KR102343479B1

KR102343479B1 - 스핑고지질 및 스핑고이드 염기의 생산성이 향상된 피키아 시페라이 변이 균주 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR102343479B1
Application number: KR1020200076795A
Authority: KR
Inventors: 안정오; 한창표; 장민정; 권희운; 이태희; 이주희; 김혜진
Original assignee: 한국생명공학연구원; 솔루스바이오텍 주식회사
Priority date: 2020-06-23
Filing date: 2020-06-23
Publication date: 2021-12-27
Also published as: CN116157518A; WO2021261816A1; EP4170038A4; US20230242951A1; EP4170038A1

Abstract

본 발명은 신규한 세라마이드 전구물질 생산용 효모 변이 균주 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 피키아 시페라이(Pichia ciferrii)에서 세라마이드 생산을 위한 대사경로의 재설계를 통해 제조된 스핑고리피드 대사산물을 과발현할 수 있도록 유전자 조작된 피키아 시페라이 변이 균주 또는 상기 변이 균주의 제조방법에 관한 것이다.

Description

스핑고지질 및 스핑고이드 염기의 생산성이 향상된 피키아 시페라이 변이 균주 및 이의 제조방법 {Pichia ciferrii mutant strains Having Enhanced Spingoid Base and Sphingolipid Production And Preparation Method of the same}

본 발명은 지방산 대사를 조절함으로 스핑고지질 및 스핑고이드 염기의 생산성이 향상된 피키아 시페라이 변이균주 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

스핑고지질(sphingolipid)은 스핑고이드 염기로부터 유도되는 지질군을 나타내며 인체 내에서 스핑고신(sphingosine), 파이토스핑고신(phytosphingosine), 스핑가닌(sphinganine)을 기본 골격으로 하고 있는 세라마이드 또는 세라마이드 유도체의 통칭이다. 자연적으로는 동물, 식물 및 미생물의 세포막에 다량으로 존재하며 세포분화, 세포성장 및 세포사멸 등의 다양한 세포 신호전달에 관여한다.

세라마이드는 친수성 및 친유성기를 함께 가지고 있어 피부의 수분이 증발하는 것을 막을 뿐 아니라, 사람 피부 각질층의 침투성, 미생물에 대한 항상성을 지니는 방어물질 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 최근에 세라마이드(ceramides)는 화장품의 유용 물질로서 이용되고 있다.

세라마이드 전구체로 가치가 있는 테트라아세틸파이토스핑고신(Tetra acetyl phytosphingosine; TAPS)은 스핑고이드 염기 중 파이토스핑고신이 N, O-아세틸화에 의해 완전히 아세틸화된 상태로 생산되는 물질로서, 탈아세틸화 반응을 통해 다시 파이토스핑고신으로 전환이 용이하다. 전환된 파이토스핑고신의 화학적 구조가 인간 피부의 세라마이드 구조와 동일한 D-erythro 이성질체 구조를 지니고 있어, 인간 피부에 친화적인 세라마이드를 생산하는 원료로서 사용이 가능하다.

TAPS는 화학적으로 합성이 가능하나(Current Organic Chemistry, 2010. 14(20) 2483-2521) 그 과정이 복잡하고 생산 비용이 높다. 따라서, 경제적인 측면에서 이를 대체하기 위한 방법으로 생물학적인 방법을 통한 생산이 주목받고 있다. 그 중 피키아 시페라이가 TAPS를 포함하는 다량의 스핑고이드 염기 및 스핑고지질을 생산한다는 것이 발견되었고(Journal of bacteriology, 1960, 80(4) 484-491), 이후 게놈 시퀀싱(Eukaryotic cell, 2012, 11(12) 1582)을 통하여 TAPS의 생합성에 대한 간략한 과정이 알려져 있다.

야생형의 피키아 시페라이는 연구목적으로 진행된 실험에서 5 mg(TAPS)/g(glucose) 수율로 233 mg/L의 TAPS를 생산하는 것으로 알려져 있다(Applied Microbiology, 1962, 10(5) 401). 또한, 새로 분리된 피키아 시페라이 DSCC 7-25는 배양조건 조절 및 스핑고지질 분리정제 방법을 통해 1,065 mg/L의 TAPS 생산수율을 나타냈다(대한민국 등록특허 제10-0221357호, 대한민국 등록특허 제10-0188857호). 하지만, 이는 실험실 수준의 생산수율 향상에 지나지 않으며, 산업적 활용을 위한 대량생산에는 미치지 못하는 수준이다.

따라서, 본 발명에서는 산업적 활용이 가능하도록 TAPS의 생산 수율이 증가된 피키아 시페라이 변이 균주 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다.

대한민국 등록특허 제10-0221357호 대한민국 등록특허 제10-0188857호 대한민국 등록특허 제10-2056651호

Current Organic Chemistry, 2010. 14(20) 2483-2521 Journal of bacteriology, 1960, 80(4) 484-491 Eukaryotic cell, 2012, 11(12) 1582 Applied Microbiology, 1962, 10(5) 401 Science 2001, 292(5516) 504 Biochimica et Biophysica Acta(BBA) -Lipids and Lipid Metabolism, 1973. 306(2) 341-345

본 발명의 목적은 스핑고지질 및 스핑고이드 염기의 생산성이 증가된 유전자 조작된 피키아 시페라이 변이 균주 및 그의 제조방법을 제공하는데 있다.

추가적으로, 본 발명의 목적은 유전자 조작된 피키아 시페라이 변이 균주를 이용하여 세라마이드 전구체인 TAPS를 생산하는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위해 본 발명은 유전자 조작된 피키아 시페라이 변이 균주를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따라, 세포 내에서 팔미토일-CoA의 축적을 높이기 위해 팔미토일-CoA의 베타 산화(β-oxidation)에 관련된 유전자의 발현이 억제된 피키아 시페라이 변이 균주를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따라, 팔미토일-CoA의 베타 산화에 관련된 유전자인 PcPOX3 유전자가 결실되어 발현이 억제된 피키아 시페라이 변이 균주를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따라, PcPOX3 유전자가 결실된 피키아 시페라이 세포에 스핑고이드 염기의 인산화에 관여하는 유전자인 PcLCB4 유전자의 발현이 추가적으로 억제된 피키아 시페라이 변이 균주를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따라, 세포 내에서 세라마이드의 전구체인 TAPS(Tetraacetyl phytosphingosine) 생산을 높이기 위한 배양 방법 및 TAPS 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따라 상기 피키아 시페라이 변이 균주에서 세라마이드의 전구체인 TAPS 제조방법을 제공한다.

본 발명에 의해 제공되는 피키아 시페라이 변이 균주는 야생형에 비해 스핑고지질 및 스핑고이드 염기의 생산성이 증가된 유전자 조작된 피키아 시페라이 균주를 제공한다. 또한, 본 발명은 생물학적 방법을 통해 스핑고지질 및 스핑고이드 염기를 생산할 수 있는 환경친화적인 생산방법을 제공한다.

도 1은 영양요구성 PcURA3 유전자 결실 카세트 벡터의 구축 도면을 나타낸 것이다.
도 2는 지방산 대사 관련 결실 카세트 벡터의 구축 및 연속 결실의 원리를 나타낸 것이다.
도 3은 각각의 피키아 시페라이 변이 균주의 TAPS 생산량을 나타낸 그래프이다.
도 4는 PcPOX3 유전자 결실된 피키아 시페라이 변이 균주에 C12의 FAME이 함유된 배지에서의 TAPS 생산량을 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명에 대한 이해를 돕기 위하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

피키아 시페라이는 다른 효모들에서는 볼 수 없는 완전히 아세틸화된 스핑고지질의 생산 및 대량 분비능력을 갖춘 유일한 효모이며(Journal of bacteriology, 1960, 80(4) 484-491), 아직까지 이러한 표현형으로 진화하게 된 정확한 기원은 밝혀지지 않았으나, 다만 아미노산 대량 생산 효모나 혹은 크랩트리 양성 균주에서 탄소 에너지원 확보를 위한 경쟁을 통해 진화했을 것으로 짐작되고 있다(Science 2001, 292(5516) 504).

피키아 시페라이는 비 전통 효모 균주로서 이전에는 한세눌라 시페라이(Hansenula ciferrii) 또는 피키아 시페라이(Pichia ciferrii)로 명명되었으나, 현재에는 위커하모마이세스(Wickerhamomyces) 속으로 재분류 되었다. 하지만, 본 발명에서는 기존의 명명과 혼돈을 방지하기 위하여 기존의 명명대로 피키아 시페라이(Pichia ciferrii)로 명시하였다. 피키아 시페라이의 주요 특징으로 다른 효모들에서는 볼 수 없는 완전히 아세틸화 된 스핑고이드의 생산 및 대량 분비능력을 갖춘 유일한 효모로 앞서 서술한 화장품 세라마이드 전구체로 가치 있는 TAPS를 생산하여 분비할 수 있다.

스핑고지질 생합성 과정의 첫 단계는 세린 팔미토일 트랜스라제(3-ketosphinganine synthase)가 세린과 팔미토일-CoA를 응축하여 탄소수 18의 3-케토스핑가닌(3-ketosphinganine)을 형성하는 단계이며, 이 단계가 스핑고지질 생합성 과정의 속도를 결정하는 단계이다(Biochimica et Biophysica Acta(BBA) -Lipids and Lipid Metabolism, 1973. 306(2) 341-345).

세린(L-serine)과 함께 TAPS 생합성의 원료가 되는 팔미토일-CoA는 베타-산화(ß-Oxidation)과정에 의하여 아세틸-CoA (Acetyl-CoA)로 분해되는 대사과정이 존재한다. 이 대사과정을 차단하면 팔미트산(Palmitic acid)에서 팔미토일-CoA로의 전환을 강화할 수 있으며 그로 인해, 팔미토일-CoA의 축적을 유도해 TAPS 생산량을 증가시킬 수 있다.

베타 산화(ß-Oxidation)과정에서 팔미토일-CoA를 trans-Δ2-Enoyl-CoA로 전환하는 반응을 촉매하는 효소와 관련된 유전자는 POX 유전자인 것으로 알려져 있으며, 피키아 시페라이에서 역시 PcPOX3 및 PcPOX4로 명명된 이와 유사한 유전자가 알려져 있다. 해당 유전자들의 발현을 억제함으로써 팔미토일-CoA의 축적률을 증가시킬 수 있다.

또한, 지방산 대사에서 PcLCB4(sphinganine kinase LCB4)는 스핑가닌 및 파이토스핑고신의 인산화시키는 키나제(kinase) 활성을 지니는 효소로서 PcLCB4 유전자를 결실시키면 스핑고신 쪽으로의 대사를 억제함으써 TAPS 생산량이 늘어난다는 것이 알려져 있다(대한민국 등록특허 제10-2056651호).

본 발명은 PcPOX3 유전자(서열번호 28) 또는 PcPOX3(서열번호 28) 및 PcLCB4(서열번호 29) 유전자의 발현이 억제된 피키아 시페라이(Pichia ciferrii) 변이 균주에 관한 것으로서, 상기 유전자들의 발현 억제 방법으로는 각 유전자의 일부 또는 전체 결실, 외래 DNA 삽입, 유전자 일부의 외래 유전자에 의한 치환, RNA 간섭, 유전자의 돌연변이 유도 또는 이들의 조합에 의한 것이고, 구체적으로는 각 유전자의 일부 또는 전체 결실에 의한 것이고, 보다 구체적으로는 각 유전자 전체 결실에 의한 것이다.

본 발명에서는 해당 유전자들을 타겟으로 결실 카세트를 구축해 팔미토일-CoA의 축적률을 증가시킬 수 있고, 본 발명에서는 PcPOX3 유전자를 결실시킨 피키아 시페라이 변이 균주, 및 PcPOX3 및 PcLCB4 유전자를 동시에 결실시킨 피키아 시페라이 변이 균주를 제작하여 증가된 TAPS 생산량을 확인하였다.

상기 효소 활성 감소는 야생형 피키아 시페라이 균주와 비교되는 것으로 이해된다.

세포의 "야생형"이란 본 발명과 관련하여 바람직하게는, 본 발명에 따른 세포가 특정된 핵산 서열에 의하여 코딩된 효소의 활성에 영향을 미치는 요소(예를 들어, 상응하는 효소를 코딩하는 특정된 핵산 서열을 포함하는 유전자 또는 상응하는 유전자에 존재하고 특정된 핵산 서열에 기능적으로 연결된 프로모터)의 변형을 통해 발달되는 모 균주를 의미한다.

야생형과 비교하여 “효소 활성 감소” 란 바람직하게는, 야생형 활성을 기준으로 적어도 50%만큼, 특히 바람직하게는 적어도 90%만큼, 추가로 바람직하게는 적어도 99.9%만큼, 추가로 한층 더 바람직하게는 적어도 99.99%만큼, 가장 바람직하게는 적어도 99.999%만큼 감소한 활성을 의미한다.

본 발명에 따른 세포의 그의 야생형과 비교한 특정 활성의 감소는 가능하면 동등한 세포수/농도, 예를 들어 배지, 가스처리, 교반과 같은 동일한 조건하에서 증식시킨 세포를 사용함으로써 활성을 측정하는 방법으로 측정할 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 효모 변이 균주는 피키아 시페리이(Pichia ciferrii) 야생형(wild type)의 균주를 모균주로 하여 스핑고지질 대사 경로를 재설계한 변이 균주이며, 바람직하게는 한국등록특허 제10-0188857호의 실시예에 개시된 피키아 시페라이 DSCC 7-25 균주(기탁번호 KFCC-10937)를 이용하거나, 스핑고지질 대사 경로를 갖는 균주라면 스트레인에 제한 없이 모균주로 이용이 가능하다.

본 발명의 일실시예에서는 상기 방법을 통한 변이 균주에서의 TAPS 생산(TAPS 특이수율)은, PcPOX3 유전자 결실 변이 균주에서는 약 1.7배, PcPOX3 및 PcLCB4 유전자를 동시에 결실시킨 변이 균주에서는 2배 이상을 보였다.

본 발명의 일실시예에서는 상기 변이균주 배양 배지에 지방산 메틸에스터를 추가하여 인위적으로 세포 내 지방산을 축적시킴으로써 TAPS 생산을 늘리는 방법을 제공한다. 그 결과 PcPOX3 유전자 결실 변이 균주에서는 약 100%로 TAPS 특이수율이 증가했다.

위 언급한 서열에 관하여 "뉴클레오티드 동일성"은 공지 방법의 도움을 빌려 측정될 수 있다. 일반적으로, 특별한 필요조건을 고려에 넣는 알고리즘을 갖춘 특수 컴퓨터 프로그램이 사용된다.

본 발명의 또다른 목적은 스핑고이드 염기 및 스핑고지질을 생성하는 본 발명에 따른 변이균주를 제공하는데 있다.

본 발명과 관련하여 용어 "스핑고이드 염기"는 피토스핑고신, 스핑고신, 스핑가디에닌, 6-히드록시스핑고신 및 스핑가닌(디히드로스핑고신), 또한 아세틸화 형태로, 예컨대 예를 들어 테트라아세틸피토스핑고신, 트리아세틸피토스핑고신, 디아세틸피토스핑고신, O-아세틸피토스핑고신, 트리아세틸스핑가닌, 디아세틸스핑가닌, O-아세틸스핑가닌, 트리아세틸스핑고신, 디아세틸스핑고신, O-아세틸스핑고신, 테트라아세틸-6-히드록시스핑고신, 트리아세틸-6-히드록시스핑고신, 디아세틸-6-히드록시스핑고신, O-아세틸-6-히드록시스핑고신, 트리아세틸스핑가디에닌, 디아세틸스핑가디에닌, O-아세틸스핑가디에닌 중에서 선택되는 것을 의미한다.

본 발명과 관련하여 용어 "스핑고지질"은 아미드 결합을 통해 지방산에 공유결합한 스핑고이드 염기를 포함하는 화합물을 의미하는 것으로 이해된다. 지방산은 포화되거나 또는 단일불포화- 또는 다불포화될 수 있다. 지방산 측쇄는 길이가 다양할 수 있다. 지방산 측쇄는 히드록시기와 같은 관능기를 또한 보유할 수 있다. 스핑고지질로는 예를 들어, 피토세라미드, 세라미드 및 디히드로세라미드, 및 좀더 복잡한 글루코실세라미드(세레브로시드) 및 이노시톨 포스포릴세라미드, 만노실이노시톨 포스포릴세라미드 및 만노실디이노시톨 포스포릴세라미드가 포함된다. 여기서 스핑고지질은 아미드 결합을 통해 아세틸 라디칼에 결합한 스핑고이드 염기, 예컨대 예를 들어 N-아세틸피토스핑고신, N-아세틸스핑가닌, N-아세틸스핑고신, N-아세틸-6-히드록시스핑고신을 또한 포함한다. 이들 화합물은 단쇄형 세라미드라는 용어로도 알려져 있다.

피토스핑고신, 스핑고신, 스핑가디에닌, 6-히드록시스핑고신, 스핑가닌(디히드로스핑고신), 테트라아세틸피토스핑고신(TAPS), 트리아세틸피토스핑고신, 디아세틸피토스핑고신, O-아세틸피토스핑고신, N-아세틸피토스핑고신, 트리아세틸스핑가닌(TriASa), 디아세틸스핑가닌, O-아세틸스핑가닌, N-아세틸스핑가닌, 트리아세틸스핑고신(TriASo), 디아세틸스핑고신, O-아세틸스핑고신, N-아세틸스핑고신, 테트라아세틸-6-히드록시스핑고신, 트리아세틸-6-히드록시스핑고신, 디아세틸-6-히드록시스핑고신, O-아세틸-6-히드록시스핑고신, N-아세틸-6-히드록시스핑고신, 트리아세틸스핑가디에닌, 디아세틸스핑가디에닌, 및 O-아세틸스핑가디에닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 스핑고이드 염기 및 스핑고지질을 제조하기 위한 본 발명에 따른 변이 균주의 이용이 유리하다. 테트라아세틸피토스핑고신(TAPS)을 제조하기 위한 본 발명에 따른 변이 균주의 이용이 바람직하다.

본 발명의 또다른 목적은 본 발명에 따른 앞서 기재한 변이 균주를 제조하는 방법을 제공하는데 있다. 상기 제조방법은

a) 피키아 시페라이 균주를 제공하는 단계, 및

b) β 산화에 관련된 적어도 1종의 유전자를, 그 유전자 내로의 외래 DNA 또는 선택 마커 유전자를 코딩하는 DNA의 삽입, 유전자의 적어도 일부 결실, 유전자 서열에서의 점 돌연변이, RNA 간섭의 영향에의 유전자 노출, 및 외래 DNA 또는 프로모터 영역의 외래 DNA에 의한 유전자의 일부 치환에 의하여 변형시키는 단계를 포함한다.

본 발명에 따른 피키아 시페라이 변이 균주는 스핑고이드 염기 및 스핑고지질을 제조하는데 사용될 수 있고, 바람직하게는 테트라아세틸피토스핑고신(TAPS)의 생산 수율을 향상시키는데 적합하나 이에 한정되지 않는다.

이하에서 본 발명에 따른 피키아 시페라이 변이 균주를 사용하여 스핑고이드 염기 및 스핑고지질을 제조하는 방법을 구체적으로 설명한다.

a) 일실시예 따라 유전자 변형된 변이 균주를, 탄소원을 포함하는 배지와 접촉시키는 단계;

b) 균주가 상기 탄소원으로부터 스핑고이드 염기 및 스핑고지질을 생성할 수 있게 해주는 조건하에서 균주를 배양하는 단계; 및

c) 임의로, 생성된 스핑고이드 염기 및 스핑고지질을 단리하는 단계를 포함한다.

이하에서 본 발명에 따른 피키아 시페라이 변이 균주를 사용하여 스핑고이드 염기 및 스핑고지질을 제조하는 추가적인 방법을 구체적으로 설명한다.

a) 일실시예 따라 유전자가 변형된 변이균주를, 탄소원 및 지방산 메틸 에스터(FAME)를 포함하는 배지와 접촉시키는 단계;

b) 변이 균주가 상기 탄소원으로부터 스핑고이드 염기 및 스핑고지질을 생성할 수 있게 해주는 조건하에서 변이 균주를 배양하는 단계; 및

상기 세포 배양 단계에서 사용될 수 있는 탄소원은 탄수화물, 예컨대 예를 들어 글루코스, 프룩토스, 글리세롤, 수크로스, 말토스, 당밀, 또는 그 밖의 알콜, 예컨대 예를 들어 에탄올, 및 유기산, 예컨대 예를 들어 아세테이트이다. 사용될 수 있는 질소원은 예를 들어 암모니아, 황산암모늄, 질산암모늄, 염화암모늄, 유기 질소 화합물(예컨대, 효모 추출물, 맥아 추출물, 펩톤, 옥수수침지액)이다. 무기 화합물, 예컨대 예를 들어 인산염, 마그네슘염, 칼륨염, 아연염, 철염 등이 또한 사용될 수 있다.

본 발명의 피키아 시페라이 균주에 대한 적합한 배양 조건은 예를 들어 국제공개특허 제2007-131720호 또는 한국등록특허 제10-0221357호로부터 당업자에게 공지되어 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 발명의 용도 범위는 전체의 상세한 설명과 특허청구범위에 따른다.

<실시예>

<실시예 1> 영양요구성 유전자 결실 카세트 구축

별도의 명시가 없는 한 이후의 카세트의 구축은 대장균 플라스미드 클로닝에 의해 구축되었다. 유전자의 결실은 고전적인 상동성 재조합과 이중 카세트 활용에 의해 DNA를 치환하여 실행하였다(Yeast, 1996. 12(14): 1439-1457).

본 발명자들은 효율적인 마커 유전자의 활용을 위해 영양요구성 유전자 PcURA3를 먼저 발굴하여 결실하였으며, 이후 PcPOX3, PcLCB4 유전자의 결실(실시예2)에 대한 마커로 활용하였다.

구체적으로, 플라스미드 pGEM-T-easy(Promega) 벡터를 운반 벡터로 사용하여 PcURA3 결실 카세트를 구축했다. pGEM-T-easy 벡터를 제한효소 SpeI과 SacI을 사용해 절단했으며 그에 따라 생성된 2.97 kb의 DNA 절편을 후속 클로닝을 위한 골격으로 사용하였다.

PCR 증폭에 의하여 피키아 시페라이 야생형 세포 게놈에서 분리한 GAPDH 유전자(서열번호 1) 5' 말단의 600bp서열과 DNA 합성한 항생제 nourseothricin 저항성 유전자 PcNAT1(서열번호 2)를 증폭했다.

제한효소 SpeI과 NdeI을 사용해 PcGAPDH 유전자(서열번호 1)의 5' 말단(P-GAP1)을 절단하고, SacI과 NdeI을 사용해 PcNAT1 유전자(서열번호 2)를 절단한 두 DNA 절편을 사전에 절단한 pGEM-T-easy 벡터 절편과 T4 DNA 접합효소(TAKARA) 처리를 통해 연결했다.

벡터상에서 연결된 GAPDH 말단을 제한효소 SpeI과 EcoRI을 사용해 절단했으며 그에 따라 생성된 4.147 kb의 DNA 절편을 후속 클로닝을 위한 골격으로 사용하였다.

PCR 증폭에 의하여 피키아 시페라이 야생형 세포 게놈에서 분리한 PcTEF1 유전자 3' 말단의 150bp서열 T-PcTEF를 증폭했다(서열번호 27).

제한효소 SpeI과 EcoRI을 사용해 T-PcTEF를 절단하고, 사전에 절단한 pGEM-T-easy 벡터 GAPDH 말단과 T4 DNA 접합효소(TAKARA) 처리를 통해 연결했다.

벡터상에서 연결된 GAPDH 말단(도 1, P-GAP1), PcNAT1 유전자와 PcTEF 말단(도1, T-PcTEF) DNA 1335bp, 피키아 시페라이 야생형 세포 게놈에서 분리한 PcURA3 유전자(서열번호 3)의 5' 말단 1171 bp, 3' 말단 548 bp를 PCR 증폭했다. 이 때 PcGAPDH 말단과 PcURA3 유전자의 5' 말단, PcTEF 유전자 말단과 PcURA3 유전자 3' 말단이 22bp, 25bp 중첩되도록 했다.

PcNAT1 유전자의 개시코돈으로부터 324bp에 위치하는 프라이머 NAT1_MB(cacctgaatcaggatattcttctaatacctgg, 서열번호 9)와 PcURA3 유전자(서열번호 3) 5' 말단 1171bp에 위치하는 PcURA3_5D1F(tgagaaacgtggcaatggatcattg, 서열번호 10)를 사용해 도 1의 카세트 1을 PCR 증폭했다.

PcNAT1 유전자의 개시코돈에 위치하는 프라이머 NAT1_1F(atgggtaaggaaaagactcacgttt, 서열번호 11)와 PcURA3 유전자 3' 말단 548bp에 위치하는 프라이머 PcURA3_3D2B(ttgtcactcttgaatggcatctactg, 서열 12)를 사용해 도 1의 카세트 2를 PCR 증폭했다.

서술된 모든 프라이머는 5'에서 3' 방향으로 표기되었다.

실시예 1의 방법으로 제조된 결실 카세트(서열번호 4)를 피키아 시페라이 균주에 형질전환으로 도입해 PcURA3 유전자(서열번호 3)를 결실하였으며, 삽입된 카세트는 PCR과 DNA서열 분석을 통해 확인했다(도 1)

<실시예 2> 지방산 및 스핑고지질 대사 관련 유전자 결실 카세트의 구축

기본적인 카세트 벡터의 구축 원리는 영양요구성 유전자 결실 카세트의 구축과 동일하다.

본 실시예에서 결실 카세트를 구축하고자 하는 타겟 유전자는 PcPOX3, PcLCB4, 또는 PcPOX3 및 PcLCB4 동시 결실이다. 플라스미드 pGEM-T-easy(Promega)을 운반벡터로 사용하여 결실 카세트를 구축했다. pGEM-T-easy(Promega) 벡터를 제한효소 NotI과 SpeI을 사용해 절단했으며 그에 따라 생성된 3.73 kb의 DNA 절편을 후속 클로닝을 위한 골격으로 사용하였다.

피키아 시페라이 야생형 게놈을 주형으로 PcURA3 유전자 ORF의 5' 말단 359bp에서부터 3' 말단 387bp를 앞서 서술한 pGEM-T-easy 벡터 절편 SpeI 절단 단면과 30bp 중첩되도록 PCR 증폭했다.

피키아 시페라이 야생형 게놈을 주형으로 PcURA3 유전자 3' 말단 387bp를 5' 말단은 앞서 서술한 pGEM-T-easy 벡터 절편 NotI 절단 단면과 30bp 중첩되고 3' 말단은 URA3 유전자의 5' 말단 329bp에서부터 359bp까지 30bp 중첩되도록 PCR 증폭했다.

앞서 PCR 증폭한 두 DNA 절편과 절단한 pGEM-T-easy 벡터 절편을 infusion cloning(TAKARA)를 통해 PcURA3 유전자 양 말단에 반복서열이 존재하도록 만들었다.

결실하고자 하는 타겟 유전자의 5' 말단 부위와 3' 말단 부위(표 1)를 각각 PCR 증폭하고, 이 때 융합하고자 하는 마커 유전자의 반복서열과 30-35bp 중첩하도록 프라이머 5' 말단을 연장해 사용했다(표 1).

결실 유전자의 해당 프라이머 서열 리스트

유전자명	결실 타겟 유전자 해당 프라이머 서열
유전자명	N1	N2	N3	N4	N5	N6
PcPOX3	gatgcatgctcgagcAGTATCAAATCAATTACTTATACACTTATGACTTTTATG (서열번호 15)	AGTATCAAATCAATTACTTATACACTTATGACTTTTATG (서열번호 16)	TATATTGTTGACCgcATAACCAGCTAATTTCACAATTTTTTTGAAAGCT (서열번호 17)
PcPOX3				cactggcggccgttaTTTCCATTACATCAGAAAACATTTCACAAT (서열번호 18)	ccgagctcggatccaATATTTCCTTAATATCCTTCTAACTTCTTCTTCA (서열번호 19)	ATATTTCCTTAATATCCTTCTAACTTCTTCTTCA (서열번호 20)
PcLCB4	gatgcatgctcgagcAAACTTATTCTCTTGTTTGGAACAC (서열번호 21)	AAACTTATTCTCTTGTTTGGAACAC (서열번호 22)	TATATTGTTGACCgcTTCAAATCTTGAAGGACCTAACC (서열번호 23)
PcLCB4				cactggcggccgttaCGTATGGCACCAACTTTATTATC (서열번호 24)	ccgagctcggatccaGCAATTCTTGTTAAAGCAGCTC (서열번호 25)	GCAATTCTTGTTAAAGCAGCTC (서열번호 26)

앞서 구축한 벡터를 NotI 제한효소 절단한 DNA 절편과 결실 타겟 유전자(도 1)의 프라이머 N1과 N3로 PCR 증폭한 5' 말단과 infusion cloning(TAKARA)을 통해 연결했다.

앞서 구축한 벡터에 SpeI 제한효소 절단한 DNA 절편과 결실 타겟 유전자의 프라이머 N4과 N5로 PCR 증폭한 3' 말단을 infusion cloning(TAKARA)을 통해 연결했다.

PcURA3 유전자 종결코돈으로부터 43bp 내부에 위치하는 프라이머 PcURA3R(GCTCTGTAACGTTCACCTTC, 서열 13)와 마커유전자 5' 말단에 삽입된 결실 타겟 말단 부위의 역방향 프라이머(N2)를 사용해 도 2의 카세트 1을 PCR 증폭했다

PcURA3 유전자의 개시코돈으로부터 150bp 유전자 내부에 결합하는 프라이머 PcURA3F(ATTAGGTCCATATATCTGTCTTGTC, 서열 14)와 마커 유전자 3' 말단에 삽입된 결실 타겟 말단 부위의 역방향 프라이머(N6)를 사용해 도 2의 카세트 2를 PCR 증폭했다.

서술된 모든 프라이머는 5'에서 3' 방향으로 표기되었다.

이 방법을 통해 PcPOX3 서열(서열번호 5, 서열번호 6), PcLCB4 서열(서열번호 7, 서열번호 8)을 갖는 특정 유전자 결실 카세트를 구축하였다.

실시예 2의 방법으로 제조된 유전자 결실 카세트(서열번호 5 내지 8)를 피키아 시페라이 균주에 형질전환으로 도입해 타겟 유전자를 결실하였으며, 삽입된 카세트는 PCR과 DNA 서열 분석을 통해 확인했다.

연속적인 유전자의 결실을 위하여 마커 유전자의 5' 및 3'의 말단에 삽입된 반복 서열의 재조합을 통해 마커 유전자가 도태된 피키아 시페라이 세포를 5'-플루오로오로틱산(5'-fluoroorotic acid)의 첨가에 의해 구축 후 PCR을 통해 확인했다.

<실시예 3> 형질전환체 선발

구축한 카세트를 온도 37℃ 조건에서 15분 열 충격(heat shock)을 가하여, 모균주인 DSCC 7-25, 및 이에서 유래한 균주에 형질전환하여, 타겟 유전자의 발현 여부를 PCR 증폭으로 확인하여 목적하는 형질전환체를 선발하였다.

<실시예 4> 형질전환체의 TAPS 생산

균주 피키아 시페라이 DSCC 7-25(기탁번호 KFCC-1093)에서 PcURA3 유전자 결실 변이 균주(BD 02), 상기 BD 02 균주에서 PcLCB4 유전자 결실 변이 균주(KD 02), BD 02 균주에서 PcPOX3 유전자 결실 변이 균주(KD 04), 및 BD 02 균주에서 PcLCB4 및 PcPOX3 유전자 동시 결실 변이 균주(KD 08)를 각각(표 2) YGM　최적배지(글리세롤　100g/ℓ,　효모 추출물　2g/ℓ, KNO₃ 3g/ℓ, (NH₄)₂SO₄ 0.5g/ℓ, MgSO₄·7H₂O 0.3g/ℓ, NaCl 0.5g/ℓ, CSL(corn steep liquor) 3g/ℓ, LS-300(anti-forming agent) 1g/ℓ) 50㎖에 접종하여 25℃에서 5일간 220rpm으로 배양한 후 메탄올을 4 부피로 첨가하여 상온에서 1시간 반응한 다음, 원심분리한 상등액의 TAPS를 분석하였다.

TAPS는 UV 200 ㎚를 이용하여 HPLC로 분석하였다. 용매로 메탄올과 물 및 TFA (trifluoroacetic acid)의 84.5:18.45:0.05 혼합액을 사용하였다.

각 변이균주의 특징

균주 명칭	특징
BD 02	피키아 시페라이 DSCC 7-25(기탁번호 KFCC-10937)에서 PcURA3 유전자 결실
KD 02	BD 02 균주에서 PcLCB4 유전자 결실
KD 04	BD 02 균주에서 PcPOX3 유전자 결실
KD 08	BD 02 균주에서 PcPOX3 및 PcLCB4 유전자 동시 결실

아래 표 3 및 도 3에 나타난 바와 같이 YGM 최적 배지를 사용한 경우, BD 02에 대한 PcLCB4 유전자 결실 변이균주(KD 02) 및 PcPOX3 유전자 결실 변이균주 (KD 04)에서의 TAPS 특이수율은 각각 1.9배, 1.7배 증가했다.

또한, BD 02에 대한 PcLCB4 및 PcPOX3 유전자 동시 결실 변이균주(KD 08)의 경우 2.3배의 높은 TAPS 특이수율을 보였다.

각 균주 별 TAPS 생산량 분석 결과

	BD 02	KD 02	KD 04	KD 08
TAPS (mg/L)	2460	3750	2800	3500
TAPS 특이수율 (mg/DCW)	10.9	20.85	18.53	24.72
상대적인 TAPS 특이수율(BD 02 기준)	1	1.9	1.7	2.3

<실시예 5> 지방산 메틸에스터 첨가 및 형질전환균주에서의 TAPS 생산

BD 02 및 KD 04 형질변환 균주 각각을 YGM　최적배지 50㎖에 접종하여 25℃에서 3일간 220 rpm으로 배양한 후 지방산 첨가배지 (글리세롤　30g/ℓ,　효모 추출물　2g/ℓ, KNO₃ 3g/ℓ, (NH₄)₂SO₄ 0.5g/ℓ, MgSO₄·7H₂O 0.3g/ℓ, NaCl 0.5g/ℓ, CSL 3g/ℓ, LS-300 1g/ℓ, Lauric acid methyl ester 2.14 g/l, Tween 80 0.5%) 50㎖를 첨가해 25℃에서 4일간 220 rpm으로 배양했다.

메탄올을 4 부피로 첨가하여 상온에서 1시간동안 반응한 다음, 원심분리한 상등액의 TAPS를 분석하였다.

TAPS는 UV 200㎚를 이용하여 HPLC로 분석하였다. 용매로 메탄올과 물 및 TFA의 84.5:18.45:0.05 (w/w) 혼합액을 사용하였다.

표 4의 결과로부터 비교할 수 있는 바와 같이 지방산 메틸에스터를 첨가한 최적배지를 사용한 경우 BD 02에 대한 PcPOX3 결실변이균주 KD 04의 TAPS 생산량이 약 70% 증가했으며 특이수율은 100% 이상 증가했다.

각 균주별 TAPS 생산량 분석 결과

	BD 02	KD 04
TAPS (mg/L)	2240	3774
TAPS 특이수율(mg/DCW)	14.1	29
상대적인 TAPS 특이수욜(BD 02 기준)	1	2.1

<110> Doosan Solus co., Ltd. Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Pichia ciferrii mutant strains Having Enhanced Spingoid Base and Sphingolipid Production And Preparation Method of the same <130> P2018-0401 <160> 29 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1647 <212> DNA <213> Pichia ciferrii <220> <221> gene <222> (1)..(1647) <223> GAPDH, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) gene <400> 1 aagcaattaa acaacatacc aacaaaacaa ttatacccag tgatacctac atacaattaa 60 cccatagtaa actaatacct cacaacatta ataaagcatc tgatcttaat gtactactaa 120 tcctaaactc atgataatta ctgctgttgt aatgtttgtc atcactttga tcatcacgag 180 catcaccgga ccgttaatta ccaacaatct caattgtaga acacagtgtt aaacagggat 240 aaaacaacaa ttaattatga taaaaggttc aaacaagtac caatagatag ataattatta 300 cctctataat atatcattta attgaattaa tatcaatagt tgttattcaa ttatccctac 360 tttcctggtt aaagttacac catcagatgg ttcaccacca atgttgttca aaccatttcc 420 actcaactga cgtttcaaca acatcacctg aaaaaaaaat tcatcacaca ttgggagaaa 480 ttgggagaat tgtatataag gagttgaaat cgctaattat tttatacttc ttcattatac 540 ttctattcta catcagtatt ttataataca aaaacaaaca aataaaacaa ataattaaca 600 atggctatca cagttggtat taacggtttc ggtcgtattg gtcgtttagt cctaagaatt 660 gctctttcaa gaaaagatat tcaaattgtt gcaattaatg atccattcat tgcaccagaa 720 tatgcttcat atatgtttaa atatgattct actcatggtc gttatgcagg tgaagtttct 780 catgaaggtg ataacattgt tattgatggt aaaaaaatca gagtttatca agaacgtgat 840 ccagttaaca tcccatgggg taaagatggt gttgattatg ttattgattc aactggtgtt 900 tttaaagaat tagattctgc tcaaaaacat attgatgccg gtgctaaaaa agttgttatt 960 actgctccat catcaactgc tccaatgttt gttgttggtg ttaatgaaga taaatatact 1020 ccagatttaa acattatttc aaatgcttca tgtacaacaa attgtttagc tccattagct 1080 aaaattatta acaacaaatt tggtattgaa gaaggtttaa tgactactgt tcattcaatt 1140 actgctactc aaaaaactgt tgatggtcca tctcataaag attggagagg tggtcgtact 1200 gcttcaggta atattattcc atcatcaact ggtgctgcta aagctgttgg taaagttatt 1260 ccagaattag ctggtaaatt aactggtatg tctttaagag ttccaactgt tgatgtttca 1320 gttgttgatt taactgttaa attattaaaa gatgccactt atgatgaaat 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1500 taaaaatact tcaaagtctt aacagcatag atagaagctt atcaatcaac tatcatcaag 1560 ccagtagatg ccattcaaaa gtgacaaatg t 1591 <210> 4 <211> 2983 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial cassette (PcURA3) <400> 4 tgagaaacgt ggcaatggat cattgtttat agaaaaattt aatgaatacg acaataatat 60 taaaacaatt taatactgaa ataaaagttg taatatagta taaaatataa aattcatgag 120 aaatatgtac aaaaggtttg taagatcacc acattttctt taaaatgatc tcaccataat 180 aataaaacat ctaaagataa atcaaaggga acccacaaat tgaaatgaaa agaattgtat 240 aaacatcatg actttaaaca attcacttct agtatatgag agataataaa ttcattaaca 300 gtattttttt tttctaaatt ttttaatttt ttgtatctaa attctttaag caaacaagaa 360 taaaagatta atacacctat taaatatctg aaccttaacg tctcatttgt tgagttaata 420 aagcattttg ttcttggaat ctttgaccga ctctttcact gtgtttcaag aatttttcag 480 aacattttaa aacacatgta ttttcttttg aagttaatga agcggaagtg aaatcattaa 540 cacaatcatt gaaacaacgt tcaaccaagt ttgagtaaag acgcatgaaa tctttcattt 600 gtttaccttc aacgattctt tggaaatctt gttgttctct ttggtttaat tgatccattt 660 tgattgattt gatatagatt tgagctttgt agttctgatc aattaggtac aaaaggtctt 720 tcaatggcaa aagtgtactt ttttgatttt tcaatgaagt cgaaaaggtt caaatttttt 780 tttggtcaac aaaacatcat aaatatccga atttggaaag attcccgata tggacaaaat 840 caggaatcaa ttggaattat gattcatttg agcattatag tgtgaataat tctttatgtt 900 ctctgttctt tattatatca agctttaaag agacactagg cgtcccatag atcggatggt 960 ctattcaagt gtctcaaaga aaaaaaatag ttgcttgatt ttggctgtag tagagcttgt 1020 acgggacacg cttctatgaa taaatttgtc cgatgagttg gataaatatt aactgaacta 1080 atttcttcta attgatagag catcatcaat atattgcaca taatataatt caaaaaaaca 1140 acaaacaaca acaactttac ccagtggtac ctacatacaa ttgacccata gtaaactaat 1200 aactcataac acaataaagc atctgatctt aatgtactac taaatactaa actgatgata 1260 attacttttg ttgtaatgtt tgtcatcact ttgatcatca cgagcatcac cggaccgtta 1320 attaccaaca atctcaattg tacaacatag tgttaaaaca ggataacttg atgattatat 1380 gtgatattaa gttcaaacaa gtaccaataa atagataatt aatagctcta taatatatca 1440 tttaattgaa ttaatatcaa tagttgttgt ttaattatcc ctagttttct ggttaaagtt 1500 acaccatcag atggttcacc accaatgttg ttcaaaccat ttccactcaa ctgacgtttc 1560 cagaacatca ccctgaaaaa aaaaaattca tcacacattg ggagaaattg gggaggattg 1620 tatataagga gtggaaattc gctaatattt ttataattct aactcacttg ttttaattca 1680 acatcagtat tttataatac aaaaacaaac aaacaaacaa ataattaatt aacaatgggt 1740 actactttag atgatactgc ttatagatat agaacttcag ttccaggtga tgctgaagct 1800 attgaagctt tagatggttc atttactact gatactgttt ttagagttac tgctactggt 1860 gatggtttta ctttaagaga agttccagtt gatccaccat taactaaagt ttttccagat 1920 gatgaatcag atgacgagtc tgatgacggt gaagatggtg atccagattc aagaactttt 1980 gttgcttatg gtgatgacgg agacttagct ggttttgttg ttgtttcata ttcaggttgg 2040 aatagaagat taactgttga agatattgaa gttgctccag aacatagagg tcatggtgtt 2100 ggtagagctt taatgggttt agctactgaa tttgctagag aacgtggtgc tggtcattta 2160 tggttagaag ttactaatgt taatgctcca gctattcatg cttatagaag aatgggtttc 2220 acattatgtg gtttagatac tgctttatat gatggtactg cttcagatgg tgaacaagct 2280 ttatatatgt caatgccatg tccataataa gttgactgat ttataatttt attattatta 2340 tttcaattct tattttttat cattaggtat taatgtggat tatgttttaa cttgttaata 2400 tataaattca cataaactaa taattgtaga tttttcgtta tcattgaaaa gcgtatacta 2460 ttaattatga ccccaggtgt tggtcttgat gataaaggtg atgccttagg tcaacaatat 2520 agatccgttg ataccgttgt ttcaactggt agtgatatca ttattgttgg tagaggtttg 2580 ttcggtaaag gaagagatcc aaatgctgaa ggtgaacgtt acagagctgc tggttggaat 2640 gcctatttga aaagaactgg tcaaatatag tatgtagttt aaatctaaca tattagacta 2700 aataattaat gggtcataat ttgtaattag ttcaacgact aactaactga cattagaagg 2760 aagactctaa ttgtatacca tgtcatcaat actcctaatt atcaaataaa tcaaaatata 2820 taccttctat cattaattag aagatgtaat gtcgatgact aagcaagata aattaaaacc 2880 gaaatccatc tgtatgtaaa aatactttca agtaattacc acatagatag aagctcacca 2940 accaactatc atcaagccag tagatgccat tcaagagtga caa 2983 <210> 5 <211> 2289 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial cassette (PcPOX3 cassette 1) <400> 5 agtatcaaat caattactta tacacttatg acttttatga cttttaaacg ggtgatttct 60 cttggacttt cgaggaacat gctctaaatc aagcagagat cacaaatatt ttaataacta 120 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ccgaaatcca tctgtatgta aaaatacttt caagtaatta ccacatagat 1020 agaagctcac caaccaacta tcatcaagcc agtagatgcc attcaagagt gacaaatgtc 1080 attggaaaat gagttcacag gatcctcctt tgagaatgag tttgaaaata ctactgccca 1140 accagaattc tgcagaatta attcgccctt tttttttggt caacaaaaca tcataaatat 1200 ccgaatttgg aaagattccc gatatggaca aaatcaggaa tcaattggaa ttatgattca 1260 tttgagcatt atagtgtgaa taattcttta tgttctctgt tctttattat atcaagcttt 1320 aaagagacac taggcgtccc atagatcgga tggtctattc aagtgtctca aagaaaaaaa 1380 atagttgctt gattttggct gtagtagagc ttgtacggga cacgcttcta tgaataaatt 1440 tgtccgatga gttggataaa tattaactga actaatttct tctaattgat agagcatcat 1500 caatatattg cacataatat aattcaaaat ggttaccaca ttatcttatt ctcaaagagc 1560 agaagctcac ccttctccat tggcaaagcg tttattcaat gttatggaat caaaaaagtc 1620 aaacttgtgt gcttcaattg atgttagaac tacaaaagaa tttttacaat tagttgacac 1680 attaggtcca tatatctgtc ttgtcaaaac tcatatcgat attattgatg atttctcatt 1740 cgaaggtacc attaaaccat tgaaagaatt agcacaaaag cacaattttt taatctttga 1800 agatcgtaaa tttgctgata tagggaacac agtcaaagca caatatgcag gtggtgcttt 1860 caaaattgca acttggtctg atatcacaaa tgctcatggt gttactggtg ctggtatcgt 1920 tagtggattg aaagaagctg ctaaagaagc ttctgatgaa ccaagagggt tgttgatgtt 1980 ggctgaattg agttcaaaag gttcattagc caaaggtgaa tatactaaac aaactgttga 2040 tatcgctaaa actgataaag atttcgttat tggttttatt gctcaaaatg atatgggtgg 2100 tagagatgga ggctttgatt ggttaattat gaccccaggt gttggtcttg atgataaagg 2160 tgatgcctta ggtcaacaat atagatccgt tgataccgtt gtttcaactg gtagtgatat 2220 cattattgtt ggtagaggtt tgttcggtaa aggaagagat ccaaatgctg aaggtgaacg 2280 ttacagagc 2289 <210> 6 <211> 1671 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial cassette (PcPOX3 cassette 2) <400> 6 tttccattac atcagaaaac atttcacaat tttattcatt caatatagtt aaaggttcag 60 attttttgga aaatttaaat tataaaattg atgaaattaa tgaattatta agacctgata 120 ttattggatt aactgatgct ttcaatttat cagattttgt aattgattct caaattggga 180 aaagaaatgg tgatatttat gaatcttatt tcaaacatgt taatgataat aattctgatt 240 tgaaacctca ttattatgat tctatcatga aacctttttt ccaaagagat atgaaaccta 300 gtgataatga agaagttgat gaggaggagg aagaatagct acacacacca acctctcaac 360 aacttattat acattcttct tgacttttct atgactttta tagctttaaa taaattcaaa 420 tttgatactt tatactgatt acgtaataca aattcccccg gtaaacacac actttttttt 480 gtttactttt caaaacatca acaaaaaatt taaaacactt tgaacgccaa aaaagaagga 540 aaaggaaaac catcaaaaag atcgattgaa gaagaagtta gaaggatatt aaggaaatat 600 attaggtcca tatatctgtc ttgtcaaaac tcatatcgat attattgatg atttctcatt 660 cgaaggtacc attaaaccat tgaaagaatt agcacaaaag cacaattttt taatctttga 720 agatcgtaaa tttgctgata tagggaacac agtcaaagca caatatgcag gtggtgcttt 780 caaaattgca acttggtctg atatcacaaa tgctcatggt gttactggtg ctggtatcgt 840 tagtggattg aaagaagctg ctaaagaagc ttctgatgaa ccaagagggt tgttgatgtt 900 ggctgaattg agttcaaaag gttcattagc caaaggtgaa tatactaaac aaactgttga 960 tatcgctaaa actgataaag atttcgttat tggttttatt gctcaaaatg atatgggtgg 1020 tagagatgga ggctttgatt ggttaattat gaccccaggt gttggtcttg atgataaagg 1080 tgatgcctta ggtcaacaat atagatccgt tgataccgtt gtttcaactg gtagtgatat 1140 cattattgtt ggtagaggtt tgttcggtaa aggaagagat ccaaatgctg aaggtgaacg 1200 ttacagagct gctggttgga atgcctattt gaaaagaact ggtcaaatat agtatgtagt 1260 ttaaatctaa catattagac taaataatta atgggtcata atttgtaatt agttcaacga 1320 ctaactaact gacattagaa ggaagactct aattgtatac catgtcatca atactcctaa 1380 ttatcaaata aatcaaaata tataccttct atcattaatt agaagatgta atgtcgatga 1440 ctaagcaaga taaattaaaa ccgaaatcca tctgtatgta aaaatacttt caagtaatta 1500 ccacatagat agaagctcac caaccaacta tcatcaagcc agtagatgcc attcaagagt 1560 gacaaatgtc attggaaaat gagttcacag gatcctcctt tgagaatgag tttgaaaata 1620 ctactgccca accagaatta agggcgaatt ccagcacact ggcggccgtt a 1671 <210> 7 <211> 2799 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial cassette (PcLCB4 cassette 1) <400> 7 aaacttattc tcttgtttgg aacacattac aacacatttt agttaaagtc ttgttggcga 60 aactggtatc aagaaaacgt ttcacaactt tatcattttg atataaagac atacttcaac 120 ccatccatac acttatttga actctttttt gcccttttca tcatgccgag ttttgactct 180 caaagaatta aactgatgga tacagtatca gtaaaccccc aagagccatc attggtgata 240 caggtatcat cattaaagat caatcttcat tctattacaa tcaacatgat aacgcttcat 300 tttcatcttg cttaagttgc tcttcatcaa actcgaatgg tacggtgaaa tcttcaggtc 360 caaaacatat tccatttgtt gatatattga gtgttcgata tataaatgaa aataatgaat 420 ctttattaga agctggaagt tccactgtga ctagtgatga acctgatgtc gaagtggtat 480 ttgttagaca aaagggtaaa actcttgtac caactccaat aatattatca atagatactt 540 taggtcatga tgatgttgta caagaaattt ggagattaag ttatcaagga acaaaccaag 600 aaaatcaata ttagttcttg ttaatccaca tggtgggaaa ggtaaagcta taaattcatt 660 ctaactcaat caaaacctgt attaattggt gctcaagctt ctgttgaagt tagacatact 720 caatattatc aacatgctac agatattgca cgcactttga atattgataa atatgatata 780 attgcatgtg cttcaggtga tggtgtccca catgaagtct tgaatggatt ttatcaaaga 840 tctgatagag ctgaagcttt caataagatt acaataactc aattaccatg tggttcaggt 900 aatgcaatga gtgaatcatg tcatggtaca aataatccaa gttttgccgc tctatcatta 960 ttgaaatcaa gtacggtaaa tttagattta atggcttgta cacaaggtga taaaacttat 1020 gtttcattct taagtcaaac tgtcggtgtt atagcagatt ctgatattgg tactgaagca 1080 cttagatggt taggtccttc aagatttgaa ggtcaacaat atagatccgt tgataccgtt 1140 gtttcaactg gtagtgatat cattattgtt ggtagaggtt tgttcggtaa aggaagagat 1200 ccaaatgctg aaggtgaacg ttacagagct gctggttgga atgcctattt gaaaagaact 1260 ggtcaaatat agtatgtagt ttaaatctaa catattagac taaataatta atgggtcata 1320 atttgtaatt agttcaacga ctaactaact gacattagaa ggaagactct aattgtatac 1380 catgtcatca atactcctaa ttatcaaata aatcaaaata tataccttct atcattaatt 1440 agaagatgta atgtcgatga ctaagcaaga taaattaaaa ccgaaatcca tctgtatgta 1500 aaaatacttt caagtaatta ccacatagat agaagctcac caaccaacta tcatcaagcc 1560 agtagatgcc attcaagagt gacaaatgtc attggaaaat gagttcacag gatcctcctt 1620 tgagaatgag tttgaaaata ctactgccca accagaattc tgcagaatta attcgccctt 1680 tttttttggt caacaaaaca tcataaatat ccgaatttgg aaagattccc gatatggaca 1740 aaatcaggaa tcaattggaa ttatgattca tttgagcatt atagtgtgaa taattcttta 1800 tgttctctgt tctttattat atcaagcttt aaagagacac taggcgtccc atagatcgga 1860 tggtctattc aagtgtctca aagaaaaaaa atagttgctt gattttggct gtagtagagc 1920 ttgtacggga cacgcttcta tgaataaatt tgtccgatga gttggataaa tattaactga 1980 actaatttct tctaattgat agagcatcat caatatattg cacataatat aattcaaaat 2040 ggttaccaca ttatcttatt ctcaaagagc agaagctcac ccttctccat tggcaaagcg 2100 tttattcaat gttatggaat caaaaaagtc aaacttgtgt gcttcaattg atgttagaac 2160 tacaaaagaa tttttacaat tagttgacac attaggtcca tatatctgtc ttgtcaaaac 2220 tcatatcgat attattgatg atttctcatt cgaaggtacc attaaaccat tgaaagaatt 2280 agcacaaaag cacaattttt taatctttga agatcgtaaa tttgctgata tagggaacac 2340 agtcaaagca caatatgcag gtggtgcttt caaaattgca acttggtctg atatcacaaa 2400 tgctcatggt gttactggtg ctggtatcgt tagtggattg aaagaagctg ctaaagaagc 2460 ttctgatgaa ccaagagggt tgttgatgtt ggctgaattg agttcaaaag gttcattagc 2520 caaaggtgaa tatactaaac aaactgttga tatcgctaaa actgataaag atttcgttat 2580 tggttttatt gctcaaaatg atatgggtgg tagagatgga ggctttgatt ggttaattat 2640 gaccccaggt gttggtcttg atgataaagg tgatgcctta ggtcaacaat atagatccgt 2700 tgataccgtt gtttcaactg gtagtgatat cattattgtt ggtagaggtt tgttcggtaa 2760 aggaagagat ccaaatgctg aaggtgaacg ttacagagc 2799 <210> 8 <211> 2278 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial cassette (PcLCB4 cassette 2) <400> 8 cgtatggcac caactttatt atcattagat caaggttctc atgttttaca accagaagtt 60 caacattcta aaataatagc atatagatta actccaaagc agcaacatgg ttatttaagt 120 gttgatggtg aaagttatcc atttgaaact attcaagttg aaattctacc cggtgctgca 180 aagactttac taagaaatgg tacttatgtt gaaacaaatt tttattgaaa tgaatgataa 240 attttgatgc ttacatatat atatatatta tctctaacga atgaaacgaa tatgatactt 300 acaatctgat tacacaaata tttaattgta gtcaacttat aattgttgaa tttaaaattt 360 gatttaattt ttgaagcttt aatggagatg ccgatgttgg ataaaccggg ttttgaaaat 420 ctttttgact ccatactaaa aaattaagtg ctgatgagta acttaaggaa cgtcaagtca 480 tagaagtaat tgttttattt caaattttta taaattaagc gctttttcct tcagttgttt 540 tttttttgtt ggtttattta ttactcaaaa atttctaaat aataacataa attatagaaa 600 tcatgagtga agacgaacaa gaatttgcta aattagaaca aactttacca gactcaatca 660 agagttcatc atcacatatt ttcaatcaag aatttttaaa ttcaattaat catactccat 720 cattaactcc acaaagttca ataccgccag aatcaccaaa attgccaaag aaaactccat 780 taagtaattt taaagatgaa ttatataaaa atggtgatgt cgaaagaacc cattcaccaa 840 ttccaacacc aggtccttta cttcatcctg atgttcattt cccagctttg aataagcaaa 900 atgcagctac tggtgttatt tggtgtactg atcgtgcaaa tgaacgtggt ttcccaaatc 960 caaattgggt caatttaggt caaggtatgc cagaaacagg tgatattcca ggatgttttg 1020 ataggccaaa atcaatgaat atttcaattg aatctcgtga atatggtcca acatctggta 1080 ttaaaccttt aagacaagct attgcaaatt tatataatga acattataga caaggtaaag 1140 aatcaaaata tacttgggaa aatgtcaatg ttgcaccagg tggcagagct gctttaacaa 1200 gaattgcatt aggtccatat atctgtcttg tcaaaactca tatcgatatt attgatgatt 1260 tctcattcga aggtaccatt aaaccattga aagaattagc acaaaagcac aattttttaa 1320 tctttgaaga tcgtaaattt gctgatatag ggaacacagt caaagcacaa tatgcaggtg 1380 gtgctttcaa aattgcaact tggtctgata tcacaaatgc tcatggtgtt actggtgctg 1440 gtatcgttag tggattgaaa gaagctgcta aagaagcttc tgatgaacca agagggttgt 1500 tgatgttggc tgaattgagt tcaaaaggtt cattagccaa aggtgaatat actaaacaaa 1560 ctgttgatat cgctaaaact gataaagatt tcgttattgg ttttattgct caaaatgata 1620 tgggtggtag agatggaggc tttgattggt taattatgac cccaggtgtt ggtcttgatg 1680 ataaaggtga tgccttaggt caacaatata gatccgttga taccgttgtt tcaactggta 1740 gtgatatcat tattgttggt agaggtttgt tcggtaaagg aagagatcca aatgctgaag 1800 gtgaacgtta cagagctgct ggttggaatg cctatttgaa aagaactggt caaatatagt 1860 atgtagttta aatctaacat attagactaa ataattaatg ggtcataatt tgtaattagt 1920 tcaacgacta actaactgac attagaagga agactctaat tgtataccat gtcatcaata 1980 ctcctaatta tcaaataaat caaaatatat accttctatc attaattaga agatgtaatg 2040 tcgatgacta agcaagataa attaaaaccg aaatccatct gtatgtaaaa atactttcaa 2100 gtaattacca catagataga agctcaccaa ccaactatca tcaagccagt agatgccatt 2160 caagagtgac aaatgtcatt ggaaaatgag ttcacaggat cctcctttga gaatgagttt 2220 gaaaatacta ctgcccaacc agaattaagg gcgaattcca gcacactggc ggccgtta 2278 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nat1_MB primer <400> 9 ttcaacggtt 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accgcataac cagctaattt cacaattttt ttgaaagct 49 <210> 18 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PcPOX3 N4 <400> 18 cactggcggc cgttatttcc attacatcag aaaacatttc acaat 45 <210> 19 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PcPOX3 N5 <400> 19 ccgagctcgg atccaatatt tccttaatat ccttctaact tcttcttca 49 <210> 20 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PcPOX3 N6 <400> 20 atatttcctt aatatccttc taacttcttc ttca 34 <210> 21 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PcLCB4 N1 <400> 21 gatgcatgct cgagcaaact tattctcttg tttggaacac 40 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PcLCB4 N2 <400> 22 aaacttattc tcttgtttgg aacac 25 <210> 23 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PcLCB4 N3 <400> 23 tatattgttg accgcttcaa atcttgaagg acctaacc 38 <210> 24 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PcLCB4 N4 <400> 24 cactggcggc cgttacgtat ggcaccaact ttattatc 38 <210> 25 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PcLCB4 N5 <400> 25 ccgagctcgg atccagcaat tcttgttaaa gcagctc 37 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PcLCB4 N6 <400> 26 gcaattcttg ttaaagcagc tc 22 <210> 27 <211> 150 <212> DNA <213> Pichia ciferrii <220> <221> gene <222> (1)..(150) <223> T-TEF <400> 27 gttgactgat ttataatttt attattatta tttcaattct tattttttat cattaggtat 60 taatgtggat tatgttttaa cttgttaata tataaattca cataaactaa taattgtaga 120 tttttcgtta tcattgaaaa gcgtatacta 150 <210> 28 <211> 2049 <212> DNA <213> Pichia ciferrii <220> <221> gene <222> (1)..(2049) <223> POX3 gene <400> 28 atgagtgcac aggagtcaga taggttgatc caggaaaggg ccattgagag ggctggaacc 60 tcttttaacg tccaggattt gattcattat ttagatgatg gagaggaaaa tactaaaatt 120 tatgaatcaa tgtcacttca attagaaaga gatccaattt ttaaaattaa atcttcacat 180 ttagatttaa aagccaaaag agaattagct ttcaaaaaaa ttgtgaaatt agctggttat 240 ttccaaaact ctgatgaagt tgaactacgt aatagaatta gaattctttc acttattgat 300 ccggatgttg ctacaagaat tggtgttcat tatgggttat tcattggtac tctaagagct 360 cttggttctt caaaacaatt tgaattttgg atcaagaaag gtgctttttc attatcaaat 420 ttttatggat gttttgcaat gactgaatta gctcatggtt ctaatgttgc agctttacaa 480 acaactgcaa cttatgatcc acaagatgaa acttttatca tccatacacc ttcattaagt 540 gctacaaaat ggtggattgg tggcgctgct cattcagcta ctcatgctgt tgtttatgct 600 agattaatct cccagggaaa ggattatggt gttaagaatt tcattgttca attaagaaat 660 tctcaacatg aattattacc aggtgtttca gttggtgata ttggtaaaaa aatgggtaga 720 gatggtattg ataatggttg gattcaattc acaaatgtta aaatccctaa attcaatatg 780 ttggataaat atgctaaagt tgataatgat ggtaaagtta cattacctca attccaacaa 840 ttaggttata ctgcattagt tgttggtaga gtctcaatgg ttgttgattc ttataacact 900 ggtaagaaat ttttaacaat tgcattaaga tatgcatcaa caagaagaca atttggtaaa 960 gattctgaag ggaaagagaa aaaaatcatt gattatacac atcatagaag aagattattc 1020 ccattattag ctagtgttta tgcaatgaat tcagctgctt tagttatttc aaaatttcaa 1080 gatgaagcta ataaacttgt tgaaagtggt gaaaatttaa aacatgtgat tccaaattta 1140 aaagatcttt ttggtctttc agctggatta aaggcatttt gtacttggga aactgctcat 1200 attattgatg aaacaagaca aagttgtggt ggtcatggtt attcagatta taatgctttt 1260 gcaagaggtt ataatgattg ggttgttcaa tgtacttggg aaggtgataa taatgtttta 1320 tcaatgagtt gtggtagagc tttaattcaa aattatctaa gtgttgaaaa gaagaaaatt 1380 gtggggaaat atacaaaata tttagaaacc acagatattt caaatgaatt tgaattaaaa 1440 tctcaagatt tagaatatat tgaaaaaata attaaagctt gggaatttgt ttctaagagt 1500 ttaattgtta aatcaacaaa taaatttaaa aattttgtta aagaatttaa tggtgatgtt 1560 gaattagcat ttgaaaaaat ctcatcatat agatttatta ttgctaaagt tcatacaaaa 1620 ttaatccttt tgaaatcatt ttatgaaaga attttggaag caccaaagaa tttaaaacca 1680 gttctgtcat tattattaca attatattct ctttccatta catcagaaaa catttcacaa 1740 ttttattcat tcaatatagt taaaggttca gattttttgg aaaatttaaa ttataaaatt 1800 gatgaaatta atgaattatt aagacctgat attattggat taactgatgc tttcaattta 1860 tcagattttg taattgattc tcaaattggg aaaagaaatg gtgatattta tgaatcttat 1920 ttcaaacatg ttaatgataa taattctgat ttgaaacctc attattatga ttctatcatg 1980 aaaccttttt tccaaagaga tatgaaacct agtgataatg aagaagttga tgaggaggag 2040 gaagaatag 2049 <210> 29 <211> 1530 <212> DNA <213> Pichia ciferrii <220> <221> gene <222> (1)..(1530) <223> LCB4 gene <400> 29 atgccgagtt ttgactctca aagaattaaa ctgatggata cagtatcagt aaacccccca 60 agagccatca ttggtgatac aggtatcatc attaaagatc aatcttcatt ctattacaat 120 caacatgata acgcttcatt ttcatcttgc ttaagttgct cttcatcaaa ctcgaatggt 180 acggtgaaat cttcaggtcc aaaacatatt ccatttgttg atatattgag tgttcgatat 240 ataaatgaaa ataatgaatc tttattagaa gctggaagtt ccactgtgac tagtgatgaa 300 cctgatgtcg aagtggtatt tgttagacaa aagggtaaaa ctcttgtacc aactccaata 360 atattatcaa tagatacttt aggtcatgat gatgttgtac aagaaatttg gagattaagt 420 tatcaaggaa caaaaccaag aaaatcaata ttagttcttg ttaatccaca tggtgggaaa 480 ggtaaagcta taaattcatt cttaactcaa tcaaaacctg tattaattgg tgctcaagct 540 tctgttgaag ttagacatac tcaatattat caacatgcta cagatattgc acgcactttg 600 aatattgata aatatgatat aattgcatgt gcttcaggtg atggtgtccc acatgaagtc 660 ttgaatggat tttatcaaag atctgataga gctgaagctt tcaataagat tacaataact 720 caattaccat gtggttcagg taatgcaatg agtgaatcat gtcatggtac aaataatcca 780 agttttgccg ctctatcatt attgaaatca agtacggtaa atttagattt aatggcttgt 840 acacaaggtg ataaaactta tgtttcattc ttaagtcaaa ctgtcggtgt tatagcagat 900 tctgatattg gtactgaagc acttagatgg ttaggtcctt caagatttga attaggtgtt 960 gcttataaag ttttatcaag atcaagatat ccatgtgata tatctgttaa atatgctgca 1020 aaatcgaaaa atgaattaag acaacatttt gatgaacatt ccactattgt ttcaacaaaa 1080 gatatccaaa taactgaaga tacttataat ttaaaatatg atccaaatgg tccaatacct 1140 gatgattggg aagagattga taaagatctt tcagaaaatt taggtatttt ctatacaggt 1200 aaaatgccat atattgcaaa agatgttcaa tttttccctg cagctttacc aaatgatggt 1260 acttttgatt tagttataac agatgctcgt acaagtatag cacgtatggc accaacttta 1320 ttatcattag atcaaggttc tcatgtttta caaccagaag ttcaacattc taaaataata 1380 gcatatagat taactccaaa gcagcaacat ggttatttaa gtgttgatgg tgaaagttat 1440 ccatttgaaa ctattcaagt tgaaattcta cccggtgctg caaagacttt actaagaaat 1500 ggtacttatg ttgaaacaaa tttttattga 1530

Claims

야생형 피키아 시페라이(Pichia ciferrii) 균주에서 팔미토일-CoA(palmitoyl Co-A)의 베타 산화(β-oxidation)의 차단 기전에 의해 세포 내 팔미토일-CoA 축적에 의해 스핑고리피드 대사산물을 과발현할 수 있도록 PcPOX3 유전자(서열번호 28)의 발현이 억제된 피키아 시페라이 (Pichia ciferrii) 변이 균주.
삭제
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제1항에 있어서,
상기 유전자의 발현 억제 방법은 각 유전자의 일부 또는 전체 결실, 외래 DNA 삽입, 유전자 일부의 외래 유전자에 의한 치환, RNA 간섭, 유전자의 돌연변이 유도 또는 이들의 조합에 의한 것인 피키아 시페라이 변이 균주.
제4항에 있어서,
상기 유전자의 발현 억제 방법은 각 유전자의 일부 또는 전체 결실에 의한 것인, 피키아 시페라이 변이 균주.
제5항에 있어서,
상기 피키아 시페라이 변이 균주는 추가적으로 PcLCB4 유전자(서열번호 29)의 발현이 억제된, 피키아 시페라이 변이 균주.
제1항, 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 피키아 시페라이 세포의 야생형은 피키아 시페라이 DSCC 7-25(기탁번호 KFCC-10937) 균주인 피키아 시페라이변이 균주.
제1항, 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항의 피키아 시페라이 변이 균주를,
(a) 탄소원을 포함하는 배지에 배양하는 단계; 및
(b) 배양된 균주 내에 축적된 TAPS(테트라아세틸파이토스핑고신; tetraacetyl phytosphingosine)를 수득하는 단계; 를 포함하는,
TAPS 생산방법.
제1항, 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항의 피키아 시페라이 변이 균주를,
(a) FAME(Fatty acid methyl ester)을 포함하는 배지에 배양하는 단계; 및
(b) 배양된 균주 내에 축적된 TAPS를 수득하는 단계; 를 포함하는,
TAPS 생산방법.
제9항에 있어서,
상기 FAME은 C12:0인 메틸 라우레이트(Methyl laurate)인, TAPS 생산방법.
제7항의 피키아 시페라이 변이 균주를,
(a) 탄소원을 포함하는 배지에 배양하는 단계; 및
(b) 배양된 세포 내에 축적된 TAPS를 수득하는 단계; 를 포함하는,
TAPS 생산방법.
제7항의 피키아 시페라이 변이 균주를,
(a) FAME(Fatty acid methyl ester)을 포함하는 배지에 배양하는 단계; 및
(b) 배양된 세포 내에 축적된 TAPS를 수득하는 단계를 포함하는,
TAPS 생산방법.
제12항에 있어서,
상기 FAME은 C12:0인 메틸 라우레이트(Methyl laurate)인, TAPS 생산방법.