CN101490260A

CN101490260A - 使用遗传工程化的微生物菌株的改进的鞘氨醇类碱的生产

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Publication number: CN101490260A
Application number: CNA2007800260806A
Authority: CN
Inventors: S·舍费尔; M·A·范登贝尔赫; D·博尔格尔; T·许勒
Original assignee: 科兹莫弗姆有限公司
Current assignee: Evonik Industries AG
Priority date: 2006-05-11
Filing date: 2007-05-11
Publication date: 2009-07-22
Anticipated expiration: 2027-05-11
Also published as: US8372595B2; JP2009536521A; WO2007131720A1; US20100190219A1; JP5357011B2; EP2024501A1; CN101490260B; EP2024501B1

Abstract

本发明提供遗传工程化的微生物菌株，特别是遗传工程化的酵母菌株，所述微生物菌株产生，以每克CDW计，至少0.5mg的式I所示的鞘氨醇类碱或其盐或酯。本发明提供获得遗传工程化的微生物菌株的方法，所述菌株产生，以每克CDW计，至少0.5mg的式I所示的鞘氨醇类碱或其盐或酯。所述方法包括步骤：a)提高编码具有神经酰胺合酶活性的酶和/或具有神经酰胺酶活性的酶的多核苷酸的表达，所述具有神经酰胺酶活性的酶能够优先或甚至特异性地水解含有式I所示的鞘氨醇类碱的神经酰胺，和/或b)降低编码具有鞘脂Δ8去饱和酶活性的酶和/或具有神经酰胺酶活性的酶的多核苷酸的表达，所述具有神经酰胺酶活性的酶能够优先或甚至特异性地水解含有植物鞘氨醇或二氢鞘氨醇作为鞘氨醇类碱的神经酰胺，和分离具有所要求的生产力的菌株。

Description

使用遗传工程化的微生物菌株的改进的鞘氨醇类碱的生产

鞘脂(sphingolipid)是一组脂类，所述脂类的膜全部具有衍生自鞘氨醇类碱(sphingoid bases)例如植物鞘氨醇(phytosphingosine)或鞘氨醇(sphingosine)这一共同特征。鞘脂经常存在于动物、植物和真菌、甚至一些细菌的细胞膜中。

神经酰胺是一组特殊的鞘脂，其含有与脂肪酸以酰胺键连接的鞘氨醇类碱。在人类皮肤中，神经酰胺与胆固醇、胆固醇硫酸酯和游离脂肪酸一起形成一道阻滞水和保护皮肤避免物理和化学有害物(noxas)所必需的通透性屏障。作为所述通透性屏障的成份，这些神经酰胺最常见于角质层(皮肤上层)，并且它们含有鞘氨醇、植物鞘氨醇、二氢鞘氨醇或6-羟基鞘氨醇作为鞘氨醇类碱。局部应用含有鞘脂的组合物(例如神经酰胺)提高皮肤的屏障功能和保湿性质(Curratolo，1987.Pharm.Res.4：271-277；Kerscher et al.，1991.Eur.J.Dermatol.1：39-43)。另外，鞘氨醇类碱同样已知介导一些生理学作用例如抑制蛋白激酶C的活性，并因此由于其抗炎和抗微生物活性而被包含在美容或皮肤病用组合物中。

由于鞘氨醇是人体中鞘脂的主要鞘氨醇类碱成份，因此其有相当的商业吸引力用于生产用于食品的鞘氨醇和含有鞘氨醇的鞘脂、以及药物学和美容应用。

当前，已经开发了一些化学合成鞘氨醇的途径。然而，由于存在两个立构中心，化学合成会产生外消旋体混和物，其中只有25％是天然存在的D-赤式-(2R，3S)-构型。另外，由于在分子中存在三个官能团，因此需要应用广泛的保护化学。因此，通过化学合成生产鞘氨醇是极端昂贵的，无法用于食品和化妆品中的掺入。对于从天然来源例如脑或鸡蛋分离的纯鞘氨醇也是这样。从动物来源提取的非均质鞘脂制备物也是可用的。尽管比纯化合物便宜，但是它们受限于组成上的非均质性，因此由于其可能含有病原物而具有潜在危险。

已经显示微生物例如酵母Pichia ciferri(Wickerham and Stodola，1960，J.Bacteriol.80：484-491)产生高水平的鞘氨醇类碱及其衍生物，但主要是C18-植物鞘氨醇及其乙酰化衍生物。这些物质可以提取出来并化学转变为相应的神经酰胺，因此含有纯的美容成份(参见例如WO 93/20038)。但是，这些菌株仅产生非常少量的植物鞘氨醇或其衍生物之外的鞘氨醇类碱。

同样，在其他酵母中，所产生的式I所示的鞘氨醇类碱的量很低，并且仅存在于脂质的葡糖神经酰胺部分，即不以游离形式存在而是结合至长链N-酰基基团和糖类。酵母中葡糖神经酰胺的含量是0至1.2mg每克细胞干重(cell dryweight，CDW)(Saito et al.，2005)。考虑到鞘氨醇类碱质量占全部质量的比例(40％；Kaufman et al.，1971)，即使这些葡糖神经酰胺中的全部鞘氨醇类碱都是式I所示的鞘氨醇类碱，以每克CDW计，也仅有0.5mg。然而，在解脂耶氏酵母(Yarrowialip。lytica)的葡糖神经酰胺中，只有25％的鞘氨醇类碱(Rupcicetal.，1998.Appl Microbiol.Biotechnol.50：583-588)是式I所示的鞘氨醇类碱，以每克CDW计，相应于在这种酵母物种中为0.13mg。

在过表达来自白假丝酵母(Candida albicans)(Ternes et al.，2002.J.Biol.Chem.277：25512-25518)和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(Garton et al.，2003.FEBS Lett.538192-538196)的二氢神经酰胺去饱和酶的重组酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Δsyr2细胞中，低于20％的二氢鞘氨醇转变为鞘氨醇。酿酒酵母Δsyr2细胞每mg蛋白质含有346pmol二氢鞘氨醇(Bae et al.，2004)。假设60％每克细胞干重(CDW)是蛋白质，这相当于0.2mg二氢鞘氨醇CDW。因此在所述重组酿酒酵母Δsyr2细胞中含有低于0.04mg鞘氨醇每克细胞干重。尽管还没有具体分析，但是即使这样微量的鞘氨醇也很可能不以游离鞘氨醇类碱的形式存在，而是结合至长链N-酰基基团，即神经酰胺，因为从二氢鞘氨醇合成鞘氨醇的酶，二氢神经酰胺去饱和酶，不能作用于游离鞘氨醇类碱，而是作用于其N-酰基化的形式。

从二氢鞘氨醇生物合成游离鞘氨醇需要三个酶的顺序作用：神经酰胺合酶、二氢神经酰胺去饱和酶和神经酰胺酶。

神经酰胺合酶用游离鞘氨醇类碱和脂肪酰-CoA硫酯作为底物形成鞘氨醇类碱N-酰基酯。神经酰胺合酶可以由一个(小鼠中；Lahiri and Futerman，2005.J.Biol.Chem.280：33735-33738)或两个亚基(酵母中；Schorling et al.，2001.Mol.Biol.Cell 12：3417-3427)组成。Schorling et al.，2001(Mol.Biol.Cell 12：3417-3427)描述了在酿酒酵母中过量产生神经酰胺合酶以提高神经酰胺合酶活性并由此提高细胞神经酰胺含量。尽管两个亚基都过量产生，但是没有观察到神经酰胺合酶活性或细胞神经酰胺含量的提高。同时，在酿酒酵母中异源过表达哺乳动物神经酰胺合酶没有实现神经酰胺量的提高，尽管观察到了鞘脂组成的改变(Guillas et al.，2003.J.Biol.Chem.278：37083-37091)。

在酿酒酵母中异源过表达来自几种生物的二氢神经酰胺去饱和酶(Ternes et al.，2002.J.Biol.Chem.277：25512-25518；Garton et al.，2003.FEBSLett.538192-538196)引起痕量鞘氨醇的形成。但是多数前体分子(>80％)(鞘氨醇类碱二氢鞘氨醇)没有转变。

过表达酿酒酵母的两种神经酰胺酶Ypc1和Ydc1(Mao et al.，2000.J.Biol.Chem.275：6876-6884，和Mao et al.，2000.J.Biol.Chem.275：31369-31378)也没有提高鞘氨醇产量。在人细胞系中提高特异性或优先水解具有式I所示鞘氨醇类碱的神经酰胺的小鼠神经酰胺酶的表达和/或酶活性水平使得鞘氨醇水平提高仅仅1.5倍(Mao et al.，2003.J.Biol.Chem.278：31184-31191)。通过将表达这种小鼠神经酰胺酶的酵母突变体的微体与各种外源添加的底物接触进一步研究这种神经酰胺酶的底物特异性。因此，基于过量产生神经酰胺酶而提高的鞘氨醇水平的相关数据都是得自人细胞系实验。与酿酒酵母相比，大多数其他酵母物种例如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)、Pichia ciferrii、解脂耶氏酵母、白假丝酵母、产朊假丝酵母(Candida utilis)、汉逊德巴利酵母(Debaryomyyces hansenii)和棉桃阿舒氏囊霉(Ashbya gossypii)仅含有一种单一神经酰胺酶。这种酶的特征和生理学作用仍然未知。

本发明现在令人惊讶地示出可以通过修饰神经酰胺合酶和/或神经酰胺酶和/或鞘脂Δ8去饱和酶的表达和/或酶活性水平而产生具有提高的式I所示的鞘氨醇类碱的生产力的菌株。优选地这些修饰伴有对二氢神经酰胺去饱和酶的表达和/或酶活性水平的修饰。本发明实现了制备能够产生植物鞘氨醇和二氢鞘氨醇之外的鞘氨醇类碱特别是鞘氨醇的遗传工程化的微生物菌株。

本发明还有助于制备能够比本领域已知的其他微生物菌株更有效地产生含有鞘氨醇类碱特别是神经酰胺类、脑苷脂类、神经节苷脂类和肌醇磷酰基神经酰胺类(inositol phosphorylceramides)的复合鞘脂的遗传工程化的微生物菌株。例如，被修饰为显示出提高的神经酰胺合酶和(任选地)提高的二氢神经酰胺去饱和酶的遗传工程化的微生物菌株可用于产生这些复合鞘脂。

因此，在第一方面，本发明提供了一种微生物菌株，特别是一种酵母株，所述微生物菌株产生，以每克CDW计，至少0.5mg的式I所示的鞘氨醇类碱：

或其盐或酯，

其中R是X-(CH₂)_m-Y-(CH₂)_n-CH₃，其中

a)X是CH₂或CHOH，并且

b)m在0和4之间，最优选地m是1，并且

c)Y是CH₂-CH₂、CH＝CH或CH＝CCH₃，并且

d)n在4和14之间，优选地n是8或10。

优选地，本发明的微生物菌株产生，以每克CDW计，至少5mg的式I所示的鞘氨醇类碱，更优选地产生，以每克CDW计，至少50mg的式I所示的鞘氨醇类碱，更优选地产生，以每克CDW计，至少500mg的式I所示的鞘氨醇类碱。

本发明的微生物菌株的鞘氨醇类碱生产力和组成优选地当所述生产鞘氨醇类碱的微生物菌株在如下条件下培养，并达到稳定期培养物时测定。将来自琼脂平板的微生物细胞接种于装有100ml YEPD培养基的500ml带有挡板的摇瓶中，在30℃以280rpm培育72小时。接下来，将该培养物的1％转移至装有100ml LCBNB生产培养基的另一个500ml带有挡板的摇瓶中，并在30℃以280rpm培育24-96小时。或者在装有100ml MM培养基的500ml带有挡板的摇瓶中在30℃以120rpm培育24-96小时完成主培养。

对于使用HPLC确定乙酰化鞘氨醇类碱(例如长链碱如植物鞘氨醇、鞘氨醇和二氢鞘氨醇)，将1ml全培养液与4ml丙酮在falcon管中混和。将所述管以每分钟250转混和10分钟以提取脂类。将溶液以5,300g离心10分钟。向C18反相HPLC柱注射10μl。在柱温30℃分析样品。移动相由含有0.05％TFA的水/乙腈(10:90)组成。流速1ml/min，用UV在200nm检测。

在另一个实施方案中，式I所示的鞘氨醇类碱处于酰基酯的形式。所述酰基可通过羟基，即“真正的”酯键，附着至鞘氨醇类碱。优选地，通过酯键连接至鞘氨醇类碱的酰基是1-4个碳原子的短直链酰基，更优选地是乙酰基。或者，所述酰基可通过氨基，即酰胺键，附着至所述鞘氨醇类碱。优选地，通过酰胺键连接至所述鞘氨醇类碱的酰基是1-4个碳原子的短直链酰基，更优选地是乙酰基。

在一个优选的实施方案中，式I所示的鞘氨醇类碱具有式II所示的D-赤式-(2R，3S)-构型：

其中R如在式I中所限定。

特别优选的是式II所示的化合物，其中R是(CH₂)₁₂-CH₃、CHOH-(CH₂)₁₁-CH₃、(CH₂)₁₄-CH₃或CHOH-(CH₂)₁₃-CH₃。

所述微生物菌株优选地是酵母，更优选地来自毕赤氏酵母属(Pichia)或阿舒氏囊霉属(Ashbya)的酵母，最优选地是Pichia ciferrii或棉桃阿舒氏囊霉物种。

在第二方面，本发明提供了用于通过遗传工程构建第一方面的微生物菌株的方法。

在亲本生物中通过遗传工程对鞘脂代谢途径进行工程化可以通过各种途径进行。例如通过修饰(即提高或降低)所述代谢途径中一或多种酶的细胞水平进行。可以通过例如对编码感兴趣的酶的基因进行靶定失活降低细胞水平。另外的或另一种方法，通过提高在宿主生物体内天然存在的鞘脂生物合成酶的浓度进行。最后，通过导入与在亲代生物体中天然存在的酶的氨基酸序列和/或底物特异性不同的鞘脂生物合成酶进行。

更准确地，本发明设想了神经酰胺合酶活性的修饰，任选地与二氢神经酰胺去饱和酶的修饰组合，任选地与神经酰胺酶的修饰组合，任选地与鞘脂Δ8去饱和酶的修饰组合，以此方式获得了从胞内二氢鞘氨醇向游离鞘氨醇，任选地向乙酰化鞘氨醇的转变提高。

另外，本发明设想了神经酰胺酶活性的修饰，任选地与二氢神经酰胺去饱和酶的修饰组合，任选地与神经酰胺合酶的修饰组合，任选地与鞘脂Δ8去饱和酶的修饰组合，以此方式获得了从胞内二氢鞘氨醇向游离鞘氨醇，任选地向乙酰化鞘氨醇的转变提高。

同时，本发明设想了鞘脂Δ8去饱和酶活性的修饰，任选地与二氢神经酰胺去饱和酶的修饰组合，任选地与神经酰胺合酶的修饰组合，任选地与神经酰胺酶的修饰组合，以此方式获得了从胞内二氢鞘氨醇向游离鞘氨醇，任选地向乙酰化鞘氨醇的转变提高。

在一个实施方案中，遗传工程被用于产生与亲本菌株相比显示出提高的式I所示的鞘氨醇类碱生产力(即，以每克CDW计，至少0.5mg的生产力)的微生物菌株，所述提高的生产力是由于神经酰胺合酶和/或神经酰胺酶和任选地二氢神经酰胺去饱和酶的表达和/或酶活性水平提高引起。具体地，这些菌株显示编码神经酰胺合酶和/或神经酰胺酶的多核苷酸的表达提高。所述微生物菌株可以进一步修饰以显示编码二氢神经酰胺去饱和酶的多核苷酸的表达提高。

在这种遗传工程中使用的神经酰胺合酶应当能够从其组成成份例如鞘氨醇类碱成份，特别是二氢鞘氨醇，和长链酰基成份，特别是脂肪酸或脂肪酰-辅酶A硫酯合成神经酰胺。

优选地所述神经酰胺合酶选自：

a.具有SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的多肽，

b.具有与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列有至少45％序列相同性和/或与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列有至少45％序列相同性的氨基酸序列的多肽，

c.具有SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的多肽，

d.具有与SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列有至少45％序列相同性的氨基酸序列的多肽，

e.具有SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列的多肽，和

f.具有与SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列有至少45％序列相同性的氨基酸序列的多肽。

优选地，与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：9和/或SEQ IDNO：10所示的氨基酸序列的序列相同性是50％，更优选地60％、70％、80％、90％。

具有与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列有至少45％序列相同性或与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列有至少45％序列相同性的神经酰胺合酶的实例是具有SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列的神经酰胺合酶。

神经酰胺合酶可以是具有相当变化的氨基酸序列、显示相同性程度低至15％的多肽。因此，适用于本发明的神经酰胺合酶可以得自各种不同来源，例如病毒、真菌、植物或动物，更优选地得自藻类病毒、酵母或哺乳动物，最优选地得自颗石藻类病毒属(Coccolithovirus)、糖酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤氏酵母属(Pichia)、耶罗威亚酵母属(Yarrowia)、假丝酵母属(Candida)、阿舒氏囊霉属、小鼠、大鼠或人类。

令人惊讶地发现由感染微藻球石藻(Emiliana huxleyi)的颗石藻类病毒编码的神经酰胺合酶特别适于发酵生产式I所示的鞘氨醇类碱。

在神经酰胺酶的表达和/或酶活性水平提高的实施方案中，所涉及的神经酰胺酶应当能够优先或甚至特异性地水解含有式I所示的鞘氨醇类碱的神经酰胺。

能够优先或甚至特异性地水解含有式I所示的鞘氨醇类碱的优选的神经酰胺酶选自：

1.具有SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列的多肽，和

2.具有与SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％序列相同性的氨基酸序列的多肽。

这种神经酰胺酶优选地可得自动物来源，更优选地得自哺乳动物，例如小鼠、大鼠或人类。

用于这种遗传工程的二氢神经酰胺去饱和酶应当能够将鞘氨醇类碱，特别是(如神经酰胺中、特别是二氢神经酰胺中所存在的)二氢鞘氨醇的C-4和C-5之间的键去饱和。这种二氢神经酰胺去饱和酶也称为鞘脂Δ4去饱和酶。

能够将鞘氨醇类碱的C-4和C-5之间的键去饱和的优选的二氢神经酰胺去饱和酶选自：

a.具有SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列的多肽，和

b.具有与SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列有至少30％、优选至少40％、更优选至少50％、60％、70％、80％、90％序列相同性的氨基酸序列的多肽。

具有与SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列有至少30％序列相同性的二氢神经酰胺去饱和酶的实例是具有SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18或SEQ IDNO：19所示的氨基酸序列的二氢神经酰胺去饱和酶。

这种二氢神经酰胺去饱和酶可以得自病毒、真菌、植物或动物，优选地得自藻类病毒、酵母或哺乳动物，更优选地得自颗石藻类病毒、酵母菌、裂殖酵母、德巴利酵母、克鲁维酵母、毕赤氏酵母、耶罗威亚酵母、假丝酵母、阿舒氏囊霉、小鼠、大鼠或人类。

在本发明另一个实施方案中，遗传工程被用于产生与亲本菌株相比显示出提高的式I所示的鞘氨醇类碱生产力的微生物菌株，所述提高的生产力是由于鞘脂Δ8去饱和酶和/或神经酰胺酶的表达和/或酶活性水平降低和/或胞内定位改变引起，特别是由于编码鞘脂Δ8去饱和酶和/或神经酰胺酶的多核苷酸表达降低引起。

用于这种遗传工程的鞘脂Δ8去饱和酶应当能够将鞘氨醇类碱的C-8和C-9之间的键去饱和。

优选的鞘脂Δ8去饱和酶选自：

a.具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的多肽，和

b.具有与SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列有至少30％、优选至少40％、更优选至少50％、60％、70％、80％、90％序列相同性的氨基酸序列的多肽。

具有与SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列有至少30％序列相同性的鞘脂Δ8去饱和酶的实例是具有SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列的鞘脂Δ8去饱和酶。

这种鞘脂Δ8去饱和酶可以得自真菌，优选地得自酵母，更优选地得自酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母、多形汉逊酵母、巴斯德毕赤氏酵母、Pichiaciferrii、解脂耶氏酵母、白假丝酵母、产朊假丝酵母或棉桃阿舒氏囊霉，最优选地得自Pichia ciferrii、棉桃阿舒氏囊霉或解脂耶氏酵母。

在神经酰胺酶的表达和/或酶活性水平降低的实施方案中，所涉及的神经酰胺酶应当能够优先或甚至特异性地将含有植物鞘氨醇或二氢鞘氨醇的神经酰胺水解为鞘氨醇类碱。

能够优先或甚至特异性地将含有植物鞘氨醇或二氢鞘氨醇的神经酰胺水解为鞘氨醇类碱的优选的神经酰胺酶选自：

a.SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的多肽，和

b.具有与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列有至少25％、优选至少30％、更优选至少40％、50％、60％、70％、80％、90％序列相同性的氨基酸序列的多肽。

这种神经酰胺酶可以得自真菌，优选地得自酵母，更优选地得自酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母、多形汉逊酵母、巴斯德毕赤氏酵母、Pichia ciferrii、解脂耶氏酵母、白假丝酵母、产朊假丝酵母或棉桃阿舒氏囊霉，最优选地得自Pichia ciferrii、棉桃阿舒氏囊霉或解脂耶氏酵母。

在一个优选的实施方案中，构建微生物菌株，其中如上述相关酶的表达水平的提高与如上述其他相关酶的表达水平的降低相组合。

在上述实施方案中，特定氨基酸序列与参考氨基酸序列的相同性百分比通过对所述参考序列进行如下分析确定。

在本发明中，遗传工程化的菌株中鞘氨醇类碱生产力的提高包括与衍生所述遗传工程化的菌株的亲本菌株的生产力相比鞘氨醇类碱的生产力提高，和/或产生所述亲本菌株基本不产生或完全不产生的鞘氨醇类碱。

在本发明中，具有符合相同性百分比要求的氨基酸序列的多肽(称为同源多肽)可以通过用所涉及的参考氨基酸序列筛选合适的序列数据库而方便地鉴别。同源多肽也可以通过对参考多肽进行诱变而衍生自此多肽。合适的应用于编码所涉及的多肽的基因的诱变技术包括随机诱变(例如易错PCR(error-prone PCR))、定点诱变和/或基因重排(gene shuffling)。例如，可以使用诱变获得比野生型多肽对其底物具有更高亲和力、和/或具有更高特异性酶活性和/或具有改变的底物特异性(例如针对鞘氨醇类碱的烃链长度或针对鞘氨醇类碱本身)的神经酰胺合酶多肽、水解含有式I所示的鞘氨醇类碱的神经酰胺的神经酰胺酶多肽、或二氢神经酰胺去饱和酶多肽。同时，可以使用诱变获得比野生型多肽对其底物具有更低的亲和力和/或具有更低酶比活性的能够优先或甚至特异性地水解含有植物鞘氨醇或二氢鞘氨醇作为鞘氨醇类碱的神经酰胺的神经酰胺酶多肽，或鞘脂Δ8去饱和酶多肽。

根据本发明对微生物菌株进行遗传工程化以获得感兴趣的酶表达提高可以通过过表达编码所述酶的内源基因(即在亲本菌株中已经天然编码)(同源过表达)或表达在亲本菌株中非天然存在的基因(异源(过)表达)实现。编码感兴趣的酶的基因的同源和异源(过)表达都可以通过将所述基因的一个拷贝或多个拷贝整合进亲本菌株的染色体中或通过提供处于能够无需亲本菌株的染色体复制即可进行自主复制的DNA元件上的所述基因的一个拷贝或多个拷贝实现。所述自主复制DNA元件可以是质粒、人工染色体或病毒。

在本发明中，降低感兴趣的酶的活性包括降低在亲本菌株中天然存在的并且编码所述感兴趣的酶的基因的表达。降低这种基因的表达可以通过由遗传学手段进行的所述基因的靶定失活实现，所述遗传学手段包括缺失编码所述酶的基因的一部分核苷酸序列和/或缺失编码所述酶的基因的全部核苷酸序列和/或破坏编码所述酶的基因的核苷酸序列。另一种方法或另外地，可以破坏、缺失或改变负责调节编码酶的基因的表达的核苷酸序列、负责信使RNA的加工、运输至特定亚细胞腔和翻译的核苷酸序列，以降低感兴趣的酶的活性。在另一个实施方案中，可以从代表编码感兴趣的酶的基因的一部分或完整基因的核苷酸序列表达反义RNA，以诱导衍生自编码这些酶的核苷酸序列的mRNA和反义RNA的杂交体的降解或阻断衍生自编码这些酶的核苷酸序列的mRNA的翻译。

在本发明中，亲本菌株可以是不产生式I所示的鞘氨醇类碱的菌株。亲本菌株也可以是虽然产生，但是，以每克CDW计，产生低于0.5mg的式I所示的鞘氨醇类碱的微生物菌株。

亲本菌株也可以是产生一定量的不同于式I所示的鞘氨醇类碱的鞘氨醇类碱的菌株，例如优选地，Pichia ciferrii NRRLY-1031 F-60-10和/或WO95/12683中公开的任何Pichia ciferrii菌株，它们均主要产生C18-植物鞘氨醇。

特别适于用作本发明的亲本菌株的菌株是在编码二氢鞘氨醇C-4羟化酶(将二氢鞘氨醇转变为植物鞘氨醇的酶)的基因中存在缺陷的菌株，特别是衍生自产生大量鞘氨醇类碱植物鞘氨醇的菌株的二氢鞘氨醇C-4羟化酶缺陷菌株。可以通过将感兴趣的菌株暴露于毒素丁香霉素E(syringomycinE)并选择丁香霉素E抗性菌株获得二氢鞘氨醇C-4羟化酶缺陷菌株(Grilley etal.(1998).J.Biol.Chem.273，11062-11068)。在这些菌株中包括二氢鞘氨醇羟化酶缺陷菌株(Δsyr2菌株)。或者，可以通过使用遗传学方法缺失或破坏而使SYR2基因靶定失活来获得缺乏二氢鞘氨醇C-4羟化酶的菌株。

例如，适合用作亲本菌株的是Pichia ciferrii的syr2突变株，可通过对Pichia ciferrii进行丁香霉素E选择而获得(参见未公开的WO 2006/048458)。

如本文所述编码多肽的多核苷酸可适于其将被在其中表达的微生物菌株的密码子使用。密码子使用表可以很方便地在数据库中找到，例如数据库如http://www.kazusa.or.jp/codon/。

如本文所述的多核苷酸所插入的载体可以是任何可以方便地进行重组DNA操作的载体，并且所述载体的选择通常依赖于其所要被导入的宿主细胞。因此，所述载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，所述载体的复制不依赖于染色体复制，例如质粒、粘粒、病毒或噬菌体载体，通常具有复制起点。或者，所述载体可以是当导入宿主细胞中时整合进宿主细胞基因组并与其所整合进的染色体一起复制的载体。所述载体可以是环状的，例如质粒，或者是线状的，例如表达盒(expression cassette)。

整合载体可以随机或在预定靶位点整合进宿主细胞染色体。对于靶定整合，所述整合载体包含与宿主基因组中预定靶基因座的DNA序列同源的DNA片段。为了促进靶定整合，所述载体在转化宿主细胞前优选地被线性化。优选地进行线性化，由此所述克隆载体的至少一个但是优选地每一个末端的侧翼是与靶基因座同源的序列。靶基因座侧翼的同源序列的长度优选地至少0.1kb，更优选地至少0.2kb，更优选地至少0.5kb，更优选地至少1kb，最优选地至少2kb。同源序列不需要与靶基因座严格相同。所需要的相同程度可依赖于同源序列的长度。典型地，所述相同百分比至少是大约80％。

根据使用的多核苷酸在本发明的遗传工程中所希望的用途，如果目的是希望表达一个基因的话，可以将所述多核苷酸插入表达盒中，或如果目的是希望失活一个基因的话，则插入失活盒中。

在表达盒中，将编码序列可操纵地连接至能够使宿主细胞从所述编码序列表达多肽的调控序列。术语“可操纵地连接”是指并置，其中所述成份处于使它们以其希望的方式发挥功能的相关联的状态。与编码序列“可操纵地连接”的调控序列例如启动子、增强子或另一个表达调控信号被置于使得在与所述调控序列相容的条件下得以实现从其编码序列表达多肽的位置。

失活盒被构建为使其能够靶向整合到需要失活的基因中。所述失活盒典型地包含需要失活的基因的非功能性对应物(counterpart)。所述非功能性对应物可以是多核苷酸，其中缺失所涉及的基因的编码序列的一部分或全部，从而靶向整合会引起天然编码序列被缺陷编码序列取代。用于基因失活的多核苷酸序列应当与包含需要失活的基因的靶序列至少80％相同。

在第三方面，本发明提供了显示神经酰胺合酶活性、鞘脂Δ8去饱和酶活性或神经酰胺酶活性的新的多肽。

在一个实施方案中，提供了显示神经酰胺合酶活性的多肽，所述多肽选自由具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多肽和具有与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％序列相同性的氨基酸序列的多肽组成的一组，和/或选自由具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的多肽和具有与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列有至少55％、优选至少60％、更优选至少70％、更优选至少80％、最优选至少90％序列相同性的氨基酸序列的多肽组成的一组。所述多肽优选地得自毕赤氏酵母，更优选地得自Pichia ciferrii。

在进一步的实施方案中，提供了显示鞘脂Δ8去饱和酶活性的多肽，所述多肽选自由具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的多肽和具有与SEQ IDNO：6所示的氨基酸序列有至少65％、优选至少70％、更优选至少80％、最优选至少90％序列相同性的氨基酸序列的多肽组成的一组。所述多肽优选地得自毕赤氏酵母，更优选地得自Pichia ciferrii。

在一个进一步的实施方案中，提供了显示神经酰胺酶活性的多肽，所述神经酰胺酶优先或甚至特异性地将具有植物鞘氨醇或二氢鞘氨醇的神经酰胺水解为鞘氨醇类碱，所述多肽选自由具有SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的多肽和具有与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列有至少60％、优选至少70％、更优选至少80％、最优选至少90％序列相同性的氨基酸序列的多肽组成的一组。所述多肽优选地得自毕赤氏酵母，更优选地得自Pichiaciferrii。

术语“同源性”或“相同性百分比”在本文中可互换使用。为了本发明的目的，本文中对其进行限定以确定两个氨基酸序列的相同性百分比，所述序列为了最佳对比目的进行排列(例如为了最佳排列可以在每一个序列中引入缺口)。之后对比在对应氨基酸位置的氨基酸残基。当第一序列中的一个位置在第二序列中的对应位置被相同氨基酸残基占据时，这两个分子在该位置是相同的。两个序列之间的相同性百分比是两个序列之间相同位置数目的函数(即％相同性＝相同位置数目/位置总数(即包括缺口的重叠位置)x 100)。优选地，所述两个序列具有相同长度。

本领域技术人员应当了解多个不同的计算机程序可用于确定两个序列之间的同源性。例如对比序列并确定两个序列之间的相同性百分比可使用数学算法进行。在一个优选的实施方案中，两个氨基酸序列之间的相同性百分比用Needleman and Wunsch(J.Mol.Biol.(48)：444-453(1970))算法确定，所述算法已经并入Accelrys GCG软件包中的GAP程序中(可在www.accelrys.com/products/gcg得到)，使用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵，缺口加权为16、14、12、10、8、6、或4，长度加权为0.5、1、2、3、4、5、或6。本领域技术人员应当了解全部这些不同的参数会得到有轻微差异的结果，但是当使用不同算法时两个序列的整体相同性百分比并未显著改变。优选地，矩阵是具有缺口加权10.0和长度加权0.5的Blossom 62矩阵。

本发明的蛋白质序列可进一步用作“查询序列”对公共数据库进行检索，以例如鉴别其他同族成员或相关序列。这些检索可使用Altschul，et al.(1990)J.Mol.Biol.215：403-10的blastp、psi-blast、phi-blast和tblastn程序(2.0版)进行。当使用blastppsi-blast、phi-blast和tblastn程序时，可以使用各个程序(例如blastp、psi-blast、phi-blast和tblastn程序)的默认参数。参见美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)的主页www.ncbi.nlm.nih.gov。

具有显示与参考氨基酸序列有相同性百分比的氨基酸序列的多肽称为同源多肽。同源多肽可以是从其他生物体特别是酵母或动物获得的天然存在的变体，或者可以是工程化的变体。

在第四方面，本发明提供了包含编码第三方面的多肽的核苷酸序列的多核苷酸。所述多核苷酸可以包含编码SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQID NO：6和/或SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的核苷酸序列。例如，分别编码SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的核苷酸序列分别是SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7。针对宿主生物的密码子使用优化核苷酸序列是有利的。所述优化的核苷酸序列的实例是编码具有SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列的碱性神经酰胺酶的SEQ ID NO：32、编码具有SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的神经酰胺合酶的SEQ ID NO：33、和编码具有SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列的神经酰胺合酶的SEQ ID NO：34。

在一个进一步的方面，本发明提供了通过在使本发明的鞘氨醇类碱和(如果需要)待用的多肽表达的条件下培养本发明的第一方面的微生物细胞(可由本发明第二方面的方法获得)和/或用本发明第四方面的(例如如上述克隆在表达盒和/或失活盒中的)多核苷酸转化的宿主细胞制备式I所示的鞘氨醇类碱，以及任选地收集所述鞘氨醇类碱的方法。

本发明的细胞可以使用本领域已知的方法培养。对于启动子和宿主细胞的每一种组合，已有有助于表达本发明的多肽的培养条件。在达到所希望的细胞密度后，停止培养并使用已知的方法收集本发明的多肽或鞘氨醇类碱。

所述发酵培养基可包括含有碳源(例如葡萄糖、麦芽糖、糖蜜)、氮源(例如氨、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵、有机氮源例如酵母提取物、麦芽提取物、蛋白胨)、以及其他无机营养源(例如磷酸盐、镁、钾、锌、铁等等)的已知培养基。任选地，可以包括诱导物。

合适的培养基的选择可以基于表达宿主和/或基于表达构建体的调控要求和/或基于与本发明的鞘氨醇类碱的最优生产相关的要求进行。本领域技术人员已知这些培养基。

所述发酵可以以0.5-30天的周期进行。其可以是合适地在0至45℃的温度范围之间和例如在pH2和10之间进行的分批、连续或补料过程。优选的发酵条件是20至37℃的温度范围之间和/或pH3和9之间。合适的条件通常基于表达宿主和需要表达的蛋白质的选择进行选择。

在发酵之后，如果需要，可以将细胞从发酵液中通过离心或过滤手段分离。之后可以从细胞和/或发酵液中收集本发明的鞘氨醇类碱，并且如果需要，可以通过常规手段纯化和分离。

本发明有利地示出了式I所示的鞘氨醇类碱或其盐或酯的完全发酵生产可以通过在发酵过程中提高活性神经酰胺合酶的胞内浓度而被显著提高。具体地，示出了鞘氨醇或其盐或酯的发酵生产通过提高活性神经酰胺合酶多肽的胞内浓度或通过在发酵过程中产生对于宿主来说新的(对于氨基酸序列来说)具有神经酰胺合酶活性的酶而被显著提高。

方便地，本发明的鞘氨醇类碱可与合适的赋形剂组合以产生鞘氨醇类碱组合物。

本发明的鞘氨醇类碱可用作起始材料以制备其他鞘氨醇类碱或鞘脂，例如神经酰胺、神经节苷脂或脑苷脂。

附图说明

图1示出了用于在棉桃阿舒氏囊霉中靶定失活SYR2的质粒pUG6-AgSUR2::kanMX的图示。示出了棉桃阿舒氏囊霉TEF启动子(水平阴影)、棉桃阿舒氏囊霉TEF终止子(对角线阴影)、loxP位点(黑体)、卡那霉素抗性基因(深灰色)、用于同源重组的棉桃阿舒氏囊霉SYR2的上游区域(US)和下游区域(DS)(网格线)、和氨苄青霉素抗性基因(bla；浅灰色)。也示出了克隆步骤相关的限制位点。

图2示出了用于在棉桃阿舒氏囊霉中由GAP启动子靶定取代DES1前面的天然启动子的质粒pAG32-hyg-PAgGAP-AgDES1的图示。示出了棉桃阿舒氏囊霉TEF启动子(水平阴影)、棉桃阿舒氏囊霉TEF终止子(对角线阴影)、潮霉素抗性基因(深灰色)、用于同源重组的棉桃阿舒氏囊霉DES1的上游区域(US)(网格线)和棉桃阿舒氏囊霉DES1的5’区域(黑色)、和氨苄青霉素抗性基因(bla；浅灰色)。也示出了克隆步骤和转化相关的限制位点。

图3示出了用于在棉桃阿舒氏囊霉中由GAP启动子靶定取代DES1前面的天然启动子和在棉桃阿舒氏囊霉ENO启动子的控制下过表达棉桃阿舒氏囊霉LAG1的质粒pAG-LAG1-1的图示。示出了棉桃阿舒氏囊霉TEF启动子(水平阴影)、棉桃阿舒氏囊霉TEF终止子(对角线阴影)、潮霉素抗性基因(深灰色)、用于同源重组的棉桃阿舒氏囊霉DES1的上游区域(US)(网格线)和棉桃阿舒氏囊霉DES1的5’区域(黑色)、棉桃阿舒氏囊霉LAG1(黑色)和氨苄青霉素抗性基因(bla；浅灰色)。也示出了克隆步骤和转化相关的限制位点。

图4示出了用于在棉桃阿舒氏囊霉中由GAP启动子靶定取代DES1前面的天然启动子和在棉桃阿舒氏囊霉ENO启动子的控制下过表达棉桃阿舒氏囊霉LAF1的质粒pAG-LAF1-1的图示。示出了棉桃阿舒氏囊霉TEF启动子(水平阴影)、棉桃阿舒氏囊霉TEF终止子(对角线阴影)、潮霉素抗性基因(深灰色)、用于同源重组的棉桃阿舒氏囊霉DES1的上游区域(US)(网格线)和棉桃阿舒氏囊霉DES1的5’区域(黑色)、棉桃阿舒氏囊霉LAF1(黑色)和氨苄青霉素抗性基因(bla；浅灰色)。也示出了克隆步骤和转化相关的限制位点。

图5示出了用于靶定取代棉桃阿舒氏囊霉SYR2和在棉桃阿舒氏囊霉ENO启动子的控制下分别过表达棉桃阿舒氏囊霉DES1和LAF1的质粒pSSTH-LAF1-2的图示。示出了棉桃阿舒氏囊霉TEF启动子(水平阴影)、棉桃阿舒氏囊霉TEF终止子(对角线阴影)、kanMX抗性基因(深灰色)、棉桃阿舒氏囊霉SYR2的启动子区域(AgSUR2-P)和终止子区域(AgSUR2-T)(网格线)、棉桃阿舒氏囊霉DES1(黑色)、棉桃阿舒氏囊霉LAF1(黑色)和氨苄青霉素抗性基因(bla；浅灰色)。也示出了克隆步骤和转化相关的限制位点。

图6示出了用于靶定破坏棉桃阿舒氏囊霉8DES的质粒pAG32-D8D的图示。示出了棉桃阿舒氏囊霉TEF启动子(水平阴影)、棉桃阿舒氏囊霉TEF终止子(对角线阴影)、潮霉素抗性基因(深灰色)和氨苄青霉素抗性基因(bla；浅灰色)。也示出了克隆步骤和转化相关的限制位点。

图7示出了分离完整Pichia ciferrii LAG1基因座的三步方法。

扩增PcLAG1的内部一部分(I.)，之后进行两轮反向PCR(II.和III.)。标出了在各个步骤中使用的寡核苷酸，并且在不同阴影中表示的序列示出了PcLAG1基因座的几个部分，所述部分的DNA序列在各个步骤中确定。也示出了实验步骤相关的限制位点。

图8示出了分离完整Pichia ciferrii LAF1基因座的三步方法。

扩增PcLAF1的内部一部分(I.)，之后进行两轮反向PCR(II.和III.)。标出了在各个步骤中使用的寡核苷酸，并且在不同阴影中表示的序列示出了PcLAF1基因座的几个部分，所述部分的DNA序列在各个步骤中确定。也示出了实验步骤相关的限制位点。

图9示出了分离完整Pichia ciferrii YXC1基因座的六步方法。

扩增PcYXC1的内部一部分(I.)，之后进行五轮反向PCR(II.-V.)。标出了在各个步骤中使用的寡核苷酸，并且在不同阴影中表示的序列示出了PcYXC1基因座的几个部分，所述部分的DNA序列在各个步骤中确定。也示出了实验步骤相关的限制位点。

图10示出了分离完整Pichia ciferrii 8DES基因座的四步方法。

扩增Pc8DES的内部一部分(I.)，之后进行三轮反向PCR(II.-IV.)。标出了在各个步骤中使用的寡核苷酸，并且在不同阴影中表示的序列示出了Pc8DES基因座的几个部分，所述部分的DNA序列在各个步骤中确定。也示出了实验步骤相关的限制位点。

图11示出了用于在Pichia ciferrii中过表达PcDES1、AgLAF1和AgLAG1的质粒pPC-DES1-AgLAF1-AgLAG1的图示。示出了Pichia ciferrii TDH1(对角线阴影)和PDA1启动子(水平阴影或白色)、棉桃阿舒氏囊霉LAF1和LAG1基因(都是深灰色)、Pichia ciferrii DES1(对角线阴影)和L41基因(深灰色)、用于同源重组的5S-26S rDNA基因间区域(网格线)和氨苄青霉素抗性基因(bla；浅灰色)。也示出了克隆步骤相关的限制位点。

图12示出了用于在Pichia ciferrii中过表达PcDES1、PcLAF1和omCER的质粒p-mCER-nat1-PcLAF1的图示。示出了Pichia ciferrii TDH1启动子(白色)和PDA1启动子(水平阴影)、Pichia ciferrii LAF1(对角线阴影)、密码子优化的omCER(竖直阴影)和密码子优化的nat1基因(深灰色)、用于同源重组的5S-26S rDNA基因间区域(网格线)和氨苄青霉素抗性基因(bla；浅灰色)。也示出了克隆步骤相关的限制位点。

图13示出了用于在Pichia ciferrii中过表达PcLAG1和omCER的质粒p-mCER-nat1-PcLAG1的图示。示出了Pichia ciferriiTDH1启动子(白色)和PDA1启动子(水平阴影)、Pichia ciferrii ENO1终止子(深灰色)、TEF终止子(对角线阴影)、Pichia ciferrii LAG1(对角线阴影)、密码子优化的omCER(竖直阴影)和密码子优化的nat1基因(深灰色)、用于同源重组的5S-26S

rDNA基因间区域(网格线)和氨苄青霉素抗性基因(bla；浅灰色)。也示出了克隆步骤相关的限制位点。

图14示出了用于在Pichia ciferrii中过表达oCvLAG1和omCER的质粒p-mCER-nat1-oCvLAG1的图示。示出了Pichia ciferrii TDH1启动子(白色)和PDA1启动子(水平阴影)、Pichia ciferrii ENO1终止子(深灰色)、TEF终止子(对角线阴影)、密码子优化的oCvLAG1(对角线阴影)、密码子优化的omCER(竖直阴影)和密码子优化的natl基因(深灰色)、用于同源重组的5S-26S rDNA基因间区域(网格线)和氨苄青霉素抗性基因(bla；浅灰色)。也示出了克隆步骤相关的限制位点。

图15示出了用于在Pichia ciferrii中过表达omLASS5和omCER的质粒p-mCER-nat1-omLASS5的图示。示出了Pichia ciferrii TDH1启动子(白色)和PDA1启动子(水平阴影)、Pichia ciferrii ENO1终止子(深灰色)、TEF终止子(对角线阴影)、密码子优化的omLASS5(对角线阴影)、密码子优化的omCER(竖直阴影)和密码子优化的nat1基因(深灰色)、用于同源重组的5S-26S rDNA基因间区域(网格线)和氨苄青霉素抗性基因(bla；浅灰色)。也示出了克隆步骤相关的限制位点。

图16示出了用于靶定整合进Pichia ciferrii 5S-26S rDNA基因间区域并过表达Pichia ciferrii DES1、过表达密码子优化的omCER和过表达密码子优化的oCvLAG1的质粒pTH-LP-1的图示，所述基因中的每一个都处于Pichia ciferrii TDH1启动子的控制之下。示出了Pichia ciferrii TDH1启动子(白色)、Pichia ciferrii ENO1终止子(黑色)、Pichia ciferrii DES1(竖直阴影)、密码子优化的omCER(竖直阴影)、密码子优化的oCvLAG1(竖直阴影)、Pichia ciferriiPcL41放线菌酮抗性基因(黑色)、5S-26S rDNA基因间区域整合位点(IS；点线)和氨苄青霉素抗性基因(bla；浅灰色)。也示出了克隆步骤和转化相关的限制位点。

图17示出了用于靶定破坏Pichia ciferrii编码鞘脂Δ8-去饱和酶的基因8DES并过表达Pichia ciferrii DES1、过表达密码子优化的omCER和过表达密码子优化的oCvLAG1的质粒pTH-deltaD8D的图示，所述基因中的每一个都处于Pichia ciferrii TDH1启动子的控制之下。示出了Pichia ciferriiTDH1启动子(白色)、Pichia ciferrii ENO1终止子(黑色)、Pichia ciferriiDES1(竖直阴影)、密码子优化的omCER(竖直阴影)、密码子优化的oCvLAG1(竖直阴影)、Pichia ciferrii PcL41放线菌酮抗性基因(黑色)、染色体整合位点8DES(点线)和氨苄青霉素抗性基因(bla；浅灰色)。也示出了克隆步骤和转化相关的限制位点。

图18示出了用于靶定失活Pichia ciferrii碱性神经酰胺酶基因(PcYXC1)并在Pichia ciferrii中同时过表达oCvLAG1、PcDES1、和omCER的质粒pSo-5的图示。示出了Pichia ciferrii TDH1启动子(P_TDH1，白色)、Pichia ciferriiENO1终止子(T_ENO1，黑色)、Pichia ciferrii DES1(对角线阴影)、密码子优化的omCER(竖直阴影)和密码子优化的oCvLAG1基因(水平阴影)、用于靶定整合的Pichia ciferrii YXC1碱性神经酰胺酶内部片段(网格线)，和氨苄青霉素抗性基因(bla；浅灰色)。也示出了克隆步骤相关的限制位点。

图19示出了棉桃阿舒氏囊霉菌株中鞘氨醇类碱组成的RP-HPLC分析结果。所分析的菌株是野生型ATCC19895(WT)及其衍生物，具有如下基因型：Δsyr2(Δsyr2)、Δsyr2 P_TDH3-DES1(Δsyr2 OP Des1p)、Δsyr2 P_TDH3-DES1P_ENO1-LAF1(Δsyr2 OP Deslp OP Laflp)和Δsyr2 P_ENO1-DES1 P_ENO1-LAF18DES::pAG32-D8D(Δsyr2 Δ8DES OP Deslp OP Laflp)。

实施例

实施例1

分别同时过量产生棉桃阿舒氏囊霉的酶Laflp和Deslp或Laglp和Deslp 的棉桃阿舒氏囊霉syr2突变株的构建

质粒pUG6-AgSUR2::kanMX被设计为用kanMX抗性基因取代棉桃阿舒氏囊霉SYR2基因，从而使其失活；质粒pAG-LAG1-1或pAG-LAF1-1是为了分别同时过表达棉桃阿舒氏囊霉DES1和LAG1或LAF1。棉桃阿舒氏囊霉SYR2序列通过使用被功能性鉴定的酿酒酵母二氢鞘氨醇C4-羟化酶(称为SUR2/SYR2)(Grilley et al.，1998；NCBI编号NC_001136.7)作为模板针对Ashbya Genome Database(http://ashbya.genome.duke.edu/blast.html/)进行BLASTP检索得到，检索结果是与棉桃阿舒氏囊霉基因AAL066W(GenBank编号#AAS50300，位于I号染色体上232310-233326位)显著匹配，分值为409字节(bit)(位置相同性和相似性分别是62％和78％)。由MWG Biotech(Ebersberg，Germany)合成如下寡核苷酸，以通过使用棉桃阿舒氏囊霉ATCC19895细胞作为模板进行菌落PCR扩增棉桃阿舒氏囊霉SYR2编码序列的下游区域，之后克隆进pUG6(EUROSCARF，Oberursel，GERMANY)：

AgSUR2T-fw：

TAT ATA GTT AAC AGG CAA AGC TGA CGC TGC TCT CC(SEQ IDNO：23中的核苷酸1719-1741；包含HpaI识别位点)

AgSUR2T-rv：

TAT ATA ACT AGT ATG GAC GCT GCA GTG CAG AAC C(SEQ IDNO：23中的核苷酸2500-2521；包含SpeI识别位点)

所述寡核苷酸用于根据Innis et al.，(PCR protocols.A guide to methodsand applications，1990，Academic Press)进行PCR反应，其中根据生产商说明使用PhusionTM High Fidelity PCR Master Mix(Finnzymes，cat.#F-531L)。通过进行此方法可以得到一个815bp片段。所述片段使用MinElute GelExtraction Kit(QIAGEN，cat.#28606)根据生产商说明进行纯化。之后用HpaI(New England Biolabs，cat.# R0138L)和SpeI(New England Biolabs，cat.#R0151S)消化2小时并与EcoRV(New England Biolabs，cat.#R0195L)和SpeI切割的pUG6用T4DNA Ligase(New England Biolabs，cat.#M0202L)根据生产商说明进行连接。将2.5μl连接产物根据生产商的方案中所描述的化学转化感受态大肠杆菌(E.coli)(Invitrogen One

TOP10，cat.#C4040-03)。同样得到质粒pUG6-AgSUR2-T(4806bp)。合成如下寡核苷酸以扩增同样需要克隆进pUG6的上游区域：

AgSUR2P-fw2：

TAT ATA CAG CTG CGT CTG TAC CAG AAC CTG TGC(SEQ IDNO：23中的核苷酸1-21；包含PvuII识别位点)

AgSUR2P-rv2：

TAT ATA GTC GAC CTA CGT CAT CCA TGA ACG ACA CT(SEQ IDNO：23中的核苷酸800-821；包含SalI识别位点)

所述寡核苷酸用于进行菌落PCR反应，其中使用Phusion^TM HighFidelity PCR Master Mix和棉桃阿舒氏囊霉ATCC19895细胞作为模板。通过进行此方法可以得到一个840bp片段。所述片段使用MinElute GelExtraction Kit进行纯化。之后用SalI(New England Biolabs，cat.#R0138L)和PvuII(New England Biolabs，cat.#R0151S)消化2小时并与SalI和PvuII切割的如上所述的pUG6-AgSUR2-T进行连接，产生图1所示的质粒pUG6-AgSUR2::kanMX(5537bp)。这个质粒适于在转化进棉桃阿舒氏囊霉之后由kanMX取代棉桃阿舒氏囊霉SYR2，从而使SYR2失活。

棉桃阿舒氏囊霉DES1序列通过使用被功能性鉴定的白假丝酵母二氢神经酰胺Δ4-去饱和酶(Ternes et al.，2002；NCBI编号NW_139432.1)作为模板针对Ashbya Genome Database(http://ashbya.genome.duke.edu/blast.html/)进行BLASTP检索得到，检索结果是与棉桃阿舒氏囊霉基因AGR025W(GenBank编号#AAS54514，位于VII号染色体上761515-762654bp)显著匹配，分值为378字节(bit)(氨基酸位置相同性和相似性分别是52％和65％)。合成如下寡核苷酸以扩增棉桃阿舒氏囊霉DES1编码序列的上游DNA区域：

AgDES1-US-fw：

TAT ATA GTT AAC TCC ATC AGC GCG ACA ACA GG(SEQ IDNO：22中的核苷酸1-20；包含HpaI识别位点)

AgDES1-US-rv：

TAT ATA GAG CTC TCC GAA TCG AGG CGT GTG TAG(SEQ ID

NO：22中的核苷酸830-850；包含SacI识别位点)

所述寡核苷酸用于进行菌落PCR反应，其中使用Phusion^TM HighFidelity PCR Master Mix和棉桃阿舒氏囊霉ATCC19895细胞作为模板。通过进行此方法可以得到一个874bp片段。所述片段使用MinElute GelExtraction Kit进行纯化。之后用HpaI(New England Biolabs，cat.#R0105S)和SacI(New England Biolabs，cat.#R0156S)消化2小时并与分别切割的载体pAG32(EUROSCARF，Oberursel，GERMANY)进行连接，产生质粒pAG32-AgDES1-US(4916bp)，所述质粒是用于进一步克隆步骤的中间质粒。接下来合成如下寡核苷酸以扩增棉桃阿舒氏囊霉DES1编码序列的5′-末端：

AgDES1-DS-fw：

ATG AAC CAA CGG GGT ATA GCG AC(SEQ ID NO：22中的核苷酸905-927)

AgDES1-DS-rv：

TAT ATA AAG CTT CTC TTC AAT GCT GAA GAG GTA GTG(SEQID NO：22中的核苷酸1652-1675；包含HindIII识别位点)

所述寡核苷酸用于进行菌落PCR反应，其中使用Phusion^TM HighFidelity PCR Master Mix和棉桃阿舒氏囊霉ATCC19895细胞作为模板。通过进行此方法可以得到一个783bp片段。所述片段使用MinElute GelExtraction Kit进行纯化。通过用Phusion^TM HighFidelity PCR Master Mix进行交叉PCR将棉桃阿舒氏囊霉3-磷酸甘油醛脱氢酶的启动子(SEQ IDNO：24)融合至前面扩增的棉桃阿舒氏囊霉DES1编码序列的5′-末端。所述启动子序列通过使用被功能性鉴定的酿酒酵母3-磷酸甘油醛脱氢酶(Holland et al.，1979；NCBI编号NC_001142.6)作为模板针对Ashbya GenomeDatabase(http://ashbya.genome.duke.edu/blast.html/)进行BLASTP检索得到，检索结果是与棉桃阿舒氏囊霉基因AER031C(GenBank编号#AAS52715，位于V号染色体上695233-696228bp)显著匹配，分值为530字节(bit)(氨基酸位置相同性和相似性分别是78％和89％)。合成如下寡核苷酸以扩增棉桃阿舒氏囊霉3-磷酸甘油醛脱氢酶编码序列起始密码子的上游启动子区域：

PGAP-fw：

TAT ATA GTC GAC GGC TCT CCT CGC TCT GCT CAA G(SEQ IDNO：24中的核苷酸1-23；包含SalI识别位点)

PGAP-rv：

GTC GCT ATA CCC CGT TGG TTC ATT GTG CGG TGT GTA TGTGTG GAC(SEQ ID NO：24中的核苷酸497-518和SEQ ID NO：22中的核苷酸1-23)

所述寡核苷酸用于进行菌落PCR反应，其中使用Phusion^TM HighFidelity PCR Master Mix和棉桃阿舒氏囊霉ATCC19895细胞作为模板。通过进行此方法可以得到一个550bp片段。所述片段使用MinElute GelExtraction Kit进行纯化。使用寡核苷酸PGAP-fw和AgDES1-DS-rv以及1μl前面扩增并纯化的棉桃阿舒氏囊霉3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因的启动子和棉桃阿舒氏囊霉DES1编码序列的5′-末端进行交叉PCR。通过进行此方法得到的1310bp片段使用MinElute Gel Extraction Kit进行纯化。之后用SalI(New England Biolabs，cat.#R0138S)和HindIII(New England Biolabs，cat.#R0104S)消化并与分别切割的如上所述的载体pAG32-AgDES1-US进行连接，产生图2所示的质粒pAG32-hyg-PAgGAP-AgDES1(6192bp)。这个质粒适于用棉桃阿舒氏囊霉3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因的启动子取代天然棉桃阿舒氏囊霉DES1启动子以获得提高的Deslp活性。所克隆的棉桃阿舒氏囊霉DES1基因的DNA上游区域、所克隆的棉桃阿舒氏囊霉DES1基因的5′-末端和所克隆的棉桃阿舒氏囊霉3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因的启动子的真实性通过由Sequiserve(Vaterstetten，GERMANY)进行的DNA测序进行确认，所述DNA测序使用Sanger et al.(Proceedings of the NationalAcademy of Sciences，U.S.A.，74：5463-5467)开发的双脱氧链终止法进行。在相应克隆的质粒pAG32-hyg-PAgGAP-AgDES1的DNA序列中缺少公开的DES1编码序列(GenBank编号#AAS50300；在Ashbya Genome Database：http://ashbya.genome.duke.edu/blast.html/中AGR025W)的核苷酸382、489和405，导致公开的蛋白质序列在氨基酸位置29-34改变为ANLPI，这与其他所有酵母Deslp中的相应区域相同。因此，公开的棉桃阿舒氏囊霉DES1DNA序列很可能含有序列错误。

棉桃阿舒氏囊霉LAG1序列通过使用被功能性鉴定的称为LAC1的酿酒酵母神经酰胺合酶成份(Schorling et al.，2001；NCBI编号NC_001143.7)作为模板针对Ashbya Genome Database(http://ashbya.genome.duke.edu/blast.html/)进行BLASTP检索得到，检索结果是与棉桃阿舒氏囊霉基因ABR009W(NP_982955，位于II号染色体上408463-409704bp)显著匹配，分值为531字节(bit)(氨基酸位置相同性和相似性分别是64％和79％)。棉桃阿舒氏囊霉LAG1序列通过使用被功能性鉴定的称为LAF1的酿酒酵母神经酰胺合酶成份(Schorling et al.，2001；NCBI编号NC_001140.5)作为模板针对AshbyaGenome Database(http://ashbya.genome.duke.edu/blast.html/)进行BLASTP检索得到，检索结果是与棉桃阿舒氏囊霉基因ADL206W(GenBank编号#AAS51714，位于IV号染色体上340556-341674bp)显著匹配，分值为117字节(bit)(氨基酸位置相同性和相似性分别是32％和48％)。合成如下寡核苷酸以扩增LAG1编码序列：

AgLAC1-fw：

ATG GCT GAA AAT TCG TTA TTG AAG C(SEQ ID NO：11中的核苷酸1-25)

AgLAC1-PacI-rv：

TAT ATA TTA ATT AAG ACC TGT ATA TAT TCT AGT AGT G(SEQID NO：11中的核苷酸1388-1410；包含PacI识别位点)

所述寡核苷酸用于进行菌落PCR反应，其中使用Phusion^TM HighFidelity PCR Master Mix和棉桃阿舒氏囊霉ATCC19895细胞作为模板。通过进行此方法可以得到一个1241bp片段。所述片段使用MinElute GelExtraction Kit进行纯化。进行交叉PCR以将棉桃阿舒氏囊霉烯醇化酶编码基因前面的启动子如前述融合至LAG1编码序列。所述棉桃阿舒氏囊霉烯醇化酶编码基因的启动子序列通过使用被功能性鉴定的命名为ENO1和ENO2的酿酒酵母烯醇化酶同工酶(McAlister et al.，1982；NCBI编号NC_001139.7和NC_001140.5)作为模板针对Ashbya Genome Database(http://ashbya.genome.duke.edu/blast.html/)进行BLASTP检索得到，检索结果是与棉桃阿舒氏囊霉基因AER294C(GenBank编号#AAS52975，位于V号染色体上1176724-1178037bp)显著匹配，对于酿酒酵母ENO1分值为734字节(bit)(氨基酸位置相同性和相似性分别是83％和91％)，对于酿酒酵母ENO2分值为709字节(bit)(氨基酸位置相同性和相似性分别是80％和87％)。选择在ENO1起始密码子上游大约455bp的区域并使用如下寡核苷酸进行扩增：

P-ENO-PacI-fw：

TAT ATA TTA ATT AAC TGT TCA CAG CCT TCT GAG AC(SEQ IDNO：25中的核苷酸1-21；包含PacI识别位点)

P-ENO-CO-LAG1-rv：

CCT GAC TTG GCC CGA CAT TTT GAA TTA TTT GAG TTT CGGAGG TGT TAA TC(SEQ ID NO：25中的核苷酸436-467和SEQ IDNO：13中的核苷酸1-18)

所述寡核苷酸用于进行菌落PCR反应，其中使用Phusion^TM HighFidelity PCR Master Mix和棉桃阿舒氏囊霉ATCC19895细胞作为模板。通过进行此方法可以得到一个475bp片段。所述片段使用MinElute GelExtraction Kit进行纯化。使用寡核苷酸P-ENO-PacI-fw和AgLAC1-PacI-rv以及1μl前述扩增并纯化的棉桃阿舒氏囊霉烯醇化酶编码基因的启动子和棉桃阿舒氏囊霉LAG1编码序列的PCR产物进行交叉PCR，其中使用Phusion^TM High Fidelity PCR Master Mix。通过进行此方法可以得到一个1716bp片段。所述片段使用MinElute Gel Extraction Kit进行纯化。之后用PacI(New England Biolabs，cat.#R0547S)消化2小时，与PacI切割并去磷酸化的(New England Biolabs，小牛肠碱性磷酸酶，cat.#M0290S)载体pAG32-hyg-PAgGAP-AgDES1如生产商的方案中所述进行连接，产生图3所示的质粒pAG-LAG1-1(8077bp)。这个质粒在转化进棉桃阿舒氏囊霉之后适于同时过表达棉桃阿舒氏囊霉DES1和LAG1。所克隆的棉桃阿舒氏囊霉烯醇化酶编码基因的启动子和棉桃阿舒氏囊霉LAG1编码序列的真实性通过由Sequiserve(Vaterstetten，GERMANY)进行的DNA测序进行确认。接下来合成如下寡核苷酸以扩增LAF1编码序列：

AgLAG1-fw：

ATG TCG GGC CAA GTC AGG C(SEQ ID NO：13中的核苷酸1-20)

AgLAG1-PacI-rv：

TAT ATA TTA ATT AAC TGC ATG CGC TGT CTG GCG(SEQ IDNO：13中的核苷酸1291-1309；包含PacI识别位点)

所述寡核苷酸用于进行菌落PCR反应，其中使用Phusion^TM HighFidelity PCR Master Mix和棉桃阿舒氏囊霉ATCC19895细胞作为模板。通过进行此方法可以得到一个1118bp片段。所述片段使用MinElute GelExtraction Kit进行纯化。进行交叉PCR以将棉桃阿舒氏囊霉烯醇化酶编码基因的启动子如上所述融合至LAF1编码序列。使用寡核苷酸P-ENO-PacI-fw和AgLAG1-PacI-rv以及1μl前述扩增并纯化的棉桃阿舒氏囊霉烯醇化酶编码基因的启动子和棉桃阿舒氏囊霉LAF1编码序列的PCR产物进行交叉PCR，其中使用Phusion^TM High Fidelity PCR Master Mix。通过进行此方法可以得到一个1593bp片段。所述片段使用MinElute GelExtraction Kit进行纯化。之后用PacI消化2小时，并与PacI切割并去磷酸化的如上所述的载体pAG32-hyg-PAgGAP-AgDES1进行连接，产生图4所示的质粒pAG-LAF1-1(7976bp)。这个质粒在转化进棉桃阿舒氏囊霉之后适于同时过表达棉桃阿舒氏囊霉DES1和LAF1。所克隆的棉桃阿舒氏囊霉烯醇化酶编码基因的启动子和棉桃阿舒氏囊霉LAF1编码序列的真实性通过由Sequiserve(Vaterstetten，GERMANY)进行的DNA测序进行确认。

棉桃阿舒氏囊霉ATCC19895的转化通过电穿孔方法进行。为了预防在液体培养基中培养时真菌菌丝体凝结成块，将其如下进行均质化：取一满环在琼脂平板(1g/l酵母提取物，10g/l蛋白胨，10g/l葡萄糖，0.3g/l肌醇和20g/l琼脂)上在30℃生长24h的菌丝体，在15ml反应管中重悬于2ml无菌水中。加入直径为3mm的无菌玻璃珠至充满凸出部分。将所述溶液在微型振荡器(IKA，Staufen，GERMANY)上全速振荡2min。用注射器移出均质化的菌丝体悬液并转移至具有隔板的含有70ml液体复合培养基(1g/l酵母提取物，10g/l蛋白胨，10g/l葡萄糖和0.3g/l肌醇)的250ml摇瓶中。以每分钟250转在30℃生长过夜，并通过真空过滤(Schleicher & Schuell VacufloPV050/2真空过滤单位)收获，用含有25mM二硫苏糖醇(DTT)的50mM磷酸盐缓冲液漂洗，在相同溶液中在28℃温育30min，并再次通过真空过滤收集。细胞接下来用含有270mM蔗糖和1mM MgCl₂的10mM Tris-HCl(pH7.5)漂洗，重悬于1ml相同溶液中并分为200μl小份。根据生产商的说明用HpaI(New England Biolabs，cat.#R0105S)将转化质粒DNApUG6-AgSUR2::kanMX、pAG-LAG1-1或pAG-LAF1-1线性化。DNA用标准苯酚：氯仿提取和乙醇沉淀方案进行纯化。将多至20μg的纯化的DNA加入到菌丝体悬液的200μl小份中，不超过体积的10％，装入预冷的2mm电穿孔杯中并用设置在1.5kV/cm，100Ω，和25μF的Gene Pulser(Bio-Rad，Munich，Germany)电击。在电穿孔之后，用移液器将菌丝体从电穿孔杯转移至如上述10ml液体复合培养基中，并在没有隔板的100ml摇瓶中以每分钟200转在30℃温育4-6h以进行细胞再生。为了施加选择压力，接下来向再生的细胞中加入10ml顶层琼脂(1g/l酵母提取物，10g/l蛋白胨，10g/l葡萄糖和0.3g/l肌醇，含有1％琼脂糖(w/v)加上750μg/ml遗传霉素G418和/或750μg/ml潮霉素B)，混和并铺至非选择性复合培养基琼脂平板(1g/l酵母提取物，10g/l蛋白胨，10g/l葡萄糖，0.3g/l肌醇和20g/l琼脂)上。在30℃温育2-3天后获得转化子。通过选择遗传霉素和/或潮霉素抗性孢子进行棉桃阿舒氏囊霉转化子的菌落纯化。为此，将转化子在孢子形成平板(10g/l酵母提取物，10g/l葡萄糖和20g/l琼脂)上划线并在30℃温育5天。接下来，将一满环真菌菌丝体重悬于含有10mg/ml得自哈茨木霉(Trichodermaharzianum)(Sigma-Aldrich，Taufkirchen，Germany)的裂解酶的1ml0.9％(w/v)NaCl中并在室温温育1h。通过离心(30s，13.200rpm)沉降的释放的孢子和细胞碎片用1ml0.9％(w/v)NaCl溶液漂洗并最后用等体积石蜡提取以通过在混和型研磨仪(Retsch，Hahn，Germany)中在30Hz振荡30s使两相彻底混和而富集孢子。不同相通过离心(30s，800rpm)分离。将0.9％(w/v)NaCl中的石蜡相的系列稀释物铺板至选择培养基800 30(1g/l酵母提取物，10g/l蛋白胨，10g/l葡萄糖，0.3g/l肌醇和20g/l琼脂，含有750μg/ml遗传霉素和/或750μg/ml潮霉素)上并在30℃温育2-3天。选择并培养出现的菌落以如实施例3所述通过反相HPLC量化并鉴定鞘氨醇类碱。

实施例2

同时过表达棉桃阿舒氏囊霉的酶Laflp和Deslp的棉桃阿舒氏囊霉SYR2 8DES双突变株的构建

质粒pSSTH-LAF1-2被设计为用kanMX抗性基因取代棉桃阿舒氏囊霉SYR2基因，从而使棉桃阿舒氏囊霉SYR2基因失活并同时过表达棉桃阿舒氏囊霉DES1和LAF1基因。如实施例1中所述获得棉桃阿舒氏囊霉SYR2、DES1和LAF1编码序列以及棉桃阿舒氏囊霉烯醇化酶编码基因的启动子序列。由MWG Biotech(Ebersberg，Germany)合成如下寡核苷酸以从棉桃阿舒氏囊霉ATCC19895细胞扩增DES1的编码序列：

AgDES1-DS-fw：

ATG AAC CAA CGG GGT ATA GCG AC(SEQ ID NO：22中的核苷酸905-927)

AgDES1-rv-SalI：

TAT ATA GTC GAC GAG TTT TGA CTC CTT CTG TCT C(SEQ IDNO：22中的核苷酸2246-2267；包含SalI识别位点)

所述寡核苷酸用于进行菌落PCR反应，其中使用棉桃阿舒氏囊霉ATCC19895细胞作为模板并根据Innis et al.，(PCR protocols.A guide tomethods and applications，1990，Academic Press)使用Phusion^TM High FidelityPCR Master Mix(Finnzymes，cat.#F-531L)根据生产商的说明进行。通过进行此方法可以得到一个1372bp片段。所述片段使用MinElute Gel ExtractionKit(QIAGEN，cat.#28606)根据生产商的说明进行纯化。合成如下寡核苷酸以扩增棉桃阿舒氏囊霉烯醇化酶编码基因的启动子：

AgPENO-fw-XbaI：

TAT ATA TCT AGA CTG TTCACA GCCTTCTGA GAC(SEQ IDNO：25中的核苷酸1-21；包含XbaI识别位点)

AgPENO-OEPCR-rv：

GTC GCT ATA CCC CGT TGG TTC ATT TTG AAT TAT TTG AGTTTC GGA GGT GTT AAT C(SEQ ID NO：25中的核苷酸436-467和SEQ ID NO：22中的核苷酸905-927)

所述寡核苷酸用于进行菌落PCR反应，其中使用Phusion^TM HighFidelity PCR Master Mix和棉桃阿舒氏囊霉ATCC19895细胞作为模板。通过进行此方法可以得到一个496bp片段。所述片段使用MinElute GelExtraction Kit进行纯化。使用寡核苷酸AgPENO-fw-XbaI和AgDES1-rv-SalI以及1μl前述扩增并纯化的棉桃阿舒氏囊霉烯醇化酶编码基因的启动子和棉桃阿舒氏囊霉DES1编码序列的PCR产物进行交叉PCR，其中使用Phusion^TM High Fidelity PCR Master Mix。通过进行此方法可以得到一个1846bp片段。所述片段使用MinElute Gel Extraction Kit进行纯化。之后用SalI(New England Biolabs，cat.#R0138S)和XbaI(New England Biolabs，cat.#R0145S)消化2小时，并与SalI和XbaI切割的载体pUG6-AgSUR2::kanMX(参见实施例1)如生产商的方案所描述的进行连接。使用2.5μl连接产物根据生产商的说明化学转化感受态大肠杆菌(Invitrogen One

TOP10，cat.#C4040-03)。同样得到质粒pSSTH(7323bp)。所克隆的棉桃阿舒氏囊霉烯醇化酶编码基因和棉桃阿舒氏囊霉DES1编码序列的片段的DNA序列的真实性通过由Sequiserve(Vaterstetten，GERMANY)进行的DNA测序进行确认。接下来合成如下寡核苷酸以扩增棉桃阿舒氏囊霉LAF1编码序列：

AgLAG1-fw：

ATG TCG GGC CAA GTC AGG C(SEQ ID NO：13中的核苷酸1-19)

AgLAG1-PacI-rv：

所述寡核苷酸用于进行菌落PCR反应，其中使用Phusion^TM HighFidelityPCRMaster Mix并使用棉桃阿舒氏囊霉ATCC19895细胞作为模板。通过进行此方法可以得到一个1118bp片段。所述片段使用MinElute GelExtraction Kit进行纯化。合成如下寡核苷酸以扩增棉桃阿舒氏囊霉烯醇化酶编码基因的启动子：

P-ENO-PacI-fw：

P-ENO-CO-LAG1-rv：

所述寡核苷酸用于进行菌落PCR反应，其中使用Phusion^TM HighFidelity PCR Master Mix并使用棉桃阿舒氏囊霉ATCC19895细胞作为模板。通过进行此方法可以得到一个475bp片段。所述片段使用MinElute GelExtraction Kit进行纯化。使用寡核苷酸P-ENO-PacI-fw和AgLAG1-PacI-rv以及1μl前述扩增并纯化的棉桃阿舒氏囊霉烯醇化酶编码基因的启动子和棉桃阿舒氏囊霉LAF1编码序列的PCR产物进行交叉PCR，其中使用Phusion^TM High Fidelity PCR Master Mix。通过进行此方法可以得到一个1593bp片段。所述片段使用MinElute Gel Extraction Kit进行纯化。之后用PacI(New England Biolabs，cat.#R0547S)消化2小时，并与PacI切割并去磷酸化(New England Biolabs，小牛肠碱性磷酸酶，cat.#M0290S)的载体pSSTH如前面所描述的进行连接，产生图5所示的质粒pSSTH-LAF1-2(9117bp)。这个质粒在转化进棉桃阿舒氏囊霉之后适于用kanMX取代棉桃阿舒氏囊霉SYR2，从而使其失活，并同时过表达棉桃阿舒氏囊霉DES1和LAF1。所克隆的棉桃阿舒氏囊霉烯醇化酶编码基因和棉桃阿舒氏囊霉LAF1编码序列的真实性通过由Sequiserve(Vaterstetten，GERMANY)进行的DNA测序进行确认。

质粒pAG32-D8D被设计为破坏棉桃阿舒氏囊霉8DES基因。8DES编码序列通过使用被功能性鉴定的乳酸克鲁维酵母的Δ(8)-鞘脂去饱和酶(Takakuwa et al.，2002；EMBL编号AB085690)作为模板针对Ashbya GenomeDatabase(http://ashbya.genome.duke.edu/blast.html/)进行BLASTP检索得到，检索结果是与棉桃阿舒氏囊霉基因AFL079W(GenBank编号#AAS53293，位于VI号染色体上290134-291750bp)显著匹配，分值为616字节(bit)(氨基酸位置相同性和相似性分别是56％和69％)。合成如下寡核苷酸以扩增8DES编码序列的一个内部区域：

AgD8D-HindIII-fw：

TAT ATA AAG CTT GCG CTG GAA GAT TGG GCA TGT G(SEQ IDNO：20中的核苷酸204-225；包含HindIII识别位点)

AgD8D-BamHI-rv：

TAT ATA GGA TCC GAG TCC AGC TTA ACA CGT AGA G(SEQ IDNO：20中的核苷酸1000-1021；包含BamHI识别位点)

所述寡核苷酸用于进行菌落PCR反应，其中使用Phusion^TM HighFidelity PCR Master Mix并使用棉桃阿舒氏囊霉ATCC19895细胞作为模板。通过进行此方法可以得到一个824bp片段。所述片段使用MinElute GelExtraction Kit进行纯化。之后用BamHI(New England Biolabs，cat.#R0136S)和HindIII(New England Biolabs，cat.#R0104S)消化2小时，并与BamHI和HindIII切割的如前所述的载体pAG32(EUROSCARF，Oberursel，GERMANY)连接，产生图6所示的质粒pAG32-D8D(4960bp)。这个质粒在转化进棉桃阿舒氏囊霉之后适于破坏棉桃阿舒氏囊霉8DES基因。所克隆的内部棉桃阿舒氏囊霉8DES序列的真实性通过由Sequiserve(Vaterstetten，GERMANY)进行的DNA测序进行确认。

棉桃阿舒氏囊霉的转化如实施例1中所述进行。质粒pSSTH-LAF1-2用HpaI(New England Biolabs，cat.#R0105S)线性化，质粒pAG32-D8D用MfeI(New England Biolabs，cat.#R0589S)线性化，并类似实施例1进行纯化。

实施例3

通过反相HPLC量化并鉴定棉桃阿舒氏囊霉菌株中的鞘氨醇类碱

对于HPLC分析，生长于含有合适的抗生素的YEPD平板上的棉桃阿舒氏囊霉突变株的菌丝体如实施例1所述进行均质化，接种于具有隔板的100ml三角瓶中的20ml YEPD培养基(蛋白胨2％(w/v)、酵母提取物1％(w/v)和葡萄糖2％(w/v))中并在30℃以250rpm生长3天。在此时细胞处于稳定期。将1ml菌丝体悬液转移至1.5ml反应管中，13200rpm离心1min并用移液管移出液体培养基。用1M HCl将样品填充至1.5ml并在80℃温育16h。将样品短暂混匀并将500μl悬液转移至新的1.5ml反应管中。加入1ml氯仿:甲醇(2:1)(v/v)并通过在混和型研磨仪(Retsch，Hahn，Germany)中在30Hz振荡30min提取脂类。样品在13200rpm离心5min并将500μl下层氯仿相转移至新的1.5ml反应管中。通过在60℃真空离心(ChristVakuumzentrifuge，Christ AG，Osterode)20min使溶剂蒸发，将沉淀重悬于适当体积的2-丙醇:H₂O(1:1)(v/v)中并在超声水浴中在40℃溶解10min。

为了确定菌丝体干重，从液体培养物中取出样品并通过滤纸过滤，如实施例1所述。收集的菌丝体在110℃干燥过夜并称重。

鞘氨醇类碱浓度使用反相高压液相色谱(RP-HPLC)确定。在C18植物鞘氨醇、C18二氢鞘氨醇和C18鞘氨醇的情况中，通过与可商购的参考物质进行校准而进行量化。在C18二氢鞘氨二烯醇(sphingadiene)的情况中，无可商购的参考物质。因此，C18二氢鞘氨二烯醇(sphingadiene)的浓度使用C18鞘氨醇作为校准物确定。

RP-HPLC详细情况：

仪器 Jasco；泵PU-2080，自动进样器AS-2055，荧光检测器FP-2020

柱 Kromasil C18，250mm x 4.6mm

RP-HPLC条件：

流速 2.00ml/min

样品体积 10μl

上柱前衍生化 2min，用等体积邻苯二甲醛(o-phtaldialdehyde，OPA)

注射体积 10μl

柱温 40℃

塔板温度环境温度

流动相甲醇∶水(92∶8)(w/v)

运行时间 8min

检测方法荧光

激发波长 340nm

发射波长 455nm

保留时间：

C18植物鞘氨醇 4.00min

C18二氢鞘氨二烯醇(sphingadiene) 4.40min

C18鞘氨醇 5.50min

C18二氢鞘氨醇 7.00min

这些分析的结果示于图19。对比于棉桃阿舒氏囊霉野生型菌株仅产生可忽略的量的鞘氨醇，所有过表达DES1并缺乏功能性SYR2基因的菌株都产生0.5mg鞘氨醇每克细胞干重。另外单独过表达LAF1或与插入失活8DES组合过表达LAF1使得不需要的副产物二氢鞘氨醇和二氢鞘氨二烯醇(sphingadienine)的形成急剧降低。

实施例4

从Pichia ciferrii F-60-10A NRRL 1031中分离基因组DNA

Pichia ciferrii F-60-10ANRRL 1031在250ml三角瓶中的50ml YEPD培养基(蛋白胨2％(w/v)、酵母提取物1％(w/v)和葡萄糖2％(w/v))中在30℃以200rpm生长并在18h后在OD₆₀₀为1.5时收集。用

DNAPurification Kit for Yeast and Gram-positive bacteria(Gentra Systems Inc.，cat.#D-6000A)根据生产商的说明分离染色体DNA。对分离的DNA用琼脂糖凝胶电泳进行定性检测显示了其高分子量(>16kbp)。

实施例5

Pichia ciferrii LAG1基因的克隆和核苷酸序列的确定扩增Pichia　ciferrii　LAG1基因的内部一部分

首先，通过用棉桃阿舒氏囊霉Laglp(GenBank acc.#NP_982955)作为模板进行TBLASTN检索，从完全的和未完成的真核基因组的NCBI数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom_table.cgi)中提取酵母菌亚门物种中推断的神经酰胺合酶的氨基酸序列。这个蛋白质与已鉴定的酿酒酵母Laclp和Laglp蛋白非常相似(氨基酸位置相同性分别是65％和69％)(Schorling ei　al.，2001；Guillasetal.，2003)，因此很可能具有神经酰胺合酶活性。所提取的序列(全部条目E-值<2 x 10^-123)使用ClustalW程序(www.ebi.ac.uk/clustalw)进行排列对比。用于扩增Pichia ciferrii LAG1基因的内部一部分的合适的寡核苷酸通过反翻译Laglp序列内部的氨基酸高度保守片段产生(考虑Pichiaciferrii密码子使用的高度偏性)。之后由MWG Biotech(Ebersberg，Germany)合成如下寡核苷酸：

LAC1-deg-fw：

TTY GTY GGT TTY TAY GCW ATH TTY TTY ACW TTY TTRMGW GAA TT(SEQ ID NO：1中的核苷酸1636-1679)

LAC1-deg-rv：

GGT TGW SWD ATC CAA CAT TTR TAT TGT TGW GT(SEQ IDNO：1中的核苷酸2297-2266)

这些寡核苷酸用于根据Innis et al.，(PCR protocols.A guide to methodsand applications，1990，Academic Press)进行菌落PCR反应，其中根据生产商的说明使用Phusion^TM High Fidelity PCR Master Mix(Finnzymes，cat.#F-531L)。通过进行此方法可以得到一个662bp片段。所述片段使用QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen，cat.#28706)根据生产商的说明进行纯化。

确定Pichia ciferrii LAG1基因的内部一部分的DNA序列

用Sanger et al.(Proceedings of the National Academy of Sciences，U.S.A.，74：5463-5467)开发的双脱氧链终止法确定纯化的PCR产物的DNA序列。使用用于PCR扩增的引物作为测序引物。DNA测序由Sequiserve(Vaterstetten，Germany)进行。得到的序列信息(662bp，相应于SEQ ID NO：1中的核苷酸1636-2297；图7A)使用Clone Manager7软件(Scientific &Educational Software)翻译为蛋白质，并将得到的氨基酸序列用作模板对NCBI非冗余蛋白质数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)进行BLASTP检索。所述检索鉴别出了一个与酿酒酵母Laclp(一个神经酰胺去饱和酶亚基)高度相似的乳酸克鲁维酵母蛋白(NCBI acc.#XP_452132)，这是在所述数据库中与所述新序列最为相似的蛋白质，确认了事实上扩增了Pichia ciferriiLAG1直系同源物的几部分。

扩增完整Pichia ciferrii LAG1基因并确定其DNA序列

为了确定完整Pichia ciferrii LAG1基因(编码序列、启动子区和3′-非翻译区)的DNA序列，之后进行反向PCR。得自Pichia ciferrii F-60-10A NRRL1031的染色体DNA(300ng)(如实施例4中所述分离的)用VspI(MBIFermentas，cat.#ER0911)根据生产商的说明消化过夜，总体积为50μl。消化的DNA用QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen，cat.#28106)根据生产商的说明进行纯化。洗脱出的DNA(50μl)用T4 DNA Ligase(New EnglandBiolabs，cat.#M0202L)根据生产商的说明进行过夜连接，总体积为200μl，使用800U的T4DNA Ligase。连接的DNA用QIAquick PCR Purification Kit根据生产商的说明进行纯化。2.5μl洗脱液作为模板用于根据Innis et al.，(PCR protocols.A guide to methods and applications，1990，Academic Press)进行的反向PCR反应。为此，应用靶向Pichia ciferrii LAG1基因已知部分的两个寡核苷酸：

PcLAC1-us-fw：

CCT TCT AAA ATC AAG AGA TTT ATG GAA CAA TC(SEQ ID NO：1中的核苷酸1732-1763)

PcLAC1-us-rv：

CCA ACA ATT GGT GCA AGG GGA C(SEQ ID NO：1中的核苷酸1721-1700)

扩增使用Phusion^TM High Fidelity PCR Master Mix根据生产商的说明进行。用此方法可获得2.2kbp PCR产物。所述片段使用Min Elute PCRPurification Kit(Qiagen，cat.#28006)根据生产商的说明进行纯化。这个片段的DNA序列如前述确定，其中使用寡核苷酸PcLAC1-us-fw、PcLAC1-us-rv、

-us-rv2：

TTA GAC AGA AGC TCA ACA GG(SEQ ID NO：1中的核苷酸1032-1013)、

-PcLAClintfw：

TTC AGC TGG TTA TTT GTC TC(SEQ ID NO：1中的核苷酸1240-1259)和

-PcLAClintrv：

TAA CCC AGA ATC AAG GTC(SEQ ID NO：1中的核苷酸94-77)

作为测序引物。新获得的序列信息包括SEQ ID NO：1中的核苷酸1-1635。无法获得所述DNA序列的下游新序列信息，因为3’VspI位点位于紧邻这一部分的下游(图7A)。为了获得Pichia ciferrii LAG1基因编码区的3′-末端及其3′-非翻译区的DNA序列，需要进行另一轮反向PCR。因此，重复上述实验方案，不同的是用HindIII(New England Biolabs，cat.#R0104S)消化Pichia ciferrii染色体DNA和在反向PCR期间使用如下寡核苷酸(由MWGBiotech(Ebersberg，Germany)合成)：

PcLAC1-ds-fw：

GGG AGA TTT TAA ATT AAA TTT TGC AAC TCA AC(SEQ ID NO：1中的核苷酸2241-2272)

PcLAC1-ds-rv：

CTG TTC TAA ATT CTG TTA AAA CTG ACC(SEQ ID NO：1中的核苷酸2239-2213)

用此方法可获得4.5kbp PCR产物。所述片段使用Min Elute PCRPurification Kit根据生产商的说明进行纯化。这个片段的DNA序列如前述确定，其中使用寡核苷酸PcLAC1-ds-fw；PcLAC1-ds-rv；

-PcLAC1dsfw2：

AAA TCA GGT TTA ACA ATG GC(SEQ ID NO：1中的核苷酸3152-3171)

-PcLAC1dsfw3：

AGT TGA TAA ATG ACG AAT GG(SEQ ID NO：1中的核苷酸4060-4079)和

-PcLAC1dsrv2：

GAA CGT ACT CTT GTA TCA CCC(SEQ ID NO：1中的核苷酸1343-1323)

作为测序引物。可以获得2655bp的新序列信息(SEQ ID NO：1中的核苷酸2298-4952)，所述序列延伸至3’VspI位点下游的下一个HindIII限制位点(图7B)。使用所描述的三步方法，可以分离总长为4952bp的Pichia ciferriiLAG1基因座，并且可以确定其DNA序列(参见SEQ ID NO：1和图7)。

如图7C所示的Pichia ciferrii LAG1基因座编码长度为429个氨基酸的Pichia ciferrii Laglp蛋白(SEQ ID NO：2)。Pichia ciferrii Laglp分别与从乳酸克鲁维酵母(GenBank acc.#XP_452132)和酿酒酵母(GenBank acc.#NC_001143)推断的神经酰胺合酶具有64％(80％)和62％(75％)的氨基酸位置相同性(相似性)。来自酿酒酵母的Laclp蛋白已经被生化鉴定并示出显示体内神经酰胺合酶活性(Schorling et al.，Molecular Biology of the Cell，12：3417-3427)。

实施例6

Pichia ciferrii LAF1基因的克隆和核苷酸序列的确定扩增Pichia ciferrii SSN8基因的内部一部分

由于用衍生自酵母菌亚门的Laflp蛋白的多序列排列对比的简并寡核苷酸扩增Pichia ciferrii LAF1基因(基因名称的选择类似于编码酿酒酵母中两个神经酰胺酶合酶亚基的基因名称LAC1和LAG1。它们源自在全部其他酵母(包括Pichia ciferrii)中也存在的LAG1基因的重复(duplication)。其他酵母(包括Pichia ciferrii)中的第二个神经酰胺酶合酶亚基是LAC1和LAG1的旁系同源物，而不是直系同源物，明显在酿酒酵母中不存在。因此，选择命名为LAF1。)的内部一部分失败了，因此我们利用了这样一个事实：在多数酵母菌亚门物种中，编码细胞周期蛋白C的SSN8基因位于LAF1基因的上游。首先，通过用棉桃阿舒氏囊霉Ssn8p(GenBank acc.#AAS51713)作为模板进行TBLASTN检索，从完全的和未完成的真核基因组的NCBI数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom_table.cgi)中提取酵母菌亚门物种的细胞周期蛋白C的氨基酸序列。所提取的序列(全部条目E-值<2 x 10^-52)使用ClustalW程序(www.ebi.ac.uk/clustalw)进行排列对比。用于扩增Pichiaciferrii SSN8基因的内部一部分的合适的寡核苷酸通过反翻译Ssn8p序列内部的氨基酸高度保守片段产生。之后由MWG Biotech(Ebersberg，Germany)合成如下寡核苷酸：

PcSSN8-deg-fw3：

GAA GAA TGT CCW CAA CAT ATH MGW(SEQ ID NO：3中的核苷酸1-24)

PcSSN8-deg-rv2：

YAA YAA CTG YAA ATC WGT DAT(SEQ ID NO：3中的核苷酸628-608)

这些寡核苷酸用于根据Innis et al.，(PCR protocols.A guide to methodsand applications，1990，Academic Press)进行PCR反应，其中根据生产商说明使用Phusion^TM High Fidelity PCR Master Mix(Finnzymes，cat.#F-531L)。通过进行此方法可以得到一个393bp片段。所述片段使用MinElute GelExtraction Kit(Qiagen，cat.#28606)根据生产商说明进行纯化。

确定Pichia ciferrii SSN8基因的内部一部分的DNA序列

用Sanger et al.(Proceedings of the National Academy of Sciences，U.S.A.，74：5463-5467)开发的双脱氧链终止法确定纯化的PCR产物的DNA序列。使用用于PCR扩增的引物作为测序引物。DNA测序由Sequiserve(Vaterstetten，Germany)进行。得到的序列信息(339bp，相应于SEQ ID NO：3中的核苷酸1-339；图8A)使用Clone Manager 7软件(Scientific & EducationalSoftware)翻译为蛋白质，并将得到的氨基酸序列用作模板对NCBI非冗余蛋白质数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)进行BLASTP检索。所述检索鉴别出了白假丝酵母Ssn8p(NCBI acc.#EAK97601)，这是在所述数据库中与所述新序列最为相似的蛋白质，确认了事实上扩增了Pichia ciferrii SSN8直系同源物的几部分。

扩增Pichia ciferrii LAF1基因并确定其DNA序列

为了确定Pichia ciferrii LAF1基因(编码序列、启动子区和3′-非翻译区)的DNA序列(在保守组织情况中应当位于SSN8基因下游)，之后进行反向PCR。得自Pichia ciferrii F-60-10A NRRL 1031的染色体DNA(300ng)(如实施例4中所述分离的)用HaeIII(New England Biolabs，cat.#R0108S)根据生产商的说明消化过夜，总体积为50μl。消化的DNA用QIAquick PCRPurification Kit(Qiagen，cat.#28106)根据生产商的说明进行纯化。洗脱出的DNA(50μl)用T4 DNA Ligase(New England Biolabs，cat.#M0202L)根据生产商的说明进行过夜连接，总体积为200μl，使用800U的T4 DNA Ligase。连接的DNA用QIAquick PCR Purification Kit根据生产商的说明进行纯化。2.5μl洗脱液作为模板用于根据Innis et al.，(PCR protocols.A guide tomethods and applications，1990，Academic Press)进行的反向PCR反应。为此，应用靶向Pichia ciferrii SSN8基因已知部分的两个寡核苷酸：

PcSSN8-ds-fw：

GCT GGT CAA TTA TAA ATG ATAGTT ATG(SEQ ID NO：3中的核苷酸293-319)

PcSSN8-ds-rv：

GTT ATT GCT ATT ATT ATT ATG ATT ATG ACC(SEQ ID NO：3中的核苷酸240-211)

扩增使用Phusion^TM High Fidelity PCR Master Mix根据生产商的说明进行。用此方法可获得1.8kbpPCR产物。所述片段使用MinElute GelExtraktion Kit(Qiagen，cat.#28606)根据生产商的说明进行纯化。这个片段的DNA序列如前述确定，其中使用寡核苷酸PcSSN8-ds-fw和PcSSN8-ds-rv作为测序引物。新获得的序列信息包括SEQ ID NO：3中的核苷酸340-1800。无法完整扩增LAF1基因，因为3’HaeIII位点位于LAF1基因内部(图8A)。为了获得Pichia ciferrii LAF1基因编码区的3′-末端及其3′-非翻译区的DNA序列，需要进行另一轮反向PCR。因此，重复上述实验方案，不同的是用Mph1103I(MBI Fermentas，cat.#ER0731)消化Pichia ciferrii染色体DNA和在反向PCR期间使用如下寡核苷酸(由MWG Biotech(Ebersberg，Germany)合成)：

PcLAG1-ds-fw：

GTT GGA TCT TGG TTA TAT TAT CAT TCA TC(SEQ ID NO：3中的核苷酸1738-1766)

PcLAG1-ds-rv：

TGT TCC ATA AAT CTT TGT TTA TCC TTT TGT G(SEQ ID NO：3中的核苷酸1700-1670)

用此方法可获得2.5kbp PCR产物。所述片段使用Min Elute PCRPurification Kit根据生产商的说明进行纯化。这个片段的DNA序列如实施例5所述确定，其中使用寡核苷酸PcLAg1-ds-fw、PcLAg1-ds-rv和

-PcLAG1dsfw2：

TTA AAC CCA AAT AAA CCT GG(SEQ ID NO：3中的核苷酸2620-2639)

作为测序引物。可以获得2396bp的新序列信息(SEQ ID NO：3中的核苷酸1801-4195)，所述序列延伸至3’HaeIII位点下游的下一个Mph1103I限制位点(图8B)。使用所描述的三步方法，可以分离总长为4195bp的Pichia ciferriiLAF1基因座，并且可以确定其DNA序列(参见SEQ ID NO：3和图8)。

如图8C所示的Pichia ciferrii LAF1基因座编码长度为385个氨基酸的Pichia ciferrii Laflp蛋白(SEQ ID NO：4)。Pichia ciferrii Laflp分别与从乳酸克鲁维酵母(GenBank acc.#XP_452132)和棉桃阿舒氏囊霉(GenBank acc.#AAS51714)推断的神经酰胺合酶具有64％(80％)和65％(79％)的氨基酸位置相同性(相似性)。

实施例7

Pichia ciferrii YXC1基因的克隆和核苷酸序列的确定

扩增Pichia ciferrii YXC1基因的内部一部分

首先，通过用棉桃阿舒氏囊霉YXC1基因(GenBank acc.#NP_986865)作为模板进行TBLASTN检索，从完全的和未完成的真核基因组的NCBI数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom_table.cgi)中提取酵母菌亚门物种的推断的神经酰胺酶的氨基酸序列。这个蛋白质与已鉴定的酿酒酵母Ypclp和Ydclp神经酰胺酶非常相似(氨基酸位置相同性分别是43％和44％)(Maoet al.，2000a，b)，因此很可能具有神经酰胺合酶活性。所提取的序列(全部条目E-值<1 x 10^-43)使用ClustalW程序(www.ebi.ac.uk/clustalw)进行排列对比。用于扩增Pichia ciferrii YXC1(基因名称的选择类似于编码酿酒酵母中两个神经酰胺酶的基因名称YPC1和YDC1，其中第二个字母表示相应酶的优选的底物植物神经酰胺和二氢神经酰胺。未知其他酵母物种(例如Pichiaciferrii)中的单一神经酰胺酶的底物偏好性，因此，选择命名为YXC1。)基因的内部一部分的合适的寡核苷酸通过反翻译Yxclp序列内部的氨基酸高度保守片段产生(考虑Pichia ciferrii密码子使用的高度偏性)。之后由MWGBiotech(Ebersberg，Germany)合成如下寡核苷酸：

ACER-deg-fw：

ATY GAT TGG TGT GAA GAA AAY TAY GT(SEQ ID NO：7中的核苷酸995-1020)

ACER-deg-rv-L2：

ACC DGT YAANAH ATG CCA CCA ACC ATG(SEQ ID NO：7中的核苷酸1633-1607)

这些寡核苷酸用于根据Innis et al.，(PCR protocols.A guide to methodsand applications，1990，Academic Press)进行PCR反应，其中根据生产商说明使用Phusion^TM High Fidelity PCR Master Mix(Finnzymes，cat.#F-531L)。通过进行此方法可以得到一个639bp片段。所述片段使用QIAquick GelExtraktion Kit(Qiagen，cat.#28706)根据生产商说明进行纯化。

确定Pichia ciferrii YXC1基因的内部一部分的DNA序列

用Sanger et al.(Proceedings of the National Academy of Sciences，U.S.A.，74：5463-5467)开发的双脱氧链终止法确定纯化的PCR产物的DNA序列。使用用于PCR扩增的引物作为测序引物。DNA测序由Sequiserve(Vaterstetten，Germany)进行。得到的序列信息(639bp，相应于SEQ ID NO：7中的核苷酸995-1633；图9A)使用Clone Manager 7软件(Scientific &Educational Software)翻译为蛋白质，并将得到的氨基酸序列用作模板对NCBI非冗余蛋白质数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)进行BLASTP检索。所述检索鉴别出了汉逊德巴利酵母Yxclp(NCBI acc.#XP_457637)，这是在所述数据库中与所述新序列最为相似的蛋白质，确认了事实上扩增了Pichia ciferrii YXC1直系同源物的几部分。

扩增完整Pichia ciferrii YXC1基因并确定其DNA序列

为了确定完整Pichia ciferrii YXC1基因(编码序列、启动子区和3′-非翻译区)的DNA序列，之后进行反向PCR。得自Pichia ciferrii F-60-10A NRRL1031的染色体DNA(300ng)(如实施例4中所述分离的)用DraI(MBIFermentas，cat.#ER0221)根据生产商的说明消化过夜，总体积为50μl。消化的DNA用QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen，cat.#28106)根据生产商的说明进行纯化。洗脱出的DNA(50μl)用T4 DNA Ligase(New EnglandBiolabs，cat.#M0202L)根据生产商的说明进行过夜连接，总体积为200μl，使用800U的T4DNA Ligase。连接的DNA用QIAquick PCR Purification Kit根据生产商的说明进行纯化。2.5μl洗脱液作为模板用于根据Innis et al.，(PCR protocols.A guide to methods and applications，1990，Academic Press)进行的反向PCR反应。为此，应用靶向Pichia ciferrii YXC1基因已知部分的两个寡核苷酸：

YPC1-IPCR-1-fw：

GCT GGA TTT GCC ATG TTT TCT GC(SEQ ID NO：7中的核苷酸1082-1104)

YPC1-IPCR-1-rv：

GCT TCT GCA ATA TAT GGA GTC ACA AC(SEQ ID NO：7中的核苷酸1044-1020)

扩增使用Phusion^TM High Fidelity PCR Master Mix根据生产商的说明进行。用此方法可获得0.3kbp PCR产物。所述片段使用Min Elute PCRPurification Kit(Qiagen，cat.#28006)根据生产商的说明进行纯化。这个片段的DNA序列如前述确定，其中使用寡核苷酸YPC1-IPCR-1-fw和YPC1-IPCR-1-rv作为测序引物。新获得的序列信息包括SEQ ID NO：7中的核苷酸795-994。无法获得所述DNA序列的下游新序列信息，因为3’DraI位点位于紧邻这一部分的下游(图9A)。为了获得Pichia ciferrii YXC1基因编码区的3′-末端及其3′-非翻译区的DNA序列，需要进行另一轮反向PCR。因此，重复上述实验方案，不同的是用Sau3AI(New England Biolabs，cat.#R0169S)消化Pichia ciferrii染色体DNA和在反向PCR期间使用如下寡核苷酸(由MWG Biotech(Ebersberg，Germany)合成)：

PcYPC1-IP-3-fw：

CAT GGT TGG TGG CAT DTN TTY ACH GG(SEQ ID NO：7中的核苷酸1607-1632)

PcYPC1-IP-3-rv：

CCA GAA AGG AAA ATA CCA ATT CCT TTAATC ATT G(SEQ IDNO：7中的核苷酸1512-1479)

用此方法可获得0.4kbp PCR产物。所述片段使用Min Elute PCRPurification Kit根据生产商的说明进行纯化。这个片段的DNA序列如前述确定，其中使用寡核苷酸PcYPC1-IP-3-fw和PcYPC1-IP-3-rv作为测序引物。可以获得153bp的新序列信息(SEQ ID NO：7中的核苷酸1634-1787)，所述序列延伸至3’DraI位点下游的下一个Sau3AI限制位点(图9B)。为了获得Pichia ciferrii YXC1上游区的进一步的信息，需要进行另一轮反向PCR。因此，重复上述实验方案，不同的是用BseMI(MBI Fermentas，cat.#ER1261)消化Pichia ciferrii染色体DNA和在反向PCR期间使用如下寡核苷酸(由MWG Biotech(Ebersberg，Germany)合成)：

PcYXC1-ds-fw：

GGG GAA ACA AGA TGA TTA TGA ATT G(SEQ ID NO：7中的核苷酸1687-1711)

PcYXC1-ds-rv：

CTA AAC CAG TTA AAA CAT GCC AC(SEQ ID NO：7中的核苷酸1637-1615)

用此方法可获得1.6kbp PCR产物。所述片段使用Min Elute PCRPurification Kit根据生产商的说明进行纯化。这个片段的DNA序列如前述确定，其中使用寡核苷酸PcYXC1-ds-fw和PcYXC1-ds-rv作为测序引物。可以获得684bp的新序列信息(SEQ ID NO：7中的核苷酸1788-2466)，所述序列延伸至3’Sau3AI位点下游的下一个BseMI限制位点(图9C)。为了获得Pichia ciferrii YXC1上游区的进一步的信息，需要进行另一轮反向PCR。因此，重复上述实验方案，不同的是用AvrII(New England Biolabs，cat.#R0174S)消化Pichia ciferrii染色体DNA和在反向PCR期间使用如下寡核苷酸(由MWG Biotech(Ebersberg，Germany)合成)：

PcYXC1-ds-fw2：

GGA GAG TTC ACG TAG TTT AGG AG(SEQ ID NO：7中的核苷酸2417-2439)

PcYXC1-ds-rv2：

GGA GTA TGA ATACAT TGA TCC GAT AAT G(SEQ ID NO：7中的核苷酸2358-2331)

用此方法可获得大约5.5kbp PCR产物。所述片段使用PCR PurificationKit根据生产商的说明进行纯化。这个片段的DNA序列如前述确定，其中使用寡核苷酸PcYXC1-ds-fw2作为测序引物。可以获得937bp的新序列信息(SEQ ID NO：7中的核苷酸2467-3402)(图9D)。为了获得Pichia ciferriiYXC1下游区的进一步的信息，需要进行另一轮反向PCR。因此，重复上述实验方案，不同的是用PagI(MBI Fermentas，cat.#ER1281)消化Pichia ciferrii染色体DNA和在反向PCR期间使用如下寡核苷酸(由MWG Biotech(Ebersberg，Germany)合成)：

PcYXC1-us-fw：

GGATAATCA GTT TAC CAT CAA AAG(SEQ ID NO：7中的核苷酸831-854)

PcYXC1-us-rv：

TATTGA TAA ACA ATT GAT ATT AGA TTA G(SEQ ID NO：7中的核苷酸830-803)

用此方法可获得大约4.0kbp PCR产物。所述片段使用Min Elute PCRPurification Kit根据生产商的说明进行纯化。这个片段的DNA序列如前述分为几个部分确定，其中使用寡核苷酸PcYXC1-us-rv作为测序引物。可以获得794bp的新序列信息(SEQ ID NO：7中的核苷酸1-794)(图9E)。

使用所描述的六步方法，可以分离总长为3402bp的Pichia ciferrii YXC1基因座，并且可以确定其DNA序列(参见SEQ ID NO：7和图9)。

如图9F所示的Pichia ciferrii YXC1基因座编码长度为284个氨基酸的Pichia ciferrii Yxclp蛋白(SEQ ID NO：8)。Pichia ciferrii Yxclp分别与从汉逊德巴利酵母(GenBankacc.#XP_457637)和酿酒酵母(GenBank acc.#NP_015238)推断的神经酰胺酶具有61％(75％)和46％(66％)的氨基酸位置相同性(相似性)。来自酿酒酵母的Ydclp蛋白已经被生化鉴定并示出显示体内神经酰胺酶活性(Mao et al.，The Journal of Biological Chemistry，275：31369-31378)。

实施例8

Pichia ciferrii鞘脂Δ8去饱和酶基因的克隆和核苷酸序列的确定

扩增Pichia ciferrii鞘脂Δ8去饱和酶基因的内部一部分

首先，通过用棉桃阿舒氏囊霉鞘脂Δ8去饱和酶基因(GenBank acc.#AAS53293)作为模板进行TBLASTN检索，从完全的和未完成的真核基因组的NCBI数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom_table.cgi)中提取酵母菌亚门物种的推断的鞘脂Δ8去饱和酶的氨基酸序列。这个蛋白质与已鉴定的乳酸克鲁维酵母鞘脂Δ8去饱和酶非常相似(氨基酸位置相同性分别是65％和59％)(Takakuwa et al.，2002)，因此很可能具有鞘脂Δ8去饱和酶活性。所提取的序列(全部条目E-值<7 x 10^-121)使用ClustalW程序(www.ebi.ac.uk/clustalw)进行排列对比。用于扩增Pichia ciferrii鞘脂Δ8去饱和酶基因的内部一部分的合适的寡核苷酸通过反翻译鞘脂Δ8去饱和酶序列内部的氨基酸高度保守片段产生(考虑Pichia ciferrii密码子使用的高度偏性)。之后由MWG Biotech(Ebersberg，Germany)合成如下寡核苷酸：

D8DES-fw：

5’-GAT GCW ACH GAT GAA ATG MAY GCW TAY C-3’(SEQ IDNO：5中的核苷酸2439-2466)

D8DES-rv：

5’-TTG RAA TTG YAA ACC ACC RTG NAA RAA ATC YAA CC-3’(SEQ ID NO：5中的核苷酸3839-3805)

这些寡核苷酸用于根据Innis et al.，(PCR protocols.A guide to methodsand applications，1990，Academic Press)进行PCR反应，其中根据生产商说明使用Phusion^TM High Fidelity PCR Master Mix(Finnzymes，cat.#F-531L)。通过进行此方法可以得到一个1401bp片段。所述片段使用QIAquick GelExtraktion Kit(Qiagen，cat.#28706)根据生产商说明进行纯化。

确定Pichia ciferrii 8DES基因的内部一部分的DNA序列

用Sanger et al.(Proceedings of the National Academy of Sciences，U.S.A.，74：5463-5467)开发的双脱氧链终止法确定纯化的PCR产物的DNA序列。使用用于PCR扩增的引物作为测序引物。DNA测序由Sequiserve(Vaterstetten，Germany)进行。得到的序列信息(1401bp，相应于SEQ ID NO：5中的核苷酸2439-3839；图10A)使用Clone Manager 7软件(Scientific &Educational Software)翻译为蛋白质，并将得到的氨基酸序列用作模板对NCBI非冗余蛋白质数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)进行BLASTP检索。所述检索鉴别出了乳酸克鲁维酵母鞘脂Δ8去饱和酶(NCBI acc.#XP_454832)，这是在所述数据库中与所述新序列最为相似的蛋白质，确认了事实上扩增了编码鞘脂Δ8去饱和酶的Pichia ciferrii直系同源物的几部分。

扩增完整Pichia　ciferrii鞘脂Δ8去饱和酶基因并确定其DNA序列

为了确定完整Pichia　ciferrii鞘脂Δ8去饱和酶基因(编码序列、启动子区和3′-非翻译区)的DNA序列，之后进行反向PCR。得自Pichia　ciferriiF-60-10A NRRL 1031的染色体DNA(300ng)(如实施例4中所述分离的)用HpyCH4V(New England Biolabs，cat.#R0620S)根据生产商的说明消化过夜，总体积为50μl。消化的DNA用QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen，cat.#28106)根据生产商的说明进行纯化。洗脱出的DNA(50μl)用T4DNA Ligase(New England Biolabs，cat.#M0202L)根据生产商的说明进行过夜连接，总体积为200μl，使用800U的T4 DNA Ligase。连接的DNA用QIAquick PCRPurification Kit根据生产商的说明进行纯化。2.5μl洗脱液作为模板用于根据Innis et al.，(PCR protocols.A guide to methods and applications，1990，Academic Press)进行的反向PCR反应。为此，应用靶向Pichia ciferrii鞘脂Δ8去饱和酶基因已知部分的两个寡核苷酸：

D8DES-IPCR-1-fw：

GGT GGG AAG TTC AGA ACT TTA GAA G(SEQ ID NO：5中的核苷酸2553-2577)

D8DES-IPCR-1-rv：

TTG AAT AGG CGG CAC AAA ATT GAT CC(SEQ ID NO：5中的核苷酸2552-2527)

扩增使用Phusion^TM High Fidelity PCR Master Mix根据生产商的说明进行。用此方法可获得0.6kbp PCR产物。所述片段使用Min Elute PCRPurification Kit(Qiagen，cat.#28006)根据生产商的说明进行纯化。这个片段的DNA序列如前述确定，其中使用寡核苷酸D8DES-IPCR-1-fw和D8DES-IPCR-1-rv作为测序引物。新获得的序列信息包括SEQ ID NO：5中的核苷酸2142-2438。为了获得编码Pichia ciferrii鞘脂Δ8去饱和酶的基因的上游区进一步的信息，需要进行另一轮反向PCR。因此，重复上述实验方案，不同的是用VspI(MBI Fermentas，cat.#ER0911)消化Pichia ciferrii染色体DNA和在反向PCR期间使用如下寡核苷酸(由MWG Biotech(Ebersberg，Germany)合成)：

PcD8DIPCR-US-fw：

GGG TCC TGT TGA AAA AAG CTA GG(SEQ ID NO：5中的核苷酸2229-2251)

PcD8DIPCR-US-rv：

CCA ACT GCT GGT TCA CCA AAA TAG(SEQ ID NO：5中的核苷酸2211-2188)

用此方法可获得大约3.4kbp PCR产物。所述片段使用Min Elute PCRPurification Kit根据生产商的说明进行纯化。这个片段的DNA序列如前述确定，其中使用寡核苷酸PcD8DIPCR-US-fw、PcD8DIPCR-US-rv、

-PcD8D-us-fw2：

TTA AAT GGT ATT TCC TTA GTG C(SEQ ID NO：5中的核苷酸3109-3130)和

-PcD8D-us-rv2：

GAT TCA TCT TCC ATT ATC ATC TC(SEQ ID NO：5中的核苷酸1343-1321)

作为测序引物。可以获得2141bp的新序列信息(SEQ ID NO：5中的核苷酸1-2141)，所述序列延伸至3’VspI位点上游的下一个VspI限制位点(图10B)。无法获得所述DNA序列的下游新序列信息，因为3’VspI位点位于紧邻这一部分的下游(图10B)。为了获得编码Pichia ciferrii鞘脂Δ8去饱和酶的基因编码区的3′-末端及其3′-非翻译区的DNA序列的进一步信息，需要进行另一轮反向PCR。因此，重复上述实验方案，不同的是用PagI(MBIFermentas，cat.#ER1281)消化Pichia ciferrii染色体DNA和在反向PCR期间使用如下寡核苷酸(由MWG Biotech(Ebersberg，Germany)合成)：

PcD8D-ds-fw：

AAA TAA GAA CAA CAA TGG AAT GTT G(SEQ ID NO：5中的核苷酸3769-3793)

PcD8D-ds-rv：

CTT TCT GAA GTT CCT AAA TCT G(SEQ ID NO：5中的核苷酸3754-3733)

用此方法可获得大约1.8kbp PCR产物。所述片段使用Min Elute PCRPurification Kit根据生产商的说明进行纯化。这个片段的DNA序列如前述确定，其中使用寡核苷酸PcD8D-ds-fw和PcD8D-ds-rv作为测序引物。可以获得1312bp的新序列信息(SEQ ID NO：5中的核苷酸3840-5106)，所述序列延伸至3’VspI位点下游的下一个PagI限制位点(图10C)。无法获得所述DNA序列的下游新序列信息，因为3’VspI位点位于紧邻这一部分的下游(图10B)。使用所描述的四步方法，可以分离总长为5106bp的Pichia ciferrii编码鞘脂Δ8去饱和酶的基因座，并且可以确定其DNA序列(参见SEQ IDNO：5和图10)。

如图10D所示的Pichia ciferrii基因座编码长度为597个氨基酸的Pichiaciferrii鞘脂Δ8去饱和酶Pc8Desp蛋白(SEQ ID NO：6)。Pc8Desp Pichiaciferrii鞘脂Δ8去饱和酶分别与从乳酸克鲁维酵母(GenBankacc.#XP_454832)和汉逊德巴利酵母(GenBank acc.#XP461611)的鞘脂Δ8去饱和酶具有62％(74％)和57％(70％)的氨基酸位置相同性(相似性)。来自乳酸克鲁维酵母的鞘脂Δ8去饱和酶8Desp蛋白已经被生化鉴定并示出显示体内鞘脂Δ8-Delta(8)鞘脂去饱和酶活性(Takakuwa et al.，Current Microbiology，45：459-461)。

实施例9

同时过量产生Pichia ciferrii的酶Laglp、Laflp和Deslp的Pichia ciferrii 突变株的构建

为了构建过表达Pichia ciferrii的酶Laglp、Laflp和Deslp的丁香霉素E抗性突变株，我们首先构建了整合DES1表达载体。

为此目的，用Pichia ciferrii F-60-10A NRRL 1031的染色体DNA(200ng)(如实施例4中所述分离的)作为模板根据Innis et al.(PCR protocols.A guideto methods and applications，1990，Academic Press)进行PCR以扩增P.ciferrii3-磷酸甘油醛脱氢酶(TDH1)的启动子区。为此应用如下寡核苷酸：

pGAP-BglII-for：

5′-TAT ATA AGA TCT GTG GTA CCT ACA TAC AAT TGA CCC-3′(在5′-末端包含BglII识别序列)

pGAP-NcoI-rev：

5′-TAT ATA CCA TGG TTA ATT AATTATTTG TTT GTT TG-3′(在5′-末端包含NcoI识别序列)。

所述片段用QIAquick PCR Purification Kit根据生产商的说明进行纯化。之后用BglII和NcoI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New EnglandBiolabs，Schwalbach，Germany的说明)消化PCR产物得到一个575bp片段，将此片段连接进分别切割的pAG25(Goldstein et al.，Three new dominantgene disruption cassettes for gene disruption in Saccharomyces cerevisiae，1999，Yeast)，生成具有融合至natl的P.ciferrii的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(TDH3)的启动子区的载体pTH-GAP-natl(3892bp)。插入体的方向和真实性通过DNA测序进行确定。连接、化学感受态大肠杆菌细胞的制备和转化通过本领域技术人员已知的方法进行。

为了将基因间间隔区作为整合位点插入进载体中，将Pichia ciferrii核糖体RNA操纵子的5S-26S rDNA基因间间隔区(intergenic spacer，IS)通过PCR进行扩增，其中用Pichia ciferrii F-60-10A NRRL 1031的染色体DNA(200ng)作为模板并使用如下寡核苷酸：

pIS-NdeI-for：

5′-TAT ATA CAT ATG CTA ATC ACA ACA GA ACAT TCT CTA ACG-3′(在5′-末端包含NdeI识别序列)

pIS-NdeI-rev：

5′-TAT ATA CAT ATG GCT AGA TTG ACA GAA GTC GAT CAG-3′(在5′-末端包含NdeI识别序列)

所述片段用QIAquick PCR Purification Kit根据生产商的说明进行纯化。之后用NdeI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)消化载体pTH-GAP-natl和PCR产物，之后进行连接，生成载体pTH-GAP-nat1-IS2(4864bp)。插入体的方向和真实性通过DNA测序进行确定。连接、化学感受态大肠杆菌细胞的制备和转化通过本领域技术人员已知的方法进行。

为了插入单一PmeI识别位点以使载体pTH-GAP-nat1-IS2线性化，将整合进pTH-GAP-nat1-IS2的Pichia ciferrii核糖体RNA操纵子的5S-26SrDNA基因间间隔区(IS)的两个片段通过PCR进行扩增，其中用载体pTH-GAP-nat1-IS2作为模板。片段1用如下寡核苷酸扩增：

pIS-NdeI-rev：

PmeI-rv：

5′-CCC ATC CAC TAA GTT TAA ACA CCC ATA CAA AAT CGA GCTTCA AAT C-3′(在5′-末端包含与PmeI-fw-寡核苷酸互补的21bp序列和PmeI识别序列)

片段2用如下寡核苷酸扩增：

p-IS-NdeI-for：

5′-TAT ATA CAT ATG CTA ATC ACA ACA GAA CAT TCT CTA ACG-3′(在5′-末端包含NdeI识别序列)

PmeI-fw：

5′-TGT TTA AAC TTA GTG GAT GGG AAA CCC TGT AGA ACTGGG ACA AAC-3′

所述片段用QIAquick PCR Purification Kit根据生产商的说明进行纯化。最后，通过进行PCR获得片段1和2的融合体，其中用两个初级PCR产物(每个产物10ng)作为模板并使用寡核苷酸：

p-IS-NdeI-for：

pIS-NdeI-rev：

产生一个在两端都具有NdeI识别序列，并且在中间具有PmeI识别序列的978bp片段。

所述片段用QIAquick PCR Purification Kit根据生产商的说明进行纯化。用NdeI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)切割PCR产物和载体pTH-GAP-nat1-IS2。进行连接以产生载体pTH-GAP-nat1-IS2-PmeI(4879bp)。插入体的方向和真实性通过DNA测序进行确定。连接、化学感受态大肠杆菌细胞的制备和转化通过本领域技术人员已知的方法进行。为了引入Pichia ciferrii丙酮酸脱氢酶A亚基基因(PDA1)的启动子区控制下的Pichia ciferrii DES1基因，用Pichia ciferrii F-60-10A NRRL 1031的染色体DNA(200ng)作为模板PCR扩增DES1基因，其中使用如下寡核苷酸：

DES1-fw：

5′-TAG AAG TTC CAG AAA CTA CTT TCC AAA CTT CAA AAT CAACTT TAT TAT CAA TGG CTA CAA TTA CAC ATA GAA AAA ACCCTT CAC AAC-3′(在5′-末端包含与PDA1-rv寡核苷酸互补的50个碱基的序列)

DES1-rv：

5′-TAT ACT GCA GGCATA TTG TCA ATT CTA TTG TAC TTG AGTATT AAT GAT TA-3′(在5′-末端包含PstI识别序列)

相应地扩增Pichia ciferrii丙酮酸脱氢酶A亚基基因(PDA1)的启动子区，其中使用如下寡核苷酸：

PDA1-fw：

5′-TAT ACT GCA GTG TGC TCT AAA TTT GCC CGG TTC GCGACG-3′(在5′-末端包含PstI识别序列)

PDA1-rv：

5′-TGA TAA TAA AGT TGA TTT TGA AGT TTG GAA AGT AGT TTCTGG AAC TTC TA-3′

所述片段用QIAquick PCR Purification Kit根据生产商的说明进行纯化。最后，通过进行PCR获得DES1基因和PDA1启动子区的融合体，其中使用包含Pichia ciferrii DES1基因和PDA1启动子区的两个PCR产物(每个产物10ng)和寡核苷酸：

PDA1-fw：

DES1-rv：

5′-TAT ACT GCA GGC ATA TTG TCA ATT CTA TTG TAC TTG AGTATT AAT GAT TA-3′(在5′-末端包含PstI识别序列)

用此方法可获得2.2kbp PCR产物。所述片段用QIAquick PCRPurification Kit根据生产商的说明进行纯化。接下来用限制性核酸内切酶PstI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)消化PCR产物并连接进PstI切割的载体pTH-GAP-nat1-IS2-PmeI以产生载体pTH/DB-002a.1。插入体的方向和真实性通过DNA测序进行确定。连接、化学感受态大肠杆菌细胞的制备和转化通过本领域技术人员已知的方法进行。

为了用放线菌酮赋予的抗性盒取代诺尔丝菌素(nourseothricin)抗性盒，用SacI和SalI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)消化载体pTH/DB-002a.1。用QIAquick GelExtraction Kit根据生产商的说明凝胶纯化不含有诺尔丝菌素抗性盒的5667bp载体骨架。

为了产生放线菌酮赋予的抗性盒，通过PCR扩增两个片段，其中使用Pichia ciferrii F-60-10ANRRL 1031的基因组DNA作为模板：片段1用如下寡核苷酸扩增：

PcL41-SalI-fw：

5′-TAT AGT CGA CGA ATT CTC TTA AAT GAT GTT GG-3′(在5′-末端包含SalI识别序列)

PcL41-internal-rv：

5′-GTT TTA GCT TTT TTA TGG AAA ACT tGT TTG GTT TGA CCACCG TAA CCG G-3′(在5′-末端包含与PcL41-internal-fw-寡核苷酸互补的49bp序列，插入一个点突变(C变为A)以将L41p的aa 56从脯氨酸取代为谷氨酰胺以赋予放线菌酮抗性)

片段2用如下寡核苷酸扩增：

PcL41-internal-fw：

5′-CCG GTT ACG GTG GTC AAA CCA AAC aAG TTT TCC ATA AAAAAG CTA AAA CTA CCA AAA AAG TTG TTT TAC G-3′

PcL41-SacI-rv：

5′-TAT AGA GCT CAA TTC CAA TGT TTT GAT CTG TC-3′(在5′-末端包含SalI识别序列)

所述片段用QIAquick PCR Purification Kit根据生产商的说明进行纯化。最后，通过进行PCR获得所述两个片段的融合体，两个PCR产物(每个产物10ng)和寡核苷酸：

PcL41-SalI-fw：

PcL41-SacI-rv：

5′-TAT AGA GCT CAA TTC CAA TGT TTT GAT CTG TC-3′(在5′-末端包含SacI识别序列)

所得到的1.9kbp片段使用QIAquick PCR Purification Kit根据生产商的说明进行纯化。接下来用限制性核酸内切酶SalI和SacI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)消化PCR产物并连接进载体pTH/DB-002a.1(见上述)的5667bp载体骨架以产生载体pDB007。插入体的方向和真实性通过DNA测序进行确定。连接、化学感受态大肠杆菌细胞的制备和转化通过本领域技术人员已知的方法进行。

为了引入Pichia ciferrii3-磷酸甘油醛脱氢酶同工酶1(TDH1)的启动子区控制下的Pichia ciferrii LAF1基因，用Pichia ciferrii F-60-10A NRRL 1031的染色体DNA(200ng)作为模板PCR扩增LAF1基因，其中使用如下寡核苷酸：

PcLAG1-fw：

5′-CAA ACA AAC AAA CAA ATA ATT AAT TAA CAA TGA TTT CAACTT CAA CAA ATT CAT CAT C-3′(在5′-末端包含与PGAP-rv-寡核苷酸互补的29个碱基的序列)

PcLAG1-rv：

5′-CAG ACA AGT TTA ATA TAG ATACTT AAA C-3′

相应地扩增Pichia ciferrii 3-磷酸甘油醛脱氢酶同工酶1基因(TDH1)的启动子区，其中使用如下寡核苷酸：

PGAP-SbfI：

5′-TAT ATA CCT GCA GGT TAC CCA GTG GTA CCT ACA TAC-3′(在5′-末端包含SbfI识别序列)

PGAP-rv：

5′-CAT TGT TAA TTA ATT ATT TGT TTG TTT GTT TG-3′

所述片段用QIAquick PCR Purification Kit根据生产商的说明进行纯化。最后，通过进行PCR获得LAF1基因和TDH1启动子区的融合体，其中使用包含Pichia ciferrii LAF1基因和TDH1启动子区的两个PCR产物(每个产物10ng)和寡核苷酸：

PGAP-SbfI：

PcLAG1-rv：

5′-CAG ACA AGT TTA ATA TAG ATA CTT AAA C-3′

用此方法可获得1.9kbp PCR产物。所述片段用QIAquick PCRPurification Kit根据生产商的说明进行纯化。接下来用限制性核酸内切酶SbfI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)消化PCR产物并连接进SalI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)消化、之后用DNA Polymerase I(根据生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)进行Klenow填充并用SbfI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)消化的载体pDB007，生成载体pPC-DES1-PcLAF1。插入体的方向和真实性通过DNA测序进行确定。连接、化学感受态大肠杆菌细胞的制备和转化通过本领域技术人员已知的方法进行。

为了引入Pichia ciferrii丙酮酸脱氢酶A亚基基因(PDA1)的启动子区控制下的Pichia ciferrii LAG1基因，用Pichia ciferrii F-60-10A NRRL 1031的染色体DNA(200ng)作为模板PCR扩增LAG1基因，其中使用如下寡核苷酸：

PcLAC1-fw：

5′-GAA ACT ACT TTC CAA ACT TCA AAA TCA ACT TTA TTA TCAATG TCC ACT TCC AGA CCA CAG-3′(在5′-末端包含与PPDA-rv-寡核苷酸互补的39个碱基的序列)

PcLAC1-BsiWI-rv：

5′-TAT ACG TAC GTG GTA CAT ACG ATA TAA TCC ATG TAG-3′(在5′-末端包含BsiWI识别序列)

PPDA-BsiWI-fw-new：

5′-TAT ACG TAC GGA CGC ACC GGC CAT TTT CAA AC-3′(在5′-末端包含BsiWI识别序列)

PPDA-rv：

5′-CAT TGA TAA TAA AGT TGA TTT TGA AGT TTG GAA AGT AGTTTC-3′

所述片段用QIAquick PCR Purification Kit根据生产商的说明进行纯化。最后，通过进行PCR获得LAG1基因和PDA1启动子区的融合体，其中使用包含Pichia　ciferrii LAG1基因和PDA1启动子区的两个PCR产物(每个产物10ng)和寡核苷酸：

PPDA-BsiWI-fw-new：

PcLAC1-BsiWI-rv：

5′-TAT ACG TAC GTG GTA CAT ACG ATATAA TCC ATG TAG-3′(在5′-末端包含BsiWI识别序列)

用此方法可获得2.2kbp PCR产物。所述片段用QIAquick PCRPurification Kit根据生产商的说明进行纯化。接下来用限制性核酸内切酶BsiWI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)消化PCR产物并连接进BsiWI切割的载体pPC-DES1-PcLAF1产生载体pPC-DES1-PcLAF1-PcLAG1(示于图12)。插入体的方向和真实性通过DNA测序进行确定。连接、化学感受态大肠杆菌细胞的制备和转化通过本领域技术人员已知的方法进行。

载体pPC-DES1-PcLAF1-PcLAG1用PmeI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)线性化，之后用QIAquick PCR Purification Kit根据生产商的说明进行纯化。

实施例10

在丁香霉素E抗性Pichia ciferrii突变株中同时过量产生Pichia ciferrii的酶 Deslp和Laflp、棉桃阿舒氏囊霉的酶Laflp和Laglp、和小鼠碱性神经酰胺酶的质粒的构建

为了构建过表达Pichia ciferrii的酶Deslp和Laflp、棉桃阿舒氏囊霉的酶Laflp和Laglp、和密码子优化形式的小鼠碱性神经酰胺酶的丁香霉素E抗性突变株，首先设计了整合DES1表达载体。

为此目的，用Pichia ciferrii F-60-10A NRRL 1031的染色体DNA 200ng作为模板根据Innis et al.(PCR protocols.A guide to methods and applications，1990，Academic Press)进行PCR以扩增P.ciferrii 3-磷酸甘油醛脱氢酶(TDH1)(GenBank编号#AF053300)的启动子区。为此应用如下寡核苷酸：

pGAP-BglII-for：

pGAP-NcoI-rev：

5′-TAT ATA CCA TGG TTA ATT AAT TATTTG TTT GTT TG-3′(在5′-末端包含NcoI识别序列)。

所述片段用QIAquick PCR Purification Kit根据生产商的说明进行纯化。之后用BglII和NcoI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New EnglandBiolabs，Schwalbach，Germany的说明)消化PCR产物得到一个575bp片段，将此片段连接进分别切割的pAG25(Goldstein et al.，Three new dominantgene disruption cassettes for gene disruption in Saccharomyces cerevisiae，1999，Yeast)产生具有融合至nat1的P.ciferrii的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(TDH3)启动子区的载体pTH-GAP-nat1(3892bp)。插入体的方向和真实性通过DNA测序进行确定。连接、化学感受态大肠杆菌细胞的制备和转化通过本领域技术人员已知的方法进行。

为了将核糖体rDNA基因间间隔区作为整合位点插入进所述载体中，将Pichia ciferrii核糖体RNA操纵子的5S-26S rDNA基因间间隔区(IS)(GenBank编号#AF053301)通过PCR进行扩增，其中用Pichia ciferriiF-60-10A NRRL 1031的染色体DNA(200ng)作为模板并使用如下寡核苷酸：

pIS-NdeI-for：

pIS-NdeI-rev：

5′-TAT ATA CAT ATG GCT AGA TTG ACA GAA GTC GAT CAG-3′(在5′-末端包含NdeI识别序列)。

所述片段用QIAquick PCR Purification Kit根据生产商的说明进行纯化。用NdeI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)消化载体pTH-GAP-nat1和PCR产物，之后进行连接，产生载体pTH-GAP-natl-IS2(4864bp)。插入体的方向和真实性通过DNA测序进行确定。连接、化学感受态大肠杆菌细胞的制备和转化通过本领域技术人员已知的方法进行。

为了插入单一PmeI识别序列以使载体pTH-GAP-natl-IS2线性化，将整合进pTH-GAP-natl-IS2的Pichia ciferrii核糖体RNA操纵子(GenBank编号#AF053301)的5S-26S rDNA基因间间隔区(IS)的两个片段通过PCR进行扩增，其中用载体pTH-GAP-natl-IS2作为模板。片段1用如下寡核苷酸扩增：

pIS-NdeI-rev：

PmeI-rv：

5′-CCC ATC CAC TAA GTT TAA ACA CCC ATA CAA AAT CGA GCTTCA AAT C-3′(在5′-末端包含与PmeI-fw-寡核苷酸互补的21bp序列和PmeI识别序列)。

片段2用如下寡核苷酸扩增：

p-IS-NdeI-for：

PmeI-fw：

5′-TGT TTA AAC TTA GTG GAT GGG AAA CCC TGT AGA ACTGGG ACA AAC-3′。

p-IS-NdeI-for：

pIS-NdeI-rev：

所述片段用QIAquick PCR Purification Kit根据生产商的说明进行纯化。用NdeI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)切割PCR产物和载体pTH-GAP-natl-IS2。进行连接以产生载体pTH-GAP-natl-IS2-PmeI(4879bp)。插入体的方向和真实性通过DNA测序进行确定。连接、化学感受态大肠杆菌细胞的制备和转化通过本领域技术人员已知的方法进行。

为了引入Pichia ciferrii丙酮酸脱氢酶A亚基基因(PDA1)的启动子区(SEQ ID NO：27)控制下的Pichia ciferrii DES1基因(SEQ ID NO：26)，用Pichiaciferrii F-60-10A NRRL 1031的染色体DNA(200ng)作为模板PCR扩增DES1基因(SEQ ID NO：26)，其中使用如下寡核苷酸：

DES1-fw：

5′-TAG AAG TTC CAG AAA CTA CTT TCC AAA CTT CAA AAT CAACTT TAT TAT CAA TGG CTA CAA TTA CAC ATA GAA AAA ACCCTT CAC AAC-3′(在5′-末端包含与PDA1-rv-寡核苷酸互补的50bp序列)

DES1-rv：

5′-TAT ACT GCA GGC ATA TTG TCA ATT CTA TTG TAC TTG AGTATT AAT GAT TA-3′(在5′-末端包含PstI识别序列)。

相应地扩增Pichia ciferrii丙酮酸脱氢酶A亚基基因(PDA1)的启动子区(SEQ ID NO：27)，其中使用如下寡核苷酸：

PDA1-fw：

PDA1-rv：

5′-TGA TAA TAA AGT TGA TTT TGA AGT TTG GAA AGT AGT TTCTGGAAC TTC TA-3′。

PDA1-fw：

5′-TAT ACT GCA GTG TGCTCT AAA TTT GCC CGG TTC GCGACG-3′(在5′-末端包含PstI识别序列)

DES1-rv：

为了用放线菌酮抗性盒取代诺尔丝菌素(nourseothricin)抗性盒，用SacI和SalI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)消化载体pTH/DB-002a.1。用QIAquick GelExtraction Kit根据生产商的说明凝胶纯化不含有诺尔丝菌素抗性盒的5667bp载体骨架。

为了产生放线菌酮抗性盒，通过PCR扩增Pichia ciferrii L41基因(GenBank编号#AF053457)的两个片段，其中使用Pichia ciferrii F-60-10ANRRL 1031的基因组DNA作为模板：片段1用如下寡核苷酸扩增：

PcL41-SalI-fw：

5′-TAT AGT CGA CGA ATT CTC TTAAAT GAT GTT GG-3′(在5′-末端包含SalI识别序列)

PcL41-internal-rv：

5′-GTT TTA GCT TTT TTA TGG AAA ACT tGT TTG GTT TGA CCACCG TAA CCG G-3′(在5′-末端包含与PcL41-internal-fw-寡核苷酸互补的49bp序列，插入一个点突变(C变为A)以将L41p的aa56从脯氨酸取代为谷氨酰胺以赋予放线菌酮抗性)。

片段2用如下寡核苷酸扩增：

PcL41-internal-fw：

PcL41-SacI-rv：

5′-TAT AGA GCT CAA TTC CAA TGT TTT GAT CTG TC-3′(在5′-末端包含SalI识别序列)。

PcL41-SalI-fw：

PcL41-SacI-rv：

5′-TAT AGA GCT CAA TTC CAA TGT TTT GAT CTG TC-3′(在5′-末端包含SacI识别序列)。

为了引入Pichia ciferrii 3-磷酸甘油醛脱氢酶同工酶1(TDH1)的启动子区(GenBank编号#AF053300)控制下的棉桃阿舒氏囊霉LAF1基因(SEQ IDNO：13)，用棉桃阿舒氏囊霉ATCC 19895的染色体DNA(200ng)作为模板PCR扩增LAF1基因(SEQ ID NO：13)，其中使用如下寡核苷酸：

AgLAG1-fw：

5′-CAA ACA AAC AAA CAA ATA ATT AAT TAA CAA TGT CGG GCCAAG TCA GGC AG-3′(在5′-末端包含与PGAP-rv-寡核苷酸互补的32个碱基的序列)

AgLAG1-rv：

5′-CAT TAC CGA TCA CCA GGT AGG-3′。

相应地扩增Pichia ciferrii 3-磷酸甘油醛脱氢酶同工酶1基因(TDH1)的启动子区(GenBank编号#AF053300)，其中使用如下寡核苷酸：

PGAP-SbfI：

5′-TAT ATA CCT GCA GGT TACCCA GTG GTA CCT ACA TAC-3′(在5′-末端包含SbfI识别序列)

PGAP-rv：

5′-CAT TGT TAA TTA ATT ATT TGT TTG TTT GTT TG-3′。

所述片段用QIAquick PCR Purification Kit根据生产商的说明进行纯化。最后，通过进行PCR获得LAF1基因和TDH1启动子区的融合体，其中使用包含棉桃阿舒氏囊霉LAF1基因和Pichia ciferrii TDH1启动子区的两个PCR产物(每个产物10ng)和寡核苷酸：

PGAP-SbfI：

AgLAG1-rv：

5′-CAT TAC CGA TCA CCA GGT AGG-3′。

用此方法可获得1.8kbp PCR产物。所述片段用QIAquick PCRPurification Kit根据生产商的说明进行纯化。接下来用限制性核酸内切酶SbfI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)消化PCR产物并连接进SalI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)消化、之后用DNA Polymerase I的Klenow片段(根据生产商：New EnglandBiolabs，Schwalbach，Germany的说明)进行Klenow填充并用SbfI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)消化的载体pDB007，生成载体pPC-DES1-AgLAF1。插入体的方向和真实性通过DNA测序进行确定。连接、化学感受态大肠杆菌细胞的制备和转化通过本领域技术人员已知的方法进行。

为了引入Pichia ciferrii丙酮酸脱氢酶A亚基基因(PDA1)的启动子区(SEQ ID NO：27)控制下的棉桃阿舒氏囊霉LAG1基因(SEQ ID NO：11)，用棉桃阿舒氏囊霉ATCC 19895的染色体DNA(200ng)作为模板PCR扩增LAG1(SEQ ID NO：11)基因，其中使用如下寡核苷酸：

AgLAC1-fw：

5′-GAA ACT ACT TTC CAA ACT TCA AAA TCA ACT TTA TTA TCAATG GCT GAA AAT TCG TTA TTG AAG CCA C-3′(在5′-末端包含与PPDA-rv-寡核苷酸互补的42个碱基的序列)

AgLAC1-BsiWI-rv：

5′-TAT ACG TAC GGT GTA ATG GCG GTG GAA CAC-3′(在5′-末端包含BsiWI识别序列)。

PPDA-B siWI-fw-new：

PPDA-rv：

5′-CAT TGA TAA TAA AGT TGA TTT TGA AGT TTG GAA AGT AGTTTC-3′。

所述片段用QIAquick PCR Purification Kit根据生产商的说明进行纯化。最后，通过进行PCR获得LAG1基因和PDA1启动子区的融合体，其中使用包含棉桃阿舒氏囊霉LAG1基因和Pichia ciferrii PDA1启动子区的两个PCR产物(每个产物10ng)和寡核苷酸：

PPDA-BsiWI-fw-new：

AgLAC1-BsiWI-rv：

用此方法可获得2.1kbp PCR产物。所述片段用QIAquick PCRPurification Kit根据生产商的说明进行纯化。接下来用限制性核酸内切酶BsiWI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Gernany的说明)消化PCR产物并连接进BsiWI切割的载体pPC-DES1-AgLAF1产生载体pPC-DES1-AgLAF1-AgLAG1(示于图11)。插入体的方向和真实性通过DNA测序进行确定。连接、化学感受态大肠杆菌细胞的制备和转化通过本领域技术人员已知的方法进行。

载体pPC-DES1-AgLAF1-AgLAG1用PmeI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)线性化，之后用QIAquick PCR Purification Kit根据生产商的说明进行纯化。

另外，构建了包含Pichia ciferrii LAF1基因和为了在Pichia ciferrii中表达而优化的密码子优化形式的小鼠碱性神经酰胺酶的第二载体。

为此目的，用100ng FirstChoice PCR-Ready小鼠肾cDNA(Ambion，Inc.，Austin，TX，U.S.A.)作为模板进行PCR反应以扩增碱性小鼠神经酰胺酶的开放读框(mCER)(GenBank编号#AF347023)。因此，应用如下寡核苷酸：

mCER-fw：

5′-CAA ACA AAC AAA CAA ATA ATT AAT TAA CAA TGC ATG TACCGG GCA CCA G-3′(在5′-末端包含与寡核苷酸PGAP-rv互补的32个碱基的序列)

mCER-rv：

5′-CGT TAT ATA GGA AAG CAC CGA AGC TAA ATT CAG CAG TTCTTG TCA TTC TC-3′(在5′-末端包含与寡核苷酸TENO-fw互补的29个碱基的序列)。

PGAP-SbfI：

PGAP-rv：

5′-CAT TGT TAA TTA ATT ATT TGT TTG TTT GTT TG-3′。

所述片段用QIAquick PCR Purification Kit根据生产商的说明进行纯化。最后，通过进行PCR获得mCER基因和TDH1启动子区的融合体，其中使用包含小家鼠(Mus musculus)CER基因和Pichia ciferrii TDH1启动子区的两个PCR产物(每个产物10ng)和寡核苷酸：

PGAP-SbfI：

mCER-rv：

用此方法可获得1.4kbp PCR产物。所述片段用QIAquick PCRPurification Kit根据生产商的说明进行纯化。

为了将Pichia ciferrii的烯醇化酶基因(ENO1)终止子区(SEQ ID NO：28)与前述扩增的构建体融合，首先使用如下寡核苷酸扩增ENO1的终止子区：

TENO-fw：

5′-ATT TAG CTT CGG TGC TTT CCT ATA TAA CG-3′

TENO-fw-SbfI：

5′-TAT ATA CCT GCA GGT TAT AAC GGT TGG GCA ATG TTG AG-3′(在5′-末端包含SbfI识别序列)。

所述片段用QIAquick PCR Purification Kit根据生产商的说明进行纯化。最后，通过进行PCR反应获得TDH1启动子区控制下的mCER基因和ENO1终止子区的融合体，其中使用两个PCR产物(每个产物10ng)和寡核苷酸：

PGAP-SbfI：

TENO-fw-SbfI：

5′-TAT ATA CCT GCA GGT TAT AAC GGT TGG GCA ATG TTG AG-3′

(在5′-末端包含SbfI识别序列)。

用此方法可获得1.8kbp PCR产物。所述片段用QIAquick PCRPurification Kit根据生产商的说明进行纯化。接下来用限制性核酸内切酶SbfI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)消化PCR产物并连接进SbfI切割的载体pDB007以生成载体pPC-DES1-mCER。插入体的方向和真实性通过DNA测序进行确定。连接、化学感受态大肠杆菌细胞的制备和转化通过本领域技术人员已知的方法进行。

为了用诺尔丝菌素抗性盒取代放线菌酮抗性盒，用SacI和SalI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)消化载体pPC-DES1-mCER。用QIAquick Gel Extraction Kit根据生产商的说明凝胶纯化不含有放线菌酮抗性盒的7403bp载体骨架。

为了产生诺尔丝菌素赋予的抗性盒，通过PCR扩增三个片段。首先，扩增为了在Pichia ciferrii中表达而优化的密码子优化形式的赋予诺尔丝菌素抗性的nat1基因(SEQ ID NO：29)，其中使用GeneartGmbH(Regensburg，Germany)提供的载体pPCR-Script-nat1作为模板，使用寡核苷酸：

opt-nat1-fw：

5′-CAA AAT CAA CTT TAT TAT CAA TGG GTA CTA CTT TAG ATGATA C-3′(在5′-末端包含与寡核苷酸PPDA-rv互补的23个碱基的序列)

opt-nat1-rv：

5′-TCT TTT TAT TGT CAG TAC TGA TTA TTA TGG ACA TGG CATTGA C-3′(在5′-末端包含与寡核苷酸T-TEF-fw互补的21个碱基的序列)。

PPDA-SalI-fw：

5′-TAT GTC GAC TGT GCT CTA AAT TTG CCC GGT TC-3′(在5′-末端包含SalI识别序列)

PPDA-rv：

5′-CAT TGA TAA TAA AGT TGA TTT TGA AGT TTG GAA AGT AGTTTC-3′。

所述片段用QIAquick PCR Purification Kit根据生产商的说明进行纯化。最后，通过进行PCR获得密码子优化的nat1基因和PDA1启动子区的融合体，其中使用包含nat1基因和Pichia ciferrii PDA1启动子区的两个PCR产物(每个产物10ng)和寡核苷酸：

PPDA-SalI-fw：

opt-nat1-rv：

用此方法可获得1.3kbp PCR产物。所述片段用QIAquick PCRPurification Kit根据生产商的说明进行纯化。

为了将棉桃阿舒氏囊霉TEF终止子区与前述扩增的构建体融合，用棉桃阿舒氏囊霉ATCC 19895的染色体DNA(200ng)作为模板PCR扩增棉桃阿舒氏囊霉TEF终止子区(GenBank编号#A29820)，其中使用如下寡核苷酸：

T-TEF-fw：

5′-TCA GTA CTG ACA ATA AAA AGA TTC TTG-3′

T-TEF-SacI-rv：

5′-TGA GCT CTC GAC ACT GGA TGG CGG CGT TAG-3′(在5′-末端包含SacI识别序列)。

所述片段用QIAquick PCR Purification Kit根据生产商的说明进行纯化。最后，通过进行PCR反应获得Pichia ciferrii PDA1启动子控制下nat1基因和棉桃阿舒氏囊霉TEF终止子区的融合体，其中使用两个PCR产物(每个产物10ng)和寡核苷酸：

PPDA-SalI-fw：

T-TEF-SacI-rv：

所得到的1.5kbp片段使用QIAquick PCR Purification Kit根据生产商的说明进行纯化。接下来用限制性核酸内切酶SalI和SacI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)消化PCR产物并连接进载体pPC-DES1-mCER(见上述)的7403bp载体骨架以产生载体p-PC-DES1-mCER-nat1。插入体的方向和真实性通过DNA测序进行确定。连接、化学感受态大肠杆菌细胞的制备和转化通过本领域技术人员已知的方法进行。

为了用为在Pichia ciferrii中表达而优化的密码子优化形式的基因(omCER)取代mCER基因，用PacI和BsiWI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)消化载体pPC-DES1-mCER-nat1。用QIAquick Gel Extraction Kit根据生产商的说明凝胶纯化不含有mCER和DES1基因的5514bp载体骨架。

为了引入具有Pichia ciferrii ENO1基因的终止子区的小家鼠omCER基因，用GeneartGmbH(Regensburg，Germany)提供的载体pUC-kana-mCER作为模板进行PCR反应扩增omCER基因(SEQ ID NO：30)，其中使用如下寡核苷酸：

opt-mCER-PacI-fw：

5′-GGT ACC TTA ATT AAC AAT GCA TG-3′(在5′-末端包含PacI识别序列)

opt-mCER-rv：

5′-AGG AAA GCA CCG AAG CTA AAT TTA ACA ATT TTT ATC ATTTTC-3′(在5′-末端包含与寡核苷酸TENO-fw互补的21个碱基的序列)。

相应地扩增Pichia ciferrii ENO1基因的终止子区(SEQ ID NO：28)，其中使用如下寡核苷酸：

TENO-fw：

5′-ATT TAG CTT CGG TGC TTT CCT AIATAA CG-3′

T-ENO-BsiWI-rv：

5′-TAC GTA CGT TAT AAC GGT TGG GCA ATG TTG-3′(在5′-末端包含BsiWI识别序列)。

所述片段用QIAquick PCR Purification Kit根据生产商的说明进行纯化。最后，通过进行PCR反应获得omCER基因和ENO1终止子区的融合体，其中使用包含密码子优化形式的小家鼠CER基因和Pichia ciferrii ENO1终止子区的两个PCR产物(每个产物10ng)和寡核苷酸：

opt-mCER-PacI-fw：

5′-GGT ACC TTA ATT AAC AAT GCA TG-3′(在5′-末端包含PacT识别序列)

T-ENO-BsiWI-rv：

5′-TAC GTA CGT TAT AAC GGT TGG GCA ATG TTG-3′(在5′-末端包

含BsiWI识别序列)。

用此方法可获得1.2kbp PCR产物。所述片段用QIAquick PCRPurification Kit根据生产商的说明进行纯化。之后用限制性核酸内切酶PacI和BsiWI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)消化PCR产物并连接进载体pPC-DES1-mCER-nat1(见上述)的5514bp载体骨架以产生载体p-mCER-nat1。插入体的方向和真实性通过DNA测序进行确定。连接、化学感受态大肠杆菌细胞的制备和转化通过本领域技术人员已知的方法进行。

为了构建过表达omCER和Pichia ciferrii TDH1启动子(GenBank编号#AF053300)和ENO1(SEQ ID NO：28)终止子区控制下的第二基因的载体，首先扩增TDH1启动子，其中用Pichia ciferrii F-60-10A NRRL 1031的染色体DNA作为模板并使用寡核苷酸：

GAPDH-SpeI-fw：

5′-TAT ATA ACT AGT TTA CCC AGT GGT ACC TAC ATA C-3′(在5′-末端包含SpeI识别序列)

GAPDH-CO-rv：

5′-CCC GGG ATT TAA ATG GCG CGC CGT TAA TTA ATT ATT TGTTTG TTT GTT TG-3′(在5′-末端包含与寡核苷酸ENO-CO-fw-互补的22个碱基的序列)。

相应地扩增Pichia ciferrii ENO1基因的终止子区，其中使用如下寡核苷酸：

ENO-CO-fw：

5′-GGC GCG CCA TTT AAA TCC CGG GAT TTA GCT TCG GTG CTTTCC TA-3′

ENO-SpeI-rv：

5′-TAT ATA CCG CGG TTA TAA CGG TTG GGC AAT GTT G-3′(在5′-末端包含SpeI识别序列)。

所述片段用QIAquick PCR Purification Kit根据生产商的说明进行纯化。最后，通过进行PCR反应获得两个片段的融合体，其中使用两个PCR产物(每个产物10ng)和寡核苷酸：

GAPDH-SpeI-fw：

ENO-SpeI-rv：

在此可获得0.9kbp PCR产物。所述片段用QIAquick PCR PurificationKit根据生产商的说明进行纯化。之后用限制性核酸内切酶SpeI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)消化PCR产物并连接进SpeI切割的进载体p-mCER-nat1以产生载体p-mCER-nat1-X-B，其中Pichia ciferrii TDH1启动子与nat1表达盒方向相反。插入体的方向和真实性通过DNA测序进行确定。连接、化学感受态大肠杆菌细胞的制备和转化通过本领域技术人员已知的方法进行。

为了最终将Pichia ciferri的LAF1基因(SEQ ID NO：3)插入进携带omCER的载体p-mCER-nat1-X-B，扩增LAF1基因(SEQ ID NO：3)，其中用Pichia ciferrii F-60-10A NRRL 1031的染色体DNA作为模板并使用寡核苷酸：

PcLAF1-HpaI-fw：

5′-TAT ATA GTT AAC ATG ATT TCA ACT TCA ACA AAT TC-3′(在5′-末端包含HpaI识别序列)

PcLAF1-XmaI-rv：

5′-TAT ATA CCC GGG CTAATC ATC ATC TTC ATC ATC-3′(在5′-末端包含XmaI识别序列)。

所述片段用QIAquick PCR Purification Kit根据生产商的说明进行纯化。之后用限制性核酸内切酶HpaI和XmaI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)消化PCR产物并连接进用AscI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)切割、之后用DNA Polymerase I的Klenow片段(根据生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)进行Klenow填充并用XmaI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New EnglandBiolabs，Schwalbach，Germany的说明)消化的载体p-mCER-nat1-X-B，生成载体p-mCER-nat1-PcLAF1(示于图12)。插入体的方向和真实性通过DNA测序进行确定。连接、化学感受态大肠杆菌细胞的制备和转化通过本领域技术人员已知的方法进行。

载体p-mCER-nat1-PcLAF1用PmeI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)线性化，之后用QIAquick PCR Purification Kit根据生产商的说明进行纯化，之后转化进丁香霉素E抗性Pichia ciferrii突变株。

实施例11

田于在丁香霉素E抗性Pichia ciferrii突变株中同时过量产生Pichia ciferrii 的酶Deslp和Laglp、棉桃阿舒氏囊霉的酶Laflp和Laglp、和小鼠碱性神经酰胺酶的质粒的构建

为了过表达Pichia ciferrii的Deslp和棉桃阿舒氏囊霉的Laflp和Laglp，使用载体pPC-DES1-AgLAF1-AgLAG1(参见实施例11)。另外，构建用于过表达Pichia ciferrii的omCER基因和Laglp的载体。

为此目的，将Pichia ciferrii的LAG1基因(SEQ ID NO：1)插入进携带omCER的载体p-mCER-nat1-X-B(参见实施例11)内。首先，用Pichia ciferriiF-60-10A NRRL 1031的染色体DNA作为模板扩增LAG1(SEQ ID NO：1)基因，使用寡核苷酸：

PcLAG1-EcoRV-fw：

5′-TAT ATA GAT ATC ATG TCC ACT TCC AGA CCA CAG-3′(在5′-末端包含EcoRV识别序列)

PcLAG1-XmaI-rv：

5′-TAT ATA CCC GGG TTA TTC ACT CTT TTT TTC TTG-3′(在5′-末端包含XmaI识别序列)。

所述片段用QIAquick PCR Purification Kit根据生产商的说明进行纯化。之后用限制性核酸内切酶EcoRV和XmaI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)消化PCR产物并连接进用AscI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)切割、之后用DNA Polymerase I的Klenow片段(根据生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)进行Klenow填充并用XmaI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New EnglandBiolabs，Schwalbach，Germany的说明)消化的载体p-mCER-nat1-X-B，生成载体p-mCER-nat1-PcLAG1(示于图13)。插入体的方向和真实性通过DNA测序进行确定。连接、化学感受态大肠杆菌细胞的制备和转化通过本领域技术人员已知的方法进行。

载体p-mCER-nat1-PcLAG1用PmeI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)线性化，之后用QIAquick PCRPurification Kit根据生产商的说明进行纯化，之后转化进丁香霉素E抗性Pichia ciferrii突变株。

实施例12

用于在丁香霉素E抗性Pichia ciferrii突变株中同时过量产生Pichia ciferrii 的酶Deslp、棉桃阿舒氏囊霉的酶Laflp和Laglp、密码子优化形式的小鼠碱性神经酰胺酶、和密码子优化形式的颗石藻类病毒神经酰胺合酶的质粒的构建

为了过表达Pichia ciferrii的Deslp和棉桃阿舒氏囊霉的Laflp和Laglp，使用载体pPC-DES1-AgLAF1-AgLAG1(参见实施例10)。另外，构建用于过表达omCER基因和编码颗石藻类病毒神经酰胺合酶的为了在Pichia ciferrii中表达而优化的密码子优化的基因(oCvLAG1)的载体。

为此目的，将颗石藻类病毒的oCvLAG1基因(SEQ ID NO：31)插入进携带omCER的载体p-mCER-nat1-X-B(参见实施例11)内。首先，用限制性核酸内切酶HPaI和XmaI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New EnglandBiolabs，Schwalbach，Germany的说明)将oCvLAG1基因(SEQ ID NO：31)从Geneart GmbH(Regensburg，Germany)提供的载体pGA4-CVLAG1中切割出来，并连接进用SwaI和XmaI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：NewEngland Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)切割的载体p-mCER-nat1-X-B内，生成载体p-mCER-nat1-oCvLAG1(示于图14)。插入体的方向和真实性通过DNA测序进行确定。连接、化学感受态大肠杆菌细胞的制备和转化通过本领域技术人员已知的方法进行。

载体p-mCER-nat1-oCvLAG1用PmeI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)线性化，之后用QIAquick PCR Purification Kit根据生产商的说明进行纯化，之后转化进丁香霉素E抗性Pichia ciferrii突变株。

实施例13

用于在丁香霉素E抗性Pichia ciferrii突变株中同时过量产生Pichia ciferrii 的酶Deslp、棉桃阿舒氏囊霉的酶Laflp和Laglp、密码子优化形式的小鼠碱性神经酰胺酶、和密码子优化形式的小鼠神经酰胺合酶的质粒的构建

为了过表达Pichia ciferrii的Deslp和棉桃阿舒氏囊霉的Laflp和Laglp，使用载体pPC-DES1-AgLAF1-AgLAG1(参见实施例10)。另外，构建用于过表达omCER基因和密码子优化的小鼠神经酰胺合酶(omLASS5)的载体。

为此目的，将小鼠的omLASS5基因(SEQ ID NO：32)插入进携带omCER的载体p-mCER-nat1-X-B(参见实施例11)内。首先，用限制性核酸内切酶HpaI和XmaI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)将omLASS5基因(SEQ ID NO：32)从GeneartGmbH(Regensburg，Germany)提供的载体pUK-kana-omLASS5中切割出来，并连接进用AscI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New EnglandBiolabs，Schwalbach，Germany的说明)切割、之后用DNA Polymerase I的Klenow片段(根据生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)进行Klenow填充并用XmaI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：NewEnglandBiolabs，Schwalbach，Germany的说明)消化的载体p-mCER-nat1-X-B内，生成载体p-mCER-nat1-omLASS5(示于图15)。插入体的方向和真实性通过DNA测序进行确定。连接、化学感受态大肠杆菌细胞的制备和转化通过本领域技术人员已知的方法进行。

载体p-mCER-nat1-omLASS5用PmeI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)线性化，之后用QIAquick PCR Purification Kit根据生产商的说明进行纯化，之后转化进丁香霉素E抗性Pichia ciferrii突变株。

实施例14

丁香霉素E抗性Pichia ciferrii突变株的转化

丁香霉素E抗性Pichia ciferrii突变株的转化如最近所描述的进行(Baeet al.，Integrative transformation system for the metabolic engineering of thesphingoid base-producing yeast Pichia ciferrii.2003.Appl Environ Microbiol.；美国专利6,638,735)。

将丁香霉素E抗性Pichia ciferrii菌株(来自WO 2006/048458的SYR21-2C，图4)在YPD培养基中生长至600nm光密度为1至1.5。离心收集细胞并重悬于0.1培养体积的50mM磷酸盐缓冲液(pH7.5)中，在使用前向所述磷酸盐缓冲液中加入25mM二硫苏糖醇。在37℃温育15min后，将细胞用一培养体积的冰冷稳定液[270mM蔗糖，10mM Tris-HCl(pH7.5)，1mM MgCl₂]漂洗两次并重悬于0.01培养体积的稳定液中。5μl线性化的载体pPC-DES1-AgLAF1-AgLAG1、p-mCER-nat1-PcLAF1、p-mCER-nat1-PcLAG1、p-mCER-nat1-oCvLAG1或p-mCER-nat1-omLASS5(含有1.6μg DNA)与50μl细胞混和并在冰上温育10min。之后将转化混和物转移至2mm电穿孔杯中。电穿孔用GenePulser Xcell(Bio-RadLaboratories，München，Germany)在500V、50μF和700Ω根据生产商的说明进行。在电穿孔之后，细胞重悬于500μl稳定液中并转移至含有2ml YPD培养基的培养管中。细胞在30℃以每分钟250转过夜再生后，将再生培养物的小份铺板于含有0.5μg放线菌酮/毫升(pPC-DES1-AgLAF1-AgLAG1)或0.5μg放线菌酮/毫升和50μg/ml诺尔丝菌素(菌株已经含有pPC-DES1-AgLAF1-AgLAG1并已经用p-mCER-nat1-PcLAF1、p-mCER-nat1-PcLAG1、p-mCER-nat1-oCvLAG1或p-mCER-nat1-omLASS5转化)的YPD平板上。在30℃温育七天后，出现几十个菌落。

实施例15

由讨表达鞘氨醇类碱牛物合成基因的丁香霉素E抗性Pichia ciferrii突变株摇瓶生产乙酰化鞘氨醇

为了测试由过表达上述基因(PcDES1、AgLAF1、AgLAG1单独或与omCER组合，另外，与PcLAF1、PcLAG1、oCvLAG1或omLASS5组合)的丁香霉素E抗性突变株增加生产乙酰化鞘氨醇，培养相应菌株用于摇瓶生产乙酰化鞘氨醇(关于相应质粒参见表3)。

为此目的，在5ml YPD培养基中(试管内)接种所述菌株作为预培养物，在30℃以每分钟250转培养3天。接下来，用所述预培养物的1％接种20ml TAPS-Medium(在具有隔板的100ml Erlenmeyer烧瓶中)并在30℃以每分钟250转生长4天。

表1.TAPS培养基的组成

成份	分子式	每升
成份	分子式	每升	酵母提取物	-	1.0g
葡萄糖	C₆H₁₂O_6·1aq	33g	酵母提取物	-	1.0g
葡萄糖	C₆H₁₂O_6·1aq	33g	硫酸镁.7aq	MgSO_4·7H₂O	0.88g
氯化钙.2aq	CaCl_2·2H₂O	0.20g	硫酸镁.7aq	MgSO_4·7H₂O	0.88g
氯化钙.2aq	CaCl_2·2H₂O	0.20g	氯化铵	NH₄Cl	4.83g
氯化钠	NaCl	0.06g	氯化铵	NH₄Cl	4.83g
氯化钠	NaCl	0.06g	磷酸二氢钾	KH₂PO₄	1.0g
邻苯二甲酸二氢钾	KH₂C₈H₄O₄	20g	磷酸二氢钾	KH₂PO₄	1.0g
邻苯二甲酸二氢钾	KH₂C₈H₄O₄	20g	肌醇	C₆H₁₂O₆	0.059g
微量元素	溶液A	0.30ml	肌醇	C₆H₁₂O₆	0.059g
微量元素	溶液A	0.30ml	维生素溶液	溶液B	1.00ml

表2.微量元素和维生素母液的组成

微量元素	溶液A(g/L)
微量元素	溶液A(g/L)	(NH₄)₂Fe(SO₄)₂ZnSO_4·7H₂OCuSO_4·5H₂OMnSO_4·1H₂OH₃BO₃NaMoO_4·2H₂OKI	0.027g0.005g0.0075g0.0006g0.0006g0.0006g0.0015g
维生素溶液	溶液B		0.027g0.005g0.0075g0.0006g0.0006g0.0006g0.0015g
维生素溶液	溶液B	烟酸D-泛酸钙硫胺素(维生素B1)对氨基苯甲酸吡哆醇(维生素B6)d-生物素	0.003g0.003g0.003g0.002g0.0003g0.00001g

实施例16

在培养液中量化乙酰化鞘氨醇类碱

为了提取脂类，向15ml falcon管中1ml未分级分离的发酵液中加入4ml丙酮，在室温以每分钟250转水平振荡10分钟。之后将混和物在5.300g离心10分钟，，并在Jasco HPLC系统(LC-2000系列)上分析上清液。应用如下条件：

流动相：丙酮/水90:10(v/v)，含有0.05％(v/v)三氟乙酸(TFA)

流速： 1.0ml/min

运行时间： 11min

注射体积： 100μl

柱： Kromasil 100 C18(250 x 4.6mm，颗粒大小5μm)

柱温： 30℃

塔板温度：环境温度

UV检测波长： 200nm

乙酰化的碱通过与已确定的参考物质(DSM，Delft)对比保留时间和UV谱进行鉴定，相应地通过对比样品和参考物质的峰面积进行量化。

由过表达上述基因的丁香霉素E抗性Pichia ciferrii突变株摇瓶生产乙酰化鞘氨醇总结于表3。浓度单位为mg每克生物量干重。

表3.遗传工程化的Pichia ciferrii菌株的三乙酰化鞘氨醇类碱的量。浓度单位为mg每克生物量干重。

质粒	过表达的基因	TriASo	TriASa	总量
质粒	过表达的基因	TriASo	TriASa	总量	pPC-DES1-AgLAF1-AgLAG1	PcDES1，AgLAF1，AgLAG1	0.5	53.7	54.2
pPC-DES1-AgLAF1-AgLAG1p-mCER-nat1	PcDES1，AgLAF1，AgLAG1，omCER	1.4	43.3	44.7	pPC-DES1-AgLAF1-AgLAG1	PcDES1，AgLAF1，AgLAG1	0.5	53.7	54.2
pPC-DES1-AgLAF1-AgLAG1p-mCER-nat1	PcDES1，AgLAF1，AgLAG1，omCER	1.4	43.3	44.7	pPC-DES1-AgLAF1-AgLAG1p-mCER-nat1-PcLAF1	PcDES1，AgLAF1，AgLAG1，omCER，PcLAF1	3.1	29.0	32.1
pPC-DES1-AgLAF1-AgLAG1p-mCER-nat1-PcLAG1	PcDES1，AgLAF1，AgLAG1，omCER，PcLAG1	2.2	63.0	65.2	pPC-DES1-AgLAF1-AgLAG1p-mCER-nat1-PcLAF1	PcDES1，AgLAF1，AgLAG1，omCER，PcLAF1	3.1	29.0	32.1
pPC-DES1-AgLAF1-AgLAG1p-mCER-nat1-PcLAG1	PcDES1，AgLAF1，AgLAG1，omCER，PcLAG1	2.2	63.0	65.2	pPC-DES1-AgLAF1-AgLAG1p-mCER-nat1-oCvLAG1	PcDES1，AgLAF1，AgLAG1，omCER，oCvLAF1	5.3	25.7	31.0
pPC-DES1-AgLAF1-AgLAG1p-mCER-nat1-omLASS5	PcDES1，AgLAF1，AgLAG1，omCER，omLASS5	3.0	42.2	45.2	pPC-DES1-AgLAF1-AgLAG1p-mCER-nat1-oCvLAG1	PcDES1，AgLAF1，AgLAG1，omCER，oCvLAF1	5.3	25.7	31.0

实施例17

在丁香霉素E抗性Pichia ciferrii突变株中失活编码鞘脂Δ8去饱和酶的基因并同时过量产牛Pichia ciferrii的酶Deslp、密码子优化形式的小鼠碱性神经酰胺酶、和密码子优化形式的颗石藻类病毒神经酰胺合酶

Pichia ciferrii具有编码与乳酸克鲁维酵母鞘脂Δ8去饱和酶具有高度相似性的酶的基因(参见实施例8)，所述酶已知在鞘氨醇类碱的C-8和C-9之间引入一个双键(Takakuwa et al.，Current Microbiolo gy，45：459-61)。因此，这个酶的活性可能不利作用于鞘氨醇的产生，因为在二氢鞘氨醇中(无论其是游离鞘氨醇类碱或作为二氢神经酰胺的一个组分)引入这样一个双键会导致与形成鞘氨醇的共同前体的竞争。为了将上述鞘脂生物合成基因的过表达与编码Pichia ciferrii鞘脂Δ8去饱和酶的基因8DES的失活组合在一起，首先，用得自载体pDB006的在aa第56位含有一个点突变的的Pichia ciferriiPcL41基因取代载体p-mCER-nat1-oCvLAG1中的natl基因(参见实施例12)，所述点突变使得Pichia ciferrii在存在抗生素放线菌酮的条件下生长。为此目的，用限制性核酸内切酶SacI和SalI消化载体pTH-GAP-nat1-IS2-Pmel(参见实施例10)，并用QIAGEN QIAquick GelExtraction Kit凝胶纯化3448bp片段。为了得到PcL41基因(GenBank编号#AF053457)并引入所希望的点突变，通过PCR扩增两个片段，其中用Pichiaciferrii F-60-10A NRRL 1031的染色体DNA作为模板。片段1使用如下寡核苷酸扩增：

PcL41-SalI-fw：

5′-TATAGTCGACGAATTCTCTTAAATGGATGTTGG-3′(在5′-末端包含SalI识别序列)

PcL41-internal-rv：

5′-GTTTTAGCTTTTTTATGGAAAACTtGTTTGGTTTGACCACCGTAACCGG-3′

产生1222bp片段，其中包含与寡核苷酸PcL41-internal-fw互补的49bp序列，并插入一个从C变为A的点突变，将aa 56从脯氨酸取代为谷氨酰胺。

片段2用如下寡核苷酸扩增：

PcL41-internal-fw：

5′-CCGGTTACGGTGGTCAAACCAAACaAGTTTTCCATAAAAAAGCTAAAACTACCAAAAAAGTTGTTTTACG-3′

PcL41-SacI-rv：

5′-TATAGAGCTC _AATTCCAATGTTTTGATCTGTC-3′(在5′-末端包含SacI识别序列)

产生753bp片段，其中包含与寡核苷酸PcL41-internal-rv互补的49bp序列，并插入一个点突变(从C变为A)，将aa 56从脯氨酸取代为谷氨酰胺。所述两个片段用QIAGEN MinElute Gel Extraction Kit凝胶纯化。用每一个片段(2μl)作为模板，以及寡核苷酸PcL41-SalI-fw和PcL41-SacI-rv(见上述)进行交叉PCR。由此产生一个1906bp片段，在其末端具有SalI-和SacI-限制位点。之后用SalI和SacI消化所述片段，用QIAGEN MinElute PCR Purification Kit纯化，并连接进pTH-GAP-nat1-IS2-PmeI的3448bp骨架。连接、化学感受态大肠杆菌细胞的制备和转化、以及确认所希望的质粒的存在通过本领域技术人员已知的方法进行。所获得的质粒命名为pDB006。

用限制性核酸内切酶PstI和SacI(根据所述限制性核酸内切酶的生产商：New England Biolabs，Schwalbach，Germany的说明)消化质粒p-mCER-nat1-oCvLAG1，并用QIAGEN QIAquick Gel Extraction Kit凝胶纯化6997bp片段。插入体PcL41通过用PstI和SacI消化pDB006获得，类似地凝胶纯化1918bp片段，并接下来连接进所述载体。连接、化学感受态大肠杆菌细胞的制备和转化、以及确认所希望的质粒的存在通过本领域技术人员已知的方法进行。在此确认过程中，显然用于克隆步骤的SacI限制位点在所产生的命名为p-mCER-LP-PcvL41-oCvLAG1的质粒中不再存在。因此，对完整插入体和相邻区域进行测序以确认真实性。可以确认，可能由于SacI的星活性，载体p-mCER-nat1-oCvLAG1在属于oCvLAG1基因的烯醇化酶终止子区的识别序列GAGCTC未被切割，而是在序列GAGCTT被切割。因此，SacI识别位点在连接后不再存在，并且所述终止子被截短至211bp而不是332bp。这个事实被认为是不相关的，并且所述载体被用于下一步：引入Pichia ciferrii DES1基因(SEQ ID NO：26)。其通过PCR扩增，使用如下寡核苷酸：

PcDES1-PstI-fw：

5′-TATATACTGCAGTTACCCAGTGGTACCTACATAC-3′(在5′-末端包含PstI识别序列)

PcDES1-PstI-rv(5′-TATATACTGCAGTTATAACGGTTGGGCAATG-3′(在5′-末端包含PstI识别序列)

并使用Pichia ciferrii F-60-10A NRR L1031的染色体DNA作为模板。所得到的1983bp片段如上所述进行凝胶纯化、用限制性核酸内切酶PstI消化。并用QIAGEN QIAquick PCR Purification Kit进行PCR纯化。载体p-mCER-LP-PcvL41-oCvLAG1进行类似切割和纯化。连接、化学感受态大肠杆菌细胞的制备和转化、以及确认所希望的质粒的存在通过本领域技术人员已知的方法进行。通过进行本方法获得的质粒命名为pTH-LP-1。插入体的方向和真实性通过DNA测序确定。

编码Pichia ciferrii鞘脂Δ8去饱和酶的基因(SEQ ID NO：5)的一个内部区域通过PCR扩增，其中用Pichia ciferrii F-60-10A NRRL 1031的染色体DNA作为模板，并使用如下寡核苷酸：

PcD8D-PshAI-fw：

5′-TATATAGACAAAAGTCCAGTTCCAAAGTGCTC-3′(在5′-末端包含PstI识别序列)

PcD8D-BsiWI-rv：

5′-TATATACGTACGAAAATTGCACTAAGGAAATAC-3′(在5′-末端包含BsiWI识别序列)

855bp片段用QIAGEN MinElute Gel Extraction Kit凝胶纯化，并且接下来用限制性核酸内切酶PshAI和BsiWI根据生产商(New England Biolabs，Schwalbach，Germany)的说明进行消化。之后用QIAGEN MinElute PCRPurification Kit进行纯化，类似地消化载体pTH-LP-1，并用QIAGENQIAquick Gel Extraction Kit凝胶纯化9662bp片段。连接、化学感受态大肠杆菌细胞的制备和转化、以及确认所希望的质粒的存在通过本领域技术人员已知的方法进行。通过进行本方法获得的质粒命名为pTH-deltaD8D(示于图17)。插入体的方向和真实性通过DNA测序确定。

实施例18

在丁香霉素E抗性Pichia ciferrii菌株中失活编码碱性神经酰胺酶的基因并同时过量产生Pichia ciferrii的酶Deslp、密码子优化形式的小鼠碱性神经酰胺酶、和密码子优化形式的颗石藻类病毒神经酰胺合酶

Pichia ciferrii具有编码与酿酒酵母碱性神经酰胺酶具有高度相似性的酶的基因(参见实施例7)，所述酶已知优先水解含有植物鞘氨醇或二氢鞘氨醇而不是鞘氨醇作为鞘氨醇类碱的神经酰胺(Mao et al.，The Joumal ofBiological Chemistry，275：31369-31378)。因此，这个酶的活性可能不利于鞘氨醇的产生，因为含有二氢鞘氨醇作为鞘氨醇类碱的神经酰胺是形成鞘氨醇的前体。为了将上述鞘脂生物合成基因的过表达与Pichia ciferrii内源碱性神经酰胺酶基因YXC1的失活组合在一起，用编码Pichia ciferrii神经酰胺酶的基因的一个内部区域(SEQ ID NO：8)取代质粒pTH-deltaD8D上的基因间间隔区(IS)区域(参见实施例17和图17)。

首先，通过PCR扩增编码Pichia ciferrii神经酰胺酶的基因(SEQ IDNO：8)的两个内部的、部分重叠的片段，其中使用Pichia ciferrii F-60-10ANRRL 1031的染色体DNA作为模板，并分别使用寡核苷酸对OTKD284/OTKD285和OTKD286/OTKD287：

OTKD284：

5′-TAT ATA GAC AGA AGT CCA TAT CAT TTA CCA TTT GCT AAACC-3′(下划线：PshAI识别序列)

OTKD285：

5′-TAA ATC TCA ATT CAC ACT GGT GCT AAA TTA TTT TTA AATGCA GA-3′(下划线：AleI识别序列)

OTKD286：

5′-TAAAAATAATTTAGCACCAGTGTGAATTGAGATTTATATTGATAAGTT-3′(下划线：AleI识别序列)

OTKD287：

5′-TAT ATA CGT ACG CAA TATTATAGA AAT ACC AAT TGT-3′(下划线：BsiWI识别序列)

两个部分重叠的片段(分别是239和236bp)用QIAGEN QIAquick GelExtraction Kit进行凝胶纯化。用每一个片段(2μl)作为模板，以及寡核苷酸OTKD284和OTKD287(见上述)进行交叉PCR。获得在其末端具有单一PshAI和BsiWI位点，以及一个中间AleI位点的439bp DNA片段。所述片段用PshAI和BsiWI根据生产商(New England Biolabs，Schwalbach，Germany)的说明进行消化。之后用QIAGEN PCR Purification Kit纯化。类似地消化载体pTH-LP-1，并使用QIAGEN QIAquick Gel Extraction Kit凝胶纯化9662bp片段。两个片段的连接、化学感受态大肠杆菌细胞的制备和转化、以及确认所希望的质粒的存在通过本领域技术人员已知的方法进行。通过进行本方法获得的质粒命名为pSo-5(示于图18)。插入体的方向和真实性通过DNA测序确定。

实施例19

由讨表达鞘氨醇类碱牛物合成基因的丁香霉素E抗性Pichia ciferrii突变株摇瓶生产乙酰化鞘氨醇类碱，以及在培养液中量化乙酰化鞘氨醇类碱

如在实施例14中所描述的，在pSo-5用AleI消化之后，用实施例17和18的质粒转化丁香霉素E抗性Pichia ciferrii菌株。如在实施例15中所描述的，由丁香霉素E抗性Pichia ciferrii突变株摇瓶生产乙酰化鞘氨醇类碱，根据实施例16用RP-HPLC检测并量化乙酰化鞘氨醇类碱。

结果示于表4。引人注目的是，当使用编码Pichia ciferrii鞘脂Δ8去饱和酶的基因的片段替代rDNA基因间间隔区(pTH-LP-1)作为靶序列(pTH-deltaD8D)，从而导致基于质粒pTH-deltaD8D同源整合进染色体而引起的Pichia ciferrii 8DES失活时，三乙酰化鞘氨醇(TriASo)的量显著增加。另外，当使用编码Pichia ciferrii YXC1碱性神经酰胺酶的基因的片段替代rDNA基因间间隔区(pTH-LP-1)作为靶序列(pSo-5)，从而导致基于质粒pSo-5同源整合进染色体而引起的Pichia ciferrii YXC1失活时，三乙酰化鞘氨醇(TriASo)的总量和TriASo/TriASa比例都显著提高。

表4.遗传工程化的Pichia ciferrii菌株中质粒整合位点对三乙酰化鞘氨醇类碱水平的影响。浓度单位为mg每克生物量干重。

质粒	整合位点	TriASo	TriASa	总量	比例TriASo/TriASa
质粒	整合位点	TriASo	TriASa	总量	比例TriASo/TriASa	pTH-LP-1	基因间间隔区(IS)	21.66	59.47	81.13	0.36
pTH-deltaD8D	Pc8DES	33.45	69.90	103.35	0.48	pTH-LP-1	基因间间隔区(IS)	21.66	59.47	81.13	0.36
pTH-deltaD8D	Pc8DES	33.45	69.90	103.35	0.48	pSo-5	PcYXC1	28.47	52.76	81.23	0.53

序列表

<110>科兹莫弗姆有限公司

<120>使用遗传工程化的微生物菌株的改进的鞘氨醇类碱的生产

<130>WO10498

<160>32

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>4952

<212>DNA

<213>Pichia ciferrii

<220>

<221>CDS

<222>(1261)..(2550)

<223>Product：Pichia ciferrii ceramide synthase Laglp

<400>1

<210>2

<211>429

<212>PRT

<213>Pichia ciferrii

<400>2

<210>3

<211>4195

<212>DNA

<213>Pichia ciferrii

<220>

<221>CDS

<222>(1219)..(2376)

<223>Product：Pichia ciferrii ceramide synthase Laflp

<400>3

<210>4

<211>385

<212>PRT

<213>Pichia ciferrii

<400>4

<210>5

<211>5106

<212>DNA

<213>Pichia ciferrii

<220>

<221>CDS

<222>(2283)..(4076)

<223>Product：Pichia ciferrii sphingolipid Delta8 desaturase

<400>5

<210>6

<211>597

<212>PRT

<213>Pichia ciferrii

<400>6

<210>7

<211>3402

<212>DNA

<213>Pichia ciferrii

<220>

<221>CDS

<222>(917)..(1771)

<223>Product：Pichia ciferrii ceramidase Yxclp

<400>7

<210>8

<211>284

<212>PRT

<213>Pichia ciferrii

<400>8

<210>9

<211>288

<212>PRT

<213>Coccoli thovirus

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(288)

<223>Coccolithovirus(Emiliana huxleyi virus 86)ceramide synthase

(GenBank accession #YP_293768)

<400>9

<210>10

<211>414

<212>PRT

<213>Mus musculus

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(414)

<223>Mouse ceramide svnthase LASS5(GenBank accession # AAH43059)

<400>10

<210>11

<211>1410

<212>DNA

<213>Ashbya gossypii

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1242)

<223>Product：Ashbya gossypii ceramide synthase Laglp(NP_982955)

<400>11

<210>12

<211>413

<212>PRT

<213>Ashbya gossypii

<400>12

<210>13

<211>1309

<212>DNA

<213>Ashbya gossypii

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1119)

<223>Product：Ashbya gossypii ceramide synthase Laflp(GenBank

accession # AAS51714)

<400>13

<210>14

<211>372

<212>PRT

<213>Ashbya gossypii

<400>14

<210>15

<211>273

<212>PRT

<213>Mus musculus

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(273)

<223>Mousealkaline ceramidase(GenBank Accession # NP_783858)

<400>15

<210>16

<211>379

<212>PRT

<213>Ashbya gossypii

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(379)

<223>Ashbya.gossypii dihydroceramide desaturase Deslp(GenBank

accession # AAS54514)

<400>16

<210>17

<211>351

<212>PRT

<213>Pichia ciferrii

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(351)

<223>Pichia ciferrii dihydroceramide desaturase Deslp

<400>17

<210>18

<211>320

<212>PRT

<213>Coccol ithovirus

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(320)

<223>Coccolithovirus(Emiliana huxleyi virus 86)dihydroceramide

desaturase Deslp(GenBank accession # YP_293815)

<400>18

<210>19

<211>323

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(323)

<223>Human dihydroceramide desaturase Deslp(GenBank accession #

AAM12531)

<400>19

<210>20

<211>1627

<212>DNA

<213>Ashbya gossypii

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1617)

<223>Product：Sphingol ipid Delta8 desaturase(GenBank accession #

AAS53293)

<400>20

<210>21

<211>538

<212>PRT

<213>Ashbya gossypii

<400>21

<210>22

<211>2267

<212>DNA

<213>Ashbya gossypii

<400>22

<210>23

<211>2521

<212>DNA

<213>Ashbya gossypii

<400>23

<210>24

<211>518

<212>DNA

<213>Ashbya gossypii

<220>

<221>promoter

<222>(1)..(518)

<223>Promoter of the Ashbya gossypii TDH3 gene，encoding

glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GenBank accession#

AAS52715)

<400>24

<210>25

<211>467

<212>DNA

<213>Ashbya gossypii

<220>

<221>promoter

<222>(1)..(467)

<223>Promoter of the Ashbya gossypii ENO gene，encoding enolase

(GenBank accession # AAS52975)

<400>25

<210>26

<211>2534

<212>DNA

<213>Pichia ciferrii

<400>26

<210>27

<211>655

<212>DNA

<213>Pichia ciferrii

<220>

<221>promoter

<222>(1)..(655)

<223>Promoter of the Pichia ciferrii PDA1 gene，encoding the El alpha

subunit of the pyruvate dehydrogenase complex

<400>27

<210>28

<211>332

<212>DNA

<213>Pichia ciferrii

<220>

<221>terminator

<222>(1)..(332)

<223>Terminator of the Pichia ciferrii ENO gene，encoding enolase

<400>28

<210>29

<211>576

<212>DNA

<213>Synthetic DNA encoding nourseothricin acetyltransferase Natl from

Streptomyces noursei

<400>29

<210>30

<211>847

<212>DNA

<213>Synthetic DNA encoding alkaline ceramidase mCER from mouse

<400>30

<210>31

<211>913

<212>DNA

<213>Synthetic DNA encoding dihydroceramide synthase Laglp from Coccolithovirus

EhV-86

<400>31

<210>32

<211>1293

<212>DNA

<213>Synthetic DNA encoding dihydroceramide synthase LASS5 from mouse

<400>32

Claims

1.一种微生物菌株，所述微生物菌株产生，以每克CDW计，至少0.5mg的式I所示的鞘氨醇类碱：

或其盐或酯，其中R是X-(CH₂)_m-Y-(CH₂)_n-CH₃，其中

a.X是CH₂或CHOH，并且

b.m在0和4之间，优选地m是1，并且

c.Y是CH₂-CH₂，CH＝CH或CH＝CCH₃，并且

d.n在4和14之间，优选地n是8或10。

2.获得权利要求1的微生物菌株的方法，所述方法通过如下步骤进行：

a.提高编码具有神经酰胺合酶活性的酶和/或具有神经酰胺酶活性的酶的多核苷酸的表达，所述具有神经酰胺酶活性的酶能够优先或甚至特异性地水解含有式I所示的鞘氨醇类碱的神经酰胺，和/或

b.降低编码具有鞘脂Δ8去饱和酶活性的酶和/或具有神经酰胺酶活性的酶的多核苷酸的表达，所述具有神经酰胺酶活性的酶能够优先或甚至特异性地水解含有植物鞘氨醇或二氢鞘氨醇作为鞘氨醇类碱的神经酰胺，和

c.分离具有权利要求1限定的生产力的菌株。

3.权利要求2的方法，进一步包括提高编码具有二氢神经酰胺去饱和酶活性的酶的多核苷酸的表达。

4.权利要求2或3的方法，包括用一或多种权利要求2或3限定的编码所述酶的多核苷酸进行DNA介导的转化。

5.权利要求2-4任一项的方法，其中所述具有神经酰胺合酶活性的酶选自：

a.具有SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的多肽，

c.具有SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的多肽，

e.具有SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列的多肽，和

6.权利要求2-4任一项的方法，其中所述酶具有神经酰胺酶活性，所述神经酰胺酶能够优先或甚至特异性地水解含有式I所示的鞘氨醇类碱的神经酰胺，所述酶选自：

d.具有SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列的多肽，和

e.具有与SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列有至少70％序列相同性的氨基酸序列的多肽。

7.权利要求2-4任一项的方法，其中所述具有鞘脂Δ8去饱和酶活性的酶选自：

f.具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的多肽，和

g.具有与SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列有至少30％序列相同性的氨基酸序列的多肽。

8.权利要求2-4任一项的方法，其中所述酶具有神经酰胺酶活性，所述神经酰胺酶能够优先或甚至特异性地水解含有植物鞘氨醇或二氢鞘氨醇作为鞘氨醇类碱的神经酰胺，所述酶选自：

h.具有SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的多肽，和

i.具有与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列有至少25％序列相同性的氨基酸序列的多肽。

9.权利要求3或4的方法，其中所述具有二氢神经酰胺去饱和酶活性的酶选自：

j.具有SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列的多肽，和

k.具有与SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列有至少30％序列相同性的氨基酸序列的多肽。

10.权利要求2-9任一项的方法，其中所述编码具有鞘脂Δ8去饱和酶活性的酶或编码具有神经酰胺酶活性的酶的多核苷酸得自真菌或酵母，优选地得自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)、Pichia ciferrii、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、白假丝酵母(Candida albicans)、产朊假丝酵母(Candida utilis)或棉桃阿舒氏囊霉(Ashbyagossypii)，更优选地得自酵母Pichia ciferrii、棉桃阿舒氏囊霉或解脂耶氏酵母，所述神经酰胺酶能够优先或甚至特异性地水解含有植物鞘氨醇或二氢鞘氨醇作为鞘氨醇类碱的神经酰胺。

11.权利要求2-9任一项的方法，其中所述编码具有神经酰胺合酶活性的酶或编码具有二氢神经酰胺去饱和酶活性的酶的多核苷酸得自病毒、真菌、植物或动物，更优选地得自藻类病毒、酵母或哺乳动物，最优选地得自颗石藻类病毒属(Coccolithovirus)、糖酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤氏酵母属(Pichia)、耶罗威亚酵母属(Yarrowia)、假丝酵母属(Candida)、阿舒氏囊霉属(Ashbya)、小鼠、大鼠或人类。

12.权利要求2-9任一项的方法，其中所述编码具有神经酰胺酶活性的酶的多核苷酸得自动物，优选地得自哺乳动物，更优选地得自小鼠、大鼠或人类，所述神经酰胺酶能够优先或甚至特异性地水解含有式I所示的鞘氨醇类碱的神经酰胺。

13.用于生产式I所示的鞘氨醇类碱或其盐或酯的方法，包括在有益于产生所述鞘氨醇类碱的条件下对权利要求1的微生物菌株进行发酵，和从发酵液中收集所述鞘氨醇类碱。

14.显示神经酰胺合酶活性的多肽，其选自由具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多肽、具有与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列有至少70％、优选地至少80％、更优选地至少90％序列相同性的氨基酸序列的多肽、具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的多肽和具有与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列有至少55％、优选地至少60％、更优选地至少70％、更优选地至少80％、最优选地至少90％序列相同性的氨基酸序列的多肽组成的一组。

15.显示鞘脂Δ8去饱和酶活性的多肽，其选自由具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的多肽和具有与SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列有至少65％、优选地至少70％、更优选地至少80％、最优选地至少90％序列相同性的氨基酸序列的多肽组成的一组。

16.显示神经酰胺酶活性的多肽，所述神经酰胺酶优先或甚至特异性地水解具有植物鞘氨醇或二氢鞘氨醇作为鞘氨醇类碱的神经酰胺，所述多肽选自由具有SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的多肽和具有与SEQ IDNO：8所示的氨基酸序列有至少60％、优选地至少70％、更优选地至少80％、最优选地至少90％序列相同性的氨基酸序列的多肽组成的一组。