JP5156933B2 - スフィンゴイド塩基又はその誘導体を生産する微生物株 - Google Patents
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Description
(ここで、A-BはCH2-CH2及びCH=CHからなる群から選択され;
Rは、
a)(CH2)m-X-(CH2)n-CH3、ここでm及びn夫々は独立して0〜18であり、XはCH2-CH2、CH=CH、C≡C、CHOH-CH2、HC=O-CH2である、但しm+nは0〜18でなければならない、及び
b)(CH2)p-CH=CH-(CH2)q-CH=CH-(CH2)w-CH3、ここでp、q及びw夫々は独立して0〜16である、但しp+q+wは0〜16でなければならない、
からなる群から選択される)
に従うスフィンゴイド塩基、又はその塩若しくはエステルを生産するピキア シフェリイ(Pichia ciferrii)株を提供する。
図1A及び図1Bは、ピキア シフェリイDES1座全体の単離を生じる3つの工程手順を概略的に記載する。PcDES1の内部部分の増幅(I.)に引き続き、逆PCRを2回(II.及びIII.)続けられた。個々の工程において使用されるオリゴヌクレオチドが示され、及び種々の濃淡における配列表現は、そのDNA配列が個々の工程において決定されたPcDES1座の部分を示す。実験手順に関連する制限部位がまた示される。
ピキア シフェリイ F-60-10A NRRL 1031が、250 ml三角フラスコにおいて、50 ml YEPD培地(ペプトン 2% (w/v)、酵母抽出物 1% (w/v)及びグルコース 2% (w/v))中、200 rpm及び30℃で成長され、そして18時間後、1.5のOD600で収穫された。染色体DNAが、製造者の指示書に従い、PUREGENE(商標)DNA Purification Kit for Yeast and Gram-positive bacteria (Gentra Systems Inc., cat.# D-6000A)を使用して単離された。アガロースゲル電気泳動による単離されたDNAの質チェックは、その高い分子量(> 16 kbp)を示した。
最初に、子嚢菌類種からの推定のジヒドロセラミド Δ4 デサチュラーゼのアミノ酸配列が、テンプレートとしてカンジダ アルビカンス(Candida albicans) Des1p タンパク質 (GenBank acc.# EAL03178)でのTBLASTN検索を実行することによって、完成した及び未完成の真核細胞ゲノムのNCBIデータベース(www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom_table.cgi)から抽出された。このタンパク質は生化学的に特徴づけられ、且つセラミド Δ4 デサチュラーゼを示すことを証明された(Ternes等, The Journal of Biological Chemistry, 第277巻:第25512-25518頁, 2002年)。抽出された配列(全てのエントリーは、E-値 < 2 x 10-52を有する)が、ClustalWプログラム (www.ebi.ac.uk/clustalw)を使用して整列された。ピキア シフェリイ DES1遺伝子の内部部分についての適切なオリゴヌクレオチドは、高度にバイアスされたピキア シフェリイコドン使用を考慮して、Des1p配列内のアミノ酸の高度に保存されたストレッチ(stretches)をバック翻訳することによって得られた。次に、下記オリゴヌクレオチドが、MWG Biotech (エーバースベルク、ドイツ)によって合成された:
精製されたPCR生産品のDNA配列が、Sanger等 (Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A., 第74巻:第5463-5467頁)によって開発されたジデオキシ・チェーン・ターミネーション法を使用して決定された。シーケンシングプライマーとして、実施例1においてPCR増幅のために使用されたそれが使用された。DNA配列決定が、Sequiserve (Vaterstetten、ドイツ)によって行われた。生成された配列情報(341 bp、SEQ ID NO:3におけるnt 1336-1676に対応する; 図1A)は、Clone Manager 7 software (Scientific & Educational Software)及びNCBIの重複を除いたタンパク質データベース(non-redundant protein database)(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)と共に、BLASTP検索のためのテンプレートとして使用された該生じたアミノ酸配列を使用して、タンパク質に翻訳された。該検索は、新しい配列に最も類似しているデータベースにおけるタンパク質として、カンジダ アルビカンス Des1p (NCBI acc.# EAL03178)の同定をもたらし、事実ピキア シフェリイ DES1 orthologの一部が増幅されたことを確認した。
(配列、プロモーター領域及び3'-非翻訳領域をコードする)ピキア シフェリイ DES1遺伝子全体を決定するために、 逆PCRアプローチが続けられた。ピキア シフェリイ F-60-10A NRRL1031からの染色体DNA(300 ng)(実施例1に記載されたようにして単離された)が、100μlの総容量において、製造者の指示書に従いNdel (MBI Fermentas, cat.# ER0581) で一晩消化された。該消化されたDNAは、製造者の指示書に従いQIAquick PCR Purification Kit(Qiagen, cat.# 28106)を使用して精製された。溶出されたDNA(50μl)が、1 UのT4 DNAリガーゼと共に200μlの総容量において、製造者の指示書に従いRapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, cat.# 1635379)を使用して一晩のライゲーションに付された。該ライゲーションされたDNAは、製造者の指示書に従いMinElute Gel Extraction Kit(Qiagen, cat.# 28604)を使用して精製された。1μlの溶出物が、Innis等に従う逆PCR反応(PCRprotocols. A guide to methods and applications, 1990年, Academic Press)のためのテンプレートとして使用された。このために、ピキア シフェリイ DES1遺伝子(実施例3を参照)の既に知られている部分に対してターゲットされた2つのオリゴヌクレオチドが適用された:
を使用して、実施例3に記載されたように決定された。新しく得られた配列情報は、SEQ ID NO:3におけるnt 1-1681をカバーし、及びテンプレートDNAのNdeI消化の故に期待されていたように2つのNdeI部位によって挟まれている。3' NdeI部位が実施例3において得られたDNA配列の下流に直接に配置されているように(図1B)、実施例3において得られたDNA配列の下流の新しい配列情報は得られなかった。ピキア シフェリイDES1遺伝子のコード領域の3'-末端及びその3'-非翻訳領域のDNA配列を得るために、逆PCRの他の回が行なわれなければならなかった。それ故に、上記実験プロトコルが繰り返された。但し、SspI (New England Biolabs, cat.# R0132S)がピキア シフェリイ染色体DNAを消化するために使用され、そしてMWG Biotech (エーバースベルク、ドイツ)によって合成された下記オリゴヌクレオチドが逆PCRの間に用いられたことを除く:
高スフィンガニンを生産するピキア シフェリイ株を単離するために、下記手順が続けられた。最初に、ストレプトマイセス シリンゲ(Streptomyces syringae)によって生産された毒性化合物 シリンゴマイシンE(Gross DC, 1985年, Regulation of syringomycin synthesis in Pseudomonas syringae pv. syringae and defined conditions for its production. J Appl Bacteriol. 第58巻:第167-174頁)についてのピキア シフェリイ株の固有の感受性が、種々の濃度のシリンゴマイシンEを寒天プレートに添加することによって決定された。3.5 mgのシリンゴマイシンE(J. Takemoto, Utah State Universityから入手された)の貯蔵液が、それを1.0 mlの0.001 N HClに溶かすことによって調製された。pHは安定性のために7以下に維持され、且つ-20℃で保存された。ピキア シフェリイ株についての最小発育阻止濃度(=MIC値)が、0.1〜20μg/ml の種々の濃度のシリンゴマイシンEを含むYEPDプレート(1リットル当たり: 酵母抽出物、10 g; Pepton、2O g;グルコース、20 g; 寒天、20 g)を使用することによって決定された。シリンゴマイシンEの種々の濃度を有する各プレート上に、100μlの新たに成長した培養物(OD600 nm =0.4)が置かれ、そして5日間、30℃でインキュベーションされた。
実施例5において記載されたようにして単離されたピキア シフェリイ・シリンゴマイシンE変異体によるスフィンゴイド塩基生産を評価するために、全ての10個の真の耐性単離物の前培養物が、30℃、1分当たり280回転で、3日間、25 ml YEPD (100 ml三角フラスコ中、バッフルなし)中に接種された。引き続き、前培養物の1%が、100 ml LCBNB (500 ml三角フラスコ中、バッフルあり)を接種するために使用され、そして30℃、1分当たり280回転で、4日間成長された。
であった。
アセチル化されたスフィンガニンの存在を確認するために、LC-MSが使用された。標準のスフィンガニン及びフィトスフィンゴシン(対照として)が、アセチル化する試薬でアセチル化された。40 mgの4-ジメチルアミノピリジン、0.6 mlの酢酸無水物及び0.2 mlのトリエチルアミンを含むアセチル化する試薬が、10 mlのエタノールフリークロロホルム中に溶解された。0.8mlのスフィンゴイド塩基溶液に、0.2 mlのアセチル化する試薬が加えられた。室温で20〜25分の反応時間後に、5μlが注入された。スフィンガニンのトリアセチル化された形(TriASa)が検出されることができた。
単離された株は、Sa及び/又は実施例6及び7に示されているようなそのアセチル化された形を生産し、そして分泌することができる。LCBの鎖長は、脂肪酸合成の効率に依存して変わりうる。発酵ブロスから得られたスフィンガニン(Sa)及びそのアセチル化された形の鎖長が、LC-MSで決定された。Sa及びその誘導体は、C18の最適の鎖長を主に存在する。
単離された株は、Sa及び/又はそのアセチル化された形を生産し、そして分泌することができる。アセチル化の程度は0〜3まで変化することができ:
・スフィンガニン(Sa)
・モノアセチルスフィンガニン(NASa)
・ジアセチルスフィンガニン(DiASa)
・トリアセチルスフィンガニン(TriASa)
を夫々生じる。
ピキア シフェリイが二倍体種であり、シリンゴマイシンEへの耐性を生じる変異が安定であることができなかった。安定なスフィンガニン生産ピキア シフェリイ株を単離するために。下記手順を続けられる。選択されたシリンゴマイシンE耐性コロニーが、良好な成長を誘発するために非選択的なYEPD寒天上でコロニー精製された。引き続き、2つの異なる主要なシリンゴマイシンE耐性コロニーのうちの10個の単離物が、実施例6に記載されるように、振とうフラスコ中で試験された。
ピキア シフェリイ・ジヒドロセラミド・デサチュラーゼ遺伝子を過剰発現するシリンゴマイシンE耐性変異体を構築するために、我々は、選択マーカー、ピキア シフェリイの染色体DNA内への線形化されたベクターの相同的統合のために使用されるDNA配列を含む統合的なDES1発現ベクターを最初に構築した。
と一緒に、Innis等に従うPCR(PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990年, Academic Press)によって増幅された。
を備えた2つのPCR生成物の夫々の10 ngと一緒に、Innis等に従うPCR (PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990年, Academic Press)を設定することによって得られた。
と一緒に、Innis等に従うPCR(PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990年, Academic Press)のためのテンプレートとして、ピキア シフェリイ F-60-10A NRRL 1031の染色体DNAの200 ngを使用して増幅された。
と一緒に、Innis等に従うPCR(PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press)を設定することによって得られた。
[オリゴヌクレオチドPcL41-internal-fwの5'末端に相補的であり、点変異(CからA;太字)を挿入し、ピキア シフェリイからのL41タンパク質のアミノ酸残基56を置換し(プロリンからグルタミン)、シクロヘキシミド耐性をもたらす(Bae等, Integrative transformation system for the metabolic engineering of the sphingoid base-producing yeast Pichia ciferrii. 2003年. Applied and Environmental Microbiology; 米国特許第6,638,735号明細書)](SEQ ID NO: 24)
[オリゴヌクレオチドPcL41-internal-rvに相補的な5'末端での49 bp配列を含み、点変異(CからAに;太字)を挿入し、ピキア シフェリイからのL41タンパク質におけるアミノ酸残基56を置換し(プロリンからグルタミン)、シクロヘキシミド耐性をもたらす)(Bae等, Integrative transformation system for the metabolic engineering of the sphingoid base-producing yeast Pichia ciferrii. 2003年. Applied and Environmental Microbiology; 米国特許第6,638,735号明細書)](SEQ ID NO: 25)
を使用して、変性されたL41*遺伝子を得るために、Innis等に従うPCR(PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990年, Academic Press)によって増幅された。
を備えた2つのPCR生成物の夫々の10 ngを用いてPCRを設定することによって得られた。
コロニーPCRが、ピキア シフェリイのピルベート・デヒドロゲナーゼ・サブユニットA遺伝子(PDA1)のプロモーター領域の制御下で、ピキア シフェリイのジヒドロセラミド・デサチュラーゼ遺伝子(DES1)を運ぶプラスミドpDB007を備えるシリンゴマイシンE耐性ピキア シフェリイ変異体の形質転換を確認するために行なわれた。
を使用して、PCRにおけるテンプレートとして直接的に使用され、PDA1プロモーターの制御下で、DES1遺伝子を運ぶ形質転換体中における402 bpフラグメントのみを生じる。
ピキア シフェリイ・ジヒドロセラミド・デサチュラーゼ遺伝子を過剰発現するシリンゴマイシンE耐性変異体によるスフィンゴシン-N-アシルエステルの増加された生産について試験するために、ベクターpDB007 (ジヒドロセラミド・デサチュラーゼ遺伝子発現ベクター)を運ぶシリンゴマイシンE耐性変異体及びシリンゴマイシンE耐性親株の1つのクローンが、シリンゴマイシンE耐性ピキア シフェリイ変異体によるスフィンガニンの振とうフラスコ生産についての実施例6に記載されたようにスフィンゴシン-N-アシルエステルの振とうフラスコ生産のために培養された(ただし、1 ml培地あたり2μgのシクロヘキシミドが、ベクターpDB007を運ぶシリンゴマイシンE耐性変異体の場合に添加されたことを除く)。サンプルが、24時間(対数増殖期)及び4日(静止期)後に取られた。
実施例12において記載されたようにして調製された細胞抽出物中のスフィンゴシン-N-アシル濃度が、エレクトロスプレイ・イオン化タンデム質量分析(ESI-MS/MS)を使用して決定された。
Claims (15)
- バイオマス乾燥重量g当たり少なくとも0.1 mgの式I
(ここで、A-BはCH 2 -CH 2 及びCH=CHからなる群から選択され;
Rは、
a)(CH 2 ) m -X-(CH 2 ) n -CH 3 、ここでm及びn夫々は独立して0〜18であり、XはCH 2 -CH 2 、CH=CH、C≡C、CHOH-CH 2 、HC=O-CH 2 である、但しm+nは0〜18でなければならない、及び
b)(CH 2 ) p -CH=CH-(CH 2 ) q -CH=CH-(CH 2 ) w -CH 3 、ここでp、q及びw夫々は独立して0〜16である、但しp+q+wは0〜16でなければならない、
からなる群から選択される)
に従うスフィンゴイド塩基、又はその塩若しくはエステルを生産するピキア シフェリイ(Pichia ciferrii)株を得るための方法であって、
適切な濃度の毒素シリンゴマイシンEの存在下でピキア シフェリイ細胞の集団をインキュベーションすること、前記毒素に対して耐性である細胞のサブ集団を選択すること、そしてバイオマス乾燥重量g当たり少なくとも0.1 mgの式Iのスフィンゴイド塩基を生産する細胞の毒素耐性サブ集団から細胞を単離することを含む、前記方法。 - バイオマス乾燥重量g当たり少なくとも0.1 mgの式Iのスフィンゴイド塩基を生産する毒素耐性ピキア シフェリイ細胞の集団を、スフィンゴ脂質代謝経路の酵素をコードするポリヌクレオチドでのDNA介在形質転換に付すことをさらに含み、スフィンゴ脂質代謝経路の該酵素が、
a. SEQ ID No:1に従うアミノ酸配列を有するポリペプチド、
b. SEQ ID No:1に少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド
からなる群から選択されるジヒドロセラミド・デサチュラーゼである、
請求項1に記載の方法。 - 毒素と一緒にインキュベーションする前に、ピキア シフェリイ細胞の集団を、スフィンゴ脂質代謝経路の酵素をコードするポリヌクレオチドでのDNA介在形質転換に付すことを含み、スフィンゴ脂質代謝経路の該酵素が、
a. SEQ ID No:1に従うアミノ酸配列を有するポリペプチド、
b. SEQ ID No:1に少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド
からなる群から選択されるジヒドロセラミド・デサチュラーゼである、
請求項1に記載の方法。 - スフィンゴイド塩基がD-エリスロ-(2R,3S)-配置を有する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- Rが(CH 2 ) m -X-(CH 2 ) n -CH 3 である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- mが0であり、XがCH 2 -CH 2 又はCHOH-CH 2 であり、及びnが8〜12である、請求項5に記載の方法。
- mが0であり、XがCH 2 -CH 2 であり、及びnが8〜12である、請求項5に記載の方法。
- 該ジヒドロセラミド・デサチュラーゼが、ピキア シフェリイから得られるものである、請求項2又は3に記載の方法。
- a. SEQ ID No:1に従うアミノ酸配列を有するポリペプチド、
b. SEQ ID No:1に少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド
からなる群から選択されるジヒドロセラミド・デサチュラーゼ活性を有するポリペプチド。 - 請求項9に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- SEQ ID No:2である請求項10に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項10又は11のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
- バイオマス乾燥重量g当たり少なくとも0.1 mgの式Iに従うスフィンゴイド塩基を生産する形質転換されたピキア シフェリイ株であって、請求項2又は3に記載の方法によって得られるピキア シフェリイ株。
- 式Iに従うスフィンゴイド塩基を生産するための方法であって、スフィンゴイド塩基の生産を助長する条件下で請求項13に記載のピキア シフェリイ株を発酵すること、そして発酵ブロスからスフィンゴイド塩基を回収することを含む、方法。
- 式Iに従うスフィンゴイド塩基を生産するための方法であって、請求項1の方法に従いピキア シフェリイ株を得ること、該ピキア シフェリイ株を該スフィンゴイド塩基の生産を助長する条件下で発酵すること、そして発酵ブロスからスフィンゴイド塩基を回収することを含む、前記方法。
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