MX2010007429A - Microorganismo del genero corynebacterium que tiene la habilidad de producir inosina y un metodo para producir inosina utilizando el mismo. - Google Patents

Abstract

Se describe un microorganismo del género Corynebacterium que tiene la habilidad de producir inosina en donde la trayectoria catabólica de inosina está bloqueada y que tiene un fenotipo auxotrófico de adenina permeable y además tiene un fenotipo auxotrófico de guanina permeable y un método para producir inosina, el método incluye cultivar el microorganismo del género Corynebacterium.

Description

MICROORGANISMO DEL GENERO CORYNEBACTERIUM QÜE TIENE LA HABILIDAD DE PRODUCIR INOSINA Y UN METODO PARA PRODUCIR INOSINA UTILIZANDO EL MISMO Campo de la Invención Una o más de las modalidades de la presente invención se refieren a microorganismos que producen nosina que pertenecen al género Corynejacterium y un método para producir inosina, el método incluye cultivar el microorganismo que produce inosina. Antecedentes de la Invención La inosina es una sustancia vital involucrada en la síntesis química y la síntesis catalizada enzimática del ácido 5 ' -inosínico, que ha llamado mucho la atención como un condimento sabroso. Además, la inosina, que es un intermediario en la trayectoria metabólica para la biosíntesis de ácido nucleico, juega un papel fisiológicamente significativo en los cuerpos de animales y plantas y ha sido ampliamente utilizado en varios campos incluyendo alimentos y medicinas. La inosina se ha producido convencionalmente a través de la fermentación utilizando microorganismos tales como Bacillus (Agrie. Biol . Chem. 46, 2347 (1982); Patente Coreana No. 27280) o Corynebacterium ammoniagenes (Agrie. Biol. Chem., 42, 399 (1978)), o a través de la Ref.212582 descomposición térmica del ácido 5'-inosínico (Publicación Abierta de la Patente Japonesa No. 43-3320) . Sin embargo, en el caso de la descomposición térmica de ácido 5'-inosínico, se requiere una gran cantidad de calor para descomponer el ácido 5 ' -inosínico, y de esta forma es difícil prácticamente utilizar este método. En el caso de la fermentación directa, se han desarrollado y estudiado varias cepas de E. coli (Biosci Biotechnol Biochem. 2001 Mar; 65 (3) : 570-8) . Sin embargo, la concentración de las cepas productoras de inosina es baja, y de esta forma los costos de producción de inosina son altos. Además, la investigación sobre la producción de inosina se ha enfocado en las cepas de E. coli y Bacillus . De esta forma, aún existe la necesidad de desarrollar cepas de microorganismos capaces de producir inosina con un alto rendimiento y acumulación de inosina a una alta concentración, y método para producir inosina utilizando tales cepas. Por consiguiente, se continúa estudiando un método para producir inosina con un alto rendimiento/concentración a través de la concentración mediante la fermentación directa utilizando el microorganismo, y como resultado, para la presente invención, desarrollado un microorganismo que produce inosina con un alto rendimiento/alta concentración.

Breve Descripción de la Invención Una o más de las modalidades de la presente invención proporcionan un microorganismo del género Corynejac eriu-T? que produce inosina en un alto rendimiento/alta concentración en donde la trayectoria catabólica de la inosina está bloqueada, y el microorganismo es un auxótropo de adenina permeable y además es un auxótropo de guanina permeable . Una o más de modalidades de la presente invención proporcionan un método para producir inosina con un mejor rendimiento/alta concentración, que incluye cultivar el microorganismo . Breve Descripción de las Figuras Las características anteriores y otras y ventajas de la presente invención serán más evidentes a través de la descripción de las modalidades ilustrativas detalladas de la misma con referencia a las figuras anexas en donde: La Figura 1 describe un esquema para construir el vector pDZmrihl para alterar una estructura de un gen que codifica el ribonucleósido de hidrolasa 1; y La Figura 2 describe un esquema para construir el vector pDZmrih2 para alterar una estructura de un gen que codifica el ribonucleósido de hidrolasa 2. Descripción Detallada de la Invención La presente invención ahora se describirá con detalle con referencia a las figuras anexas. La presente invención proporciona un microorganismo del género Corynejbacterium que tiene la habilidad de producir inosina en un alto rendimiento/alta concentración, caracterizado en la trayectoria catabólica de inosina está bloqueada, y tiene un fenotipo auxotrófico de adenina permeable. El microorganismo además puede tener un fenotipo auxotrófico de guanina permeable. En el microorganismo del genéro Corynejbacterium que produce inosina, la trayectoria catabólica de inosina está bloqueada con la recombinación genética. Es decir, un gen que codifica el ribonucleósido de hidrolasa (rih) 1 y un gen que codifica rih 2 se inactivan mediante la variación de secuencia causada por la inserción, eliminación, o sustitución de una base. Al mismo tiempo, el microorganismo del género Corynejbacterium puede tener un fenotipo auxotrópico de adenina y/o guanina permeable, seleccionado a través de mutagénesis artificial . Los ejemplos del microoganismo del género Corynebacterium que incluyen Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium diphtheriae, y Corynebacterium ammoniagenes. Preferiblemente, el microorganismo del género Corynebacterium puede ser Corynejbacterium ammoniagenes, más preferiblemente, Corynebacterium ammoniagenes C 04-0027, originado de Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6872. La cepa proge'nitora Corynebacterium ammoniagenes ATCC6872, que es una cepa de Corynebacterium ammoniagenes de tipo silvestre provista por la Colección del Cultivo de Tipo Americano, no produce inosina. El Corynejacterium ammoniagenes CN04-0027 (KCC 10905) puede directamente acumular una alta concentración de inosina con un alto rendimiento en un cultivo ya que tiene el gen rihl que codifica rihl y el gen rih2 que codifica el rih2 alterado, por lo tanto bloqueando la trayectoria de separación de inosina y, al mismo tiempo, tiene un fenotipo auxotófico permeable de adenina y un fenotipo axotrófico permeable de guanina. Un medio utilizado para cultivar el microorganismo del género Corynejbacterium, que se describe en la descripción detallada incluyendo los ejemplos, puede ser un medio nutriente, un medio mínimo, un medio de sembrado, o un medio de fermentación en matraz, y un ejemplo de la composición de cada medio se muestra en la Tabla 1 siguiente. Sin embargo la composición del medio no está limitada a los ejemplos mostrados en la Tabla 1, y puede ser cualquier medio de cultivo adecuado para utilizarse en un cultivo de microorganismos del género Corynejacterium puede utilizarse.

Tabla 1. Composición del medio Tipo de medio Composición del medio Medio nutriente 1% de peptona, 1% de extracto de carne, 0.25% de cloruro de sodio, 1% de extracto de levadura, 199 mg/l de adenina, 100 mg/mL de guanina, 2% de agar, pH 7.2 Medio mínimo 2% de glucosa, 0.3% de sulfato de sodio, 0.1% de KH2P04, 0.3% de K2HP04, 0.3% de MgS04, 10 mg/mL de CaCl2( 10 mg/l de sulfato de hierro, 1 mg/l de ZnS04, 3.6 mg/l de MnCl2, 20 mg/l de 1-cisteína, 10 mg/l de pantotenato de calcio, 5 mg/l de clorhidrato de tiamina, 30 g/l de biotina,- 20 mg/l de adenina, 20 mg/l de guanina, 2% de agar, pH 7.2 Medio de sembrado 5% de glucosa, 0.5% de peptona, 0.5% de levadura de carne, 0.25% de cloruro de sodio, 1% de extracto de levadura, 100 mg/l de adenina, 100 mg/l de guanina, pH 7,2 Medio de 0.1% de glutamato de sodio, 1% de cloruro de fermentación amonio, 1.2% de MgS04, 0.01% de CaCl2, 20 mg/l de en matraz sulfato de hierro, 20 mg/l de MgS04, 20 mg/l de ZnS04, 5 mg/l de CuS04, 23 mg/l de 1-cisteína, 24 mg/l de alanina, 8 mg/l de ácido nicotínico, 45 ug/1 de biotina, 5 mg/l de clorhidrato de tiamina, 50 mg/l de adenina, 30 mg/l de guanina, 1.9% de ácido fosfórico al 85%, 6% de azúcar de reducción preparada mediante la mezcla de fructosa, glucosa y melasas , pH 7.2 El microorganismo del género Corynebacterium puede ser una cepa mutante que mejora la productividad de inosina obtenida a través de un medio en el cual, las estructuras de los genes rihl y rih2 que respectivamente codifican rihl y rih2 se alteran para bloquear la trayectoria catabólica de inosina, y la acumulación de inosina en un cultivo del organismo; la mutagénesis arterial se aplica al microorganismo para seleccionar un auxótropo de adenina permeable y después se confirma un auxótropo de adenina quinina permeable . El microorganismo del género CoryneJbacterium puede ser una cepa recombinante de Corynebacterium awmoniagenes ATCC 6872, que se genera a través de la transformación mediante un vector recombinante que lleva los genes rihl y rih2, que han sido publicados por un experto en la técnica a la cual pertenece la presente invención, con una mutación de terminación prematura creada por la inserción, eliminación o sustitución de una base, en donde la traducción de los genes rihl y rih2 no está apropiadamente establecida, conduciendo a la inactivación del ribonucleósido de hidrolasa 1 y el ribonucleósido de hidrolasa 2, las enzimas rihl y rih2 se inactivan, y de esta forma se bloquea la trayectoria catabólica de inosina. En la cepa recombinante en donde se bloquea la trayectoria catabólica de inosina, el gen rihl y el gen rih2 que se inactivan debido a la variación de secuencia pueden tener una secuencia mostrada por SEC ID NO: 9 y SEC ID NO: 10, respectivamente. En una modalidad de la presente invención, para adicionalmente proporcionar la cepa recombinante en donde la trayectoria de separación de inosina se bloquea con un fenotipo auxotropico de adenina permeable, rayos X o UV, o un mutagen químico tal como N-metil-N-nitro-N-nitrosoguanina, sulfuro de dietilo, o etilamina pueden aplicarse a la cepa. Después de que se trata la cepa recombinante con el mutagen químico, la cepa se coloca en placas en un medio mínimo con la composición mostrada en la Tabla 1, y las colonias individuales exhiben un fenotipoauxotrópico de adenina permeable, que se cultivan en un medio sin adenina, pero crecen más rápido en un medio que incluye adenina, se seleccionan. Después, cada colonia individual se cultiva en un medio nutriente seguido por el cultivo, en un medio de semilla por 24 horas, y después se cultiva en un medio de fermentación durante 5 a 6 días, y entre las cepas obtenidas, una cepa que tiene la productividad más alta de inosina acumulada en el cultivo de fermentación puede seleccionarse como la cepa auxotrópica de adenina permeable en donde se bloquea la trayectoria de separación de inosina. Además, la cepa seleccionada con un fenotipo auxotropico de adenina permeable puede someterse a mutagénesis descrita anteriormente, en donde se trata con el mutagen químico, las cepas exhiben un fenotipo auxotrófico de guanina permeable se seleccionan cada cepa se cultiva en un medio nutriente, el medio de semilla y el medio de fermentación, y después una cepa que tiene la mayor productividad de inosina acumulada en el cultivo de fermentación se selecciona como un microorganismo producto de inosina que tiene el fenotipo auxotrófico de adenina y guanina permeables en donde se bloquea la trayectoria de separación de inosina. La presente invención también proporciona un método para producir inosina, el método incluye: cultivar un microorganismo del género Corynebacterium en donde la trayectoria de separación de inosina se bloquea, y que tiene un fenotipo auxotrófico de adenina y guanina permeable y produce una alta concentración de inosina con un alto rendimiento para producir inosina en el microorganismo o el cultivo; y recuperar la inosina del microorganismo o el cultivo . En el método para producir inosina, el microorganismo del género Corynejbacterium puede ser Corynejbacteriuii? ammoniagenes CN04-0027 (KCCM 10905) . El método para producir inosina incluye cultivar el microorganismo del género Corynebacterium para producir inosina en el microorganismo o el cultivo. En el cultivo del microorganismo del género Corynejbacterium, la cepa se cultiva en un medio típico que contiene cantidades apropiadas de la fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, aminoácido, vitamina de otros nutrientes en una temperatura y pH controlados, bajo condiciones aeróbicas . Este respecto, la fuente de carbono puede ser carbohidrato tal como glucosa, o melasas pretratadas esterilizadas (es decir, melasas convertidas en azúcar de reducción) , la fuente de nitrógeno puede ser cualquier fuente de nitrógeno inorgánico tal como amoniaco, cloruro de amonio o sulfato de amonio; o una fuente de nitrógeno orgánica tal como peptona, NZ-amino, extracto de carne, extracto de levadura, un licor de residuo de maíz, hidrolizado de caseína, pescado o sus productos de descomposición, o una torta de frijol de soya desgrasada o sus productos de descomposición. Como minerales, pueden utilizarse KH2P04, K2HP04, sulfato de magnesio, sulfato de hierro, sulfato de manganeso, o carbonato de calcio (CaC03) , y si se desea, vitaminas y gases que se requieren para que se pueda agregar el auxótropo. El cultivo puede llevarse a cabo bajo condiciones aeróbicas, por ejemplo, agitando el cultivo o aireando el cultivo de agitación a una temperatura en el intervalo de 28 a 36°. El pH del medio puede mantenerse a un pH de 6 a un pide 8 durante el procedimiento del cultivo. El cultivo puede realizarse durante 5 a 6 días, y la inosina acumularse mediante la fermentación directa que puede analizarse a través de HPLC (cromatografía en líquido de alto rendimiento) .

Una o más modalidades de la presente invención ahora se describirán más completamente con referencia a los siguientes ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos son provistos solamente para propósitos ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la presente invención. Ejemplo 1: Construcción de una cepa en donde la estructura del gen rih se altera utilizando el vector pDZ para la inserción del cromosoma. Para inactivar genes que codifican rihl y rih2 causando la variación de secuencia en los genes por la inserción, sustitución, o eliminación para así bloquear la trayectoria de separación de inosina, vector pDZ derivado del vector pACYC177 (New England, Biolab, GenBank acceso # X06402) , se utilizó un vector de clonación del plásmido de E. coli como un vector recombinante (Publicación de Patente Coreana No. 07-94433) . La Fig. 1 describe un esquema para la construcción del vector pDZmrihl que altera la estructura de un gen que codifica rihl. La Fig. 2 describe un proceso para construir el vector pDZmirh2 que altera la estructura de un gen que codifica rih2. Para amplificar el gen que codifica rihl y el gen que codifica rih2 , primero, se llevó a cabo la PCR utilizando ADN cromosómico de Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6872 como una plantilla y los iniciadores que tienen las secuencias SEC ID NOS: 1 a 4 y los iniciadores que tienen las secuencias SEC ID NOS : 5 a 8, respectivamente. En detalle, se llevó a cabo una PCR en el gen que codifica rihl utilizando el ADN cromosómico de Corynejbacterium armoniagenes ATCC 6872 como una plantilla y los iniciadores de SEC ID NOS: 1 y 2 y los iniciadores de SEC ID NOS: 3 y 4, respectivamente, para obtener un fragmento rih-A y un fragmento rihl-B. Subsiguientemente, se realizó la PCR utilizando los fragmentos rihl-A y rihl-B como una plantilla y utilizando los iniciadores de SEC ID NOS: 1 y 4 para obtener un fragmento de gen mutante que tiene la variación de secuencia, es decir, mrihl. Además, para obtener el fragmento de gen mutante mrih2 con la variación de secuencia rih2, se realizó la PCR en el gen que codifica rih2 utilizando ADN cromosómico de Corynejbacterium armoniagenes ATCC 6872 como una plantilla y los iniciadores de SEC ID NOS: 5 y 6 y los iniciadores de SEC ID NOS: 7 y 8, respectivamente, para obtener un fragmento rih2-A y un fragmento rih2-B y se realizó la PCR utilizando los fragmentos rih2-A y rih2-B como una plantilla y utilizando los iniciadores de SEC ID NOS: 5 y 8. Las condiciones de la PCR realizada para obtener los fragmentos rihl-A, rihl-B, rih2-A y rih2-B fueron como sigue: desnaturalización inicial a 94° por 5 minutos; 20 ciclos de desnaturalización a 94° por 30 segundos, templado a 52° por 30 segundos y alargamiento a 72° por 1 minuto; y alargamiento a 72° por 7 minutos. Las condiciones de la PCR realizada para obtener los fragmentos del gen mutante mediante la combinación de los fragmentos rihl A y B y los fragmentos rih2 A y B, respectivamente, como sigue: desnaturalización inicial a 94° por 5 minutos; 25 ciclos de desnaturalización a 94° por 30 segundos, templado a 50° por 30 segundos y alargamiento a 72° por 1 minuto; y alargamiento a 72° por 7 minutos. El mrihl amplificado, mrih2 y el vector pDZ se digirieron con la enzima de restricción Xbal, y después se ligaron con ligasa T4 para obtener el vector recombinante pDZmrihl y pDZmrih2. Para mutar la secuencia del gen rih2 en el cromosoma de Corynebacterium mediante eliminación base, el vector construido pDZmrih2 se utilizó para transformar Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6872 de tipo silvestre mediante electroporación (método de transformación descrito en Appl. Microbiol .Biotechnol . (1999) 52:541-545). Después, las cepas transformadas en donde el vector pDZmrih2 se insertó en el cromosoma mediante recombinación homologa con el gen rih2 por consiguiente se seleccionó en un medio de selección conteniendo 25 mg/1 de kanamicina. La exitosa inserción del vector pDZmrih2 en el cromosoma se confirma evaluando si las colonias exhibieron un color azul en un medio sólido conteniendo X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil- (3-D-galactosida) . Cada cepa en donde se insertó el vector en su cromosoma mediante la recombinación homologa se agitó en cultivo en un medio nutriente a 30° Por 8 horas, y la cepa del cultivo se diluyó serialmente de 104 a 10~10, y el cultivo diluido después se colocó en placas en un medio sólido conteniendo X-gal. La mayor parte de las colonias exhibieron un color azul, pero también existieron colonias blancas a un bajo nivel. A este respecto, al seleccionar colonias blancas, las cepas de cuya secuencia se eliminó el vector pDZmrih2 del cromosoma vía un Segundo cruce se seleccionaron. Como un resultado, se obtuvo una cepa en donde el G 262° G del gen rih2 en el cromosoma de la cepa Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6872 se eliminó. Después, para mutar una secuencia del gen rihl mediante sustitución de la base, el vector pDZmrihl se utilizó para transformar la cepa obtenida como anteriormente que tiene una eliminación en la secuencia del gen rih2, y el proceso de selección se llevó a cabo utilizando el mismo método que el utilizado en la selección de la cepa mutante del gen rih2 para obtener Corynebacterium ammoniagenes CN04-0092 en donde G 148° del gen rihl se sustituyó con T, mientras se bloqueó la trayectoria de separación de inosina. La cepa seleccionada finalmente se identificó mediante una prueba de susceptibilidad para kanamicina y un análisis de secuencia de gen por PCR. El gen rihl y el gen rih2 mutados de la cepa respectivamente tuvieron las secuencias de SEC ID NO: 9 y SEC ID NO: 10. Ejemplo 2: Selección de la cepa mutante CN04-0093 que tiene un fenotipo auxotrofico de adenina permeable. El CorynebacLerium ammoniagenes CN04-0092 obtenido en el Ejemplo 1 se suspendió en un regulador de pH de fosfato (pH 7.0) o un regulador de pH de citrato (pH 5.5) a una concentración de 107 a 108 células/ml, y se agregó N-metil-N-nitro-N-nitrosoguanina a la suspensión resultante a una concentración final de 10 a 50 pg/ml, y el resultante se mantuvo a temperatura ambiente o de 30 a 34° de 40 a 90 minutos para inducir la mutación. Las células obtenidas después de la centrifugación se lavaron con una solución salina al 0.85% tres veces, las células resultantes se diluyeron aproximadamente en un medio mínimo con la composición mostrada en la Tabla 1 conteniendo 2% de agar, se colocaron en placas, y el cultivo de 30 a 34° por 4 a 5 días para obtener colonias. Las colonias obtenidas se transfirieron a un medio sin adenina y un medio conteniendo 100 mg/1 de adenina, respectivamente, y se cultivó ahí por de 3 a 4 días, y después las colonias crecieron en medio sin adenina que crecieron más rápido en el medio conteniendo 100 mg/1 de adenina se seleccionaron. Después las cepas seleccionadas se identificaron como cepas que tienen un fenotipo auxotrofico de adenina permeable, cada colonia obtenida se cultivo en el medio nutriente con la composición mostrada en la Tabla 1, en un medio de sembrado por 24 horas y se cultivó en un medio de fermentación de 5 a 6 días. A través del proceso de cultivo, se seleccionó una cepa que tiene la mayor productividad de inosina y se denominó Corynebacterium ammoniagenes CN04-0093. Ejemplo 3: Selección de la cepa mutante CNO4-0027 (KCCM 10905) que tiene un fenotipo auxotrófico de guanina permeable El Corynejacterium ammoniagenes CN04-0093 obtenido en el Ejemplo 2 se suspendió en un regulador de pH de fosfato (pH 7.0) o un regulador de pH de citrato (pH 5.5) a una concentración de 107 a 108 células/ml, y se agregó N-metil-N-nitro-N-nitrosoguanina a la suspensión resultante a una concentración final de 10 a 50 µg/mlJ y se mantuvo a temperatura ambiente o de 30 a 32° por 40 a 90 minutos para inducir la mutación. Las células obtenidas después de la centrifugación se lavaron con una solución salina al 0.85% tres veces, las células resultantes se diluyeron apropiadamente en medio mínimo con la composición, mostrada en la Tabla 1, conteniendo 2% de agar, se colocaron en placas, y después se cultivaron de 30 a 34° por 4 a 5 días para obtener colonias . Las colonias obtenidas se transfirieron a un medio sin guanina y un medio conteniendo 100 mg/1 de guanina, respectivamente, y se cultivaron ahí por de 3 a 4 días, y después las colonias crecieron en el medio sin guanina y se seleccionaron las que crecieron más rápido en el medio conteniendo 100 mg/1 de guanina. Cada colonia obtenida se cultivó en el medio nutriente con la composición mostrada en la Tabla 1, se cultivó en un medio de sembrado por 24 horas y se cultivó en un medio de fermentación por 5 a 6 días. A través del proceso de cultivo, se seleccionó una cepa que tiene la mayor productividad de inosina. El CoryneJacteriun? ammoniagenes seleccionado en donde la trayectoria de la separación de inosina está bloqueada y que tiene un fenotipo auxotrófico de adenina y guanina permeable y produce una alta concentración de inosina con un alto rendimiento se denominó Corynebacterium ammoniagenes CN04-0027. El Corynebacterium ammoniagenes CN04-0027 se depositó en el Centro de Microorganismos de Cultivo Coreano localizado en Hongje 1-dong, Seodaemun-gu, Seúl, con el No. de Acceso KCCM 10905 el 20 de diciembre, 2007 bajo el Tratado de Budapest . Ejemplo 4: Concentración de la fermentación en un matraz Erlenmeyer Cada 3 mi del medio de sembrado con la composición mostrada en la Tabla 1 se distribuyeron en tubos de ensayo, cada uno teniendo un diámetro de 18 mm, y se esterilizaron bajo presión a 120°C por 10 minutos. Después, el Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6872, el Corynebacterium ammoniagenes CN04-0092 en donde se alteran los genes rihl y rih2, el Corynebacterium ammoniagenes CN04-0093 en donde los genes rihl y rih2 se alteran y que tiene el fenotipo auxotrófico de adenina permeable y el Corynebacterium ammoniagenes CN04-0027 en donde los genes rihl y rih2 están alterados y tienen un fenotipo auxotrófico de adenina y guanina alterado se inocularon respectivamente en los tubos de ensayo, y cada cepa se agitó en cultivo a 37°C por 24 horas para ser utilizada como un cultivo de sembrado. Cada 27 mi de medio de fermentación con la composición mostrada en la Tabla 1 se distribuyo en matraces Erlenmeyer de 250 mi y se esterilizó a 120°C por 10 minutos, y cada 3 mi del medio de sembrado se inoculó en los matraces de 250 mi Erlenmeyer y se cultivaron ahí por 5 a 6 días. Las revoluciones por minuto de una incubadora de agitación fueron de 220 rpm/min, y la incubadora de agitación se ajustó a una temperatura de 32°C y pH 7.2. Como resultado del cultivo, la cantidad de inosina acumulada en el medio de la cepa progenitora Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6872 fue 0 g/1, y la cantidad de inosina acumulada en el medio del Corynebacterium ammoniagenes CN04-0092 fue de aproximadamente 1 g/1. Además, la cantidad de inosina acumulada en el medio del Corynebacterium ammoniagenes CN04-0093 con un fenotipo auxotrófico de adenina permeable fue de aproximadamente 2 g/1 mayor que la del Corynebacterium ammoniagenes CN04-0092, y el Corynebacterium ammoniagenes CN04-0027 con el fenotipo auxotrófico de adenina y guanina permeables que produjo aproximadamente 5 g/1 de inosina, que fue de aproximadamente 2 g/1 mayor que al del Corynebacterium ammoniagenes CN04-0093. La productividad de la inosina de cada cepa se muestra en la Tabla 2 siguiente. Tabla 2 Como se describe anteriormente, de acuerdo con una o más modalidades de la presente invención, cuando se produce inosina utilizando Corynejacterium ammoniagenes CN04-0027 (KCCM 10905) , se puede producir una alta concentración de inosina con un alto rendimiento a través de la fermentación directa, y los costos de producción pueden reducirse debido a una disminución en el consumo de azúcares. Ya que la presente invención ha sido particularmente mostrada y descrita con referencia a sus modalidades ilustrativas, se entenderá por los expertos en la técnica que pueden hacerse varios cambios en la forma y detalles de la misma sin apartarse del espíritu y alcance de la presente invención como se define en las siguientes reivindicaciones . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (6)

1. REIVINDICACIONES
2. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. - Un microorganismo del género Corynebacterium, caracterizado porque tiene la habilidad de producir inosina en donde los genes que codifican el ribonuclésido de hidrolasa 1 (rihl) y rih2 se inactivan para bloquear la trayectoria de separación de inosina, y que tiene por lo menos un fenotipo auxotrófico de adenina. 2. - El microorganismo del género Corynebacterium de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además tiene un fenotipo auxotrófico de guanina permeable. 3. - El microorganismo del género
3. Corynebacterium de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el gen rihl inactivado que codifica rihl y el rih2 inactivado que codifica rih2 tiene las secuencias mostradas en SEC ID NO: 9 y SEC ID NO: 10, respectivamente. 4.- El microorganismo del género
4. Corynebacterium de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque es Corynebacterium ammoniagenes . 5. - El microorganismo del género
5. Corynejacterium de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque es Corynebacterium ammoniagenes CN04- 0027 (KCCM 10905) .
6. 6.- Un método para producir inosina, caracterizado porque comprende: cultivar el microorganismo del género Corynebacterium de conformidad con la reivindicación 1 ó 2 para producir inosina del microorganismo o el cultivo; y recuperar la enosina del microorganismo o cultivo.