CN101490260B

CN101490260B - 使用遗传工程化的微生物菌株的改进的鞘氨醇类碱的生产

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Publication number: CN101490260B
Application number: CN200780026080.6A
Authority: CN
Inventors: S·舍费尔; M·A·范登贝尔赫; D·博尔格尔; T·许勒
Original assignee: 赢创工业股份公司
Current assignee: Evonik Industries AG
Priority date: 2006-05-11
Filing date: 2007-05-11
Publication date: 2016-08-17
Anticipated expiration: 2027-05-11
Also published as: WO2007131720A1; CN101490260A; US20100190219A1; JP2009536521A; EP2024501B1; EP2024501A1; US8372595B2; JP5357011B2

Abstract

本发明提供遗传工程化的微生物菌株，特别是遗传工程化的酵母菌株，所述微生物菌株产生，以每克CDW计，至少0.5mg的式I所示的鞘氨醇类碱或其盐或酯。本发明提供获得遗传工程化的微生物菌株的方法，所述菌株产生，以每克CDW计，至少0.5mg的式I所示的鞘氨醇类碱或其盐或酯。所述方法包括步骤：a)提高编码具有神经酰胺合酶活性的酶和/或具有神经酰胺酶活性的酶的多核苷酸的表达，所述具有神经酰胺酶活性的酶能够优先或甚至特异性地水解含有式I所示的鞘氨醇类碱的神经酰胺，和/或b)降低编码具有鞘脂Δ8去饱和酶活性的酶和/或具有神经酰胺酶活性的酶的多核苷酸的表达，所述具有神经酰胺酶活性的酶能够优先或甚至特异性地水解含有植物鞘氨醇或二氢鞘氨醇作为鞘氨醇类碱的神经酰胺，和分离具有所要求的生产力的菌株。

Description

使用遗传工程化的微生物菌株的改进的鞘氨醇类碱的生产

鞘脂(sphingolipid)是一组脂类，所述脂类的膜全部具有衍生自鞘氨醇类碱(sphingoid bases)例如植物鞘氨醇(phytosphingosine)或鞘氨醇(sphingosine)这一共同特征。鞘脂经常存在于动物、植物和真菌、甚至一些细菌的细胞膜中。

神经酰胺是一组特殊的鞘脂，其含有与脂肪酸以酰胺键连接的鞘氨醇类碱。在人类皮肤中，神经酰胺与胆固醇、胆固醇硫酸酯和游离脂肪酸一起形成一道阻滞水和保护皮肤避免物理和化学有害物(noxas)所必需的通透性屏障。作为所述通透性屏障的成份，这些神经酰胺最常见于角质层(皮肤上层)，并且它们含有鞘氨醇、植物鞘氨醇、二氢鞘氨醇或6-羟基鞘氨醇作为鞘氨醇类碱。局部应用含有鞘脂的组合物(例如神经酰胺)提高皮肤的屏障功能和保湿性质(Curratolo，1987.Pharm.Res.4：271-277；Kerscher et al.，1991.Eur.J.Dermatol.1：39-43)。另外，鞘氨醇类碱同样已知介导一些生理学作用例如抑制蛋白激酶C的活性，并因此由于其抗炎和抗微生物活性而被包含在美容或皮肤病用组合物中。

由于鞘氨醇是人体中鞘脂的主要鞘氨醇类碱成份，因此其有相当的商业吸引力用于生产用于食品的鞘氨醇和含有鞘氨醇的鞘脂、以及药物学和美容应用。

当前，已经开发了一些化学合成鞘氨醇的途径。然而，由于存在两个立构中心，化学合成会产生外消旋体混和物，其中只有25％是天然存在的D-赤式-(2R，3S)-构型。另外，由于在分子中存在三个官能团，因此需要应用广泛的保护化学。因此，通过化学合成生产鞘氨醇是极端昂贵的，无法用于食品和化妆品中的掺入。对于从天然来源例如脑或鸡蛋分离的纯鞘氨醇也是这样。从动物来源提取的非均质鞘脂制备物也是可用的。尽管比纯化合物便宜，但是它们受限于组成上的非均质性，因此由于其可能含有病原物而具有潜在危险。

已经显示微生物例如酵母Pichia ciferri(Wickerham and Stodola，1960，J.Bacteriol.80：484-491)产生高水平的鞘氨醇类碱及其衍生物，但主要是C18-植物鞘氨醇及其乙酰化衍生物。这些物质可以提取出来并化学转变为相应的神经酰胺，因此含有纯的美容成份(参见例如WO 93/20038)。但是，这些菌株仅产生非常少量的植物鞘氨醇或其衍生物之外的鞘氨醇类碱。

同样，在其他酵母中，所产生的式I所示的鞘氨醇类碱的量很低，并且仅存在于脂质的葡糖神经酰胺部分，即不以游离形式存在而是结合至长链N-酰基基团和糖类。酵母中葡糖神经酰胺的含量是0至1.2mg每克细胞干重(cell dry weight，CDW)(Saito et al.，2005)。考虑到鞘氨醇类碱质量占全部质量的比例(40％；Kaufman et al.，1971)，即使这些葡糖神经酰胺中的全部鞘氨醇类碱都是式I所示的鞘氨醇类碱，以每克CDW计，也仅有0.5mg。然而，在解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)的葡糖神经酰胺中，只有25％的鞘氨醇类碱(Rupcic et al.，1998.Appl Microbiol.Biotechnol.50：583-588)是式I所示的鞘氨醇类碱，以每克CDW计，相应于在这种酵母物种中为0.13mg。

在过表达来自白假丝酵母(Candida albicans)(Ternes et al.，2002.J.Biol.Chem.277：25512-25518)和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(Garton et al.，2003.FEBS Lett.538192-538196)的二氢神经酰胺去饱和酶的重组酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Δsyr2细胞中，低于20％的二氢鞘氨醇转变为鞘氨醇。酿酒酵母Δsyr2细胞每mg蛋白质含有346pmol二氢鞘氨醇(Bae et al.，2004)。假设60％每克细胞干重(CDW)是蛋白质，这相当于0.2mg二氢鞘氨醇CDW。因此在所述重组酿酒酵母Δsyr2细胞中含有低于0.04mg鞘氨醇每克细胞干重。尽管还没有具体分析，但是即使这样微量的鞘氨醇也很可能不以游离鞘氨醇类碱的形式存在，而是结合至长链N-酰基基团，即神经酰胺，因为从二氢鞘氨醇合成鞘氨醇的酶，二氢神经酰胺去饱和酶，不能作用于游离鞘氨醇类碱，而是作用于其N-酰基化的形式。

从二氢鞘氨醇生物合成游离鞘氨醇需要三个酶的顺序作用：神经酰胺合酶、二氢神经酰胺去饱和酶和神经酰胺酶。

神经酰胺合酶用游离鞘氨醇类碱和脂肪酰-CoA硫酯作为底物形成鞘氨醇类碱N-酰基酯。神经酰胺合酶可以由一个(小鼠中；Lahiri and Futerman，2005.J.Biol.Chem.280：33735-33738)或两个亚基(酵母中；Schorling et al.，2001.Mol.Biol.Cell 12：3417-3427)组成。Schorling et al.，2001(Mol.Biol.Cell 12：3417-3427)描述了在酿酒酵母中过量产生神经酰胺合酶以提高神经酰胺合酶活性并由此提高细胞神经酰胺含量。尽管两个亚基都过量产生，但是没有观察到神经酰胺合酶活性或细胞神经酰胺含量的提高。同时，在酿酒酵母中异源过表达哺乳动物神经酰胺合酶没有实现神经酰胺量的提高，尽管观察到了鞘脂组成的改变(Guillas et al.，2003.J.Biol.Chem.278：37083-37091)。

在酿酒酵母中异源过表达来自几种生物的二氢神经酰胺去饱和酶(Ternes etal.，2002.J.Biol.Chem.277：25512-25518；Garton et al.，2003.FEBSLett.538192-538196)引起痕量鞘氨醇的形成。但是多数前体分子(＞80％)(鞘氨醇类碱二氢鞘氨醇)没有转变。

过表达酿酒酵母的两种神经酰胺酶Ypc1和Ydc1(Mao et al.，2000.J.Biol.Chem.275：6876-6884，和Mao et al.，2000.J.Biol.Chem.275：31369-31378)也没有提高鞘氨醇产量。在人细胞系中提高特异性或优先水解具有式I所示鞘氨醇类碱的神经酰胺的小鼠神经酰胺酶的表达和/或酶活性水平使得鞘氨醇水平提高仅仅1.5倍(Maoet al.，2003.J.Biol.Chem.278：31184-31191)。通过将表达这种小鼠神经酰胺酶的酵母突变体的微体与各种外源添加的底物接触进一步研究这种神经酰胺酶的底物特异性。因此，基于过量产生神经酰胺酶而提高的鞘氨醇水平的相关数据都是得自人细胞系实验。与酿酒酵母相比，大多数其他酵母物种例如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)、Pichia ciferrii、解脂耶氏酵母、白假丝酵母、产朊假丝酵母(Candida utilis)、汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)和棉桃阿舒氏囊霉(Ashbya gossypii)仅含有一种单一神经酰胺酶。这种酶的特征和生理学作用仍然未知。

本发明现在令人惊讶地示出可以通过修饰神经酰胺合酶和/或神经酰胺酶和/或鞘脂Δ8去饱和酶的表达和/或酶活性水平而产生具有提高的式I所示的鞘氨醇类碱的生产力的菌株。优选地这些修饰伴有对二氢神经酰胺去饱和酶的表达和/或酶活性水平的修饰。本发明实现了制备能够产生植物鞘氨醇和二氢鞘氨醇之外的鞘氨醇类碱特别是鞘氨醇的遗传工程化的微生物菌株。

本发明还有助于制备能够比本领域已知的其他微生物菌株更有效地产生含有鞘氨醇类碱特别是神经酰胺类、脑苷脂类、神经节苷脂类和肌醇磷酰基神经酰胺类(inositolphosphorylceramides)的复合鞘脂的遗传工程化的微生物菌株。例如，被修饰为显示出提高的神经酰胺合酶和(任选地)提高的二氢神经酰胺去饱和酶的遗传工程化的微生物菌株可用于产生这些复合鞘脂。

因此，在第一方面，本发明提供了一种微生物菌株，特别是一种酵母株，所述微生物菌株产生，以每克CDW计，至少0.5mg的式I所示的鞘氨醇类碱：

或其盐或酯，

其中R是X-(CH₂)_m-Y-(CH₂)_n-CH₃，其中

a)X是CH₂或CHOH，并且

b)m在0和4之间，最优选地m是1，并且

c)Y是CH₂-CH₂、CH＝CH或CH＝CCH₃，并且

d)n在4和14之间，优选地n是8或10。

优选地，本发明的微生物菌株产生，以每克CDW计，至少5mg的式I所示的鞘氨醇类碱，更优选地产生，以每克CDW计，至少50mg的式I所示的鞘氨醇类碱，更优选地产生，以每克CDW计，至少500mg的式I所示的鞘氨醇类碱。

本发明的微生物菌株的鞘氨醇类碱生产力和组成优选地当所述生产鞘氨醇类碱的微生物菌株在如下条件下培养，并达到稳定期培养物时测定。将来自琼脂平板的微生物细胞接种于装有100ml YEPD培养基的500ml带有挡板的摇瓶中，在30℃以280rpm培育72小时。接下来，将该培养物的1％转移至装有100ml LCBNB生产培养基的另一个500ml带有挡板的摇瓶中，并在30℃以280rpm培育24-96小时。或者在装有100ml MM培养基的500ml带有挡板的摇瓶中在30℃以120rpm培育24-96小时完成主培养。

对于使用HPLC确定乙酰化鞘氨醇类碱(例如长链碱如植物鞘氨醇、鞘氨醇和二氢鞘氨醇)，将1ml全培养液与4ml丙酮在falcon管中混和。将所述管以每分钟250转混和10分钟以提取脂类。将溶液以5,300g离心10分钟。向C18反相HPLC柱注射10μl。在柱温30℃分析样品。移动相由含有0.05％TFA的水/乙腈(10∶90)组成。流速1ml/min，用UV在200nm检测。

在另一个实施方案中，式I所示的鞘氨醇类碱处于酰基酯的形式。所述酰基可通过羟基，即“真正的”酯键，附着至鞘氨醇类碱。优选地，通过酯键连接至鞘氨醇类碱的酰基是1-4个碳原子的短直链酰基，更优选地是乙酰基。或者，所述酰基可通过氨基，即酰胺键，附着至所述鞘氨醇类碱。优选地，通过酰胺键连接至所述鞘氨醇类碱的酰基是1-4个碳原子的短直链酰基，更优选地是乙酰基。

在一个优选的实施方案中，式I所示的鞘氨醇类碱具有式II所示的D-赤式-(2R，3S)-构型：

其中R如在式I中所限定。

特别优选的是式II所示的化合物，其中R是(CH₂)₁₂-CH₃、CHOH-(CH₂)₁₁-CH₃、(CH₂)₁₄-CH₃或CHOH-(CH₂)₁₃-CH₃。

所述微生物菌株优选地是酵母，更优选地来自毕赤氏酵母属(Pichia)或阿舒氏囊霉属(Ashbya)的酵母，最优选地是Pichia ciferrii或棉桃阿舒氏囊霉物种。

在第二方面，本发明提供了用于通过遗传工程构建第一方面的微生物菌株的方法。

在亲本生物中通过遗传工程对鞘脂代谢途径进行工程化可以通过各种途径进行。例如通过修饰(即提高或降低)所述代谢途径中一或多种酶的细胞水平进行。可以通过例如对编码感兴趣的酶的基因进行靶定失活降低细胞水平。另外的或另一种方法，通过提高在宿主生物体内天然存在的鞘脂生物合成酶的浓度进行。最后，通过导入与在亲代生物体中天然存在的酶的氨基酸序列和/或底物特异性不同的鞘脂生物合成酶进行。

更准确地，本发明设想了神经酰胺合酶活性的修饰，任选地与二氢神经酰胺去饱和酶的修饰组合，任选地与神经酰胺酶的修饰组合，任选地与鞘脂Δ8去饱和酶的修饰组合，以此方式获得了从胞内二氢鞘氨醇向游离鞘氨醇，任选地向乙酰化鞘氨醇的转变提高。

另外，本发明设想了神经酰胺酶活性的修饰，任选地与二氢神经酰胺去饱和酶的修饰组合，任选地与神经酰胺合酶的修饰组合，任选地与鞘脂Δ8去饱和酶的修饰组合，以此方式获得了从胞内二氢鞘氨醇向游离鞘氨醇，任选地向乙酰化鞘氨醇的转变提高。

同时，本发明设想了鞘脂Δ8去饱和酶活性的修饰，任选地与二氢神经酰胺去饱和酶的修饰组合，任选地与神经酰胺合酶的修饰组合，任选地与神经酰胺酶的修饰组合，以此方式获得了从胞内二氢鞘氨醇向游离鞘氨醇，任选地向乙酰化鞘氨醇的转变提高。

在一个实施方案中，遗传工程被用于产生与亲本菌株相比显示出提高的式I所示的鞘氨醇类碱生产力(即，以每克CDW计，至少0.5mg的生产力)的微生物菌株，所述提高的生产力是由于神经酰胺合酶和/或神经酰胺酶和任选地二氢神经酰胺去饱和酶的表达和/或酶活性水平提高引起。具体地，这些菌株显示编码神经酰胺合酶和/或神经酰胺酶的多核苷酸的表达提高。所述微生物菌株可以进一步修饰以显示编码二氢神经酰胺去饱和酶的多核苷酸的表达提高。

在这种遗传工程中使用的神经酰胺合酶应当能够从其组成成份例如鞘氨醇类碱成份，特别是二氢鞘氨醇，和长链酰基成份，特别是脂肪酸或脂肪酰-辅酶A硫酯合成神经酰胺。

优选地所述神经酰胺合酶选自：

a.具有SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的多肽，

b.具有与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列有至少45％序列相同性和/或与SEQ IDNO：4所示的氨基酸序列有至少45％序列相同性的氨基酸序列的多肽，

c.具有SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的多肽，

d.具有与SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列有至少45％序列相同性的氨基酸序列的多肽，

e.具有SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列的多肽，和

f.具有与SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列有至少45％序列相同性的氨基酸序列的多肽。

优选地，与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：9和/或SEQ IDNO：10所示的氨基酸序列的序列相同性是50％，更优选地60％、70％、80％、90％。

具有与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列有至少45％序列相同性或与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列有至少45％序列相同性的神经酰胺合酶的实例是具有SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列的神经酰胺合酶。

神经酰胺合酶可以是具有相当变化的氨基酸序列、显示相同性程度低至15％的多肽。因此，适用于本发明的神经酰胺合酶可以得自各种不同来源，例如病毒、真菌、植物或动物，更优选地得自藻类病毒、酵母或哺乳动物，最优选地得自颗石藻类病毒属(Coccolithovirus)、糖酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤氏酵母属(Pichia)、耶罗威亚酵母属(Yarrowia)、假丝酵母属(Candida)、阿舒氏囊霉属、小鼠、大鼠或人类。

令人惊讶地发现由感染微藻球石藻(Emiliana huxleyi)的颗石藻类病毒编码的神经酰胺合酶特别适于发酵生产式I所示的鞘氨醇类碱。

在神经酰胺酶的表达和/或酶活性水平提高的实施方案中，所涉及的神经酰胺酶应当能够优先或甚至特异性地水解含有式I所示的鞘氨醇类碱的神经酰胺。

能够优先或甚至特异性地水解含有式I所示的鞘氨醇类碱的优选的神经酰胺酶选自：

1.具有SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列的多肽，和

2.具有与SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％序列相同性的氨基酸序列的多肽。

这种神经酰胺酶优选地可得自动物来源，更优选地得自哺乳动物，例如小鼠、大鼠或人类。

用于这种遗传工程的二氢神经酰胺去饱和酶应当能够将鞘氨醇类碱，特别是(如神经酰胺中、特别是二氢神经酰胺中所存在的)二氢鞘氨醇的C-4和C-5之间的键去饱和。这种二氢神经酰胺去饱和酶也称为鞘脂Δ4去饱和酶。

能够将鞘氨醇类碱的C-4和C-5之间的键去饱和的优选的二氢神经酰胺去饱和酶选自：

a.具有SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列的多肽，和

b.具有与SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列有至少30％、优选至少40％、更优选至少50％、60％、70％、80％、90％序列相同性的氨基酸序列的多肽。

具有与SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列有至少30％序列相同性的二氢神经酰胺去饱和酶的实例是具有SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18或SEQ IDNO：19所示的氨基酸序列的二氢神经酰胺去饱和酶。

这种二氢神经酰胺去饱和酶可以得自病毒、真菌、植物或动物，优选地得自藻类病毒、酵母或哺乳动物，更优选地得自颗石藻类病毒、酵母菌、裂殖酵母、德巴利酵母、克鲁维酵母、毕赤氏酵母、耶罗威亚酵母、假丝酵母、阿舒氏囊霉、小鼠、大鼠或人类。

在本发明另一个实施方案中，遗传工程被用于产生与亲本菌株相比显示出提高的式I所示的鞘氨醇类碱生产力的微生物菌株，所述提高的生产力是由于鞘脂Δ8去饱和酶和/或神经酰胺酶的表达和/或酶活性水平降低和/或胞内定位改变引起，特别是由于编码鞘脂Δ8去饱和酶和/或神经酰胺酶的多核苷酸表达降低引起。

用于这种遗传工程的鞘脂Δ8去饱和酶应当能够将鞘氨醇类碱的C-8和C-9之间的键去饱和。

优选的鞘脂Δ8去饱和酶选自：

a.具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的多肽，和

b.具有与SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列有至少30％、优选至少40％、更优选至少50％、60％、70％、80％、90％序列相同性的氨基酸序列的多肽。

具有与SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列有至少30％序列相同性的鞘脂Δ8去饱和酶的实例是具有SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列的鞘脂Δ8去饱和酶。

这种鞘脂Δ8去饱和酶可以得自真菌，优选地得自酵母，更优选地得自酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母、多形汉逊酵母、巴斯德毕赤氏酵母、Pichiaciferrii、解脂耶氏酵母、白假丝酵母、产朊假丝酵母或棉桃阿舒氏囊霉，最优选地得自Pichia ciferrii、棉桃阿舒氏囊霉或解脂耶氏酵母。

在神经酰胺酶的表达和/或酶活性水平降低的实施方案中，所涉及的神经酰胺酶应当能够优先或甚至特异性地将含有植物鞘氨醇或二氢鞘氨醇的神经酰胺水解为鞘氨醇类碱。

能够优先或甚至特异性地将含有植物鞘氨醇或二氢鞘氨醇的神经酰胺水解为鞘氨醇类碱的优选的神经酰胺酶选自：

a.SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的多肽，和

b.具有与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列有至少25％、优选至少30％、更优选至少40％、50％、60％、70％、80％、90％序列相同性的氨基酸序列的多肽。

这种神经酰胺酶可以得自真菌，优选地得自酵母，更优选地得自酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母、多形汉逊酵母、巴斯德毕赤氏酵母、Pichia ciferrii、解脂耶氏酵母、白假丝酵母、产朊假丝酵母或棉桃阿舒氏囊霉，最优选地得自Pichia ciferrii、棉桃阿舒氏囊霉或解脂耶氏酵母。

在一个优选的实施方案中，构建微生物菌株，其中如上述相关酶的表达水平的提高与如上述其他相关酶的表达水平的降低相组合。

在上述实施方案中，特定氨基酸序列与参考氨基酸序列的相同性百分比通过对所述参考序列进行如下分析确定。

在本发明中，遗传工程化的菌株中鞘氨醇类碱生产力的提高包括与衍生所述遗传工程化的菌株的亲本菌株的生产力相比鞘氨醇类碱的生产力提高，和/或产生所述亲本菌株基本不产生或完全不产生的鞘氨醇类碱。

在本发明中，具有符合相同性百分比要求的氨基酸序列的多肽(称为同源多肽)可以通过用所涉及的参考氨基酸序列筛选合适的序列数据库而方便地鉴别。同源多肽也可以通过对参考多肽进行诱变而衍生自此多肽。合适的应用于编码所涉及的多肽的基因的诱变技术包括随机诱变(例如易错PCR(error-prone PCR))、定点诱变和/或基因重排(geneshuffling)。例如，可以使用诱变获得比野生型多肽对其底物具有更高亲和力、和/或具有更高特异性酶活性和/或具有改变的底物特异性(例如针对鞘氨醇类碱的烃链长度或针对鞘氨醇类碱本身)的神经酰胺合酶多肽、水解含有式I所示的鞘氨醇类碱的神经酰胺的神经酰胺酶多肽、或二氢神经酰胺去饱和酶多肽。同时，可以使用诱变获得比野生型多肽对其底物具有更低的亲和力和/或具有更低酶比活性的能够优先或甚至特异性地水解含有植物鞘氨醇或二氢鞘氨醇作为鞘氨醇类碱的神经酰胺的神经酰胺酶多肽，或鞘脂Δ8去饱和酶多肽。

根据本发明对微生物菌株进行遗传工程化以获得感兴趣的酶表达提高可以通过过表达编码所述酶的内源基因(即在亲本菌株中已经天然编码)(同源过表达)或表达在亲本菌株中非天然存在的基因(异源(过)表达)实现。编码感兴趣的酶的基因的同源和异源(过)表达都可以通过将所述基因的一个拷贝或多个拷贝整合进亲本菌株的染色体中或通过提供处于能够无需亲本菌株的染色体复制即可进行自主复制的DNA元件上的所述基因的一个拷贝或多个拷贝实现。所述自主复制DNA元件可以是质粒、人工染色体或病毒。

在本发明中，降低感兴趣的酶的活性包括降低在亲本菌株中天然存在的并且编码所述感兴趣的酶的基因的表达。降低这种基因的表达可以通过由遗传学手段进行的所述基因的靶定失活实现，所述遗传学手段包括缺失编码所述酶的基因的一部分核苷酸序列和/或缺失编码所述酶的基因的全部核苷酸序列和/或破坏编码所述酶的基因的核苷酸序列。另一种方法或另外地，可以破坏、缺失或改变负责调节编码酶的基因的表达的核苷酸序列、负责信使RNA的加工、运输至特定亚细胞腔和翻译的核苷酸序列，以降低感兴趣的酶的活性。在另一个实施方案中，可以从代表编码感兴趣的酶的基因的一部分或完整基因的核苷酸序列表达反义RNA，以诱导衍生自编码这些酶的核苷酸序列的mRNA和反义RNA的杂交体的降解或阻断衍生自编码这些酶的核苷酸序列的mRNA的翻译。

在本发明中，亲本菌株可以是不产生式I所示的鞘氨醇类碱的菌株。亲本菌株也可以是虽然产生，但是，以每克CDW计，产生低于0.5mg的式I所示的鞘氨醇类碱的微生物菌株。

亲本菌株也可以是产生一定量的不同于式I所示的鞘氨醇类碱的鞘氨醇类碱的菌株，例如优选地，Pichia ciferrii NRRL Y-1031 F-60-10和/或WO95/12683中公开的任何Pichia ciferrii菌株，它们均主要产生C18-植物鞘氨醇。

特别适于用作本发明的亲本菌株的菌株是在编码二氢鞘氨醇C-4羟化酶(将二氢鞘氨醇转变为植物鞘氨醇的酶)的基因中存在缺陷的菌株，特别是衍生自产生大量鞘氨醇类碱植物鞘氨醇的菌株的二氢鞘氨醇C-4羟化酶缺陷菌株。可以通过将感兴趣的菌株暴露于毒素丁香霉素E(syringomycinE)并选择丁香霉素E抗性菌株获得二氢鞘氨醇C-4羟化酶缺陷菌株(Grilley etal.(1998).J.Biol.Chem.273，11062-11068)。在这些菌株中包括二氢鞘氨醇羟化酶缺陷菌株(Δsyr2菌株)。或者，可以通过使用遗传学方法缺失或破坏而使SYR2基因靶定失活来获得缺乏二氢鞘氨醇C-4羟化酶的菌株。

例如，适合用作亲本菌株的是Pichia ciferrii的syr2突变株，可通过对Pichiaciferrii进行丁香霉素E选择而获得(参见未公开的WO 2006/048458)。

如本文所述编码多肽的多核苷酸可适于其将被在其中表达的微生物菌株的密码子使用。密码子使用表可以很方便地在数据库中找到，例如数据库如http:// www.kazusa.or.jp/codon/。

如本文所述的多核苷酸所插入的载体可以是任何可以方便地进行重组DNA操作的载体，并且所述载体的选择通常依赖于其所要被导入的宿主细胞。因此，所述载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，所述载体的复制不依赖于染色体复制，例如质粒、粘粒、病毒或噬菌体载体，通常具有复制起点。或者，所述载体可以是当导入宿主细胞中时整合进宿主细胞基因组并与其所整合进的染色体一起复制的载体。所述载体可以是环状的，例如质粒，或者是线状的，例如表达盒(expression cassette)。

整合载体可以随机或在预定靶位点整合进宿主细胞染色体。对于靶定整合，所述整合载体包含与宿主基因组中预定靶基因座的DNA序列同源的DNA片段。为了促进靶定整合，所述载体在转化宿主细胞前优选地被线性化。优选地进行线性化，由此所述克隆载体的至少一个但是优选地每一个末端的侧翼是与靶基因座同源的序列。靶基因座侧翼的同源序列的长度优选地至少0.1kb，更优选地至少0.2kb，更优选地至少0.5kb，更优选地至少1kb，最优选地至少2kb。同源序列不需要与靶基因座严格相同。所需要的相同程度可依赖于同源序列的长度。典型地，所述相同百分比至少是大约80％。

根据使用的多核苷酸在本发明的遗传工程中所希望的用途，如果目的是希望表达一个基因的话，可以将所述多核苷酸插入表达盒中，或如果目的是希望失活一个基因的话，则插入失活盒中。

在表达盒中，将编码序列可操纵地连接至能够使宿主细胞从所述编码序列表达多肽的调控序列。术语“可操纵地连接”是指并置，其中所述成份处于使它们以其希望的方式发挥功能的相关联的状态。与编码序列“可操纵地连接”的调控序列例如启动子、增强子或另一个表达调控信号被置于使得在与所述调控序列相容的条件下得以实现从其编码序列表达多肽的位置。

失活盒被构建为使其能够靶向整合到需要失活的基因中。所述失活盒典型地包含需要失活的基因的非功能性对应物(counterpart)。所述非功能性对应物可以是多核苷酸，其中缺失所涉及的基因的编码序列的一部分或全部，从而靶向整合会引起天然编码序列被缺陷编码序列取代。用于基因失活的多核苷酸序列应当与包含需要失活的基因的靶序列至少80％相同。

在第三方面，本发明提供了显示神经酰胺合酶活性、鞘脂Δ8去饱和酶活性或神经酰胺酶活性的新的多肽。

在一个实施方案中，提供了显示神经酰胺合酶活性的多肽，所述多肽选自由具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多肽和具有与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％序列相同性的氨基酸序列的多肽组成的一组，和/或选自由具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的多肽和具有与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列有至少55％、优选至少60％、更优选至少70％、更优选至少80％、最优选至少90％序列相同性的氨基酸序列的多肽组成的一组。所述多肽优选地得自毕赤氏酵母，更优选地得自Pichia ciferrii。

在进一步的实施方案中，提供了显示鞘脂Δ8去饱和酶活性的多肽，所述多肽选自由具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的多肽和具有与SEQ IDNO：6所示的氨基酸序列有至少65％、优选至少70％、更优选至少80％、最优选至少90％序列相同性的氨基酸序列的多肽组成的一组。所述多肽优选地得自毕赤氏酵母，更优选地得自Pichia ciferrii。

在一个进一步的实施方案中，提供了显示神经酰胺酶活性的多肽，所述神经酰胺酶优先或甚至特异性地将具有植物鞘氨醇或二氢鞘氨醇的神经酰胺水解为鞘氨醇类碱，所述多肽选自由具有SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的多肽和具有与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列有至少60％、优选至少70％、更优选至少80％、最优选至少90％序列相同性的氨基酸序列的多肽组成的一组。所述多肽优选地得自毕赤氏酵母，更优选地得自Pichiaciferrii。

术语“同源性”或“相同性百分比”在本文中可互换使用。为了本发明的目的，本文中对其进行限定以确定两个氨基酸序列的相同性百分比，所述序列为了最佳对比目的进行排列(例如为了最佳排列可以在每一个序列中引入缺口)。之后对比在对应氨基酸位置的氨基酸残基。当第一序列中的一个位置在第二序列中的对应位置被相同氨基酸残基占据时，这两个分子在该位置是相同的。两个序列之间的相同性百分比是两个序列之间相同位置数目的函数(即％相同性＝相同位置数目/位置总数(即包括缺口的重叠位置)×100)。优选地，所述两个序列具有相同长度。

本领域技术人员应当了解多个不同的计算机程序可用于确定两个序列之间的同源性。例如对比序列并确定两个序列之间的相同性百分比可使用数学算法进行。在一个优选的实施方案中，两个氨基酸序列之间的相同性百分比用Needleman and Wunsch(J.Mol.Biol.(48)：444-453(1970))算法确定，所述算法已经并入Accelrys GCG软件包中的GAP程序中(可在www.accelrys.com/products/gcg得到)，使用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵，缺口加权为16、14、12、10、8、6、或4，长度加权为0.5、1、2、3、4、5、或6。本领域技术人员应当了解全部这些不同的参数会得到有轻微差异的结果，但是当使用不同算法时两个序列的整体相同性百分比并未显著改变。优选地，矩阵是具有缺口加权10.0和长度加权0.5的Blossom 62矩阵。

本发明的蛋白质序列可进一步用作“查询序列”对公共数据库进行检索，以例如鉴别其他同族成员或相关序列。这些检索可使用Altschul，et al.(1990)J.Mol.Biol.215：403-10的blastp、psi-blast、phi-blast和tblastn程序(2.0版)进行。当使用blastp、psi-blast、phi-blast和tblastn程序时，可以使用各个程序(例如blastp、psi-blast、phi-blast和tblastn程序)的默认参数。参见美国国家生物技术信息中心(National Centerfor Biotechnology Information)的主页www.ncbi.nlm.nih.gov。

具有显示与参考氨基酸序列有相同性百分比的氨基酸序列的多肽称为同源多肽。同源多肽可以是从其他生物体特别是酵母或动物获得的天然存在的变体，或者可以是工程化的变体。

在第四方面，本发明提供了包含编码第三方面的多肽的核苷酸序列的多核苷酸。所述多核苷酸可以包含编码SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQID NO：6和/或SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的核苷酸序列。例如，分别编码SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的核苷酸序列分别是SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：5和SEQ ID NO：7。针对宿主生物的密码子使用优化核苷酸序列是有利的。所述优化的核苷酸序列的实例是编码具有SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列的碱性神经酰胺酶的SEQ IDNO：32、编码具有SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的神经酰胺合酶的SEQ ID NO：33、和编码具有SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列的神经酰胺合酶的SEQ ID NO：34。

在一个进一步的方面，本发明提供了通过在使本发明的鞘氨醇类碱和(如果需要)待用的多肽表达的条件下培养本发明的第一方面的微生物细胞(可由本发明第二方面的方法获得)和/或用本发明第四方面的(例如如上述克隆在表达盒和/或失活盒中的)多核苷酸转化的宿主细胞制备式I所示的鞘氨醇类碱，以及任选地收集所述鞘氨醇类碱的方法。

本发明的细胞可以使用本领域已知的方法培养。对于启动子和宿主细胞的每一种组合，已有有助于表达本发明的多肽的培养条件。在达到所希望的细胞密度后，停止培养并使用已知的方法收集本发明的多肽或鞘氨醇类碱。

所述发酵培养基可包括含有碳源(例如葡萄糖、麦芽糖、糖蜜)、氮源(例如氨、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵、有机氮源例如酵母提取物、麦芽提取物、蛋白胨)、以及其他无机营养源(例如磷酸盐、镁、钾、锌、铁等等)的已知培养基。任选地，可以包括诱导物。

合适的培养基的选择可以基于表达宿主和/或基于表达构建体的调控要求和/或基于与本发明的鞘氨醇类碱的最优生产相关的要求进行。本领域技术人员已知这些培养基。

所述发酵可以以0.5-30天的周期进行。其可以是合适地在0至45℃的温度范围之间和例如在pH 2和10之间进行的分批、连续或补料过程。优选的发酵条件是20至37℃的温度范围之间和/或pH 3和9之间。合适的条件通常基于表达宿主和需要表达的蛋白质的选择进行选择。

在发酵之后，如果需要，可以将细胞从发酵液中通过离心或过滤手段分离。之后可以从细胞和/或发酵液中收集本发明的鞘氨醇类碱，并且如果需要，可以通过常规手段纯化和分离。

本发明有利地示出了式I所示的鞘氨醇类碱或其盐或酯的完全发酵生产可以通过在发酵过程中提高活性神经酰胺合酶的胞内浓度而被显著提高。具体地，示出了鞘氨醇或其盐或酯的发酵生产通过提高活性神经酰胺合酶多肽的胞内浓度或通过在发酵过程中产生对于宿主来说新的(对于氨基酸序列来说)具有神经酰胺合酶活性的酶而被显著提高。

方便地，本发明的鞘氨醇类碱可与合适的赋形剂组合以产生鞘氨醇类碱组合物。

本发明的鞘氨醇类碱可用作起始材料以制备其他鞘氨醇类碱或鞘脂，例如神经酰胺、神经节苷脂或脑苷脂。

附图说明

图1示出了用于在棉桃阿舒氏囊霉中靶定失活SYR2的质粒pUG6-AgSUR2::kanMX的图示。示出了棉桃阿舒氏囊霉TEF启动子(水平阴影)、棉桃阿舒氏囊霉TEF终止子(对角线阴影)、loxP位点(黑体)、卡那霉素抗性基因(深灰色)、用于同源重组的棉桃阿舒氏囊霉SYR2的上游区域(US)和下游区域(DS)(网格线)、和氨苄青霉素抗性基因(bla；浅灰色)。也示出了克隆步骤相关的限制位点。

图2示出了用于在棉桃阿舒氏囊霉中由GAP启动子靶定取代DES1前面的天然启动子的质粒pAG32-hyg-PAgGAP-AgDES1的图示。示出了棉桃阿舒氏囊霉TEF启动子(水平阴影)、棉桃阿舒氏囊霉TEF终止子(对角线阴影)、潮霉素抗性基因(深灰色)、用于同源重组的棉桃阿舒氏囊霉DES1的上游区域(US)(网格线)和棉桃阿舒氏囊霉DES1的5’区域(黑色)、和氨苄青霉素抗性基因(bla；浅灰色)。也示出了克隆步骤和转化相关的限制位点。

图3示出了用于在棉桃阿舒氏囊霉中由GAP启动子靶定取代DES1前面的天然启动子和在棉桃阿舒氏囊霉ENO启动子的控制下过表达棉桃阿舒氏囊霉LAG1的质粒pAG-LAG1-1的图示。示出了棉桃阿舒氏囊霉TEF启动子(水平阴影)、棉桃阿舒氏囊霉TEF终止子(对角线阴影)、潮霉素抗性基因(深灰色)、用于同源重组的棉桃阿舒氏囊霉DES1的上游区域(US)(网格线)和棉桃阿舒氏囊霉DES1的5’区域(黑色)、棉桃阿舒氏囊霉LAG1(黑色)和氨苄青霉素抗性基因(bla；浅灰色)。也示出了克隆步骤和转化相关的限制位点。

图4示出了用于在棉桃阿舒氏囊霉中由GAP启动子靶定取代DES1前面的天然启动子和在棉桃阿舒氏囊霉ENO启动子的控制下过表达棉桃阿舒氏囊霉LAF1的质粒pAG-LAF1-1的图示。示出了棉桃阿舒氏囊霉TEF启动子(水平阴影)、棉桃阿舒氏囊霉TEF终止子(对角线阴影)、潮霉素抗性基因(深灰色)、用于同源重组的棉桃阿舒氏囊霉DES1的上游区域(US)(网格线)和棉桃阿舒氏囊霉DES1的5’区域(黑色)、棉桃阿舒氏囊霉LAF1(黑色)和氨苄青霉素抗性基因(bla；浅灰色)。也示出了克隆步骤和转化相关的限制位点。

图5示出了用于靶定取代棉桃阿舒氏囊霉SYR2和在棉桃阿舒氏囊霉ENO启动子的控制下分别过表达棉桃阿舒氏囊霉DES1和LAF1的质粒pSSTH-LAF1-2的图示。示出了棉桃阿舒氏囊霉TEF启动子(水平阴影)、棉桃阿舒氏囊霉TEF终止子(对角线阴影)、kanMX抗性基因(深灰色)、棉桃阿舒氏囊霉SYR2的启动子区域(AgSUR2-P)和终止子区域(AgSUR2-T)(网格线)、棉桃阿舒氏囊霉DES1(黑色)、棉桃阿舒氏囊霉LAF1(黑色)和氨苄青霉素抗性基因(bla；浅灰色)。也示出了克隆步骤和转化相关的限制位点。

图6示出了用于靶定破坏棉桃阿舒氏囊霉8DES的质粒pAG32-D8D的图示。示出了棉桃阿舒氏囊霉TEF启动子(水平阴影)、棉桃阿舒氏囊霉TEF终止子(对角线阴影)、潮霉素抗性基因(深灰色)和氨苄青霉素抗性基因(bla；浅灰色)。也示出了克隆步骤和转化相关的限制位点。

图7示出了分离完整Pichia ciferrii LAG1基因座的三步方法。

扩增PcLAG1的内部一部分(I.)，之后进行两轮反向PCR(II.和III.)。标出了在各个步骤中使用的寡核苷酸，并且在不同阴影中表示的序列示出了PcLAG1基因座的几个部分，所述部分的DNA序列在各个步骤中确定。也示出了实验步骤相关的限制位点。

图8示出了分离完整Pichia ciferrii LAF1基因座的三步方法。

扩增PcLAF1的内部一部分(I.)，之后进行两轮反向PCR(II.和III.)。标出了在各个步骤中使用的寡核苷酸，并且在不同阴影中表示的序列示出了PcLAF1基因座的几个部分，所述部分的DNA序列在各个步骤中确定。也示出了实验步骤相关的限制位点。

图9示出了分离完整Pichia ciferrii YXC1基因座的六步方法。

扩增PcYXC1的内部一部分(I.)，之后进行五轮反向PCR(II.-V.)。标出了在各个步骤中使用的寡核苷酸，并且在不同阴影中表示的序列示出了PcYXC1基因座的几个部分，所述部分的DNA序列在各个步骤中确定。也示出了实验步骤相关的限制位点。

图10示出了分离完整Pichia ciferrii 8DES基因座的四步方法。

扩增Pc8DES的内部一部分(I.)，之后进行三轮反向PCR(II.-IV.)。标出了在各个步骤中使用的寡核苷酸，并且在不同阴影中表示的序列示出了Pc8DES基因座的几个部分，所述部分的DNA序列在各个步骤中确定。也示出了实验步骤相关的限制位点。

图11示出了用于在Pichia ciferrii中过表达PcDES1、AgLAF1和AgLAG1的质粒pPC-DES1-AgLAF1-AgLAG1的图示。示出了Pichia ciferrii TDH1(对角线阴影)和PDA1启动子(水平阴影或白色)、棉桃阿舒氏囊霉LAF1和LAG1基因(都是深灰色)、Pichia ciferriiDES1(对角线阴影)和L41基因(深灰色)、用于同源重组的5S-26S rDNA基因间区域(网格线)和氨苄青霉素抗性基因(bla；浅灰色)。也示出了克隆步骤相关的限制位点。

图12示出了用于在Pichia ciferrii中过表达PcDES1、PcLAF1和omCER的质粒p-mCER-nat1-PcLAF1的图示。示出了Pichia ciferrii TDH1启动子(白色)和PDA1启动子(水平阴影)、Pichia ciferrii LAF1(对角线阴影)、密码子优化的omCER(竖直阴影)和密码子优化的nat1基因(深灰色)、用于同源重组的5S-26S rDNA基因间区域(网格线)和氨苄青霉素抗性基因(bla；浅灰色)。也示出了克隆步骤相关的限制位点。

图13示出了用于在Pichia ciferrii中过表达PcLAG1和omCER的质粒p-mCER-nat1-PcLAG1的图示。示出了Pichia ciferrii TDH1启动子(白色)和PDA1启动子(水平阴影)、Pichia ciferrii ENO1终止子(深灰色)、TEF终止子(对角线阴影)、Pichia ciferriiLAG1(对角线阴影)、密码子优化的omCER(竖直阴影)和密码子优化的nat1基因(深灰色)、用于同源重组的5S-26SrDNA基因间区域(网格线)和氨苄青霉素抗性基因(bla；浅灰色)。也示出了克隆步骤相关的限制位点。

图14示出了用于在Pichia ciferrii中过表达oCvLAG1和omCER的质粒p-mCER-nat1-oCvLAG1的图示。示出了Pichia ciferrii TDH1启动子(白色)和PDA1启动子(水平阴影)、Pichia ciferrii ENO1终止子(深灰色)、TEF终止子(对角线阴影)、密码子优化的oCvLAG1(对角线阴影)、密码子优化的omCER(竖直阴影)和密码子优化的nat1基因(深灰色)、用于同源重组的5S-26S rDNA基因间区域(网格线)和氨苄青霉素抗性基因(bla；浅灰色)。也示出了克隆步骤相关的限制位点。

图15示出了用于在Pichia ciferrii中过表达omLASS5和omCER的质粒p-mCER-nat1-omLASS5的图示。示出了Pichia ciferrii TDH1启动子(白色)和PDA1启动子(水平阴影)、Pichia ciferrii ENO1终止子(深灰色)、TEF终止子(对角线阴影)、密码子优化的omLASS5(对角线阴影)、密码子优化的omCER(竖直阴影)和密码子优化的nat1基因(深灰色)、用于同源重组的5S-26S rDNA基因间区域(网格线)和氨苄青霉素抗性基因(bla；浅灰色)。也示出了克隆步骤相关的限制位点。

图16示出了用于靶定整合进Pichia ciferrii 5S-26S rDNA基因间区域并过表达Pichia ciferrii DES1、过表达密码子优化的omCER和过表达密码子优化的oCvLAG1的质粒pTH-LP-1的图示，所述基因中的每一个都处于Pichia ciferrii TDH1启动子的控制之下。示出了Pichia ciferrii TDH1启动子(白色)、Pichia ciferrii ENO1终止子(黑色)、Pichia ciferrii DES1(竖直阴影)、密码子优化的omCER(竖直阴影)、密码子优化的oCvLAG1(竖直阴影)、Pichia ciferrii PcL41放线菌酮抗性基因(黑色)、5S-26S rDNA基因间区域整合位点(IS；点线)和氨苄青霉素抗性基因(bla；浅灰色)。也示出了克隆步骤和转化相关的限制位点。

图17示出了用于靶定破坏Pichia ciferrii编码鞘脂Δ8-去饱和酶的基因8DES并过表达Pichia ciferrii DES1、过表达密码子优化的omCER和过表达密码子优化的oCvLAG1的质粒pTH-deltaD8D的图示，所述基因中的每一个都处于Pichia ciferrii TDH1启动子的控制之下。示出了Pichia ciferriiTDH1启动子(白色)、Pichia ciferrii ENO1终止子(黑色)、Pichia ciferriiDES1(竖直阴影)、密码子优化的omCER(竖直阴影)、密码子优化的oCvLAG1(竖直阴影)、Pichia ciferrii PcL41放线菌酮抗性基因(黑色)、染色体整合位点8DES(点线)和氨苄青霉素抗性基因(bla；浅灰色)。也示出了克隆步骤和转化相关的限制位点。

图18示出了用于靶定失活Pichia ciferrii碱性神经酰胺酶基因(PcYXC1)并在Pichia ciferrii中同时过表达oCvLAG1、PcDES1、和omCER的质粒pSo-5的图示。示出了Pichia ciferrii TDH1启动子(P_TDH1，白色)、Pichia ciferriiENO1终止子(T_ENO1，黑色)、Pichia ciferrii DES1(对角线阴影)、密码子优化的omCER(竖直阴影)和密码子优化的oCvLAG1基因(水平阴影)、用于靶定整合的Pichia ciferrii YXC1碱性神经酰胺酶内部片段(网格线)，和氨苄青霉素抗性基因(bla；浅灰色)。也示出了克隆步骤相关的限制位点。

图19示出了棉桃阿舒氏囊霉菌株中鞘氨醇类碱组成的RP-HPLC分析结果。所分析的菌株是野生型ATCC19895(WT)及其衍生物，具有如下基因型：Δsyr2(Δsyr2)、Δsyr2P_TDH3-DES1(Δsyr2 OP Des1p)、Δsyr2 P_TDH3-DES1P_ENO1-LAF1(Δsyr2 OP Des1p OP Laf1p)和Δsyr2 P_ENO1-DES1 P_ENO1-LAF18DES::pAG32-D8D(Δsyr2Δ8DES OP Des1p OP Laf1p)。

实施例

实施例1

分别同时过量产生棉桃阿舒氏囊霉的酶Laf1p和Des1p或Lag1p和Des1p的棉桃阿舒氏囊霉syr2突变株的构建

质粒pUG6-AgSUR2::kanMX被设计为用kanMX抗性基因取代棉桃阿舒氏囊霉SYR2基因，从而使其失活；质粒pAG-LAG1-1或pAG-LAF1-1是为了分别同时过表达棉桃阿舒氏囊霉DES1和LAG1或LAF1。棉桃阿舒氏囊霉SYR2序列通过使用被功能性鉴定的酿酒酵母二氢鞘氨醇C4-羟化酶(称为SUR2/SYR2)(Grilley et al.，1998；NCBI编号NC_001136.7)作为模板针对Ashbya Genome Database(http://ashbya.genome.duke.edu/blast.html/)进行BLASTP检索得到，检索结果是与棉桃阿舒氏囊霉基因AAL066W(GenBank编号#AAS50300，位于I号染色体上232310-233326位)显著匹配，分值为409字节(bit)(位置相同性和相似性分别是62％和78％)。由MWG Biotech(Ebersberg，Germany)合成如下寡核苷酸，以通过使用棉桃阿舒氏囊霉ATCC19895细胞作为模板进行菌落PCR扩增棉桃阿舒氏囊霉SYR2编码序列的下游区域，之后克隆进pUG6(EUROSCARF，Oberursel，GERMANY)：

AgSUR2T-fw：

TAT ATAGTT AAC AGG CAA AGC TGA CGC TGC TCT CC(SEQ IDNO：23中的核苷酸1719-1741；包含HpaI识别位点)

AgSUR2T-rv：

TAT ATAACT AGT ATG GAC GCT GCA GTG CAG AAC C(SEQ IDNO：23中的核苷酸2500-2521；包含SpeI识别位点)

所述寡核苷酸用于根据Innis et al.，(PCR protocols.A guide to methodsandapplications，1990，Academic Press)进行PCR反应，其中根据生产商说明使用PhusionTMHigh Fidelity PCR Master Mix(Finnzymes，cat.#F-531L)。通过进行此方法可以得到一个815bp片段。所述片段使用MinElute GelExtraction Kit(QIAGEN，cat.#28606)根据生产商说明进行纯化。之后用HpaI(New England Biolabs，cat.#R0138L)和SpeI(New EnglandBiolabs，cat.#R0151S)消化2小时并与EcoRV(New England Biolabs，cat.#R0195L)和SpeI切割的pUG6用T4DNA Ligase(New England Biolabs，cat.#M0202L)根据生产商说明进行连接。将2.5μl连接产物根据生产商的方案中所描述的化学转化感受态大肠杆菌(E.coli)(Invitrogen OneTOP10，cat.#C4040-03)。同样得到质粒pUG6-AgSUR2-T(4806bp)。合成如下寡核苷酸以扩增同样需要克隆进pUG6的上游区域：

AgSUR2P-fw2：

TAT ATACAG CTG CGT CTG TAC CAG AAC CTG TGC(SEQ IDNO：23中的核苷酸1-21；包含PvuII识别位点)

AgSUR2P-rv2：

TAT ATAGTC GAC CTA CGT CAT CCA TGA ACG ACA CT(SEQ IDNO：23中的核苷酸800-821；包含SalI识别位点)

所述寡核苷酸用于进行菌落PCR反应，其中使用Phusion^TM HighFidelity PCRMaster Mix和棉桃阿舒氏囊霉ATCC19895细胞作为模板。通过进行此方法可以得到一个840bp片段。所述片段使用MinElute GelExtraction Kit进行纯化。之后用SalI(NewEngland Biolabs，cat.#R0138L)和PvuII(New England Biolabs，cat.#R0151S)消化2小时并与SalI和PvuII切割的如上所述的pUG6-AgSUR2-T进行连接，产生图1所示的质粒pUG6-AgSUR2::kanMX(5537bp)。这个质粒适于在转化进棉桃阿舒氏囊霉之后由kanMX取代棉桃阿舒氏囊霉SYR2，从而使SYR2失活。

棉桃阿舒氏囊霉DES1序列通过使用被功能性鉴定的白假丝酵母二氢神经酰胺Δ4-去饱和酶(Ternes et al.，2002；NCBI编号NW_139432.1)作为模板针对Ashbya GenomeDatabase(http://ashbya.genome.duke.edu/blast.html/)进行BLASTP检索得到，检索结果是与棉桃阿舒氏囊霉基因AGR025W(GenBank编号#AAS54514，位于VII号染色体上761515-762654bp)显著匹配，分值为378字节(bit)(氨基酸位置相同性和相似性分别是52％和65％)。合成如下寡核苷酸以扩增棉桃阿舒氏囊霉DES1编码序列的上游DNA区域：

AgDES1-US-fw：

TAT ATAGTT AAC TCC ATC AGC GCG ACA ACA GG(SEQ IDNO：22中的核苷酸1-20；包含HpaI识别位点)

AgDES1-US-rv：

TAT ATAGAG CTC TCC GAA TCG AGG CGT GTG TAG(SEQ IDNO：22中的核苷酸830-850；包含SacI识别位点)

所述寡核苷酸用于进行菌落PCR反应，其中使用Phusion^TM HighFidelity PCRMaster Mix和棉桃阿舒氏囊霉ATCC19895细胞作为模板。通过进行此方法可以得到一个874bp片段。所述片段使用MinElute GelExtraction Kit进行纯化。之后用HpaI(NewEngland Biolabs，cat.#R0105S)和SacI(New England Biolabs，cat.#R0156S)消化2小时并与分别切割的载体pAG32(EUROSCARF，Oberursel，GERMANY)进行连接，产生质粒pAG32-AgDES1-US(4916bp)，所述质粒是用于进一步克隆步骤的中间质粒。接下来合成如下寡核苷酸以扩增棉桃阿舒氏囊霉DES1编码序列的5′-末端：

AgDES1-DS-fw：

ATG AAC CAA CGG GGT ATA GCG AC(SEQ ID NO：22中的核苷酸905-927)

AgDES1-DS-rv：

TAT ATAAAG CTT CTC TTC AAT GCT GAA GAG GTA GTG(SEQID NO：22中的核苷酸1652-1675；包含HindIII识别位点)

所述寡核苷酸用于进行菌落PCR反应，其中使用Phusion^TM HighFidelity PCRMaster Mix和棉桃阿舒氏囊霉ATCC19895细胞作为模板。通过进行此方法可以得到一个783bp片段。所述片段使用MinElute GelExtraction Kit进行纯化。通过用Phusion^TM HighFidelity PCR Master Mix进行交叉PCR将棉桃阿舒氏囊霉3-磷酸甘油醛脱氢酶的启动子(SEQ IDNO：24)融合至前面扩增的棉桃阿舒氏囊霉DES1编码序列的5′-末端。所述启动子序列通过使用被功能性鉴定的酿酒酵母3-磷酸甘油醛脱氢酶(Holland et al.，1979；NCBI编号NC_001142.6)作为模板针对Ashbya GenomeDatabase(http://ashbya.genome.duke.edu/blast.html/)进行BLASTP检索得到，检索结果是与棉桃阿舒氏囊霉基因AER031C(GenBank编号#AAS52715，位于V号染色体上695233-696228bp)显著匹配，分值为530字节(bit)(氨基酸位置相同性和相似性分别是78％和89％)。合成如下寡核苷酸以扩增棉桃阿舒氏囊霉3-磷酸甘油醛脱氢酶编码序列起始密码子的上游启动子区域：

PGAP-fw：

TAT ATAGTC GACGGC TCT CCT CGC TCT GCT CAA G(SEQ IDNO：24中的核苷酸1-23；包含SalI识别位点)

PGAP-rv；

GTC GCT ATA CCC CGT TGG TTC ATT GTG CGG TGT GTA TGT

GTG GAC(SEQ ID NO：24中的核苷酸497-518和SEQ ID NO：22中的核苷酸1-23)

所述寡核苷酸用于进行菌落PCR反应，其中使用Phusion^TM HighFidelity PCRMaster Mix和棉桃阿舒氏囊霉ATCC19895细胞作为模板。通过进行此方法可以得到一个550bp片段。所述片段使用MinElute GelExtraction Kit进行纯化。使用寡核苷酸PGAP-fw和AgDES1-DS-rv以及1μl前面扩增并纯化的棉桃阿舒氏囊霉3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因的启动子和棉桃阿舒氏囊霉DES1编码序列的5′-末端进行交叉PCR。通过进行此方法得到的1310bp片段使用MinElute Gel Extraction Kit进行纯化。之后用SalI(New EnglandBiolabs，cat.#R0138S)和HindIII(New England Biolabs，cat.#R0104S)消化并与分别切割的如上所述的载体pAG32-AgDES1-US进行连接，产生图2所示的质粒pAG32-hyg-PAgGAP-AgDES1(6192bp)。这个质粒适于用棉桃阿舒氏囊霉3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因的启动子取代天然棉桃阿舒氏囊霉DES1启动子以获得提高的Des1p活性。所克隆的棉桃阿舒氏囊霉DES1基因的DNA上游区域、所克隆的棉桃阿舒氏囊霉DES1基因的5′-末端和所克隆的棉桃阿舒氏囊霉3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因的启动子的真实性通过由Sequiserve(Vaterstetten，GERMANY)进行的DNA测序进行确认，所述DNA测序使用Sanger et al.(Proceedings of the NationalAcademy of Sciences，U.S.A.，74：5463-5467)开发的双脱氧链终止法进行。在相应克隆的质粒pAG32-hyg-PAgGAP-AgDES1的DNA序列中缺少公开的DES1编码序列(GenBank编号#AAS50300；在Ashbya Genome Database：http://ashbya.genome.duke.edu/blast.html/中AGR025W)的核苷酸382、489和405，导致公开的蛋白质序列在氨基酸位置29-34改变为ANLPI，这与其他所有酵母Des1p中的相应区域相同。因此，公开的棉桃阿舒氏囊霉DES1DNA序列很可能含有序列错误。

棉桃阿舒氏囊霉LAG1序列通过使用被功能性鉴定的称为LAC1的酿酒酵母神经酰胺合酶成份(Schorling et al.，2001；NCBI编号NC_001143.7)作为模板针对AshbyaGenome Database(http://ashbya.genome.duke.edu/blast.html/)进行BLASTP检索得到，检索结果是与棉桃阿舒氏囊霉基因ABR009W(NP_982955，位于II号染色体上408463-409704bp)显著匹配，分值为531字节(bit)(氨基酸位置相同性和相似性分别是64％和79％)。棉桃阿舒氏囊霉LAG1序列通过使用被功能性鉴定的称为LAF1的酿酒酵母神经酰胺合酶成份(Schorling et al.，2001；NCBI编号NC_001140.5)作为模板针对AshbyaGenomeDatabase(http://ashbya.genome.duke.edu/blast.html/)进行BLASTP检索得到，检索结果是与棉桃阿舒氏囊霉基因ADL206W(GenBank编号#AAS51714，位于IV号染色体上340556-341674bp)显著匹配，分值为117字节(bit)(氨基酸位置相同性和相似性分别是32％和48％)。合成如下寡核苷酸以扩增LAG1编码序列：

AgLAC1-fw：

ATG GCT GAA AAT TCG TTA TTG AAG C(SEQ ID NO：11中的核苷酸1-25)

AgLAC1-PacI-rv：

TAT ATATTA ATT AAG ACC TGT ATA TAT TCT AGT AGT G(SEQID NO：11中的核苷酸1388-1410；包含PacI识别位点)

所述寡核苷酸用于进行菌落PCR反应，其中使用Phusion^TM HighFidelity PCRMaster Mix和棉桃阿舒氏囊霉ATCC19895细胞作为模板。通过进行此方法可以得到一个1241bp片段。所述片段使用MinElute GelExtraction Kit进行纯化。进行交叉PCR以将棉桃阿舒氏囊霉烯醇化酶编码基因前面的启动子如前述融合至LAG1编码序列。所述棉桃阿舒氏囊霉烯醇化酶编码基因的启动子序列通过使用被功能性鉴定的命名为ENO1和ENO2的酿酒酵母烯醇化酶同工酶(McAlister et al.，1982；NCBI编号NC_001139.7和NC_001140.5)作为模板针对Ashbya Genome Database(http://ashbya.genome.duke.edu/blast.html/)进行BLASTP检索得到，检索结果是与棉桃阿舒氏囊霉基因AER294C(GenBank编号#AAS52975，位于V号染色体上1176724-1178037bp)显著匹配，对于酿酒酵母ENO1分值为734字节(bit)(氨基酸位置相同性和相似性分别是83％和91％)，对于酿酒酵母ENO2分值为709字节(bit)(氨基酸位置相同性和相似性分别是80％和87％)。选择在ENO1起始密码子上游大约455bp的区域并使用如下寡核苷酸进行扩增：

P-ENO-PacI-fw：

TAT ATATTA ATT AAC TGT TCA CAG CCT TCT GAG AC(SEQ IDNO：25中的核苷酸1-21；包含PacI识别位点)

P-ENO-CO-LAG1-rv：

CCT GAC TTG GCC CGA CAT TTT GAA TTA TTT GAG TTT CGG

AGG TGT TAA TC(SEQ ID NO：25中的核苷酸436-467和SEQ IDNO：13中的核苷酸1-18)

所述寡核苷酸用于进行菌落PCR反应，其中使用Phusion^TM HighFidelity PCRMaster Mix和棉桃阿舒氏囊霉ATCC19895细胞作为模板。通过进行此方法可以得到一个475bp片段。所述片段使用MinElute GelExtraction Kit进行纯化。使用寡核苷酸P-ENO-PacI-fw和AgLAC1-PacI-rv以及1μl前述扩增并纯化的棉桃阿舒氏囊霉烯醇化酶编码基因的启动子和棉桃阿舒氏囊霉LAG1编码序列的PCR产物进行交叉PCR，其中使用Phusion^TMHigh Fidelity PCR Master Mix。通过进行此方法可以得到一个1716bp片段。所述片段使用MinElute Gel Extraction Kit进行纯化。之后用PacI(New England Biolabs，cat.#R0547S)消化2小时，与PacI切割并去磷酸化的(New England Biolabs，小牛肠碱性磷酸酶，cat.# M0290S)载体pAG32-hyg-PAgGAP-AgDES1如生产商的方案中所述进行连接，产生图3所示的质粒pAG-LAG1-1(8077bp)。这个质粒在转化进棉桃阿舒氏囊霉之后适于同时过表达棉桃阿舒氏囊霉DES1和LAG1。所克隆的棉桃阿舒氏囊霉烯醇化酶编码基因的启动子和棉桃阿舒氏囊霉LAG1编码序列的真实性通过由Sequiserve(Vaterstetten，GERMANY)进行的DNA测序进行确认。接下来合成如下寡核苷酸以扩增LAF1编码序列：

AgLAG1-fw：

ATG TCG GGC CAA GTC AGG C(SEQ ID NO：13中的核苷酸1-20)

AgLAG1-PacI-rv：

TAT ATATTA ATT AAC TGC ATG CGC TGT CTG GCG(SEQ IDNO：13中的核苷酸1291-1309；包含PacI识别位点)

所述寡核苷酸用于进行菌落PCR反应，其中使用Phusion^TM HighFidelity PCRMaster Mix和棉桃阿舒氏囊霉ATCC19895细胞作为模板。通过进行此方法可以得到一个1118bp片段。所述片段使用MinElute GelExtraction Kit进行纯化。进行交叉PCR以将棉桃阿舒氏囊霉烯醇化酶编码基因的启动子如上所述融合至LAF1编码序列。使用寡核苷酸P-ENO-PacI-fw和AgLAG1-PacI-rv以及1μl前述扩增并纯化的棉桃阿舒氏囊霉烯醇化酶编码基因的启动子和棉桃阿舒氏囊霉LAF1编码序列的PCR产物进行交叉PCR，其中使用Phusion^TMHigh Fidelity PCR Master Mix。通过进行此方法可以得到一个1593bp片段。所述片段使用MinElute GelExtraction Kit进行纯化。之后用PacI消化2小时，并与PacI切割并去磷酸化的如上所述的载体pAG32-hyg-PAgGAP-AgDES1进行连接，产生图4所示的质粒pAG-LAF1-1(7976bp)。这个质粒在转化进棉桃阿舒氏囊霉之后适于同时过表达棉桃阿舒氏囊霉DES1和LAF1。所克隆的棉桃阿舒氏囊霉烯醇化酶编码基因的启动子和棉桃阿舒氏囊霉LAF1编码序列的真实性通过由Sequiserve(Vaterstetten，GERMANY)进行的DNA测序进行确认。

棉桃阿舒氏囊霉ATCC19895的转化通过电穿孔方法进行。为了预防在液体培养基中培养时真菌菌丝体凝结成块，将其如下进行均质化：取一满环在琼脂平板(1g/l酵母提取物，10g/l蛋白胨，10g/l葡萄糖，0.3g/l肌醇和20g/l琼脂)上在30℃生长24h的菌丝体，在15ml反应管中重悬于2ml无菌水中。加入直径为3mm的无菌玻璃珠至充满凸出部分。将所述溶液在微型振荡器(IKA，Staufen，GERMANY)上全速振荡2min。用注射器移出均质化的菌丝体悬液并转移至具有隔板的含有70ml液体复合培养基(1g/l酵母提取物，10g/l蛋白胨，10g/l葡萄糖和0.3g/l肌醇)的250ml摇瓶中。以每分钟250转在30℃生长过夜，并通过真空过滤(Schleicher & Schuell VacufloPV 050/2真空过滤单位)收获，用含有25mM二硫苏糖醇(DTT)的50mM磷酸盐缓冲液漂洗，在相同溶液中在28℃温育30min，并再次通过真空过滤收集。细胞接下来用含有270mM蔗糖和1mM MgCl₂的10mM Tris-HCl(pH7.5)漂洗，重悬于1ml相同溶液中并分为200μl小份。根据生产商的说明用HpaI(New England Biolabs，cat.#R0105S)将转化质粒DNApUG6-AgSUR2::kanMX、pAG-LAG1-1或pAG-LAF1-1线性化。DNA用标准苯酚:氯仿提取和乙醇沉淀方案进行纯化。将多至20μg的纯化的DNA加入到菌丝体悬液的200μl小份中，不超过体积的10％，装入预冷的2mm电穿孔杯中并用设置在1.5kV/cm，100Ω，和25μF的Gene Pulser(Bio-Rad，Munich，Germany)电击。在电穿孔之后，用移液器将菌丝体从电穿孔杯转移至如上述10ml液体复合培养基中，并在没有隔板的100ml摇瓶中以每分钟200转在30℃温育4-6h以进行细胞再生。为了施加选择压力，接下来向再生的细胞中加入10ml顶层琼脂(1g/l酵母提取物，10g/l蛋白胨，10g/l葡萄糖和0.3g/l肌醇，含有1％琼脂糖(w/v)加上750μg/ml遗传霉素G418和/或750μg/ml潮霉素B)，混和并铺至非选择性复合培养基琼脂平板(1g/l酵母提取物，10g/l蛋白胨，10g/l葡萄糖，0.3g/l肌醇和20g/l琼脂)上。在30℃温育2-3天后获得转化子。通过选择遗传霉素和/或潮霉素抗性孢子进行棉桃阿舒氏囊霉转化子的菌落纯化。为此，将转化子在孢子形成平板(10g/l酵母提取物，10g/l葡萄糖和20g/l琼脂)上划线并在30℃温育5天。接下来，将一满环真菌菌丝体重悬于含有10mg/ml得自哈茨木霉(Trichodermaharzianum)(Sigma-Aldrich，Taufkirchen，Germany)的裂解酶的1ml 0.9％(w/v)NaCl中并在室温温育1h。通过离心(30s，13.200rpm)沉降的释放的孢子和细胞碎片用1ml 0.9％(w/v)NaCl溶液漂洗并最后用等体积石蜡提取以通过在混和型研磨仪(Retsch，Hahn，Germany)中在30Hz振荡30s使两相彻底混和而富集孢子。不同相通过离心(30s，800rpm)分离。将0.9％(w/v)NaCl中的石蜡相的系列稀释物铺板至选择培养基800 30(1g/l酵母提取物，10g/l蛋白胨，10g/l葡萄糖，0.3g/l肌醇和20g/l琼脂，含有750μg/ml遗传霉素和/或750μg/ml潮霉素)上并在30℃温育2-3天。选择并培养出现的菌落以如实施例3所述通过反相HPLC量化并鉴定鞘氨醇类碱。

实施例2

同时过表达棉桃阿舒氏囊霉的酶Laf1p和Des1p的棉桃阿舒氏囊霉SYR28DES双突变株的构建

质粒pSSTH-LAF1-2被设计为用kanMX抗性基因取代棉桃阿舒氏囊霉SYR2基因，从而使棉桃阿舒氏囊霉SYR2基因失活并同时过表达棉桃阿舒氏囊霉DES1和LAF1基因。如实施例1中所述获得棉桃阿舒氏囊霉SYR2、DES1和LAF1编码序列以及棉桃阿舒氏囊霉烯醇化酶编码基因的启动子序列。由MWG Biotech(Ebersberg，Germany)合成如下寡核苷酸以从棉桃阿舒氏囊霉ATCC19895细胞扩增DES1的编码序列：

AgDES1-DS-fw：

ATG AAC CAA CGG GGT ATA GCG AC(SEQ ID NO：22中的核苷酸905-927)

AgDES1-rv-SalI：

TAT ATAGTC GAC GAG TTT TGA CTC CTT CTG TCT C(SEQ IDNO：22中的核苷酸2246-2267；包含SalI识别位点)

所述寡核苷酸用于进行菌落PCR反应，其中使用棉桃阿舒氏囊霉ATCC19895细胞作为模板并根据Innis et al.，(PCR protocols.A guide tomethods and applications，1990，Academic Press)使用Phusion^TM High FidelityPCR Master Mix(Finnzymes，cat.#F-531L)根据生产商的说明进行。通过进行此方法可以得到一个1372bp片段。所述片段使用MinElute Gel ExtractionKit(QIAGEN，cat.#28606)根据生产商的说明进行纯化。合成如下寡核苷酸以扩增棉桃阿舒氏囊霉烯醇化酶编码基因的启动子：

AgPENO-fw-XbaI：

TAT ATATCT AGA CTG TTC ACA GCC TTC TGA GAC(SEQ IDNO：25中的核苷酸1-21；包含XbaI识别位点)

AgPENO-OEPCR-rv：

GTC GCT ATA CCC CGT TGG TTC ATT TTG AAT TAT TTG AGT

TTC GGA GGT GTT AAT C(SEQ ID NO：25中的核苷酸436-467和SEQ ID NO：22中的核苷酸905-927)

所述寡核苷酸用于进行菌落PCR反应，其中使用Phusion^TM HighFidelity PCRMaster Mix和棉桃阿舒氏囊霉ATCC19895细胞作为模板。通过进行此方法可以得到一个496bp片段。所述片段使用MinElute GelExtraction Kit进行纯化。使用寡核苷酸AgPENO-fw-XbaI和AgDES1-rv-SalI以及1μl前述扩增并纯化的棉桃阿舒氏囊霉烯醇化酶编码基因的启动子和棉桃阿舒氏囊霉DES1编码序列的PCR产物进行交叉PCR，其中使用Phusion^TMHigh Fidelity PCR Master Mix。通过进行此方法可以得到一个1846bp片段。所述片段使用MinElute Gel Extraction Kit进行纯化。之后用SalI(New England Biolabs，cat.#R0138S)和XbaI(New England Biolabs，cat.#R0145S)消化2小时，并与SalI和XbaI切割的载体pUG6-AgSUR2::kanMX(参见实施例1)如生产商的方案所描述的进行连接。使用2.5μl连接产物根据生产商的说明化学转化感受态大肠杆菌(Invitrogen OneTOP10，cat.#C4040-03)。同样得到质粒pSSTH(7323bp)。所克隆的棉桃阿舒氏囊霉烯醇化酶编码基因和棉桃阿舒氏囊霉DES1编码序列的片段的DNA序列的真实性通过由Sequiserve(Vaterstetten，GERMANY)进行的DNA测序进行确认。接下来合成如下寡核苷酸以扩增棉桃阿舒氏囊霉LAF1编码序列：

AgLAG1-fw：

ATG TCG GGC CAA GTC AGG C(SEQ ID NO：13中的核苷酸1-19)

AgLAG1-PacI-rv：

所述寡核苷酸用于进行菌落PCR反应，其中使用Phusion^TM HighFidelity PCRMaster Mix并使用棉桃阿舒氏囊霉ATCC19895细胞作为模板。通过进行此方法可以得到一个1118bp片段。所述片段使用MinElute GelExtraction Kit进行纯化。合成如下寡核苷酸以扩增棉桃阿舒氏囊霉烯醇化酶编码基因的启动子：

P-ENO-PacI-fw：

P-ENO-CO-LAG1-rv：

CCT GAC TTG GCC CGA CAT TTT GAA TTA TTT GAG TTT CGG

所述寡核苷酸用于进行菌落PCR反应，其中使用Phusion^TM HighFidelity PCRMaster Mix并使用棉桃阿舒氏囊霉ATCC19895细胞作为模板。通过进行此方法可以得到一个475bp片段。所述片段使用MinElute GelExtraction Kit进行纯化。使用寡核苷酸P-ENO-PacI-fw和AgLAG1-PacI-rv以及1μl前述扩增并纯化的棉桃阿舒氏囊霉烯醇化酶编码基因的启动子和棉桃阿舒氏囊霉LAF1编码序列的PCR产物进行交叉PCR，其中使用Phusion^TMHigh Fidelity PCR Master Mix。通过进行此方法可以得到一个1593bp片段。所述片段使用MinElute Gel Extraction Kit进行纯化。之后用PacI(New England Biolabs，cat.#R0547S)消化2小时，并与PacI切割并去磷酸化(New England Biolabs，小牛肠碱性磷酸酶，cat.#M0290S)的载体pSSTH如前面所描述的进行连接，产生图5所示的质粒pSSTH-LAF1-2(9117bp)。这个质粒在转化进棉桃阿舒氏囊霉之后适于用kanMX取代棉桃阿舒氏囊霉SYR2，从而使其失活，并同时过表达棉桃阿舒氏囊霉DES1和LAF1。所克隆的棉桃阿舒氏囊霉烯醇化酶编码基因和棉桃阿舒氏囊霉LAF1编码序列的真实性通过由Sequiserve(Vaterstetten，GERMANY)进行的DNA测序进行确认。

质粒pAG32-D8D被设计为破坏棉桃阿舒氏囊霉8DES基因。8DES编码序列通过使用被功能性鉴定的乳酸克鲁维酵母的Δ(8)-鞘脂去饱和酶(Takakuwa et al.，2002；EMBL编号AB085690)作为模板针对Ashbya GenomeDatabase(http://ashbya.genome.duke.edu/blast.html/)进行BLASTP检索得到，检索结果是与棉桃阿舒氏囊霉基因AFL079W(GenBank编号#AAS53293，位于VI号染色体上290134-291750bp)显著匹配，分值为616字节(bit)(氨基酸位置相同性和相似性分别是56％和69％)。合成如下寡核苷酸以扩增8DES编码序列的一个内部区域：

AgD8D-HindIII-fw：

TAT ATA AAG CTT GCG CTG GAA GAT TGG GCA TGT G(SEQ IDNO：20中的核苷酸204-225；包含HindIII识别位点)

AgD8D-BamHI-rv：

TAT ATA GGA TCC GAG TCC AGC TTA ACA CGT AGA G(SEQ IDNO：20中的核苷酸1000-1021；包含BamHI识别位点)

所述寡核苷酸用于进行菌落PCR反应，其中使用Phusion^TM HighFidelity PCRMaster Mix并使用棉桃阿舒氏囊霉ATCC19895细胞作为模板。通过进行此方法可以得到一个824bp片段。所述片段使用MinElute GelExtraction Kit进行纯化。之后用BamHI(NewEngland Biolabs，cat.#R0136S)和HindIII(New England Biolabs，cat.#R0104S)消化2小时，并与BamHI和HindIII切割的如前所述的载体pAG32(EUROSCARF，Oberursel，GERMANY)连接，产生图6所示的质粒pAG32-D8D(4960bp)。这个质粒在转化进棉桃阿舒氏囊霉之后适于破坏棉桃阿舒氏囊霉8DES基因。所克隆的内部棉桃阿舒氏囊霉8DES序列的真实性通过由Sequiserve(Vaterstetten，GERMANY)进行的DNA测序进行确认。

棉桃阿舒氏囊霉的转化如实施例1中所述进行。质粒pSSTH-LAF1-2用HpaI(NewEngland Biolabs，cat.#R0105S)线性化，质粒pAG32-D8D用MfeI(New England Biolabs，cat.#R0589S)线性化，并类似实施例1进行纯化。

实施例3

通过反相HPLC量化并鉴定棉桃阿舒氏囊霉菌株中的鞘氨醇类碱

对于HPLC分析，生长于含有合适的抗生素的YEPD平板上的棉桃阿舒氏囊霉突变株的菌丝体如实施例1所述进行均质化，接种于具有隔板的100ml三角瓶中的20ml YEPD培养基(蛋白胨2％(w/v)、酵母提取物1％(w/v)和葡萄糖2％(w/v))中并在30℃以250rpm生长3天。在此时细胞处于稳定期。将1ml菌丝体悬液转移至1.5ml反应管中，13200rpm离心1min并用移液管移出液体培养基。用1M HCl将样品填充至1.5ml并在80℃温育16h。将样品短暂混匀并将500μl悬液转移至新的1.5ml反应管中。加入1ml氯仿∶甲醇(2∶1)(v/v)并通过在混和型研磨仪(Retsch，Hahn，Germany)中在30Hz振荡30min提取脂类。样品在13200rpm离心5min并将500μl下层氯仿相转移至新的1.5ml反应管中。通过在60℃真空离心(ChristVakuumzentrifuge，Christ AG，Osterode)20min使溶剂蒸发，将沉淀重悬于适当体积的2-丙醇∶H₂O(1∶1)(v/v)中并在超声水浴中在40℃溶解10min。

为了确定菌丝体干重，从液体培养物中取出样品并通过滤纸过滤，如实施例1所述。收集的菌丝体在110℃干燥过夜并称重。

鞘氨醇类碱浓度使用反相高压液相色谱(RP-HPLC)确定。在C18植物鞘氨醇、C18二氢鞘氨醇和C18鞘氨醇的情况中，通过与可商购的参考物质进行校准而进行量化。在C18二氢鞘氨二烯醇(sphingadiene)的情况中，无可商购的参考物质。因此，C18二氢鞘氨二烯醇(sphingadiene)的浓度使用C18鞘氨醇作为校准物确定。

RP-HPLC详细情况：

仪器 Jasco；泵PU-2080，自动进样器AS-2055，荧光检测器FP-2020

柱 Kromasil C18，250mm×4.6mm

RP-HPLC条件：

流速 2.00ml/min

样品体积 10μl

上柱前衍生化 2min，用等体积邻苯二甲醛(o-phtaldialdehyde，OPA)

注射体积 10μl

柱温 40℃

塔板温度环境温度

流动相甲醇∶水(92∶8)(w/v)

运行时间 8min

检测方法荧光

激发波长 340nm

发射波长 455nm

保留时间：

C18植物鞘氨醇 4.00min

C18氢鞘氨二烯醇(sphingadiene) 4.40min

C18鞘氨醇 5.50min

C18氢鞘氨醇 7.00min

这些分析的结果示于图19。对比于棉桃阿舒氏囊霉野生型菌株仅产生可忽略的量的鞘氨醇，所有过表达DES1并缺乏功能性SYR2基因的菌株都产生0.5mg鞘氨醇每克细胞干重。另外单独过表达LAF1或与插入失活8DES组合过表达LAF1使得不需要的副产物二氢鞘氨醇和二氢鞘氨二烯醇(sphingadienine)的形成急剧降低。

实施例4

从Pichia ciferrii F-60-10A NRRL 1031中分离基因组DNA

Pichia ciferrii F-60-10ANRRL 1031在250ml三角瓶中的50ml YEPD培养基(蛋白胨2％(w/v)、酵母提取物1％(w/v)和葡萄糖2％(w/v))中在30℃以200rpm生长并在18h后在OD₆₀₀为1.5时收集。用DNAPurification Kit for Yeast and Gram-positive bacteria(Gentra Systems Inc.，cat.#D-6000A)根据生产商的说明分离染色体DNA。对分离的DNA用琼脂糖凝胶电泳进行定性检测显示了其高分子量(＞16kbp)。

实施例5

Pichia ciferrii LAG1基因的克隆和核苷酸序列的确定

扩增Pichia ciferrii LAG1基因的内部一部分

首先，通过用棉桃阿舒氏囊霉Lag1p(GenBank acc.#NP_982955)作为模板进行TBLASTN检索，从完全的和未完成的真核基因组的NCBI数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom_table.cgi)中提取酵母菌亚门物种中推断的神经酰胺合酶的氨基酸序列。这个蛋白质与已鉴定的酿酒酵母Lac1p和Lag1p蛋白非常相似(氨基酸位置相同性分别是65％和69％)(Schorling et al.，2001；Guillas et al.，2003)，因此很可能具有神经酰胺合酶活性。所提取的序列(全部条目E-值＜2×10^-123)使用ClustalW程序(www.ebi.ac.uk/clustalw)进行排列对比。用于扩增Pichia ciferrii LAG1基因的内部一部分的合适的寡核苷酸通过反翻译Lag1p序列内部的氨基酸高度保守片段产生(考虑Pichiaciferrii密码子使用的高度偏性)。之后由MWG Biotech(Ebersberg，Germany)合成如下寡核苷酸：

LAC1-deg-fw：

TTY GTY GGT TTY TAY GCW ATH TTY TTY ACW TTY TTR

MGW GAA TT(SEQ ID NO：1中的核苷酸1636-1679)

LAC1-deg-rv：

GGT TGW SWD ATC CAA CAT TTR TAT TGT TGW GT(SEQ IDNO：1中的核苷酸2297-2266)

这些寡核苷酸用于根据Innis et al.，(PCR protocols.A guide to methodsandapplications，1990，Academic Press)进行菌落PCR反应，其中根据生产商的说明使用Phusion^TM High Fidelity PCR Master Mix(Finnzymes，cat.#F-531L)。通过进行此方法可以得到一个662bp片段。所述片段使用QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen，cat.#28706)根据生产商的说明进行纯化。

确定Pichia ciferrii LAG1基因的内部一部分的DNA序列

用Sanger et al.(Proceedings of the Naional Academy of Sciences，U.S.A.，74：5463-5467)开发的双脱氧链终止法确定纯化的PCR产物的DNA序列。使用用于PCR扩增的引物作为测序引物。DNA测序由Sequiserve(Vaterstetten，Germany)进行。得到的序列信息(662bp，相应于SEQ ID NO：1中的核苷酸1636-2297；图7A)使用Clone Manager7软件(Scientific&Educational Software)翻译为蛋白质，并将得到的氨基酸序列用作模板对NCBI非冗余蛋白质数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)进行BLASTP检索。所述检索鉴别出了一个与酿酒酵母Lac1p(一个神经酰胺去饱和酶亚基)高度相似的乳酸克鲁维酵母蛋白(NCBI acc.#XP 452132)，这是在所述数据库中与所述新序列最为相似的蛋白质，确认了事实上扩增了Pichia ciferriiLAG1直系同源物的几部分。

扩增完整Pichia ciferrii LAG1基因并确定其DNA序列

为了确定完整Pichia ciferrii LAG1基因(编码序列、启动子区和3′-非翻译区)的DNA序列，之后进行反向PCR。得自Pichia ciferrii F-60-10A NRRL1031的染色体DNA(300ng)(如实施例4中所述分离的)用VspI(MBIFermentas，cat.#ER0911)根据生产商的说明消化过夜，总体积为50μl。消化的DNA用QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen，cat.#28106)根据生产商的说明进行纯化。洗脱出的DNA(50μl)用T4DNA Ligase(NewEnglandBiolabs，cat.#M0202L)根据生产商的说明进行过夜连接，总体积为200μl，使用800U的T4DNA Ligase。连接的DNA用QIAquick PCR Purification Kit根据生产商的说明进行纯化。2.5μl洗脱液作为模板用于根据Innis et al.，(PCR protocols.A guide tomethods and applications，1990，Academic Press)进行的反向PCR反应。为此，应用靶向Pichia ciferrii LAG1基因已知部分的两个寡核苷酸：

PcLAC1-us-fw：

CCT TCT AAA ATC AAG AGA TTT ATG GAA CAA TC(SEQ ID NO：1中的核苷酸1732-1763)

PcLAC1-us-rv：

CCA ACA ATT GGT GCA AGG GGA C(SEQ ID NO：1中的核苷酸1721-1700)

扩增使用Phusion^TM High Fidelity PCR Master Mix根据生产商的说明进行。用此方法可获得2.2kbp PCR产物。所述片段使用Min Elute PCRPurification Kit(Qiagen，cat.#28006)根据生产商的说明进行纯化。这个片段的DNA序列如前述确定，其中使用寡核苷酸PcLAC1-us-fw、PcLAC1-us-rv、

PcLAC1-us-rv2：

TTA GAC AGA AGC TCA ACA GG(SEQ ID NO：1中的核苷酸1032-1013)、

-PcLAClintfw：

TTC AGC TGG TTA TTT GTC TC(SEQ ID NO：1中的核苷酸1240-1259)和

-PcLAClintrv：

TAA CCC AGA ATC AAG GTC(SEQ ID NO：1中的核苷酸94-77)

作为测序引物。新获得的序列信息包括SEQ ID NO：1中的核苷酸1-1635。无法获得所述DNA序列的下游新序列信息，因为3’VspI位点位于紧邻这一部分的下游(图7A)。为了获得Pichia ciferrii LAG1基因编码区的3′-末端及其3′-非翻译区的DNA序列，需要进行另一轮反向PCR。因此，重复上述实验方案，不同的是用HindIII(New England Biolabs，cat.#R0104S)消化Pichia ciferrii染色体DNA和在反向PCR期间使用如下寡核苷酸(由MWGBiotech(Ebersberg，Germany)合成)：

PcLAC1-ds-fw：

GGG AGA TTT TAA ATT AAA TTT TGC AAC TCA AC(SEQ ID NO：1中的核苷酸2241-2272)

PcLAC1-ds-rv：

CTG TTC TAA ATT CTG TTA AAA CTG ACC(SEQ ID NO：1中的核苷酸2239-2213)

用此方法可获得4.5kbp PCR产物。所述片段使用Min Elute PCRPurificationKit根据生产商的说明进行纯化。这个片段的DNA序列如前述确定，其中使用寡核苷酸PcLAC1-ds-fw；PcLAC1-ds-rv；

-PcLAC1dsfw2：

AAA TCA GGT TTA ACA ATG GC (SEQ ID NO：1中的核苷酸3152-3171)

-PcLAC1dsfw3：

AGT TGA TAA ATG ACG AAT GG(SEQ ID NO：1中的核苷酸4060-4079)和

-PcLAC1dsrv2：

GAA CGT ACT CTT GTA TCA CCC(SEQ ID NO：1中的核苷酸1343-1323)

作为测序引物。可以获得2655bp的新序列信息(SEQ ID NO：1中的核苷酸2298-4952)，所述序列延伸至3’VspI位点下游的下一个HindIII限制位点(图7B)。使用所描述的三步方法，可以分离总长为4952bp的Pichia ciferriiLAG1基因座，并且可以确定其DNA序列(参见SEQ ID NO：1和图7)。

如图7C所示的Pichia ciferrii LAG1基因座编码长度为429个氨基酸的Pichiaciferrii Lag1p蛋白(SEQ ID NO：2)。Pichia ciferrii Lag1p分别与从乳酸克鲁维酵母(GenBank acc.#XP_452132)和酿酒酵母(GenBank acc.#NC_001143)推断的神经酰胺合酶具有64％(80％)和62％(75％)的氨基酸位置相同性(相似性)。来自酿酒酵母的Lac1p蛋白已经被生化鉴定并示出显示体内神经酰胺合酶活性(Schorling et al.，MolecularBiology of the Cell，12：3417-3427)。

实施例6

Pichia ciferrii LAF1基因的克隆和核苷酸序列的确定

扩增Pichia ciferrii SSN8基因的内部一部分

由于用衍生自酵母菌亚门的Laf1p蛋白的多序列排列对比的简并寡核苷酸扩增Pichia ciferrii LAF1基因(基因名称的选择类似于编码酿酒酵母中两个神经酰胺酶合酶亚基的基因名称LAC1和LAG1。它们源自在全部其他酵母(包括Pichia ciferrii)中也存在的LAG1基因的重复(duplication)。其他酵母(包括Pichia ciferrii)中的第二个神经酰胺酶合酶亚基是LAC1和LAG1的旁系同源物，而不是直系同源物，明显在酿酒酵母中不存在。因此，选择命名为LAF1。)的内部一部分失败了，因此我们利用了这样一个事实：在多数酵母菌亚门物种中，编码细胞周期蛋白C的SSN8基因位于LAF1基因的上游。首先，通过用棉桃阿舒氏囊霉Ssn8p(GenBank acc.#AAS51713)作为模板进行TBLASTN检索，从完全的和未完成的真核基因组的NCBI数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom_table.cgi)中提取酵母菌亚门物种的细胞周期蛋白C的氨基酸序列。所提取的序列(全部条目E-值＜2×10^-52)使用ClustalW程序(www.ebi.ac.uk/clustalw)进行排列对比。用于扩增Pichiaciferrii SSN8基因的内部一部分的合适的寡核苷酸通过反翻译Ssn8p序列内部的氨基酸高度保守片段产生。之后由MWG Biotech(Ebersberg，Germany)合成如下寡核苷酸：

PcSSN8-deg-fw3：

GAA GAA TGT CCW CAA CAT ATH MGW(SEQ ID NO：3中的核苷酸1-24)

PcSSN8-deg-rv2：

YAA YAA CTG YAA ATC WGT DAT(SEQ ID NO：3中的核苷酸628-608)

这些寡核苷酸用于根据Innis et al.，(PCR protocols.A guide to methodsandapplications，1990，Academic Press)进行PCR反应，其中根据生产商说明使用Phusion^TMHigh Fidelity PCR Master Mix(Finnzymes，cat.#F-531L)。通过进行此方法可以得到一个393bp片段。所述片段使用MinElute GelExtraction Kit(Qiagen，cat.#28606)根据生产商说明进行纯化。

确定Pichia ciferrii SSN8基因的内部一部分的DNA序列

用Sanger et al.(Proceedings ofthe National Academy of Sciences，U.S.A.，74：5463-5467)开发的双脱氧链终止法确定纯化的PCR产物的DNA序列。使用用于PCR扩增的引物作为测序引物。DNA测序由Sequiserve(Vaterstetten，Germany)进行。得到的序列信息(339bp，相应于SEQ ID NO：3中的核苷酸1-339；图8A)使用Clone Manager 7软件(Scientific&EducationalSoftware)翻译为蛋白质，并将得到的氨基酸序列用作模板对NCBI非冗余蛋白质数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)进行BLASTP检索。所述检索鉴别出了白假丝酵母Ssn8p(NCBI acc.#EAK97601)，这是在所述数据库中与所述新序列最为相似的蛋白质，确认了事实上扩增了Pichia ciferrii SSN8直系同源物的几部分。

扩增Pichia ciferrii LAF1基因并确定其DNA序列

为了确定Pichia ciferrii LAF1基因(编码序列、启动子区和3′-非翻译区)的DNA序列(在保守组织情况中应当位于SSN8基因下游)，之后进行反向PCR。得自Pichiaciferrii F-60-10A NRRL 1031的染色体DNA(300ng)(如实施例4中所述分离的)用HaeIII(New England Biolabs，cat.#R0108S)根据生产商的说明消化过夜，总体积为50μl。消化的DNA用QIAquick PCRPurification Kit(Qiagen，cat.#28106)根据生产商的说明进行纯化。洗脱出的DNA(50μl)用T4DNA Ligase(New England Biolabs，cat.#M0202L)根据生产商的说明进行过夜连接，总体积为200μl，使用800U的T4DNALigase。连接的DNA用QIAquick PCRPurification Kit根据生产商的说明进行纯化。2.5μl洗脱液作为模板用于根据Innis etal.，(PCR protocols.A guide tomethods and applications，1990，Academic Press)进行的反向PCR反应。为此，应用靶向Pichia ciferrii SSN8基因已知部分的两个寡核苷酸：

PcSSN8-ds-fw：

GCT GGT CAA TTA TAA ATG ATA GTT ATG(SEQ ID NO：3中的核苷酸293-319)

PcSSN8-ds-rv：

GTT ATT GCT ATT ATT ATT ATG ATT ATG ACC(SEQ ID NO：3中的核苷酸240-211)

扩增使用Phusion^TM High Fidelity PCR Master Mix根据生产商的说明进行。用此方法可获得1.8kbp PCR产物。所述片段使用MinElute GelExtraktion Kit(Qiagen，cat.#28606)根据生产商的说明进行纯化。这个片段的DNA序列如前述确定，其中使用寡核苷酸PcSSN8-ds-fw和PcSSN8-ds-rv作为测序引物。新获得的序列信息包括SEQ ID NO：3中的核苷酸340-1800。无法完整扩增LAF1基因，因为3’HaeIII位点位于LAF1基因内部(图8A)。为了获得Pichia ciferrii LAF1基因编码区的3′-末端及其3′-非翻译区的DNA序列，需要进行另一轮反向PCR。因此，重复上述实验方案，不同的是用Mph1103I(MBI Fermentas，cat.#ER0731)消化Pichia ciferrii染色体DNA和在反向PCR期间使用如下寡核苷酸(由MWGBiotech(Ebersberg，Germany)合成)：

PcLAG1-ds-fw：

GTT GGA TCT TGG TTA TAT TAT CAT TCA TC(SEQ ID NO：3中的核苷酸1738-1766)

PcLAG1-ds-rv：

TGT TCC ATA AAT CTT TGT TTA TCC TTT TGT G(SEQ ID NO：3中的核苷酸1700-1670)

用此方法可获得2.5kbp PCR产物。所述片段使用Min Elute PCRPurificationKit根据生产商的说明进行纯化。这个片段的DNA序列如实施例5所述确定，其中使用寡核苷酸PcLAg1-ds-fw、PcLAg1-ds-rv和

-PcLAG1dsfw2：

TTA AAC CCA AAT AAA CCT GG(SEQ ID NO：3中的核苷酸2620-2639)

作为测序引物。可以获得2396bp的新序列信息(SEQ ID NO：3中的核苷酸1801-4195)，所述序列延伸至3’HaeIII位点下游的下一个Mph1103I限制位点(图8B)。使用所描述的三步方法，可以分离总长为4195bp的Pichia ciferriiLAF1基因座，并且可以确定其DNA序列(参见SEQ ID NO：3和图8)。

如图8C所示的Pichia ciferrii LAF1基因座编码长度为385个氨基酸的Pichiaciferrii Laf1p蛋白(SEQ ID NO：4)。Pichia ciferrii Laf1p分别与从乳酸克鲁维酵母(GenBank acc.#XP_452132)和棉桃阿舒氏囊霉(GenBank acc.#AAS51714)推断的神经酰胺合酶具有64％(80％)和65％(79％)的氨基酸位置相同性(相似性)。

实施例7

Pichia ciferrii YXC1基因的克隆和核苷酸序列的确定

扩增Pichia ciferrii YXC1基因的内部一部分

首先，通过用棉桃阿舒氏囊霉YXC1基因(GenBank acc.#NP_986865)作为模板进行TBLASTN检索，从完全的和未完成的真核基因组的NCB1数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom_table.cgi)中提取酵母菌亚门物种的推断的神经酰胺酶的氨基酸序列。这个蛋白质与已鉴定的酿酒酵母Ypc1p和Ydc1p神经酰胺酶非常相似(氨基酸位置相同性分别是43％和44％)(Maoet al.，2000a，b)，因此很可能具有神经酰胺合酶活性。所提取的序列(全部条目E-值＜1×10^-43)使用ClustalW程序(www.ebi.ac.uk/clustalw)进行排列对比。用于扩增Pichia ciferrii YXC1(基因名称的选择类似于编码酿酒酵母中两个神经酰胺酶的基因名称YPC1和YDC1，其中第二个字母表示相应酶的优选的底物植物神经酰胺和二氢神经酰胺。未知其他酵母物种(例如Pichiaciferrii)中的单一神经酰胺酶的底物偏好性，因此，选择命名为YXC1。)基因的内部一部分的合适的寡核苷酸通过反翻译Yxc1p序列内部的氨基酸高度保守片段产生(考虑Pichia ciferrii密码子使用的高度偏性)。之后由MWGBiotech(Ebersberg，Germany)合成如下寡核苷酸：

ACER-deg-fw：

ATY GAT TGG TGT GAA GAA AAY TAY GT(SEQ ID NO：7中的核苷酸995-1020)

ACER-deg-rv-L2：

ACC DGT YAA NAH ATG CCA CCA ACC ATG(SEQ ID NO：7中的核苷酸1633-1607)

这些寡核苷酸用于根据Innis et al.，(PCR protocols.A guide to methodsandapplications，1990，Academic Press)进行PCR反应，其中根据生产商说明使用Phusion^TMHigh Fidelity PCR Master Mix(Finnzymes，cat.#F-531L)。通过进行此方法可以得到一个639bp片段。所述片段使用QIAquick GelExtraktion Kit(Qiagen，cat.#28706)根据生产商说明进行纯化。

确定Pichia ciferrii YXC1基因的内部一部分的DNA序列

用Sanger et al.(Proceedings of the National Academy of Sciences，U.S.A.，74：5463-5467)开发的双脱氧链终止法确定纯化的PCR产物的DNA序列。使用用于PCR扩增的引物作为测序引物。DNA测序由Sequiserve(Vaterstetten，Germany)进行。得到的序列信息(639bp，相应于SEQ ID NO：7中的核苷酸995-1633；图9A)使用Clone Manager 7软件(Scientific &Educational Software)翻译为蛋白质，并将得到的氨基酸序列用作模板对NCBI非冗余蛋白质数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)进行BLASTP检索。所述检索鉴别出了汉逊德巴利酵母Yxc1p(NCBI acc.#XP_457637)，这是在所述数据库中与所述新序列最为相似的蛋白质，确认了事实上扩增了Pichia ciferrii YXC1直系同源物的几部分。

扩增完整Pichia ciferrii YXC1基因并确定其DNA序列

为了确定完整Pichia ciferrii YXC1基因(编码序列、启动子区和3′-非翻译区)的DNA序列，之后进行反向PCR。得自Pichia ciferrii F-60-10A NRRL1031的染色体DNA(300ng)(如实施例4中所述分离的)用DraI(MBIFermentas，cat.#ER0221)根据生产商的说明消化过夜，总体积为50μl。消化的DNA用QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen，cat.#28106)根据生产商的说明进行纯化。洗脱出的DNA(50μl)用T4DNA Ligase(NewEnglandBiolabs，cat.#M0202L)根据生产商的说明进行过夜连接，总体积为200μl，使用800U的T4DNA Ligase。连接的DNA用QIAquick PCR Purification Kit根据生产商的说明进行纯化。2.5μl洗脱液作为模板用于根据Innis et al.，(PCR protocols.A guide tomethods and applications，1990，Academic Press)进行的反向PCR反应。为此，应用靶向Pichia ciferrii YXC1基因已知部分的两个寡核苷酸：

YPC1-IPCR-1-fw：

GCT GGA TTT GCC ATG TTT TCT GC(SEQ ID NO：7中的核苷酸1082-1104)

YPC1-IPCR-1-rv：

GCT TCT GCA ATA TAT GGA GTC ACA AC(SEQ ID NO：7中的核苷酸1044-1020)

扩增使用Phusion^TM High Fidelity PCR Master Mix根据生产商的说明进行。用此方法可获得0.3kbp PCR产物。所述片段使用Min Elute PCRPurification Kit(Qiagen，cat.#28006)根据生产商的说明进行纯化。这个片段的DNA序列如前述确定，其中使用寡核苷酸YPC1-IPCR-1-fw和YPC1-IPCR-1-rv作为测序引物。新获得的序列信息包括SEQ ID NO：7中的核苷酸795-994。无法获得所述DNA序列的下游新序列信息，因为3’DraI位点位于紧邻这一部分的下游(图9A)。为了获得Pichia ciferrii YXC1基因编码区的3′-末端及其3′-非翻译区的DNA序列，需要进行另一轮反向PCR。因此，重复上述实验方案，不同的是用Sau3AI(New England Biolabs，cat.#R0169S)消化Pichia ciferrii染色体DNA和在反向PCR期间使用如下寡核苷酸(由MWG Biotech(Ebersberg，Germany)合成)：

PcYPC1-IP-3-fw：

CAT GGT TGG TGG CAT DTN TTY ACH GG(SEQ ID NO：7中的核苷酸1607-1632)

PcYPC1-IP-3-rv：

CCA GAA AGG AAA ATA CCA ATT CCT TTA ATC ATT G(SEQ IDNO：7中的核苷酸1512-1479)

用此方法可获得0.4kbp PCR产物。所述片段使用Min Elute PCRPurificationKit根据生产商的说明进行纯化。这个片段的DNA序列如前述确定，其中使用寡核苷酸PcYPC1-IP-3-fw和PcYPC1-IP-3-rv作为测序引物。可以获得153bp的新序列信息(SEQ IDNO：7中的核苷酸1634-1787)，所述序列延伸至3’DraI位点下游的下一个Sau3AI限制位点(图9B)。为了获得Pichia ciferrii YXC1上游区的进一步的信息，需要进行另一轮反向PCR。因此，重复上述实验方案，不同的是用BseMI(MBI Fermentas，cat.#ER1261)消化Pichia ciferrii染色体DNA和在反向PCR期间使用如下寡核苷酸(由MWG Biotech(Ebersberg，Germany)合成)：

PcYXC1-ds-fw：

GGG GAA ACA AGA TGA TTA TGA ATT G(SEQ ID NO：7中的核苷酸1687-1711)

PcYXC1-ds-rv：

CTA AAC CAG TTA AAA CAT GCC AC(SEQ ID NO：7中的核苷酸1637-1615)

用此方法可获得1.6kbp PCR产物。所述片段使用Min Elute PCRPurificationKit根据生产商的说明进行纯化。这个片段的DNA序列如前述确定，其中使用寡核苷酸PcYXC1-ds-fw和PcYXC1-ds-rv作为测序引物。可以获得684bp的新序列信息(SEQ ID NO：7中的核苷酸1788-2466)，所述序列延伸至3’Sau3AI位点下游的下一个BseMI限制位点(图9C)。为了获得Pichia ciferrii YXC1上游区的进一步的信息，需要进行另一轮反向PCR。因此，重复上述实验方案，不同的是用AvrII(New England Biolabs，cat.#R0174S)消化Pichia ciferrii染色体DNA和在反向PCR期间使用如下寡核苷酸(由MWG Biotech(Ebersberg，Germany)合成)：

PcYXC1-ds-fw2：

GGA GAG TTC ACG TAG TTT AGG AG(SEQ ID NO：7中的核苷酸2417-2439)

PcYXC1-ds-rv2：

GGA GTA TGA ATA CAT TGA TCC GAT AAT G(SEQ ID NO：7中的核苷酸2358-2331)

用此方法可获得大约5.5kbp PCR产物。所述片段使用PCR PurificationKit根据生产商的说明进行纯化。这个片段的DNA序列如前述确定，其中使用寡核苷酸PcYXC1-ds-fw2作为测序引物。可以获得937bp的新序列信息(SEQ ID NO：7中的核苷酸2467-3402)(图9D)。为了获得Pichia ciferriiYXC1下游区的进一步的信息，需要进行另一轮反向PCR。因此，重复上述实验方案，不同的是用PagI(MBI Fermentas，cat.#ER1281)消化Pichiaciferrii染色体DNA和在反向PCR期间使用如下寡核苷酸(由MWG Biotech(Ebersberg，Germany)合成)：

PcYXC1-us-fw：

GGA TAA TCA GTT TAC CAT CAA AAG(SEQ ID NO：7中的核苷酸831-854)

PcYXC1-us-rv：

TAT TGA TAA ACA ATT GAT ATT AGA TTA G(SEQ ID NO：7中的核苷酸830-803)

用此方法可获得大约4.0kbp PCR产物。所述片段使用Min ElutePCRPurification Kit根据生产商的说明进行纯化。这个片段的DNA序列如前述分为几个部分确定，其中使用寡核苷酸PcYXC1-us-rv作为测序引物。可以获得794bp的新序列信息(SEQID NO：7中的核苷酸1-794)(图9E)。

使用所描述的六步方法，可以分离总长为3402bp的Pichia ciferrii YXC1基因座，并且可以确定其DNA序列(参见SEQ ID NO：7和图9)。

如图9F所示的Pichia ciferrii YXC1基因座编码长度为284个氨基酸的Pichiaciferrii Yxc1p蛋白(SEQ ID NO：8)。Pichia ciferrii Yxc1p分别与从汉逊德巴利酵母(GenBank acc.#XP_457637)和酿酒酵母(GenBank acc.#NP_015238)推断的神经酰胺酶具有61％(75％)和46％(66％)的氨基酸位置相同性(相似性)。来自酿酒酵母的Ydc1p蛋白已经被生化鉴定并示出显示体内神经酰胺酶活性(Mao et al.，The Journal of BiologicalChemistry，275：31369-31378)。

实施例8

Pichia ciferrii鞘脂Δ8去饱和酶基因的克隆和核苷酸序列的确定

扩增Pichia ciferrii鞘脂Δ8去饱和酶基因的内部一部分

首先，通过用棉桃阿舒氏囊霉鞘脂Δ8去饱和酶基因(GenBank acc.#AAS53293)作为模板进行TBLASTN检索，从完全的和未完成的真核基因组的NCBI数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom_table.cgi)中提取酵母菌亚门物种的推断的鞘脂Δ8去饱和酶的氨基酸序列。这个蛋白质与已鉴定的乳酸克鲁维酵母鞘脂Δ8去饱和酶非常相似(氨基酸位置相同性分别是65％和59％)(Takakuwa et al.，2002)，因此很可能具有鞘脂Δ8去饱和酶活性。所提取的序列(全部条目E-值＜7×10^-121)使用ClustalW程序(www.ebi.ac.uk/clustalw)进行排列对比。用于扩增Pichia ciferrii鞘脂Δ8去饱和酶基因的内部一部分的合适的寡核苷酸通过反翻译鞘脂Δ8去饱和酶序列内部的氨基酸高度保守片段产生(考虑Pichia ciferrii密码子使用的高度偏性)。之后由MWG Biotech(Ebersberg，Germany)合成如下寡核苷酸：

D8DES-fw：

5’-GAT GCW ACH GAT GAA ATG MAY GCW TAY C-3’(SEQ IDNO：5中的核苷酸2439-2466)

D8DES-rv：

5’-TTG RAA TTG YAA ACC ACC RTG NAA RAA ATC YAA CC-3’(SEQ ID NO：5中的核苷酸3839-3805)

这些寡核苷酸用于根据Innis et al.，(PCR protocols.A guide to methodsandapplications，1990，Academic Press)进行PCR反应，其中根据生产商说明使用Phusion^TMHigh Fidelity PCR Master Mix(Finnzymes，cat.#F-531L)。通过进行此方法可以得到一个1401bp片段。所述片段使用QIAquick GelExtraktion Kit(Qiagen，cat.#28706)根据生产商说明进行纯化。

确定Pichia ciferrii 8DES基因的内部一部分的DNA序列

用Sanger et al.(Proceedings ofthe National Academy of Sciences，U.S.A.，74：5463-5467)开发的双脱氧链终止法确定纯化的PCR产物的DNA序列。使用用于PCR扩增的引物作为测序引物。DNA测序由Sequiserve(Vaterstetten，Germany)进行。得到的序列信息(1401bp，相应于SEQ ID NO：5中的核苷酸2439-3839；图10A)使用CloneManager 7软件(Scientific &Educational Software)翻译为蛋白质，并将得到的氨基酸序列用作模板对NCBI非冗余蛋白质数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)进行BLASTP检索。所述检索鉴别出了乳酸克鲁维酵母鞘脂Δ8去饱和酶(NCBI acc.#XP_454832)，这是在所述数据库中与所述新序列最为相似的蛋白质，确认了事实上扩增了编码鞘脂Δ8去饱和酶的Pichia ciferrii直系同源物的几部分。

扩增完整Pichia ciferrii鞘脂Δ8去饱和酶基因并确定其DNA序列

为了确定完整Pichia ciferrii鞘脂Δ8去饱和酶基因(编码序列、启动子区和3′-非翻译区)的DNA序列，之后进行反向PCR。得自Pichia ciferriiF-60-10A NRRL 1031的染色体DNA(300ng)(如实施例4中所述分离的)用HpyCH4V (New England Biolabs，cat.#R0620S)根据生产商的说明消化过夜，总体积为50μl。消化的DNA用QIAquick PCRPurification Kit(Qiagen，cat.#28106)根据生产商的说明进行纯化。洗脱出的DNA(50μl)用T4 DNA Ligase(New England Biolabs，cat.#M0202L)根据生产商的说明进行过夜连接，总体积为200μl，使用800U的T4DNALigase。连接的DNA用QIAquick PCRPurification Kit根据生产商的说明进行纯化。2.5μl洗脱液作为模板用于根据Innis et al.，(PCRprotocols.A guide to methods and applications，1990，Academic Press)进行的反向PCR反应。为此，应用靶向Pichia ciferrii鞘脂Δ8去饱和酶基因已知部分的两个寡核苷酸：

D8DES-IPCR-1-fw：

GGT GGG AAG TTC AGA ACT TTA GAA G(SEQ ID NO：5中的核苷酸2553-2577)

D8DES-IPCR-1-rv：

TTG AAT AGG CGG CAC AAA ATT GAT CC(SEQ ID NO：5中的核苷酸2552-2527)

扩增使用Phusion^TM High Fidelity PCR Master Mix根据生产商的说明进行。用此方法可获得0.6kbp PCR产物。所述片段使用Min Elute PCRPurification Kit(Qiagen，cat.#28006)根据生产商的说明进行纯化。这个片段的DNA序列如前述确定，其中使用寡核苷酸D8DES-IPCR-1-fw和D8DES-IPCR-1-rv作为测序引物。新获得的序列信息包括SEQ IDNO：5中的核苷酸2142-2438。为了获得编码Pichia ciferrii鞘脂Δ8去饱和酶的基因的上游区进一步的信息，需要进行另一轮反向PCR。因此，重复上述实验方案，不同的是用VspI(MBI Fermentas，cat.#ER0911)消化Pichia ciferrii染色体DNA和在反向PCR期间使用如下寡核苷酸(由MWG Biotech(Ebersberg，Germany)合成)：

PcD8DIPCR-US-fw：

GGG TCC TGT TGA AAA AAG CTA GG(SEQ ID NO：5中的核苷酸2229-2251)

PcD8DIPCR-US-rv：

CCA ACT GCT GGT TCA CCA AAA TAG(SEQ ID NO：5中的核苷酸2211-2188)

用此方法可获得大约3.4kbp PCR产物。所述片段使用Min ElutePCRPurification Kit根据生产商的说明进行纯化。这个片段的DNA序列如前述确定，其中使用寡核苷酸PcD8DIPCR-US-fw、PcD8DIPCR-US-rv、

-PcD8D-us-fw2：

TTA AAT GGT ATT TCC TTA GTG C(SEQ ID NO：5中的核苷酸3109-3130)和

-PcD8D-us-rv2：

GAT TCA TCT TCC ATT ATC ATC TC (SEQ ID NO：5中的核苷酸1343-1321)

作为测序引物。可以获得2141bp的新序列信息(SEQ ID NO：5中的核苷酸1-2141)，所述序列延伸至3’VspI位点上游的下一个VspI限制位点(图10B)。无法获得所述DNA序列的下游新序列信息，因为3’VspI位点位于紧邻这一部分的下游(图10B)。为了获得编码Pichiaciferrii鞘脂Δ8去饱和酶的基因编码区的3′-末端及其3′-非翻译区的DNA序列的进一步信息，需要进行另一轮反向PCR。因此，重复上述实验方案，不同的是用PagI(MBIFermentas，cat.#ER1281)消化Pichia ciferrii染色体DNA和在反向PCR期间使用如下寡核苷酸(由MWGBiotech(Ebersberg，Germany)合成)：

PcD8D-ds-fw：

AAA TAA GAA CAA CAA TGG AAT GTT G(SEQ ID NO：5中的核苷酸3769-3793)

PcD8D-ds-rv：

CTT TCT GAA GTT CCT AAA TCT G(SEQ ID NO：5中的核苷酸3754-3733)

用此方法可获得大约1.8kbp PCR产物。所述片段使用Min ElutePCRPurification Kit根据生产商的说明进行纯化。这个片段的DNA序列如前述确定，其中使用寡核苷酸PcD8D-ds-fw和PcD8D-ds-rv作为测序引物。可以获得1312bp的新序列信息(SEQ ID NO：5中的核苷酸3840-5106)，所述序列延伸至3’VspI位点下游的下一个PagI限制位点(图10C)。无法获得所述DNA序列的下游新序列信息，因为3’VspI位点位于紧邻这一部分的下游(图10B)。使用所描述的四步方法，可以分离总长为5106bp的Pichia ciferrii编码鞘脂Δ8去饱和酶的基因座，并且可以确定其DNA序列(参见SEQ IDNO：5和图10)。

如图10D所示的Pichia ciferrii基因座编码长度为597个氨基酸的Pichiaciferrii鞘脂Δ8去饱和酶Pc8Desp蛋白(SEQ ID NO：6)。Pc8Desp Pichiaciferrii鞘脂Δ8去饱和酶分别与从乳酸克鲁维酵母(GenBank acc.#XP_454832)和汉逊德巴利酵母(GenBank acc.#XP_461611)的鞘脂Δ8去饱和酶具有62％(74％)和57％(70％)的氨基酸位置相同性(相似性)。来自乳酸克鲁维酵母的鞘脂Δ8去饱和酶8Desp蛋白已经被生化鉴定并示出显示体内鞘脂Δ8-Delta(8)鞘脂去饱和酶活性(Takakuwa et al.，CurrentMicrobiology，45：459-461)。

实施例9

同时过量产生Pichia ciferrii的酶Lag1p、Laf1p和Des1p的Pichia ciferrii突变株的构建

为了构建过表达Pichia ciferrii的酶Lag1p、Laf1p和Des1p的丁香霉素E抗性突变株，我们首先构建了整合DES1表达载体。

为此目的，用Pichia ciferrii F-60-10A NRRL 1031的染色体DNA(200ng)(如实施例4中所述分离的)作为模板根据Innis et al.(PCR protocols.A guideto methodsand applications，1990，Academic Press)进行PCR以扩增P.ciferrii3-磷酸甘油醛脱氢酶(TDH1)的启动子区。为此应用如下寡核苷酸：

pGAP-BglII-for：

5′-TAT ATAAGA TCT GTG GTA CCT ACA TAC AAT TGA CCC-3′(在5′-末端包含BglII识别序列)

pGAP-NcoI-rev：

5′-TAT ATACCA TGG TTA ATT AAT TAT TTG TTT GTT TG-3′(在5′-末端包含NcoI识别序列)。

所述片段用QIAquick PCR Purification Kit根据生产商的说明进行纯化。之后用BglII和NcoI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New EnglandBiolabs，Schwalbach，Germany的说明)消化PCR产物得到一个575bp片段，将此片段连接进分别切割的pAG25(Goldstein et al.，Three new dominantgene disruption cassettes for genedisruption in Saccharomyces cerevisiae，1999，Yeast)，生成具有融合至nat1的P.ciferrii的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(TDH3)的启动子区的载体pTH-GAP-nat1(3892bp)。插入体的方向和真实性通过DNA测序进行确定。连接、化学感受态大肠杆菌细胞的制备和转化通过本领域技术人员已知的方法进行。

为了将基因间间隔区作为整合位点插入进载体中，将Pichia ciferrii核糖体RNA操纵子的5S-26S rDNA基因间间隔区(intergenic spacer，IS)通过PCR进行扩增，其中用Pichia ciferrii F-60-10A NRRL 1031的染色体DNA(200ng)作为模板并使用如下寡核苷酸：

pIS-NdeI-for：

5′-TAT ATACAT ATG CTA ATC ACA ACA GAA CAT TCT CTA ACG-3′(在5′-末端包含NdeI识别序列)

pIS-NdeI-rev：

5′-TAT ATACAT ATG GCT AGA TTG ACA GAA GTC GAT CAG-3′(在5′-末端包含NdeI识别序列)

所述片段用QIAquick PCR Purification Kit根据生产商的说明进行纯化。之后用NdeI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)消化载体pTH-GAP-nat1和PCR产物，之后进行连接，生成载体pTH-GAP-nat1-IS2(4864bp)。插入体的方向和真实性通过DNA测序进行确定。连接、化学感受态大肠杆菌细胞的制备和转化通过本领域技术人员已知的方法进行。

为了插入单一PmeI识别位点以使载体pTH-GAP-nat1-IS2线性化，将整合进pTH-GAP-nat1-IS2的Pichia ciferrii核糖体RNA操纵子的5S-26SrDNA基因间间隔区(IS)的两个片段通过PCR进行扩增，其中用载体pTH-GAP-nat1-IS2作为模板。片段1用如下寡核苷酸扩增：

pIS-NdeI-rev：

PmeI-rv：

5′-CCC ATC CAC TAAGTT TAA ACA CCC ATA CAA AAT CGA GCTTCA AAT C-3′(在5′-末端包含与PmeI-fw-寡核苷酸互补的21bp序列和PmeI识别序列)

片段2用如下寡核苷酸扩增：

p-IS-NdeI-for：

PmeI-fw：

5′-TGT TTA AAC TTA GTG GAT GGG AAA CCC TGT AGA ACTGGG ACA AAC-3′

所述片段用QIAquick PCR Purification Kit根据生产商的说明进行纯化。最后，通过进行PCR获得片段1和2的融合体，其中用两个初级PCR产物(每个产物10ng)作为模板并使用寡核苷酸：

p-IS-NdeI-for：

pIS-NdeI-rev：

产生一个在两端都具有NdeI识别序列，并且在中间具有PmeI识别序列的978bp片段。

所述片段用QIAquick PCR Purification Kit根据生产商的说明进行纯化。用NdeI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)切割PCR产物和载体pTH-GAP-nat1-IS2。进行连接以产生载体pTH-GAP-nat1-IS2-PmeI(4879bp)。插入体的方向和真实性通过DNA测序进行确定。连接、化学感受态大肠杆菌细胞的制备和转化通过本领域技术人员已知的方法进行。为了引入Pichia ciferrii丙酮酸脱氢酶A亚基基因(PDA1)的启动子区控制下的Pichia ciferrii DES1基因，用Pichiaciferrii F-60-10ANRRL 1031的染色体DNA(200ng)作为模板PCR扩增DES1基因，其中使用如下寡核苷酸：

DES1-fw：

5′-TAG AAG TTC CAG AAA CTA CTT TCC AAA CTT CAA AAT CAACTT TAT TAT CAATGG CTA CAA TTA CAC ATA GAA AAA ACCCTT CAC AAC-3′(在5′-末端包含与PDA1-rv寡核苷酸互补的50个碱基的序列)

DES1-rv：

5′-TAT ACT GCA GGC ATA TTG TCA ATT CTA TTG TAC TTG AGTATT AAT GAT TA-3′(在5′-末端包含PstI识别序列)

相应地扩增Pichia ciferrii丙酮酸脱氢酶A亚基基因(PDA1)的启动子区，其中使用如下寡核苷酸：

PDA1-fw：

5′-TAT ACT GCA GTG TGC TCT AAA TTT GCC CGG TTC GCGACG-3′(在5′-末端包含PstI识别序列)

PDA1-rv：

5′-TGA TAA TAA AGT TGA TTT TGA AGT TTG GAA AGT AGT TTCTGG AAC TTC TA-3′

所述片段用QIAquick PCR Purification Kit根据生产商的说明进行纯化。最后，通过进行PCR获得DES1基因和PDA1启动子区的融合体，其中使用包含Pichia ciferriiDES1基因和PDA1启动子区的两个PCR产物(每个产物10ng)和寡核苷酸：

PDA1-fw：

DES1-rv：

用此方法可获得2.2kbp PCR产物。所述片段用QIAquick PCRPurification Kit根据生产商的说明进行纯化。接下来用限制性核酸内切酶PstI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)消化PCR产物并连接进PstI切割的载体pTH-GAP-nat1-IS2-PmeI以产生载体pTH/DB-002a.1。插入体的方向和真实性通过DNA测序进行确定。连接、化学感受态大肠杆菌细胞的制备和转化通过本领域技术人员已知的方法进行。

为了用放线菌酮赋予的抗性盒取代诺尔丝菌素(nourseothricin)抗性盒，用SacI和SalI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)消化载体pTH/DB-002a.1。用QIAquick GelExtraction Kit根据生产商的说明凝胶纯化不含有诺尔丝菌素抗性盒的5667bp载体骨架。

为了产生放线菌酮赋予的抗性盒，通过PCR扩增两个片段，其中使用Pichiaciferrii F-60-10ANRRL 1031的基因组DNA作为模板：片段1用如下寡核苷酸扩增：

PcL41-SalI-fw：

5′-TAT AGT CGA CGA ATT CTC TTA AAT GAT GTT GG-3′(在5′-末端包含SalI识别序列)

PcL41-internal-rv：

5′-GTT TTA GCT TTT TTA TGG AAA ACT tGT TTG GTT TGA CCACCG TAA CCG G-3′(在5′-末端包含与PcL41-internal-fw-寡核苷酸互补的49bp序列，插入一个点突变(C变为A)以将L41p的aa 56从脯氨酸取代为谷氨酰胺以赋予放线菌酮抗性)

片段2用如下寡核苷酸扩增：

PcL41-internal-fw：

5′-CCG GTT ACG GTG GTC AAA CCA AAC aAG TTT TCC ATA AAAAAG CTA AAA CTACCA AAA AAG TTG TTT TAC G-3′

PcL41-SacI-rv：

5′-TAT AGA GCT CAA TTC CAA TGT TTT GAT CTG TC-3′(在5′-末端包含SalI识别序列)

所述片段用QIAquick PCR Purification Kit根据生产商的说明进行纯化。最后，通过进行PCR获得所述两个片段的融合体，两个PCR产物(每个产物10ng)和寡核苷酸：

PcL41-SalI-fw：

PcL41-SacI-rv：

5′-TAT AGA GCT CAA TTC CAA TGT TTT GAT CTG TC-3′(在5′-末端包含SacI识别序列)

所得到的1.9kbp片段使用QIAquick PCR Purification Kit根据生产商的说明进行纯化。接下来用限制性核酸内切酶SalI和SacI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)消化PCR产物并连接进载体pTH/DB-002a.1(见上述)的5667bp载体骨架以产生载体pDB007。插入体的方向和真实性通过DNA测序进行确定。连接、化学感受态大肠杆菌细胞的制备和转化通过本领域技术人员已知的方法进行。

为了引入Pichia ciferrii 3-磷酸甘油醛脱氢酶同工酶1(TDH1)的启动子区控制下的Pichia ciferrii LAF1基因，用Pichia ciferrii F-60-10ANRRL 1031的染色体DNA(200ng)作为模板PCR扩增LAF1基因，其中使用如下寡核苷酸：

PcLAG1-fw：

5′-CAA ACA AAC AAA CAA ATA ATT AAT TAA CAA TGA TTT CAACTT CAA CAA ATTCAT CAT C-3′(在5′-末端包含与PGAP-rv-寡核苷酸互补的29个碱基的序列)

PcLAG1-rv：

5′-CAG ACA AGT TTA ATA TAG ATA CTT AAA C-3′

相应地扩增Pichia ciferrii 3-磷酸甘油醛脱氢酶同工酶1基因(TDH1)的启动子区，其中使用如下寡核苷酸：

PGAP-SbfI：

5′-TAT ATACCT GCA GGT TAC CCA GTG GTA CCT ACA TAC-3′(在5′-末端包含SbfI识别序列)

PGAP-rv：

5′-CAT TGT TAA TTA ATT ATT TGT TTG TTT GTT TG-3′

所述片段用QIAquick PCR Purification Kit根据生产商的说明进行纯化。最后，通过进行PCR获得LAF1基因和TDH1启动子区的融合体，其中使用包含Pichia ciferriiLAF1基因和TDH1启动子区的两个PCR产物(每个产物10ng)和寡核苷酸：

PGAP-SbfI：

PcLAG1-rv：

5′-CAG ACA AGT TTA ATA TAG ATA CTT AAA C-3′

用此方法可获得1.9kbp PCR产物。所述片段用QIAquick PCRPurification Kit根据生产商的说明进行纯化。接下来用限制性核酸内切酶SbfI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)消化PCR产物并连接进SalI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)消化、之后用DNA Polymerase I(根据生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)进行Klenow填充并用SbfI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：NewEngland Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)消化的载体pDB007，生成载体pPC-DES1-PcLAF1。插入体的方向和真实性通过DNA测序进行确定。连接、化学感受态大肠杆菌细胞的制备和转化通过本领域技术人员已知的方法进行。

为了引入Pichia ciferrii丙酮酸脱氢酶A亚基基因(PDA1)的启动子区控制下的Pichia ciferrii LAG1基因，用Pichia ciferrii F-60-10A NRRL 1031的染色体DNA(200ng)作为模板PCR扩增LAG1基因，其中使用如下寡核苷酸：

PcLAC1-fw：

5′-GAA ACT ACT TTC CAA ACT TCA AAA TCA ACT TTA TTA TCA

ATG TCC ACT TCC AGA CCA CAG-3′(在5′-末端包含与PPDA-rv-寡核苷酸互补的39个碱基的序列)

PcLAC1-BsiWI-rv：

5′-TAT ACG TAC GTG GTA CAT ACG ATA TAA TCC ATG TAG-3′(在5′-末端包含BsiWI识别序列)

PPDA-BsiWI-fw-new：

5′-TAT ACG TAC GGA CGC ACC GGC CAT TTT CAA AC-3′(在5′-末端包含BsiWI识别序列)

PPDA-rv：

5′-CAT TGA TAA TAA AGT TGA TTT TGA AGT TTG GAA AGT AGTTTC-3′

所述片段用QIAquick PCR Purification Kit根据生产商的说明进行纯化。最后，通过进行PCR获得LAG1基因和PDA1启动子区的融合体，其中使用包含Pichia ciferriiLAG1基因和PDA1启动子区的两个PCR产物(每个产物10ng)和寡核苷酸：

PPDA-BsiWI-fw-new：

PcLAC1-BsiWI-rv：

用此方法可获得2.2kbp PCR产物。所述片段用QIAquick PCRPurification Kit根据生产商的说明进行纯化。接下来用限制性核酸内切酶BsiWI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)消化PCR产物并连接进BsiWI切割的载体pPC-DES1-PcLAF1产生载体pPC-DES1-PcLAF1-PcLAG1(示于图12)。插入体的方向和真实性通过DNA测序进行确定。连接、化学感受态大肠杆菌细胞的制备和转化通过本领域技术人员已知的方法进行。

载体pPC-DES1-PcLAF1-PcLAG1用PmeI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：NewEngland Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)线性化，之后用QIAquick PCRPurification Kit根据生产商的说明进行纯化。

实施例10

在丁香霉素E抗性Pichia ciferrii突变株中同时过量产生Pichia ciferrii的酶 Des1p和Laf1p、棉桃阿舒氏囊霉的酶Laf1p和Lag1p、和小鼠碱性神经酰胺酶的质粒的构建

为了构建过表达Pichia ciferrii的酶Des1p和Laf1p、棉桃阿舒氏囊霉的酶Laf1p和Lag1p、和密码子优化形式的小鼠碱性神经酰胺酶的丁香霉素E抗性突变株，首先设计了整合DES1表达载体。

为此目的，用Pichia ciferrii F-60-10A NRRL 1031的染色体DNA 200ng作为模板根据Innis et al.(PCR protocols.A guide to methods and applications，1990，Academic Press)进行PCR以扩增P.ciferrii 3-磷酸甘油醛脱氢酶(TDH1)(GenBank编号#AF053300)的启动子区。为此应用如下寡核苷酸：

pGAP-BglII-for：

pGAP-NcoI-rev：

所述片段用QIAquick PCR Purification Kit根据生产商的说明进行纯化。之后用BglII和NcoI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New EnglandBiolabs，Schwalbach，Germany的说明)消化PCR产物得到一个575bp片段，将此片段连接进分别切割的pAG25(Goldstein et al.，Three new dominantgene disruption cassettes for genedisruption in Saccharomyces cerevisiae，1999，Yeast)产生具有融合至nat1的P.ciferrii的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(TDH3)启动子区的载体pTH-GAP-nat1(3892bp)。插入体的方向和真实性通过DNA测序进行确定。连接、化学感受态大肠杆菌细胞的制备和转化通过本领域技术人员已知的方法进行。

为了将核糖体rDNA基因间间隔区作为整合位点插入进所述载体中，将Pichiaciferrii核糖体RNA操纵子的5S-26S rDNA基因间间隔区(IS)(GenBank编号#AF053301)通过PCR进行扩增，其中用Pichia ciferriiF-60-10A NRRL 1031的染色体DNA(200ng)作为模板并使用如下寡核苷酸：

pIS-NdeI-for：

pIS-NdeI-rev：

5′-TAT ATACAT ATG GCT AGA TTG ACA GAA GTC GAT CAG-3′(在5′-末端包含NdeI识别序列)。

所述片段用QIAquick PCR Purification Kit根据生产商的说明进行纯化。用NdeI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)消化载体pTH-GAP-nat1和PCR产物，之后进行连接，产生载体pTH-GAP-nat1-IS2(4864bp)。插入体的方向和真实性通过DNA测序进行确定。连接、化学感受态大肠杆菌细胞的制备和转化通过本领域技术人员已知的方法进行。

为了插入单一PmeI识别序列以使载体pTH-GAP-nat1-IS2线性化，将整合进pTH-GAP-nat1-IS2的Pichia ciferrii核糖体RNA操纵子(GenBank编号#AF053301)的5S-26SrDNA基因间间隔区(IS)的两个片段通过PCR进行扩增，其中用载体pTH-GAP-nat1-IS2作为模板。片段1用如下寡核苷酸扩增：

pIS-NdeI-rev：

PmeI-rv：

5′-CCC ATC CAC TAAGTT TAA ACA CCC ATA CAA AAT CGA GCTTCA AAT C-3′(在5′-末端包含与PmeI-fw-寡核苷酸互补的21bp序列和PmeI识别序列)。

片段2用如下寡核苷酸扩增：

p-IS-NdeI-for：

PmeI-fw：

5′-TGT TTA AAC TTA GTG GAT GGG AAA CCC TGT AGA ACTGGGACAAAC-3′。

p-IS-NdeI-for：

pIS-NdeI-rev：

所述片段用QIAquick PCR Purification Kit根据生产商的说明进行纯化。用NdeI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)切割PCR产物和载体pTH-GAP-nat1-IS2。进行连接以产生载体pTH-GAP-nat1-IS2-PmeI(4879bp)。插入体的方向和真实性通过DNA测序进行确定。连接、化学感受态大肠杆菌细胞的制备和转化通过本领域技术人员已知的方法进行。

为了引入Pichia ciferrii丙酮酸脱氢酶A亚基基因(PDA1)的启动子区(SEQ IDNO：27)控制下的Pichia ciferrii DES1基因(SEQ ID NO：26)，用Pichiaciferrii F-60-10A NRRL 1031的染色体DNA(200ng)作为模板PCR扩增DES1基因(SEQ ID NO：26)，其中使用如下寡核苷酸：

DES1-fw：

5′-TAG AAG TTC CAG AAA CTA CTT TCC AAA CTT CAA AAT CAACTT TAT TAT CAATGG CTA CAA TTA CAC ATA GAA AAA ACCCTT CAC AAC-3′(在5′-末端包含与PDA1-rv-寡核苷酸互补的50bp序列)

DES1-rv：

5′-TAT ACT GCA GGC ATA TTG TCA ATT CTA TTG TAC TTG AGTATT AAT GAT TA-3′(在5′-末端包含PstI识别序列)。

相应地扩增Pichia ciferrii丙酮酸脱氢酶A亚基基因(PDA1)的启动子区(SEQ IDNO：27)，其中使用如下寡核苷酸：

PDA1-fw：

PDA1-rv：

5′-TGA TAA TAA AGT TGA TTT TGA AGT TTG GAA AGT AGT TTCTGG AAC TTC TA-3′。

PDA1-fw：

DES1-rv：

为了用放线菌酮抗性盒取代诺尔丝菌素(nourseothricin)抗性盒，用SacI和SalI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)消化载体pTH/DB-002a.1。用QIAquick GelExtraction Kit根据生产商的说明凝胶纯化不含有诺尔丝菌素抗性盒的5667bp载体骨架。

为了产生放线菌酮抗性盒，通过PCR扩增Pichia ciferrii L41基因(GenBank编号#AF053457)的两个片段，其中使用Pichia ciferrii F-60-10ANRRL 1031的基因组DNA作为模板：片段1用如下寡核苷酸扩增：

PcL41-SalI-fw：

PcL41-internal-rv；

5′-GTT TTA GCT TTT TTA TGG AAA ACT tGT TTG GTT TGA CCACCG TAA CCG G-3′(在5′-末端包含与PcL41-internal-fw-寡核苷酸互补的49bp序列，插入一个点突变(C变为A)以将L41p的aa 56从脯氨酸取代为谷氨酰胺以赋予放线菌酮抗性)。

片段2用如下寡核苷酸扩增：

PcL41-internal-fw：

PcL41-SacI-rv：

5′-TAT AGA GCT CAA TTC CAA TGT TTT GAT CTG TC-3′(在5′-末端包含SalI识别序列)。

PcL41-SalI-fw：

PcL41-SacI-rv：

5′-TAT AGA GCT CAA TTC CAA TGT TTT GAT CTG TC-3′(在5′-末端包含SacI识别序列)。

为了引入Pichia ciferrii 3-磷酸甘油醛脱氢酶同工酶1(TDH1)的启动子区(GenBank编号#AF053300)控制下的棉桃阿舒氏囊霉LAF1基因(SEQ IDNO：13)，用棉桃阿舒氏囊霉ATCC 19895的染色体DNA(200ng)作为模板PCR扩增LAF1基因(SEQ ID NO：13)，其中使用如下寡核苷酸：

AgLAG1-fw：

5′-CAA ACA AAC AAA CAA ATA ATT AAT TAA CAA TGT CGG GCCAAG TCA GGC AG-3′(在5′-末端包含与PGAP-rv-寡核苷酸互补的32个碱基的序列)

AgLAG1-rv：

5′-CAT TAC CGA TCA CCA GGT AGG-3′。

相应地扩增Pichia ciferrii 3-磷酸甘油醛脱氢酶同工酶1基因(TDH1)的启动子区(GenBank编号#AF053300)，其中使用如下寡核苷酸：

PGAP-SbfI：

PGAP-rv：

5′-CAT TGT TAA TTA ATT ATT TGT TTG TTT GTT TG-3′。

所述片段用QIAquick PCR Purification Kit根据生产商的说明进行纯化。最后，通过进行PCR获得LAF1基因和TDH1启动子区的融合体，其中使用包含棉桃阿舒氏囊霉LAF1基因和Pichia ciferrii TDH1启动子区的两个PCR产物(每个产物10ng)和寡核苷酸：

PGAP-Sbf1：

AgLAG1-rv：

5′-CAT TAC CGA TCA CCA GGT AGG-3′。

用此方法可获得1.8kbp PCR产物。所述片段用QIAquick PCRPurification Kit根据生产商的说明进行纯化。接下来用限制性核酸内切酶SbfI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)消化PCR产物并连接进SalI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)消化、之后用DNA Polymerase I的Klenow片段(根据生产商：New EnglandBiolabs，Schwalbach，Germany的说明)进行Klenow填充并用SbfI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)消化的载体pDB007，生成载体pPC-DES1-AgLAF1。插入体的方向和真实性通过DNA测序进行确定。连接、化学感受态大肠杆菌细胞的制备和转化通过本领域技术人员已知的方法进行。

为了引入Pichia ciferrii丙酮酸脱氢酶A亚基基因(PDA1)的启动子区(SEQ IDNO：27)控制下的棉桃阿舒氏囊霉LAG1基因(SEQ ID NO：11)，用棉桃阿舒氏囊霉ATCC 19895的染色体DNA(200ng)作为模板PCR扩增LAG1(SEQ ID NO：11)基因，其中使用如下寡核苷酸：

AgLAC1-fw：

5′-GAA ACT ACT TTC CAA ACT TCA AAA TCA ACT TTA TTA TCAATG GCT GAA AATTCG TTA TTG AAG CCA C-3′(在5′-末端包含与PPDA-rv-寡核苷酸互补的42个碱基的序列)

AgLAC1-BsiWI-rv：

5′-TAT ACG TAC GGT GTA ATG GCG GTG GAA CAC-3′(在5′-末端包含BsiWI识别序列)。

PPDA-BsiWI-fw-new：

PPDA-rv：

5′-CAT TGA TAA TAA AGT TGA TTT TGA AGT TTG GAA AGT AGTTTC-3′

所述片段用QIAquick PCR Purification Kit根据生产商的说明进行纯化。最后，通过进行PCR获得LAG1基因和PDA1启动子区的融合体，其中使用包含棉桃阿舒氏囊霉LAG1基因和Pichia ciferrii PDA1启动子区的两个PCR产物(每个产物10ng)和寡核苷酸：

PPDA-BsiWI-fw-new：

AgLAC1-BsiWI-rv：

用此方法可获得2.1kbp PCR产物。所述片段用QIAquick PCRPurification Kit根据生产商的说明进行纯化。接下来用限制性核酸内切酶BsiWI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)消化PCR产物并连接进BsiWI切割的载体pPC-DES1-AgLAF1产生载体pPC-DES1-AgLAF1-AgLAG1(示于图11)。插入体的方向和真实性通过DNA测序进行确定。连接、化学感受态大肠杆菌细胞的制备和转化通过本领域技术人员已知的方法进行。

载体pPC-DES1-AgLAF1-AgLAG1用PmeI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：NewEngland Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)线性化，之后用QIAquick PCRPurfication Kit根据生产商的说明进行纯化。

另外，构建了包含Pichia ciferrii LAF1基因和为了在Pichia ciferrii中表达而优化的密码子优化形式的小鼠碱性神经酰胺酶的第二载体。

为此目的，用100ng FirstChoice PCR-Ready小鼠肾cDNA(Ambion，Inc.，Austin，TX，U.S.A.)作为模板进行PCR反应以扩增碱性小鼠神经酰胺酶的开放读框(mCER)(GenBank编号#AF347023)。因此，应用如下寡核苷酸：

mCER-fw：

5′-CAA ACA AAC AAA CAA ATA ATT AAT TAA CAA TGC ATG TAC

CGG GCA CCA G-3′(在5′-末端包含与寡核苷酸PGAP-rv互补的32个碱基的序列)

mCER-rv：

5′-CGT TAT ATA GGA AAG CAC CGA AGC TAA ATT CAG CAG TTC

TTG TCA TTC TC-3′(在5′-末端包含与寡核苷酸TENO-fw互补的29个碱基的序列)。

PGAP-SbfI：

PGAP-rv：

5′-CAT TGT TAA TTA ATT ATT TGT TTG TTT GTT TG-3′。

所述片段用QIAquick PCR Purification Kit根据生产商的说明进行纯化。最后，通过进行PCR获得mCER基因和TDH1启动子区的融合体，其中使用包含小家鼠(Musmusculus)CER基因和Pichia ciferrii TDH1启动子区的两个PCR产物(每个产物10ng)和寡核苷酸：

PGAP-SbfI：

mCER-rv：

5′-CGT TAT ATA GGA AAG CAC CGA AGC TAA ATT CAG CAG TTC

用此方法可获得1.4kbp PCR产物。所述片段用QIAquick PCRPurification Kit根据生产商的说明进行纯化。

为了将Pichia ciferrii的烯醇化酶基因(ENO1)终止子区(SEQ ID NO：28)与前述扩增的构建体融合，首先使用如下寡核苷酸扩增ENO1的终止子区：

TENO-fw：

5′-ATT TAG CTT CGG TGC TTT CCT ATA TAA CG-3′

TENO-fw-SbfI：

5′-TAT ATACCT GCA GGT TAT AAC GGT TGG GCA ATG TTG AG-3′

(在5′-末端包含SbfI识别序列)。

所述片段用QIAquick PCR Purification Kit根据生产商的说明进行纯化。最后，通过进行PCR反应获得TDH1启动子区控制下的mCER基因和ENO1终止子区的融合体，其中使用两个PCR产物(每个产物10ng)和寡核苷酸：

PGAP-SbfI：

TENO-fw-SbfI：

5′-TAT ATACCT GCA GGT TAT AAC GGT TGG GCA ATG TTG AG-3′

(在5′-末端包含SbfI识别序列)。

用此方法可获得1.8kbp PCR产物。所述片段用QIAquick PCRPurification Kit根据生产商的说明进行纯化。接下来用限制性核酸内切酶SbfI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)消化PCR产物并连接进SbfI切割的载体pDB007以生成载体pPC-DES1-mCER。插入体的方向和真实性通过DNA测序进行确定。连接、化学感受态大肠杆菌细胞的制备和转化通过本领域技术人员已知的方法进行。

为了用诺尔丝菌素抗性盒取代放线菌酮抗性盒，用SacI和SalI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)消化载体pPC-DES1-mCER。用QIAquick Gel Extraction Kit根据生产商的说明凝胶纯化不含有放线菌酮抗性盒的7403bp载体骨架。

为了产生诺尔丝菌素赋予的抗性盒，通过PCR扩增三个片段。首先，扩增为了在Pichia ciferrii中表达而优化的密码子优化形式的赋予诺尔丝菌素抗性的nat1基因(SEQID NO：29)，其中使用Geneart GmbH(Regensburg，Germany)提供的载体pPCR-Script-nat1作为模板，使用寡核苷酸：

opt-nat1-fw：

5′-CAA AAT CAA CTT TAT TAT CAA TGG GTA CTA CTT TAG ATG

ATA C-3′(在5′-末端包含与寡核苷酸PPDA-rv互补的23个碱基的序列)

opt-nat1-rv：

5′-TCT TTT TAT TGT CAG TAC TGA TTA TTA TGG ACA TGG CATTGA C-3′(在5′-末端包含与寡核苷酸T-TEF-fw互补的21个碱基的序列)。

PPDA-SalI-fw：

5′-TATGTC GAC TGT GCT CTA AAT TTG CCC GGT TC-3′(在5′-末端包含SalI识别序列)

PPDA-rv：

5′-CAT TGA TAA TAA AGT TGA TTT TGA AGT TTG GAA AGT AGTTTC-3′。

所述片段用QIAquick PCR Purification Kit根据生产商的说明进行纯化。最后，通过进行PCR获得密码子优化的nat1基因和PDA1启动子区的融合体，其中使用包含nat1基因和Pichia ciferrii PDA1启动子区的两个PCR产物(每个产物10ng)和寡核苷酸：

PPDA-SalI-fw：

opt-nat1-rv：

用此方法可获得1.3kbp PCR产物。所述片段用QIAquick PCRPurification Kit根据生产商的说明进行纯化。

为了将棉桃阿舒氏囊霉TEF终止子区与前述扩增的构建体融合，用棉桃阿舒氏囊霉ATCC 19895的染色体DNA(200ng)作为模板PCR扩增棉桃阿舒氏囊霉TEF终止子区(GenBank编号#A29820)，其中使用如下寡核苷酸：

T-TEF-fw：

5′-TCA GTA CTG ACA ATA AAA AGA TTC TTG-3′

T-TEF-SacI-rv：

5′-TGA GCT CTC GAC ACT GGA TGG CGG CGT TAG-3′(在5′-末端包含SacI识别序列)。

所述片段用QIAquick PCR Purification Kit根据生产商的说明进行纯化。最后，通过进行PCR反应获得Pichia ciferriiPDA1启动子控制下nat1基因和棉桃阿舒氏囊霉TEF终止子区的融合体，其中使用两个PCR产物(每个产物10ng)和寡核苷酸：

PPDA-SalI-fw：

T-TEF-SacI-rv：

所得到的1.5kbp片段使用QIAquick PCR Purification Kit根据生产商的说明进行纯化。接下来用限制性核酸内切酶SalI和SacI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)消化PCR产物并连接进载体pPC-DES1-mCER(见上述)的7403bp载体骨架以产生载体p-PC-DES1-mCER-nat1。插入体的方向和真实性通过DNA测序进行确定。连接、化学感受态大肠杆菌细胞的制备和转化通过本领域技术人员已知的方法进行。

为了用为在Pichia ciferrii中表达而优化的密码子优化形式的基因(omCER)取代mCER基因，用PacI和BsiWI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New EnglandBiolabs，Schwalbach，Germany的说明)消化载体pPC-DES1-mCER-nat1。用QIAquick GelExtraction Kit根据生产商的说明凝胶纯化不含有mCER和DES1基因的5514bp载体骨架。

为了引入具有Pichia ciferrii ENO1基因的终止子区的小家鼠omCER基因，用Geneart GmbH(Regensburg，Germany)提供的载体pUC-kana-mCER作为模板进行PCR反应扩增omCER基因(SEQ ID NO：30)，其中使用如下寡核苷酸：

opt-mCER-PacI-fw：

5′-GGT ACC TTA ATT AAC AAT GCA TG-3′(在5′-末端包含PacI识别序列)

opt-mCER-rv：

5′-AGG AAA GCA CCG AAG CTA AAT TTA ACA ATT TTT ATC ATTTTC-3′(在5′-末端包含与寡核苷酸TENO-fw互补的21个碱基的序列)。

相应地扩增Pichia ciferrii ENO1基因的终止子区(SEQ ID NO：28)，其中使用如下寡核苷酸：

TENO-fw：

5′-ATT TAG CTT CGG TGC TTT CCT ATA TAA CG-3′

T-ENO-BsiWI-rv：

5′-TAC GTA CGT TAT AAC GGT TGG GCA ATG TTG-3′(在5′-末端包含BsiWI识别序列)。

所述片段用QIAquick PCR Purification Kit根据生产商的说明进行纯化。最后，通过进行PCR反应获得omCER基因和ENO1终止子区的融合体，其中使用包含密码子优化形式的小家鼠CER基因和Pichia ciferrii ENO1终止子区的两个PCR产物(每个产物10ng)和寡核苷酸：

opt-mCER-PacI-fw：

5′-GGT ACC TTA ATT AAC AAT GCA TG-3′(在5′-末端包含PacI识别序列)

T-ENO-BsiWI-rv：

用此方法可获得1.2kbp PCR产物。所述片段用QIAquick PCRPurification Kit根据生产商的说明进行纯化。之后用限制性核酸内切酶PacI和BsiWI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany 的说明)消化PCR产物并连接进载体pPC-DES1-mCER-nat1(见上述)的5514bp载体骨架以产生载体p-mCER-nat1。插入体的方向和真实性通过DNA测序进行确定。连接、化学感受态大肠杆菌细胞的制备和转化通过本领域技术人员已知的方法进行。

为了构建过表达omCER和Pichia ciferrii TDH1启动子(GenBank编号#AF053300)和ENO1(SEQ ID NO：28)终止子区控制下的第二基因的载体，首先扩增TDH1启动子，其中用Pichia ciferrii F-60-10ANRRL 1031的染色体DNA作为模板并使用寡核苷酸：

GAPDH-SpeI-fw：

5′-TAT ATAACT AGT TTA CCC AGT GGT ACC TAC ATAC-3′(在5′-末端包含SpeI识别序列)

GAPDH-CO-rv：

5′-CCC GGG ATT TAA ATG GCG CGC CGT TAA TTA ATT ATT TGTTTG TTT GTT TG-3′(在5′-末端包含与寡核苷酸ENO-CO-fw-互补的22个碱基的序列)。

相应地扩增Pichia ciferrii ENO1基因的终止子区，其中使用如下寡核苷酸：

ENO-CO-fw：

5′-GGC GCG CCA TTT AAA TCC CGG GAT TTA GCT TCG GTG CTTTCC TA-3′

ENO-SpeI-rv：

5′-TAT ATACCG CGG TTA TAA CGG TTG GGC AAT GTT G-3′(在5′-末端包含SpeI识别序列)。

所述片段用QIAquick PCR Purification Kit根据生产商的说明进行纯化。最后，通过进行PCR反应获得两个片段的融合体，其中使用两个PCR产物(每个产物10ng)和寡核苷酸：

GAPDH-SpeI-fw：

5′-TAT ATAACT AGT TTA CCC AGT GGT ACC TAC ATA C-3′(在5′-末端包含SpeI识别序列)

ENO-SpeI-rv：

在此可获得0.9kbp PCR产物。所述片段用QIAquick PCR PurificationKit根据生产商的说明进行纯化。之后用限制性核酸内切酶SpeI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)消化PCR产物并连接进SpeI切割的进载体p-mCER-nat1以产生载体p-mCER-nat1-X-B，其中Pichia ciferrii TDH1启动子与nat1表达盒方向相反。插入体的方向和真实性通过DNA测序进行确定。连接、化学感受态大肠杆菌细胞的制备和转化通过本领域技术人员已知的方法进行。

为了最终将Pichia ciferrii的LAF1基因(SEQ ID NO：3)插入进携带omCER的载体p-mCER-nat1-X-B，扩增LAF1基因(SEQ ID NO：3)，其中用Pichia ciferrii F-60-10A NRRL1031的染色体DNA作为模板并使用寡核苷酸：

PcLAF1-HpaI-fw：

5′-TAT ATAGTT AAC ATG ATT TCA ACT TCA ACA AAT TC-3′(在5′-末端包含HpaI识别序列)

PcLAF1-XmaI-rv：

5′-TAT ATACCC GGG CTAATC ATC ATC TTC ATC ATC-3′(在5′-末端包含XmaI识别序列)。

所述片段用QIAquickPCRPurificationKit根据生产商的说明进行纯化。之后用限制性核酸内切酶HpaI和XmaI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New EnglandBiolabs，Schwalbach，Germany的说明)消化PCR产物并连接进用AscI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)切割、之后用DNAPolymerase I的Klenow片段(根据生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)进行Klenow填充并用XmaI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：NewEnglandBiolabs，Schwalbach，Germany的说明)消化的载体p-mCER-nat1-X-B，生成载体p-mCER-nat1-PcLAF1(示于图12)。插入体的方向和真实性通过DNA测序进行确定。连接、化学感受态大肠杆菌细胞的制备和转化通过本领域技术人员已知的方法进行。

载体p-mCER-nat1-PcLAF1用PmeI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：NewEngland Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)线性化，之后用QIAquick PCRPurification Kit根据生产商的说明进行纯化，之后转化进丁香霉素E抗性Pichiaciferrii突变株。

实施例11

用于在丁香霉素E抗性Pichia ciferrii突变株中同时过量产生Pichia ciferrii 的酶Des1p和Lag1p、棉桃阿舒氏囊霉的酶Laf1p和Lag1p、和小鼠碱性神经酰胺酶的质粒的构建

为了过表达Pichia ciferrii的Des1p和棉桃阿舒氏囊霉的Laf1p和Lag1p，使用载体pPC-DES1-AgLAF1-AgLAG1(参见实施例11)。另外，构建用于过表达Pichia ciferrii的omCER基因和Lag1p的载体。

为此目的，将Pichia ciferrii的LAG1基因(SEQ ID NO：1)插入进携带omCER的载体p-mCER-nat1-X-B(参见实施例11)内。首先，用Pichia ciferriiF-60-10A NRRL 1031的染色体DNA作为模板扩增LAGl(SEQ ID NO：1)基因，使用寡核苷酸：

PcLAG1-EcoRV-fw：

5′-TAT ATAGAT ATC ATG TCC ACT TCC AGA CCA CAG-3′(在5′-末端包含EcoRV识别序列)

PcLAG1-XmaI-rv：

5′-TAT ATACCC GGG TTA TTC ACT CTT TTT TTC TTG-3′(在5′-末端包含XmaI识别序列)。

所述片段用QIAquick PCR Purification Kit根据生产商的说明进行纯化。之后用限制性核酸内切酶EcoRV和XmaI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New EnglandBiolabs，Schwalbach，Germany的说明)消化PCR产物并连接进用AscI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)切割、之后用DNAPolymerase I的Klenow片段(根据生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)进行Klenow填充并用XmaI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：NewEnglandBiolabs，Schwalbach，Germany的说明)消化的载体p-mCER-nat1-X-B，生成载体p-mCER-nat1-PcLAG1(示于图13)。插入体的方向和真实性通过DNA测序进行确定。连接、化学感受态大肠杆菌细胞的制备和转化通过本领域技术人员已知的方法进行。

载体p-mCER-nat1-PcLAG1用PmeI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：NewEngland Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)线性化，之后用QIAquick PCRPurification Kit根据生产商的说明进行纯化，之后转化进丁香霉素E抗性Pichiaciferrii突变株。

实施例12

用于在丁香霉素E抗性Pichia ciferrii突变株中同时过量产生Pichia ciferrii 的酶Des1p、棉桃阿舒氏囊霉的酶Laf1p和Lag1p、密码子优化形式的小鼠碱性神经酰胺酶、和密码子优化形式的颗石藻类病毒神经酰胺合酶的质粒的构建

为了过表达Pichia ciferrii的Des1p和棉桃阿舒氏囊霉的Laf1p和Lag1p，使用载体pPC-DES1-AgLAF1-AgLAG1(参见实施例10)。另外，构建用于过表达omCER基因和编码颗石藻类病毒神经酰胺合酶的为了在Pichia ciferrii中表达而优化的密码子优化的基因(oCvLAG1)的载体。

为此目的，将颗石藻类病毒的oCvLAG1基因(SEQ ID NO：31)插入进携带omCER的载体p-mCER-nat1-X-B(参见实施例11)内。首先，用限制性核酸内切酶HpaI和XmaI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New EnglandBiolabs，Schwalbach，Germany的说明)将oCvLAG1基因(SEQ ID NO：31)从Geneart GmbH(Regensburg，Germany)提供的载体pGA4-CVLAG1中切割出来，并连接进用SwaI和XmaI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：NewEngland Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)切割的载体p-mCER-nat1-X-B内，生成载体p-mCER-nat1-oCvLAG1(示于图14)。插入体的方向和真实性通过DNA测序进行确定。连接、化学感受态大肠杆菌细胞的制备和转化通过本领域技术人员已知的方法进行。

载体p-mCER-nat1-oCvLAG1用PmeI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：NewEngland Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)线性化，之后用QIAquick PCRPurification Kit根据生产商的说明进行纯化，之后转化进丁香霉素E抗性Pichiaciferrii突变株。

实施例13

用于在丁香霉素E抗性Pichia ciferrii突变株中同时过量产生Pichia ciferrii 的酶Des1p、棉桃阿舒氏囊霉的酶Laf1p和Lag1p、密码子优化形式的小鼠碱性神经酰胺酶、和密码子优化形式的小鼠神经酰胺合酶的质粒的构建

为了过表达Pichia ciferrii的Des1p和棉桃阿舒氏囊霉的Laf1p和Lag1p，使用载体pPC-DES1-AgLAF1-AgLAG1(参见实施例10)。另外，构建用于过表达omCER基因和密码子优化的小鼠神经酰胺合酶(omLASS5)的载体。

为此目的，将小鼠的omLASS5基因(SEQ ID NO：32)插入进携带omCER的载体p-mCER-nat1-X-B(参见实施例11)内。首先，用限制性核酸内切酶HpaI和XmaI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)将omLASS5基因(SEQ ID NO：32)从GeneartGmbH(Regensburg，Germany)提供的载体pUK-kana-omLASS5中切割出来，并连接进用AscI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New EnglandBiolabs，Schwalbach，Germany的说明)切割、之后用DNA Polymerase I的Klenow片段(根据生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)进行Klenow填充并用XmaI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：NewEngland Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)消化的载体p-mCER-nat1-X-B内，生成载体p-mCER-nat1-omLASS5(示于图15)。插入体的方向和真实性通过DNA测序进行确定。连接、化学感受态大肠杆菌细胞的制备和转化通过本领域技术人员已知的方法进行。

载体p-mCER-nat1-omLASS5用PmeI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：NewEngland Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)线性化，之后用QIAquick PCRPurification Kit根据生产商的说明进行纯化，之后转化进丁香霉素E抗性Pichiaciferrii突变株。

实施例14

丁香霉素E抗性Pichia ciferrii突变株的转化

丁香霉素E抗性Pichia ciferrii突变株的转化如最近所描述的进行(Baeet al.，Integrative transformation system for the metabolic engineering ofthesphingoid base-producing yeast Pichia ciferrii.2003.Appl EnvironMicrobiol.；美国专利6,638,735)。

将丁香霉素E抗性Pichia ciferrii菌株(来自WO2006/048458的SYR21-2C，图4)在YPD培养基中生长至600nm光密度为1至1.5。离心收集细胞并重悬于0.1培养体积的50mM磷酸盐缓冲液(pH7.5)中，在使用前向所述磷酸盐缓冲液中加入25mM二硫苏糖醇。在37℃温育15min后，将细胞用一培养体积的冰冷稳定液[270mM蔗糖，10mM Tris-HCl(pH7.5)，1mMMgCl₂]漂洗两次并重悬于0.01培养体积的稳定液中。5μl线性化的载体pPC-DES1-AgLAF1-AgLAG1、p-mCER-nat1-PcLAF1、p-mCER-nat1-PcLAG1、p-mCER-nat1-oCvLAG1或p-mCER-nat1-omLASS5(含有1.6μg DNA)与50μl细胞混和并在冰上温育10min。之后将转化混和物转移至2mm电穿孔杯中。电穿孔用GenePulser Xcell(Bio-RadLaboratories，München，Germany)在500V、50μF和700Ω根据生产商的说明进行。在电穿孔之后，细胞重悬于500μl稳定液中并转移至含有2ml YPD培养基的培养管中。细胞在30℃以每分钟250转过夜再生后，将再生培养物的小份铺板于含有0.5μg放线菌酮/毫升(pPC-DES1-AgLAF1-AgLAG1)或0.5μg放线菌酮/毫升和50μg/ml诺尔丝菌素(菌株已经含有pPC-DES1-AgLAF1-AgLAG1并已经用p-mCER-nat1-PcLAF1、p-mCER-nat1-PcLAG1、p-mCER-nat1-oCvLAG1或p-mCER-nat1-omLASS5转化)的YPD平板上。在30℃温育七天后，出现几十个菌落。

实施例15

由过表达鞘氨醇类碱生物合成基因的丁香霉素E抗性Pichia ciferrii突变株摇瓶生产乙酰化鞘氨醇

为了测试由过表达上述基因(PcDES1、AgLAF1、AgLAG1单独或与omCER组合，另外，与PcLAF1、PcLAG1、oCvLAG1或omLASS5组合)的丁香霉素E抗性突变株增加生产乙酰化鞘氨醇，培养相应菌株用于摇瓶生产乙酰化鞘氨醇(关于相应质粒参见表3)。

为此目的，在5ml YPD培养基中(试管内)接种所述菌株作为预培养物，在30℃以每分钟250转培养3天。接下来，用所述预培养物的1％接种20ml TAPS-Medium(在具有隔板的100ml Erlenmeyer烧瓶中)并在30℃以每分钟250转生长4天。

表1.TAPS培养基的组成

成份	分子式	每升
			酵母提取物	-	1.0g
葡萄糖	C₆H₁₂O₆.1aq	33g
			硫酸镁.7aq	MgSO₄.7H₂O	0.88g
氯化钙.2aq	CaCl₂.2H₂O	0.20g
			氯化铵	NH₄Cl	4.83g
氯化钠	NaCl	0.06g
			磷酸二氢钾	KH₂PO₄	1.0g
邻苯二甲酸二氢钾	KH₂C₈H₄O₄	20g
			肌醇	C₆H₁₂O₆	0.059g
微量元素	溶液A	0.30ml
			维生素溶液	溶液B	1.00ml

表2.微量元素和维生素母液的组成

微量元素	溶液A(g/L)
		(NH₄)₂Fe(SO₄)₂ZnSO₄.7H₂OCuSO₄.5H₂OMnSO₄.1H₂OH₃BO₃NaMoO₄.2H₂OKI	0.027g0.005g0.0075g0.0006g0.0006g0.0006g0.0015g
维生素溶液	溶液B
		烟酸D-泛酸钙硫胺素(维生素B1)对氨基苯甲酸吡哆醇(维生素B6)d-生物素	0.003g0.003g0.003g0.002g0.0003g0.00001g

实施例16

在培养液中量化乙酰化鞘氨醇类碱

为了提取脂类，向15ml falcon管中1ml未分级分离的发酵液中加入4ml丙酮，在室温以每分钟250转水平振荡10分钟。之后将混和物在5.300g离心10分钟，，并在Jasco HPLC系统(LC-2000系列)上分析上清液。应用如下条件：

流动相：丙酮/水90∶10(v/v)，含有0.05％(v/v)三氟乙酸(TFA)

流速： 1.0ml/min

运行时间： 11min

注射体积： 100μl

柱： Kromasil 100C18(250×4.6mm，颗粒大小5μm)

柱温： 30℃

塔板温度：环境温度

UV检测波长： 200nm

乙酰化的碱通过与已确定的参考物质(DSM，Delft)对比保留时间和UV谱进行鉴定，相应地通过对比样品和参考物质的峰面积进行量化。

由过表达上述基因的丁香霉素E抗性Pichia ciferrii突变株摇瓶生产乙酰化鞘氨醇总结于表3。浓度单位为mg每克生物量干重。

表3.遗传工程化的Pichia ciferrii菌株的三乙酰化鞘氨醇类碱的量。浓度单位为mg每克生物量干重。

质粒	过表达的基因	TriASo	TriASa	总量
					pPC-DES1-AgLAF1-AgLAG1	PcDES1，AgLAF1，AgLAG1	0.5	53.7	54.2
pPC-DES1-AgLAF1-AgLAG1p-mCER-nat1	PcDES1，AgLAF1，AgLAG1，omCER	1.4	43.3	44.7
					pPC-DES1-AgLAF1-AgLAG1p-mCER-nat1-PcLAF1	PcDES1，AgLAF1，AgLAG1，omCER，PcLAF1	3.1	29.0	32.1
pPC-DES1-AgLAF1-AgLAG1p-mCER-nat1-PcLAG1	PcDES1，AgLAF1，AgLAG1，omCER，PcLAG1	2.2	63.0	65.2
					pPC-DES1-AgLAF1-AgLAG1p-mCER-nat1-oCvLAG1	PcDES1，AgLAF1，AgLAG1，omCER，oCvLAF1	5.3	25.7	31.0
pPC-DES1-AgLAF1-AgLAG1p-mCER-nat1-omLASS5	PcDES1，AgLAF1，AgLAG1，omCER，omLASS5	3.0	42.2	45.2

实施例17

在丁香霉素E抗性Pichia ciferrii突变株中失活编码鞘脂Δ8去饱和酶的基因并同时过量产生Pichia ciferrii的酶Des1p、密码子优化形式的小鼠碱性神经酰胺酶、和密码子优化形式的颗石藻类病毒神经酰胺合酶

Pichia ciferrii具有编码与乳酸克鲁维酵母鞘脂Δ8去饱和酶具有高度相似性的酶的基因(参见实施例8)，所述酶已知在鞘氨醇类碱的C-8和C-9之间引入一个双键(Takakuwa et al.，Current Microbiology，45：459-61)。因此，这个酶的活性可能不利作用于鞘氨醇的产生，因为在二氢鞘氨醇中(无论其是游离鞘氨醇类碱或作为二氢神经酰胺的一个组分)引入这样一个双键会导致与形成鞘氨醇的共同前体的竞争。为了将上述鞘脂生物合成基因的过表达与编码Pichia ciferrii鞘脂Δ8去饱和酶的基因8DES的失活组合在一起，首先，用得自载体pDB006的在aa第56位含有一个点突变的的PichiaciferriiPcL41基因取代载体p-mCER-nat1-oCvLAG1中的nat1基因(参见实施例12)，所述点突变使得Pichia ciferrii在存在抗生素放线菌酮的条件下生长。为此目的，用限制性核酸内切酶SacI和SalI消化载体pTH-GAP-nat1-IS2-Pme1(参见实施例10)，并用QIAGENQIAquick GelExtraction Kit凝胶纯化3448bp片段。为了得到PcL41基因(GenBank编号#AF053457)并引入所希望的点突变，通过PCR扩增两个片段，其中用Pichiaciferrii F-60-10A NRRL 1031的染色体DNA作为模板。片段1使用如下寡核苷酸扩增：

PcL41-SalI-fw：

5′-TATAGTCGACGAATTCTCTTAAATGATGTTGG-3′(在5′-末端包含SalI识别序列)

PcL41-internal-rv：

5′-GTTTTAGCTTTTTTATGGAAAACTtGTTTGGTTTGACCACCGTAACCGG-3′

产生1222bp片段，其中包含与寡核苷酸PcL41-internal-fw互补的49bp序列，并插入一个从C变为A的点突变，将aa 56从脯氨酸取代为谷氨酰胺。片段2用如下寡核苷酸扩增：

PcL41-internal-fw：

5′-CCGGTTACGGTGGTCAAACCAAACaAGTTTTCCATAAAAAAG

CTAAAACTACCA AAAAAGTTGTTTTACG-3′

PcL41-SacI-rv：

5′-TATAGAGCTCAATTCCAATGTTTTGATCTGTC-3′(在5′-末端包含SacI识别序列)

产生753bp片段，其中包含与寡核苷酸PcL41-internal-rv互补的49bp序列，并插入一个点突变(从C变为A)，将aa 56从脯氨酸取代为谷氨酰胺。所述两个片段用QIAGENMinElute Gel Extraction Kit凝胶纯化。用每一个片段(2μl)作为模板，以及寡核苷酸PcL41-SalI-fw和PcL41-SacI-rv(见上述)进行交叉PCR。由此产生一个1906bp片段，在其末端具有SalI-和SacI-限制位点。之后用SalI和SacI消化所述片段，用QIAGEN MinElute PCRPurification Kit纯化，并连接进pTH-GAP-nat1-IS2-PmeI的3448bp骨架。连接、化学感受态大肠杆菌细胞的制备和转化、以及确认所希望的质粒的存在通过本领域技术人员已知的方法进行。所获得的质粒命名为pDB006。

用限制性核酸内切酶PstI和SacI (根据所述限制性核酸内切酶的生产商：NewEngland Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)消化质粒p-mCER-nat1-oCvLAG1，并用QIAGEN QIAquick Gel Extraction Kit凝胶纯化6997bp片段。插入体PcL41通过用PstI和SacI消化pDB006获得，类似地凝胶纯化1918bp片段，并接下来连接进所述载体。连接、化学感受态大肠杆菌细胞的制备和转化、以及确认所希望的质粒的存在通过本领域技术人员已知的方法进行。在此确认过程中，显然用于克隆步骤的SacI限制位点在所产生的命名为p-mCER-LP-PcvL41-oCvLAG1的质粒中不再存在。因此，对完整插入体和相邻区域进行测序以确认真实性。可以确认，可能由于SacI的星活性，载体p-mCER-nat1-oCvLAG1在属于oCvLAG1基因的烯醇化酶终止子区的识别序列GAGCTC未被切割，而是在序列GAGCTT被切割。因此，SacI识别位点在连接后不再存在，并且所述终止子被截短至211bp而不是332bp。这个事实被认为是不相关的，并且所述载体被用于下一步：引入Pichia ciferrii DES1基因(SEQ IDNO：26)。其通过PCR扩增，使用如下寡核苷酸：

PcDES1-PstI-fw：

5′-TATATACTGCAGTTACCCAGTGGTACCTACATAC-3′(在5′-末端包含PstI识别序列)

PcDES1-PstI-rv(5′-TATATACTGCAGTTATAACGGTTGGGCAATG-3′(在5′-末端包含PstI识别序列)

并使用Pichia ciferrii F-60-10A NRRL 1031的染色体DNA作为模板。所得到的1983bp片段如上所述进行凝胶纯化、用限制性核酸内切酶PstI消化。并用QIAGEN QIAquickPCR Purification Kit进行PCR纯化。载体p-mCER-LP-PcvL41-oCvLAG1进行类似切割和纯化。连接、化学感受态大肠杆菌细胞的制备和转化、以及确认所希望的质粒的存在通过本领域技术人员已知的方法进行。通过进行本方法获得的质粒命名为pTH-LP-1。插入体的方向和真实性通过DNA测序确定。

编码Pichia ciferrii鞘脂Δ8去饱和酶的基因(SEQ ID NO：5)的一个内部区域通过PCR扩增，其中用Pichia ciferrii F-60-10A NRRL 1031的染色体DNA作为模板，并使用如下寡核苷酸：

PcD8D-PshAI-fw：

5′-TATATAGACAAAAGTCCAGTTCCAAAGTGCTC-3′(在5′-末端包含PstI识别序列)

PcD8D-BsiWI-rv：

5′-TATATACGTACGAAAATTGCACTAAGGAAATAC-3′(在5′-末端包含BsiWI识别序列)

855bp片段用QIAGEN MinElute Gel Extraction Kit凝胶纯化，并且接下来用限制性核酸内切酶PshAI和BsiWI根据生产商(New England Biolabs，Schwalbach，Germany)的说明进行消化。之后用QIAGEN MinElute PCRPurification Kit进行纯化，类似地消化载体pTH-LP-1，并用QIAGENQIAquick Gel Extraction Kit凝胶纯化9662bp片段。连接、化学感受态大肠杆菌细胞的制备和转化、以及确认所希望的质粒的存在通过本领域技术人员已知的方法进行。通过进行本方法获得的质粒命名为pTH-deltaD8D(示于图17)。插入体的方向和真实性通过DNA测序确定。

实施例18

在丁香霉素E抗性Pichia ciferrii菌株中失活编码碱性神经酰胺酶的基因并同时过量产生Pichia ciferrii的酶Des1p、密码子优化形式的小鼠碱性神经酰胺酶、和密码子优化形式的颗石藻类病毒神经酰胺合酶

Pichia ciferrii具有编码与酿酒酵母碱性神经酰胺酶具有高度相似性的酶的基因(参见实施例7)，所述酶已知优先水解含有植物鞘氨醇或二氢鞘氨醇而不是鞘氨醇作为鞘氨醇类碱的神经酰胺(Mao et al.，The Journal ofBiological Chemistry，275：31369-31378)。因此，这个酶的活性可能不利于鞘氨醇的产生，因为含有二氢鞘氨醇作为鞘氨醇类碱的神经酰胺是形成鞘氨醇的前体。为了将上述鞘脂生物合成基因的过表达与Pichiaciferrii内源碱性神经酰胺酶基因YXC1的失活组合在一起，用编码Pichia ciferrii神经酰胺酶的基因的一个内部区域(SEQ ID NO：8)取代质粒pTH-deltaD8D上的基因间间隔区(IS)区域(参见实施例17和图17)。

首先，通过PCR扩增编码Pichia ciferrii神经酰胺酶的基因(SEQ IDNO：8)的两个内部的、部分重叠的片段，其中使用Pichia ciferrii F-60-10ANRRL 1031的染色体DNA作为模板，并分别使用寡核苷酸对OTKD284/OTKD285和OTKD286/OTKD287：

OTKD284：

5′-TAT ATAGAC AGA AGT CCA TAT CAT TTA CCA TTT GCT AAACC-3′(下划线：PshAI识别序列)

OTKD285：

5′-TAA ATC TCA ATTCAC ACT GGT GCT AAA TTA TTT TTA AATGCA GA-3′(下划线：AleI识别序列)

OTKD286：

5′-TAAAAATAATTTAGCACCAGTGTGAATTGAGATTTATATTGATAAGTT-3′(下划线：AleI识别序列)

OTKD287：

5′-TAT ATACGT ACG CAA TAT TAT AGA AAT ACC AAT TGT-3′(下划线：BsiWI识别序列)

两个部分重叠的片段(分别是239和236bp)用QIAGEN QIAquick GelExtractionKit进行凝胶纯化。用每一个片段(2μl)作为模板，以及寡核苷酸OTKD284和OTKD287(见上述)进行交叉PCR。获得在其末端具有单一PshAI和BsiWI位点，以及一个中间AleI位点的439bp DNA片段。所述片段用PshAI和BsiWI根据生产商(New England Biolabs，Schwalbach，Germany)的说明进行消化。之后用QIAGEN PCR Purification Kit纯化。类似地消化载体pTH-LP-1，并使用QIAGEN QIAquick Gel Extraction Kit凝胶纯化9662bp片段。两个片段的连接、化学感受态大肠杆菌细胞的制备和转化、以及确认所希望的质粒的存在通过本领域技术人员已知的方法进行。通过进行本方法获得的质粒命名为pSo-5(示于图18)。插入体的方向和真实性通过DNA测序确定。

实施例19

由过表达鞘氨醇类碱生物合成基因的丁香霉素E抗性Pichia ciferrii突变株摇瓶生产乙酰化鞘氨醇类碱，以及在培养液中量化乙酰化鞘氨醇类碱

如在实施例14中所描述的，在pSo-5用AleI消化之后，用实施例17和18的质粒转化丁香霉素E抗性Pichia ciferrii菌株。如在实施例15中所描述的，由丁香霉素E抗性Pichiaciferrii突变株摇瓶生产乙酰化鞘氨醇类碱，根据实施例16用RP-HPLC检测并量化乙酰化鞘氨醇类碱。

结果示于表4。引人注目的是，当使用编码Pichia ciferrii鞘脂Δ8去饱和酶的基因的片段替代rDNA基因间间隔区(pTH-LP-1)作为靶序列(pTH-deltaD8D)，从而导致基于质粒pTH-deltaD8D同源整合进染色体而引起的Pichia ciferrii 8DES失活时，三乙酰化鞘氨醇(TriASo)的量显著增加。另外，当使用编码Pichia ciferrii YXC1碱性神经酰胺酶的基因的片段替代rDNA基因间间隔区(pTH-LP-1)作为靶序列(pSo-5)，从而导致基于质粒pSo-5同源整合进染色体而引起的Pichia ciferrii YXC1失活时，三乙酰化鞘氨醇(TriASo)的总量和TriASo/TriASa比例都显著提高。

表4.遗传工程化的Pichia ciferrii菌株中质粒整合位点对三乙酰化鞘氨醇类碱水平的影响。浓度单位为mg每克生物量干重。

质粒	整合位点	TriASo	TriASa	总量	比例TriASo/TriASa
						pTH-LP-1	基因间间隔区(IS)	21.66	59.47	81.13	0.36
pTH-deltaD8D	Pc8DES	33.45	69.90	103.35	0.48
						pSo-5	PcYXC1	28.47	52.76	81.23	0.53

<110>科兹莫弗姆有限公司

<120>使用遗传工程化的微生物菌株的改进的鞘氨醇类碱的生产

<130>WO10498

<160>32

<170>PatentIn version3.3

<210>1

<211>4952

<212>DNA

<213>Pichia ciferrii

<220>

<221>CDS

<222>(1261)..(2550)

<223>Product：Pichia ciferrii ceramide synthase Lag1p

<400>1

ccacctaatt caggtttaat tataatagtt tcttgatata atttttgaaa ttcatttgat 60

gataacaagt catcttgacc ttgattctgg gttaataaag ttaataattt ttcaaccttt 120

cttgattgat ttaatattaa agtttctttt tcaacttcta attttaattc ttcaggagtt 180

ggatcatata atggagttac ataattaaaa ggaaataaac caatttctcc acgtaatgaa 240

cctttccccc aatctttata aacacgatct aatactgtaa ttatatcacc tttacggaaa 300

tgtaaatctg caggatcttg actaaatgaa tcatatagag cacggaccct agagaatgaa 360

ggttgtgctt ttgagattgg tggaggttgt tgaactggag cttgttgttg ttgttgctgt 420

tgttgctgtt gttgttgttg aatatcttgt tgagttggaa ttgaagcttg attattttca 480

cttagggata atgcaatagc agctttcaaa tcttcttctt ctttaatacg atcattatct 540

aaatttctct tttgaggttt atcaggaggg aaatattgtg aataaaactt ttccacctcg 600

ttattagcat cttggatagg tctcagtgaa ggatcatttg caaatgaatc agataattgt 660

ttgataactt ggacaatctt gattttaatt tccttatgta ctgtgggttc tcttaactta 720

ttcaacaata ttgaagtgaa tcctctagtg gcaatttcct gtttaactct tgaaccacaa 780

ttctcagcaa tcgaagtgag taaacttagt gatctcaatt gaacattagc atctctttga 840

cccaaccttg tggaaaccaa ttgaataact tgttttgaac cttcttccgg ttcttcacca 900

accaagtcac aaacatcaag aataaactgc caattgtccg ccaacaacgt cgcatccgtt 960

gccttctcca ctgcgttctt caactgttca ctataatctc tgaccatgat atcctgttga 1020

gcttctgtct aatctctgtc tagcttccct ttggcttccc tttggctccc ttcaactccc 1080

tttaaattta aatcaacgcc tctttttaaa acacgtaaaa gaattcgcga attttaacgg 1140

tttcggtttt ttttcaaata ggggaaattt aaaatttaaa tgaaaacatc aacaaaatga 1200

ttttaagtac tttgactatt cattggtttt aattgattgt tcagctggtt atttgtctca 1260

atg tcc act tcc aga cca cag ttc aac cgt cgc aga act tct tct gtc 1308

Met Ser Thr Ser Arg Pro Gln Phe Asn Arg Arg Arg Thr Ser Ser Val

1 5 10 15

ggc aaa atc gac ttg ggt gat aca aga gta cgt tca ttc tca act tca 1356

Gly Lys Ile Asp Leu Gly Asp Thr Arg Val Arg Ser Phe Ser Thr Ser

20 25 30

cgt act tca cat caa aga aat gct tca gat tca aga gtt aat gaa tta 1404

Arg Thr Ser His Gln Arg Asn Ala Ser Asp Ser Arg Val Asn Glu Leu

35 40 45

tca aat tat tcc aag act gat tta gaa att ata aca aaa att aaa act 1452

Ser Asn Tyr Ser Lys Thr Asp Leu Glu Ile Ile Thr Lys Ile Lys Thr

50 55 60

ggt cta gtt gaa tta agt tat cgt cac aca tgg gct tta cct gct ttg 1500

Gly Leu Val Glu Leu Ser Tyr Arg His Thr Trp Ala Leu Pro Ala Leu

65 70 75 80

atc ttg tta att gtt tat act gct tat ttc act tca ggt aat tat aca 1548

Ile Leu Leu Ile Val Tyr Thr Ala Tyr Phe Thr Ser Gly Asn Tyr Thr

85 90 95

gaa tca aat ttt tta cac atg ttt gta tca ata tca tat caa atc cct 1596

Glu Ser Asn Phe Leu His Met Phe Val Ser Ile Ser Tyr Gln Ile Pro

100 105 110

ggt aca aat caa tat gat aaa ggt att aaa gat tta gca ttt gtg cta 1644

Gly Thr Asn Gln Tyr Asp Lys Gly Ile Lys Asp Leu Ala Phe Val Leu

115 120 125

ttt tat atg att ttt ttc aca ttt ttc aga gaa ttt tgt atg gaa gtt 1692

Phe Tyr Met Ile Phe Phe Thr Phe Phe Arg Glu Phe Cys Met Glu Val

130 135 140

ata tta cgt ccc ctt gca cca att gtt ggt gtt aaa aaa cct tct aaa 1740

Ile Leu Arg Pro Leu Ala Pro Ile Val Gly Val Lys Lys Pro Ser Lys

145 150 155 160

atc aag aga ttt atg gaa caa tct tat tct gtt att tat tct ggt tta 1788

Ile Lys Arg Phe Met Glu Gln Ser Tyr Ser Val Ile Tyr Ser Gly Leu

165 170 175

tca ggt cct ttt ggt ctt tat gtt atg tat gga act gat tta tgg tta 1836

Ser Gly Pro Phe Gly Leu Tyr Val Met Tyr Gly Thr Asp Leu Trp Leu

180 185 190

ttt aga act gat act atg tat gca aca tat cca gat tta aca aat gat 1884

Phe Arg Thr Asp Thr Met Tyr Ala Thr Tyr Pro Asp Leu Thr Asn Asp

195 200 205

tac ttg tac aaa tta ttt tat tta ggt caa gct gca ttt tgg tgt caa 1932

Tyr Leu Tyr Lys Leu Phe Tyr Leu Gly Gln Ala Ala Phe Trp Cys Gln

210 215 220

caa tct gtt atc ttg ata tta caa gtt gaa aaa cca aga aaa gat ttc 1980

Gln Ser Val Ile Leu Ile Leu Gln Val Glu Lys Pro Arg Lys Asp Phe

225 230 235 240

aaa gaa tta gtc ttg cat cat att gtt aca att tta atg att tgg tta 2028

Lys Glu Leu Val Leu His His Ile Val Thr Ile Leu Met Ile Trp Leu

245 250 255

tca tat gtt ttc cat ttc acc aaa atg gga tta gca att tat att aca 2076

Ser Tyr Val Phe His Phe Thr Lys Met Gly Leu Ala Ile Tyr Ile Thr

260 265 270

atg gat gtt tca gat ttt ttc ctt gca gtt tcc aag aat tta aat tat 2124

Met Asp Val Ser Asp Phe Phe Leu Ala Val Ser Lys Asn Leu Asn Tyr

275 280 285

tta gat tct ccg tta aca atg cct tgg ttt atc ctt ttt gtt ata tca 2172

Leu Asp Ser Pro Leu Thr Met Pro Trp Phe Ile Leu Phe Val Ile Ser

290 295 300

tgg att tat tta cgt cat tat att aat tta aaa att tta tgg tca gtt 2220

Trp Ile Tyr Leu Arg His Tyr Ile Asn Leu Lys Ile Leu Trp Ser Val

305 310 315 320

tta aca gaa ttt aga aca gtg gga gat ttt aaa tta aat ttt gca act 2268

Leu Thr Glu Phe Arg Thr Val Gly Asp Phe Lys Leu Asn Phe Ala Thr

325 330 335

caa caa tat aaa tgt tgg att tca tta cca att gta ttt gta tta att 2316

Gln Gln Tyr Lys Cys Trp Ile Ser Leu Pro Ile Val Phe Val Leu Ile

340 345 350

ggt gct tta caa tta tta aat atg tat tgg tta ttc tta att tta aga 2364

Gly Ala Leu Gln Leu Leu Asn Met Tyr Trp Leu Phe Leu Ile Leu Arg

355 360 365

att ctt tat aga ttt atc ttt ggt act ggt gtt gtg gaa gat gat cgt 2412

Ile Leu Tyr Arg Phe Ile Phe Gly Thr Gly Val Val Glu Asp Asp Arg

370 375 380

agt gat gat gaa agt gaa gat agt gaa gat gtt caa tta gaa aat gat 2460

Ser Asp Asp Glu Ser Glu Asp Ser Glu Asp Val Gln Leu Glu Asn Asp

385 390 395 400

ggt gaa gaa tta tct aaa aat caa tca att caa tca cca cca gaa att 2508

Gly Glu Glu Leu Ser Lys Asn Gln Ser Ile Gln Ser Pro Pro Glu Ile

405 410 415

aca att gaa ttt aaa tct gat caa gaa aaa aag agt gaa taa 2550

Thr Ile Glu Phe Lys Ser Asp Gln Glu Lys Lys Ser Glu

420 425

gtcatcaact cataaaatca atttattgca tacaacatat tctcataatc atatatccca 26l0

catataaaaa aaaacaaaca taaatcacat aaacacacat aaaaacatat atatatcagc 2670

taatttttac ccattttttt gttcaacttg tcttatagaa gtatatatct aattcaaact 2730

taatcttaat aataatttat aatataattg tcgttgtagt tcttctacat ggattatatc 2790

gtatgtacca tttatttttc tatttacaaa acttatatga atgtataaag atatctaatt 2850

tgattcaatt tcttttggtg atttaccctt ttgtttatct tttaatcttt tttcaaaatc 2910

ttgttgattt tttttataat tttcaatctt attaatacgt ttctttgcac ccatttctgc 2970

agcttttgat aaaataccaa caattaaact tattgaacga actgaatcat cattacctgg 3030

aattggataa gtaacaagac ttgcctctga atcagtatca attaatccaa ttgttggaat 3090

tcttgattgt atacattcat taaccaagac tctattttca gttggattta aaataacaac 3150

taaatcaggt ttaacaatgg ctttttcttc atctgcattt aatgaacgat ttgttggaga 3210

atttaataaa tcaacttcat gacgtgacca agttgaaatt tctgtacaat ttgttatagt 3270

accaggaacc catcttgttg ccacgtaata accatttgat ctttttgcag ctaattctaa 3330

aggtcttctt aaattttctc ttgtaccaac atacaagata ataccaccac gttctgaaac 3390

tccttcaata atcttggaag cacgacgtaa atatgttaaa gtttgttcta aatcaataat 3450

atggattcct ttatatgaac caaggataaa tggttgattt gatgatctat ataatgaagt 3510

tgattgacct aaatgaacac ctgcagctaa taattttgaa attgaaacat ctttaatagt 3570

tgccggataa aaaacatcat gatgtggtaa ataaacattt tttaaattag aacctaattg 3630

atcaacattt gatttagaat gttgacgacg taaatataat tcttgatttg tataagattc 3690

ttccttggtg gaaggtatta aatatgggaa atctttattt ggaccttttt gaacttgaac 3750

agatttttct ggtaaaaatt tatcattaac taaatcatca aataattttt gtaattcatt 3810

ttttaatttt ttattttgtg ctaatttaga atttaattca tttgatgatc cattattaaa 3870

taaaatatca ataatttgtt gatcaatttt ttcagcttct tcttttggaa ctttaacaaa 3930

acttgaatct tcaacaattt cttgatttgg ggtgcctgcg gctaaagttt gttcattaac 3990

tggtgaatct tgaacaagtt gtggatttat tgtttgatct tttgttatag tatttaatct 4050

ttttatacta gttgataaat gacgaatggg cgctgggaat ttgttagaat taaatcaata 4110

aagagtggaa ataagaatat actcacttag tcttcgactg aacatgctca tcttgtaaaa 4170

ataatctatt agttcttcac aagtcttcct ttttctattt gaaacttctt caatatttca 4230

ttttgtttat ttcaataatt ttccaatttt ttcaatgggt attaattttc gcgaatttcg 4290

atgattttga ttttttttac ccggtgttga acttttcaaa taattaacta ctataaaaga 4350

attgaaacat cacttgaaaa agtggttatt ctgagtggtc tctgagtgat ctaagtggtc 4410

ttagtggttg gttatgcagt tgtttactgg ttcttttgac caatttgtgg acaaaatagt 4470

tggattacga gaatctgcaa cattaattat atgtaatatt gatcaagatt tatcaatact 4530

tccaaatttt catagatcaa gtattgaata tctttataat tcgaaatttg ttgaagttat 4590

ttatattgat actagtcaga aattattagt ttatttggct aatcaagaat tagaacaatt 4650

gaatggtgaa attaatggta atttatttat ttgggattta ccatgtcttg atttaatttg 4710

ttcaaaatta tgtaaattga ataatatttg tttaattggt tcatcaggta ataatcctga 4770

attcttatca atgattgaaa aatggatacg atgaattgaa aatcaatttt tgaaccccca 4830

gaaaaagaat ttatttttat tttaaaatgc tattatacaa atatgatcta tactcaagtg 4890

aatttatttt tcttccatat taagatcaac aattttaatt tcagatgttt cattatcata 4950

at 4952

<210>2

<211>429

<212>PRT

<213>Pichia ciferrii

<400>2

Met Ser Thr Ser Arg Pro Gln Phe Asn Arg Arg Arg Thr Ser Ser Val

1 5 10 15

Gly Lys Ile Asp Leu Gly Asp Thr Arg Val Arg Ser Phe Ser Thr Ser

20 25 30

Arg Thr Ser His Gln Arg Asn Ala Ser Asp Ser Arg Val Asn Glu Leu

35 40 45

Ser Asn Tyr Ser Lys Thr Asp Leu Glu Ile Ile Thr Lys Ile Lys Thr

50 55 60

Gly Leu Val Glu Leu Ser Tyr Arg His Thr Trp Ala Leu Pro Ala Leu

65 70 75 80

Ile Leu Leu Ile Val Tyr Thr Ala Tyr Phe Thr Ser Gly Asn Tyr Thr

85 90 95

Glu Ser Asn Phe Leu His Met Phe Val Ser Ile Ser Tyr Gln Ile Pro

100 105 110

Gly Thr Asn Gln Tyr Asp Lys Gly Ile Lys Asp Leu Ala Phe Val Leu

115 120 125

Phe Tyr Met Ile Phe Phe Thr Phe Phe Arg Glu Phe Cys Met Glu Val

130 135 140

Ile Leu Arg Pro Leu Ala Pro Ile Val Gly Val Lys Lys Pro Ser Lys

145 150 155 160

Ile Lys Arg Phe Met Glu Gln Ser Tyr Ser Val Ile Tyr Ser Gly Leu

165 170 175

Ser Gly Pro Phe Gly Leu Tyr Val Met Tyr Gly Thr Asp Leu Trp Leu

180 185 190

Phe Arg Thr Asp Thr Met Tyr Ala Thr Tyr Pro Asp Leu Thr Asn Asp

195 200 205

Tyr Leu Tyr Lys Leu Phe Tyr Leu Gly Gln Ala Ala Phe Trp Cys Gln

210 215 220

Gln Ser Val Ile Leu Ile Leu Gln Val Glu Lys Pro Arg Lys Asp Phe

225 230 235 240

Lys Glu Leu Val Leu His His Ile Val Thr Ile Leu Met Ile Trp Leu

245 250 255

Ser Tyr Val Phe His Phe Thr Lys Met Gly Leu Ala Ile Tyr Ile Thr

260 265 270

Met Asp Val Ser Asp Phe Phe Leu Ala Val Ser Lys Asn Leu Asn Tyr

275 280 285

Leu Asp Ser Pro Leu Thr Met Pro Trp Phe Ile Leu Phe Val Ile Ser

290 295 300

Trp Ile Tyr Leu Arg His Tyr Ile Asn Leu Lys Ile Leu Trp Ser Val

305 310 315 320

Leu Thr Glu Phe Arg Thr Val Gly Asp Phe Lys Leu Asn Phe Ala Thr

325 330 335

Gln Gln Tyr Lys Cys Trp Ile Ser Leu Pro Ile Val Phe Val Leu Ile

340 345 350

Gly Ala Leu Gln Leu Leu Asn Met Tyr Trp Leu Phe Leu Ile Leu Arg

355 360 365

Ile Leu Tyr Arg Phe Ile Phe Gly Thr Gly Val Val Glu Asp Asp Arg

370 375 380

Ser Asp Asp Glu Ser Glu Asp Ser Glu Asp Val Gln Leu Glu Asn Asp

385 390 395 400

Gly Glu Glu Leu Ser Lys Asn Gln Ser Ile Gln Ser Pro Pro Glu Ile

405 410 415

Thr Ile Glu Phe Lys Ser Asp Gln Glu Lys Lys Ser Glu

420 425

<210>3

<211>4195

<212>DNA

<213>Pichia ciferrii

<220>

<221>CDS

<222>(1219)..(2376)

<223>Product：Pichia ciferri i ceramide synthase Laf1p

<400>3

gaagaatgtc cwcaacatat aagaactatt gtttcagaag caagaaatct ttggccagaa 60

tatataccac atgatgcaac aaaagttgca gaatttgaat tttatttaat tgaagaaatg 120

gatacttatt taattgttca tcatccttat agatctttat tacttataaa tgaagtttta 180

tcaaattata atcaatcaca taaatcagag ggtcataatc ataataataa tagcaataac 240

aataatgaca cttcacaacc atttgcatta tcaccagaag aattacaatc atgctggtca 300

attataaatg atagttatgt tacagattta cctttaattc atgcaccaca tattatagca 360

tcagcttcaa tttttttaac tatagtacta aaatataatc atttaaaaca tatttccaaa 420

gattcattaa agaattcaaa accaaataca atgataactg aagaatatct taaaagtgga 480

tttttaaaga attttattaa atttttaggt tattcaaata tagatctcgg aggtgttata 540

gaagctgttc aagaattaat aacactttat gaaatatggg aaacttatga tgaatcaagt 600

tgtaaaaaac cattagaatc agttctttta aatagataaa tacccataca aaacaataca 660

attaaaacca aatcaggtaa ttaaatattg aaatttgata gttaccctta tgaaatcatc 720

cgcgaatttt agattttcgg tgctttttat ttttttttat tttttttttg ttggtttgat 780

ttttttcttg aaaaaagaag gatacgctgt cagaatttta aaagacgttg agaaataaat 840

tttaagatct ttgataagaa ttttgttttg tgctgttatt atttgttcag gggatcatca 900

tatgctggta gttcaggttt aggctcatag gtttaggtat ctcatcactg gtttttgtta 960

ttcttcgttc gttcattcat tgttcccacg cgttgcattt agatctcagg taccattatt 1020

tcaagatcta gaagtcctcc aaaaacgtca atacaattca aatcattaag aatatattca 1080

ttcattagac cactataaca ggtgtctatt ctatttattt aatctcattt tcattatcat 1140

tttcattcat tattaaaaca atttagtcac gtgattagat ctataattat aaatatcatc 1200

aaatatcatt attatatt atg att tca act tca aca aat tca tca tct aaa 1251

Met Ile Ser Thr Ser Thr Asn Ser Ser Ser Lys

1 5 10

aag aat gaa act act ata tct caa gtt aga tta tca gat tct tca agt 1299

Lys Asn Glu Thr Thr Ile Ser Gln Val Arg Leu Ser Asp Ser Ser Ser

15 20 25

gat tca tca tca tat gaa gat gaa aaa tta gat ata aaa tca gaa gaa 1347

Asp Ser Ser Ser Tyr Glu Asp Glu Lys Leu Asp Ile Lys Ser Glu Glu

30 35 40

ggt tta ata tca gaa cat caa gaa caa ata aaa caa cat aat caa act 1395

Gly Leu Ile Ser Glu His Gln Glu Gln Ile Lys Gln His Asn Gln Thr

45 50 55

aaa act tac aaa aca aat aaa att gat aaa tat caa att gaa att tct 1443

Lys Thr Tyr Lys Thr Asn Lys Ile Asp Lys Tyr Gln Ile Glu Ile Ser

60 65 70 75

tta att gcc tta ata ata tta aat tta tta aat aaa ttt gaa aat ttc 1491

Leu Ile Ala Leu Ile Ile Leu Asn Leu Leu Asn Lys Phe Glu Asn Phe

80 85 90

caa cct tat aca cat aaa ttt tta caa tta caa tat aaa tat cct gaa 1539

Gln Pro Tyr Thr His Lys Phe Leu Gln Leu Gln Tyr Lys Tyr Pro Glu

95 100 105

aca aat tat tat gat att ggt aaa gat gat att tat gtt gtt atc aca 1587

Thr Asn Tyr Tyr Asp Ile Gly Lys Asp Asp Ile Tyr Val Val Ile Thr

110 115 120

ggg atg ttt gct gca act ttt ata aga gct ttt tca atg cat tat ata 1635

Gly Met Phe Ala Ala Thr Phe Ile Arg Ala Phe Ser Met His Tyr Ile

125 130 135

tta aaa cct tta gca aaa ttt aat aaa att tat tca caa aag gat aaa 1683

Leu Lys Pro Leu Ala Lys Phe Asn Lys Ile Tyr Ser Gln Lys Asp Lys

140 145 150 155

caa aga ttt atg gaa caa ggt tgg tgt gta atg tta tat gct tca tct 1731

Gln Arg Phe Met Glu Gln Gly Trp Cys Val Met Leu Tyr Ala Ser Ser

160 165 170

ttt agt gtt gga tct tgg tta tat tat cat tca tca tat ttc aac aat 1779

Phe Ser Val Gly Ser Trp Leu Tyr Tyr His Ser Ser Tyr Phe Asn Asn

175 180 185

ttt gat aat ttt tat ata aat tgg cct cat gat gaa atg tct gga tta 1827

Phe Asp Asn Phe Tyr Ile Asn Trp Pro His Asp Glu Met Ser Gly Leu

190 195 200

ttt aaa tta tat tat tta atg tca ata gca tca tgg tct caa caa att 1875

Phe Lys Leu Tyr Tyr Leu Met Ser Ile Ala Ser Trp Ser Gln Gln Ile

205 210 215

ttt aca tta aat att gaa gct aaa aga aaa gat cat tat caa atg ttt 1923

Phe Thr Leu Asn Ile Glu Ala Lys Arg Lys Asp His Tyr Gln Met Phe

220 225 230 235

agt cat cat ata att acc gtg gca tta gtt att gga tca tat tat tat 1971

Ser His His Ile Ile Thr Val Ala Leu Val Ile Gly Ser Tyr Tyr Tyr

240 245 250

tat ttt act aga att ggg aat gtt ata tta gtt ata atg gat ttt gtt 2019

Tyr Phe Thr Arg Ile Gly Asn Val Ile Leu Val Ile Met Asp Phe Val

255 260 265

gat att tta tta tca act gca aaa tta tta aaa tat tgt ggt tat caa 2067

Asp Ile Leu Leu Ser Thr Ala Lys Leu Leu Lys Tyr Cys Gly Tyr Gln

270 275 280

aat tta tgt gat ttt atg ttt ggt gtt ttc gta tta ggt tgg att gca 2115

Asn Leu Cys Asp Phe Met Phe Gly Val Phe Val Leu Gly Trp Ile Ala

285 290 295

tta aga cat ggt gtt tat aat tat att ttt tat cat gct gct aca aaa 2163

Leu Arg His Gly Val Tyr Asn Tyr Ile Phe Tyr His Ala Ala Thr Lys

300 305 310 315

gca aga gat ctt atg gtt tca ggt aga tgt att gat gga tta att caa 2211

Ala Arg Asp Leu Met Val Ser Gly Arg Cys Ile Asp Gly Leu Ile Gln

320 325 330

aaa aga tgt tat act gat cga att gtt gat gtt ttt tta tct tta ttg 2259

Lys Arg Cys Tyr Thr Asp Arg Ile Val Asp Val Phe Leu Ser Leu Leu

335 340 345

gga ggt tta caa atc att aca ttg att tgg atg tat tta att gct aaa 2307

Gly Gly Leu Gln Ile Ile Thr Leu Ile Trp Met Tyr Leu Ile Ala Lys

350 355 360

gtt att ata aaa gtt tta aca ggt aat ggt gct gat gat gtt aga agt 2355

Val Ile Ile Lys Val Leu Thr Gly Asn Gly Ala Asp Asp Val Arg Ser

365 370 375

gat gat gaa gat gat gat tag attatgaacc catttaattc attacataga 2406

Asp Asp Glu Asp Asp Asp

380 385

taaacatttt tttttcaatt cgtacctgtt tttattcatt gcatttattt tattatatat 2466

catgttttaa taaaaagttt aagtatctat attaaacttg tctgtatttt ttaatagtat 2526

aaagttgcaa aaactgatgc aatcataact ataaatccaa atatagttaa acttaaactt 2586

aatgatttat taatatcatt atctggaaat aatttaaacc caaataaacc tggtaatata 2646

aaacaaatta atgttgaacc agtggcacca actaatgata atactaattc aaatgattta 2706

attgataatg ctaatccata tgtacccaaa gttaataaag tagtaactaa tacaaatcta 2766

tttgttgaaa atggaacttc atcatttgat tcattaatac cagattcttc atcattaatt 2826

aatccagttc tttcattaac aactgttgat gtggttttat ttttagatat ttcttgttga 2886

atccaatgaa tcatattatt tgttgataaa cgacatggat gaaacattaa tggataagat 2946

aaagtaacca ttaatacaag agcaaattta ccaatttttg aacttaataa tttactttta 3006

tattctaata taacattccc atgaacatta tcaccaaatt gtaaataacc tgcaaatcca 3066

acacttaaga acaataaact tgcaattaaa tttgctaaag tgataacttt tggaacttgt 3126

gattgatcat taatttcatt tataatagaa caaatgtttt gtgcagcagt gaatgcaaat 3186

accacaatgg aaaaagttga aaggatttga gatattgaac caatttctaa tattttaaca 3246

tgaccttgac tcttggacca atcatcccat attgaatgag aaataaccaa tattgttaaa 3306

taaccaattg ccaataatcc aattaaagaa ccaattttca aagaatctaa ttttctaaaa 3366

ctgattaaag gtatgatgat aatcaaacta agcaatataa cttgatttct actcaatact 3426

tcattaatta aacttggaac caaatcacca atcaatacta aataacttaa agccacacca 3486

aaacattgaa ttgcaataga aaaatcaaaa atcaaagtca atttaggata agttatacca 3546

caaagagcaa aatatgaagt atcaccaggt aattttttac taacttgact aacaatataa 3606

agaccataag aagatgcaat accagcaatt aaaattaata tagtacctaa tatcaaacca 3666

tcagctttga aagcgaaagg aattgccagg agacctgctc cgatgattgt tttggttaaa 3726

ttgatgactg atgattgaac agaagccatt ttaaacaact tgaacccctt tttgaatcaa 3786

caataataag ttgatctttt tgatggaaag tttggaatgt tcttattgtt ttgatggttt 3846

tgttttgatt ttggtgaaga agagcgcgaa tatttttgtt tatatacaag agaaaaaaga 3906

tcaaatttac ttgaagattt atttaataaa gacagaaggt gatcatgagt gagtacaagg 3966

tgacgaagaa gaagagtcgg ctggtggcac cggagaacag acagagagca gcgttcagtt 4026

gtgacaggtg caagactaaa aagatcaagt gcaagaggat tggtgacggt ggagatggta 4086

atggtaatgg taatggttca cggtgtatga gttgtgataa gttaggattg gaatgcttga 4146

caagtatacc cagaagaaga agggtttata gctcatatga gaatttagg 4195

<210>4

<211>385

<212>PRT

<213>Pichia ciferrii

<400>4

Met Ile Ser Thr Ser Thr Asn Ser Ser Ser Lys Lys Asn Glu Thr Thr

1 5 10 15

Ile Ser Gln Val Arg Leu Ser Asp Ser Ser Ser Asp Ser Ser Ser Tyr

20 25 30

Glu Asp Glu Lys Leu Asp Ile Lys Ser Glu Glu Gly Leu Ile Ser Glu

35 40 45

His Gln Glu Gln Ile Lys Gln His Asn Gln Thr Lys Thr Tyr Lys Thr

50 55 60

Asn Lys Ile Asp Lys Tyr Gln Ile Glu Ile Ser Leu Ile Ala Leu Ile

65 70 75 80

Ile Leu Asn Leu Leu Asn Lys Phe Glu Asn Phe Gln Pro Tyr Thr His

85 90 95

Lys Phe Leu Gln Leu Gln Tyr Lys Tyr Pro Glu Thr Asn Tyr Tyr Asp

100 105 110

Ile Gly Lys Asp Asp Ile Tyr Val Val Ile Thr Gly Met Phe Ala Ala

115 120 125

Thr Phe Ile Arg Ala Phe Ser Met His Tyr Ile Leu Lys Pro Leu Ala

130 135 140

Lys Phe Asn Lys Ile Tyr Ser Gln Lys Asp Lys Gln Arg Phe Met Glu

145 150 155 160

Gln Gly Trp Cys Val Met Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Ser Val Gly Ser

165 170 175

Trp Leu Tyr Tyr His Ser Ser Tyr Phe Asn Asn Phe Asp Asn Phe Tyr

180 185 190

Ile Asn Trp Pro His Asp Glu Met Ser Gly Leu Phe Lys Leu Tyr Tyr

195 200 205

Leu Met Ser Ile Ala Ser Trp Ser Gln Gln Ile Phe Thr Leu Asn Ile

210 215 220

Glu Ala Lys Arg Lys Asp His Tyr Gln Met Phe Ser His His Ile Ile

225 230 235 240

Thr Val Ala Leu Val Ile Gly Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Phe Thr Arg Ile

245 250 255

Gly Asn Val Ile Leu Val Ile Met Asp Phe Val Asp Ile Leu Leu Ser

260 265 270

Thr Ala Lys Leu Leu Lys Tyr Cys Gly Tyr Gln Asn Leu Cys Asp Phe

275 280 285

Met Phe Gly Val Phe Val Leu Gly Trp Ile Ala Leu Arg His Gly Val

290 295 300

Tyr Asn Tyr Ile Phe Tyr His Ala Ala Thr Lys Ala Arg Asp Leu Met

305 310 315 320

Val Ser Gly Arg Cys Ile Asp Gly Leu Ile Gln Lys Arg Cys Tyr Thr

325 330 335

Asp Arg Ile Val Asp Val Phe Leu Ser Leu Leu Gly Gly Leu Gln Ile

340 345 350

Ile Thr Leu Ile Trp Met Tyr Leu Ile Ala Lys Val Ile Ile Lys Val

355 360 365

Leu Thr Gly Asn Gly Ala Asp Asp Val Arg Ser Asp Asp Glu Asp Asp

370 375 380

Asp

385

<210>5

<211>5106

<212>DNA

<213>Pichia ciferrii

<220>

<221>CDS

<222>(2283)..(4076)

<223>Product：Pichia ciferrii sphingolipid Delta8desaturase

<400>5

gagcatataa atatacccgt gaaggcatga cagttcatac taattttact cattaaatag 60

agctcaattt gattatatgt caaacttgta aagaaaaact atataagcct ccaagaatct 120

ttcatttcat tttatttttc tttcttcttc acttcagaat ttcataacat taaacattca 180

aaacatcaaa cattcataac atcaaacatt cataatcata taaacactta acatgacaga 240

accattagaa actaaacccc caagttcaac taagattcat aagtgtgtta cactcttact 300

taaagtcatc actgctgaaa cactatacaa cgctttaaaa aaaactggta ttgttacccc 360

tgatgcattc tgtgaaccta cacttgaaag tatctcacat tatcttgagc tttgctatga 420

tgaaaatatt caaccttacg ttacgaattt caattggaaa ctacaaaaag ttggactttg 480

gttaagatat catatttcaa agcctttcaa tttcttaaag attcctttga gctcttttca 540

tgagaaacat acaagttcaa tcatacgttt taaatcattc ttcaaatcaa ttaaagagaa 600

attatcattg acaaaaacat catcagttga agaacttcca tccacaaact tcaaatcatg 660

ttttcctatt gagatttggc ttttgattgt tgaaattggt gacgttgaac ctgcaaactt 720

gattagagtg aacaaagatt tgttccaagt atttgctcca gtggtttatc gctcaatcca 780

tttagacctt ttcattagtt caagtgagat tctcaaattg aatcattctc attgtatgaa 840

atttgcagac tcttgttatt tccaatcctc taatccatat caactttata acgattggaa 900

ggaaagtcaa cattctgatt ttgttttttg gatattagac atagggaatt cccaaatgag 960

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gtaatcagaa attttgaaga tgtctataaa tttctcatta gaaccatctt gaatgaaaac 1080

tctatatttt tcaagtatat tgaagagatt gcaactaaca tcaccgttat tgatgttgat 1140

gggtacaaca ctttaatcaa tggagatttt ggtcaaacac tcaaagatct ttcaggtggt 1200

gagtctcaac ttatttctct tgaaagtcgt gcattcaaaa cttttgaatt tgatcatgaa 1260

ctacataaga acccaatttt acaaggtgtt aaaattccag aagaagacta ttttgtcttt 1320

gagatgataa tggaagatga atcatctagg ttagcaactt gttctttccc agacaaccct 1380

ttctacagag aattggttat cataggtata ctcttagaca acaatcgaaa tgataagaag 1440

agaatgcaac taaatgcttc aaattttaca acagactcag atgcatttgc aatttggaag 1500

gatgaatgtt tatcactcca cgattatttt tcagaaggca aagctgaaga aaaaggtcct 1560

atttcaatag aagtaatgaa acataaattc atgaatgata ttcaaactaa tactttcttg 1620

actagattca tcaaatcctt agctttaaaa ggccgtaaag aagacttgaa aagaaacaca 1680

gtgatgattt ctggtgttga taaaatcacc agaggaagag acaggacgtt aagaggtaca 1740

tttattgatg aagacaatat cccctatatc aatcatccag tgatcacttt cattgatgac 1800

tgtacaacta agtgattcag caccacgaag tatatagata taaataaaaa tccatacaat 1860

aaacttcagc tgtctggttt gttaaagacc gcatctgatt tcaaccataa tagtgttact 1920

atatcatttg tggccaaatt ttgtcctctt ctggattacc tacgtaatta aagtttatag 1980

gtttgacaca ttctttagta tttggtattt gatttggttt gttaaagtat ttgatatagg 2040

gccctttctt aactatggtg tgtccccttt acaaatttga tctttttttg tatacgattc 2100

agatttcaca gccattctgt ttttaaaaaa acgttccatt ttgcaattaa acgaacttga 2160

cacagttgag atttggatca gatcacgcta ttttggtgaa ccagcagttg gtatataaga 2220

ctagagaagg gtcctgttga aaaaagctag gagctacaca gactggttag gaaagagttc 2280

aa atg tcc agt tcc aaa gtg ctc tcc aga ggt gaa atc gag cat cgt 2327

Met Ser Ser Ser Lys Val Leu Ser Arg Gly Glu Ile Glu His Arg

1 5 10 15

atc gct tta ggt gat gcc att gtg atc ttt gaa aac tct gtg ctt cga 2375

Ile Ala Leu Gly Asp Ala Ile Val Ile Phe Glu Asn Ser Val Leu Arg

20 25 30

atg aac aag tgg ttg aag ttc cat cct ggt ggt gat aag gcc gtg ttc 2423

Met Asn Lys Trp Leu Lys Phe His Pro Gly Gly Asp Lys Ala Val Phe

35 40 45

cat ttg gtc ggg aga gat gct act gat gag atg att gcg tac cat tgt 2471

His Leu Val Gly Arg Asp Ala Thr Asp Glu Met Ile Ala Tyr His Cys

50 55 60

gat gag acc caa gcc acg ttc aaa aga tgg aag att ggt gaa atc aat 2519

Asp Glu Thr Gln Ala Thr Phe Lys Arg Trp Lys Ile Gly Glu Ile Asn

65 70 75

tat aaa tgg atc aat ttt gtg ccg cct att caa ggt ggg aag ttc aga 2567

Tyr Lys Trp Ile Asn Phe Val Pro Pro Ile Gln Gly Gly Lys Phe Arg

80 85 90 95

act tta gaa gaa caa gag ttg gat gaa att aaa gag gaa caa ctg agt 2615

Thr Leu Glu Glu Gln Glu Leu Asp Glu Ile Lys Glu Glu Gln Leu Ser

100 105 110

aga tca cca gct tca cca gct tca aat tca tct tca agt gaa gat ttg 2663

Arg Ser Pro Ala Ser Pro Ala Ser Asn Ser Ser Ser Ser Glu Asp Leu

115 120 125

aaa ctt tca tct tca act gat cca tca gat gtt gag gat tct att gat 2711

Lys Leu Ser Ser Ser Thr Asp Pro Ser Asp Val Glu Asp Ser Ile Asp

130 135 140

aca aag gcc gag tcc tca tca aat tat gca aaa caa caa caa caa aaa 2759

Thr Lys Ala Glu Ser Ser Ser Asn Tyr Ala Lys Gln Gln Gln Gln Lys

145 150 155

caa caa caa cca aaa tta aac acc aca gcg ggt caa tgc tca gaa gtc 2807

Gln Gln Gln Pro Lys Leu Asn Thr Thr Ala Gly Gln Cys Ser Glu Val

160 165 170 175

acc aaa cca aag ata cca caa gga ctt ata ccg tct tta tca aca aaa 2855

Thr Lys Pro Lys Ile Pro Gln Gly Leu Ile Pro Ser Leu Ser Thr Lys

180 185 190

gaa gca tat gaa agg aaa gtt gtt aaa gat cca agt gat gtt att gat 2903

Glu Ala Tyr Glu Arg Lys Val Val Lys Asp Pro Ser Asp Val Ile Asp

195 200 205

aat tat gat aat ggt caa gtt gaa caa gat tta aaa tca tta cct tca 2951

Asn Tyr Asp Asn Gly Gln Val Glu Gln Asp Leu Lys Ser Leu Pro Ser

210 215 220

tta gat tat gaa act caa gaa cat tta tca aaa gaa tat aat aaa tta 2999

Leu Asp Tyr Glu Thr Gln Glu His Leu Ser Lys Glu Tyr Asn Lys Leu

225 230 235

cat gat ata att att gaa aat gga tgg tat caa tgt cct tat tgg gaa 3047

His Asp Ile Ile Ile Glu Asn Gly Trp Tyr Gln Cys Pro Tyr Trp Glu

240 245 250 255

tat gca aaa gaa gct aca aga att gca act tta ttt agt att tca ttc 3095

Tyr Ala Lys Glu Ala Thr Arg Ile Ala Thr Leu Phe Ser Ile Ser Phe

260 265 270

aca cta ctt tat ttt aaa tgg tat ttc ctt agt gca att ttc tta ggt 3143

Thr Leu Leu Tyr Phe Lys Trp Tyr Phe Leu Ser Ala Ile Phe Leu Gly

275 280 285

tta gca tgg caa caa tta gtt ttc att gca cat gat gca ggt cat atc 3191

Leu Ala Trp Gln Gln Leu Val Phe Ile Ala His Asp Ala Gly His Ile

290 295 300

tca ata aca cat caa tat gaa act gat aat ata att ggt atg att gtt 3239

Ser Ile Thr His Gln Tyr Glu Thr Asp Asn Ile Ile Gly Met Ile Val

305 310 315

gca tca ttc att ggt gga tta tca tta ggt tgg tgg aaa aga aat cat 3287

Ala Ser Phe Ile Gly Gly Leu Ser Leu Gly Trp Trp Lys Arg Asn His

320 325 330 335

aat gtt cat cat ctt ata aca aat gat cct gtt cat gat cct gat att 3335

Asn Val His His Leu Ile Thr Asn Asp Pro Val His Asp Pro Asp Ile

340 345 350

caa cat tta cca ttt ttt gca gtt tca aca aga tta ttt gga aat gtt 3383

Gln His Leu Pro Phe Phe Ala Val Ser Thr Arg Leu Phe Gly Asn Val

355 360 365

tat tca act tat tat gaa aaa ttt tta tgg ttt gat gca ttt gct aaa 3431

Tyr Ser Thr Tyr Tyr Glu Lys Phe Leu Trp Phe Asp Ala Phe Ala Lys

370 375 380

aaa tta att cca att caa caa ttt atg tat tat cca att tta tca ttt 3479

Lys Leu Ile Pro Ile Gln Gln Phe Met Tyr Tyr Pro Ile Leu Ser Phe

385 390 395

gga aga ttt aat ctt tat aga tta tca tgg gaa cat gtt tta ttt ggc 3527

Gly Arg Phe Asn Leu Tyr Arg Leu Ser Trp Glu His Val Leu Phe Gly

400 405 410 415

cag ggt cca aga cat ggt aaa gct gca tgg ttt aga tat ttt gaa tta 3575

Gln Gly Pro Arg His Gly Lys Ala Ala Trp Phe Arg Tyr Phe GIu Leu

420 425 430

gtt gga tta act ttt ttc aat tgg tgg ttt ttt tat tta att gtt tat 3623

Val Gly Leu Thr Phe Phe Asn Trp Trp Phe Phe Tyr Leu Ile Val Tyr

435 440 445

aaa tca att gaa tca aat tca tca aga ttt atg ttt gtt atg gtt agt 3671

Lys Ser Ile Glu Ser Asn Ser Ser Arg Phe Met Phe Val Met Val Ser

450 455 460

cat ata aca aca atg att gtt cat gtt caa atc act tta tca cat ttt 3719

His Ile Thr Thr Met Ile Val His Val Gln Ile Thr Leu Ser His Phe

465 470 475

gca atg tca aca tca gat tta gga act tca gaa agt ttt gta agt aga 3767

Ala Met Ser Thr Ser Asp Leu Gly Thr Ser Glu Ser Phe Val Ser Arg

480 485 490 495

caa ata aga aca aca atg gat gtt gat tgt cca gga tgg ttt gat ttt 3815

Gln Ile Arg Thr Thr Met Asp Val Asp Cys Pro Gly Trp Phe Asp Phe

500 505 510

ttc cat ggt gga tta caa ttt caa gct att cat cat tta ttc cca aga 3863

Phe His Gly Gly Leu Gln Phe Gln Ala Ile His His Leu Phe Pro Arg

515 520 525

gtt cca aga cat aat ttc aga aaa att caa cct tta gtt att gga ttt 3911

Val Pro Arg His Asn Phe Arg Lys Ile Gln Pro Leu Val Ile Gly Phe

530 535 540

tgt gat aaa gtt gga tta aaa tat tca att tat gga ttt gtt gat ggt 3959

Cys Asp Lys Val Gly Leu Lys Tyr Ser Ile Tyr Gly Phe Val Asp Gly

545 550 555

aat gaa gtt gtt att aat aaa tta tca gat att gct aaa caa gct aaa 4007

Asn Glu Val Val Ile Asn Lys Leu Ser Asp Ile Ala Lys Gln Ala Lys

560 565 570 575

att atg aga gat tgt cat aaa aca atg aaa aaa gaa gct att gaa gaa 4055

Ile Met Arg Asp Cys His Lys Thr Met Lys Lys Glu Ala Ile Glu Glu

580 585 590

gga aaa tac ttt gaa ttc tga aaaaagctga aagggaactg aaagactaga 4106

Gly Lys Tyr Phe Glu Phe

595

agcttcgcta atttatttat attaatacat atttatagat ctggatcaaa atattgtgta 4166

aagaatatgt tctgtatgaa ttgatcattt atattgttta tattgttgtt gtcttgaccg 4226

attctggcta tttttctttt agacaatata aaaacaaaac gtcattaata agagaatcat 4286

cagatcatca aatttagttc ataaaactca tactttatta gatcaacaat actcaattat 4346

agatcataat accaggttat aattgaagaa aatgcctgaa agtacattca ccaattcact 4406

caaaggtttt ttcaaaaaac aaaaatcgcc atctccatcc ccagaatcaa acacatcatc 4466

aaaatcacca agtataagga ataatgcatt attcatagaa gatccaccat taacacccct 4526

tgaacttcat ggatactcca aaactactaa aaacaagatt ctcacattgg aattgggtga 4586

agaaataagg aatatgttac cttcaagaca tcaagtttca tcaaattggg aattagttta 4646

tagtttagag caacatggag cctctttaaa cactttatat tcaaatatta aaccatcaac 4706

aaaatatgat aagaatggtt atttattagt gattaaagac caacgtggaa caatattggg 4766

gagttataca aatgaacatt ttcatccaac agatatgaag agattttatg ggaatggtga 4826

atgtttcctt tggaaatcaa aattaataga taataaagaa tctggagaga aatttataag 4886

atttcaagca ttcccatata caggattaaa tgatttcata atatattgta caagtaaatt 4946

cttatcttta ggtggtggtg atggtcatta tggactctgg attgatcaag aattattaca 5006

tggtgttagt gatcattctt taacttttgg aaatgaacca ttgagctctc aggggaataa 5066

gtttagtata ttaggtgttg aagtatggag aatatcatga 5106

<210>6

<211>597

<212>PRT

<213>Pichia ciferrii

<400>6

Met Ser Ser Ser Lys Val Leu Ser Arg Gly Glu Ile Glu His Arg Ile

1 5 10 15

Ala Leu Gly Asp Ala Ile Val Ile Phe Glu Asn Ser Val Leu Arg Met

20 25 30

Asn Lys Trp Leu Lys Phe His Pro Gly Gly Asp Lys Ala Val Phe His

35 40 45

Leu Val Gly Arg Asp Ala Thr Asp Glu Met Ile Ala Tyr His Cys Asp

50 55 60

Glu Thr Gln Ala Thr Phe Lys Arg Trp Lys Ile Gly Glu Ile Asn Tyr

65 70 75 80

Lys Trp Ile Asn Phe Val Pro Pro Ile Gln Gly Gly Lys Phe Arg Thr

85 90 95

Leu Glu Glu Gln Glu Leu Asp Glu Ile Lys Glu Glu Gln Leu Ser Arg

100 105 110

Ser Pro Ala Ser Pro Ala Ser Asn Ser Ser Ser Ser Glu Asp Leu Lys

115 120 125

Leu Ser Ser Ser Thr Asp Pro Ser Asp Val Glu Asp Ser Ile Asp Thr

130 135 140

Lys Ala Glu Ser Ser Ser Asn Tyr Ala Lys Gln Gln Gln Gln Lys Gln

145 150 155 160

Gln Gln Pro Lys Leu Asn Thr Thr Ala Gly Gln Cys Ser Glu Val Thr

165 170 175

Lys Pro Lys Ile Pro Gln Gly Leu Ile Pro Ser Leu Ser Thr Lys Glu

180 185 190

Ala Tyr Glu Arg Lys Val Val Lys Asp Pro Ser Asp Val Ile Asp Asn

195 200 205

Tyr Asp Asn Gly Gln Val Glu Gln Asp Leu Lys Ser Leu Pro Ser Leu

210 215 220

Asp Tyr Glu Thr Gln Glu His Leu Ser Lys Glu Tyr Asn Lys Leu His

225 230 235 240

Asp Ile Ile Ile Glu Asn Gly Trp Tyr Gln Cys Pro Tyr Trp Glu Tyr

245 250 255

Ala Lys Glu Ala Thr Arg Ile Ala Thr Leu Phe Ser Ile Ser Phe Thr

260 265 270

Leu Leu Tyr Phe Lys Trp Tyr Phe Leu Ser Ala Ile Phe Leu Gly Leu

275 280 285

Ala Trp Gln Gln Leu Val Phe Ile Ala His Asp Ala Gly His Ile Ser

290 295 300

Ile Thr His Gln Tyr Glu Thr Asp Asn Ile Ile Gly Met Ile Val Ala

305 310 315 320

Ser Phe Ile Gly Gly Leu Ser Leu Gly Trp Trp Lys Arg Asn His Asn

325 330 335

Val His His Leu Ile Thr Asn Asp Pro Val His Asp Pro Asp Ile Gln

340 345 350

His Leu Pro Phe Phe Ala Val Ser Thr Arg Leu Phe Gly Asn Val Tyr

355 360 365

Ser Thr Tyr Tyr Glu Lys Phe Leu Trp Phe Asp Ala Phe Ala Lys Lys

370 375 380

Leu Ile Pro Ile Gln Gln Phe Met Tyr Tyr Pro Ile Leu Ser Phe Gly

385 390 395 400

Arg Phe Asn Leu Tyr Arg Leu Ser Trp Glu His Val Leu Phe Gly Gln

405 410 415

Gly Pro Arg His Gly Lys Ala Ala Trp Phe Arg Tyr Phe Glu Leu Val

420 425 430

Gly Leu Thr Phe Phe Asn Trp Trp Phe Phe Tyr Leu Ile Val Tyr Lys

435 440 445

Ser Ile Glu Ser Asn Ser Ser Arg Phe Met Phe Val Met Val Ser His

450 455 460

Ile Thr Thr Met Ile Val His Val Gln Ile Thr Leu Ser His Phe Ala

465 470 475 480

Met Ser Thr Ser Asp Leu Gly Thr Ser Glu Ser Phe Val Ser Arg Gln

485 490 495

Ile Arg Thr Thr Met Asp Val Asp Cys Pro Gly Trp Phe Asp Phe Phe

500 505 510

His Gly Gly Leu Gln Phe Gln Ala Ile His His Leu Phe Pro Arg Val

515 520 525

Pro Arg His Asn Phe Arg Lys Ile Gln Pro Leu Val Ile Gly Phe Cys

530 535 540

Asp Lys Val Gly Leu Lys Tyr Ser Ile Tyr Gly Phe Val Asp Gly Asn

545 550 555 560

Glu Val Val Ile Asn Lys Leu Ser Asp Ile Ala Lys Gln Ala Lys Ile

565 570 575

Met Arg Asp Cys His Lys Thr Met Lys Lys Glu Ala Ile Glu Glu Gly

580 585 590

Lys Tyr Phe Glu Phe

595

<210>7

<211>3402

<212>DNA

<213>Pichia ciferrii

<220>

<221>CDS

<222>(917)..(1771)

<223>Product：Pichia ciferrii ceramidase Yxc1p

<400>7

gattttaatt ttaattgttt tgattttgat agtttataag gggctgctta tgtcagggat 60

tatgtaacag tgtatgggaa tatactttaa actaaaatat atgtaaatgt ttgtatgtga 120

tggatgtttt taaaatatat atttataatc agtggatcaa gaggattata attatgtaac 180

ttattaatgg tttaaaagtg gtttagaaat tgatgatatt gatttcatag attttataca 240

ctttaataat tttatatttg gtttagaaat gaaatattaa taaattaatg gaaaaaatta 300

aattattaac ttcaaaaatc aacaatttaa actaaacata atgaaattaa ttaaattaaa 360

aacattataa acattttatt aaatcattat ctatttaata tatatattta taatactaat 420

attaattctt cttataggta ttacataatc actgacataa gcagcaatca attgtactcg 480

tatataaaca ataaagaata aaactaaaca aaactaaaat aaataaaaac caattaaatc 540

aattatatat ataatcaata taataataat acaatataat tacttattat tttcaaatca 600

tttagtaatc atagtgttat taaaaagtcg aaattcggaa caaccggtgt gcttagtgca 660

gtaaattacc tcccttgttt gttttaccgc aaattacaca aattaaatta cctgaaatta 720

ctacttgtta cacttgttac tattaacaat tcaatacaaa agaaagaaga gaatcaagag 780

atcaatctca tagatttaaa atctaatcta atatcaattg tttatcaata ggataatcag 840

tttaccatca aaagatcatt gccccatata tcattaatac ccagacacaa tcggagtata 900

caacaacaac aacaaa atg tca tat cat tta cca ttt gct aaa cct tac ccc 952

Met Ser Tyr His Leu Pro Phe Ala Lys Pro Tyr Pro

1 5 10

aat gaa cca tat cat gct tat tgg aat caa gtc act tca aca ata gat 1000

Asn Glu Pro Tyr His Ala Tyr Trp Asn Gln Val Thr Ser Thr Ile Asp

15 20 25

tgg tgt gaa gaa aat tat att gtg act cca tat att gca gaa gct ata 1048

Trp Cys Glu Glu Asn Tyr Ile Val Thr Pro Tyr Ile Ala Glu Ala Ile

30 35 40

aat act ata tca aat tca att ttt ata tta tta gct gga ttt gcc atg 1096

Asn Thr Ile Ser Asn Ser Ile Phe Ile Leu Leu Ala Gly Phe Ala Met

45 50 55 60

ttt tct gca ttt aaa aat aat tta gaa ttg aga ttt ata ttg ata agt 1144

Phe Ser Ala Phe Lys Asn Asn Leu Glu Leu Arg Phe Ile Leu Ile Ser

65 70 75

ttt ggt ttt gct tta gtt ggt gtg gga agt tgg tta ttt cat atg act 1192

Phe Gly Phe Ala Leu Val Gly Val Gly Ser Trp Leu Phe His Met Thr

80 85 90

tta cat tat gag ttc caa tta tta gat gaa tta cca atg att tat gca 1240

Leu His Tyr Glu Phe Gln Leu Leu Asp Glu Leu Pro Met Ile Tyr Ala

95 100 105

act tgt atc cca atg tgg agt gtt ttc agt gaa ggt gtt tcc aag aaa 1288

Thr Cys Ile Pro Met Trp Ser Val Phe Ser Glu Gly Val Ser Lys Lys

110 115 120

aaa tca att aca att ggt att tct ata ata ttg ggt gca aat tta tta 1336

Lys Ser Ile Thr Ile Gly Ile Ser Ile Ile Leu Gly Ala Asn Leu Leu

125 130 135 140

act gca att tat tta tat tta aaa gat cca act gtt cat caa gtt gct 1384

Thr Ala Ile Tyr Leu Tyr Leu Lys Asp Pro Thr Val His Gln Val Ala

145 150 155

tat gcc tta tta aat gtt ttc att gtg ggg aaa tct cat tat tta aca 1432

Tyr Ala Leu Leu Asn Val Phe Ile Val Gly Lys Ser His Tyr Leu Thr

160 165 170

ata aaa aac att cat aat caa aca acc caa aaa caa tta ttt ata aca 1480

Ile Lys Asn Ile His Asn Gln Thr Thr Gln Lys Gln Leu Phe Ile Thr

175 180 185

atg att aaa gga att ggt att ttc ctt tct ggt tat ttc tta tgg aat 1528

Met Ile Lys Gly Ile Gly Ile Phe Leu Ser Gly Tyr Phe Leu Trp Asn

190 195 200

tta gat gtt cat ttt tgt aat tct tgg att tgg tta aga aga agt att 1576

Leu Asp Val His Phe Cys Asn Ser Trp Ile Trp Leu Arg Arg Ser Ile

205 210 215 220

ggt atg cct tat ggt ttc cta tta gaa tta cat gct tgg tgg cat gtt 1624

Gly Met Pro Tyr Gly Phe Leu Leu Glu Leu His Ala Trp Trp His Val

225 230 235

tta act ggt tta ggt gtt tat ttt tat att att tat tta gaa tta tta 1672

Leu Thr Gly Leu Gly Val Tyr Phe Tyr Ile Ile Tyr Leu Glu Leu Leu

240 245 250

aga att aat tta ttg ggg aaa caa gat gat tat gaa ttg att tat aaa 1720

Arg Ile Asn Leu Leu Gly Lys Gln Asp Asp Tyr Glu Leu Ile Tyr Lys

255 260 265

ttt gga ttt tta cct gaa gtt aaa tta tta aaa aag gat aaa aat gaa 1768

Phe Gly Phe Leu Pro Glu Val Lys Leu Leu Lys Lys Asp Lys Asn Glu

270 275 280

taa ttaatcaatc aacatgatca aatagcaatc aattagttca aatggcatga 1821

ttatttgata cacatattat ttatacttta tattgttctt tgttatgtgc cttctttttt 1881

gttatacctt tttatatcat aaatgctcct tttttaacaa aaactttata tatttataca 1941

tgaatagaat attggatgat tttaatgtaa tatttatgaa atattgctgt ttattaatca 2001

aaaatatacg aattgatatt ataattacgt ataatacgtt cctgggagtc aatttacaac 2061

aaaacattat atcaaacaag agtaaaatta aaaagtggta tgataattga ttatatcaat 2121

tgaaacttac atagatctta ttccaacttg aaagggttta gatcttttgt ctctttagat 2181

cttaacgaat aaacgtattt gaatctaact tcttgtttta atccttgttt gtgagatgat 2241

agatctaata atctaatcta taaaacaagg gtttgtaaat attcaaatta agaaggtaca 2301

agacgcttat gcttggtgat tatcctaggc attatcggat caatgtattc atactccgta 2361

ttaatccagg gtacaattag ttcatagtac atacactcca tagcctgtca aatatggaga 2421

gttcacgtag tttaggagtc aaagtaatta ctcgttaata ttacgcaatg gagatcttta 2481

aatgtcaaat cacaaaaact cgaaaatctt tcttaagaat ttaaaaattt taacttttta 2541

aattgatttg atttgttgaa tatatattct aacttgtaca cttatcataa ttgtgtaatt 2601

gattatctgt tgatcttatt taaaagtatt ttatacatta gtgtaaagta tgaaggcatt 2661

agtgaagaca tgaggcatga gggatatgag gcattgaaga gttcggttaa actgatgttg 2721

atttaaagaa caaattgaaa agtgtttaat tcaattcaat ccaattcaat tcaattcaat 2781

tgttaatgtt aatgatttat actcactgga tcaaagttta tccgatgatt tttatattaa 2841

ttttccgaat atcaaccttt taattttttc ctcaatcgaa gcgcgtttat ataaaagtaa 2901

acaaaccagt tttataatca tcatcaacga aaaatcactg aaactcgcgt cgtgtttttt 2961

cttgaattcc aagtactata tgatgatttt tggagaacaa gagcttcata catgatcgtt 3021

aagccttggg tatgatacga agaagtttga acaagacttg atgaactgat ttttttatca 3081

ttctataagc agtaatcata ttgatctata tgatccatgt tatcatgatt attgaaattt 3141

atataaatat tgatcaaaat cttctgattt aatattcaat atttttaaat gttgatcata 3201

aaccacaaag cttaaacaat gattactaaa atcttttcaa tatttttact tttcagttta 3261

gtaattgctg ctgataaaaa ttataataga cctcaattca tttacacctg aaaaaggttg 3321

gatgaatgat ccaaatggtc tttggtttga tcaaaaggat aaaatatggc atgctattat 3381

caaaaaatcc aaaatcaacg t 3402

<210>8

<211>284

<212>PRT

<213>Pichia ciferrii

<400>8

Met Ser Tyr His Leu Pro Phe Ala Lys Pro Tyr Pro Asn Glu Pro Tyr

1 5 10 15

His Ala Tyr Trp Asn Gln Val Thr Ser Thr Ile Asp Trp Cys Glu Glu

20 25 30

Asn Tyr Ile Val Thr Pro Tyr Ile Ala Glu Ala Ile Asn Thr Ile Ser

35 40 45

Asn Ser Ile Phe Ile Leu Leu Ala Gly Phe Ala Met Phe Ser Ala Phe

50 55 60

Lys Asn Asn Leu Glu Leu Arg Phe Ile Leu Ile Ser Phe Gly Phe Ala

65 70 75 80

Leu Val Gly Val Gly Ser Trp Leu Phe His Met Thr Leu His Tyr Glu

85 90 95

Phe Gln Leu Leu Asp Glu Leu Pro Met Ile Tyr Ala Thr Cys Ile Pro

100 105 110

Met Trp Ser Val Phe Ser Glu Gly Val Ser Lys Lys Lys Ser Ile Thr

115 120 125

Ile Gly Ile Ser Ile Ile Leu Gly Ala Asn Leu Leu Thr Ala Ile Tyr

130 135 140

Leu Tyr Leu Lys Asp Pro Thr Val His Gln Val Ala Tyr Ala Leu Leu

145 150 155 160

Asn Val Phe Ile Val Gly Lys Ser His Tyr Leu Thr Ile Lys Asn Ile

165 170 175

His Asn Gln Thr Thr Gln Lys Gln Leu Phe Ile Thr Met Ile Lys Gly

180 185 190

Ile Gly Ile Phe Leu Ser Gly Tyr Phe Leu Trp Asn Leu Asp Val His

195 200 205

Phe Cys Asn Ser Trp Ile Trp Leu Arg Arg Ser Ile Gly Met Pro Tyr

210 215 220

Gly Phe Leu Leu Glu Leu His Ala Trp Trp His Val Leu Thr Gly Leu

225 230 235 240

Gly ValTyr Phe Tyr Ile Ile Tyr Leu Glu Leu Leu Arg Ile Asn Leu

245 250 255

Leu Gly Lys Gln Asp Asp Tyr Glu Leu Ile Tyr Lys Phe Gly Phe Leu

260 265 270

Pro Glu Val Lys Leu Leu Lys Lys Asp Lys Asn Glu

275 280

<210>9

<211>288

<212>PRT

<213>Coccolithovirus

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(288)

<223>Coccolithovirus (Emiliana huxleyi virus86)ceramide synthase

(GenBank accession#YP_293768)

<400>9

Met Tyr Cys Gly Thr Ser Gly Leu Arg Asp Phe Met Tyr Ala Asp Ile

1 5 10 15

Met Glu Met Ala Gln Phe Ser Val Ile Met Phe Ser Phe Ala Thr Ile

20 25 30

Leu Arg Thr Phe Val Met Ile Tyr Ile Leu Asp Pro Leu Ser Glu Ile

35 40 45

Met Val Arg Pro Glu Arg Val Leu Lys Phe Gln Gln Ser Ala Trp Arg

50 55 60

Phe Val Leu Tyr Ser Ile Ala Thr Ile Ser Ser Ile Ile Val Phe Met

65 70 75 80

Thr Asp Asp Thr Val Asp Phe Lys Glu Ser Ser Phe Phe Glu Asn Trp

85 90 95

Pro Leu Tyr Asn Pro Gly Ser Gly Ile Lys Phe Met Tyr Ala Leu Tyr

100 105 110

Ala Gly Phe Tyr Ile His Gln Thr Val Tyr Ile Phe Gly Asp Glu Arg

115 120 125

Leu Asp Asp Phe Asn Glu His Val Phe His His Ala Ile Thr Leu Val

130 135 140

Leu Val Tyr Val Ser Trp Val Phe Asn Phe Thr Lys Ile Gly Phe Phe

145 150 155 160

Ile Met Thr Leu His Asp Gly Ser Asp Val Phe Leu Glu Leu Ala Lys

165 170 175

Cys Met Asn Tyr Ala Lys Glu Ile Arg Pro Arg Leu Ser Ile Ile Ser

180 185 190

Asp Val Ser Phe Ile Ile Phe Ala Ser Ser Phe Phe Tyr Leu Arg Leu

195 200 205

Tyr Leu Tyr Pro Val Tyr Ala Ile Gly Ser Ile Val Asn Pro Tyr Asp

210 215 220

Ala Cys Ala His Val Ser Cys Ala Leu Tyr Glu Gly Gly Val Ser Tyr

225 230 235 240

Ser Tyr Cys Ala Ser Lys Pro Ile Tyr Ala Val Ala Ile Ala Ala Leu

245 250 255

Thr Ser Leu Tyr Ile Leu Gln Val Met Trp Ala Gly Arg Ile Ile Asn

260 265 270

Val Ile Ala Lys Val Ile Ala Gly Asn Pro Leu Glu Asp Ser Arg Asp

275 280 285

<210>10

<211>414

<212>PRT

<213>Mus musculus

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(414)

<223>Mouse ceramide synthase LASS5(GenBank accession#AAH43059)

<400>10

Met Ala Thr Ala Ala Ala Glu Thr Leu Gly Leu Leu Trp Gly Trp Leu

1 5 10 15

Trp Ser Glu Ser Phe Trp Leu Pro Gln Asn Val Ser Trp Ala Asp Leu

20 25 30

Glu Gly Pro Gly Asp Gly Tyr Gly Tyr Pro Arg Ala Gln His Val Leu

35 40 45

Ser Val Phe Pro Leu Ala Val Cys Ile Phe Ser Val Arg Met Leu Phe

50 55 60

Glu Arg Phe Ile Ala Lys Pro Cys Ala Leu Arg Val Gly Ile Lys Asp

65 70 75 80

Ser Pro Val Asn Lys Val Glu Pro Asn Asp Thr Leu Glu Lys Val Phe

85 90 95

Val Ser Val Thr Lys Tyr Pro Asp Glu Lys Arg Leu Lys Gly Leu Ser

100 105 110

Lys Gln Leu Asp Trp Ser Val Arg Lys Ile Gln Cys Trp Phe Arg His

115 120 125

Arg Arg Asn Gln Asp Lys Pro Pro Thr Leu Thr Lys Phe Cys Glu Ser

130 135 140

Met Trp Arg Phe Thr Tyr Tyr Leu Cys Ile Phe Cys Tyr Gly Ile Arg

145 150 155 160

Phe Leu Trp Ser Met Pro Trp Phe Trp Asp Thr Arg Gln Cys Trp Tyr

165 170 175

Asn Tyr Pro Tyr Gln Pro Leu Ser Arg Glu Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Ile

180 185 190

Thr Gln Leu Ala Phe Tyr Trp Ser Leu Met Phe Ser Gln Phe Ile Asp

195 200 205

Val Lys Arg Lys Asp Phe Leu Met Met Phe Ile His His Met Ile Gly

210 215 220

Ile Met Leu Thr Thr Phe Ser Tyr Val Asn Asn Met Val Arg Val Gly

225 230 235 240

Ala Leu Ile Phe Cys Leu His Asp Phe Ala Asp Pro Leu Leu Glu Ala

245 250 255

Ala Lys Met Ala Asn Tyr Ala Arg Arg Glu Arg Leu Cys Thr Thr Leu

260 265 270

Phe Val Ile Phe Gly Ala Ala Phe Ile Val Ser Arg Leu Ala Ile Phe

275 280 285

Pro Leu Trp Ile Leu Asn Thr Thr Leu Phe Glu Ser Trp Glu Ile Ile

290 295 300

Gly Pro Tyr Pro Ser Trp Trp Leu Phe Asn Ala Leu Leu Leu Ile Leu

305 310 315 320

Gln Val Leu His Ala Ile Trp Ser Tyr Leu Ile Val Gln Thr Ala Ser

325 330 335

Lys Ala Leu Ser Arg Gly Lys Val Ser Lys Asp Asp Arg Ser Asp Val

340 345 350

Glu Ser Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu Thr Thr His Lys Asn Asn Leu

355 360 365

Ser Gly Ser Ser Ser Ser Asn Gly Ala Asn Cys Met Asn Gly Tyr Met

370 375 380

Gly Gly Ser His Leu Ala Glu Glu Gln Gly Thr Cys Lys Ala Thr Gly

385 390 395 400

Asn Leu His Phe Arg Ala Ser Pro His Leu His Ser Cys Asp

405 410

<210>11

<211>1410

<212>DNA

<213>Ashbya gossypii

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1242)

<223>Product：Ashbya gossypi i ceramide synthase Lag1p(NP_982955)

<400>11

atg gct gaa aat tcg tta ttg aag cca cca tcg ctc tcc cgg aag cgg 48

Met Ala Glu Asn Ser Leu Leu Lys Pro Pro Ser Leu Ser Arg Lys Arg

1 5 10 15

agt tcc tct gtg ggg aac att ggt ctt ggt gat aca aaa gtg cct ggg 96

Ser Ser Ser Val Gly Asn Ile Gly Leu Gly Asp Thr Lys Val Pro Gly

20 25 30

cta tcc acg atg tct gaa tcg aaa gaa tcc aag att gcc gcg agg gcg 144

Leu Ser Thr Met Ser Glu Ser Lys Glu Ser Lys Ile Ala Ala Arg Ala

35 40 45

cgg ttg cgg gca ctt tct gga gca tcg aag acg gat atc gac atc tac 192

Arg Leu Arg Ala Leu Ser Gly Ala Ser Lys Thr Asp Ile Asp Ile Tyr

50 55 60

tac aag ctg tgg cta tcg tat aga gag ctg aat tat cgt cac gcg tgg 240

Tyr Lys Leu Trp Leu Ser Tyr Arg Glu Leu Asn Tyr Arg His Ala Trp

65 70 75 80

ctg act cct ctg att atc ctg ttt ctg att tat agc tgt tat ttt gct 288

Leu Thr Pro Leu Ile Ile Leu Phe Leu Ile Tyr Ser Cys Tyr Phe Ala

85 90 95

tcc ggc aac agg aca gag agt aac cca ctt cat atg ttc gtt gcg ata 336

Ser Gly Asn Arg Thr Glu Ser Asn Pro Leu His Met Phe Val Ala Ile

100 105 110

tct tat aga gtt ggc aac acg aac atg tac ggg aaa ggt gtc aaa gac 384

Ser Tyr Arg Val Gly Asn Thr Asn Met Tyr Gly Lys Gly Val Lys Asp

115 120 125

atg tgc ttt gtg ttc tac tac atg gta ttc ttc acc ttt ctg cgc gaa 432

Met Cys Phe Val Phe Tyr Tyr Met Val Phe Phe Thr Phe Leu Arg Glu

130 135 140

ttt atg atg gag atg gtg ttg cgc cca ttg acg ttc cgg ctc ggt gtc 480

Phe Met Met Glu Met Val Leu Arg Pro Leu Thr Phe Arg Leu Gly Val

145 150 155 160

acc aag cca cac aag gtc aag cgt atg atg gag caa gct tat tcc acg 528

Thr Lys Pro His Lys Val Lys Arg Met Met Glu Gln Ala Tyr Ser Thr

165 170 175

ttc tac tat ggt ctt tct ggt ccc ttt ggg ttg ttt gtg atg tac cgt 576

Phe Tyr Tyr Gly Leu Ser Gly Pro Phe Gly Leu Phe Val Met Tyr Arg

180 185 190

acc gat ctg tgg tta ttc aag aca gca gaa atg tac aag act tat cca 624

Thr Asp Leu Trp Leu Phe Lys Thr Ala Glu Met Tyr Lys Thr Tyr Pro

195 200 205

gac ctc acc aac gag tac tat tat aaa atc ttc tac ctc ggc caa gca 672

Asp Leu Thr Asn Glu Tyr Tyr Tyr Lys Ile Phe Tyr Leu Gly Gln Ala

210 215 220

gct ttc tgg gcg caa cag gcg tgt atc ctg gtt ttg caa cta gag aag 720

Ala Phe Trp Ala Gln Gln Ala Cys Ile Leu Val Leu Gln Leu Glu Lys

225 230 235 240

cca aga aag gac ttc agg gaa ctt gtc ttt cac cat att gtc acc ttg 768

Pro Arg Lys Asp Phe Arg Glu Leu Val Phe His His Ile Val Thr Leu

245 250 255

gcg cta att tca tta tca tac gtt ttc cac ttc aca aag atg ggc ctg 816

Ala Leu Ile Ser Leu Ser Tyr Val Phe His Phe Thr Lys Met Gly Leu

260 265 270

gca gtg tac atc acc atg gat gta tcg gat ttt ttc cta gcc ctt tca 864

Ala Val Tyr Ile Thr Met Asp Val Ser Asp Phe Phe Leu Ala Leu Ser

275 280 285

aag att ttc aat tac atg gag tct tcg ttc aca gct ccg tta ttt ctt 912

Lys Ile Phe Asn Tyr Met Glu Ser Ser Phe Thr Ala Pro Leu Phe Leu

290 295 300

cta ttt gtg tcg tcc tgg gtc tat ctg aga cac tac gtt aat att aag 960

Leu Phe Val Ser Ser Trp Val Tyr Leu Arg His Tyr Val Asn Ile Lys

305 310 315 320

atc ctc tgg tct gtg ttg aca gag ttc cgt acc gtg ggt gac tac aca 1008

Ile Leu Trp Ser Val Leu Thr Glu Phe Arg Thr Val Gly Asp Tyr Thr

325 330 335

ttg aac ttc gct acc gag caa tac aaa agt tgg atc gct ttg ccg att 1056

Leu Asn Phe Ala Thr Glu Gln Tyr Lys Ser Trp Ile Ala Leu Pro Ile

340 345 350

gtt ttt ggt tta ata ttt gcg ttg cat ctt gtt aat ctc tat tgg ctt 1104

Val Phe Gly Leu Ile Phe Ala Leu His Leu Val Asn Leu Tyr Trp Leu

355 360 365

gcc cta ata ttc cgt att tta tac cgc atg ctc ttc caa ggt gtc caa 1152

Ala Leu Ile Phe Arg Ile Leu Tyr Arg Met Leu Phe Gln Gly Val Gln

370 375 380

aag gat gag aga agc gac agt gag tcc gaa gat aat gaa gag gag ctg 1200

Lys Asp Glu Arg Ser Asp Ser Glu Ser Glu Asp Asn Glu Glu Glu Leu

385 390 395 400

gat gac tca tcg gat gag act gat aag aaa aag aac caa taa 1242

Asp Asp Ser Ser Asp Glu Thr Asp Lys Lys Lys Asn Gln

405 410

attggcattg tcattggcac ttcgtgttta tgtattgaat gtatagcata tcgattacgg 1302

cttgccatgg gatttcgtaa tgcaggagta aaagcacaaa aatgatagtt ctaacatctt 1362

ccgactgcgt gttccaccgc cattacacta ctagaatata tacaggtc 1410

<210>12

<211>413

<212>PRT

<213>Ashbya gossypii

<400>12

Met Ala Glu Asn Ser Leu Leu Lys Pro Pro Ser Leu Ser Arg Lys Arg

1 5 10 15

Ser Ser Ser Val Gly Asn Ile Gly Leu Gly Asp Thr Lys Val Pro Gly

20 25 30

Leu Ser Thr Met Ser Glu Ser Lys Glu Ser Lys Ile Ala Ala Arg Ala

35 40 45

Arg Leu Arg Ala Leu Ser Gly Ala Ser Lys Thr Asp Ile Asp Ile Tyr

50 55 60

Tyr Lys Leu Trp Leu Ser Tyr Arg Glu Leu Asn Tyr Arg His Ala Trp

65 70 75 80

Leu Thr Pro Leu Ile Ile Leu Phe Leu Ile Tyr Ser Cys Tyr Phe Ala

85 90 95

Ser Gly Asn Arg Thr Glu Ser Asn Pro Leu His Met Phe Val Ala Ile

100 105 110

Ser Tyr Arg Val Gly Asn Thr Asn Met Tyr Gly Lys Gly Val Lys Asp

115 120 125

Met Cys Phe Val Phe Tyr Tyr Met Val Phe Phe Thr Phe Leu Arg Glu

130 135 140

Phe Met Met Glu Met Val Leu Arg Pro Leu Thr Phe Arg Leu Gly Val

145 150 155 160

Thr Lys Pro His Lys Val Lys Arg Met Met Glu Gln Ala Tyr Ser Thr

165 170 175

Phe Tyr Tyr Gly Leu Ser Gly Pro Phe Gly Leu Phe Val Met Tyr Arg

180 185 190

Thr Asp Leu Trp Leu Phe Lys Thr Ala Glu Met Tyr Lys Thr Tyr Pro

195 200 205

Asp Leu Thr Asn Glu Tyr Tyr Tyr Lys Ile Phe Tyr Leu Gly Gln Ala

210 215 220

Ala Phe Trp Ala Gln Gln Ala Cys Ile Leu Val Leu Gln Leu Glu Lys

225 230 235 240

Pro Arg Lys Asp Phe Arg Glu Leu Val Phe His His Ile Val Thr Leu

245 250 255

Ala Leu Ile Ser Leu Ser Tyr Val Phe His Phe Thr Lys Met Gly Leu

260 265 270

Ala Val Tyr Ile Thr Met Asp Val Ser Asp Phe Phe Leu Ala Leu Ser

275 280 285

Lys Ile Phe Asn Tyr Met Glu Ser Ser Phe Thr Ala Pro Leu Phe Leu

290 295 300

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Ile Leu Trp Ser Val Leu Thr Glu Phe Arg Thr Val Gly Asp Tyr Thr

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Leu Asn Phe Ala Thr Glu Gln Tyr Lys Ser Trp Ile Ala Leu Pro Ile

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Val Phe Gly Leu Ile Phe Ala Leu His Leu Val Asn Leu Tyr Trp Leu

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Ala Leu Ile Phe Arg Ile Leu Tyr Arg Met Leu Phe Gln Gly Val Gln

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Lys Asp Glu Arg Ser Asp Ser Glu Ser Glu Asp Asn Glu Glu Glu Leu

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Ser Gln Ile Glu Val Glu Tyr Gly Ser Lys Asp Ala Ala Phe Glu Ala

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Asp Lys Ser Val Glu Leu Glu Glu Arg Glu Glu Leu Leu Pro Ile Arg

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Gly Gln Leu Ala Val Ser Lys Val Asp Leu Tyr Thr Val Tyr Ala Ser

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tgg gtg acg ggc ttc tac ctg tac tac cac tcg ccc tac ttc ctg aac 528

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Ile Val Leu Asn Val Glu Glu Lys Arg Lys Asp Tyr Trp Gln Met Phe

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gcg cac cac ata atc acg gtc gcg ctg acc acg ggg tcg tac tac tat 720

Ala His His Ile Ile Thr Val Ala Leu Thr Thr Gly Ser Tyr Tyr Tyr

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tac ttc aac cgc att ggc cat gtg att ctg att atc atg gac gtg gtc 768

Tyr Phe Asn Arg Ile Gly His Val Ile Leu Ile Ile Met Asp Val Val

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gat atc ttg ctc tcc agc gcc aag atc ctg aag tac tgt ggc ttc tct 816

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290 295 300

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Ile Val Leu Asn Val Glu Glu Lys Arg Lys Asp Tyr Trp Gln Met Phe

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245 250 255

Asp Ile Leu Leu Ser Ser Ala Lys Ile Leu Lys Tyr Cys Gly Phe Ser

260 265 270

Val Ala Cys Asp Tyr Met Phe Val Val Phe Leu Gly Phe Trp Val Val

275 280 285

Leu Arg His Gly Val Tyr Asn Tyr Ile Leu His His Ala Trp Ala Lys

290 295 300

Ser Arg Gly Leu Met Gln Asn Gln Arg Cys Gly Val His Ala Pro Gly

305 310 315 320

Thr Arg Cys Trp Thr Pro Leu Val Ile Asp Ile Phe Val Leu Leu Leu

325 330 335

Ala Gly Leu Gln Leu Ile Thr Val Ile Trp Ser Phe Leu Ile Val Lys

340 345 350

Val Phe Met Lys Val Ile Arg Gly Ser Gly Ala Glu Asp Val Arg Ser

355 360 365

Asp Asp Glu Glu

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<212>PRT

<213>Mus musculus

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Cys

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<221>PEPTIDE

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<223>Ashbya gossypii dihydroceramide desaturase Des1p(GenBank

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Met Cys Pro Glu Phe Tyr Glu Thr Leu Pro Lys His Asp Ser Trp Val

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Arg Val Leu Trp Asp Phe Ile Phe Lys Tyr Asp Val Thr Leu Tyr Asn

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Arg Val Arg Arg Val Asn Lys His Leu Glu Ser

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245 250 255

Met Asp Pro Pro Lys Thr Tyr Asn Arg Tyr Lys Asp His Pro Pro Leu

260 265 270

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275 280 285

Gly Leu His Asn Glu His His Asp Phe Pro Tyr Val Ala Trp Ser Lys

290 295 300

Leu His Lys Leu Asn Glu Val Ala Ash Glu Phe Tyr Cys Asp Leu Pro

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Lys His Asp Ser Trp Thr Met Val Ile Val Asn Phe Ile Leu Asp Lys

325 330 335

Asn Val Leu Leu Tyr Asn Arg Val Lys Arg Glu Thr Ala Lys Lys

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<220>

<221>PEPTIDE

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<223>Coccolithovirus(Emiliana huxleyi virus86)dihydroceramide

desaturase Des1p(GenBank accession#YP_293815)

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Ala His Phe Ile Thr Glu His Tyr Asn Phe Pro Gly Met Pro Glu Asp

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Gln Glu Thr Ser Ser Tyr Tyr Gly Pro Phe Asn Met Phe Ile Trp Asn

245 250 255

Ala Gly Tyr His Val Glu His His Asp Phe Lys Ser Ile Pro Trp Thr

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<212>PRT

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<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(323)

<223>Human dihydroceramide desaturase Des1p(GenBank accession#

AAM12531)

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Ile Lys Ser Leu Met Lys Pro Asp Pro Asn Leu Ile Trp Ile Ile Ile

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Gln Val Thr Phe Asp Ile Leu Ile Tyr Tyr Phe Leu Gly Ile Lys Ser

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Leu Val Tyr Met Leu Ala Ala Ser Leu Leu Gly Leu Gly Leu His Pro

210 215 220

Ile Ser Gly His Phe Ile Ala Glu His Tyr Met Phe Leu Lys Gly His

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Glu Thr Tyr Ser Tyr Tyr Gly Pro Leu Asn Leu Leu Thr Phe Asn Val

245 250 255

Gly Tyr His Asn Glu His His Asp Phe Pro Asn Ile Pro Gly Lys Ser

260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

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305 310 315 320

Val Leu Glu

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<212>DNA

<213>Ashbya gossypii

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1617)

<223>Product：Sphingolipid Delta8desaturase(GenBank accession#

AAS53293)

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Met Ala Val Leu Ser Lys Ser Glu Val Glu Glu Arg Ile Ala Asn Gly

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Asp Ala Lys Val Glu Thr Met Gly Gln Ala Tyr Lys Asn His Val Val

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Leu Asp Arg Lys Leu Phe Pro Ser Ala Asp Ser Glu Thr Gln Gln Arg

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att tcg gcg gag tac aac aag ctg cat cag gag ctc ata gac gcg ggc 528

Ile Ser Ala Glu Tyr Asn Lys Leu His Gln Glu Leu Ile Asp Ala Gly

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ttc tac gcc tgt ccg tat tgg aag tac ggc gtc gag ctg cta cgg ata 576

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Val Asp Ser Val Phe Gly Met Leu Val Ser Ala Trp Phe Gly Gly Leu

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tcg ctg gga tgg tgg aag cgc aac cac aac gtg cac cac ctg gtg acg 816

Ser Leu Gly Trp Trp Lys Arg Asn His Asn Val His His Leu Val Thr

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aac gac ccg gag cac gat ccc gac atc cag cat ctg ccg ttc ttt gcg 864

Asn Asp Pro Glu His Asp Pro Asp Ile Gln His Leu Pro Phe Phe Ala

275 280 285

gtc acc tcg cgc ctg ttc acg ggc ctc aag tcc acg tac tac gag cgt 912

Val Thr Ser Arg Leu Phe Thr Gly Leu Lys Ser Thr Tyr Tyr Glu Arg

290 295 300

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ata ctg tac tac ccg att ctt gcg ttc ggt agg ttc aat ctc tac gtg 1008

Ile Leu Tyr Tyr Pro Ile Leu Ala Phe Gly Arg Phe Asn Leu Tyr Val

325 330 335

tta agc tgg act cac ttg ctg ggc ggc aaa ggg cca cgc cac ggc caa 1056

Leu Ser Trp Thr His Leu Leu Gly Gly Lys Gly Pro Arg His Gly Gln

340 345 350

gcc gcg tgg ttc cgt tac ttc gag ctc tgt ggc ctt gtc ttc ttc tgc 1104

Ala Ala Trp Phe Arg Tyr Phe Glu Leu Cys Gly Leu Val Phe Phe Cys

355 360 365

tac tgg ttc tgc tac cgc ctg ctc gcc tgc tcg ctc tcc acc gcg acc 1152

Tyr Trp Phe Cys Tyr Arg Leu Leu Ala Cys Ser Leu Ser Thr Ala Thr

370 375 380

gac cgc gtg ctg tac gtg ctc gtg tcc cac ctc acc acc atg atc gtc 1200

Asp Arg Val Leu Tyr Val Leu Val Ser His Leu Thr Thr Met Ile Val

385 390 395 400

cat gtg cag atc acg ctc tcg cac ttc gcc atg tcc aca gcc gac ctt 1248

His Val Gln Ile Thr Leu Ser His Phe Ala Met Ser Thr Ala Asp Leu

405 410 415

ggc gtg tcg gaa tcc ttc ccg cag cgg cag ctg cgg acc tca atg gac 1296

Gly Val Ser Glu Ser Phe Pro Gln Arg Gln Leu Arg Thr Ser Met Asp

420 425 430

gtc gcc tgc ccg cgc tgg ctg gac ttc ttc cac ggc ggc ctg cag ttc 1344

Val Ala Cys Pro Arg Trp Leu Asp Phe Phe His Gly Gly Leu Gln Phe

435 440 445

cag gtc ata cac cac ctc ttc cct cgg ctc cct cgc cac aac ctg cgc 1392

Gln Val Ile His His Leu Phe Pro Arg Leu Pro Arg His Asn Leu Arg

450 455 460

gat gct cag ccg tac ctc ttg cgc ttc tgc gag cgt gtg ggc att aag 1440

Asp Ala Gln Pro Tyr Leu Leu Arg Phe Cys Glu Arg Val Gly Ile Lys

465 470 475 480

tac tcc atc tac ggg ttt tcg cac tgc aat tcc atg gtg ctg tcc cac 1488

Tyr Ser Ile Tyr Gly Phe Ser His Cys Asn Ser Met Val Leu Ser His

485 490 495

ctc gag cag att gcc cag cag gcc cgc acc gtt ctt gca tgt gcc cac 1536

Leu Glu Gln Ile Ala Gln Gln Ala Arg Thr Val Leu Ala Cys Ala His

500 505 510

acg atg gga cct cac aaa gac gtg gca atg ccg gcc cca ggc gga gac 1584

Thr Met Gly Pro His Lys Asp Val Ala Met Pro Ala Pro Gly Gly Asp

515 520 525

agc cgc cag tat agt aac cct aag cat gca tag agctgcgcgc 1627

Ser Arg Gln Tyr Ser Asn Pro Lys His Ala

530 535

<210>21

<211>538

<212>PRT

<213>Ashbya gossypii

<400>21

Met Ala Val Leu Ser Lys Ser Glu Val Glu Glu Arg Ile Ala Asn Gly

1 5 10 15

Glu Val Ile Val Ile Tyr Lys Ser Ala Val Leu Lys Leu Asp Lys Trp

20 25 30

Ile Lys Tyr His Pro Gly Gly Asp Lys Ala Ile Tyr His Met Val Gly

35 40 45

Arg Asp Ala Thr Asp Glu Met Asn Ala Tyr His Ser Asp Glu Ser Val

50 55 60

Gln Gln Phe Met Arg Trp Lys Ile Gly His Val Glu Gly Glu Trp Lys

65 70 75 80

Asn Leu Val Pro Pro Ile Gln Arg Asn Ala Cys Glu Thr Ser Met Gln

85 90 95

Pro Gly Thr Pro Gly Asp Glu Asp Thr Cys Tyr Glu Asp Asp Ala Cys

100 105 110

Asp Ala Lys Val Glu Thr Met Gly Gln Ala Tyr Lys Asn His Val Val

115 120 125

Val Asp Pro Met Gln Leu Ser Glu Leu Phe Asp Glu Glu Arg Ala Ala

130 135 140

Leu Asp Arg Lys Leu Phe Pro Ser Ala Asp Ser Glu Thr Gln Gln Arg

145 150 155 160

Ile Ser Ala Glu Tyr Asn Lys Leu His Gln Glu Leu Ile Asp Ala Gly

165 170 175

Phe Tyr Ala Cys Pro Tyr Trp Lys Tyr Gly Val Glu Leu Leu Arg Ile

180 185 190

Ser Thr Leu Leu Gly Ala Ser Tyr Phe Thr Leu Ile Arg Leu Asn Trp

195 200 205

Gln Ile Val Ser Ala Leu Leu Leu Gly Val Ala Trp Gln Gln Ala Val

210 215 220

Phe Ile Ala His Asp Ala Gly His Ile Ser Ile Thr His Asn Tyr Gln

225 230 235 240

Val Asp Ser Val Phe Gly Met Leu Val Ser Ala Trp Phe Gly Gly Leu

245 250 255

Ser Leu Gly Trp Trp Lys Arg Asn His Asn Val His His Leu Val Thr

260 265 270

Asn Asp Pro Glu His Asp Pro Asp Ile Gln His Leu Pro Phe Phe Ala

275 280 285

Val Thr Ser Arg Leu Phe Thr Gly Leu Lys Ser Thr Tyr Tyr Glu Arg

290 295 300

Asp Leu Ala Phe Asp Leu Pro Ala Arg Ile Phe Ile Pro Leu Gln His

305 310 315 320

Ile Leu Tyr Tyr Pro Ile Leu Ala Phe Gly Arg Phe Asn Leu Tyr Val

325 330 335

Leu Ser Trp Thr His Leu Leu Gly Gly Lys Gly Pro Arg His Gly Gln

340 345 350

Ala Ala Trp Phe Arg Tyr Phe Glu Leu Cys Gly Leu Val Phe Phe Cys

355 360 365

Tyr Trp Phe Cys Tyr Arg Leu Leu Ala Cys Ser Leu Ser Thr Ala Thr

370 375 380

Asp Arg Val Leu Tyr Val Leu Val Ser His Leu Thr Thr Met Ile Val

385 390 395 400

His Val Gln Ile Thr Leu Ser His Phe Ala Met Ser Thr Ala Asp Leu

405 410 415

Gly Val Ser Glu Ser Phe Pro Gln Arg Gln Leu Arg Thr Ser Met Asp

420 425 430

Val Ala Cys Pro Arg Trp Leu Asp Phe Phe His Gly Gly Leu Gln Phe

435 440 445

Gln Val Ile His His Leu Phe Pro Arg Leu Pro Arg His Asn Leu Arg

450 455 460

Asp Ala Gln Pro Tyr Leu Leu Arg Phe Cys Glu Arg Val Gly Ile Lys

465 470 475 480

Tyr Ser Ile Tyr Gly Phe Ser His Cys Asn Ser Met Val Leu Ser His

485 490 495

Leu Glu Gln Ile Ala Gln Gln Ala Arg Thr Val Leu Ala Cys Ala His

500 505 510

Thr Met Gly Pro His Lys Asp Val Ala Met Pro Ala Pro Gly Gly Asp

515 520 525

Ser Arg Gln Tyr Ser Asn Pro Lys His Ala

530 535

<210>22

<211>2267

<212>DNA

<213>Ashbya gossypii

<400>22

tccatcagcg cgacaacagg cttcgggtac gtcgccagca tccagttcat ggtgtactcg 60

ccctggaaga agtcgtccac cttctccagc atgtcccgcc gcatggcctt cgccatcagc 120

acgatgtcgc caccggcgca gaacgcccgt ggcgcgcacg cagagtcgaa cacaatcacg 180

ttggccacat cgcttttggc gtactcctgc atcaccggca gaatcgagtg gcagatctca 240

tggttgatgg cgttcagctt ctcgggccga ttgagcgtga ccacacgggc cgtgttattc 300

gttttgaact tgactaaaga cgacatctgc cttctctgga ccatgcctct aacggtgctt 360

cttatcatta tcactcggtg ccgcttttat attgttgtga aggacaaact gcatgcgcaa 420

ccctgctttt agcaaggacg tgatttctga cgatagccta gatccgaatg agatgaccag 480

gccgctcggc tctcgttagt tctccggtct ccacgttcag tgctactgat acgacggtca 540

cgtttccaca tcgtggacgg tctcacatca tgtgaaacga caattacccg gacatacctt 600

tcgtgatgta cagattgtag aaacataacg gagcatgagg tgatcttgct ccaatggtgg 660

ttcaaagcag acattgcact ctccaggtgg gaccacagac cgaatcgcac caccgatctg 720

catctatggt gccggtttcg acgtagagcg cacataagcg acgtccgtag atccgaatta 780

ttgagatgtg gcctataaaa acgatgctgt atattggcct cgtgttctac tacacacgcc 840

tcgattcgga tgactgcaag cagcctagtc ctccatagtg cgaacagaca gcgacgagac 900

tgacatgaac caacggggta tagcgacagc agtgacggcg gagccgccga gcgcggacgc 960

cgacgtcgag gtgcttcaca acttctactg gacctcgctg aaggaaccgc acgcgcatcg 1020

gcggaaagag atcctccgcg cgcacccgga ggtgaagaag ctgatggggc acgagccgcg 1080

cacaaagtac ctcgtggcgc tggtggtggg gctgcagctg ttgtctgcgt acatgctgcg 1140

ggacaccgac ccgctgagcc tgaagttcct tgcgtgggcg tacgtggtcg gcgcgacggc 1200

cacgcagaac ctgtacctgg cgatccacga gctatcgcac aacctggcct tcaagaagcc 1260

aaagcacaac cgtctgttct ccatctttgc aaacctgccg atcgggatcc cgttcgcggc 1320

ctcttttggc ccgtaccacc agctgcacca caagtttctc ggggacgagg tgtacgacac 1380

ggacgtgccg acggtgctcg aggcggtcct tttgtccaat gtgctcggga agacattctt 1440

tgcgacgttc cagatcttct tctatgccct gcgccccatg atggtcgtgc gcatcccgat 1500

caccggtttc cacgtactga acgttgtttg ccagtttgta ttcgatgtga tctggatccg 1560

tcagtttggc ctgaatgggt tcttctactt tctgctctcg tcgttcttgg ccggctcgct 1620

gcacccttgc tctgggcact tcatcgcgga gcactacctc ttcagcattg aagaggccat 1680

cgttggcggc aaggttgcga tgaagagcgc cgctggcgag gccgagcccg tctacgtgac 1740

tgatgagagc gccgtcaagc ggcccgatgt cgagttccgc aaggattatg ctttggagac 1800

gtattcgtac tatggaatcc tgaacgctgt tacttggaac gttggactgc acaatgagca 1860

ccacgacttt ccgttcatcg cctggtcgaa gctctgggag ctgaatcgca tgtgcccgga 1920

gttttatgag acacttccaa aacacgattc gtgggtccgc gttctctggg atttcatatt 1980

caagtacgac gttactctct acaaccgtgt caggcgtgta aataagcatt tggagtcata 2040

attgcgcccc tccactcgcc aaactcttat agatgattcg tttatgctat atgttaagta 2100

ttattaattc atgatgccgc gtcgtttaca atcactgccc cgttgcagcg taggccatgt 2160

atccaactgt tgcccagtac aagctgagga cccacttcag tagtccgaag agcgacagcg 2220

tgaacaccac aaggaagaac acatggagac agaaggagtc aaaactc 2267

<210>23

<211>2521

<212>DNA

<213>Ashbya gossypii

<400>23

cgtctgtacc agaacctgtg ccgcctgcgc tacctgcgcg aggtgccgca gcgcaaggcc 60

gcggagcagc tgcgcaagcg caacgagttc ggccacatct ggtactccgc gcagtaccgc 120

cccacctaca cgcaggaggc tgtcgcggac ctgcgcgagt gcctgctgcg cgcgcgcggc 180

ggcgccaccg tccactggga ggacccctgg cgcatgggcg accgcgccaa gcactgggcc 240

gcgctgcccg ccgtccagca ccagttcctg ccgcgcatgg ccaacgtggc tcgcgaggag 300

agcgccatcc tcaagcagct cggcgagcgc gcgaagcgcg ccttcgccgc gcccgccccg 360

cctgcgcccg ccccgcaaag cctctgatga ggggtgctgc agcctgcgcc gcatttgctg 420

gcgtgcgccg cccccacctg taaatagcgc aaaatcccgg ctcgcctcga cctgctacgc 480

ccgcgcgccg ccgggactgc ttgccgaaga ttaccaatcc gccagcaccc tgcatgcttc 540

gggacggtgg tctcgcttcg agacatgcgt gatgctgtac gagaatttct ttttctccta 600

tgagttgaaa tattatataa gtacatcgtt acatcgtttc tcaggaccgt tcgggacatc 660

accttagcgc agaatcatta gtaccggagg ttcgtagatt agagcaaacc gtggtcagac 720

acttggaggt tgctttgaga tgttaaacca cacttatagc gatattggcg ttaggctggc 780

gccccggttc ctcccggacg tgtcgttcat ggatgacgta gtcgcgccgt tgacggcagt 840

caagccgcga cccacgctgg tgccagggat atcggacggg cacctgtcgt tgctggcgcc 900

agtgctggcg tactgggtgt tctcggggct gttccacgtg atggatacgc tgcggctggc 960

ggaaaagtac cggatccacc cgagcgagga agtagcgtcg cggaacaggg ccggcaggct 1020

ggacgttctg gcgcaggtgg tgctgcagca catcatccag acgctgacgg ggctggtgct 1080

ggtatactat gacggggagc cgcagacggg gatggagcag ctggcgatgt ggcggtggcg 1140

gcaggcggcg ccagggtggg tgtcgaacga ggcgatatac gtggcgtacc actacggctt 1200

gtcggtggcg aagctgctgg tggggttctt cctgatcgat acatggcagt tctggctcca 1260

ctacctgatg cacatgaaca agacgctgta ccggaagttc cacgcgcacc accaccgcct 1320

gtacgtcccg tacgcgtacg gcgcgctgta caacaacccc gtggaggcct ttgtgctcga 1380

ttcctgcggc accgcactgg ctgctcttgt cactcgtatg acgcacaggg aggagatgct 1440

gctctacaca tttgcaacca tgaagacggt ggacgaccac tgtggctacg cgctgccgtg 1500

ggatccgttc cagtggctct tcccgaacaa cgcggtgtac cacgacatcc accaccagaa 1560

cttcggtatc aagagcaact tcgcgcagcc gttctttacc atatgggact cgttttgccg 1620

caccaagttc ccgcagttcg aggagtacga gaagaagcaa agacgagtga cggtggaccg 1680

gtacaagcag tttttggcag agcgccagat ggaacgggag gcaaagctga cgctgctctc 1740

caaaaaacta agctgagcgc taattaatac ttatctcaaa cacttaatac catctattgg 1800

gctgcaacca agtgcagtcg gttctgttct ataacgccac actagggcta cgacgttgtt 1860

taagcatacg actcttttaa tgtaatatct ggccccgcct ggggcggtca tgtgtacgca 1920

tatccatggg cagtggcgca tgcgtgcggc gagcccgcag cgcatgccgg ttctaacggg 1980

cctatttcct ttaagagaat atatgtagga ttacactaga tcgtttggcg ccggagcgcg 2040

tagggcctcc gagtgcgcag gcgtcgcaac ggggaccgct gctcccagcc cccggacctt 2100

caagctggtg ttccgtgatg atatcgtggg taaacatggg gtcataagtc tggatggagc 2160

tcccatcacg agcttaaatg gactccttta gcacctggtt cagcttgctg attctggaag 2220

cgatgctcaa gtccacggtt ctgtcggcga cctccacaat caacccgccc tgaatctctg 2280

gcttcacgac gttctccagc ttcaaggtct tgccggcgcc gatgaagctc gactgtgcca 2340

gcgccttctc gactcttctg aacagcttgc cctccagagg ctgcgcggtg gtcacagtcg 2400

cctggaccag gccgttgtgc gcgtctgtca acttggtgaa ttcgccagcc acaccctgca 2460

gcaggttcag tctgttgttc tctgctagca cctgcatcag gttctgcact gcagcgtcca 2520

t 2521

<210>24

<211>518

<212>DNA

<213>Ashbya gossypii

<220>

<221>promoter

<222>(1)..(518)

<223>Promoter of the Ashbya gossypii TDH3gene，encoding

glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GenBank accession#

AAS52715)

<400>24

cggctctcct cgctctgctc aagggcccac gcacaccctt atatacgtct cccgcgctgc 60

ccgtccgctg cttgagctca cccgatgcca gtcagcctcc ccggaatcac cagtcgcaca 120

cctcgccacg gggtgggccg ccggtgtctg ggtgcacgac acctgacctc cgccccgcgg 180

gcttcctgtt ttcgccgggc gcggcacatg gtgcggcttc ctccgacagg aagccgggcc 240

gccggacgcg cacgtcagag gcgtcaccag ggcaaatggg tggaagcgaa gggaactacg 300

acgaacggtc agcacccctg gggcccccac gctcgcacca cagccgctgc gcgtgggcgt 360

gaaaaatttt acctgcgggc tctccttacg atctcctatt ttatttcctg gggggcagtc 420

gaaatctata taagagggcc ccgggacgca caacgggagg actctggtgg agagaccagg 480

agtttgaatt aattcagtcc acacatacac accgcaca 518

<210>25

<211>467

<212>DNA

<213>Ashbya gossypii

<220>

<221>promoter

<222>(1)..(467)

<223>Promoter of the Ashbya gossypii ENO gene，encoding enolase

(GenBank accession#AAS52975)

<400>25

ctgttcacag ccttctgaga caatcagacg ataaaaagga agctgagaag ttacgttttt 60

ttgatagctt cctctaactg gacacggctt cttgttgtcc ctgtgtctcg tgctaggcgt 120

aggaacgctc cctacatcac gttcatagct agcatccttt ggggcccctt tcggccaagt 180

aaagcccata tgcgcgacgc aaacggcacg cccaattacg aacgtgcacg aacagcggaa 240

tcctcgcgtg gtgattaagc agctcctagt gtgatgccgc agttgaatgc ctaaaaaaat 300

tcgtggggcg gaccgacatc agaggcgata catgtggaaa cttagagaaa agtgctaaac 360

ggtataaata ggagagaaat aagagtgcat tagccgttgc tcttgcagga ttttttctgg 420

gctcagagca gtagagatta acacctccga aactcaaata attcaaa 467

<210>26

<211>2534

<212>DNA

<213>Pichia ciferrii

<400>26

catatggtat tattctaatt atacatagac aagtgttacc acaagtttct catgataaat 60

ggaaagtatt tggattatgg actttagtta acgcatttgc tgttggttat catccgattc 120

aaaatacttg gttacaacta aactgtgatt ctccacagga aagaagtatt tcaattgcac 180

tttgggtaat gtttgccatg attggactaa tgagtggatc tcagttgttt agacaagatg 240

ataaaccttt atatcaaaag ggaactttag ccatgatttg tatggttttt ggaggattcc 300

tcatatcctt gggacagtat ctcttatact atcatctaaa caggaaaaag caatcaaatg 360

agcgtaaatg gctattataa aatgatattt gactcattaa tttgtgaata ttttgtagtt 420

tatactgatt acataaccat gacataagca aatcaggaac gttttttttt ttatttttat 480

ttttattttt acttttgcga atcgcctcgt ttaaaacgtt taaaaaacca aaaatttaat 540

tgttttctat taacatcagc tcattttaat tgtatttaaa gaacagctca actttttctt 600

tgaaaggaag atcagactac aaatttgtca aactccaaaa ctcctattta tacacagaga 660

aattcttttt tctctttttc cattcattta tacccctaat atcattggat ctcaaaaaag 720

ttgttattcg agatctgaat ctggatctat attatattaa taaaaagatt ccaaaagctc 780

atcatggcta caattacaca tagaaaaaac ccttcacaac caataacttt ccaaacacct 840

ccagcagatg ctccaattga aaaattaaat gatttttatt ggacaaatga aactgaacct 900

catacaatta gaagaaaatt aatattgaaa aaatatccaa aaattacaga actttgtgga 960

cctgaacctt taactaaata tattattttc ggagttgttt cattacaatt atcaattgct 1020

tattatttaa gaaatactcc atttttaagt tggaaattct ttttgttaag ttatataatt 1080

ggtgctactg caaatcaaaa tgtcttttta gctattcatg aattaactca taatttagca 1140

tttaaaaaac cattacataa caaattatat gcaattttca caaatattcc aattggtata 1200

ccttattcag cttctttcca accttatcat caattacatc ataaatattt aggtgatgaa 1260

gttttagata ctgatgtccc aacaaaatat gaagctatag ttttatcaaa tgtcttgggg 1320

aaatcatttt ttgcaacttt ccaaatctta ttttatgctt taagaccaat gtttattaca 1380

caaattaaat ttacttatat tcatttactt aacgtcttgg ttcaactatt tgttgatttc 1440

ttaattgtga aatactgggg ttggaaatca ttaagttatt tcatctttag ttcattttta 1500

gctggttctt tacatccatg ttcaggtcat ttcattgctg aacattatat catggatcca 1560

ccaaagactt ataacagata taaagatcat ccacctttag aaacttattc atattatggt 1620

gccttaaatt tagttacatg gaatgttggt ctacataatg aacatcatga tttcccatat 1680

gttgcttggt caaaacttca taaattgaat gaagttgcta atgagtttta ttgtgattta 1740

ccaaaacatg attcatggac tatggttatt gttaacttca ttcttgataa aaatgtctta 1800

ttatacaata gagttaaaag agaaactgca aagaaataaa atccataaaa ttatcattat 1860

ttataaacta tatatgtacg aattgggctg gagaatagag gtataacaaa atatacaaaa 1920

catatcatta tttatacgaa aattgtagtc accagatagt catctaaaat gctgacatgt 1980

aactgtcgtc gtattcgttc aatttgatgt gaagtatcca tgctcaatgc tgagatcctc 2040

atacaaaaaa taattagcga aaagcaaaaa ataaaaaaaa aaaaaaacct ttaatctcct 2100

gataatttaa ctaacaaatt ttgtcaaacg gtagaaacga ttcgaacttt atcaattcta 2160

gttttgaaca agatcagttg tcacaaaaga acgaagtgtt aaacgataaa tcattgattg 2220

tcaattgtat ataaacacag acaggaaacc gttgaattcg ttgtatcttt atcaaaactt 2280

aatcattaat actcaagtac aatagaattg acaatatgcc tttcactgat caaacatcac 2340

caaatgcccc aattagggaa aagatggaag ctttaatccg tcaaaaacaa caagaaatca 2400

ctaaaggtct tgaagcttta gaaccaactg ctagattctt tgctgattct tggtctcgtg 2460

gtgaaagtgc tggaggtggt acttcatgtg ttattcaaga tggtgaagtt tttgaaaaag 2520

gtggtgtgaa tatt 2534

<210>27

<211>655

<212>DNA

<213>Pichia ciferrii

<220>

<221>promoter

<222>(1)..(655)

<223>Promoter of the Pichia ciferrii PDA1gene，encoding the E1alpha

subunit of the pyruvate dehydrogenase complex

<400>27

gacgcaccgg ccattttcaa acacctgatg cgaaaaaacg aaaagtaaat ttatcgattt 60

tgaattcaaa attcaataat acattcaatt gataatttgt ttggtttgaa aatagtagaa 120

gtattcaact tttattagag gtttgcaatt ctcccccatt ttcaactaaa tattcaacac 180

aactaaactt tcccggagga gttcagacta ctatacaaag atgatgttga agaatattgt 240

tcgtcctctt tcaaacacaa cttctttgag atcaactcaa agagttgcca gaactatggc 300

cactgaagcc aaccaagatg atgaagtaag tagattgtta ttatattttt ggatcgatga 360

tgaattgtgg ataatggaga tgaattgatt ggattttaat tggttctttg attgttttgt 420

gattgttttt ttgatatcta ggaaagatag gggacaatca agatttagat ctatacaacc 480

acaaatcacc aaattttcaa tccaaatcag tgggaaacac tagacaatgt ttaattacta 540

acccgttttc acacagattg tcactattaa cttaccagct tcatcatttg aaggttatga 600

attagaagtt ccagaaacta ctttccaaac ttcaaaatca actttattat caatg 655

<210>28

<211>332

<212>DNA

<213>Pichia ciferrii

<220>

<221>terminator

<222>(1)..(332)

<223>Terminator of the Pichia ciferrii ENO gene，encoding enolase

<400>28

atttagcttc ggtgctttcc tatataacgc ttttataagt ttatgaataa tttacgtttt 60

tactgaaatt acctattgta gatacttcat ttgcaacatt ttctcataat aagtaggtgt 120

ttgatgacat ggctatattt tgtgattcat caactgattg ttttattttg aaaattgtcg 180

tcttacatat aattcttcca tcataaagct cataaattat atataaaagt tatgtttaat 240

gacatgccaa agtttcatta atttcaccac cataaagata attacctaaa attgcaccag 300

caacaacact caacattgcc caaccgttat aa 332

<210>29

<211>576

<212>DNA

<213>Synthetic DNA encoding nourseothricin acetyltransferase Nat1 from

Streptomyces noursei

<400>29

atgggtacta ctttagatga tactgcttat agatatagaa cttcagttcc aggtgatgct 60

gaagctattg aagctttaga tggttcattt actactgata ctgtttttag agttactgct 120

actggtgatg gttttacttt aagagaagtt ccagttgatc caccattaac taaagttttt 180

ccagatgatg aatcagatga cgagtctgat gacggtgaag atggtgatcc agattcaaga 240

acttttgttg cttatggtga tgacggagac ttagctggtt ttgttgttgt ttcatattca 300

ggttggaata gaagattaac tgttgaagat attgaagttg ctccagaaca tagaggtcat 360

ggtgttggta gagctttaat gggtttagct actgaatttg ctagagaacg tggtgctggt 420

catttatggt tagaagttac taatgttaat gctccagcta ttcatgctta tagaagaatg 480

ggtttcacat tatgtggttt agatactgct ttatatgatg gtactgcttc agatggtgaa 540

caagctttat atatgtcaat gccatgtcca taataa 576

<210>30

<211>847

<212>DNA

<213>Synthetic DNA encod ing alkal ine ceramidase mCER from mouse

<400>30

ggtaccttaa ttaacaatgc atgttccagg tactagagct aaaatgtcat caatttttgc 60

ttatcaatca tctgaagttg attggtgtga atcaaatttt caacattcag aattagttgc 120

tgaattctat aatacttttt caaatgtttt tttcttaatt tttggtccat taatgatgtt 180

tttaatgcat ccatatgctc aaaaaagaac tagatgtttt tatggtgttt cagttttatt 240

catgttaatt ggtttatttt caatgtattt tcatatgact ttatcatttt taggtcaatt 300

attagatgaa atttcaattt tatggttatt agcttcaggt tattcagttt ggttaccaag 360

atgttatttt ccaaaatttg ttaaaggtaa tagattttat ttctcatgtt tagttactat 420

tactactatt atttcaactt ttttaacttt tgttaaacca actgttaatg cttatgcttt 480

aaattcaatt gctattcata tcttatacat tgttagaact gaatacaaaa aaattagaga 540

tgatgattta agacatttaa ttgctgtttc agttgtttta tgggctgctg ctttaacttc 600

atggatttca gatagagttt tgtgttcatt ttggcaaaga attcatttct attatttgca 660

ttcaatttgg catgttttaa tttcaattac ttttccatat ggtattgtta ctatggcttt 720

agttgatgca aaatatgaaa tgccagataa aactttaaaa gttcattatt ggccaagaga 780

ttcttgggtt attggtttac catatgtcga aattcaagaa aatgataaaa attgttaata 840

agagctc 847

<210>31

<211>913

<212>DNA

<213>Synthetic DNA encoding dihydroceramide synthase Lag1p fromCoccolithovirus

EhV-86

<400>31

ggtaccgtta acgtacctaa taatatgtat tgtggtactt caggtttaag agatttcatg 60

tatgcagata ttatggaaat ggctcaattc tcagttatta tgttttcatt tgctacaatt 120

ttaagaactt ttgttatgat ttatatttta gatccattat cagaaattat ggttagacca 180

gaaagagttt taaaatttca acaatcagct tggagatttg ttttatattc aattgctact 240

atttcatcaa ttattgtttt tatgactgat gatactgttg attttaaaga atcttcattt 300

ttcgaaaatt ggccattata taatccaggt tcaggtatta aattcatgta tgcattatat 360

gctggtttct atattcatca aactgtttat attttcggtg atgaaagatt agatgatttt 420

aatgaacatg tttttcatca tgctattact ttagttttag tttatgtttc atgggttttc 480

aatttcacta aaattggttt tttcattatg actttacatg atggttcaga tgttttttta 540

gaattagcta aatgtatgaa ttatgctaaa gaaattagac caagattatc aattatttca 600

gatgtttcat tcattatttt tgcttcatca tttttctatt taagattata tttatatcca 660

gtttatgcta ttggttcaat tgttaatcca tatgatgctt gtgctcatgt ttcatgtgct 720

ttatatgaag gtggtgtttc atattcatat tgtgcttcaa aaccaattta tgctgttgct 780

attgctgctt taacttcatt atatatttta caagttatgt gggctggtag aattattaat 840

gttattgcta aagttattgc tggtaatcca ttagaagatt caagagatta aatttatagt 900

atcccgggag ctc 913

<210>32

<211>1293

<212>DNA

<213>Synthetic DNA encoding dihydroceramide synthase LASS5from mouse

<400>32

ggtaccgtta accgggcgcg cgtaagatgg ctactgctgc tgctgaaact ttaggtttat 60

tatggggttg gttatggtca gaatcatttt ggttaccaca aaatgtttca tgggctgatt 120

tagaaggtcc aggtgatggt tatggttatc caagagcaca acatgtttta tcagtttttc 180

cattagctgt ttgtattttt tcagttagaa tgttatttga aagatttatt gctaaaccat 240

gtgctttaag agttggtatt aaagattcac cagttaataa agttgaacca aatgatactt 300

tagaaaaagt ttttgtttca gttactaaat atccagatga aaaaagatta aaaggtttat 360

caaaacaatt agattggtca gttagaaaaa ttcaatgttg gtttagacat agaagaaatc 420

aagataaacc accaacttta actaaatttt gtgaatcaat gtggagattt acttattatt 480

tatgtatttt ttgttatggt attagatttt tatggtcaat gccatggttt tgggatacta 540

gacaatgttg gtataattat ccatatcaac cattatcaag agaattatat tattattata 600

ttactcaatt agctttttat tggtcattaa tgttttcaca atttattgat gttaaaagaa 660

aagatttctt aatgatgttt attcatcata tgattggtat tatgttgact actttttcat 720

atgttaataa tatggttaga gttggtgctt taattttctg tttacatgat tttgctgatc 780

cattattaga agctgctaaa atggctaatt atgctagaag agaaagatta tgtactactt 840

tattcgttat ttttggtgct gcttttattg tttcaagatt agctattttt ccattatgga 900

ttttaaatac tactttattt gaatcatggg aaattattgg tccatatcca tcatggtggt 960

tatttaatgc tttattatta attttacaag ttttacatgc tatttggtct tatttaattg 1020

ttcaaactgc ttcaaaagct ttatcaagag gtaaagtttc aaaagatgat agatcagatg 1080

ttgaatcatc atcagaagaa gaagatgaaa ctactcataa aaataattta tcaggttcat 1140

catcatcaaa tggtgctaat tgtatgaatg gttatatggg tggttcacat ttagctgaag 1200

aacaaggtac ttgtaaagct actggtaatt tacattttag agcttcacca catttacatt 1260

catgtgatta aagggactgc aacccgggag ctc 1293

Claims

1.一种获得来自Pichia ciferri或棉桃阿舒氏囊霉(Ashbya gossypii)的微生物菌株的方法，所述微生物菌株产生，以每克CDW计，至少0.5mg的式I所示的鞘氨醇类碱：

或其盐或酯，其中R是X-(CH₂)_m-Y-(CH₂)_n-CH₃，其中

X是CH₂或CHOH，并且

m在0和4之间，并且

Y是CH₂-CH₂,CH＝CH或CH＝CCH₃，并且

n在4和14之间，

所述方法通过如下步骤进行：

A.提高编码具有神经酰胺合酶活性的酶和/或具有神经酰胺酶活性的酶的多核苷酸的表达，所述具有神经酰胺酶活性的酶能够优先或甚至特异性地水解含有式I所示的鞘氨醇类碱的神经酰胺，和/或

B.降低编码具有鞘脂Δ8去饱和酶活性的酶和/或具有神经酰胺酶活性的酶的多核苷酸的表达，所述具有神经酰胺酶活性的酶能够优先或甚至特异性地水解含有植物鞘氨醇或二氢鞘氨醇作为鞘氨醇类碱的神经酰胺，和

C.分离具有以每克CDW计至少0.5mg的式I所示的鞘氨醇类碱的生产力的菌株，

其中所述具有神经酰胺合酶活性的酶选自：

a.由SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列组成的多肽，

b.由SEQ ID NO:12和/或SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列组成的多肽，

c.由SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列组成的多肽，和

d.由SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列组成的多肽；

其中所述具有神经酰胺酶活性且能够优先或甚至特异性地水解含有式I所示的鞘氨醇类碱的神经酰胺的酶选自：

e.由SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列组成的多肽；

其中所述具有鞘脂Δ8去饱和酶活性的酶选自：

f.由来自Pichia ciferri的菌株的SEQ ID NO:6所示的氨基酸序

列组成的多肽，和

j.由来自棉桃阿舒氏囊霉的菌株的SEQ ID NO:21所示的氨基

酸序列组成的多肽；

其中所述具有神经酰胺酶活性且能够优先或甚至特异性地水解含有植物鞘氨醇或二氢鞘氨醇作为鞘氨醇类碱的神经酰胺的酶选自：

h.由来自Pichia ciferri的菌株的SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列组成的多肽，且

其中来自所述Pichia ciferri或棉桃阿舒氏囊霉的起始微生物菌株为二氢鞘氨醇C-4羟化酶缺陷型菌株。

2.权利要求1的方法，进一步包括提高编码具有二氢神经酰胺去饱和酶活性的酶的多核苷酸的表达，其中所述具有二氢神经酰胺去饱和酶活性的酶选自：

i.由来自Pichia ciferri的菌株的SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列组成的多肽，和

j.由来自棉桃阿舒氏囊霉的菌株的SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列组成的多肽。

3.权利要求1或2的方法，其中m是1和/或n是8或10。

4.权利要求1或2的方法，包括用一或多种权利要求1部分A中或权利要求2中限定的编码所述酶的多核苷酸进行DNA介导的转化。

5.权利要求1或2的方法，包括通过遗传学手段将权利要求1部分B中限定的编码所述酶的基因靶定失活。

6.用于生产式I所示的鞘氨醇类碱或其盐或酯的方法，包括通过权利要求1-5任一项的方法获得鞘氨醇类碱产生菌株，在有益于产生所述鞘氨醇类碱的条件下对所述微生物菌株进行发酵，和从发酵液中收集所述鞘氨醇类碱。