CN116157518A - 具有改善的鞘脂及鞘氨醇类碱生产力的雪氏毕赤酵母突变株及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于生产神经酰胺前体的新型酵母突变株及其制备方法，或制备该突变株的方法，更具体地说，涉及一种经基因工程改造成过表达鞘脂代谢物的雪氏毕赤酵母(Pichia ciferrii)突变株，该突变株通过重建雪氏毕赤酵母生产神经酰胺的代谢途径而制备。

Description

具有改善的鞘脂及鞘氨醇类碱生产力的雪氏毕赤酵母突变株 及其制备方法
技术领域
本申请要求于2020年6月23日向韩国知识产权局提交的第10-2020-0076795号韩国专利申请的权益，所述韩国专利申请的公开内容在此通过引用整体并入。
本公开涉及一种通过调节脂肪酸代谢而具有改善的鞘脂及鞘氨醇类碱生产力的雪氏毕赤酵母突变株，及其制备方法。
背景技术
鞘脂(Sphingolipid)是指源自于鞘氨醇类碱的一组脂质，是在人体中以鞘氨醇(sphingosine)、植物鞘氨醇(phytosphingosine)和二氢鞘氨醇(sphinganine)为基本骨架的神经酰胺或神经酰胺衍生物的通称。鞘脂天然地在动物、植物和微生物的细胞膜中大量存在，并参与多种细胞信号传导，如细胞分化、细胞生长和细胞死亡。
已知神经酰胺兼有亲水性和亲脂性基团来防止皮肤的水分蒸发，以及充当向人体皮肤角质层的渗透性和对抗微生物的稳态的防御物质。近来，神经酰胺已被用作化妆品中的有用物质。
四乙酰基植物鞘氨醇(TAPS)是一种有价值的神经酰胺前体，是通过对植物鞘氨醇的鞘氨醇类碱的N,O-乙酰化而产生的完全乙酰化状态的物质，并且容易通过脱乙酰化反应而转化回植物鞘氨醇。其转化的植物鞘氨醇的化学结构具有与人体皮肤的神经酰胺结构相同的D-赤式异构体结构，因此可以用作生产对人体皮肤友好的神经酰胺的原料。
TAPS可以化学合成(Current Organic Chemistry,2010.14(20)2483-2521)，但工艺复杂且生产成本高。因此，作为从经济角度代替它的方法，通过生物学方法进行生产正受到关注。发现在这些方法之中，雪氏毕赤酵母产生了大量的鞘氨醇类像碱和包括TAPS在内的鞘脂(Journal of bacteriology,1960,80(4)484-491)，后来通过基因组测序得知了TAPS生物合成的简易过程(Eukaryotic cell,2012,11(12)1582)。
在一项为研究目的而进行的实验(Applied Microbiology,1962,10(5)401)中，得知野生型雪氏毕赤酵母以5毫克(TAPS)/克(葡萄糖)的产率产生了233mg/L的TAPS。另外，新分离的雪氏毕赤酵母DSCC 7-25通过调节培养条件以及分离和纯化鞘脂的方法，显示出TAPS产量达1065mg/L(韩国专利第10-0221357号，韩国专利第10-0188857号)。然而，这只不过是实验室水平的产量改善，还没有达到工业用途的大规模生产水平。
因此，本公开旨在提供一种增加TAPS产量以致能够工业利用的雪氏毕赤酵母突变株及其制备方法。
【现有技术参考文献】
专利文件
韩国专利第10-0221357号
韩国专利第10-0188857号
韩国专利第10-2056651号
非专利文件
Current Organic Chemistry,2010.14(20)2483-2521
Journal of bacteriology,1960,80(4)484-491
Eukaryotic cell,2012,11(12)1582
Applied Microbiology,1962,10(5)401
Science 2001,292(5516)504
Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Lipids and Lipid Metabolism,1973.306(2)341-345
发明内容
技术问题
本发明的一个目的是提供一种增加鞘脂及鞘氨醇类碱生产力的基因工程化雪氏毕赤酵母突变株及其制备方法。
另外，本公开的另一个目的是提供一种使用所述基因工程化雪氏毕赤酵母突变株生产TAPS的方法，TAPS是一种神经酰胺前体。
技术解决方案
为了实现上述目的，本公开提供一种基因工程化雪氏毕赤酵母突变株。
根据本公开的一个实施方式，提供一种雪氏毕赤酵母突变株，其中与棕榈酰辅酶A的β-氧化相关的基因表达被抑制，从而增加细胞中棕榈酰辅酶A的积累。
根据本公开的一个实施方式，提供一种雪氏毕赤酵母突变株，其中与棕榈酰辅酶A的β-氧化相关的基因—PcPOX3基因缺失，从而抑制该基因表达。
根据本公开的一个实施方式，提供一种雪氏毕赤酵母突变株，其中在PcPOX3基因缺失的雪氏毕赤酵母细胞中还抑制了参与鞘氨醇类碱的磷酸化的基因—PcLCB4基因的表达。
根据本公开的一个实施方式，提供一种四乙酰基植物鞘氨醇(TAPS)的培养方法和生产方法，用于增加细胞中作为神经酰胺前体的TAPS的生产。
根据本公开的一个实施方式，提供一种在雪氏毕赤酵母突变株中生产神经酰胺前体TAPS的方法。
有利效果
本公开提供的雪氏毕赤酵母突变株提供一种与其野生型相比具有增加鞘脂及鞘氨醇类碱生产力的基因工程化雪氏毕赤酵母菌株。另外，本公开提供一种能够通过生物学方法生产鞘脂及鞘氨醇类碱的环境友好的生产方法。
附图说明
图1显示了营养缺陷型PcURA3基因缺失盒载体的构建图。
图2显示了与脂肪酸代谢相关的缺失盒载体的构建和连续缺失的原理。
图3是显示每个雪氏毕赤酵母突变株的TAPS生产的图。
图4是显示PcPOX3基因缺失的雪氏毕赤酵母突变株在含有C12 FAME的培养基中的TAPS生产的图。
具体实施方式
以下，将更详细地描述本公开以便于对本公开的理解。
雪氏毕赤氏酵母是唯一能够产生和分泌大量在其它酵母中见不到的完全乙酰化鞘脂的酵母(Journal of bacteriology,1960,80(4)484-491)，而进化到这种表型的确切起源还没有被阐明，但假设它是通过竞争来进化的，以确保大量生产氨基酸的酵母或Crabtree阳性菌株中的碳能源(Science 2001,292(5516)504)。
西弗毕赤酵母(Pichia siferri)是一种非常规的酵母菌株，以前被命名为雪氏汉逊酵母(Hansenula ciferrii)或雪氏毕赤酵母(Pichia ciferrii)，但现在被重新归类为威克汉姆酵母属(Wickerhaomyces)。然而，在本公开中，为了防止与现有名称混淆，按照现有名称将其指定为雪氏毕赤酵母(Pichia ciferrii)。雪氏毕赤酵母的主要特征在于它是唯一能够产生和分泌大量在其它酵母中见不到的完全乙酰化鞘氨醇类的酵母，并且可以产生和分泌TAPS，TAPS如上所述是美容用神经酰胺的有价值的前体。
鞘脂生物合成的第一步是通过丝氨酸棕榈酰转移酶(3-酮基二氢鞘氨酸合成酶)使丝氨酸和棕榈酰辅酶A缩合以形成具有18个碳原子的3-酮基二氢鞘氨酸，这一步决定了鞘脂生物合成的速率(Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Lipids and LipidMetabolism,1973.306(2)341-345)。
有一个代谢过程是其中与丝氨酸(L-丝氨酸)一起作为TAPS生物合成的原料的棕榈酰辅酶A通过β-氧化过程分解为乙酰辅酶A。阻断这一代谢过程可增强棕榈酸向棕榈酰辅酶A的转化，从而引起棕榈酰辅酶A积累并增加TAPS生产。
在所述β-氧化过程中与催化棕榈酰辅酶A转化为反式-Δ2-烯酰辅酶A的反应的酶相关的基因已知是POX基因，在雪氏毕赤酵母中被称为PcPOX3和PcPOX4的类似基因也是已知的。抑制相应基因的表达可增加棕榈酰辅酶A的积累速率。
另外，在脂肪酸代谢中，PcLCB4(二氢鞘氨醇激酶LCB4)是一种具有将二氢鞘氨醇和植物鞘氨醇磷酸化的激酶活性的酶，已知PcLCB4基因的缺失抑制对鞘氨醇的代谢，从而增加TAPS生产(韩国专利第10-2056651号)。
本发明涉及一种雪氏毕赤酵母突变株，其中PcPOX3基因(SEQ ID NO:28)或PcPOX3(SEQ ID NO:28)和PcLCB4(SEQ ID NO:29)基因的表达被抑制，以及一种抑制所述基因的表达的方法包括各基因的部分或完全缺失、插入外源DNA、用外源基因替换一部分基因、RNA干扰、诱导基因突变或其组合，具体地，通过各基因的部分或完全缺失，更具体地，通过各基因的完全缺失。
在本公开中，可通过构建针对相应基因的缺失盒来增加棕榈酰辅酶A的积累速率，并且在本公开中，制备了PcPOX3基因缺失的雪氏毕赤酵母突变株以及PcPOX3和PcLCB4基因共同缺失的雪氏毕赤酵母突变株，并确认了TAPS生产的增加。
应理解，酶活性的降低是与野生型雪氏毕赤酵母菌株相比。
本公开的上下文中的细胞的“野生型”优选是指亲本菌株，由该亲本菌株通过修饰影响由指定的核酸序列(例如，包含编码相应酶的指定核酸序列的基因，或存在于相应基因中并与指定的核酸序列功能上连接的启动子)编码的酶的活性的元件来开发本公开的细胞。
与野生型相比“酶活性降低”优选是指与野生型活性相比，活性降低至少50％、特别优选至少90％、进一步优选至少99.9％、更进一步优选至少99.99％、并最优选至少99.999％。
本公开的细胞的比活性与其野生型相比的降低可以通过但不限于使用在相同条件下生长的细胞的活性测量方法来测量，所述相同的条件是例如，相等的细胞数量/浓度，例如，如果可能的话，培养基、气体处理和搅拌。
本公开的酵母突变株是使用野生型雪氏毕赤酵母菌株作为亲本菌株来重新设计鞘脂脂代谢途径的突变株，并且优选可使用韩国专利第10-0188857号的实施例中公开的雪氏毕赤酵母DSCC 7-25(登录号Kfcc-10937)，或者可使用任何具有鞘脂代谢途径的菌株作为亲本菌株，而对该菌株没有任何限制。
在本公开的一个实施方式中，通过上述方法，所述突变株中的TAPS生产(TAPS单位产量)在PcPOX3基因缺失的突变株中为约1.7倍，在PcPOX3和PcLCB4基因共同缺失的突变株中为2倍或更高。
本公开的一个实施方式提供了一种通过向所述突变株的培养基添加脂肪酸甲酯以在细胞中人工积累脂肪酸来增加TAPS生产的方法。结果，在PcPOX3基因缺失突变株中，TAPS单位产量增加到约100％。
关于上述序列，可以借助已知的方法来测量“核苷酸同一性”。通常，特殊的计算机程序与考虑特殊要求的算法一起使用。
本公开的另一个目的是提供生产鞘氨醇类碱及鞘脂的本公开的突变株。
在本公开的上下文中，术语“鞘氨醇类碱”是指选自下列之一：植物鞘氨醇、鞘氨醇、二氢鞘氨二烯醇(sphingadienine)、6-羟基鞘氨醇和二氢鞘氨醇及其乙酰化形式，例如四乙酰基植物鞘氨醇、三乙酰基植物鞘氨醇、二乙酰基植物鞘氨醇、O-乙酰基植物鞘氨醇、三乙酰基二氢鞘氨醇、二乙酰基二氢鞘氨醇、O-乙酰基二氢鞘氨醇、三乙酰基鞘氨醇、二乙酰基鞘氨醇、O-乙酰基鞘氨醇、四乙酰基-6-羟基鞘氨醇、三乙酰基-6-羟基鞘氨醇、二乙酰基-6-羟基鞘氨基、O-乙酰基-6-羟基二氢鞘氨二烯醇、三乙酰基二氢鞘氨二烯醇、二乙酰基二氢鞘氨二烯醇和O-乙酰基二氢鞘氨二烯醇。
在本公开的上下文中，术语“鞘脂”被理解为是指包含通过酰胺键与脂肪酸共价键合的鞘氨醇类碱的化合物。所述脂肪酸可以是饱和的、或单不饱和或多不饱和的。脂肪酸侧链的长度可以不同。脂肪酸侧链也可含有官能团，如羟基基团。鞘脂包括例如植物神经酰胺、神经酰胺和二氢神经酰胺，以及更复杂的葡萄糖神经酰胺(脑苷脂)和肌醇磷酸神经酰胺、甘露糖肌醇磷酸神经酰胺和甘露糖二肌醇磷酸神经酰胺。在这种情况下，鞘脂还包括通过酰胺键与乙酰基键合的鞘氨醇类碱，例如N-乙酰基植物鞘氨醇、N-乙酰基二氢鞘氨醇、N-乙酰基鞘氨醇和N-乙酰基-6-羟基鞘氨醇。这些化合物也以术语短链神经酰胺称呼。
使用本公开的突变株对于生产鞘脂和鞘氨醇类碱是有利的，所述鞘脂和鞘氨醇类碱选自：植物鞘氨醇、鞘氨醇、二氢鞘氨二烯醇、6-羟基鞘氨醇、二氢鞘氨醇、四乙酰基植物鞘氨醇、三乙酰基植物鞘氨醇、二乙酰基植物鞘氨醇、O-乙酰基植物鞘氨醇、N-乙酰基植物鞘氨醇、三乙酰基二氢鞘氨醇(TriASa)、二乙酰基二氢鞘氨醇、O-乙酰基二氢鞘氨醇、N-乙酰基二氢鞘氨醇、三乙酰基鞘氨醇(TriASo)、二乙酰基鞘氨醇、O-乙酰基鞘氨醇、N-乙酰基鞘氨醇、四乙酰基-6-羟基鞘氨醇、三乙酰基-6-羟基鞘氨醇、二乙酰基-6-羟基鞘氨基、O-乙酰基-6-羟基鞘氨醇、N-乙酰基-6-羟基鞘氨醇、三乙酰基二氢鞘氨二烯醇、二乙酰基二氢鞘氨二烯醇和O-乙酰基二氢鞘氨二烯醇。优选使用本公开的突变株来生产四乙酰基植物鞘氨醇(TAPS)。
本公开的另一个目的是提供一种用于生产上述本公开的突变株的方法。所述方法包括以下步骤：
a)提供雪氏毕赤酵母菌株，以及
b)通过将编码选择性标志基因的外源DNA或DNA插入到基因中、缺失至少一部分基因、基因序列中的点突变、使基因暴露于RNA干扰的影响、以及用外源DNA或在启动子区域中用外源DNA部分替换基因，来修饰至少一个参与β-氧化的基因。
本公开的雪氏毕赤酵母突变株可用于制备鞘氨醇类碱和鞘脂，并且优选地适合于但不限于改善四乙酰基植物鞘氨醇(TAPS)的产量。
在下文中，将详细描述一种使用本公开的雪氏毕赤酵母突变株生产鞘氨醇类碱和鞘脂的方法，所述方法包括以下步骤：
a)用含有碳源的培养基接触根据一个实施方式的基因修饰突变株；
b)在允许所述菌株由所述碳源生产鞘氨醇类碱和鞘脂的条件下培养所述菌株；以及
c)任选地，分离所生成的鞘氨醇类碱和鞘脂。
在下文中，将详细描述另一种使用本公开的雪氏毕赤酵母突变株生产鞘氨醇类碱和鞘脂的方法，所述方法包括以下步骤：
a)用含有碳源和脂肪酸甲酯(FAME)的培养基接触根据一个实施方式的基因修饰突变株；
b)在允许所述突变株由所述碳源生产鞘氨醇类碱和鞘脂的条件下培养所述突变株；以及
c)任选地，分离所生成的鞘氨醇类碱和鞘脂。
可用于所述细胞培养步骤中的碳源包括：碳水化合物，例如葡萄糖、果糖、甘油、蔗糖、麦芽糖、糖蜜；或其它醇，例如乙醇；以及有机酸，例如乙酸。可使用的氮源包括例如氨、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵、有机氮化合物(例如，酵母提取物、麦芽提取物、蛋白胨、玉米浆)。也可使用无机化合物，例如磷酸盐、镁盐、钾盐、锌盐、铁盐等。
本公开的雪氏毕赤酵母菌株的合适培养条件是本领域技术人员知道的，例如从国际公布第WO2007/131720号或韩国专利第10-0221357号得知。
在下文中，将通过实施例详细描述本公开。
然而，以下实施例仅用于说明本公开，本公开的内容不限于以下实施例。本公开的使用范围遵循完整的详细说明和权利要求书。
最佳方式
<实施例>
<实施例1>营养缺陷型基因缺失盒的构建
除非另有说明，否则随后的所述盒的构建是通过大肠杆菌质粒克隆来构建的。基因缺失是通过经典的同源重组和利用双重盒来替代DNA而进行的(Yeast,1996.12(14):1439-1457)。
本发明人首先发现并缺失了营养缺陷型基因PcURA3以便有效利用标志基因，然后将其用作PcPOX3和PcLCB4基因缺失的标志物(实施例2)。
具体地，利用质粒pGEM-T-Easy(Promega)载体作为转移载体，构建了PcURA3缺失盒。用限制酶SpeI和SacI切割所述pGEM-T-Easy载体，并将所生成的2.97kb的DNA片段用作后续克隆的骨架。
将从野生型雪氏毕赤酵母细胞的基因组分离的在GAPDH基因的5'-端的600bp序列(SEQ ID NO:1)和DNA合成的抗生素诺尔丝菌素抗性基因PcNA1(SEQ ID NO:2)通过PCR扩增进行扩增。
用限制酶SpeI和NdeI切割所述PcGAPDH基因的5'-端(P-GAP1)(SEQ IDNO:1)，并将用SacI和NdeI切割的所述PcNA1基因(SEQ ID NO:2)的两个DNA片段通过T4 DNA连接酶(TAKARA)处理与之前切割的pGEM-T-easy载体连接。
将连接在所述载体上的GAPDH末端用限制酶SpeI和EcoRI进行切割，并将所生成的4.147kb DNA片段用作后续克隆的骨架。
将从野生型雪氏毕赤酵母细胞的基因组分离的在PcTEF1基因的3'-端的150bp序列T-PcTEF通过PCR扩增进行扩增(SEQ ID NO:27)。
用限制酶SpeI和EcoRI切割所述T-PcTEF，并通过T4 DNA连接酶(TAKARA)处理与之前切割的pGEM-T-easy载体连接。
将连接在所述载体上的GAPDH末端(图1，P-GAP1)、PcNAT1基因和PcTEF末端的1335bp DNA(图1，T-PcTEF)、从野生型雪氏毕赤酵母细胞的基因组分离的PcURA3基因(SEQID NO:3)的1171bp 5'-端和548bp 3'-端通过PCR进行扩增。此时，所述PcGAPDH末端和所述PcURA3基因的5'-端、以及所述PcTEF基因末端和所述PcURA3基因的3'-端重叠了22bp和25bp。
使用位于距PcNAT1基因的起始密码子324bp处的引物NAT1_MB(cacctgaatcaggatattcttctaatacctgg；SEQ ID NO:9)和位于PcURA3基因(SEQ IDNO:3)的5'-端的1171bp处的引物PcURA3_5D1F(tgagaaacgtggcaatggatcattg；SEQ ID NO:10)，通过PCR将图1中的盒1进行扩增。
使用位于PcNAT1基因的起始密码子处的引物NAT1_1F(atgggtaaggaaaagactcacgttt；SEQ ID NO:11)和位于PcURA3基因的548bp处的引物(ttgtcactcttgaatggcatctactg；SEQ ID NO:12)，通过PCR将图1中的盒2进行扩增。
所描述的所有引物都以5'至3'方向标示。
通过将以实施例1的方法制备的所述缺失盒(SEQ ID NO:4)转化到雪氏毕赤酵母菌株中，来缺失PcURA3基因(SEQ ID NO:3)，并通过PCR和DNA测序确认该插入的盒(图1)。
<实施例2>与脂肪酸和鞘脂代谢相关的基因缺失盒的构建
基本的盒载体的构建原理与所述营养缺陷型基因缺失盒的构建原理相同。
在本实施例中，要通过缺失盒构建的靶基因是PcPOX3、PcLCB4、或PcPOX3和PcLCB4二者。使用质粒pGEM-T-easy(Promega)为转移载体，来构建所述缺失盒。将pGEM-T-easy(Promega)载体用限制酶NotI和SpeI进行切割，并将所生成的3.73kb DNA片段用作后续克隆的骨架。
使用野生型雪氏毕赤酵母的基因组为模板，通过PCR来扩增PcURA3基因的从5'-端的359bp至3'-端的387bp的ORF，使得与上述pGEM-T-easy载体片段的SpeI切割段重叠30bp。
使用野生型雪氏毕赤酵母的基因组为模板，通过PCR来扩增PcURA3基因的3'-端的387bp，使得5'-端与之前所述的pGEM-T-easy载体片段的NotI切割段重叠30bp并且3'-端与URA3基因的5'-端的329bp至359bp重叠30bp。
通过infusion克隆(Takara)，使得之前通过PCR扩增的所述两个DNA片段和所切割的pGEM-T-easy载体片段在PcURA3基因的两端具有重复序列。
通过PCR分别扩增待缺失的靶基因的5'-端部位和3'-端部位(表1)，并在此时，使所述引物的5'-端延伸至与待融合的标志基因的重复序列(表1)重叠30-35bp。
[表1]
待缺失的基因的相应引物序列列表
Figure BDA0004113443680000101
Figure BDA0004113443680000111
通过infusion克隆(TAKARA)，将之前构建的载体与用限制酶Not1切割的DNA片段和待缺失的靶基因的用引物N1和N3通过PCR扩增的5'-端连接(图1)。
通过infusion克隆(TAKARA)，将之前构建的载体与用限制酶SpeI切割的DNA片段和待缺失的靶基因的用引物N4和N5通过PCR扩增的3'-端连接。
用位于距PcURA3基因的终止密码子43bp内的引物PcURA3R(GCTCTGTAACGTTCACCTTC；SEQ ID NO:13)和插入在标志基因的5'-端处的待缺失的靶末端部位的反向引物(N2)，通过PCR将图2中的盒1进行扩增。
用连接在距PcURA3基因的起始密码子150bp内的引物PcURA3F(ATTAGGTCCATATATCTGTCTTGTC；SEQ ID NO:14)和插入在标志基因的3'-端处的待缺失的靶末端部位的反向引物(N6)，通过PCR将图2中的盒2进行扩增。
所描述的所有引物都以5'至3'方向标示。
通过这种方法，构建了具有PcPOX3序列(SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6)或PcLCB4序列(SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8)的特定基因缺失盒。
将通过实施例2的方法制备的基因缺失盒(SEQ ID NO:5至8)转化到雪氏毕赤酵母菌株中来缺失靶基因，并通过PCR和DNA测序来确认该插入的盒。
对于连续的基因缺失，通过添加5'-氟乳清酸构建了其中通过在标志基因的5'-和3'-端插入的重复序列的重组来挑选标志基因的雪氏毕赤酵母细胞，并通过PCR进行确认。
<实施例3>转化株的选择
将构建好的盒在37℃温度下进行15分钟的热冲击，转化到亲本菌株DSCC7-25和由其衍生的菌株中，通过PCR扩增确认靶基因是否表达，并选择出目标转化株。
<实施例4>转化株的TAPS生产
将雪氏毕赤酵母DSCC 7-25(登录号KFCC-1093)菌株的PcURA3基因缺失突变株(BD02)、菌株BD 02的PcLCB4基因缺失突变株(KD 02)、菌株BD02的PcPOX3基因缺失突变株(KD04)、以及菌株BD 02的PcLCB4和PcPOX3基因共同缺失突变株(KD 08)(表2)各自接种到50ml的YGM最佳培养基(甘油100g/l，酵母提取物2g/l，KNO3 3g/l，(NH4)2SO4 0.5g/l，MgSO4·7H2O 0.3g/l，NaCl 0.5g/l，CSL(玉米浆)3g/l，和LS-300(消泡剂)1g/l)中，并在25℃下以220rpm培养5天，然后，向其中添加4倍体积的甲醇，在室温下反应1小时，然后分析离心上清液的TAPS。
通过HPLC使用UV 200nm分析TAPS。甲醇、水和TFA(三氟乙酸)的84.5:18.45:0.05混合物用作溶剂。
[表2]
各突变株的特性
Figure BDA0004113443680000131
如下表3和图3所示，当使用YGM最适培养基时，PcLCB4基因缺失突变株(KD02)和PcPOX3基因缺失突变株(KD04)的TAPS单位产量相对于BD 02分别增加到1.9倍和1.7倍。
另外，PcLCB4和PcPOX3基因共同缺失突变株(KD 08)相对于BD 02显示出2.3倍的TAPS单位产量。
[表3]
各菌株的TAPS生产的分析结果
BD 02 KD 02 KD 04 KD 08
TAPS(mg/L) 2460 3750 2800 3500
TAPS单位产量(mg/DCW) 10.9 20.85 18.53 24.72
相对TAPS单位产量(基于BD 02) 1 1.9 1.7 2.3
<实施例5>脂肪酸甲酯的添加以及转化株中TAPS的生产
将BD 02和KD 04转化株各自接种到50ml的YGM最佳培养基中并在25℃下以220rpm培养3天，然后，向其中添加50ml的含脂肪酸培养基(甘油30g/l，酵母提取物2g/l，KNO3 3g/l，(NH4)2SO4 0.5g/l，MgSO4·7H2O 0.3g/l，NaCl 0.5g/l，CSL 3g/l，LS-300 1g/l，月桂酸甲酯2.14g/l，和Tween 80 0.5％)并在25℃下以220rpm培养4天。
向其中添加4倍体积的甲醇，在室温下反应1小时，然后分析离心上清液的TAPS。
通过HPLC使用UV 200nm分析TAPS。甲醇、水和TFA的84.5:18.45:0.05(w/w)混合物用作溶剂。
从表4中的结果可以比较，当使用含有脂肪酸甲酯的最佳培养基时，PcPOX3缺失突变株KD 04的TAPS生产相对于BD 02增加了约70％，单位产量增加了100％以上。
[表4]
各菌株的TAPS生产的分析结果
BD 02 KD 04
TAPS(mg/L) 2240 3774
TAPS单位产量(mg/DCW) 14.1 29
相对TAPS单位产量(基于BD 02) 1 2.1
<110> 索路思高新材料有限公司
韩国生命工学研究院
<120> 具有改善的鞘脂及鞘氨醇类碱生产力的雪氏毕赤酵母突变株，及其制备方法
<130> P2018-0401
<160> 29
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1647
<212> DNA
<213> 雪氏毕赤酵母
<220>
<221> 基因
<222> (1)..(1647)
<223> GAPDH, 甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）基因
<400> 1
aagcaattaa acaacatacc aacaaaacaa ttatacccag tgatacctac atacaattaa 60
cccatagtaa actaatacct cacaacatta ataaagcatc tgatcttaat gtactactaa 120
tcctaaactc atgataatta ctgctgttgt aatgtttgtc atcactttga tcatcacgag 180
catcaccgga ccgttaatta ccaacaatct caattgtaga acacagtgtt aaacagggat 240
aaaacaacaa ttaattatga taaaaggttc aaacaagtac caatagatag ataattatta 300
cctctataat atatcattta attgaattaa tatcaatagt tgttattcaa ttatccctac 360
tttcctggtt aaagttacac catcagatgg ttcaccacca atgttgttca aaccatttcc 420
actcaactga cgtttcaaca acatcacctg aaaaaaaaat tcatcacaca ttgggagaaa 480
ttgggagaat tgtatataag gagttgaaat cgctaattat tttatacttc ttcattatac 540
ttctattcta catcagtatt ttataataca aaaacaaaca aataaaacaa ataattaaca 600
atggctatca cagttggtat taacggtttc ggtcgtattg gtcgtttagt cctaagaatt 660
gctctttcaa gaaaagatat tcaaattgtt gcaattaatg atccattcat tgcaccagaa 720
tatgcttcat atatgtttaa atatgattct actcatggtc gttatgcagg tgaagtttct 780
catgaaggtg ataacattgt tattgatggt aaaaaaatca gagtttatca agaacgtgat 840
ccagttaaca tcccatgggg taaagatggt gttgattatg ttattgattc aactggtgtt 900
tttaaagaat tagattctgc tcaaaaacat attgatgccg gtgctaaaaa agttgttatt 960
actgctccat catcaactgc tccaatgttt gttgttggtg ttaatgaaga taaatatact 1020
ccagatttaa acattatttc aaatgcttca tgtacaacaa attgtttagc tccattagct 1080
aaaattatta acaacaaatt tggtattgaa gaaggtttaa tgactactgt tcattcaatt 1140
actgctactc aaaaaactgt tgatggtcca tctcataaag attggagagg tggtcgtact 1200
gcttcaggta atattattcc atcatcaact ggtgctgcta aagctgttgg taaagttatt 1260
ccagaattag ctggtaaatt aactggtatg tctttaagag ttccaactgt tgatgtttca 1320
gttgttgatt taactgttaa attattaaaa gatgccactt atgatgaaat taaagctgct 1380
gttaaagaag ctgctgaagg tccattaaaa ggtgttgttg gttatactga agatcaagtt 1440
gtttcttcag atttcttgac tgataacaga tcatcaattt tcgatgctga agctggtatt 1500
tggttatcac caagatttgt taaattaatt gcttggtatg ataatgaata tggttactct 1560
accagagttg ttgatttatt agaatacgtt gcttcaaaaa ctaagaaacg aaagctaatg 1620
aaaagcaata gctttgaatt agtttga 1647
<210> 2
<211> 576
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> nat1
<400> 2
atgggtacta ctttagatga tactgcttat agatatagaa cttcagttcc aggtgatgct 60
gaagctattg aagctttaga tggttcattt actactgata ctgtttttag agttactgct 120
actggtgatg gttttacttt aagagaagtt ccagttgatc caccattaac taaagttttt 180
ccagatgatg aatcagatga cgagtctgat gacggtgaag atggtgatcc agattcaaga 240
acttttgttg cttatggtga tgacggagac ttagctggtt ttgttgttgt ttcatattca 300
ggttggaata gaagattaac tgttgaagat attgaagttg ctccagaaca tagaggtcat 360
ggtgttggta gagctttaat gggtttagct actgaatttg ctagagaacg tggtgctggt 420
catttatggt tagaagttac taatgttaat gctccagcta ttcatgctta tagaagaatg 480
ggtttcacat tatgtggttt agatactgct ttatatgatg gtactgcttc agatggtgaa 540
caagctttat atatgtcaat gccatgtcca taataa 576
<210> 3
<211> 1591
<212> DNA
<213> 雪氏毕赤酵母
<220>
<221> 基因
<222> (1)..(1591)
<223> URA3, 乳清苷-5'-磷酸脱羧酶（URA3）基因
<400> 3
gattgatttg atatagattt gagctttgta gttctgatct attaggtaca aaaggtcttt 60
caatggcaaa agtgtacttt tttgattttt caatgaagtc gaaaaggttc aaattttttt 120
tgtcaacaaa acatcataaa tacccggatt tggcaagtat cccgatatgg tcatactcag 180
gaaccaattg atatcattat ttatttaggc attaaagtgt gaataattct ttgtgatatc 240
agtactttat tatatcaagc ttgaaaggga tactaggtga tccattgatc gaatctgctc 300
ttcttttcaa ccttctcaaa gaaacaaaat tgttgcttaa ttttggctgt tgtagaactt 360
gtacgggaca cgcttctatg aacaaatttg tccgatgagt tggataaata ttactttcct 420
ttgattgata gcacatcatc aatagattgc aaatataatc caaaatggtc accacattat 480
cttacactca aaggcagaag ctcacccttc tccattggca aagcgtttat tcaatgtcat 540
ggaatcaaaa aagtcaaact tgtgtgcttc aattgatgtt agaactacaa aagaattttt 600
acaattagtt gacacattag gtccatatat ctgtcttgtc aaaactcata tcgatattat 660
tgatgatttc tcatttgaag gtactatcaa accattgaga gaattagcac aaaagcacaa 720
ttttttaatc tttgaagatc gtaaatttgc tgatataggg aacacagtca aagcacaata 780
tgcaggtggt gctttcaaaa ttgcaacttg gtctgatatc acaaatgctc atggtgttac 840
tggtgctggt atcgttagtg ggttgaaaga ggctgctaaa gaagcttcag atgaaccaag 900
aggtttgttg atgttggctg aattgagttc aaaaggttca ttagccaaag gtgaatatac 960
taaacaaact gttgatatcg ctaaaactga taaagatttt gttattggat ttattgctca 1020
aaatgatatg ggtggtagag atgaaggctt tgattggtta atcatgaccc aggtgttggt 1080
cttgatgata aaggtgatgc cttaggtcaa caatatagat ctgttgatac tgtcgtttca 1140
actggtagtg atatcattat tgtcggtaga ggtttattcg gtaaaggaag agatccaaat 1200
gctgaaggtg aacgttacag agctgctggt tggaatgctt atttgaaaag aactggtcaa 1260
atatagaatg tagtttaaat ataaaatatt agactaaata attaatgggt gctagtttgt 1320
aactagttca acgactataa ttaactgaca ttaaaagtag ctgactctaa gtgtattcaa 1380
tgtcattcat actgctaatc aaataaatca aaatatacat tgaagtttgt atcattaatt 1440
agaagatgtt ataatgtcga tgactaagca agtaaattaa aaccgaaatc catctgtatg 1500
taaaaatact tcaaagtctt aacagcatag atagaagctt atcaatcaac tatcatcaag 1560
ccagtagatg ccattcaaaa gtgacaaatg t 1591
<210> 4
<211> 2983
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工盒 (PcURA3)
<400> 4
tgagaaacgt ggcaatggat cattgtttat agaaaaattt aatgaatacg acaataatat 60
taaaacaatt taatactgaa ataaaagttg taatatagta taaaatataa aattcatgag 120
aaatatgtac aaaaggtttg taagatcacc acattttctt taaaatgatc tcaccataat 180
aataaaacat ctaaagataa atcaaaggga acccacaaat tgaaatgaaa agaattgtat 240
aaacatcatg actttaaaca attcacttct agtatatgag agataataaa ttcattaaca 300
gtattttttt tttctaaatt ttttaatttt ttgtatctaa attctttaag caaacaagaa 360
taaaagatta atacacctat taaatatctg aaccttaacg tctcatttgt tgagttaata 420
aagcattttg ttcttggaat ctttgaccga ctctttcact gtgtttcaag aatttttcag 480
aacattttaa aacacatgta ttttcttttg aagttaatga agcggaagtg aaatcattaa 540
cacaatcatt gaaacaacgt tcaaccaagt ttgagtaaag acgcatgaaa tctttcattt 600
gtttaccttc aacgattctt tggaaatctt gttgttctct ttggtttaat tgatccattt 660
tgattgattt gatatagatt tgagctttgt agttctgatc aattaggtac aaaaggtctt 720
tcaatggcaa aagtgtactt ttttgatttt tcaatgaagt cgaaaaggtt caaatttttt 780
tttggtcaac aaaacatcat aaatatccga atttggaaag attcccgata tggacaaaat 840
caggaatcaa ttggaattat gattcatttg agcattatag tgtgaataat tctttatgtt 900
ctctgttctt tattatatca agctttaaag agacactagg cgtcccatag atcggatggt 960
ctattcaagt gtctcaaaga aaaaaaatag ttgcttgatt ttggctgtag tagagcttgt 1020
acgggacacg cttctatgaa taaatttgtc cgatgagttg gataaatatt aactgaacta 1080
atttcttcta attgatagag catcatcaat atattgcaca taatataatt caaaaaaaca 1140
acaaacaaca acaactttac ccagtggtac ctacatacaa ttgacccata gtaaactaat 1200
aactcataac acaataaagc atctgatctt aatgtactac taaatactaa actgatgata 1260
attacttttg ttgtaatgtt tgtcatcact ttgatcatca cgagcatcac cggaccgtta 1320
attaccaaca atctcaattg tacaacatag tgttaaaaca ggataacttg atgattatat 1380
gtgatattaa gttcaaacaa gtaccaataa atagataatt aatagctcta taatatatca 1440
tttaattgaa ttaatatcaa tagttgttgt ttaattatcc ctagttttct ggttaaagtt 1500
acaccatcag atggttcacc accaatgttg ttcaaaccat ttccactcaa ctgacgtttc 1560
cagaacatca ccctgaaaaa aaaaaattca tcacacattg ggagaaattg gggaggattg 1620
tatataagga gtggaaattc gctaatattt ttataattct aactcacttg ttttaattca 1680
acatcagtat tttataatac aaaaacaaac aaacaaacaa ataattaatt aacaatgggt 1740
actactttag atgatactgc ttatagatat agaacttcag ttccaggtga tgctgaagct 1800
attgaagctt tagatggttc atttactact gatactgttt ttagagttac tgctactggt 1860
gatggtttta ctttaagaga agttccagtt gatccaccat taactaaagt ttttccagat 1920
gatgaatcag atgacgagtc tgatgacggt gaagatggtg atccagattc aagaactttt 1980
gttgcttatg gtgatgacgg agacttagct ggttttgttg ttgtttcata ttcaggttgg 2040
aatagaagat taactgttga agatattgaa gttgctccag aacatagagg tcatggtgtt 2100
ggtagagctt taatgggttt agctactgaa tttgctagag aacgtggtgc tggtcattta 2160
tggttagaag ttactaatgt taatgctcca gctattcatg cttatagaag aatgggtttc 2220
acattatgtg gtttagatac tgctttatat gatggtactg cttcagatgg tgaacaagct 2280
ttatatatgt caatgccatg tccataataa gttgactgat ttataatttt attattatta 2340
tttcaattct tattttttat cattaggtat taatgtggat tatgttttaa cttgttaata 2400
tataaattca cataaactaa taattgtaga tttttcgtta tcattgaaaa gcgtatacta 2460
ttaattatga ccccaggtgt tggtcttgat gataaaggtg atgccttagg tcaacaatat 2520
agatccgttg ataccgttgt ttcaactggt agtgatatca ttattgttgg tagaggtttg 2580
ttcggtaaag gaagagatcc aaatgctgaa ggtgaacgtt acagagctgc tggttggaat 2640
gcctatttga aaagaactgg tcaaatatag tatgtagttt aaatctaaca tattagacta 2700
aataattaat gggtcataat ttgtaattag ttcaacgact aactaactga cattagaagg 2760
aagactctaa ttgtatacca tgtcatcaat actcctaatt atcaaataaa tcaaaatata 2820
taccttctat cattaattag aagatgtaat gtcgatgact aagcaagata aattaaaacc 2880
gaaatccatc tgtatgtaaa aatactttca agtaattacc acatagatag aagctcacca 2940
accaactatc atcaagccag tagatgccat tcaagagtga caa 2983
<210> 5
<211> 2289
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工盒 (PcPOX3 盒 1)
<400> 5
agtatcaaat caattactta tacacttatg acttttatga cttttaaacg ggtgatttct 60
cttggacttt cgaggaacat gctctaaatc aagcagagat cacaaatatt ttaataacta 120
atgaataatt ttaaaattaa aggacttgta gcatattttg tggaatttcc ccatagttta 180
ttaatgtttt tggaacctcg gctttaatgg gccctgcaca aatccgacgg tccccaattg 240
cacaaatccg acggcagcca atttgtttat aaaagaaaag gaaaatcctt taatttcaaa 300
tccaaaacat caacaaaaaa gttggatctc aattggaaat aggctgggaa tcactgggaa 360
atgagtgcac aggagtcaga taggttgatc caggaaaggg ccattgagag ggctggaacc 420
tcttttaacg tccaggattt gattcattat ttagatgatg gagaggaaaa tactaaaatt 480
tatgaatcaa tgtcacttca attagaaaga gatccaattt ttaaaattaa atcttcacat 540
ttagatttaa aagccaaaag agaattagct ttcaaaaaaa ttgtgaaatt agctggttat 600
ggtcaacaat atagatccgt tgataccgtt gtttcaactg gtagtgatat cattattgtt 660
ggtagaggtt tgttcggtaa aggaagagat ccaaatgctg aaggtgaacg ttacagagct 720
gctggttgga atgcctattt gaaaagaact ggtcaaatat agtatgtagt ttaaatctaa 780
catattagac taaataatta atgggtcata atttgtaatt agttcaacga ctaactaact 840
gacattagaa ggaagactct aattgtatac catgtcatca atactcctaa ttatcaaata 900
aatcaaaata tataccttct atcattaatt agaagatgta atgtcgatga ctaagcaaga 960
taaattaaaa ccgaaatcca tctgtatgta aaaatacttt caagtaatta ccacatagat 1020
agaagctcac caaccaacta tcatcaagcc agtagatgcc attcaagagt gacaaatgtc 1080
attggaaaat gagttcacag gatcctcctt tgagaatgag tttgaaaata ctactgccca 1140
accagaattc tgcagaatta attcgccctt tttttttggt caacaaaaca tcataaatat 1200
ccgaatttgg aaagattccc gatatggaca aaatcaggaa tcaattggaa ttatgattca 1260
tttgagcatt atagtgtgaa taattcttta tgttctctgt tctttattat atcaagcttt 1320
aaagagacac taggcgtccc atagatcgga tggtctattc aagtgtctca aagaaaaaaa 1380
atagttgctt gattttggct gtagtagagc ttgtacggga cacgcttcta tgaataaatt 1440
tgtccgatga gttggataaa tattaactga actaatttct tctaattgat agagcatcat 1500
caatatattg cacataatat aattcaaaat ggttaccaca ttatcttatt ctcaaagagc 1560
agaagctcac ccttctccat tggcaaagcg tttattcaat gttatggaat caaaaaagtc 1620
aaacttgtgt gcttcaattg atgttagaac tacaaaagaa tttttacaat tagttgacac 1680
attaggtcca tatatctgtc ttgtcaaaac tcatatcgat attattgatg atttctcatt 1740
cgaaggtacc attaaaccat tgaaagaatt agcacaaaag cacaattttt taatctttga 1800
agatcgtaaa tttgctgata tagggaacac agtcaaagca caatatgcag gtggtgcttt 1860
caaaattgca acttggtctg atatcacaaa tgctcatggt gttactggtg ctggtatcgt 1920
tagtggattg aaagaagctg ctaaagaagc ttctgatgaa ccaagagggt tgttgatgtt 1980
ggctgaattg agttcaaaag gttcattagc caaaggtgaa tatactaaac aaactgttga 2040
tatcgctaaa actgataaag atttcgttat tggttttatt gctcaaaatg atatgggtgg 2100
tagagatgga ggctttgatt ggttaattat gaccccaggt gttggtcttg atgataaagg 2160
tgatgcctta ggtcaacaat atagatccgt tgataccgtt gtttcaactg gtagtgatat 2220
cattattgtt ggtagaggtt tgttcggtaa aggaagagat ccaaatgctg aaggtgaacg 2280
ttacagagc 2289
<210> 6
<211> 1671
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工盒 (PcPOX3 盒 2)
<400> 6
tttccattac atcagaaaac atttcacaat tttattcatt caatatagtt aaaggttcag 60
attttttgga aaatttaaat tataaaattg atgaaattaa tgaattatta agacctgata 120
ttattggatt aactgatgct ttcaatttat cagattttgt aattgattct caaattggga 180
aaagaaatgg tgatatttat gaatcttatt tcaaacatgt taatgataat aattctgatt 240
tgaaacctca ttattatgat tctatcatga aacctttttt ccaaagagat atgaaaccta 300
gtgataatga agaagttgat gaggaggagg aagaatagct acacacacca acctctcaac 360
aacttattat acattcttct tgacttttct atgactttta tagctttaaa taaattcaaa 420
tttgatactt tatactgatt acgtaataca aattcccccg gtaaacacac actttttttt 480
gtttactttt caaaacatca acaaaaaatt taaaacactt tgaacgccaa aaaagaagga 540
aaaggaaaac catcaaaaag atcgattgaa gaagaagtta gaaggatatt aaggaaatat 600
attaggtcca tatatctgtc ttgtcaaaac tcatatcgat attattgatg atttctcatt 660
cgaaggtacc attaaaccat tgaaagaatt agcacaaaag cacaattttt taatctttga 720
agatcgtaaa tttgctgata tagggaacac agtcaaagca caatatgcag gtggtgcttt 780
caaaattgca acttggtctg atatcacaaa tgctcatggt gttactggtg ctggtatcgt 840
tagtggattg aaagaagctg ctaaagaagc ttctgatgaa ccaagagggt tgttgatgtt 900
ggctgaattg agttcaaaag gttcattagc caaaggtgaa tatactaaac aaactgttga 960
tatcgctaaa actgataaag atttcgttat tggttttatt gctcaaaatg atatgggtgg 1020
tagagatgga ggctttgatt ggttaattat gaccccaggt gttggtcttg atgataaagg 1080
tgatgcctta ggtcaacaat atagatccgt tgataccgtt gtttcaactg gtagtgatat 1140
cattattgtt ggtagaggtt tgttcggtaa aggaagagat ccaaatgctg aaggtgaacg 1200
ttacagagct gctggttgga atgcctattt gaaaagaact ggtcaaatat agtatgtagt 1260
ttaaatctaa catattagac taaataatta atgggtcata atttgtaatt agttcaacga 1320
ctaactaact gacattagaa ggaagactct aattgtatac catgtcatca atactcctaa 1380
ttatcaaata aatcaaaata tataccttct atcattaatt agaagatgta atgtcgatga 1440
ctaagcaaga taaattaaaa ccgaaatcca tctgtatgta aaaatacttt caagtaatta 1500
ccacatagat agaagctcac caaccaacta tcatcaagcc agtagatgcc attcaagagt 1560
gacaaatgtc attggaaaat gagttcacag gatcctcctt tgagaatgag tttgaaaata 1620
ctactgccca accagaatta agggcgaatt ccagcacact ggcggccgtt a 1671
<210> 7
<211> 2799
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工盒 (PcLCB4 盒 1)
<400> 7
aaacttattc tcttgtttgg aacacattac aacacatttt agttaaagtc ttgttggcga 60
aactggtatc aagaaaacgt ttcacaactt tatcattttg atataaagac atacttcaac 120
ccatccatac acttatttga actctttttt gcccttttca tcatgccgag ttttgactct 180
caaagaatta aactgatgga tacagtatca gtaaaccccc aagagccatc attggtgata 240
caggtatcat cattaaagat caatcttcat tctattacaa tcaacatgat aacgcttcat 300
tttcatcttg cttaagttgc tcttcatcaa actcgaatgg tacggtgaaa tcttcaggtc 360
caaaacatat tccatttgtt gatatattga gtgttcgata tataaatgaa aataatgaat 420
ctttattaga agctggaagt tccactgtga ctagtgatga acctgatgtc gaagtggtat 480
ttgttagaca aaagggtaaa actcttgtac caactccaat aatattatca atagatactt 540
taggtcatga tgatgttgta caagaaattt ggagattaag ttatcaagga acaaaccaag 600
aaaatcaata ttagttcttg ttaatccaca tggtgggaaa ggtaaagcta taaattcatt 660
ctaactcaat caaaacctgt attaattggt gctcaagctt ctgttgaagt tagacatact 720
caatattatc aacatgctac agatattgca cgcactttga atattgataa atatgatata 780
attgcatgtg cttcaggtga tggtgtccca catgaagtct tgaatggatt ttatcaaaga 840
tctgatagag ctgaagcttt caataagatt acaataactc aattaccatg tggttcaggt 900
aatgcaatga gtgaatcatg tcatggtaca aataatccaa gttttgccgc tctatcatta 960
ttgaaatcaa gtacggtaaa tttagattta atggcttgta cacaaggtga taaaacttat 1020
gtttcattct taagtcaaac tgtcggtgtt atagcagatt ctgatattgg tactgaagca 1080
cttagatggt taggtccttc aagatttgaa ggtcaacaat atagatccgt tgataccgtt 1140
gtttcaactg gtagtgatat cattattgtt ggtagaggtt tgttcggtaa aggaagagat 1200
ccaaatgctg aaggtgaacg ttacagagct gctggttgga atgcctattt gaaaagaact 1260
ggtcaaatat agtatgtagt ttaaatctaa catattagac taaataatta atgggtcata 1320
atttgtaatt agttcaacga ctaactaact gacattagaa ggaagactct aattgtatac 1380
catgtcatca atactcctaa ttatcaaata aatcaaaata tataccttct atcattaatt 1440
agaagatgta atgtcgatga ctaagcaaga taaattaaaa ccgaaatcca tctgtatgta 1500
aaaatacttt caagtaatta ccacatagat agaagctcac caaccaacta tcatcaagcc 1560
agtagatgcc attcaagagt gacaaatgtc attggaaaat gagttcacag gatcctcctt 1620
tgagaatgag tttgaaaata ctactgccca accagaattc tgcagaatta attcgccctt 1680
tttttttggt caacaaaaca tcataaatat ccgaatttgg aaagattccc gatatggaca 1740
aaatcaggaa tcaattggaa ttatgattca tttgagcatt atagtgtgaa taattcttta 1800
tgttctctgt tctttattat atcaagcttt aaagagacac taggcgtccc atagatcgga 1860
tggtctattc aagtgtctca aagaaaaaaa atagttgctt gattttggct gtagtagagc 1920
ttgtacggga cacgcttcta tgaataaatt tgtccgatga gttggataaa tattaactga 1980
actaatttct tctaattgat agagcatcat caatatattg cacataatat aattcaaaat 2040
ggttaccaca ttatcttatt ctcaaagagc agaagctcac ccttctccat tggcaaagcg 2100
tttattcaat gttatggaat caaaaaagtc aaacttgtgt gcttcaattg atgttagaac 2160
tacaaaagaa tttttacaat tagttgacac attaggtcca tatatctgtc ttgtcaaaac 2220
tcatatcgat attattgatg atttctcatt cgaaggtacc attaaaccat tgaaagaatt 2280
agcacaaaag cacaattttt taatctttga agatcgtaaa tttgctgata tagggaacac 2340
agtcaaagca caatatgcag gtggtgcttt caaaattgca acttggtctg atatcacaaa 2400
tgctcatggt gttactggtg ctggtatcgt tagtggattg aaagaagctg ctaaagaagc 2460
ttctgatgaa ccaagagggt tgttgatgtt ggctgaattg agttcaaaag gttcattagc 2520
caaaggtgaa tatactaaac aaactgttga tatcgctaaa actgataaag atttcgttat 2580
tggttttatt gctcaaaatg atatgggtgg tagagatgga ggctttgatt ggttaattat 2640
gaccccaggt gttggtcttg atgataaagg tgatgcctta ggtcaacaat atagatccgt 2700
tgataccgtt gtttcaactg gtagtgatat cattattgtt ggtagaggtt tgttcggtaa 2760
aggaagagat ccaaatgctg aaggtgaacg ttacagagc 2799
<210> 8
<211> 2278
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工盒 (PcLCB4 盒 2)
<400> 8
cgtatggcac caactttatt atcattagat caaggttctc atgttttaca accagaagtt 60
caacattcta aaataatagc atatagatta actccaaagc agcaacatgg ttatttaagt 120
gttgatggtg aaagttatcc atttgaaact attcaagttg aaattctacc cggtgctgca 180
aagactttac taagaaatgg tacttatgtt gaaacaaatt tttattgaaa tgaatgataa 240
attttgatgc ttacatatat atatatatta tctctaacga atgaaacgaa tatgatactt 300
acaatctgat tacacaaata tttaattgta gtcaacttat aattgttgaa tttaaaattt 360
gatttaattt ttgaagcttt aatggagatg ccgatgttgg ataaaccggg ttttgaaaat 420
ctttttgact ccatactaaa aaattaagtg ctgatgagta acttaaggaa cgtcaagtca 480
tagaagtaat tgttttattt caaattttta taaattaagc gctttttcct tcagttgttt 540
tttttttgtt ggtttattta ttactcaaaa atttctaaat aataacataa attatagaaa 600
tcatgagtga agacgaacaa gaatttgcta aattagaaca aactttacca gactcaatca 660
agagttcatc atcacatatt ttcaatcaag aatttttaaa ttcaattaat catactccat 720
cattaactcc acaaagttca ataccgccag aatcaccaaa attgccaaag aaaactccat 780
taagtaattt taaagatgaa ttatataaaa atggtgatgt cgaaagaacc cattcaccaa 840
ttccaacacc aggtccttta cttcatcctg atgttcattt cccagctttg aataagcaaa 900
atgcagctac tggtgttatt tggtgtactg atcgtgcaaa tgaacgtggt ttcccaaatc 960
caaattgggt caatttaggt caaggtatgc cagaaacagg tgatattcca ggatgttttg 1020
ataggccaaa atcaatgaat atttcaattg aatctcgtga atatggtcca acatctggta 1080
ttaaaccttt aagacaagct attgcaaatt tatataatga acattataga caaggtaaag 1140
aatcaaaata tacttgggaa aatgtcaatg ttgcaccagg tggcagagct gctttaacaa 1200
gaattgcatt aggtccatat atctgtcttg tcaaaactca tatcgatatt attgatgatt 1260
tctcattcga aggtaccatt aaaccattga aagaattagc acaaaagcac aattttttaa 1320
tctttgaaga tcgtaaattt gctgatatag ggaacacagt caaagcacaa tatgcaggtg 1380
gtgctttcaa aattgcaact tggtctgata tcacaaatgc tcatggtgtt actggtgctg 1440
gtatcgttag tggattgaaa gaagctgcta aagaagcttc tgatgaacca agagggttgt 1500
tgatgttggc tgaattgagt tcaaaaggtt cattagccaa aggtgaatat actaaacaaa 1560
ctgttgatat cgctaaaact gataaagatt tcgttattgg ttttattgct caaaatgata 1620
tgggtggtag agatggaggc tttgattggt taattatgac cccaggtgtt ggtcttgatg 1680
ataaaggtga tgccttaggt caacaatata gatccgttga taccgttgtt tcaactggta 1740
gtgatatcat tattgttggt agaggtttgt tcggtaaagg aagagatcca aatgctgaag 1800
gtgaacgtta cagagctgct ggttggaatg cctatttgaa aagaactggt caaatatagt 1860
atgtagttta aatctaacat attagactaa ataattaatg ggtcataatt tgtaattagt 1920
tcaacgacta actaactgac attagaagga agactctaat tgtataccat gtcatcaata 1980
ctcctaatta tcaaataaat caaaatatat accttctatc attaattaga agatgtaatg 2040
tcgatgacta agcaagataa attaaaaccg aaatccatct gtatgtaaaa atactttcaa 2100
gtaattacca catagataga agctcaccaa ccaactatca tcaagccagt agatgccatt 2160
caagagtgac aaatgtcatt ggaaaatgag ttcacaggat cctcctttga gaatgagttt 2220
gaaaatacta ctgcccaacc agaattaagg gcgaattcca gcacactggc ggccgtta 2278
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> nat1_MB 引物
<400> 9
ttcaacggtt aatctacggt tcc 23
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PcURA3_5D1F 引物
<400> 10
tgagaaacgt ggcaatggat cattg 25
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> nat1_1F 引物
<400> 11
atgaccactt tggatgacac c 21
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PcURA3_3D2B 引物
<400> 12
ttgtcactct tgaatggcat ctactg 26
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCura3R 引物
<400> 13
gctctgtaac gttcaccttc 20
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCura3F 引物
<400> 14
attaggtcca tatatctgtc ttgtc 25
<210> 15
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PcPOX3 N1
<400> 15
gatgcatgct cgagcagtat caaatcaatt acttatacac ttatgacttt tatg 54
<210> 16
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PcPOX3 N2
<400> 16
agtatcaaat caattactta tacacttatg acttttatg 39
<210> 17
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PcPOX3 N3
<400> 17
tatattgttg accgcataac cagctaattt cacaattttt ttgaaagct 49
<210> 18
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PcPOX3 N4
<400> 18
cactggcggc cgttatttcc attacatcag aaaacatttc acaat 45
<210> 19
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PcPOX3 N5
<400> 19
ccgagctcgg atccaatatt tccttaatat ccttctaact tcttcttca 49
<210> 20
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PcPOX3 N6
<400> 20
atatttcctt aatatccttc taacttcttc ttca 34
<210> 21
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PcLCB4 N1
<400> 21
gatgcatgct cgagcaaact tattctcttg tttggaacac 40
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PcLCB4 N2
<400> 22
aaacttattc tcttgtttgg aacac 25
<210> 23
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PcLCB4 N3
<400> 23
tatattgttg accgcttcaa atcttgaagg acctaacc 38
<210> 24
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PcLCB4 N4
<400> 24
cactggcggc cgttacgtat ggcaccaact ttattatc 38
<210> 25
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PcLCB4 N5
<400> 25
ccgagctcgg atccagcaat tcttgttaaa gcagctc 37
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PcLCB4 N6
<400> 26
gcaattcttg ttaaagcagc tc 22
<210> 27
<211> 150
<212> DNA
<213> 雪氏毕赤酵母
<220>
<221> 基因
<222> (1)..(150)
<223> T-TEF
<400> 27
gttgactgat ttataatttt attattatta tttcaattct tattttttat cattaggtat 60
taatgtggat tatgttttaa cttgttaata tataaattca cataaactaa taattgtaga 120
tttttcgtta tcattgaaaa gcgtatacta 150
<210> 28
<211> 2049
<212> DNA
<213> 雪氏毕赤酵母
<220>
<221> 基因
<222> (1)..(2049)
<223> POX3 基因
<400> 28
atgagtgcac aggagtcaga taggttgatc caggaaaggg ccattgagag ggctggaacc 60
tcttttaacg tccaggattt gattcattat ttagatgatg gagaggaaaa tactaaaatt 120
tatgaatcaa tgtcacttca attagaaaga gatccaattt ttaaaattaa atcttcacat 180
ttagatttaa aagccaaaag agaattagct ttcaaaaaaa ttgtgaaatt agctggttat 240
ttccaaaact ctgatgaagt tgaactacgt aatagaatta gaattctttc acttattgat 300
ccggatgttg ctacaagaat tggtgttcat tatgggttat tcattggtac tctaagagct 360
cttggttctt caaaacaatt tgaattttgg atcaagaaag gtgctttttc attatcaaat 420
ttttatggat gttttgcaat gactgaatta gctcatggtt ctaatgttgc agctttacaa 480
acaactgcaa cttatgatcc acaagatgaa acttttatca tccatacacc ttcattaagt 540
gctacaaaat ggtggattgg tggcgctgct cattcagcta ctcatgctgt tgtttatgct 600
agattaatct cccagggaaa ggattatggt gttaagaatt tcattgttca attaagaaat 660
tctcaacatg aattattacc aggtgtttca gttggtgata ttggtaaaaa aatgggtaga 720
gatggtattg ataatggttg gattcaattc acaaatgtta aaatccctaa attcaatatg 780
ttggataaat atgctaaagt tgataatgat ggtaaagtta cattacctca attccaacaa 840
ttaggttata ctgcattagt tgttggtaga gtctcaatgg ttgttgattc ttataacact 900
ggtaagaaat ttttaacaat tgcattaaga tatgcatcaa caagaagaca atttggtaaa 960
gattctgaag ggaaagagaa aaaaatcatt gattatacac atcatagaag aagattattc 1020
ccattattag ctagtgttta tgcaatgaat tcagctgctt tagttatttc aaaatttcaa 1080
gatgaagcta ataaacttgt tgaaagtggt gaaaatttaa aacatgtgat tccaaattta 1140
aaagatcttt ttggtctttc agctggatta aaggcatttt gtacttggga aactgctcat 1200
attattgatg aaacaagaca aagttgtggt ggtcatggtt attcagatta taatgctttt 1260
gcaagaggtt ataatgattg ggttgttcaa tgtacttggg aaggtgataa taatgtttta 1320
tcaatgagtt gtggtagagc tttaattcaa aattatctaa gtgttgaaaa gaagaaaatt 1380
gtggggaaat atacaaaata tttagaaacc acagatattt caaatgaatt tgaattaaaa 1440
tctcaagatt tagaatatat tgaaaaaata attaaagctt gggaatttgt ttctaagagt 1500
ttaattgtta aatcaacaaa taaatttaaa aattttgtta aagaatttaa tggtgatgtt 1560
gaattagcat ttgaaaaaat ctcatcatat agatttatta ttgctaaagt tcatacaaaa 1620
ttaatccttt tgaaatcatt ttatgaaaga attttggaag caccaaagaa tttaaaacca 1680
gttctgtcat tattattaca attatattct ctttccatta catcagaaaa catttcacaa 1740
ttttattcat tcaatatagt taaaggttca gattttttgg aaaatttaaa ttataaaatt 1800
gatgaaatta atgaattatt aagacctgat attattggat taactgatgc tttcaattta 1860
tcagattttg taattgattc tcaaattggg aaaagaaatg gtgatattta tgaatcttat 1920
ttcaaacatg ttaatgataa taattctgat ttgaaacctc attattatga ttctatcatg 1980
aaaccttttt tccaaagaga tatgaaacct agtgataatg aagaagttga tgaggaggag 2040
gaagaatag 2049
<210> 29
<211> 1530
<212> DNA
<213> 雪氏毕赤酵母
<220>
<221> 基因
<222> (1)..(1530)
<223> LCB4 基因
<400> 29
atgccgagtt ttgactctca aagaattaaa ctgatggata cagtatcagt aaacccccca 60
agagccatca ttggtgatac aggtatcatc attaaagatc aatcttcatt ctattacaat 120
caacatgata acgcttcatt ttcatcttgc ttaagttgct cttcatcaaa ctcgaatggt 180
acggtgaaat cttcaggtcc aaaacatatt ccatttgttg atatattgag tgttcgatat 240
ataaatgaaa ataatgaatc tttattagaa gctggaagtt ccactgtgac tagtgatgaa 300
cctgatgtcg aagtggtatt tgttagacaa aagggtaaaa ctcttgtacc aactccaata 360
atattatcaa tagatacttt aggtcatgat gatgttgtac aagaaatttg gagattaagt 420
tatcaaggaa caaaaccaag aaaatcaata ttagttcttg ttaatccaca tggtgggaaa 480
ggtaaagcta taaattcatt cttaactcaa tcaaaacctg tattaattgg tgctcaagct 540
tctgttgaag ttagacatac tcaatattat caacatgcta cagatattgc acgcactttg 600
aatattgata aatatgatat aattgcatgt gcttcaggtg atggtgtccc acatgaagtc 660
ttgaatggat tttatcaaag atctgataga gctgaagctt tcaataagat tacaataact 720
caattaccat gtggttcagg taatgcaatg agtgaatcat gtcatggtac aaataatcca 780
agttttgccg ctctatcatt attgaaatca agtacggtaa atttagattt aatggcttgt 840
acacaaggtg ataaaactta tgtttcattc ttaagtcaaa ctgtcggtgt tatagcagat 900
tctgatattg gtactgaagc acttagatgg ttaggtcctt caagatttga attaggtgtt 960
gcttataaag ttttatcaag atcaagatat ccatgtgata tatctgttaa atatgctgca 1020
aaatcgaaaa atgaattaag acaacatttt gatgaacatt ccactattgt ttcaacaaaa 1080
gatatccaaa taactgaaga tacttataat ttaaaatatg atccaaatgg tccaatacct 1140
gatgattggg aagagattga taaagatctt tcagaaaatt taggtatttt ctatacaggt 1200
aaaatgccat atattgcaaa agatgttcaa tttttccctg cagctttacc aaatgatggt 1260
acttttgatt tagttataac agatgctcgt acaagtatag cacgtatggc accaacttta 1320
ttatcattag atcaaggttc tcatgtttta caaccagaag ttcaacattc taaaataata 1380
gcatatagat taactccaaa gcagcaacat ggttatttaa gtgttgatgg tgaaagttat 1440
ccatttgaaa ctattcaagt tgaaattcta cccggtgctg caaagacttt actaagaaat 1500
ggtacttatg ttgaaacaaa tttttattga 1530

Claims (13)

1.一种雪氏毕赤酵母(Pichia ciferrii)突变株，所述突变株通过阻断野生型雪氏毕赤酵母菌株中棕榈酰辅酶A的β氧化来诱导细胞内棕榈酰辅酶A积累，从而被基因工程改造成过表达鞘脂代谢物。
2.根据权利要求1所述的雪氏毕赤酵母突变株，其中所述工程基因是PcPOX3基因(SEQID NO:28)。
3.根据权利要求2所述的雪氏毕赤酵母突变株，其中所述基因的表达被抑制。
4.根据权利要求3所述的雪氏毕赤酵母突变株，其中一种抑制所述基因表达的方法包括各基因的部分或完全缺失、插入外源DNA、用外源基因替换一部分基因、RNA干扰、诱导基因突变或其组合。
5.根据权利要求4所述的雪氏毕赤酵母突变株，其中所述抑制所述基因表达的方法包括各基因的部分或完全缺失。
6.根据权利要求5所述的雪氏毕赤酵母突变株，其中还抑制PcLCB4基因(SEQ ID NO:29)的表达。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的雪氏毕赤酵母突变株，其中所述野生型雪氏毕赤酵母细胞是雪氏毕赤酵母DSCC 7-25(登录号KFCC-10937)菌株。
8.一种用于生产TAPS的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在含有碳源的培养基中培养根据权利要求1至6中的任一项所述的雪氏毕赤酵母突变株；以及
(b)获得在所述培养的菌株中积累的TAPS。
9.一种用于生产TAPS的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在含有脂肪酸甲酯(FAME)的培养基中培养根据权利要求1至6中任一项所述的雪氏毕赤酵母突变株；以及
(b)获得在所述培养的菌株中积累的TAPS。
10.根据权利要求9所述的生产TAPS的方法，其中所述FAME是C12:0月桂酸甲酯。
11.一种用于生产TAPS的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在含有碳源的培养基中培养根据权利要求7所述的雪氏毕赤酵母突变株；以及
(b)获得在所述培养的细胞中积累的TAPS。
12.一种用于生产TAPS的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在含有脂肪酸甲酯(FAME)的培养基中培养根据权利要求7所述的雪氏毕赤酵母突变株；以及
(b)获得在所述培养的细胞中积累的TAPS。
13.根据权利要求12所述的生产TAPS的方法，其中所述FAME是C12:0月桂酸甲酯。
CN202180057358.6A 2020-06-23 2021-06-10 具有改善的鞘脂及鞘氨醇类碱生产力的雪氏毕赤酵母突变株及其制备方法 Pending CN116157518A (zh)

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