KR102540378B1 - Taps 생산능이 향상된 위커하모마이세스 시페라이 균주, 및 그를 이용한 목적 물질을 생산하는 방법 - Google Patents
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Abstract
TAPS 생산능이 향상된 위커하모마이세스 시페라이 균주, 및 그를 이용한 목적 물질을 생산하는 방법에 관한 것으로, 일 양상에 따른 균주에 의하면, 스핑고지질 및 스핑고이드 염기의 생산성이 증가되어 생물학적 방법을 통해 효율적으로 스핑고지질 및 스핑고이드 염기를 생산할 수 있는 효과가 있다.
Description
TAPS 생산능이 향상된 신규한 미생물, 그의 파쇄물, 배양액, 배양액의 추출물 및 이들의 용도에 관한 것이다.
스핑고지질(sphingolipid)은 스핑고이드 염기로부터 유도되는 지질군을 나타내며 인체 내에서 스핑고신(sphingosine), 파이토스핑고신(phytosphingosine), 스핑가닌(sphinganine)을 기본 골격으로 하고 있는 세라마이드 또는 세라마이드 유도체의 통칭이다. 자연적으로는 동물, 식물 및 미생물의 세포막에 다량으로 존재하며 세포분화, 세포성장 및 세포사멸 등의 다양한 세포 신호전달에 관여한다.
세라마이드는 친수성 및 친유성기를 함께 가지고 있어 피부의 수분이 증발하는 것을 막을 뿐 아니라, 사람 피부 각질층의 침투성, 미생물에 대한 항상성을 지니는 방어물질 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 최근에 세라마이드(ceramides)는 화장품의 유용 물질로서 이용되고 있다.
세라마이드 전구체로 테트라아세틸파이토스핑고신(Tetraacetylphytosphingosine; TAPS)은 스핑고이드 염기 중 파이토스핑고신이 N, O-아세틸화에 의해 완전히 아세틸화된 상태로 생산되는 물질로서, 탈아세틸화 반응을 통해 다시 파이토스핑고신으로 전환이 용이하다. 전환된 파이토스핑고신의 화학적 구조가 인간 피부의 세라마이드 구조와 동일한 D-erythro 이성질체 구조를 지니고 있어, 인간 피부에 친화적인 세라마이드를 생산하는 원료로서 사용이 가능하다.
TAPS는 화학적으로 합성이 가능하나(Current Organic Chemistry, 2010. 14(20) 2483-2521) 그 과정이 복잡하고 생산 비용이 높다. 따라서, 경제적인 측면에서 이를 대체하기 위한 방법으로 생물학적인 방법을 통한 생산이 주목받고 있다.
일 양상은 위커하모마이세스 시페라이(Wickerhamomyces ciferrii) 균주를 제공하는 것이다.
상기 균주는 수탁번호 KFCC 11942P로 기탁된 것일 수 있다.
다른 양상은 상기 균주를 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 배양된 균주, 배지 또는 이들의 혼합물로부터 스핑고이드 염기 또는 스핑고지질을 분리하는 단계를 포함하는 스핑고이드 염기 또는 스핑고지질을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 스핑고이드 염기 또는 스핑고지질을 생산하기 위한 상기 균주의 용도를 제공하는 것이다.
일 양상은 위커하모마이세스 시페라이(Wickerhamomyces ciferrii) 균주를 제공한다.
일 구체예에 있어서, 상기 균주는 수탁번호 KFCC 11942P로 기탁된 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 위커하모마이세스 시페라이 균주는 서열번호 1의 16S rRNA를 포함하는 균주일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 16S rRNA 또는 이와 뉴클레오타이드 서열 상동성이 97%이상인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 16S rRNA을 가지는 균주일 수 있다. 구체적으로, 본 명세서의 서열번호 1로 이루어진 뉴클레오티드 서열과 적어도 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.8%, 99.9% 또는 100%의 상동성을 갖는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 균주는 자연적으로 일어난 상기 위커하모마이세스 시페라이 균주의 돌연변이를 포함하는 것일 수 있다.
명세서에 걸쳐서, 돌연변이체, 변이체 및 유전적으로 변이된 돌연변이체의 용어는 모세포 또는 야생형 세포에 비해 유전 및/또는 표현형 성질이 변경된 위커하모마이세스 시페라이 균주의 스트레인을 포함한다. 위커하모마이세스 시페라이 균주의 자연적으로 발생하는 변이체는 선택적으로 분리된 목표 성질의 자동적인 변경을 포함한다. 유전적 변이는 전달체(예를 들면, 벡터)에 의해 스트레인의 게놈(genome)으로 삽입에 의해, 위커하모마이세스 시페라이 스트레인의 게놈으로 외인성 및/또는 내인성 DNA 시퀀스의 이입을 포함한다.
자연의 혹은 야기된 돌연변이는 DNA 시퀀스에 의해 인코드된 아미노산 시퀀스의 변경의 결과로, 삭제, 삽입, 전위 또는 다른 DNA 변위와 같은 적어도 단일 염기 변경을 포함한다.
또한, 돌연변이, 변이체 및 유전적으로 변이된 돌연변이체의 용어는, 게놈의 계획적인(시험관 내의) 촉진에 의해 이루어지지는 않았지만 항생물질과 같은 환경의 압력에 노출될 때 세포의 생존을 지원하도록 선택의 이익을 제공하는 변이체 및/또는 돌연변이체의 자연적 선택을 통해 획득되어진 자연의 돌연변이 및/또는 유전자의 획득 및/또는 유전자의 손실을 통해 발생하는 모든 마이크로-유기체 및/또는 유전적 변경에 대해 사실상 일치하는 비율로 게놈에 축적하는 유전적 변경을 겪었던 위커하모마이세스 시페라이의 스트레인을 포함한다.
위커하모마이세스 시페라이의 돌연변이체 또는 변이체 스트레인이 모(parent) 세포와의 DNA 시퀀스 상동 분석에 의해 확인될 수 있는 것을 당업자는 이해할 수 있다. 모세포에 근접한 시퀀스 동일성을 가지는 위커하모마이세스 시페라이 균주는 돌연변이체 또는 변이체 스트레인이 되는 것이 고려될 수 있다. 모(parent) DNA시퀀스로 97%이상 혹은 98%이상 혹은 99%이상과 같이, 96%이상의 시퀀스 동일성(상동)으로 위커하모마이세스 시페라이 균주는 돌연변이체 또는 변이체 스트레인이 되는 것이 고려된다. 시퀀스 상동은, 온라인 상동 알고리즘 "BLAST" 프로그램을 사용하여 결정되어질 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 상기 균주는 모세포 또는 야생형에 비해 스핑고이드 염기 및 스핑고지질, 예를 들면, 테트라아세틸파이토스핑고신(TAPS)의 생산능이 향상된 것일 수 있다.
용어 "모세포 (parent cells)"는 야생형 세포(wild-type cells), 본래 세포 (original cells)와 상호환적으로 사용되고, 일 구체예에 따른 균주의 선별을 위한 출발 물질을 의미할 수 있다.
일 구체예에 따른 균주는 스핑고이드 염기 및/또는 스핑고지질의 생합성 경로에 관여하는 효소의 활성이 모세포에 비하여 증가된 것일 수 있다. 스핑고이드 염기 및/또는 스핑고지질의 생합성 경로에 관여하는 공지된 효소의 예시는 아세틸기 전이효소, 세라마이드 합성효소, 또는 스핑고지질 불포화 효소를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "활성 증가 (increase in activity)", 또는 "증가된 활성 (increased activity)"은 세포, 단백질, 또는 효소의 활성의 검출가능한 증가를 나타낼 수 있다. "활성 증가 (increase in activity)", 또는 "증가된 활성 (increased activity)"은 동일한 타입의 비교 세포(예를 들면, 모세포), 단백질, 또는 효소의 수준 보다 더 높은 변형된 세포, 단백질, 또는 효소의 활성을 나타낼 수 있다. "세포의 활성 (cell activity)"이란 세포의 특정 단백질 또는 효소의 활성을 나타낼 수 있다. 상기 증가된 활성을 갖는 세포는, 모세포에 비하여 하나 이상의 효소 또는 폴리펩티드의 활성이 증가된 변형을 갖는 것일 수 있다.
다른 양상은 상기 균주의 파쇄액, 발효액, 배양액 또는 이들의 혼합물을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "배양액" 또는 "발효물"은 "배양 또는 발효 상층액", "배양물 또는 발효물 상등액", "조건 배양액 또는 발효액" 또는 "조정 배지"와 호환적으로 사용될 수 있고, 상기 균주가 시험관 내에서 성장 및 생존할 수 있도록 영양분을 공급할 수 있는 배지에 상기 균주를 일정기간 배양하여 얻는 상기 균주, 이의 대사물, 여분의 영양분 등을 포함하는 전체 배지를 의미할 수 있다.
상기 배양액 또는 발효물은 균주를 배양 또는 발효하여 수득된 배양액 또는 발효액 자체, 그의 농축물, 또는 동결건조물 또는 배양액 또는 발효액으로부터 균주를 제거하여 수득된 배양 상등액 또는 발효 상등액, 그의 농축물 또는 동결건조물을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "파쇄물(lysate)"는 "용해물"과 호환적으로 사용될 수 있고, 이는 깨진 세포의 수성 배지의 용액 또는 현탁액을 의미할 수 있다. 세포 용해물은, 예를 들어 DNA, RNA, 단백질, 펩타이드, 탄수화물, 지질 등과 같은 거대 분자 및/또는 아미노산, 당, 지방산 등과 같은 미소분자, 또는 그의 분획을 포함한다.
다른 양상은 위커하모마이세스 시페라이(Wickerhamomyces ciferrii) 균주를 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 배양된 균주, 배지 또는 이들의 혼합물로부터 스핑고이드 염기 또는 스핑고지질을 분리하는 단계를 포함하는 스핑고이드 염기 또는 스핑고지질을 생산하는 방법을 제공한다.
또 다른 양상은 스핑고이드 염기 또는 스핑고지질을 생산하기 위한 위커하모마이세스 시페라이(Wickerhamomyces ciferrii) 균주의 용도를 제공하는 것이다.
본 명세서와 관련하여 용어 "스핑고이드 염기"는 피토스핑고신, 스핑고신, 스핑가디에닌, 6-히드록시스핑고신 및 스핑가닌(디히드로스핑고신), 또한 아세틸화 형태로, 예컨대 예를 들어 테트라아세틸피토스핑고신, 트리아세틸피토스핑고신, 디아세틸피토스핑고신, O-아세틸피토스핑고신, 트리아세틸스핑가닌, 디아세틸스핑가닌, O-아세틸스핑가닌, 트리아세틸스핑고신, 디아세틸스핑고신, O-아세틸스핑고신, 테트라아세틸-6-히드록시스핑고신, 트리아세틸-6-히드록시스핑고신, 디아세틸-6-히드록시스핑고신, O-아세틸-6-히드록시스핑고신, 트리아세틸스핑가디에닌, 디아세틸스핑가디에닌, 또는 O-아세틸스핑가디에닌를 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서와 관련하여 용어 "스핑고지질"은 아미드 결합을 통해 지방산에 공유결합한 스핑고이드 염기를 포함하는 화합물을 의미하는 것일 수 있다. 지방산은 포화되거나 또는 단일불포화- 또는 다불포화될 수 있다. 지방산 측쇄는 길이가 다양할 수 있다. 지방산 측쇄는 히드록시기와 같은 관능기를 또한 보유할 수 있다. 스핑고지질로는 예를 들어, 피토세라미드, 세라미드 및 디히드로세라미드, 및 좀더 복잡한 글루코실세라미드(세레브로시드) 및 이노시톨 포스포릴세라미드, 만노실이노시톨 포스포릴세라미드 및 만노실디이노시톨 포스포릴세라미드가 포함될 수 있다. 여기서 스핑고지질은 아미드 결합을 통해 아세틸 라디칼에 결합한 스핑고이드 염기, 예를 들어 N-아세틸피토스핑고신, N-아세틸스핑가닌, N-아세틸스핑고신, 또는 N-아세틸-6-히드록시스핑고신을 포함할 수 있다.
피토스핑고신, 스핑고신, 스핑가디에닌, 6-히드록시스핑고신, 스핑가닌(디히드로스핑고신), 테트라아세틸피토스핑고신(TAPS), 트리아세틸피토스핑고신, 디아세틸피토스핑고신, O-아세틸피토스핑고신, N-아세틸피토스핑고신, 트리아세틸스핑가닌(TriASa), 디아세틸스핑가닌, O-아세틸스핑가닌, N-아세틸스핑가닌, 트리아세틸스핑고신(TriASo), 디아세틸스핑고신, O-아세틸스핑고신, N-아세틸스핑고신, 테트라아세틸-6-히드록시스핑고신, 트리아세틸-6-히드록시스핑고신, 디아세틸-6-히드록시스핑고신, O-아세틸-6-히드록시스핑고신, N-아세틸-6-히드록시스핑고신, 트리아세틸스핑가디에닌, 디아세틸스핑가디에닌, 및 O-아세틸스핑가디에닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 스핑고이드 염기 및 스핑고지질을 제조하기 위한 본 명세서에 따른 세포의 용도가 특히 유리하다. 또한, 테트라아세틸피토스핑고신(TAPS)을 제조하기 위한 본 명세서에 따른 세포의 용도가 특히 바람직하다.
상기 세포 배양 단계에서 사용될 수 있는 탄소원은 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 프룩토스, 글리세롤, 수크로스, 말토스, 당밀, 또는 그 밖의 알콜, 예를 들어 에탄올, 및 유기산, 예를 들어 아세테이트이다. 사용될 수 있는 질소원은 예를 들어 암모니아, 황산암모늄, 질산암모늄, 염화암모늄, 유기 질소 화합물(예컨대, 효모 추출물, 맥아 추출물, 펩톤, 옥수수침지액)이다. 무기 화합물, 예를 들어 인산염, 마그네슘염, 칼륨염, 아연염, 철염 등이 또한 사용될 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 배양하는 단계는 스핑고이드 염기 및 스핑고지질을 생성할 수 있게 해주는 조건하(또한, 상기 테트라아세틸파이토스핑고신의 생성에 유리한 조건하)에서 배양하는 것을 포함하는 수 있다.
상기 스핑고이드 염기 및 스핑고지질이 테트라아세틸파이토스핑고신인 경우 얻어진 테트라아세틸파이토스핑고신 탈아세틸화하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 균주에 대한 적합한 배양 또는 발효 조건은 예를 들어 국제공개특허 제2007-131720호 또는 한국등록특허 제10-0221357호로부터 당업자에게 공지되어 있고, 이들 문헌은 참조로서 본 명세서에 포함된다.
구체적으로, 발효 또는 배양은 0.5 내지 30일의 기간에 걸쳐 수행될 수 있다. 발효 또는 배양은 적합하게는 0 내지 45℃범위의 온도와, 예를 들어 2 내지 10의 pH에서의 회분식 공정, 연속 또는 첨가 회분식 (fed-batch) 공정일 수 있다. 바람직한 발효 또는 배양 조건은 20 내지 37℃의 온도 및/또는 3 내지 9의 pH일 수 있다. 적절한 조건은 일반적으로 발현 숙주의 선택 및 생산될 목적 물질에 기초하여 선택될 수 있다.
발효 또는 배양 후, 필요한 경우, 세포를 원심분리 또는 여과에 의해 발효 배지 또는 배양 배지로부터 제거할 수 있다. 이어서 본 명세서의 목적 물질, 예를 들면, 스핑고이드 염기 또는 스핑고지질을 회수하고, 통상적인 수단으로 정제 및 분리할 수 있다.
일 양상에 따른 신규 균주 및 이의 유래 파쇄액, 배양액, 배양액의 추출물 또는 이들의 혼합물에 의하면, 스핑고지질 및 스핑고이드 염기의 생산성이 증가되어 생물학적 방법을 통해 효율적으로 스핑고지질 및 스핑고이드 염기를 생산할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 일 구체예에 따른 균주의 TAPS 생성량을 비교 분석한 그래프이다.
도 2는 일 구체예에 따른 균주의 성장을 비교 분석한 그래프이다.
도 3은 일 구체예에 따른 균주의 글리세롤 소모양을 비교 분석한 그래프이다.
도 2는 일 구체예에 따른 균주의 성장을 비교 분석한 그래프이다.
도 3은 일 구체예에 따른 균주의 글리세롤 소모양을 비교 분석한 그래프이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다. 실시예들은 다양한 변환을 가할 수 있는 바, 실시예들은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 다양한 형태로 구현될 수 있다.
실시예 1. 위커하모마이세스 시페라이(
Wickerhamomyces ciferrii
) 균주의 분리 및 동정
1.1. 균주의 분리
본 발명의 위커하모마이세스 시페라이 (Wickerhamomyces ciferrii) SB8-25균주는 모균주인 위커하모마이세스 시페라이 KCCM 50215 (이하, KCCM 50215이라고도 한다.)로부터 새로운 단일 포자 유도체를 분리하였다.
구체적으로, 2배체인 KCCM 50215을 YMgl 배지(효모추출물 0.3%, 맥아추출물 0.3%, 페톤0.5%, 글리세롤 3%)에서 3일간 25℃로 진탕배양하였다. 이후에 포자형성 평판배지(맥아추출물5%, 한천 3%)에 배양액 0.1~0.5ml를 도말하여 실온에서 7
`10일간 배양하여 모자모양의(hat-shape spore) 포자가 형성됨을 관찰하였다. 형성된 포자를 선택적으로 분리하기 위하여 열충격(heat shock)을 가했다. 열충격은 포자 현탁액(6 x 107 내지 1 x 108 cells/ml) 1~2ml을 시험관에 넣고 55℃에서 1~5분간 처리한 후 시간 별로 0.1ml씩 EGTA가 2~30mM 포함된 YMgl 평판배지에 도말하여 25℃에서 배양했다. 형성된 균체집락 가운데에서 모균주와 집락형태, 색깔 및 크기 등이 다른 것들을 1차 선별하였다. 1차 선별된 단일포자 유도체의 세포의 형태, 침강성 및 배양 시험관이 표면에 형성되는 소수성 피막의 정도를 고려하여 2차 평가를 실시하여 선별하였다. 2차 선별된 단일포자 유도체를 YMgl 평판배지에서 4일간 25℃로 배양한 후 4℃ 냉장고에 2~3일 동안 방치하여 세포 밖으로 분비되는 스핑고지질의 결정화를 유도하였다. 현미경 관찰을 통해 스핑고지질의 결정이 많은 균주를 최종 선별하였다. 요약하여, 형성된 결정은 80℃의 오븐에서 약 30분 정도 가온을 하면 녹는 것이 관찰되었고, TLC(Thin layer chromatography)분석으로 TAPS 생성량이 가장 높은 균주를 최종 선별하였다. 선별된 균주에 대한 정량적 TAPS 분석은 HPLC(high performance liquid chromatography)로 실시하였다.
상기 단일 포자 유도체 가운데 TAPS 생성량이 가장 높은 위커하모마이세스 시페라이 균주를 선별하였다.
1.2. 선별한 균주의 분자생물학적 동정
상기 실시예 1.1.에서 최종 선별된 위커하모마이세스 시페라이 균주의 동정은 16S rRNA 유전자 서열 유사성을 기반으로 진행하였다. 상기 실시예에서 분리한 플레이트 상의 균주를 마크로젠(MACROGEN)에 의뢰하여 16S rRNA 서열을 분석하였다. 구체적으로, 아래 표 1에 표기된 프라이머 서열을 이용하여 PCR을 수행하였다.
| 유전자 | 프라이머 | 서열 (5'-> 3') |
| 16S rRNA | ITS5 | TCCGTAGGTGAACCTGCGG(서열번호2) |
| 1TS4 | TCCTCCGCTTATTGATATGC(서열번호3) |
PCR 증폭하기 위해 ITS5와 1TS4 프라이머를 이용하여 분석한 균주의 16S rRNA 유전자 서열은 서열번호 1으로 나타내었다.
이에, 상기 균주를 "위커하모마이세스 시페라이 (Wickerhamomyces ciferrii) SB8-25" (이하 'SB8-25'라고도 함)로 명명하고 이를 한국미생물보존센터(Korean culture center of microorganisms, KCCM)에 2022년 9월 22일자에 기탁하였고, 기탁번호 KFCC11942P를 부여받았다.
1.3. 선별한 균주의 탄소원 이용가능성 분석
상기 실시예 1.1.에서 최종 선별된 위커하모마이세스 시페라이 균주의 균학적 특성을 확인하기 위해, 탄소원별 이용가능성을 분석하였다.
구체적으로, 위커하모마이세스 시페라이 균주와 유일한 탄소원이 각각 들어있는 키트의 cupules에 접종 배양한 후 시험균이 이들 당을 이용할 수 있는지 여부를 탁도 변화로써 판정하였고, 그 결과를 아래 표 2에 나타내었다.
| 탄소원 | 이용능 |
| D-글루코스 | O |
| 글리세린 | O |
| 케토글루콘산염 | X |
| D-아라비노스 | X |
| D-크실로스 | X |
| 아도니톨 | O |
| 락토스 | X |
| 셀로비오스 | X |
| N-아세틸글루코사민 | X |
| 메틸-D-글루코시드 | O |
| 말토스 | O |
| 슈크로스 | O |
| D-칼락토스 | X |
| 이노시톨 | X |
| 자일리톨 | X |
| 솔비톨 | O |
| 트레할로스 | O |
| 멜레지토스 | X |
| 라피노스 | X |
실험예 1.
W. ciferrii
SB8-25 균주의 TAPS 생성량 분석
위커하모마이세스 시페라이 SB8-25 균주 및 대조군으로 위커하모마이세스 시페라이 야생형 균주(기탁번호 KCCM 50215)의 TAPS 생산능을 비교하였다.
구체적으로, 위커하모마이세스 시페라이 SB8-25(기탁번호: KFCC11942P) 및 위커하모마이세스 시페라이 야생형 균주(기탁번호 KCCM 50215)를 각각YGM 최적배지(글리세롤 100g/ℓ, 효모 추출물 2g/ℓ, KNO3 3g/ℓ, (NH4)2SO4 0.5g/ℓ, MgSO4·7H2O 0.3g/ℓ, NaCl 0.5g/ℓ, CSL(corn steep liquor) 3g/ℓ, LS-300(anti-forming agent) 1g/ℓ) 50㎖에 접종하여 25℃에서 5일간 220rpm으로 배양한후 메탄올을 첨가하여 상온에서 1시간 반응한 다음, 원심분리한 상등액의 TAPS를 분석하였다. TAPS의 생성량은 UV 200 ㎚를 이용하여 HPLC로 분석하였고, 각각 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 120시간에 측정하였다. 용매로 메탄올 : 물 : TFA(trifluoroacetic acid)을 84.5 : 18.45 : 0.05 비율의 혼합액을 사용하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1은 일 구체예에 따른 균주의 TAPS 생성량을 비교 분석한 그래프이다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 대조군 균주와 대비하여 W. ciferrii SB8-25 균주의 배양 상등액이 가장 높은 TAPS 생성량이 측정되었다.
실험예 2.
W. ciferrii
SB8-25 균주의 성장 분석
위커하모마이세스 시페라이 SB8-25 균주 및 대조군으로 피키아 시페라이 야생형 균주(기탁번호 KCCM 50215)균주의 성장을 비교하였다.
구체적으로, YMgl 배지에서 전배양된 각각의 효모를 동일한 흡광도(O.D.600 = 0.05)가 되도록 YMgl 100ml에 접종하여 30℃, 250rpm으로 진탕하면서 배양하였다. 각각 0시간, 24시간, 48시간, 68시간, 97시간, 120시간 시간별로 샘플을 채취하여 흡광도(O.D.600)에서 측정하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2는 일 구체예에 따른 균주의 성장을 비교 분석한 그래프이다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 대조군 균주와 대비하여 W. ciferrii SB8-25 균주는 배양 120시간 후 가장 크게 성장하였음을 확인하였다.
파이토스핑고신의 아세틸화된 형태인 TAPS의 생성은 균체량에 비례하는 것으로 보고되었다. 이상의 결과를 통해, 대조군 균주와 대비하여 W. ciferrii SB8-25 균주는TAPS의 생산량뿐 아니라, 균체량도 향상된 것을 확인하였다.
실험예 3.
W. ciferrii
SB8-25 균주의 글리세롤 소모량 분석
위커하모마이세스 시페라이 SB8-25 균주 및 대조군으로 피키아 시페라이 야생형 균주 (기탁번호 KCCM 50215)의 글리세롤 소모량을 비교하였다.
구체적으로, 상기 실험예1.와 동일한 방법으로 균주를 배양 및 원심분리하여 상등액을 얻은 후, 각각 0시간, 24시간, 48시간, 68시간, 97시간, 120시간 시간별로 샘플을 채취하여 글리세롤의 소모량을 측정하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3은 일 구체예에 따른 균주의 글리세롤 소모양을 비교 분석한 그래프이다.
도3에 나타낸 바와 같이, 대조군 균주와 대비하여 W. ciferrii SB8-25 균주는 글리세롤 소모량, 즉 글리세롤 이용능이 매우 우수함을 확인하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예 및 실험예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
Claims (11)
- 수탁번호 KFCC 11942P로 기탁된, 서열번호 1의 16S rRNA를 포함하는 위커하모마이세스 시페라이(Wickerhamomyces ciferrii) 균주.
- 삭제
- 청구항 1에 있어서, 상기 균주는 자연적으로 일어난 상기 위커하모마이세스 시페라이 균주의 돌연변이를 포함하는 것인 균주.
- 청구항 1에 있어서, 야생형에 비해 테트라아세틸파이토스핑고신(TAPS)의 생산능이 향상된 것인 균주.
- 청구항 1에 있어서, 상기 균주는 탄소원으로 D-글루코스, 글리세린, 아도니톨, 메틸-D-글루코시드, 말토스, 슈크로스, 솔비톨, 및 트레할로스으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있는 것인 균주.
- 청구항 1의 균주를 배지에서 배양하는 단계; 및
상기 배양된 균주, 배지 또는 이들의 혼합물로부터 스핑고이드 염기 또는 스핑고지질을 분리하는 단계를 포함하는 스핑고이드 염기 또는 스핑고지질을 생산하는 방법. - 청구항 6에 있어서, 상기 배지는 탄소원을 포함하는 배지인 것인 방법.
- 청구항 7에 있어서, 상기 탄소원은 글리세롤인 것인 방법.
- 청구항 6에 있어서, 상기 배양하는 단계는 스핑고이드 염기 및 스핑고지질을 생성할 수 있게 해주는 조건하에서 배양하는 것인 방법.
- 청구항 6에 있어서, 상기 스핑고이드 염기 또는 스핑고지질은 테트라아세틸파이토스핑고신(TAPS)인 것인 방법.
- 청구항 6에 있어서, 상기 배양하는 단계는 테트라아세틸파이토스핑고신의 생성에 유리한 조건하에서 배양하고, 얻어진 테트라아세틸파이토스핑고신 탈아세틸화하는 단계를 더 포함하는 것인 방법
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| KR102187234B1 (ko) * | 2019-06-11 | 2020-12-04 | 아주대학교 산학협력단 | Taps 과생산 돌연변이 균주 및 이를 이용한 taps 생산방법 |
| KR102343479B1 (ko) * | 2020-06-23 | 2021-12-27 | 한국생명공학연구원 | 스핑고지질 및 스핑고이드 염기의 생산성이 향상된 피키아 시페라이 변이 균주 및 이의 제조방법 |
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| WO2024144132A1 (en) * | 2022-12-30 | 2024-07-04 | Croda Korea Ltd. | Wickerhamomyces ciferrii strain having enhanced taps productivity and method of producing desired substance using same |
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