지를 제공하는 단계, 수성 배양 배지를 소수성 유기 용액과 접촉시키는 단계, 및 소수성 유기 용액을 수성 배양 배지로부터 분리하는 단계를 포함하며, 여기서 세포는 지방산의 β 산화 반응 중 하나를 촉매하는 하나 이상의 효소의 활성이 세포의 야생형과 비교하여 감소되어 있는 것인, 수성 배양 배지로부터 소수성 유기 용액을 분리하는 개선된 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 지방산의 β 산화 반응 중 하나를 촉매하는 효소, 바람직하게는 FadA, FadB, FadD, FadL 및 FadE, 및 이들의 변이체를 포함하는 군으로부터 선택되는 효소, 바람직하게는 FadE 또는 그의 변이체의 활성이 야생형과 비교하여 감소되어 있는 대사 활성 세포를 포함하는 수성 배양 배지로부터의 소수성 유기 용액의 분리를 개선하기 위한, 상기 대사 활성 세포의 용도에 관한 것이다.

Description

수성 배양 배지로부터 소수성 유기 용액을 분리하는 개선된 방법 {METHOD FOR THE IMPROVED SEPARATION OF A HYDROPHOBIC ORGANIC SOLUTION FROM AN AQUEOUS CULTURE MEDIUM}

본 출원은 대사 활성 세포를 포함하는 수성 배양 배지를 제공하는 단계, 수성 배양 배지를 소수성 유기 용액과 접촉시키는 단계, 소수성 유기 용액을 수성 배양 배지로부터 분리하는 단계를 포함하며, 여기서 세포는 지방산의 β-산화 반응 중 하나를 촉매하는 하나 이상의 효소의 활성이 세포의 야생형과 비교하여 감소되어 있는 것인, 수성 배양 배지로부터 소수성 유기 용액을 분리하는 개선된 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 지방산의 β-산화 반응 중 하나를 촉매하는 효소, 바람직하게는 FadA, FadB, FadD, FadL 및 FadE 뿐만 아니라 이들의 변이체를 포함하는 군으로부터 선택되는 효소, 더욱 바람직하게는 FadE의 활성이 야생형과 비교하여 감소되어 있는 대사 활성 세포를 포함하는 수성 배양 배지로부터의 소수성 유기 용액의 분리를 개선하기 위한, 상기 대사 활성 세포의 용도에 관한 것이다.

화석 연료 대신 재생가능한 원료로부터 출발하여 정밀 화학물질을 제조하는 방법에 있어서 근본적인 문제는, 전형적으로는 초기에 다량의 수성상에 존재하는, 일단 수득된 생성물을 소수성 유기상으로 전환시키는 데 있다. 이러한 전환은 한편으로는 완성된 중간체 또는 최종 생성물을 농축시키는 데, 및 임의로 후속 반응 단계에서 유기 용액에서의 합성 공정을 가능하게 하는 데 필요하고, 다른 한편으로는 원하는 생성물을 제거함으로써 수성상에서의 반응 수율을 개선시키는 데 필요하거나, 또는 우선적으로 어쨌든 기술상 의미 있는 맥락에서, 특히 생산 균주에의 독성, 또는 생성물에 의한 관련된 생체촉매의 억제로 인해 생성물이 존재하는 것이 반응 진행에 불리하게 작용할 때에 반응 과정을 가능하게 하는 데 있어 필요하다. 일반적으로는 빈번히 낮은 농도로 존재하는 생성물을 다량의 수용액으로부터 직접적으로 가열 농축시키는 것이 적절하지는 않다

통상 석유에 함유되어 있는 탄화수소로부터 출발하여 제조된 것인, 상기와 같은 산업적으로 수요가 많은 생성물의 예로는 12-아미노라우르산 (ALA) 또는 그의 메틸 에스테르 (ALAME)가 있다. ALA는 중합체를 제조하는 데 있어, 예를 들어 나일론을 기재로 한 배관 시스템을 제조하는 데 중요한 출발 생성물이다. 통상, ALA는 화석 원료로부터 출발하여, 부타디엔의 삼량체화에 이어, 수소화에 따른 시클로도데칸 형성, 이어서 시클로도데카논으로의 산화, 히드록실아민과의 반응 및 이어서 베크만(Beckmann) 재배열에 의해 합성되는 라우로락탐을 통해 이루어지는 공정에서 저수율로 제조된다. ALA 또는 ALAME를 생명공학적으로 제조하는 데 있어 유망한 새로운 경로는 WO 2009/077461에 기술되어 있다. 상기 경로에 기초가 되는 생명공학적 방법은 EP11154707에 기술되어 있는 바와 같이, 액체 이온 교환체를 사용하는 2상 시스템으로 수행될 수 있다.

생성물을 추출에 의해 수성상으로부터 소수성 유기상으로 후처리하기 위해서는 우선적으로, 상기 생성물이 혼합되지 않는 친수성 수성상 및 소수성 유기상을 포함하는 2상 시스템 중 유기상 내로 유입될 수 있는 적절한 경향을 띄어야 하는 데, 이는 각 화합물의 물리화학적 특성에 따라 현저하게 달라질 수 있다. 비치환된 탄화수소를 고함량으로 가지거나, 전적으로 그러한 탄화수소로만 이루어진 화합물은 주로 소수성 상 내에 풍부하게 존재하는 반면, 극성 기, 예컨대 헤테로원자-함유 관능기를 고함량으로 갖는 화합물, 및 매우 특히, 전하를 갖는 화합물은 주로 또는 사실상 전적으로 수성상에 존재하며, 이는 유기상으로의 전달에 방해가 된다.

평형 조정 이후 상기 2상 시스템에서의 화합물의 분배는 빈번하게는, 예를 들어 하기 네른스트식(Nernst's equation)에 따른 분배 계수에 의해 기술된다:

α = c_{상 1}/c_{상 2}.

특정 분배 계수는 P 값이라고도 기술되는 K_ow이며, 이는 옥탄올과 수성상 사이의 화합물의 분배 평형을 특징짓는다:

K_ow = P = c_옥탄올/C_물.

소수성 상으로부터 생성물을 후처리하기 위한 추가의 전제 조건은 분배가 상기 방정식에 의해 기술되는 평형 상태에 이미 도달해 있어야 한다거나, 또는 적어도 그에 충분하게 도달할 수 있어야 한다는 것이다. 평형 조정은 특히, 접촉 면적은 이미 예컨대 통기와 같은 수단에 의해 증가되어 있기 때문에 생명공학적 방법에 있어서는 일반적으로는 비제한적 인자인 두 상 사이의 접촉 면적의 크기, 및 고밀도의 대사 활성 세포를 유지시키기 위해서든 어떻든 간에 필요한, 수성 배양 배지 및 소수성 유기 용액의 철저한 교반에 의해 결정된다.

그러나, 소수성 유기 용액이 주로 미셀 또는 다른 서브구획에 존재하는 상기와 같은 반응 혼합물을 효율적으로 후처리할 수 있기 전에, 2상을 분리하는 것이 필요하다. 2상 분리가 흔히 순수한 물과 순수한 유기 소수성 용매를 혼합할 때 동시에 어떤 추가 조치 없이 일어난다면, 복합 수성 배양 배지로부터 소수성 유기 용액을 분리하는 것은 많은 가능한 상호작용으로 인해 기술적 지원, 예를 들어 원심분리에 의하지 않고는 덜 간단하고, 수시간 또는 심지어는 수일간 지속될 수 있다.

생명공학적 방법에 의해 산업적으로 수요가 많은 화학 화합물을 대규모로 제조하기 위해서는, 상 분리 공정이 예컨대 ALA와 같은 화합물의 자원 절약형의 신속한 제조 및 후처리를 위한 방법의 개발 및 적용에서 상기 배경에 대해 상당히 중요한 인자가 된다. 대량 반응기 중의 대량 수성상으로부터 소수성 유기 용액에 용해되어 있는 생성물을 주기적으로 제거하고, 이어서 공정 처리해야 한다면, 자원을 절약하고, 전체 공정이 가능한 환경 친화적으로 이루어지도록 하기 위해서는, 실제 제조와 관련된 파라미터, 예컨대 기질의 유형 및 양, 온도 및 배지의 산소 함량 이외에도, 소수성 용액의 분리 또한 최적화되어야 한다. 특히, 대규모로 사용되는 다수의 소수성 유기 용매는 적어도 상대적으로 장기간 접촉시에는 생명공학적으로 사용되는 유기체에 대해 독성 작용을 미치고, 이는 또한 배경에 반하여 생명공학적으로 사용되는 균주를 포함하기 위해 수성 배양 배지 중의 유기체와 용매 사이의 접촉을 단축시키고, 세포 용해 동안 방출된 바람직하지 못한 부산물이 표적 생성물을 오염시키거나, 또는 심지어는 분해시키지 못하도록 하는 것이 바람직할 수 있다는 것을 언급하고자 한다.

그러므로, 본 발명은 대사 활성 세포를 사용하는 수성 배양 배지 및 소수성 유기 용액을 포함하는 2상 시스템에서 생명공학적으로 제조된 생성물을 제조하고 생산하기 위한 개선된 방법이 이용될 수 있도록 하는 목적에 기초한다. 특히, 본 목적은 주어진 시간 창 내에서 소수성 유기 용액을 수성 배양 배지로부터 분리하는 공정의 신속성 및/또는 그러한 분리 정도와 관련해서 소수성 유기 용액 분리, 및 그 안에서 가용성인 생명공학적으로 제조된 생성물의 추출을 개선시키고자 하는 것이다.

본 발명의 기초가 되는 추가의 목적은 소수성 용액으로부터 나온, 생명공학적으로 이용가능한 세포에 대한 독성에 대하여 높은 저항성을 띠는 상기 세포가 이용될 수 있도록 하는 데 있다.

본 발명은 추가로 산소 소모가 감소된, 소수성 화합물을 제조하는 생명공학적 방법이 이용될 수 있도록 하는 목적과, 상기 목적에 적합한 세포에 기초한다.

본 목적 및 추가 목적은 본 출원의 대상, 및 특히, 첨부된 독립항, 종속항으로부터의 실시양태의 대상에 의해서도 또한 달성된다.

본 발명의 기초가 되는 목적은 제1 측면에서

a) 대사 활성 세포를 포함하는 수성 배양 배지를 제공하는 단계,

b) 수성 배양 배지를 소수성 유기 용액과 접촉시키는 단계,

c) 소수성 유기 용액을 수성 배양 배지로부터 분리하는 단계

를 포함하며, 여기서 세포는 지방산의 β-산화 반응 중 하나를 촉매하는 하나 이상의 효소의 활성이 세포의 야생형과 비교하여 감소되어 있는 것인 방법에 의해 달성된다.

제1 측면의 제1 실시양태에서, 지방산의 β-산화 반응 중 하나를 촉매하는 효소는 FadA, FadB, FadD, FadE 및 FadL 뿐만 아니라 이들의 변이체를 포함하는 군으로부터의 효소, 바람직하게는 FadE 또는 그의 변이체이다.

제1 측면의 제2 실시양태에서, 상기 방법은 유기 용액이 실온-액체 치환 및 비치환된 알칸, 시클로알칸, 시클로알켄, 아릴, 지방산, 지방산 에스테르, 알콜, 헤테로시클로알칸, 헤테로시클로알켄 및 헤테로아릴을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 용매를 포함하는 것에 관한 것이다.

제1 측면의 제3 실시양태에서, 상기 방법은 유기 용액이 12개 초과의 탄소 원자를 갖는 지방산 또는 그의 에스테르, 바람직하게는 올레산, 에루스산 또는 라우르산 메틸 에스테르를 포함하는 것에 관한 것이다.

제1 측면의 제4 실시양태에서, 세포는 재조합 알칸 히드록실라제를 함유한다.

본 발명의 기초가 되는 목적은 제2 측면에서 지방산의 β-산화 반응 중 하나를 촉매하는 효소, 바람직하게는 FadA, FadB, FadD, FadE 및 FadL 뿐만 아니라 이들의 변이체를 포함하는 군으로부터 선택되는 효소, 더욱 바람직하게는 FadE의 활성이 야생형과 비교하여 감소되어 있는 대사 활성 세포를 포함하는 수성 배양 배지로부터의 소수성 유기 용액의 분리를 개선하기 위한, 상기 대사 활성 세포의 용도에 의해 달성된다.

본 발명의 기초가 되는 목적은 제3 측면에서 대사 활성 세포를 포함하는 수성 배양 배지로부터의 소수성 유기 용액의 분리를 개선하기 위한, 상기 대사 활성 세포의 유전적 구성 요소의 일부로서 지방산의 β-산화 반응 중 하나를 촉매하는 효소, 바람직하게는 FadA, FadB, FadD, FadE 및 FadL 뿐만 아니라 이들의 변이체를 포함하는 군으로부터 선택되는 효소, 더욱더 바람직하게는 FadE 또는 그의 변이체의 녹아웃(knockout)의 용도에 의해 달성된다.

본 발명의 기초가 되는 목적은 제4 측면에서 지방산의 β-산화 반응 중 하나를 촉매하는 효소의 활성이 야생형과 비교하여 감소되어 있고, 재조합 모노옥시게나제, 더욱 바람직하게는 알칸 히드록실라제를 추가로 포함하는 세포에 의해 달성된다.

제4 측면의 제1 실시양태에서, 본 목적은 지방산의 β-산화 반응 중 하나를 촉매하는 효소가 FadA, FadB, FadD, FadE 및 FadL 뿐만 아니라 이들의 변이체를 포함하는 군으로부터의 효소, 더욱 바람직하게는 FadE 또는 그의 변이체인 세포에 의해 달성된다.

본 발명의 기초가 되는 목적은 제5 측면에서 대사 활성 세포를 함유하는 수용액 및 소수성 유기 용액을 포함하는 반응 혼합물로서, 여기서 세포는 지방산의 β-산화 반응 중 하나를 촉매하는 효소의 활성이 세포의 야생형과 비교하여 감소되어 있는 것인 반응 혼합물에 의해 달성된다.

제5 측면의 제1 실시양태에서, 본 목적은 지방산의 β-산화 반응 중 하나를 촉매하는 효소가 FadA, FadB, FadD, FadE 및 FadL 뿐만 아니라 이들의 변이체를 포함하는 군으로부터의 효소, 더욱 바람직하게는 FadE 또는 그의 변이체인 반응 혼합물에 의해 달성된다.

제5 측면의 제2 실시양태에서, 본 목적은 소수성 유기 용액이 실온-액체 치환 및 비치환된 알칸, 시클로알칸, 시클로알켄, 아릴, 지방산, 지방산 에스테르, 알콜, 헤테로시클로알칸, 헤테로시클로알켄 및 헤테로아릴을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 용매를 포함하는 것인 반응 혼합물에 의해 달성된다.

제5 측면의 제3 실시양태에서, 본 목적은 소수성 유기 용액이 12개 초과의 탄소 원자를 갖는 지방산 또는 그의 에스테르, 바람직하게는 올레산, 에루스산 또는 라우르산 메틸 에스테르를 포함하는 것인 반응 혼합물에 의해 달성된다.

제1, 제2, 제3, 제4, 또는 제5 측면의 추가의 실시양태에서, 본 목적은 대사 활성 세포가 재조합 알칸 히드록실라제 및 트랜스아미나제를 함유하고, 바람직하게는 알콜 데히드로게나제, 알라닌 데히드로게나제 및 락탐 히드롤라제를 함유하는 군으로부터의 하나 이상의 효소를 추가로 함유하는 세포인, 방법, 용도 또는 반응 혼합물에 의해 달성된다.

제1, 제2, 제3, 제4, 또는 제5 측면의 추가의 실시양태에서, 본 목적은 세포가 하등 진핵 세포 또는 원핵 세포, 바람직하게는 이. 콜라이(E. coli)인, 방법, 용도 또는 반응 혼합물에 의해 달성된다.

제1, 제2, 제3, 제4, 또는 제5 측면의 추가의 실시양태에서, 본 목적은 세포 가 재조합 세포인, 방법, 용도 또는 반응 혼합물에 의해 달성된다.

제1, 제2, 제3, 제4, 또는 제5 측면의 추가의 실시양태에서, 본 목적은 소수성 유기 용액이 소수성 유기 용액 및 수성 배양 배지의 전체 부피의 5% 이상, 바람직하게는 20% 이상을 차지하는 것인, 방법, 용도 또는 반응 혼합물에 의해 달성된다.

제1, 제2, 제3, 제4, 또는 제5 측면의 추가의 실시양태에서, 본 목적은 접촉시 수성 배양 배지의 pH가 5 내지 9, 더욱 바람직하게는 6 내지 8인, 방법, 용도 또는 반응 혼합물에 의해 달성된다.

본 발명의 발명자들은, 대사 활성 세포가 지방산의 β-산화 반응 중 하나를 촉매하는 하나 이상의 효소의 활성이 세포의 야생형과 비교하여 감소되어 있는 것일 경우, 소수성 유기 용액은 놀랍게도 대사 활성 세포를 포함하는 수성 배양 배지로부터 분리될 수 있다는 것을 발견하게 되었다.

추가로, 본 발명의 발명자들은, 놀랍게도 지방산의 β-산화 반응 중 하나를 촉매하는 하나 이상의 효소의 활성이 야생형과 비교하여 감소되어 있는 대사 활성 세포는 표적 생성물과 관련하여 생산 능력이 유사한 생명공학적 방법에서 산소 요구량이 더 낮고, 산소 소모량에 대한 생산 수율의 비가 더 높다는 것을 발견하게 되었다.

어느 이론으로도 제한하고자 하지 않으면서, 본 발명자들은 β-산화 반응 중 하나를 촉매하는 하나 이상의 효소의 활성이 감소되면 계면활성제로서의 역할을 하는, 현재까지 미확인된 대사 산물은 농축되고, 수성 배양 배지 중에서는 감소되고, 이로써 한편으로는 소수성 용액과, 수성 배양 배지 중에서 발견되는 용매 감수성 대사 활성 세포 사이의 접촉 면적은 배지를 교반하면서 세포를 배양할 때 감소되고, 이로써 세포에 대한 용매 응력은 감소되며, 다른 한편으로는 교반 장치의 전원을 끈 이후에 분리된 상의 형성이 촉진될 것이라고 추측하였다.

본 발명에 따른 교시는 대사 활성 세포를 사용하는 생성물, 예컨대 정밀 화학물질 제조, 수성 배지 중에서의 상기 세포의 배양, 및 소수성 유기 용액을 사용하는 상기 생성물의 후처리를 포함하는 모든 생명공학적 방법을 개선시키는 데 사용될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본원에서 사용되는 바, "대사 활성 세포"라는 용어는 대사 활성을 가진 살아있는 세포, 바람직하게는 관심 생성물을 활성 형태로 생명공학적으로 제조하는 것과 관련된 효소를 발현하거나, 또는 더욱 바람직하게는 과다발현하는 세포를 의미하는 것으로 이해된다. 세포는 고세균을 비롯한, 원핵 생물 또는 진핵 생물일 수 있고, 원핵 생물인 경우, 바람직하게는 슈도모나스(Pseudomonas), 코리네박테리움(Corynebacterium) 및 에스케리키아(Escherichia)를 포함하는 속으로 이루어진 군으로부터의 것일 수 있다. 더욱더 바람직한 실시양태에서, 세포는 박테리아 세포, 더욱더 바람직하게는 그램-음성 박테리아 세포, 가장 바람직하게는 이. 콜라이이다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 세포는 진핵 세포, 더욱 바람직하게는 진균 세포, 더욱더 바람직하게는 효모 세포, 가장 바람직하게는 사카로미세스(Saccharomyces) 또는 칸디다(Candida), 피키아(Pichia), 특히 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis)이다. 바람직한 실시양태에서, 본원에서 사용되는 바, "하등 진핵 생물"이라는 용어는, 분화된 세포를 포함하는 조직을 가진 다세포 유기체의 형태로 그의 일생의 대부분을 보내는 고등 진핵 생물과는 대조적으로, 그가 존재하는 모든 단계 동안 단세포인 진핵 생물을 의미한다. 특정 실시양태에서, "세포"라는 용어는 본 출원에서는 "미생물"이라는 용어와 동의어로 및 상호교환적으로 사용된다. 추가로, 세포는 단리된 세포, 또는 상이한 세포의 혼합물일 수 있다.

세포, 특히 생명공학적으로 중요한 세포를 유지시키거나 또는 배양하는 데 적합한, 다수의 수성 배양 배지가 당업자에게 알려져 있다. 이 중에는 동등하게 완전 배지, 예컨대 LB 배지, 최소 배지, 예컨대 M9 배지 뿐만 아니라, 선택 배지, 예를 들어 고농도의 염을 함유하고, 이로써 호염성 또는 적어도 내염성 유기체만이 오직 성장할 수 있도록 하는 것이 있다. 바람직한 실시양태에서, 본원에서 사용되는 바, "수성 배양 배지"라는 용어는 모든 관련 인자, 특히 pH, 염 함량 및 온도와 관련하여, 그 안에 함유되어 있는 세포, 바람직하게는 미생물의 생육성을 유지 또는 촉진시킬 수 있도록, 및 수성 배양 배지 및 소수성 유기상, 이 둘 모두가 액체 형태로 존재할 수 있도록 구성된, 물 기반의 반응 배지를 의미하는 것으로 이해된다. 생명공학적으로 중요한 다양한 세포의 온도 요구 조건은 미생물학 및 분자 생물학 교재, 예컨대 문헌 [Fuchs/Schlegl, 2008]로부터 추론해 낼 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 접촉시 수성 배양 배지의 pH는 4 내지 9, 더욱 바람직하게는 4.5 내지 8.5, 가장 바람직하게는 6.5 내지 7.5이다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 온도는 0 내지 45℃, 더욱 바람직하게는 15 내지 40℃, 가장 바람직하게는 20 내지 37℃이다.

소수성 유기 용액을 제조하는 데 사용될 수 있는 다수의 용매는 당업자에게 공지되어 있다. 바람직한 실시양태에서, 본원에서 사용되는 바, "소수성"이라는 용어는 액체 수성상의 존재하에서 수성상으로부터 명확하게 선을 긋는 분리된 액체상을 액체 상태로 형성하는 액체의 특성을 의미하는 것으로 이해된다. 상기 액체상은 응집성 액체상 또는 에멀젼일 수 있다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 본원에서 사용되는 바, "소수성"이라는 용어는 본질적으로 물에 용해되지 않는 화합물의 특성을 의미하는 것으로 이해된다. 마지막으로, 추가의 바람직한 실시양태에서, 본원에서 사용되는 바, 상기 용어는 상기 유형의 지정된 화합물이 상용 로그 값이 0보다 큰, 바람직하게는 0.5보다 큰, 더욱더 바람직하게는 1보다 큰, 및 가장 바람직하게는 2보다 큰 P 값을 가진다는 것을 의미하는 것으로 이해된다 (문헌 [J. Sangster, Octanol - Water Partition Coefficients : Fundamentals and Physical Chemistry, Vol . 2 of Wiley Series in Solution Chemistry, John Wley & Sons, Chichester, 1997)]). 바람직한 유기 용매로는 실온-액체 치환 및 비치환된 알칸, 시클로알칸, 시클로알켄, 아릴, 지방산, 지방산 에스테르, 알콜, 헤테로시클로알칸, 헤테로시클로알켄 및 헤테로아릴을 포함하는 군으로부터 선택되는 용매를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 소수성 유기 용액은 또한 하나 초과의 소수성 유기 용매를 포함하는 혼합물일 수 있다.

지방산의 β-산화는 원핵 및 진핵 유기체가 동등하게 지방산을 산화시킬 수 있고, 그 안에 함유되어 있는 화학 에너지가 대사에 이용될 수 있게 만드는 것을 허용하는 일반적인 대사 경로이다 (문헌 [Fujita et al., 2007]). 보다 광범위한 의미에서, 상기 산화는 지방산의 세포 내로의 흡수로 시작되는데, 이. 콜라이의 경우, 상기 흡수는 그램-음성 박테리아 세포의 외막 및 내막을 통해 지방산을 운반하는 수송체 FadL (문헌 [Black, 1991]), 및 CoA 에스테르 형태의 지방산을 세포질 내로 방출하는 FadD 유전자 생성물 (문헌 [Black et al., 1992])에 의해 이루어진다. 이러한 점에서, 조건상 지방산이 필요할 경우, 지방산은 먼저 아실-CoA 데히드로게나제에 의해, 이. 콜라이의 경우에는 FadE에 의해 CoA-지방산 에스테르의 β-위치에서 산화된다 (문헌 [Campbell and Cronan, 2002]). 별법으로, 유사 분자 또한 이. 콜라이 FadH를 이용하여 2,4-디에노일-CoA 리덕타제에 의한 환원에 의해 이중으로 불포화된 지방산으로부터 형성될 수 있다. 이. 콜라이 FadB와 함께, 다기능성 효소인 에노일-CoA 히드라타제/3-히드록시아실-CoA 데히드로게나제는 이어서 2차 알콜 형성을 수반하는 수화, 및 그에 후속되는 케톤으로의 산화를 촉매한다. 최종 단계에서, 3-케토아실-CoA 티올라제, 이. 콜라이의 경우, FadA는 케토아실-CoA의 절단을 촉매하며, 그 결과로 출발 분자와 비교하여 탄소 원자 2개만큼 더 짧은 지방산의 CoA 에스테르 및 아세틸-CoA가 유리된다. 이 또한 아세틸-CoA가 아닐 경우, 상기 지방산의 CoA 에스테르는 다시 β-산화 사이클로 제공될 수 있고, 산화되어 단축될 수 있다. Fad 오페론의 조절인자인 FadR 또한 지방산의 β-산화의 조절에 관여하며, 이는 β-산화의 반응을 촉매하는 FadR 없이, 지방산 분해에 필요한 유전자를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, "지방산의 β-산화 반응 중 하나를 촉매하는 효소"라는 용어는 아세틸-CoA로의 경로상에서 지방산 기질 또는 그로부터 생성된 분자와 직접 상호작용하는, 바람직하게는 지방산을 기질로서 인식하고, 그를 바람직하게, 지방산을 세포 내로 흡수시키는 지방산 내수송 인자를 포함하는 상기 분해 경로에서 아세틸-CoA에 더 가까운 대사 생성물로 전환시키는 것을 촉매하는 임의의 효소를 의미하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 아실-CoA 데히드로게나제는 지방산 CoA 에스테르와 상호작용하고, 그를 β-산화의 대사 경로에서 지방산 CoA 에스테르보다 아세틸-CoA에 더 가까이에 있는 에노일-CoA에 전환시키는 것을 촉매하기 때문에, 전술한 정의에 따른 상기 효소 중에서 중요하다. 특히 바람직한 실시양태에서, 본원에서 사용되는 바, "지방산의 β-산화 반응 중 하나를 촉매하는 효소"라는 용어는 이. 콜라이로부터의 유전자 생성물 FadA, FadB, FadD, FadL 및 FadE, 및/또는 유기체로부터의 이들의 변이체 또는 상동체를 포함하는 군으로부터의 임의의 효소를 의미하는 것으로 이해된다. 이. 콜라이로부터의 유전자 생성물 FadA, FadB, FadD, FadL 및 FadE 뿐만 아니라, 생명공학적으로 이용가능한 다수의 다른 유기체로부터의 변이체 및 상동체, 및 그의 핵산 및 폴리펩티드 서열은 선행 기술에 기술되어 있으며, 그 예로, 등록 번호 AP009048.1하의 FadA, 등록 번호 BAE77457.1하의 FadB, 등록 번호 BAA15609.1하의 FadD, 등록 번호 BAA77891.2하의 FadE 및 등록 번호 BAA16205.1하의 FadL이 있다.

본 발명의 교시는, 예를 들어 β-산화 반응 중 하나를 촉매하는 효소를 코딩하는 유전자의 녹아웃에 의해, 본원에 기술된 생물학적 거대분자의 정확한 아미노산 또는 핵산 서열을 사용하여 수행될 수 있거나 적용될 수 있을 뿐만 아니라, 1개 또는 1개 초과의 아미노산 또는 핵산의 결실, 부가 또는 치환에 의해 수득될 수 있는 상기 거대분자 또는 그의 변이체를 사용함으로써도 수행될 수 있거나 적용될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본원에서 사용되는 바, 하기에서 "상동체"라는 용어와 동의어로 상호교환적으로 사용되는 "변이체"라는 용어는, 상응하는 원래의 야생형 핵산 또는 아미노산 서열에 대해 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 96, 98, 99% 또는 그 초과의, 본원에서 동일성과 동의어로 사용되는 상동성을 갖는 또 다른 핵산 또는 아미노산 서열로서, 여기서 바람직하게는 촉매 활성 중심을 형성하는 아미노산 또는 구조 또는 폴딩에 필수적인 아미노산 이외의 아미노산은 결실 또는 치환되거나, 후자는, 예를 들어 아스파르테이트 대신에 글루타메이트 또는 발린 대신에 류신인 것과 같이, 단지 보존적으로 치환된 것인 한 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 의미한다. 선행 기술에는 두 서열들의 상동성 정도를 계산하는 데 사용될 수 있는 알고리즘이 기술되어 있다 (예컨대, 문헌 [Arthur Lesk (2008), Introduction to bioinformatics, 3^rd edition]). 본 발명의 추가의 더욱 바람직한 실시양태에서, 아미노산 또는 핵산 서열의 변이체는 바람직하게는 상기 언급한 서열 상동성 이외에도, 야생형 분자 또는 원래의 분자와 본질적으로 동일한 효소 활성을 가진다. 예를 들어, 프로테아제로서 효소적으로 활성인 폴리펩티드의 변이체는 폴리펩티드 효소와 동일한, 또는 본질적으로 동일한 단백질 분해 활성, 즉, 펩티드 결합의 가수 분해를 촉매할 수 있는 능력을 가진다. 특정 실시양태에서, "본질적으로 동일한 효소 활성"이라는 용어는 기저 활성을 훨씬 상회하거나/고, 야생형 폴리펩티드가 동일한 기질에 대해 갖는 K_M 및/또는 k_cat 값의 10³ 배 미만, 바람직하게는 10² 배 미만, 더욱더 바람직하게는 10배 미만만큼 상이한 야생형 폴리펩티드의 기질에 대한 활성을 의미한다. 추가의 바람직한 실시양태에서, "변이체"라는 용어는 핵산 또는 아미노산 서열의 1개 이상의 활성 부분/또는 단편인 핵산 또는 아미노산 서열을 포함한다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 본원에서 사용되는 바, "활성 부분"이라는 용어는 전장의 아미노산 서열보다 길이가 더 짧거나, 전장의 아미노산 서열보다 길이가 더 짧은 것을 코딩하는 아미노산 서열 또는 핵산 서열로서, 야생형 아미노산 서열보다는 길이가 더 짧은 아미노산 서열 또는 코딩된 아미노산 서열은 야생형 폴리펩티드 또는 그의 변이체, 예를 들어 지방산 내수송 인자, 에노일-CoA 히드라타제 또는 FadE 또는 아세틸-CoA 아실트랜스퍼라제 또는 FadB와 본질적으로 동일한 효소 활성을 갖는 것인 아미노산 서열 또는 핵산 서열을 의미한다. 특정 실시양태에서, 핵산의 "변이체"라는 용어는 바람직하게는 엄격한 조건하에서 그의 상보적인 가닥이 야생형 핵산에 결합하는 핵산을 포함한다. 하이브리드화 반응의 엄격도는 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있고, 이는 일반적으로는 프로브의 길이, 세척 온도 및 염 농도에 따라 달라진다. 일반적으로, 프로브 길이가 길수록 더 고온의 하이브리드화 온도를 필요로 하는 반면, 프로브 길이가 더 짧은 경우에는 낮은 온도도 충분하다. 하이브리드화가 이루어지는지 그 여부는 일반적으로 변성된 DNA가 그의 주변 환경에서, 즉, 융점 미만에서 존재하는 상보적인 가닥에 융합할 수 있는 능력에 따라 달라진다. 하이브리드화 반응 및 상응하는 조건의 엄격도는 문헌 [Ausubel et al . 1995]에 의해 더욱 상세하게 기술되어 있다. 당업자는 특히, 편람 ["The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" of Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Germany, 1993)] 및 문헌 [Liebl et al . (International Journal of Systematic Bacteriology 41:255-260 (1991))]에서 하이브리드화에 의해 DNA 서열을 확인하는 것에 관한 설명을 찾아볼 수 있다. 하이브리드화는 엄격한 조건하에서 이루어지며, 바람직한 실시양태에서, 여기서 프로브 및 표적 서열, 즉, 프로브로 처리된 폴리뉴클레오티드가 70% 이상 동일한 것인 유일의 하이브리드가 형성된다. 세척 단계를 포함하는 하이브리드화의 엄격도는 완충제의 조성, 온도 및 염 농도를 달리함에 따라 영향을 받게 되거나, 그에 의해 결정된다는 것이 공지되어 있다. 하이브리드화 반응은 일반적으로 세척 단계에 비하여 상대적으로 낮은 엄격도로 수행된다 (문헌 [Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996]). 하이브리드화 반응을 위해, 예를 들어 약 50℃-68℃ 온도의 5xSSC 완충제에 상응하는 완충제를 사용할 수 있다. 여기서, 프로브는 또한 상기 프로브의 서열과 70% 미만의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드와 하이브리드화할 수 있다. 상기 하이브리드는 안정성이 더 낮고, 엄격한 조건하에서 세척에 의해 제거된다. 이는, 예를 들어 더욱 바람직한 순서로 약 50℃-68℃, 약 52℃-68℃, 약 54℃-68℃, 약 56℃-68℃, 약 58℃-68℃, 약 60℃-68℃, 약 62℃-68℃, 약 64℃-68℃, 약 66℃-68℃로 설정된 온도에서 염 농도를 2xSSC로, 임의로는, 이어서 0.5xSSC로 감소시킴으로써 달성될 수 있다 (문헌 [The DIG System User's Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany, 1995]). 온도 범위는 약 64℃-68℃ 또는 약 66℃-68℃인 것이 바람직하다. 임의로, 염 농도를 0.2xSSC 또는 0.1xSSC에 상응하는 농도로 감소시키는 것도 가능하다. 하이브리드화 온도를 약 1-2℃씩의 단계로 단계식으로 50℃에서 68℃까지 증가시킴으로써, 예를 들어 사용되는 핵산 분자의 서열과 더욱 바람직한 순서로 70% 이상, 또는 80% 이상, 또는 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 단편을 단리시킬 수 있다. 하이브리드화에 대한 추가의 설명은 시판되는 "키트" (예컨대, 로슈 다이아그노스틱스 게엠베하(Roche Diagnostics GmbH: 독일 만하임)로부터의 DIG 이지 Hyb(DIG Easy Hyb), 카탈로그 번호 1603558) 형태로 수득될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본원에서 사용되는 바, 핵산의 "변이체"라는 용어는 유전자 코드의 축중성이라는 맥락에서 원래의 핵산과 동일한 아미노산 서열 또는 이러한 아미노산 서열의 변이체를 코딩하는 임의의 원하는 핵산 서열을 포함한다.

현대적인 유전학적, 미생물학적 및 분자 생물학적 방법이 개발됨에 따라, 당업자는 다수의 도구를 이용할 수 있고, 이를 사용하여 당업자는 살아있는 세포에 존재하는 효소의 활성을 통상적으로 측정하고, 그에 영향을 미칠 수 있다. 현탁액 또는 펠릿 형태로 존재하거나, 또는 프로세싱된 형태로 세포 배양물로부터 제거될 수 있는 효소의 활성을 측정하기 위해, 교재, 예를 들어 [Cornish-Bowden, 1995]에 기술되어 있는 바와 같이, 효소 표준 시험을 사용하여 평가할 수 있다. 선행 기술에는, 예를 들어 문헌 [Kameda & Nunn (1981)], [Marrakchi et al . (2003)], [Lobo et al . (2001)], 및 [Xu et al. (2011)]에는 특히 지방산의 β-산화 반응 중 하나를 촉매하는 효소의 활성을 측정하는 데 적합한 다수의 시험이 개시되어 있다. 예를 들어, 방사선에 노출시킨 후, 돌연변이체를 농축시키거나, 스크리닝함으로써 수행되는 비지정 돌연변이유발법에 의해, 점 돌연변이의 부위-지정 도입에 의해, 또는 세포내 염색체로 통합된, 활성 효소를 코딩하는 유전자의 녹아웃에 의해 이루어지는, 세포에서 효소의 활성을 감소시키기 위한 통상의 적용가능한 방법 또한 선행 기술, 예를 들어 문헌 [Maniatis et al . (1989)] 또는 [Fuchs & Schlegl (2007)]에 기술되어 있다. 특히, Fad 유전자 생성물일 경우, 전사 억제 인자, 예를 들어 FadR의 과다발현 또한 활성을 저하시키는 데 적합하다 (문헌 [Fujita et al ., 2007]). RNA 간섭에 기반한 (문헌 [Tuschl, 2001]), 또는 특이 억제제를 사용하는 활성 감소 또한 가능하다. 바람직한 실시양태에서, 본원에서 사용되는 바, "여기서 세포는 효소의 활성이 세포의 야생형과 비교하여 감소되어 있는 것인"이라는 기술 내용은 변형된 세포에서 효소의 활성이 야생형 세포에서의 같은 효소의 활성과 비교하여 감소되어 있다는 것을 의미하는 것이다. 바람직한 실시양태에서, 상대적인 감소는 더욱 바람직한 순서로 활성의 5, 10, 20, 40, 50, 75, 90, 95, 99% 또는 그 초과이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 효소 활성은 배경과 비교하여 검출이 더 이상은 불가능한 것이다.

본 발명에 따른 방법의 제2 단계에서, 수성 배양 배지를 소수성 유기 용액과 접촉시키는 단계가 이루어진다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본원에서 사용되는 바, "접촉시킨다"라는 용어는, 예를 들어 무기 막과 같은, 수성 배양 배지 및/또는 소수성 유기 용액이 넘을 수 없는 기계적 장벽이 중간에 개재되어 있지 않고, 수성 배양 배지 및 유기 용액이 직접적으로 접촉한다는 것을 의미한다. 예를 들어, 수성 배양 배지를 발효조에 도입시킬 수 있고, 같은 발효조 중의 배양 배지에 유기 용액을 첨가하여 상기 두 액체 모두가 혼합될 수 있도록 할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 접촉은 적어도 부분적으로는 교반, 가스 유입, 또는 2상의 접촉 면적을 증가시키는 데 적합한 유사 수단을 이용함으로써 이루어질 수 있다.

제2 단계 후, 소수성 유기 용액을 수성 배양 배지로부터 분리한다. 2상을 형성할 수 있는 상기 시스템의 고유한 능력에 기인하여, 분리는 당업자가 쉽게 수행할 수 있는 과정으로, 이는 용기를 정치시킨 후, 이어서 하나의 상을 경사분리함으로써 간단하게 진행될 수 있다. 별법으로, 분별 깔때기가 사용될 수 있다. 비등점이 충분히 다를 경우, 감압을 가함으로써, 보다 저온의 비등점을 갖는 상, 일반적으로는 유기상인 것을 제거할 수 있다. 유기상에 남아있는 소량의 물은 무기 건조제, 예컨대 수소화칼슘, 무수 염화칼슘, 실리카 겔, 무수 황산나트륨, 수산화나트륨 등을 사용함으로써 제거할 수 있다.

본 발명에 따른 방법은 실온-액체 치환 및 비치환된 알칸, 시클로알칸, 시클로알켄, 아릴, 지방산, 지방산 에스테르, 알콜, 헤테로시클로알칸, 헤테로시클로알켄 및 헤테로아릴을 포함하는 통상의 소수성 유기 용매를 사용하여 수행될 수 있다. 소수성 유기 용매는 단, 그 전체가 액체인 용매들의 혼합물의 일부일 경우, 그 자체가 액체가 아닌 소수성 유기 용매 또한 적합하다. 본원에서 임의로는 다수의 용매가 대사 활성 세포에 대하여 거의 독성 작용을 미친다는 것을 고려하여야 한다. 따라서, 세포가 그의 대사 활성을 적어도 일시적으로 유지한다면, 비독성 효과를 가진 소수성 유기 용매는 적절한 중간 농도 또는 균등한 농도로 사용된다. 특히 바람직한 실시양태에서, 용매는 8개 이상, 바람직하게는 12개 이상의 탄소 원자를 갖는 포화 또는 불포화 지방산, 예를 들어 라우르산, 올레산 또는 에루스산 또는 그의 메틸 에스테르이다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 용매는 식 CH₃-(CH₂)_x-COOH의 지방산이다 (여기서 x는 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 그 초과일 수 있다). 추가의 바람직한 실시양태에서, 이중 결합을 갖는, 특히 바람직하게는 9번 위치에 이중 결합을 갖는 불포화 지방산, 특히 바람직하게는 올레산이다. 추가로 특히 바람직한 실시양태에서, 용매는 헥산산이다.

소수성 유기 용액의 부피는 유기상이 쉽게 분리될 수 있도록 하는 부피로 측정되어야 하며, 바람직한 실시양태에서, 수성 배양 배지 및 소수성 유기 용액의 전체 부피의 2 내지 98%, 더욱 바람직하게는 5 내지 95%, 더욱더 바람직하게는 10 내지 40%, 가장 바람직하게는 20 내지 30%이다.

대사 활성 세포로서 세포는 일반적으로 특히 관심 생성물을 생산할 수 있는 세포인 것으로 선택된다. 그를 위해서는 재조합 세포를 사용하는 것이 특히 이롭다. 바람직한 실시양태에서, 본원에서 "재조합"이라는 용어는 "재조합 세포" 내로 도입된, 재조합으로 지칭되는 핵산 분자가 천연으로부터의 핵산 분자가 아니라, 분자 생물학적 또는 화학적 합성 방법을 사용하여 제조된 핵산 분자를 의미하거나, 재조합으로 지칭되는 세포가 재조합 핵산 분자 또는 그로부터 코딩된 폴리펩티드를 포함한다는 것을 의미하는 것으로 이해된다. 재조합 핵산 분자 및 세포를 제조하는 분자 생물학적인 통상의 방법은 선행 기술, 예를 들어 문헌 [Sambrook et al . (1989)] 또는 [Schlegl & Fuchs (2007)]에 기술되어 있다.

세포가 생성물 또는 전구체 또는 그의 중간체를 생산하는 효소를 포함하거나, 특히 바람직하게는 그를 과다발현하는 경우에 추가로 특히 이롭다. 이는 효소를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 형질전환 등에 의해 세포 내로 도입하거나, 또는 효소를 코딩하는 핵산 분자를 세포의 유전적 구성 요소, 예를 들어 염색체 내로 혼입시킴으로써 달성될 수 있다. 예컨대, 이. 콜라이와 같은, 생명공학적으로 중요한 다수의 세포 유형의 경우, 핵산 분자의 발현 또는 과다발현을 위해 적합한 방법 및 벡터, 예를 들어 pET 또는 pGEX 유형의 벡터 및 그의 발현에 적합한 세포가 공지되어 있다 (문헌 [Moffatt & Studier (1986)], [Rosenberg et al . (1987)], 및 [Studier et al . (1990)]).

본 발명에 따른 방법은 특히 대사 활성 세포가 소수성 유기 용매를 대사하는 데, 또는 기질로서 소수성 유기 용매를 사용하는 화학 반응을 촉매하는 데 사용될 때에 적합하다. 이러한 효소로는 알칸 히드록실라제를 포함한다.

특히 바람직한 실시양태에서, 본원에서 사용되는 바, "알칸 히드록실라제"란 알칸의 알콜 알데히드/케톤으로의, 및/또는 카르복실산으로의, 바람직하게는 주로 알콜로의 산화를 촉매하는 효소이다. 알칸 히드록실라제는 선행 기술, 예를 들어 문헌 [Grant et al . (2011)] 또는 [Koch et al . (2009)]에 광범위하게 기술되어 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, 알칸 히드록실라제는 "alkB 유형의 알칸 히드록실라제"이다. AlkB는 그의 히드록실라제 활성에 대해 공지되어 있는, 슈도모나스 푸티다( Pseudomonas putida)의 AlkBGT 시스템으로부터의 옥시도리덕타제이다. 이는 추가의 두 폴리펩티드, AlkG 및 AlkT에 의존한다. AlkT는 전자를 NADH로부터 AlkG로 전달하는 FAD-의존성 루브레독신 리덕타제로서 특징화된다. AlkG는 AlkB에 대한 직접적인 전자 공여자로서의 기능을 하는, 철 함유 산화 환원 단백질인 루브레독신이다. 바람직한 실시양태에서, 본원에서 사용되는 바, "alkB 유형의 알칸 히드록실라제"라는 용어는 막 결합 알칸 히드록실라제를 의미하는 것으로 이해된다. 추가의 바람직한 실시양태에서, "alkB 유형의 알칸 히드록실라제"라는 같은 용어는 슈도모나스 푸티다 Gpo1의 AlkB의 서열 (데이터베이스 코드: CAB54050.1, 본 문헌에서 사용된 상기 및 다른 모든 데이터베이스 코드는 2011년 11월 9일자로 이용가능한 공개된 NCBI의 유전자 뱅크 단백질 데이터베이스로부터 기원하는 것이다)과, 더욱더 바람직하게는 75, 80, 85, 90, 92, 94, 96, 98 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드를 의미하는 것으로 이해된다. 본원에서 사용되는 바, "서열"이라는 용어는 폴리펩티드의 아미노산 서열 및/또는 그를 코딩하는 핵산 서열에 관한 것일 수 있다.

본 방법은 지방산 또는 그의 에스테르를 먼저 산화시킨 후, 이어서 아미노화시키는 데 사용될 수 있다. 이를 위해서는, 예를 들어 국제 특허 출원 WO 2009/077461에 기술되어 있는 바와 같은 효소 시스템이 적합하다. 이러한 경우, 대사 활성 세포는 재조합 알칸 히드록실라제 및 트랜스아미나제를 함유하고, 바람직하게는 알콜 데히드로게나제, 알라닌 데히드로게나제 및 락탐 히드롤라제를 포함하는 군으로부터의 하나 이상의 효소를 추가로 함유하는 세포이다. 바람직한 실시양태에서, 본원에서 사용되는 바, "알콜 데히드로게나제"라는 용어는 알데히드 또는 케톤을 상응하는 1차 또는 2차 알콜로 산화시키는 효소를 의미하는 것으로 이해된다. 그 예로는 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha) (ACB78191.1), 락토바실루스 브레비스(Lactobacillus brevis) (YP_795183.1), 락토바실루스 케피리(Lactobacillus kefiri) (ACF95832.1), 말 간, 파라코쿠스 판토트로푸스(Paracoccus pantotrophus) (ACB78182.1), 및 스핑고비움 야노이쿠이애(Sphingobium yanoikuyae) (EU427523.1)의 알콜 데히드로게나제 뿐만 아니라, 이들의 각 변이체를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 본원에서 사용되는 바, "트랜스아미나제"라는 용어는 공여자 분자, 바람직하게는 아미노산으로부터의 α-아미노기를 수용자 분자, 바람직하게는 α-케토카르복실산으로 전달하는 것을 촉매하는 효소를 의미하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 크로모박테리움 비올라세움(Chromobacterium violaceum) ATCC 12472 (데이터베이스 코드 NP_901695))의 트랜스아미나제가 사용될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본원에서 사용되는 바, "알라닌 데히드로게나제"라는 용어는 물 및 NAD⁺를 소모하면서 L-알라닌을 피루베이트, 암모니아 및 NADH로 전환시키는 것을 촉매하는 효소를 의미하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) (데이터베이스 코드 L20916), 리조비움 레구미노사룸(Rhizobium leguminosarum) (데이터베이스 코드 CP001622), 비브리오 프로테오리티쿠스(Vibrio proteolyticus) (데이터베이스 코드 AF070716), 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) (데이터베이스 코드 X63069), 엔테로박터 아에로게네스(Enterobacter aerogenes) (데이터베이스 코드 AB013821)로부터의 알라닌 데히드로게나제가 사용될 수 있다.

본 발명은 본 발명에 따른 방법 뿐만 아니라, 대사 활성 세포를 포함하는 수성 배양 배지로부터의 소수성 유기 용액의 분리를 개선하기 위한, 상기 대사 활성 세포의 유전적 구성 요소의 일부로서 지방산의 β-산화 반응 중 하나를 촉매하는 효소, 바람직하게는 FadA, FadB, FadD, FadE 및 FadL을 포함하는 군으로부터 선택되는 효소, 더욱 바람직하게는 FadE의 녹아웃의 용도에 관한 것이다. 따라서, 본 발명에 따라, 임의의 원하는 방법과 관련하여, 지방산 대사가 적절히 변형되지 않은 대사 활성 세포 대신, 지방산의 β-산화 반응을 촉매하는 효소, 바람직하게는 FadA, FadB, FadD, FadE 및 FadL을 포함하는 군으로부터의 효소, 더욱 바람직하게는 FadE의 활성이 야생형과 비교하여 변함이 없거나 심지어는 증가되어 있는 세포인 대사 활성 세포를 포함하는 수성 배양 배지로부터 소수성 유기 용액을 분리하는 것이 필요할 경우, 지방산의 β-산화 반응 중 하나를 촉매하는 하나 이상의 효소, 바람직하게는 FadA, FadB, FadD, FadE 및 FadL를 포함하는 군으로부터 선택되는 효소, 더욱 바람직하게는 FadE가 녹아웃되어 있는 세포가 사용되어야 한다.

Fad 유전자의 상기와 같은 녹아웃은 대사 활성 세포가 지방산 또는 그의 유도체의 제조를 위해, 또는 β-산화의 대사 경로에 의해 분해될 수 있는 또 다른 분자의 제조를 위해 사용되는지 여부와는 상관없이 독립적으로 사용되어야 한다.

바람직한 실시양태에서, 본원에서 사용되는 바, "녹아웃"이라는 용어는, 예를 들어 전체 유전자 중 일부 또는 그의 결실에 의해, 적합한 부위에의 종결 코돈 삽입에 의해, 프로모터의 필수 부분의 제거에 의해, 또는 리보솜 결합 부위의 제거에 의해 유전자 또는 그의 유전자 생성물의 전사 및/또는 번역이 야생형 세포와 비교하여 감소되어 있는 것을 의미하는 것으로 이해된다.

가장 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 a) 대사 활성 세포를 포함하는 수성 배양 배지를 제공하는 단계, b) 수성 배양 배지를 소수성 유기 용액과 접촉시키는 단계 및 c) 소수성 유기 용액을 수성 배양 배지로부터 분리하는 단계를 포함하며, 여기서 세포는 FadE 또는 그의 변이체의 활성이 세포의 야생형과 비교하여 감소되어 있는 것이고, 여기서 대사 활성 세포는 재조합 알칸 히드록실라제, 바람직하게는 슈도모나스 푸티다로부터의 AlkBGT 또는 그의 변이체 뿐만 아니라, 재조합 트랜스아미나제를 함유하는 이. 콜라이의 재조합 균주이고, 소수성 유기 용매는 라우르산 또는 헥산산 또는 그의 메틸 에스테르 및 불포화 지방산, 바람직하게는 올레산 또는 에루스산, 가장 바람직하게는 올레산의 혼합물을 포함하며, 올레산 또는 에루스산 대 라우르산 또는 헥산산 또는 그의 메틸 에스테르의 비는, 바람직하게는 20:80 내지 80:20, 바람직하게는 20:80 내지 40:60이다.

가장 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 a) 대사 활성 세포를 포함하는 수성 배양 배지를 제공하는 단계, b) 수성 배양 배지를 소수성 유기 용액과 접촉시키는 단계, c) 소수성 유기 용액을 수성 배양 배지로부터 분리하는 단계를 포함하며, 여기서 세포는 지방산의 β-산화 반응 중 하나를 촉매하는 하나 이상의 효소의 활성이 세포의 야생형과 비교하여 감소되어 있는 것이고, 세포는 바람직하게는 이. 콜라이이고, 지방산의 β-산화 반응 중 하나를 촉매하는 효소는 FadE이고, 세포는 더욱이, 바람직하게는 알칸 히드록실라제, 바람직하게는 슈도모나스 푸티다로부터의 AlkBGT, 임의로 알콜 데히드로게나제 및 ω-트랜스아미나제를 포함하는 재조합 효소 시스템이 장착되어 있기 때문에, 그의 야생형과 비교하여 ω-아미노카르복실산을 증가된 양으로 제조할 수 있도록 유전적으로 변형된 것인, ω-아미노카르복실산을 제조하는 방법이다. 추가로 가장 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 지방산의 β-산화 반응 중 하나를 촉매하는 하나 이상의 효소의 활성이 야생형과 비교하여 감소되어 있는 세포로서, 세포는 바람직하게는 이. 콜라이이고, 지방산의 β-산화 반응 중 하나를 촉매하는 효소는 FadE이고, 세포는 더욱이, 바람직하게는 알칸 히드록실라제, 바람직하게는 슈도모나스 푸티다로부터의 AlkBGT, 임의로 알콜 데히드로게나제 및 ω-트랜스아미나제를 포함하는 재조합 효소 시스템이 장착되어 있기 때문에, 그의 야생형과 비교하여 ω-아미노카르복실산을 증가된 양으로 제조할 수 있도록 유전적으로 변형된 것인 세포에 관한 것이다.

본 발명은 하기 도면 및 비제한적인 실시예에 의해 추가로 예시되며, 그로부터 본 발명의 특징, 실시양태, 측면 및 이점이 추가로 추론될 수 있다.

도 1은 ΔFadE 돌연변이체 W3110 ΔFadE [alkB-alaD-TA] (이는 또한 하기에서 "ΔFadE"로 지칭된다) (좌측), 및 ΔFadE 결실이 존재하지 않는다는 점을 제외하면 동일한 균주 W3110 [alkB-alaD-TA] (이는 또한 하기에서 야생형 ("WT")으로 지칭된다) (우측)을 이용한 ALAME 제조에서 상 분리의 차이를 보여주는 것이다. 화살표 표시는 돌연변이체를 사용하였을 때에는 10분 경과 후 유기상 및 수성상의 분리가 뚜렷하게 일어난 반면, 다른 균주를 사용한 경우에는 같은 시간이 경과한 후에도 상 분리는 여전히 육안으로는 관찰되지 않았다는 것을 보여주는 것이다.
도 2는 반응 배지를 발효 이후에 팔콘(Falcon) 튜브 내로 충전시켰다는 사실을 제외하면 도 1의 것과 동일한 실험을 보여주는 것이다.
도 3은 도 1의 것과 동일한 실험에서 두 균주 모두의 OTR (산소 전달율) 형태의 산소 유입량 및 CTR (이산화탄소 전달율) 형태의 이산화탄소 배출량을 보여주는 것이다.
도 4는 도 1의 것과 동일한 실험에서 시간 경과에 따른 배지 중의 ALAME의 농도를 보여주는 것이다.
도 5는 실시예 2에 기술된 바와 같은 라우르산 메틸 에스테르 (LAME) 반응에서 다양한 생성물, 즉, 아미노라우르산 (ALA), 아미노라우르산 메틸 에스테르 (ALAME), ω-카르복시라우르산 (DDA), ω-카르복시라우르산 메틸 에스테르 (DDAME), ω-히드록시라우르산 (HLA), ω-히드록시라우르산 메틸 에스테르 (HLAME) 및 ω-옥소라우르산 (OLA)의 농도를 보여주는 것이다. 균주로서, ΔFadE 균주 (도 5a), 야생형 (W3110) (도 5b), ΔFadL 균주 (도 5c) 및 ΔFadE 및 ΔFadL을 함유하는 균주 (도 5d)를 조사하였다.
도 6은 실시예 2에 기술된 실험에 대한 OTR (도 6a) 및 CTR (도 6b) 곡선을 보여주는 것이다.
도 7은 실시예 2에서 ΔFadE, 야생형 (W3110), ΔFadL 및 ΔFadE/ΔFadL 균주를 이용한 ALAME 제조에서 상 분리에 있어 차이가 관찰되었다는 것을 보여주는 것이다. 화살표 표시는 돌연변이체를 사용하였을 때에는 10분 경과 후 유기상 및 수성상의 분리가 뚜렷하게 일어난 반면, 야생형 균주를 사용한 경우에는 같은 시간이 경과한 후에도 상 분리는 여전히 육안으로는 관찰되지 않았다는 것을 보여주는 것이다.

실시예 1: 아민라우르산 메틸 에스테르의 생명공학적 제조에서 Δ FadE 돌연변이체를 이용한 소수성 상으로부터의 수성상 분리의 가속화

균주 W3110 ΔFadE [alkB-alaD-TA] 및 W3110 [alkB-alaD-TA]를 이용한 라우르산 메틸 에스테르에서 아미노라우르산 메틸 에스테르로의 생체변환은 DASGIP 8단 평행 발효 시스템에서 이루어졌다. W3110 [alkB-alaD-TA]은 WO2009077461에 기술되어 있는 바와 같이, 옥시도리덕타제 AlkB, 알라닌 데히드로게나제 및 트랜스아미나제를 포함하는 산화 및 아미노교환 시스템이 있는, pBR322 기반 플라스미드를 포함하는 이. 콜라이 W3110 균주이다. W3110 ΔFadE [alkB-alaD-TA]는 FadE를 코딩하는 유전자가 결실되어 있고, 따라서, 균주에는 아실-CoA 데히드로게나제 활성이 없다는 점을 제외하면, 상기 이. 콜라이 W3110 균주와 동일하다.

발효를 위해 1 ℓ 반응기를 사용하였다. pH 4.0 및 pH 7.0인 표준 용액을 사용하여 2점 보정에 의해 pH 프로브를 보정하였다. 반응기를 300 ㎖의 식수로 충전시키고, 121℃에서 20 min 동안 오토클레이빙시켜 확실하게 멸균화시켰다. 이어서, pO2 프로브를 DASGIP 시스템 상에서 밤새도록 (6 h 이상 동안) 분극화시켰다. 다음날 아침, 클린 벤치 아래서 물을 제거하고, 100 mg/ℓ의 암피실린을 함유하는 300 ㎖의 고밀도 세포 배지로 대체하였다. 이어서, 1점 보정 (교반기: 400 rpm/가스 발생: 10 sl/h의 대기) 및 공급(feed)을 사용하여 pO2 프로브를 보정하고, 클린-인-플레이스(Clean-in-Place)에 의해 교정 수단 및 유도제 트랙을 세정하였다. 이를 위해, 70% 에탄올로, 이어서 1 M NaOH 후, 멸균 완전 탈염수로 배관을 세정하고, 마지막으로 각각의 배지로 충전시켰다.

먼저 ALA 및 ALAME를 생산하는 이. 콜라이 균주를 100 mg/ℓ의 암피실린을 포함하는 LB 배지 (100 ㎖ 배플형 플라스크 중 25 ㎖) 중 각 냉동배양물로부터 37℃에서 밤새도록 및 200 rpm으로 약 18 h 동안 성장시켰다. 이어서, 각 2 ㎖씩의 배양물을 100 mg/ℓ의 암피실린과 함께 고밀도 세포 배지 (글루코스 15 g/ℓ (30 ㎖/ℓ의, 1% MgSO₄·7H₂O 및 2.2% NH₄Cl을 함유하는 별개로 오토클레이빙된 500 g/ℓ 원액), (NH₄)₂SO₄ 1.76 g/ℓ, K₂HPO₄ 19.08 g/ℓ, KH₂PO₄ 12.5 g/ℓ, 효모 추출물 6.66 g/ℓ, 시트르산삼나트륨 2수화물 2.24 g/ℓ, 별개로 오토클레이빙된 1% 농도의 원액 1 ℓ당 시트르산철암모늄 용액 17 ㎖, 별개로 오토클레이빙된 원액 1 ℓ당 미량 원소 용액 5 ㎖ (HCl (37%) 36.50 g/ℓ, MnCl₂·4H₂O 1.91 g/ℓ, ZnSO₄·7H₂O 1.87 g/ℓ, 에틸렌디아민테트라아세트산 2수화물 0.84 g/ℓ, H₃BO₃ 0.30 g/ℓ, Na₂MoO₄·2H₂O 0.25 g/ℓ, CaCl₂·2H₂O 4.70 g/ℓ, FeSO₄·7H₂O 17.80 g/ℓ, CuCl₂·2H₂O 0.15 g/ℓ)) (100 ㎖ 배플형 플라스크 중 25 ㎖씩의 각 균주)에 재-접종하고, 추가로 5.5 h 동안 37℃/200 rpm으로 인큐베이션시켰다.

600 nm에서 배양물의 광학 밀도는 W3110 ΔFadE [alkB-alaD-TA]의 경우, 6.9이고, W3110 [alkB-alaD-TA]의 경우, 7.4인 것으로 측정되었다. 반응기에 0.1의 광학 밀도로 접종하기 위해, 각 4.0 ㎖ 또는 4.4 ㎖ (ΔFadE)씩을 (멸균 조건하에서) 5 ㎖ 시린지 내로 뽑아내고, 70% 에탄올 층으로 덮인 격막을 통해 캐뉼라에 의해서 반응기를 접종하였다.

하기 표준 프로그램을 사용하였다:

수행된 실험은 세포가 특정 광학 밀도를 달성하게 되는 성장 단계, 및 기질 라우르산 메틸 에스테르 첨가 후, 발현을 통해 형성된 효소로부터 아미노라우르산 에스테르로의 전환이 이루어지는 후속 생체변환 단계인 2 단계로 나눌 수 있다. pH 값은 암모니아 (12.5%)를 사용하여 pH 6.8이 되도록 한쪽으로만 조정하였다. 성장 및 생체변환 동안, 교반기 속도 및 폭기율에 의해 배양물 중의 용존 산소량 (DO, 용존 산소량)을 30%로 조정하였다. DO가 최고점에 도달하였을 때에 유발되는 공급 개시, 5 g/ℓh의 글루코스 공급 (500 g/ℓ의, 1% MgSO₄.7H₂O 및 2.2% NH₄Cl을 함유하는 글루코스)로 유가식 발효를 수행하였다. 공급이 개시됨에 따라, 온도 또한 이전 37℃에서 30℃로 하강하였다. 공급 개시 후 2 h째에 IPTG (1 mM)를 자동으로 첨가함으로써 트랜스아미나제의 발현을 유도하였다. alk 유전자의 유도는 공급 개시 후 10 h째에 DCPK (0.025% v/v)를 수동으로 첨가함으로써 이루어졌다. 생체변환 개시 이전에, 배양 브로쓰의 광학 밀도를 측정하였다.

생체변환 단계 개시는 공급 개시 후 14 h째에 이루어졌다. 이를 위해, 라우르산 메틸 에스테르 및 이온 교환체 올레산 (기술상 90%)으로 구성된 150 ㎖의 혼합물을 배치로서 발효조에 첨가하였다. 트랜스아미나제에 대한 공여자로서 아미노기를 이용하기 위해, 생체변환 개시 30분 전에 5 ㎖의 3 M 황산암모늄 용액을 발효조에 첨가하였다. 샘플링하기 위해, 2 ㎖의 발효조를 용기로부터 제거하고, 그의 일부를 아세톤/HCl 혼합물 (c(HCl) = 0.1 mol/ℓ) 중에 1/20으로 희석시키고, 추출하였다. 생체변환 개시 후, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 5 h, 7.5 h, 10.5 h, 19.5 h 및 21 h째에 모든 반응기로부터 샘플을 채취하였다. 산소 전환 속도 (OTR = 산소 전달율) 및 탄소 전환 속도 (CTR = 탄소 전달율)는 폐가스 분석에 의해 발효 동안 DASGIP 시스템에서 측정하였다. 생체변환 개시 후 21 h째에 발효를 종료하였다. 교반기, 폭기, 온도 조절 및 pH 조절의 전원을 끄고, 용기를 5-10분 동안 가만히 정치시켰다.

결과:

생체변환 단게 동안, W3110 ΔFadE [alkB-alaD-TA]의 경우, W3110 [alkB-alaD-TA]와 비교하여 생성물 ALAME의 형성은 유사하거나, 심지어는 약간 증가된 것으로 보였고, 산소 소모량은 더 적은 것으로 관찰되었다 (도 3 및 4 참조).

10분 경과 후, 균주 W3110 ΔFadE [alkB-alaD-TA]를 함유하는 용기에서는 약 40%의 상부상, 약 60%의 하부상인 비로 뚜렷한 상 분리가 관찰되었다. 상기 두 상 사이에는 상간 얇은 층이 있었다. 하부상 및 상부상의 샘플을 15 ㎖ 팔콘 튜브 내로 충전시키고, 10분 동안 5,500 x g로 원심분리하였다. 이후, 하부상을 함유한 튜브에서는 수성상 및 바이오매스가 약 95% 존재하는 것으로 보였다. 상부상을 함유한 튜브에서는 상부상이 60% 초과의 유기 분획으로 구성된 것으로 관찰되었다. 균주 W3110 [alkB-alaD-TA]를 함유하는 용기에서는 10분 후 균질 에멀젼이 존재하였고, 추가로 20분의 대기 시간이 경과한 후에도 어떤 상 분리도 관찰되지 않았다.

실시예 2: 아민라우르산 메틸 에스테르의 생명공학적 제조에서 ΔFadL 돌연변이체 뿐만 아니라 Δ FadE Δ FadL 돌연변이체를 이용한 소수성 상으로부터의 수성상 분리의 가속화

실시예 1과 유사하게, 하기 균주

W3110 ΔfadL [alkB-alaD-TA] 및

W3110 ΔfadE ΔfadL [alkB-alaD-TA] 뿐만 아니라,

W3110 ΔfadE [alkB-alaD-TA] 및

W3110 [alkB-alaD-TA]를 대조군으로서 사용하여 추가의 실험을 수행하였다.

또한, 정확하게 실시예 1에 기술된 것과 동일한 프로토콜 및 파라미터와 함께 DASGIP 8단 평행 발효 시스템을 사용하였다.

라우르산 메틸 에스테르/올레산 혼합물의 첨가에 의해 생체변환을 개시시킨 후, 1.25, 2.5, 3.5, 20.5, 22.5 및 23.5시간 경과시에 샘플을 채취하고, 상기 언급된 방법에 따라 후처리하였다. 결과는 도 5, 6, 및 7에 요약되어 있다.

24시간 후, 생체변환은 종료되었고, pH, 온도 및 DO 조절을 종료하고, 반응기를 5-10분 동안 가만히 정치시켰다.

상기 언급된 실험에서와 같이, 본 실험에서도 역시, 단, Fad 유전자 중 1개 이상의 것이 비작동된 경우에는 짧은 시간 후에도 유기상으로부터의 수성상의 뚜렷한 분리를 관찰할 수 있었다. 생체촉매로서 사용된 야생형의 경우, 즉, Fad 유전자 중 어느 하나에도 결실을 포함하지 않는 경우에는 어떤 상 분리도 식별불가능할 수 있다 (도 7 참조).

1개 이상의 Fad 결실을 포함하는 균주의 경우에는 역시 산소 소모량도 야생형과 비교하여 감소되어 있는 것이 관찰되었다 (도 6a).

참고문헌:

Claims

a) 대사 활성 세포를 포함하는 수성 배양 배지를 제조하는 단계,
b) 수성 배양 배지를 소수성 유기 용액과 접촉시키는 단계,
c) 소수성 유기 용액을 수성 배양 배지로부터 분리하는 단계
를 포함하며, 여기서 세포는 지방산의 β-산화 반응 중 하나를 촉매하는 하나 이상의 효소의 활성이 야생형과 비교하여 감소되어 있고, alkB 유형의 재조합 알칸 히드록실라제를 함유하며, 원핵 세포인 것인 방법.
제1항에 있어서, 지방산의 β-산화 반응 중 하나를 촉매하는 효소가 FadA, FadB, FadD, FadE 및 FadL 또는 이들의 변이체를 포함하는 군으로부터의 효소이고, 변이체는 상응하는 원래의 야생형 핵산 서열에 대해, 70% 이상의 동일성을 가지는 다른 핵산 서열이며, 변이체는 야생형 분자와 동일한 효소 활성을 가지는 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 유기 용액이 실온-액체 치환 및 비치환된 알칸, 시클로알칸, 시클로알켄, 아릴, 지방산, 지방산 에스테르, 알콜, 헤테로시클로알칸, 헤테로시클로알켄 및 헤테로아릴을 포함하는 군으로부터의 하나 이상의 용매를 포함하는 것인 방법.
제3항에 있어서, 유기 용액이 12개 초과의 탄소 원자를 갖는 지방산 또는 그의 에스테르, 올레산, 에루스산 또는 라우르산 메틸 에스테르를 포함하는 것인 방법.
대사 활성 세포를 포함하는 수성 배양 배지로부터의 소수성 유기 용액의 분리를 개선하기 위한 것으로, 지방산의 β-산화 반응 중 하나를 촉매하는 효소의 활성이 야생형과 비교하여 감소되어 있고, alkB 유형의 재조합 알칸 히드록실라제를 함유하며, 원핵 세포인, 대사 활성 세포.
대사 활성 세포를 포함하는 수성 배양 배지로부터의 소수성 유기 용액의 분리를 개선하기 위한 것으로, 지방산의 β-산화 반응 중 하나를 촉매하고 대사 활성 세포의 유전적 구성 요소의 일부인 녹아웃(knockout) 된 효소를 포함하며, alkB 유형의 재조합 알칸 히드록실라제를 함유하고, 원핵 세포인, 대사 활성 세포.
지방산의 β-산화 반응 중 하나를 촉매하는 효소의 활성이 야생형과 비교하여 감소되어 있고, alkB 유형의 재조합 알칸 히드록실라제를 함유하는 원핵 세포.
제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 지방산의 β-산화 반응 중 하나를 촉매하는 효소가 FadA, FadB, FadD, FadE 및 FadL 또는 이들의 변이체로 이루어지는 군으로부터의 효소이고, 변이체는 상응하는 원래의 야생형 핵산 서열에 대해, 70% 이상의 동일성을 가지는 다른 핵산 서열이며, 변이체는 야생형 분자와 동일한 효소 활성을 가지는 것인 세포.
대사 활성 세포를 함유하는 수용액 및 소수성 유기 용액을 포함하는 반응 혼합물이며, 여기서 세포는 지방산의 β-산화 반응 중 하나를 촉매하는 효소의 활성이 세포의 야생형과 비교하여 감소되어 있고, alkB 유형의 재조합 알칸 히드록실라제를 함유하며, 원핵 세포인 것인 반응 혼합물.
제9항에 있어서, 지방산의 β-산화 반응 중 하나를 촉매하는 효소가 FadA, FadB, FadD, FadE 및 FadL 또는 이들의 변이체를 포함하는 군으로부터의 효소이고, 변이체는 상응하는 원래의 야생형 핵산 서열에 대해, 70% 이상의 동일성을 가지는 다른 핵산 서열이며, 변이체는 야생형 분자와 동일한 효소 활성을 가지는 것인 반응 혼합물.
제9항 또는 제10항에 있어서, 소수성 유기 용액이 실온-액체 치환 및 비치환된 알칸, 시클로알칸, 시클로알켄, 아릴, 지방산, 지방산 에스테르, 알콜, 헤테로시클로알칸, 헤테로시클로알켄 및 헤테로아릴을 포함하는 군으로부터의 하나 이상의 용매를 포함하는 것인 반응 혼합물.
제9항 또는 제10항에 있어서, 소수성 유기 용액이 12개 초과의 탄소 원자를 갖는 지방산 또는 그의 에스테르, 올레산, 에루스산 또는 라우르산 메틸 에스테르를 포함하는 것인 반응 혼합물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 대사 활성 세포가 트랜스아미나제를 함유하고, 알콜 데히드로게나제, 알라닌 데히드로게나제 및 락탐 히드롤라제를 포함하는 군으로부터의 하나 이상의 효소를 추가로 함유할 수 있는 세포인 방법.
제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 대사 활성 세포가 트랜스아미나제를 함유하고, 알콜 데히드로게나제, 알라닌 데히드로게나제 및 락탐 히드롤라제를 포함하는 군으로부터의 하나 이상의 효소를 추가로 함유할 수 있는 세포인 세포.
제9항 또는 제10항에 있어서, 대사 활성 세포가 트랜스아미나제를 함유하고, 알콜 데히드로게나제, 알라닌 데히드로게나제 및 락탐 히드롤라제를 포함하는 군으로부터의 하나 이상의 효소를 추가로 함유할 수 있는 세포인 반응 혼합물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 세포가 이. 콜라이(E. coli)인 방법.
제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 이. 콜라이인 세포.
제9항 또는 제10항에 있어서, 세포가 이. 콜라이인 반응 혼합물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 소수성 유기 용액이 소수성 유기 용액 및 수성 배양 배지의 전체 부피의 5% 이상, 또는 20% 이상을 차지하는 것인 방법.
제5항 또는 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 소수성 유기 용액이 소수성 유기 용액 및 수성 배양 배지의 전체 부피의 5% 이상, 또는 20% 이상을 차지하는 것인 세포.
제9항 또는 제10항에 있어서, 소수성 유기 용액이 소수성 유기 용액 및 수성 배양 배지의 전체 부피의 5% 이상, 또는 20% 이상을 차지하는 것인 반응 혼합물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 접촉시 수성 배양 배지의 pH가 5 내지 9, 또는 6 내지 8인 방법.
제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉시 수성 배양 배지의 pH가 5 내지 9, 또는 6 내지 8인 세포.
제9항 또는 제10항에 있어서, 접촉시 수성 배양 배지의 pH가 5 내지 9, 또는 6 내지 8인 반응 혼합물.