JP2009536521A - 遺伝的に操作された微生物株を用いる、スフィンゴイド塩基の改善された生産 - Google Patents
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Abstract
【選択図】 なし
Description
[式中、RはX−(CH2)m−Y−(CH2)n−CH3であり、
a)XはCH2またはCHOHであり、
b)mは0と4との間であり、最も好ましくはmは1であり、
c)YはCH2−CH2、CH=CH、またはCH=CCH3であり、
d)nは4と14との間であり、好ましくはnは8または10である]
をCDW1gあたり少なくとも0.5mg生産する、微生物株、とりわけ酵母株を提供する。
a.配列番号2および/または配列番号4のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
b.配列番号2のアミノ酸配列に対して少なくとも45%、および/または配列番号4のアミノ酸配列に対して少なくとも45%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、
c.配列番号9のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
d.配列番号9のアミノ酸配列に対して少なくとも45%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、
e.配列番号10のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および
f.配列番号10のアミノ酸配列に対して少なくとも45%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド
からなる群から選択されることが好ましい。
1.配列番号15のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および
2.配列番号15のアミノ酸配列に対して少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド
からなる群から選択される。
a.配列番号17のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および
b.配列番号17のアミノ酸配列に対して少なくとも30%、好ましくは少なくとも40%、より好ましくは少なくとも50%、60%、70%、80%、90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド
からなる群から選択される。
a.配列番号6のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および
b.配列番号6のアミノ酸配列に対して少なくとも30%、好ましくは少なくとも40%、より好ましくは少なくとも50%、60%、70%、80%、90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド
からなる群から選択される。
a.配列番号8のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および
b.配列番号8のアミノ酸配列に対して少なくとも25%、好ましくは少なくとも30%、より好ましくは少なくとも40%、50%、60%、70%、80%、90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド
からなる群から選択される。
(アシュビア・ゴシッピー酵素Laf1pおよびDes1p、またはLaq1pおよびDes1pをそれぞれ同時に過剰生産するアシュビア・ゴシッピーsyr2変異体の構築)
アシュビア・ゴシッピーSYR2遺伝子をkanMX耐性遺伝子で置換して、それによって不活性化するように、プラスミドpUG6−AgSUR2::kanMXを設計した。アシュビア・ゴシッピーDES1、およびLAG1またはLAF1をそれぞれ同時に過剰発現させるために、プラスミドpAG−LAG1−1またはpAG−LAF1−1を設計した。機能的に特徴付けされている、SUR2/SYR2(Grilleyら、1998年;NCBIアクセッション番号NC_001136.7)という名の、サッカロミセス・セレヴィジエのスフィンガニンC4−ヒドロキシラーゼを鋳型として用いて、アシュビア・ゲノム・データベース(Ashbya Genome Database)(http://ashbya.genome.duke.edu/blast.html/)に対してBLASTP検索を行うことによって、アシュビア・ゴシッピーSYR2配列を得た。この結果、アシュビア・ゴシッピー遺伝子AAL066W(GenBankアクセッション#AAS50300;染色体Iの232310〜233326位に位置)に、409ビットのスコアで有意な一致が得られた(それぞれ62%および78%の位置同一性および類似性)。アシュビア・ゴシッピーATCC19895細胞を鋳型として用いたコロニーPCRによって、アシュビア・ゴシッピーSYR2コード配列の下流領域を増幅し、その後pUG6(EUROSCARF社、独国オーバーウルゼル(Oberursel)所在)にクローニングするために、MWG Biotech社(独国エーバースベルク(Ebersberg)所在)が以下のオリゴヌクレオチドを合成した。
AgSUR2T−fw:
TAT ATA GTT AAC AGG CAA AGC TGA CGC TGC TCT CC(配列番号23中のnt1719−1741;HpaI認識部位を含む)
AgSUR2T−rv:
TAT ATA ACT AGT ATG GAC GCT GCA GTG CAG AAC C(配列番号23中のnt2500−2521;SpeI認識部位を含む)
TAT ATA CAG CTG CGT CTG TAC CAG AAC CTG TGC(配列番号23中のnt1−21;PvuII認識部位を含む)
AgSUR2P−rv2:
TAT ATA GTC GAC CTA CGT CAT CCA TGA ACG ACA CT(配列番号23中のnt800−821;SalI認識部位を含む)
AgDES1−US−fw:
TAT ATA GTT AAC TCC ATC AGC GCG ACA ACA GG(配列番号22中のnt1−20;HpaI認識部位を含む)
AgDES1−US−rv:
TAT ATA GAG CTC TCC GAA TCG AGG CGT GTG TAG(配列番号22中のnt830−850;SacI認識部位を含む)
AgDES1−DS−fw:
ATG AAC CAA CGG GGT ATA GCG AC(配列番号22中のnt905−927)
AgDES1−DS−rv:
TAT ATA AAG CTT CTC TTC AAT GCT GAA GAG GTA GTG(配列番号22中のnt1652−1675;HindIII認識部位を含む)
PGAP−fw:
TAT ATA GTC GAC GGC TCT CCT CGC TCT GCT CAA G(配列番号24中のnt1−23;SalI認識部位を含む)
PGAP−rv:
GTC GCT ATA CCC CGT TGG TTC ATT GTG CGG TGT GTA TGT GTG GAC(配列番号24中のnt497−518および配列番号22中のnt1−23)
AgLAC1−fw:
ATG GCT GAA AAT TCG TTA TTG AAG C(配列番号11中のnt1−25)
AgLAC1−PacI−rv:
TAT ATA TTA ATT AAG ACC TGT ATA TAT TCT AGT AGT G(配列番号11中のnt1388−1410;PacI認識部位を含む)
P−ENO−PacI−fw:
TAT ATA TTA ATT AAC TGT TCA CAG CCT TCT GAG AC(配列番号25中のnt1−21;PacI)
P−ENO−CO−LAG1−rv:
CCT GAC TTG GCC CGA CAT TTT GAA TTA TTT GAG TTT CGG AGG TGT TAA TC(配列番号25中のnt436−467および配列番号13中のnt1−18)
AgLAG1−fw:
ATG TCG GGC CAA GTC AGG C(配列番号13中のnt1−20)
AgLAG1−PacI−rv:
TAT ATA TTA ATT AAC TGC ATG CGC TGT CTG GCG(配列番号13中のnt1291−1309;PacI認識部位を含む)
(アシュビア・ゴシッピー酵素Laf1pおよびDes1pを同時に過剰生産するアシュビア・ゴシッピーSYR2 8DES二重変異体の構築)
アシュビア・ゴシッピーSYR2遺伝子をkanMX耐性遺伝子で置換して、それによってアシュビア・ゴシッピーSYR2遺伝子不活性化し、アシュビア・ゴシッピーDES1およびLAF1遺伝子を過剰発現するように、プラスミドpSSTH−LAF1−2を設計した。アシュビア・ゴシッピーSYR2、DES1およびLAF1をコードする配列ならびにアシュビア・ゴシッピーのエノラーゼコード遺伝子のプロモーターの配列を、実施例1に記載の通りに得た。アシュビア・ゴシッピーATCC19895からのDES1コード配列を増幅するために、MWG Biotech社(独国エーバースベルク所在)が以下のオリゴヌクレオチドを合成した。
AgDES1−DS−fw:
ATG AAC CAA CGG GGT ATA GCG AC(配列番号22中のnt905−927)
AgDES1−rv−SalI:
TAT ATA GTC GAC GAG TTT TGA CTC CTT CTG TCT C(配列番号22中のnt2246−2267;SalI認識部位を含む)
AgPENO−fw−XbaI:
TAT ATA TCT AGA CTG TTC ACA GCC TTC TGA GAC(配列番号25中のnt1−21;XbaI認識部位を含む)
AgPENO−OEPCR−rv:
GTC GCT ATA CCC CGT TGG TTC ATT TTG AAT TAT TTG AGT TTC GGA GGT GTT AAT C(配列番号25中のnt436−467および配列番号22中のnt905−927)
AgLAG1−fw:
ATG TCG GGC CAA GTC AGG C(配列番号13中のnt1−19)
AgLAG1−PacI−rv:
TAT ATA TTA ATT AAC TGC ATG CGC TGT CTG GCG(配列番号13中のnt1291−1309;PacI認識部位を含む)
P−ENO−PacI−fw:
TAT ATA TTA ATT AAC TGT TCA CAG CCT TCT GAG AC(配列番号25中のnt1−21;PacI認識部位を含む)
P−ENO−CO−LAG1−rv:
CCT GAC TTG GCC CGA CAT TTT GAA TTA TTT GAG TTT CGG AGG TGT TAA TC (配列番号25中のnt436−467および配列番号13中のnt1−18)
AgD8D−HindIII−fw:
TAT ATA AAG CTT GCG CTG GAA GAT TGG GCA TGT G (配列番号20中のnt204−225;HindIII認識部位を含む)
AgD8D−BamHI−rv:
TAT ATA GGA TCC GAG TCC AGC TTA ACA CGT AGA G (配列番号20中のnt1000−1021;BamHI認識部位を含む)
これをBamHI(New England Biolabs社、カタログ#R0136S)およびHindIII(New England Biolabs社、カタログ#R0104S)で2時間消化し、上記の通りに、BamHIおよびHindIII切断pAG32ベクター、その結果、図6に示すプラスミドpAG32−D8D(4960bp)を得た。このプラスミドは、アシュビア・ゴシッピー内に形質転換された後に、アシュビア・ゴシッピーの8DES遺伝子を破壊するのに適している。クローニングされた内部アシュビア・ゴシッピー8DES配列のDNA配列の真正性は、Sequiserve社(独国ファーターシュテッテン所在)が行ったDNA配列決定によって確認した。
(アシュビア・ゴシッピー株における、逆相HPLCによるスフィンゴイド塩基の定量および特性解析)
HPLC分析のために、適切な抗生物質を含むYEPDプレート上で増殖させたアシュビア・ゴシッピー変異体株の菌糸を、実施例1に記載の通り懸濁し、バッフル付き100ml三角フラスコ中、20mlのYEPD培地(ペプトン2%(w/v)、酵母抽出物1%(w/v)およびグルコース2%(w/v))に接種し、30℃および250rpmで3日間培養した。その時点で細胞は定常期にあった。菌糸の懸濁物1mlを、1.5ml反応管中に移し、13200rpmで1分間遠心分離し、ピペットで液体培地を除去した。試料を1M HClで1.5mlまで満たし、80℃で16時間インキュベートした。試料を簡単に混合し、懸濁物の500μlを新しい1.5ml反応管に移した。1mlのクロロホルム:メタノール(2:1)(v/v)を添加し、ミキサーミル(Retsch社、独国ハーン所在)により30Hzで30分間振とうして脂質を抽出した。試料を13200rpmで5分間遠心分離し、下層のクロロホルム相の500μlを、新しい1.5ml反応管に移した。真空遠心分離機(Christ Vakuumzentrifuge、Christ AG社、オステローデ所在)で20分間、60℃で溶媒を蒸発させ、適切な体積の2−プロパノール:H2O(1:1)(v/v)中にペレットを再懸濁し、40℃の超音波水浴中で10分間溶解した。
装置 Jasco;ポンプ PU−2080、オートサンプラー AS−2055、蛍光検出器 FP−2020
カラム Kromasil C18、250mm x 4.6mm
流速 2.00ml/分
試料体積 10μl
プレカラム誘導体化 同体積のo−フタルジアルデヒド(OPA)で2分間
注入体積 10μl
カラム温度 40℃
トレイ温度 周囲温度
移動相 メタノール:水(92:8)(w/v)
ランタイム 8分間
検出方法 蛍光
励起波長 340nm
発光波長 455nm
C18フィトスフィンゴシン 4.00分
C18スフィンガジエン 4.40分
C18スフィンゴシン 5.50分
C18スフィンガニン 7.00分
(ピキア・シフェリイF−60−10A NRRL 1031からのゲノムDNAの単離)
ピキア・シフェリイ F−60−10A NRRL 1031を、250ml三角フラスコ中の50mlYEPD培地(ペプトン2%(w/v)、酵母抽出物1%(w/v)およびグルコース2%(w/v))で、200rpmおよび30℃で培養し、18時間後、1.5のOD600で採取した。製造元の説明書に従って、PUREGENE(登録商標)酵母およびグラム陽性細菌用DNA精製キット(Gentra Systems社、カタログ#D−6000A)を用いて染色体DNAを単離した。アガロースゲル電気泳動による単離DNAの品質確認により、分子量が大きい(>16kbp)ことが証明された。
(ピキア・シフェリイのLAG1遺伝子ヌクレオチド配列のクローニングおよび決定)
(ピキア・シフェリイのLAG1遺伝子の内部部分の増幅)
まず、サッカロミセス亜門種からの推測セラミドシンターゼのアミノ酸配列を、完全および未完成の真核生物ゲノムのNCBIのデータベース(www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom_table.cgi)から、アシュビア・ゴシッピーLag1p(GenBankアクセッション#NP_982955)を鋳型としてTBLASTN検索を実行することによって、抽出した。このタンパク質は、特徴づけされたS.セレヴィジエのLac1pおよびLag1pタンパク質と非常に類似していた(それぞれ65%および69%の位置アミノ酸同一性)(Schorlingら、2001年;Guillasら、2003年)。したがって、それらはセラミドシンターゼ活性を有する可能性が非常に高い。ClustalWプログラム(www.ebi.ac.uk/clustalw)を用いて抽出配列(全て<2x10−123のE値を有する)を配置した。ピキア・シフェリイのLAG1遺伝子の内部部分の増幅のために適切なヌクレオチドは、ピキア・シフェリイのコドン使用頻度が高度にバイアスを受けていることを考慮し、Lag1p配列において高度に保存された一続きのアミノ酸を逆翻訳することにより得られた。その後、MWG Biotech社(独国エーバースベルク所在)が以下のオリゴヌクレオチドを合成した。
LAC1−deg−fw:
TTY GTY GGT TTY TAY GCW ATH TTY TTY ACW TTY TTR MGW GAA TT (配列番号1中のnt1636−1679)
LAC1−deg−rv:
GGT TGW SWD ATC CAA CAT TTR TAT TGT TGW GT (配列番号1中のnt2297−2266)
Sangerらが開発したジデオキシ法(Proceedings of the National Academy of Sciences,U.S.A.、74:5463−5467)を用いて、精製PCR産物のDNA配列を決定した。配列決定プライマーとして、PCR増幅に用いたものを使用した。DNA配列決定は、Sequiserve社(独国ファーターシュテッテン所在)により行われた。得られた配列情報(662bp、配列番号1中のnt1636−2297に対応;図7A)を、クローンマネージャー7ソフトウェア(Scientific&Educational Software)を用いてタンパク質に翻訳し、得られたアミノ酸配列を、NCBIの重複のない(non−redundant)タンパク質データベース(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)によるBLASTP探索の鋳型として用いた。探索の結果、サッカロミセス・セレヴィジエのLac1p(セラミドデサチュラーゼのサブユニット)と非常に類似するクリュイベロミセス・ラクティスタンパク質(NCBIアクセッション#XP_452132)が、データベース中で新規な配列と最も類似するタンパク質として同定され、ピキア・シフェリイのLAG1オルソログの部分が実際に増幅されたことが確認された。
ピキア・シフェリイの全LAG1遺伝子(コード配列、プロモーター領域および3’−非翻訳領域)のDNA配列を決定するために、逆PCR法に従った。ピキア・シフェリイF−60−10A NRRL 1031からの染色体DNA(300ng)(実施例4に記載の通りに単離)を、製造元の説明書に従って、全体積50μl中で、VspI(MBI Fermentas社、カタログ#ER0911)により一晩消化した。製造元の説明書に従ってQIAquickPCR精製キット(Qiagen社、カタログ#28106)を用いて、この消化DNAを精製した。溶出DNA(50μl)を、製造元の説明書に従って、全体積200μl、T4DNAリガーゼ800Uで、T4DNAリガーゼ(New England Biolabs社、カタログ#M0202L)を用いて一晩ライゲーションした。製造元の説明書に従ってQIAquickPCR精製キットを用いて、このライゲートDNAを精製した。溶出物の2.5μlを、Innisら(「PCR protocols.A guide to methods and applications、1990年、Academic Press社)による逆PCR反応の鋳型として用いた。これには、ピキア・シフェリイのLAG1遺伝子の既知の部分に標的化した2つのオリゴヌクレオチドを適用した:
PcLAC1−us−fw:
CCT TCT AAA ATC AAG AGA TTT ATG GAA CAA TC (配列番号1中のnt1732−1763)
PcLAC1−us−rv:
CCA ACA ATT GGT GCA AGG GGA C (配列番号1中のnt1721−1700)
DBoPcLAC1−us−rv2:
TTA GAC AGA AGC TCA ACA GG (配列番号1中のnt1032−1013)、
DBo−PcLAC1intfw:
TTC AGC TGG TTA TTT GTC TC (配列番号1中のnt1240−1259)および
DBo−PcLAC1intrv:
TAA CCC AGA ATC AAG GTC (配列番号1中のnt94−77)
を配列決定プライマーとして用いて決定した。新たに得られた配列情報は、配列番号1中のnt1−1635をカバーした。3’VspI部位が、この部分のすぐ下流に位置しているため(図7A)、このDNA配列の下流の新たな配列情報は得ることができなかった。ピキア・シフェリイLAG1遺伝子のコード領域の3’末端、およびその3’−非翻訳領域のDNA配列を得るために、別ラウンドの逆PCRを行う必要があった。従って、ピキア・シフェリイ染色体DNAの消化にHindIII(New England Biolabs社、カタログ#R0104S)を用い、逆PCR中に、MWG Biotech社(独国エーバースベルク所在)により合成された以下のオリゴヌクレオチドを適用した以外は、上記の実験プロトコルを繰り返した。
PcLAC1−ds−fw:
GGG AGA TTT TAA ATT AAA TTT TGC AAC TCA AC (配列番号1中のnt2241−2272)
PcLAC1−ds−rv:
CTG TTC TAA ATT CTG TTA AAA CTG ACC (配列番号1中のnt2239−2213)
DBo−PcLAC1dsfw2:
AAA TCA GGT TTA ACA ATG GC (配列番号1中のnt3152−3171)
DBo−PcLAC1dsfw3:
AGT TGA TAA ATG ACG AAT GG (配列番号1中のnt4060−4079)および
DBo−PcLAC1dsrv2:
GAA CGT ACT CTT GTA TCA CCC (配列番号1中のnt1343−1323)
を配列決定プライマーとして用いて決定した。3’VspI部位の下流から次のHindIII制限部位まで延びる、2655bpの新たな配列情報(配列番号1中のnt2298−4952)を得ることができた(図7B)。記載した3ステップの手順を用いて、全4952bpのピキア・シフェリイLAG1遺伝子座を単離し、そのDNA配列を決定することができた(配列番号1および図7参照)。
(ピキア・シフェリイのLAF1遺伝子ヌクレオチド配列のクローニングおよび決定)
(ピキア・シフェリイのSSN8遺伝子の内部部分の増幅)
ピキア・シフェリイのLAF1遺伝子(遺伝子名は、サッカロミセス・セレヴィジエにおいて2つのセラミダーゼシンターゼサブユニットをコードする遺伝子名LAC1およびLAG1と類似するよう選択された。これらは、ピキア・シフェリイを含む全ての他の酵母においても存在するLAG1遺伝子の重複の結果である。ピキア・シフェリイを含む他の酵母における第2のセラミダーゼシンターゼは、LAC1およびLAG1のオルソログよりもむしろパラログであり、サッカロミセス・セレヴィジエには明らかに存在しない。したがって、LAF1の表記が選択された。)の内部部分の増幅において、様々なサッカロミセス亜門からのLaf1pタンパク質の多重配列アラインメント由来の縮重オリゴヌクレオチドは機能しなかったため、我々は、ほとんどのサッカロミセス亜門の種において、サイクリンCをコードするSSN8遺伝子がLAF1遺伝子の上流に位置するという事実を利用した。まず、サッカロミセス亜門種からのサイクリンCのアミノ酸配列を、完全および未完成の真核生物ゲノムのNCBIのデータベース(www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom_table.cgi)から、アシュビア・ゴシッピーSsn8p(GenBankアクセッション#AAS51713)を鋳型としてTBLASTN検索を実行することによって、抽出した。ClustalWプログラム(www.ebi.ac.uk/clustalw)を用いて抽出配列(全て<2x10−52のE値を有する)を配置した。ピキア・シフェリイのSSN8遺伝子の内部部分の増幅のために適切なヌクレオチドは、ピキア・シフェリイのコドン使用頻度が高度にバイアスを受けていることを考慮し、Ssn8p配列において高度に保存された一続きのアミノ酸を逆翻訳することにより得られた。その後、MWG Biotech社(独国エーバースベルク所在)が以下のオリゴヌクレオチドを合成した。
PcSSN8−deg−fw3:
GAA GAA TGT CCW CAA CAT ATH MGW(配列番号3中のnt1−24)
PcSSN8−deg−rv2:
YAA YAA CTG YAA ATC WGT DAT (配列番号3中のnt628−608)
Sangerらが開発したジデオキシ法(Proceedings of the National Academy of Sciences,U.S.A.、74:5463−5467)を用いて、精製PCR産物のDNA配列を決定した。配列決定プライマーとして、PCR増幅に用いたものを使用した。DNA配列決定は、Sequiserve社(独国ファーターシュテッテン所在)により行われた。得られた配列情報(339bp、配列番号3中のnt1−339に対応;図8A)を、クローンマネージャー7ソフトウェア(Scientific&Educational Software)を用いてタンパク質に翻訳し、得られたアミノ酸配列を、NCBIの重複のないタンパク質データベース(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)によるBLASTP探索の鋳型として用いた。探索の結果、カンジダ・アルビカンスのSsn8p(NCBIアクセッション#EAK97601)が、データベースにおいて新規な配列と最も類似するタンパク質であると同定され、ピキア・シフェリイのSSN8オルソログの部分が実際に増幅されたことが確認された。
保存的構成の場合にはSSN8遺伝子の下流に位置するであろう、ピキア・シフェリイのLAF1遺伝子のDNA配列(コード配列、プロモーター領域および3’−非翻訳領域)を決定するために、逆PCR法に従った。ピキア・シフェリイF−60−10A NRRL 1031からの染色体DNA(300ng)(実施例4に記載の通りに単離)を、製造元の説明書に従って、全体積50μl中で、HaeIII(New England Biolabs社、カタログ#R0108S)により一晩消化した。製造元の説明書に従ってQIAquickPCR精製キット(Qiagen社、カタログ#28106)を用いて、この消化DNAを精製した。溶出DNA(50μl)を、製造元の説明書に従って、全体積200μl、T4DNAリガーゼ800Uで、T4DNAリガーゼ(New England Biolabs社、カタログ#M0202L)を用いて一晩ライゲーションした。製造元の説明書に従ってQIAquickPCR精製キットを用いて、このライゲートDNAを精製した。溶出物の2.5μlを、Innisら(「PCR protocols.A guide to methods and applications、1990年、Academic Press社)による逆PCR反応の鋳型として用いた。これには、ピキア・シフェリイのSSN8遺伝子の既知の部分に標的化した2つのオリゴヌクレオチドを適用した:
PcSSN8−ds−fw:
GCT GGT CAA TTA TAA ATG ATA GTT ATG (配列番号3中のnt293−319)
PcSSN8−ds−rv:
GTT ATT GCT ATT ATT ATT ATG ATT ATG ACC (配列番号3中のnt240−211)
PcLAG1−ds−fw:
GTT GGA TCT TGG TTA TAT TAT CAT TCA TC (配列番号3中のnt1738−1766)
PcLAG1−ds−rv:
TGT TCC ATA AAT CTT TGT TTA TCC TTT TGT G (配列番号3中のnt1700−1670)
DBo−PcLAG1dsfw2:
TTA AAC CCA AAT AAA CCT GG (配列番号3中のnt2620−2639)
を配列決定プライマーとして用いて決定した。3’ HaeIII部位の下流から次のMph1103I制限部位まで延びる、2396bpの新たな配列情報(配列番号3中のnt1801−4195)を得ることができた(図8B)。記載した3ステップの手順を用いて、全4195bpのピキア・シフェリイLAF1遺伝子座を単離し、そのDNA配列を決定することができた(配列番号3および図8参照)。
(ピキア・シフェリイのYXC1遺伝子ヌクレオチド配列のクローニングおよび決定)
(ピキア・シフェリイのYXC1遺伝子の内部部分の増幅)
まず、サッカロミセス亜門種からの推測セラミダーゼのアミノ酸配列を、完全および未完成の真核生物ゲノムのNCBIのデータベース(www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom_table.cgi)から、アシュビア・ゴシッピーYXC1遺伝子(GenBankアクセッション#NP_986865)を鋳型としてTBLASTN検索を実行することによって、抽出した。このタンパク質は、特徴づけされたサッカロミセス・セレヴィジエからのセラミダーゼYpc1pおよびYdc1pと非常に類似していた(それぞれ43%および44%の位置アミノ酸同一性)(Maoら、2000年、a,b)。したがって、それらはセラミダーゼ活性を有する可能性が非常に高い。ClustalWプログラム(www.ebi.ac.uk/clustalw)を用いて抽出配列(全て<1x10−43のE値を有する)を配置した。ピキア・シフェリイのYXC1遺伝子(遺伝子名は、サッカロミセス・セレヴィジエにおいて2つのセラミダーゼをコードする遺伝子名YPC1およびYDC1と類似するよう選択され、ここで、2番目の文字は、対応する酵素において好ましい基質、フィトセラミドおよびジヒドロセラミドを示す。ピキア・シフェリイを含む他の酵母において存在する単一のセラミダーゼの基質選択性は知られていないため、YXC1とする。)の内部部分の増幅のために適切なヌクレオチドは、ピキア・シフェリイのコドン使用頻度が高度にバイアスを受けていることを考慮し、Yxc1p配列において高度に保存された一続きのアミノ酸を逆翻訳することにより得られた。その後、MWG Biotech社(独国エーバースベルク所在)が以下のオリゴヌクレオチドを合成した。
ACER−deg−fw:
ATY GAT TGG TGT GAA GAA AAY TAY GT (配列番号7中のnt995−1020)
ACER−deg−rv−L2:
ACC DGT YAA NAH ATG CCA CCA ACC ATG (配列番号7中のnt1633−1607)
Sangerらが開発したジデオキシ法(Proceedings of the National Academy of Sciences,U.S.A.、74:5463−5467)を用いて、精製PCR産物のDNA配列を決定した。配列決定プライマーとして、PCR増幅に用いたものを使用した。DNA配列決定は、Sequiserve社(独国ファーターシュテッテン所在)により行われた。得られた配列情報(639bp、配列番号7中のnt995−1633に対応;図9A)を、クローンマネージャー7ソフトウェア(Scientific&Educational Software)を用いてタンパク質に翻訳し、得られたアミノ酸配列を、NCBIの重複のないタンパク質データベース(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)によるBLASTP探索の鋳型として用いた。探索の結果、デバリオマイセス・ハンセニイのYxc1p(NCBIアクセッション#XP_457637)が、データベースにおいて新規な配列と最も類似するタンパク質として同定され、ピキア・シフェリイのYXC1オルソログの部分が実際に増幅されたことが確認された。
ピキア・シフェリイの全YXC1遺伝子(コード配列、プロモーター領域および3’−非翻訳領域)のDNA配列を決定するために、逆PCR法に従った。ピキア・シフェリイF−60−10A NRRL 1031からの染色体DNA(300ng)(実施例4に記載の通りに単離)を、製造元の説明書に従って、全体積50μl中で、DraI(MBI Fermentas社、カタログ#ER0221)により一晩消化した。製造元の説明書に従ってQIAquickPCR精製キット(Qiagen社、カタログ#28106)を用いて、この消化DNAを精製した。溶出DNA(50μl)を、製造元の説明書に従って、全体積200μl、T4DNAリガーゼ800Uで、T4DNAリガーゼ(New England Biolabs社、カタログ#M0202L)を用いて一晩ライゲーションした。製造元の説明書に従ってQIAquickPCR精製キットを用いて、このライゲートDNAを精製した。溶出物の2.5μlを、Innisら(「PCR protocols.A guide to methods and applications、1990年、Academic Press社)による逆PCR反応の鋳型として用いた。これには、ピキア・シフェリイのYXC1遺伝子の既知の部分に標的化した2つのオリゴヌクレオチドを適用した:
YPC1−IPCR−1−fw:
GCT GGA TTT GCC ATG TTT TCT GC (配列番号7中のnt1082−1104)
YPC1−IPCR−1−rv:
GCT TCT GCA ATA TAT GGA GTC ACA AC (配列番号7中のnt1044−1020)
PcYPC1−IP−3−fw:
CAT GGT TGG TGG CAT DTN TTY ACH GG (配列番号7中のnt1607−1632)
PcYPC1−IP−3−rv:
CCA GAA AGG AAA ATA CCA ATT CCT TTA ATC ATT G (配列番号7中のnt1512−1479)
PcYXC1−ds−fw:
GGG GAA ACA AGA TGA TTA TGA ATT G (配列番号7中のnt1687−1711)
PcYXC1−ds−rv:
CTA AAC CAG TTA AAA CAT GCC AC (配列番号7中のnt1637−1615)
PcYXC1−ds−fw2:
GGA GAG TTC ACG TAG TTT AGG AG (配列番号7中のnt2417−2439)
PcYXC1−ds−rv2:
GGA GTA TGA ATA CAT TGA TCC GAT AAT G (配列番号7中のnt2358−2331)
PcYXC1−us−fw:
GGA TAA TCA GTT TAC CAT CAA AAG (配列番号7中のnt831−854)
PcYXC1−us−rv:
TAT TGA TAA ACA ATT GAT ATT AGA TTA G (配列番号7中のnt830−803)
(ピキア・シフェリイのスフィンゴ脂質Δ8デサチュラーゼ遺伝子ヌクレオチド配列のクローニングおよび決定)
(ピキア・シフェリイのスフィンゴ脂質Δ8デサチュラーゼ遺伝子の内部部分の増幅)
まず、サッカロミセス亜門種からの推測スフィンゴ脂質Δ8デサチュラーゼのアミノ酸配列を、完全および未完成の真核生物ゲノムのNCBIのデータベース(www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom_table.cgi)から、アシュビア・ゴシッピーのスフィンゴ脂質Δ8デサチュラーゼ(GenBankアクセッション#AAS53293)を鋳型としてTBLASTN検索を実行することによって、抽出した。このタンパク質は、特徴づけされたクリュイベロミセス・ラクティスからのスフィンゴ脂質Δ8デサチュラーゼと非常に類似していた(それぞれ65%および59%の位置アミノ酸同一性)(Takakuwaら、2002年)。したがって、スフィンゴ脂質Δ8デサチュラーゼ活性を有する可能性が非常に高い。ClustalWプログラム(www.ebi.ac.uk/clustalw)を用いて抽出配列(全て<7x10−121のE値を有する)を配置した。ピキア・シフェリイのスフィンゴ脂質Δ8デサチュラーゼ遺伝子の内部部分の増幅のために適切なヌクレオチドは、ピキア・シフェリイのコドン使用頻度が高度にバイアスを受けていることを考慮し、スフィンゴ脂質Δ8デサチュラーゼ配列において高度に保存された一続きのアミノ酸を逆翻訳することにより得られた。その後、MWG Biotech社(独国エーバースベルク所在)が以下のオリゴヌクレオチドを合成した。
D8DES−fw:
5’-GAT GCW ACH GAT GAA ATG MAY GCW TAY C-3’ (配列番号5中のnt2439−2466)
D8DES−rv:
5’-TTG RAA TTG YAA ACC ACC RTG NAA RAA ATC YAA CC-3’ (配列番号5中のnt3839−3805)
Sangerらが開発したジデオキシ法(Proceedings of the National Academy of Sciences,U.S.A.、74:5463−5467)を用いて、精製PCR産物のDNA配列を決定した。配列決定プライマーとして、PCR増幅に用いたものを使用した。DNA配列決定は、Sequiserve社(独国ファーターシュテッテン所在)により行われた。得られた配列情報(1401bp、配列番号5中のnt2439−3839に対応;図10A)を、クローンマネージャー7ソフトウェア(Scientific&Educational Software)を用いてタンパク質に翻訳し、得られたアミノ酸配列を、NCBIの重複のないタンパク質データベース(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)によるBLASTP探索の鋳型として用いた。探索の結果、クリュイベロミセス・ラクティスのスフィンゴ脂質Δ8デサチュラーゼ(NCBIアクセッション#XP_454832)が、データベースにおいて新規な配列と最も類似するタンパク質として「同定され、ピキア・シフェリイのスフィンゴ脂質Δ8デサチュラーゼをコードするオルソログの部分が実際に増幅されたことが確認された。
ピキア・シフェリイの全スフィンゴ脂質Δ8デサチュラーゼ遺伝子(コード配列、プロモーター領域および3’−非翻訳領域)のDNA配列を決定するために、逆PCR法に従った。ピキア・シフェリイF−60−10A NRRL 1031からの染色体DNA(300ng)(実施例4に記載の通りに単離)を、製造元の説明書に従って、全体積50μl中で、HpyCH4V(New England Biolabs社、カタログ#R0620S)により一晩消化した。製造元の説明書に従ってQIAquickPCR精製キット(Qiagen社、カタログ#28106)を用いて、この消化DNAを精製した。溶出DNA(50μl)を、製造元の説明書に従って、全体積200μl、T4DNAリガーゼ800Uで、T4DNAリガーゼ(New England Biolabs社、カタログ#M0202L)を用いて一晩ライゲーションした。製造元の説明書に従ってQIAquickPCR精製キットを用いて、このライゲートDNAを精製した。溶出物の2.5μlを、Innisら(「PCR protocols.A guide to methods and applications、1990年、Academic Press社)による逆PCR反応の鋳型として用いた。これには、ピキア・シフェリイのスフィンゴ脂質Δ8デサチュラーゼ遺伝子の既知の部分に標的化した2つのオリゴヌクレオチドを適用した:
D8DES−IPCR−1−fw:
GGT GGG AAG TTC AGA ACT TTA GAA G (配列番号5中のnt2553−2577)
D8DES−IPCR−1−rv:
TTG AAT AGG CGG CAC AAA ATT GAT CC (配列番号5中のnt2552−2527)
PcD8DIPCR−US−fw:
GGG TCC TGT TGA AAA AAG CTA GG (配列番号5中のnt2229−2251)
PcD8DIPCR−US−rv:
CCA ACT GCT GGT TCA CCA AAA TAG (配列番号5中のnt2211−2188)
DBo−PcD8D−us−fw2:
TTA AAT GGT ATT TCC TTA GTG C (配列番号5中のnt3109−3130)および
DBo−PcD8D−us−rv2:
GAT TCA TCT TCC ATT ATC ATC TC (配列番号5中のnt1343−1321)
を配列決定プライマーとして用いて決定した。3’VspI部位の上流から次のVspI制限部位まで延びる、2141bpの新たな配列情報(配列番号5中のnt1−2141)を得ることができた(図10B)。3’VspI部位がこの部分のすぐ下流に位置しているため(図10B)、このDNA配列の下流の新規な配列情報は得られなかった。ピキア・シフェリイのスフィンゴ脂質Δ8デサチュラーゼをコードする遺伝子のコード領域の3’末端、およびその3’−非翻訳領域のDNA配列を得るために、別ラウンドの逆PCRを行う必要があった。従って、ピキア・シフェリイ染色体DNAの消化にPagI(MBI Fermentas社、カタログ#ER1281)を用い、逆PCR中に、MWG Biotech社(独国エーバースベルク所在)により合成された以下のオリゴヌクレオチドを適用した以外は、上記の実験プロトコルを繰り返した。
PcD8D−ds−fw:
AAA TAA GAA CAA CAA TGG AAT GTT G (配列番号5中のnt3769−3793)
PcD8D−ds−rv:
CTT TCT GAA GTT CCT AAA TCT G (配列番号5中のnt3754−3733)
(ピキア・シフェリイ酵素Lag1p、Laf1pおよびDes1pを同時に過剰生産するピキア・シフェリイ変異体の構築)
ピキア・シフェリイ酵素Lag1p、Laf1pおよびDes1pを過剰発現するシリンゴマイシンE耐性変異体を構築するために、我々はまず組込みDES1発現ベクターを構築した。
pGAP−BglII−for:
5'-TAT ATA AGA TCT GTG GTA CCT ACA TAC AAT TGA CCC-3' (5’末端に、BglII認識配列を含む)
pGAP−NcoI−rev:
5'-TAT ATA CCA TGG TTA ATT AAT TAT TTG TTT GTT TG-3' (5’末端に、NcoI認識配列を含む)
pIS−NdeI−for:
5'-TAT ATA CAT ATG CTA ATC ACA ACA GAA CAT TCT CTA ACG-3' (5’末端に、NdeI認識配列を含む)
pIS−NdeI−rev:
5'-TAT ATA CAT ATG GCT AGA TTG ACA GAA GTC GAT CAG-3' (5’末端に、NdeI認識配列を含む)
pIS−NdeI−rev:
5'-TAT ATA CAT ATG GCT AGA TTG ACA GAA GTC GAT CAG-3' (5’末端に、NdeI認識配列を含む)
PmeI−rv:
5'-CCC ATC CAC TAA GTT TAA ACA CCC ATA CAA AAT CGA GCT TCA AAT C-3' (5’末端に、PmeI−fw−オリゴヌクレオチドに対する21bpの相補配列およびPmeI認識配列を含む)
を用いて増幅した。
p−IS−NdeI−for:
5'-TAT ATA CAT ATG CTA ATC ACA ACA GAA CAT TCT CTA ACG-3' (5’末端に、NdeI認識配列を含む)
PmeI−fw:
5'-TGT TTA AAC TTA GTG GAT GGG AAA CCC TGT AGA ACT GGG ACA AAC-3'
を用いて増幅した。
p−IS−NdeI−for:
5'-TAT ATA CAT ATG CTA ATC ACA ACA GAA CAT TCT CTA ACG-3' (5’末端に、NdeI認識配列を含む)
pIS−NdeI−rev:
5'-TAT ATA CAT ATG GCT AGA TTG ACA GAA GTC GAT CAG-3' (5’末端に、NdeI認識配列を含む)
とともにPCRをセットアップすることによって、断片の、両端にNdel認識配列を有し、中間にPmeI認識配列を有する、978bp断片が生成し、断片1および2の縮合物が得られた。
DES1−fw:
5'-TAG AAG TTC CAG AAA CTA CTT TCC AAA CTT CAA AAT CAA CTT TAT TAT CAA TGG CTA CAA TTA CAC ATA GAA AAA ACC CTT CAC AAC-3' (5’末端に、PDA1−rv−オリゴヌクレオチドに対する50塩基の相補配列を含む)
DES1−rv:
5'-TAT ACT GCA GGC ATA TTG TCA ATT CTA TTG TAC TTG AGT ATT AAT GAT TA-3' (5’末端に、PstI認識配列を含む)
とともに、DES1遺伝子を増幅した。
PDA1−fw:
5'-TAT ACT GCA GTG TGC TCT AAA TTT GCC CGG TTC GCG ACG-3' (5’末端に、PstI認識配列を含む)
PDA1−rv:
5'-TGA TAA TAA AGT TGA TTT TGA AGT TTG GAA AGT AGT TTC TGG AAC TTC TA-3'
PDA1−fw:
5'-TAT ACT GCA GTG TGC TCT AAA TTT GCC CGG TTC GCG ACG-3' (5’末端に、PstI認識配列を含む)
DES1−rv:
5'-TAT ACT GCA GGC ATA TTG TCA ATT CTA TTG TAC TTG AGT ATT AAT GAT TA-3' (5’末端に、PstI認識配列を含む)
とともにPCRをセットアップすることによって、DES1遺伝子およびPDA1プロモーター領域の縮合物が得られた。
PcL41−SalI−fw:
5'-TAT AGT CGA CGA ATT CTC TTA AAT GAT GTT GG-3'(5’末端に、SalI認識配列を含む)
PcL41−internal−rv:
5'-GTT TTA GCT TTT TTA TGG AAA ACT tGT TTG GTT TGA CCA CCG TAA CCG G-3'(5’末端に、PcL41−内部−fw−オリゴヌクレオチドに対する49塩基の相補配列を含み、点変異の変異(CからA)を挿入してL41pのaa56をプロリンからグルタミンへ置換してシクロヘキシミド耐性を付与する)
を用いて増幅した。
PcL41−internal−fw:
5'-CCG GTT ACG GTG GTC AAA CCA AAC aAG TTT TCC ATA AAA AAG CTA AAA CTA CCA AAA AAG TTG TTT TAC G-3'
PcL41−SacI−rv:
5'-TAT AGA GCT CAA TTC CAA TGT TTT GAT CTG TC-3'(5’末端に、SacI認識配列を含む)
を用いて増幅した。
PcL41−SalI−fw:
5'-TAT AGT CGA CGA ATT CTC TTA AAT GAT GTT GG-3'(5’末端に、SalI認識配列を含む)
PcL41−SacI−rv:
5'-TAT AGA GCT CAA TTC CAA TGT TTT GAT CTG TC-3'(5’末端に、SacI認識配列を含む)
によりPCRをセットアップすることによって、2つの断片の縮合物が得られた。
PcLAG1−fw:
5'-CAA ACA AAC AAA CAA ATA ATT AAT TAA CAA TGA TTT CAA CTT CAA CAA ATT CAT CAT C-3'(5’末端に、PGAP−rv−オリゴヌクレオチドに対する29塩基の相補配列を含む)
PcLAG1−rv:
5'-CAG ACA AGT TTA ATA TAG ATA CTT AAA C-3'
とともにPCRによりLAF1遺伝子を増幅した。
PGAP−SbfI:
5'-TAT ATA CCT GCA GGT TAC CCA GTG GTA CCT ACA TAC-3'(5’末端に、SbfI認識配列を含む)
PGAP−rv:
5'-CAT TGT TAA TTA ATT ATT TGT TTG TTT GTT TG-3'
PGAP−SbfI:
5'-TAT ATA CCT GCA GGT TAC CCA GTG GTA CCT ACA TAC-3' (5’末端に、SbfI認識配列を含む)
PcLAG1−rv:
5'-CAG ACA AGT TTA ATA TAG ATA CTT AAA C-3'
によりPCRをセットアップすることによって、LAF1遺伝子およびTDH1プロモーター領域の縮合物が得られた。
PcLAC1−fw:
5'-GAA ACT ACT TTC CAA ACT TCA AAA TCA ACT TTA TTA TCA ATG TCC ACT TCC AGA CCA CAG-3'(5’末端に、PPDA−rv−オリゴヌクレオチドに対する39塩基の相補配列を含む)
PcLAC1−BsiWI−rv:
5'-TAT ACG TAC GTG GTA CAT ACG ATA TAA TCC ATG TAG-3'(5’末端に、BsiWI認識配列を含む)
とともに、LAG1遺伝子を増幅した。
PPDA−BsiWI−fw−new:
5'-TAT ACG TAC GGA CGC ACC GGC CAT TTT CAA AC-3'(5’末端に、BsiWI認識配列を含む)
PPDA−rv:
5'- CAT TGA TAA TAA AGT TGA TTT TGA AGT TTG GAA AGT AGT TTC-3'
PPDA−BsiWI−fw−new:
5'-TAT ACG TAC GGA CGC ACC GGC CAT TTT CAA AC-3'(5’末端に、BsiWI認識配列を含む)
PcLAC1−BsiWI−rv:
5'-TAT ACG TAC GTG GTA CAT ACG ATA TAA TCC ATG TAG-3'(5’末端に、BsiWI認識配列を含む)
によりPCRをセットアップすることによって、LAG1遺伝子およびPDA1プロモーター領域の縮合物が得られた。
(ピキア・シフェリイ酵素Des1pおよびLaf1p、アシュビア・ゴシッピー酵素Laf1pおよびLag1p、ならびにマウスのアルカリ性セラミダーゼを、シリンゴマイシンE耐性ピキア・シフェリイ変異体中で同時に過剰生産するためのプラスミドの構築)
ピキア・シフェリイ酵素Des1pおよびLaf1p、アシュビア・ゴシッピー酵素Laf1pおよびLag1p、ならびにマウスのアルカリ性セラミダーゼのコドン最適化形態を過剰生産するシリンゴマイシンE耐性変異体を構築するために、まず組込みDES1発現ベクターを設計した。
pGAP−BglII−for:
5'-TAT ATA AGA TCT GTG GTA CCT ACA TAC AAT TGA CCC-3'(5’末端に、BglII認識配列を含む)
pGAP−NcoI−rev:
5'-TAT ATA CCA TGG TTA ATT AAT TAT TTG TTT GTT TG-3'(5’末端に、NcoI認識配列を含む)
pIS−NdeI−for:
5'-TAT ATA CAT ATG CTA ATC ACA ACA GAA CAT TCT CTA ACG-3' (5’末端に、NdeI認識配列を含む)
pIS−NdeI−rev:
5'-TAT ATA CAT ATG GCT AGA TTG ACA GAA GTC GAT CAG-3' (5’末端に、NdeI認識配列を含む)
pIS−NdeI−rev:
5'-TAT ATA CAT ATG GCT AGA TTG ACA GAA GTC GAT CAG-3'(5’末端に、NdeI認識配列を含む)
PmeI−rv:
5'-CCC ATC CAC TAA GTT TAA ACA CCC ATA CAA AAT CGA GCT TCA AAT C-3'(5’末端に、PmeI−fw−オリゴヌクレオチドに対する21bpの相補配列およびPmeI認識配列を含む)
を用いて増幅した。
p−IS−NdeI−for:
5'-TAT ATA CAT ATG CTA ATC ACA ACA GAA CAT TCT CTA ACG-3'(5’末端に、NdeI認識配列を含む)
PmeI−fw:
5'-TGT TTA AAC TTA GTG GAT GGG AAA CCC TGT AGA ACT GGG ACA AAC-3'
p−IS−NdeI−for:
5'-TAT ATA CAT ATG CTA ATC ACA ACA GAA CAT TCT CTA ACG-3'(5’末端に、NdeI認識配列を含む)
pIS−NdeI−rev:
5'-TAT ATA CAT ATG GCT AGA TTG ACA GAA GTC GAT CAG-3'(5’末端に、NdeI認識配列を含む)
とともにPCRをセットアップすることによって、断片の両端にNdel認識配列を有し、中間にPmeI認識配列を有する、978bp断片が生成し、断片1および2の縮合物が得られた。
DES1−fw:
5'-TAG AAG TTC CAG AAA CTA CTT TCC AAA CTT CAA AAT CAA CTT TAT TAT CAA TGG CTA CAA TTA CAC ATA GAA AAA ACC CTT CAC AAC-3'(5’末端に、PDA1−rv−オリゴヌクレオチドに対する50塩基の相補配列を含む)
DES1−rv:
5'-TAT ACT GCA GGC ATA TTG TCA ATT CTA TTG TAC TTG AGT ATT AAT GAT TA-3'(5’末端に、PstI認識配列を含む)
とともに、DES1遺伝子(配列番号26)を増幅した。
PDA1−fw:
5'-TAT ACT GCA GTG TGC TCT AAA TTT GCC CGG TTC GCG ACG-3'(5’末端に、PstI認識配列を含む)
PDA1−rv:
5'-TGA TAA TAA AGT TGA TTT TGA AGT TTG GAA AGT AGT TTC TGG AAC TTC TA-3'
PDA1−fw:
5'-TAT ACT GCA GTG TGC TCT AAA TTT GCC CGG TTC GCG ACG-3'(5’末端に、PstI認識配列を含む)
DES1−rv:
5'-TAT ACT GCA GGC ATA TTG TCA ATT CTA TTG TAC TTG AGT ATT AAT GAT TA-3'(5’末端に、PstI認識配列を含む)
によりPCRをセットアップすることによって、DES1遺伝子およびPDA1プロモーター領域の縮合物が得られた。
PcL41−SalI−fw:
5'-TAT AGT CGA CGA ATT CTC TTA AAT GAT GTT GG-3'(5’末端に、SalI認識配列を含む)
PcL41−internal−rv:
5'-GTT TTA GCT TTT TTA TGG AAA ACT tGT TTG GTT TGA CCA CCG TAA CCG G-3'(5’末端に、PcL41−内部−fw−オリゴヌクレオチドに対する49塩基の相補配列を含み、点変異の変異(CからA)を挿入してL41pのaa56をプロリンからグルタミンへ置換してシクロヘキシミド耐性を付与する)
PcL41−internal−fw:
5'-CCG GTT ACG GTG GTC AAA CCA AAC AAG TTT TCC ATA AAA AAG CTA AAA CTA CCA AAA AAG TTG TTT TAC G-3'
PcL41−SacI−rv:
5'-TAT AGA GCT CAA TTC CAA TGT TTT GAT CTG TC-3'(5’末端に、SacI認識配列を含む)
を用いて増幅した。
PcL41−SalI−fw:
5'-TAT AGT CGA CGA ATT CTC TTA AAT GAT GTT GG-3' (5’末端に、SalI認識配列を含む)
PcL41−SacI−rv:
5'-TAT AGA GCT CAA TTC CAA TGT TTT GAT CTG TC-3'(5’末端に、SacI認識配列を含む)
によりPCRをセットアップすることによって、2つの断片の縮合物が得られた。
AgLAG1−fw:
5'-CAA ACA AAC AAA CAA ATA ATT AAT TAA CAA TGT CGG GCC AAG TCA GGC AG-3'(5’末端に、オリゴヌクレオチドPGAP−rvに相補的な32塩基配列を含む)
AgLAG1−rv:
5'-CAT TAC CGA TCA CCA GGT AGG-3'
とともにPCRによりLAF1遺伝子(配列番号13)を増幅した。
PGAP−SbfI:
5'-TAT ATA CCT GCA GGT TAC CCA GTG GTA CCT ACA TAC-3'(5’末端に、SbfI認識配列を含む)
PGAP−rv:
5'-CAT TGT TAA TTA ATT ATT TGT TTG TTT GTT TG-3'
PGAP−SbfI:
5'-TAT ATA CCT GCA GGT TAC CCA GTG GTA CCT ACA TAC-3'(5’末端に、SbfI認識配列を含む)
AgLAG1−rv:
5'-CAT TAC CGA TCA CCA GGT AGG-3'
によりPCRをセットアップすることによって、LAF1遺伝子およびTDH1プロモーター領域の縮合物が得られた。
AgLAC1−fw:
5'-GAA ACT ACT TTC CAA ACT TCA AAA TCA ACT TTA TTA TCA ATG GCT GAA AAT TCG TTA TTG AAG CCA C-3'(5’末端に、オリゴヌクレオチドPPDA−rvに相補的な42塩基配列を含む)
AgLAC1−BsiWI−rv:
5'-TAT ACG TAC GGT GTA ATG GCG GTG GAA CAC-3'(5’末端に、BsiWI認識配列を含む)
とともに、LAG1遺伝子(配列番号11)を増幅した。
PPDA−BsiWI−fw−new:
5'-TAT ACG TAC GGA CGC ACC GGC CAT TTT CAA AC-3' (5’末端に、BsiWI認識配列を含む)
PPDA−rv:
5'-CAT TGA TAA TAA AGT TGA TTT TGA AGT TTG GAA AGT AGT TTC-3'
PPDA−BsiWI−fw−new:
5'-TAT ACG TAC GGA CGC ACC GGC CAT TTT CAA AC-3' (5’末端に、BsiWI認識配列を含む)
AgLAC1−BsiWI−rv:
5'-TAT ACG TAC GGT GTA ATG GCG GTG GAA CAC-3' (5’末端に、BsiWI認識配列を含む)
によりPCRをセットアップすることによって、LAG1遺伝子およびPDA1プロモーター領域の縮合物が得られた。
mCER−fw:
5'-CAA ACA AAC AAA CAA ATA ATT AAT TAA CAA TGC ATG TAC CGG GCA CCA G-3'(5’末端に、オリゴヌクレオチドPGAP−rvに相補的な32塩基配列を含む)
mCER−rv:
5'-CGT TAT ATA GGA AAG CAC CGA AGC TAA ATT CAG CAG TTC TTG TCA TTC TC-3'(5’末端に、オリゴヌクレオチドTENO−fwに対する29塩基の相補配列を含む)
PGAP−SbfI:
5'-TAT ATA CCT GCA GGT TAC CCA GTG GTA CCT ACA TAC-3'(5’末端に、SbfI認識配列を含む)
PGAP−rv:
5'-CAT TGT TAA TTA ATT ATT TGT TTG TTT GTT TG-3'
とともに、増幅された。
PGAP−SbfI:
5'-TAT ATA CCT GCA GGT TAC CCA GTG GTA CCT ACA TAC-3' (5’末端に、SbfI認識配列を含む)
mCER−rv:
5'-CGT TAT ATA GGA AAG CAC CGA AGC TAA ATT CAG CAG TTC TTG TCA TTC TC-3' (5’末端に、オリゴヌクレオチドTENO−fwに相補的な29塩基配列を含む)
とともにPCRをセットアップすることによって、mCER遺伝子およびTDH1プロモーター領域の縮合物が得られた。
TENO−fw:
5'-ATT TAG CTT CGG TGC TTT CCT ATA TAA CG-3'
TENO−fw−SbfI:
5'-TAT ATA CCT GCA GGT TAT AAC GGT TGG GCA ATG TTG AG-3' (5’末端に、SbfI認識配列を含む)
PGAP−SbfI:
5'-TAT ATA CCT GCA GGT TAC CCA GTG GTA CCT ACA TAC-3' (5’末端に、SbfI認識配列を含む)
TENO−fw−SbfI:
5'-TAT ATA CCT GCA GGT TAT AAC GGT TGG GCA ATG TTG AG-3' (5’末端に、SbfI認識配列を含む)
とともにPCR反応をセットアップすることによって、TDH1プロモーター制御下のmCER遺伝子およびENO1ターミネーター領域の縮合物が得られた。
opt−nat1−fw:
5'-CAA AAT CAA CTT TAT TAT CAA TGG GTA CTA CTT TAG ATG ATA C-3' (5’末端に、オリゴヌクレオチドPPDA−rvに相補的な23塩基配列を含む)
opt−nat1−rv:
5'-TCT TTT TAT TGT CAG TAC TGA TTA TTA TGG ACA TGG CAT TGA C-3'(5’末端に、21塩基配列のオリゴヌクレオチドT−TEF−fwに相補的な21塩基配列を含む)
を用いて増幅した。
PPDA−SalI−fw:
5'-TAT GTC GAC TGT GCT CTA AAT TTG CCC GGT TC-3' (5’末端に、SalI認識配列を含む)
PPDA−rv:
5'-CAT TGA TAA TAA AGT TGA TTT TGA AGT TTG GAA AGT AGT TTC-3'
PPDA−SalI−fw:
5'-TAT GTC GAC TGT GCT CTA AAT TTG CCC GGT TC-3' (5’末端に、SalI認識配列を含む)
opt−nat1−rv:
5'-TCT TTT TAT TGT CAG TAC TGA TTA TTA TGG ACA TGG CAT TGA C-3' (5’末端に、オリゴヌクレオチドT−TEF−fwに相補的な21塩基配列を含む)
によりPCRをセットアップすることによって、コドン最適化nat1遺伝子およびPDA1プロモーター領域の縮合物が得られた。
T−TEF−fw:
5'-TCA GTA CTG ACA ATA AAA AGA TTC TTG-3'
T−TEF−SacI−rv:
5'-TGA GCT CTC GAC ACT GGA TGG CGG CGT TAG-3' (5’末端に、SacI認識配列を含む)
PPDA−SalI−fw:
5'-TAT GTC GAC TGT GCT CTA AAT TTG CCC GGT TC-3' (5’末端に、SalI認識配列を含む)
T−TEF−SacI−rv:
5'-TGA GCT CTC GAC ACT GGA TGG CGG CGT TAG-3' (5’末端に、SacI認識配列を含む)
とともにPCR反応をセットアップすることによって、ピキア・シフェリイのPDA1プロモーター制御下のnat1遺伝子およびアシュビア・ゴシッピーのTEFターミネーター領域の縮合物が得られた。
opt−mCER−PacI−fw:
5'-GGT ACC TTA ATT AAC AAT GCA TG-3' (5’末端に、PacI認識配列を含む)
opt−mCER−rv:
5'-AGG AAA GCA CCG AAG CTA AAT TTA ACA ATT TTT ATC ATT TTC-3'(5’末端に、オリゴヌクレオチドTENO−fw−に相補的な21塩基配列を含む)
を用いてomCER遺伝子(配列番号30)を増幅した。
TENO−fw:
5'-ATT TAG CTT CGG TGC TTT CCT ATA TAA CG-3'
T−ENO−BsiWI−rv:
5'-TAC GTA CGT TAT AAC GGT TGG GCA ATG TTG-3' (5’末端に、BsiWI認識配列を含む)
opt−mCER−PacI−fw:
5'-GGT ACC TTA ATT AAC AAT GCA TG-3' (5’末端に、PacI認識配列を含む)
T−ENO−BsiWI−rv:
5'-TAC GTA CGT TAT AAC GGT TGG GCA ATG TTG-3' (5’末端に、BsiWI認識配列を含む)
によりPCRをセットアップすることによって、omCER遺伝子およびENO1ターミネーター領域の縮合物が得られた。
GAPDH−SpeI−fw:
5'-TAT ATA ACT AGT TTA CCC AGT GGT ACC TAC ATA C-3' (5’末端に、SpeI認識配列を含む)
GAPDH−CO−rv:
5'-CCC GGG ATT TAA ATG GCG CGC CGT TAA TTA ATT ATT TGT TTG TTT GTT TG-3'(5’末端に、オリゴヌクレオチドENO−CO−fw−に相補的な22塩基配列を含む)
を用いて増幅した。
ENO−CO−fw:
5'-GGC GCG CCA TTT AAA TCC CGG GAT TTA GCT TCG GTG CTT TCC TA-3'
ENO−SpeI−rv:
5'-TAT ATA CCG CGG TTA TAA CGG TTG GGC AAT GTT G-3' (5’末端に、SpeI認識部位を含む)
GAPDH−SpeI−fw:
5'-TAT ATA ACT AGT TTA CCC AGT GGT ACC TAC ATA C-3' (5’末端に、SpeI認識配列を含む)
ENO−SpeI−rv:
5'-TAT ATA CCG CGG TTA TAA CGG TTG GGC AAT GTT G-3' (5’末端に、SpeI認識配列を含む)
とともにPCR反応をセットアップすることによって、2つの断片の縮合物が得られた。
PcLAF1−HpaI−fw:
5'-TAT ATA GTT AAC ATG ATT TCA ACT TCA ACA AAT TC-3' (5’末端に、HpaI認識配列を含む)
PcLAF1−XmaI−rv:
5'-TAT ATA CCC GGG CTA ATC ATC ATC TTC ATC ATC-3' (5’末端に、XmaI認識配列を含む)
を用いてLAF1遺伝子(配列番号3)を増幅した。
(ピキア・シフェリイ酵素Des1pおよびLag1p、アシュビア・ゴシッピー酵素Laf1pおよびLag1p、ならびにマウスのアルカリ性セラミダーゼを、シリンゴマイシンE耐性ピキア・シフェリイ変異体中で同時に過剰生産するためのプラスミドの構築)
ピキア・シフェリイDes1pならびにアシュビア・ゴシッピーLaf1pおよびLag1pの過剰発現のために、ベクターpPC−DES1−AgLAF1−AgLAG1を用いた(実施例11参照)。さらに、omCERおよびピキア・シフェリイLag1pの過剰発現のためのベクターを構築した。
PcLAG1−EcoRV−fw:
5'-TAT ATA GAT ATC ATG TCC ACT TCC AGA CCA CAG-3' (5’末端に、EcoRV認識配列を含む)
PcLAG1−XmaI−rv:
5'-TAT ATA CCC GGG TTA TTC ACT CTT TTT TTC TTG-3' (5’末端に、XmaI認識配列を含む)
(ピキア・シフェリイ酵素Des1p、アシュビア・ゴシッピー酵素Laf1pおよびLag1p、マウスのアルカリ性セラミダーゼのコドン最適化形態、ならびにコッコリスウイルスのセラミドシンターゼのコドン最適化形態を、シリンゴマイシンE耐性ピキア・シフェリイ変異体中で同時に過剰生産するためのプラスミドの構築)
ピキア・シフェリイDes1pならびにアシュビア・ゴシッピーLaf1pおよびLag1pの過剰発現のために、ベクターpPC−DES1−AgLAF1−AgLAG1を用いた(実施例10参照)。さらに、omCERおよびコッコリスウイルスのセラミドシンターゼをコードするコドン最適化遺伝子(oCvLAG1)の過剰発現のための、ピキア・シフェリイにおける発現に最適化したベクターを構築した。
(シリンゴマイシンE耐性ピキア・シフェリイ変異体における、ピキア・シフェリイの酵素Des1p、アシュビア・ゴシッピーの酵素Laf1pおよびLag1p、マウスアルカリ性セラミダーゼのコドン最適化形態、ならびにマウスセラミドシンターゼのコドン最適化形態の同時過剰生産用のプラスミドの構築)
ピキア・シフェリイのDes1p、アシュビア・ゴシッピーのLaf1pおよびLag1pの過剰発現には、ベクターpPC−DES1−AgLAF1−AgLAG1を用いた(実施例10を参照)。加えて、omCER遺伝子およびコドン最適化されたマウスセラミドシンターゼ(omLASS5)の過剰発現用のベクターを構築した。
(シリンゴマイシンE耐性ピキア・シフェリイ変異体の形質転換)
シリンゴマイシンE耐性ピキア・シフェリイ変異体の形質転換は、最近の記述(Baeら、「Integrative transformation system for the metabolic engineering of the sphingoid base−producing yeast Pichia ciferrii.」、2003年、Appl.Environ.Microbiol.;米国特許第6638735号)に従って行った。
(スフィンゴイド塩基生合成遺伝子を過剰発現するシリンゴマイシンE耐性ピキア・シフェリイ変異体によるアセチル化スフィンゴシンの振とうフラスコ生産)
上述した遺伝子(PcDES1、AgLAF1、AgLAG1のみ、またはomCERと組み合わせて、さらに、PcLAF1、PcLAG1、oCvLAG1、またはomLASS5と組み合わせて)を過剰発現するシリンゴマイシンE耐性変異体によるアセチル化スフィンゴシンの生産が増大しているかどうか試験するために、対応する株を、アセチル化スフィンゴシンの振とうフラスコ生産用に培養した(対応するプラスミドについては表3を参照)。
(培養ブロス中のアセチル化スフィンゴイド塩基の定量)
脂質を抽出するために、15mlファルコンチューブ内の未分画ブロス1mlにアセトン4mlを添加し、室温、1分間あたり250回転で、10分間、水平に振とうさせた。その後、混合物を5300gで10分間、遠心分離し、Jasco社製HPLCシステム(LC−2000シリーズ)で上清を分析した。以下の条件が適用された。
移動相: 0.05%(v/v)トリフルオロ酢酸(TFA)を含有するアセトニトリル/水90:10(v/v)
流速: 1.0ml/分
ランタイム: 11分
注入体積: 100μl
カラム: Kromasil 100C18(250×4.6mm、粒径5μm)
カラム温度: 30℃
トレー温度: 周囲温度
UV検出波長: 200nm
(シリンゴマイシンE耐性ピキア・シフェリイ株におけるスフィンゴ脂質Δ8−デサチュラーゼ・コード遺伝子の不活性化、ならびにピキア・シフェリイ酵素Des1p、マウスアルカリ性セラミダーゼのコドン最適化形態、およびコッコリスウイルス・セラミドシンターゼのコドン最適化形態の同時過剰生産)
ピキア・シフェリイは、スフィンゴイド塩基のC−8とC−9との間に二重結合を導入することが知られている(Takakuwaら、Current Microbiology、45:459−61)、クリュイベロミセス・ラクティスのスフィンゴ脂質Δ8−デサチュラーゼに高い類似性を有する酵素をコードする遺伝子を保持している(実施例8を参照)。したがって、この酵素の活性がスフィンゴシン生産に関して、逆効果となっているかもしれない。何故なら、ジヒドロスフィンゴシンへのそのような二重結合の導入は、それが遊離スフィンゴイド塩基であろうと、ジヒドロセラミドの構成成分であろうと、スフィンゴシン形成の共通の前駆体との競合をもたらすであろうからである。上述したスフィンゴ脂質生合成遺伝子の過剰発現を、ピキア・シフェリイスフィンゴ脂質Δ8−デサチュラーゼ・コード遺伝子8DESの不活性化と組み合わせるために、最初に、ピキア・シフェリイが抗生物質シクロヘキシミドの存在下で増殖するのを可能にする、アミノ酸位置56における点突然変異を含有するpDB006ベクターから入手したピキア・シフェリイPcL41の遺伝子で、p−mCER−nat1−oCvLAG1ベクター(実施例12参照)のnat1遺伝子を置換した。そのために、ベクターpTH−GAP−nat1−IS2−Pme1(実施例10を参照)を制限エンドヌクレアーゼSacIおよびSalIで消化し、QIAGEN社製QIAquickゲル抽出キットを用いて、3448bpの断片をゲル精製した。PcL41遺伝子(GenBankアクセッション#AF053457)を得て、所望の点突然変異を導入するために、ピキア・シフェリイF60−10A NRRL1031の染色体DNAを鋳型として用いて、2つの断片をPCRで増幅させた。断片1は以下のオリゴヌクレオチドを用いて増幅させた。
PcL41−SalI−fw:
5’-TATAGTCGACGAATTCTCTTAAATGATGTTGG-3’ (5’末端に、SalI認識配列を含む)
PcL41−internal−rv:
5’-GTTTTAGCTTTTTTATGGAAAACTtGTTTGGTTTGACCACCGTAACCGG-3’
PcL41-internal-fw:
5’-CCGGTTACGGTGGTCAAACCAAACaAGTTTTCCATAAAAAAGCTAAAACTACCA AAAAAGTTGTTTTACG-3’
PcL41-SacI-rv:
5’-TATAGAGCTCAATTCCAATGTTTTGATCTGTC-3’ (5’末端に、SacI認識配列を含む)
PcDES1−PstI−fw:
5’-TATATACTGCAGTTACCCAGTGGTACCTACATAC-3’ (5’末端に、PstI認識配列を含む)
PcDES1−PstI−rv
5’-TATATACTGCAGTTATAACGGTTGGGCAATG-3’ (5’末端に、PstI認識配列を含む)
と、鋳型としてピキア・シフェリイF−60−10A NRRL1031の染色体DNAとを用いて、PCRを介して増幅した。この結果得られた1983bpの断片を、上述の通り、ゲル精製し、制限エンドヌクレアーゼPstIで消化し、QIAGEN社製QIAquick PCR精製キットを用いて、PCR精製した。p−mCER−LP−PcvL41−oCvLAG1ベクターを同様に切断し、精製した。ライゲーション、調製、および化学的コンピテント大腸菌細胞の形質転換、ならびに所望のプラスミドが存在していることの確認は、当業者に既知の方法で行った。この方法を適用することによって得られたプラスミドをpTH−LP−1と名付けた。挿入断片の方向性および真正性はDNA配列決定によって判定した。
PcD8D−PshAI−fw:
5’-TATATAGACAAAAGTCCAGTTCCAAAGTGCTC-3’ (5’末端に、PshAI認識配列を含む)
PcD8D−BsiWI−rv:
5’-TATATACGTACGAAAATTGCACTAAGGAAATAC-3’ (5’末端に、BsiWI認識配列を含む)
(シリンゴマイシンE耐性ピキア・シフェリイ株におけるアルカリ性セラミダーゼ・コード遺伝子の不活性化、ならびにピキア・シフェリイ酵素Des1p、マウスアルカリ性セラミダーゼのコドン最適化形態、およびコッコリスウイルスのセラミドシンターゼのコドン最適化形態の同時過剰生産)
ピキア・シフェリイは、スフィンゴイド塩基として、スフィンゴシンではなく、フィトスフィンゴシンまたはジヒドロスフィンゴシンを含有するセラミドを選択的に加水分解することが知られている(Maoら、The Journal of Biological Chemistry、275:31369−31378)、S.セレヴィジエのアルカリ性セラミダーゼに高い類似性を有する酵素をコードする遺伝子を保持する(実施例7を参照)。したがって、この酵素の活性は、スフィンゴシン生産に関して、逆効果となっているかもしれない。何故なら、スフィンゴイド塩基としてジヒドロスフィンゴシンを含有するセラミドは、スフィンゴシン形成の前駆体であるからである。上述したスフィンゴ脂質生合成遺伝子の過剰発現を、ピキア・シフェリイ内在性アルカリ性セラミダーゼ遺伝子YXC1の不活性化と組み合わせるために、pTH−deltaD8Dプラスミド上の遺伝子間スペーサ(IS)領域(実施例17および図17参照)を、ピキア・シフェリイ・セラミダーゼ・コード遺伝子の内部領域(配列番号8)で置換した。
OTKD284:
5’-TAT ATA GAC AGA AGT CCA TAT CAT TTA CCA TTT GCT AAA CC-3’(下線:PshAI認識配列)
OTKD285:
5’-TAA ATC TCA ATT CAC ACT GGT GCT AAA TTA TTT TTA AAT GCA GA -3’ (下線:AleI認識配列)
OTKD286:
5’-TAAAAATAATTTAGCACCAGTGTGAATTGAGATTTATATTGATAAGTT-3’ (下線:AleI認識配列)
OTKD287:
5’-TAT ATA CGT ACG CAA TAT TAT AGA AAT ACC AAT TGT-3’ (下線:BsiWI認識配列)
(スフィンゴイド塩基生合成遺伝子を過剰発現するシリンゴマイシンE耐性ピキア・シフェリイ変異体によるアセチル化スフィンゴイド塩基の振とうフラスコ生産、および培養ブロス中のアセチル化スフィンゴイド塩基の定量化)
pSo−5をAleIで消化した後に、実施例14に記載した通りに、実施例17および18のプラスミドで、シリンゴマイシンE耐性ピキア・シフェリイ株の形質転換を行った。実施例15で記載した通りに、シリンゴマイシンE耐性ピキア・シフェリイ変異体による、アセチル化スフィンゴイド塩基の振とうフラスコ生産を行い、実施例16に従って、RP−HPLCを用いた、アセチル化スフィンゴイド塩基の検出および定量化を行った。
Claims (16)
- a.セラミドシンターゼ活性を有する酵素および/またはセラミダーゼ活性を有する酵素であって、後者の酵素が式Iのスフィンゴイド塩基を含有するセラミドを選択的またはさらには特異的に加水分解できる酵素をコードするポリヌクレオチドの発現を増大させるステップ、および/または
b.スフィンゴ脂質Δ8−デサチュラーゼ活性を有する酵素および/またはセラミダーゼ活性を有する酵素であって、後者の酵素がスフィンゴイド塩基としてフィトスフィンゴシンまたはジヒドロスフィンゴシンを含有するセラミドを選択的またはさらには特異的に加水分解できる酵素をコードするポリヌクレオチドの発現を低減させるステップ、および
c.請求項1に定義される生産性を有する株を単離するステップ
によって請求項1に記載の微生物株を得る方法。 - ジヒドロセラミドデサチュラーゼ活性を有する酵素をコードするポリヌクレオチドの発現を増大させるステップをさらに含む、請求項2に記載の方法。
- 請求項2または3に定義される酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドを用いたDNA媒介の形質転換を含む、請求項2または3に記載の方法。
- 前記セラミドシンターゼ活性を有する酵素が、
a.配列番号2および/または配列番号4のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
b.配列番号2のアミノ酸配列に対して少なくとも45%、および/または配列番号4のアミノ酸配列に対して少なくとも45%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、
c.配列番号9のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
d.配列番号9のアミノ酸に少なくとも45%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、
e.配列番号10のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
f.配列番号10のアミノ酸配列に対して少なくとも45%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド
からなる群から選択される、請求項2〜4のいずれか一項に記載の方法。 - 前記セラミダーゼ活性を有する酵素であって、該セラミダーゼが、式Iのスフィンゴイド塩基を含有するセラミドを選択的にまたはさらには特異的に加水分解できる酵素が、
d.配列番号15のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および
e.配列番号15のアミノ酸配列に対して少なくとも70%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド
からなる群から選択される、請求項2〜4のいずれか一項に記載の方法。 - 前記スフィンゴ脂質Δ8−デサチュラーゼ活性を有する酵素が、
f.配列番号6のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
g.配列番号6のアミノ酸配列に対して少なくとも30%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドと
からなる群から選択される、請求項2〜4のいずれか一項に記載の方法。 - 前記セラミダーゼ活性を有する酵素であって、該セラミダーゼが、スフィンゴイド塩基としてフィトスフィンゴシンもしくはジヒドロスフィンゴシンを含有するセラミドを選択的またはさらには特異的に加水分解できる酵素が、
h.配列番号8のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および
i.配列番号8のアミノ酸配列に対して少なくとも25%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド
からなる群から選択される、請求項2〜4のいずれか一項に記載の方法。 - 前記ジヒドロセラミドデサチュラーゼ活性を有する酵素が、
j.配列番号17のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
k.配列番号17のアミノ酸配列に対して少なくとも30%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド
からなる群から選択される、請求項3または4に記載の方法。 - 前記スフィンゴ脂質Δ8−デサチュラーゼ活性を有する酵素をコードするか、またはセラミダーゼ活性を有する酵素であって、該セラミダーゼが、スフィンゴイド塩基としてフィトスフィンゴシンもしくはジヒドロスフィンゴシンを含有するセラミドを選択的またはさらには特異的に加水分解できる酵素をコードするポリヌクレオチドが、真菌または酵母から、好ましくは酵母サッカロミセス・セレヴィジエ、クリュイベロミセス・ラクティス、ハンゼヌラ・ポリモルファ、ピキア・パストリス、ピキア・シフェリイ、イエロビア・リポリティカ、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・ユチリスまたはアシュビア・ゴシッピーから、より好ましくは酵母ピキア・シフェリイ、アシュビア・ゴシッピーまたはイエロビア・リポリティカから入手可能である、請求項2〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記セラミドシンターゼ活性を有する酵素をコードするか、またはジヒドロセラミドデサチュラーゼ活性を有する酵素をコードするポリヌクレオチドが、ウイルス、真菌、植物または動物から、より好ましくは藻類ウイルス、酵母、または哺乳動物から、最も好ましくはコッコリスウイルス属、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、デバリオマイセス属、クリュイベロミセス属、ピキア属、イエロビア属、カンジダ属、アシュビア属、マウス、ラットまたはヒトから入手可能である、請求項2〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記セラミダーゼ活性を有する酵素であって、該セラミダーゼが、式Iのスフィンゴイド塩基を含有するセラミドを選択的またはさらには特異的に加水分解できる酵素をコードするポリヌクレオチドが、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウス、ラットまたはヒトから入手可能である、請求項2〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 式Iのスフィンゴイド塩基またはその塩もしくはエステルを生産する方法であって、該スフィンゴイド塩基の生産に資する条件下での請求項1に記載の微生物株の発酵と、該発酵ブロスからの該スフィンゴイド塩基の回収とを含む方法。
- 配列番号2のアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号2のアミノ酸配列に対して少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、最も好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号4のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および配列番号4のアミノ酸配列に対して少なくとも55%、好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、最も好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、からなる群から選択される、セラミドシンターゼ活性を示すポリペプチド。
- 配列番号6のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および配列番号6のアミノ酸配列に対して少なくとも65%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、最も好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、からなる群から選択される、スフィンゴ脂質Δ8−デサチュラーゼ活性を示すポリペプチド。
- 配列番号8のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および配列番号8のアミノ酸配列に対して少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、最も好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、からなる群から選択される、セラミダーゼ活性を示すポリペプチドであって、該セラミダーゼが、スフィンゴイド塩基としてフィトスフィンゴシンまたはジヒドロスフィンゴシンを有するセラミドを選択的またはさらには特異的に加水分解するポリペプチド。
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