JP6869960B2 - スフィンゴイド塩基またはスフィンゴ脂質の製造法 - Google Patents
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Description
[1]
目的物質の製造方法であって、
目的物質との会合、目的物質との結合、目的物質の可溶化、および/または目的物質の捕捉が可能な添加剤を含有する培地で目的物質を生産する能力を有する酵母を培養すること、および
前記酵母の菌体および/または前記培地から目的物質を回収すること、
を含み、
前記目的物質が、スフィンゴイド塩基およびスフィンゴ脂質からなる群より選択される、方法。
[2]
前記添加剤が、シクロデキストリンおよびゼオライトからなる群より選択される、前記方法。
[3]
前記シクロデキストリンが、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、およびそれらの誘導体からなる群より選択される、前記方法。
[4]
前記誘導体が、メチル−α−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−α−シクロデキストリン、およびヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンからなる群より選択される、前記方法。
[5]
前記目的物質が、フィトスフィンゴシン(PHS)、スフィンゴシン、6−ヒドロキシスフィンゴシン、スフィンガニン(DHS)、テトラアセチルフィトスフィンゴシン(TAPS)、トリアセチルフィトスフィンゴシン、ジアセチルフィトスフィンゴシン、フィトセラミド、ジヒドロセラミド、6−ヒドロキシセラミド、およびグルコシルセラミドからなる群より選択される、前記方法。
[6]
前記目的物質が、フィトスフィンゴシン(PHS)、スフィンガニン(DHS)、テトラアセチルフィトスフィンゴシン(TAPS)、フィトセラミド、およびグルコシルセラミドからなる群より選択される、前記方法。
[7]
前記フィトスフィンゴシンが、C16 PHS、C18 PHS、C20 PHS、C18:1 PHS、C20:1 PHS、4−(ヒドロキシメチル)−2−メチル−6−テトラデカニル−1,3−オキサジナン−5−オール、および4−(ヒドロキシメチル)−2−メチル−6−ヘキサデカニル−1,3−オキサジナン−5−オールからなる群より選択される、前記方法。
[8]
前記酵母が、LCB1、LCB2、TSC10、SUR2、SLI1、ATF2、LAG1、LAC1、LIP1、およびUGCG遺伝子にコードされるタンパク質から選択される1種またはそれ以上のタンパク質の発現および/または活性が増大するように改変されている、前記方法。
[9]
前記1種またはそれ以上のタンパク質の活性が、該タンパク質をコードする遺伝子の発現を増大させることにより、増大した、前記方法。
[10]
前記酵母が、LCB4、LCB5、ELO3、CKA2、ORM2、CHA1、およびYPC1遺伝子にコードされるタンパク質から選択される1種またはそれ以上のタンパク質の発現および/または活性が低下するように改変されている、前記方法。
[11]
前記1種またはそれ以上のタンパク質の活性が、該タンパク質をコードする遺伝子の発現を弱化させることにより、または該タンパク質をコードする遺伝子を破壊することにより、低下した、前記方法。
[12]
前記酵母が、サッカロマイセス(Saccharomyces)属またはピヒア(Pichia)属に属する、前記方法。
[13]
前記酵母が、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)またはピチア・シフェリイ(Pichia ciferrii)(ウィッカーハモマイセス・シフェリイ(Wickerhamomyces ciferrii))である、前記方法。
[14]
前記酵母による前記目的物質の生産量が、前記添加物の非存在下と比較して、前記添加物の存在下で増大する、前記方法。
本発明の酵母は、目的物質を生産する能力を有する酵母である。「目的物質を生産する能力」を、「目的物質生産能」ともいう。
本発明において、「目的物質生産能を有する酵母」とは、培地で培養したときに、目的物質を生成し、回収できる程度に培地中および/または菌体内に蓄積することができる酵母をいう。培地は、本発明の方法で用いることができる培地であってよく、特に、目的物質との会合、目的物質との結合、目的物質の可溶化、および/または目的物質の捕捉が可能な添加剤を含有する培地であってよい。目的物質生産能を有する酵母は、非改変株よりも多い量の目的物質を培地中および/または菌体内に蓄積することができる酵母であってよい。「非改変株」とは、目的物質生産能が付与または増強されるように改変されていない対照株であってよい。すなわち、非改変株としては、野生株や親株、例えば、Saccharomyces cerevisiae BY4742株(ATCC 201389; EUROSCARF Y10000)、S288C株(ATCC 26108)、NCYC 3608株が挙げられる。また、目的物質生産能を有する酵母は、好ましくは5 mg/L以上、より好ましくは10 mg/L以上の量の目的物質を培地に蓄積することができる酵母であってもよい。
DHSを意味してもよく、DHSの上記のようなバリアント種を総称してもよい。このようなバリアント種についての記載は、他のスフィンゴイド塩基にも準用できる。
sitol phosphorylceramide)、マンノシルイノシトールホスホリルセラミド(mannosylinositol phosphorylceramide)、マンノシルジイノシトールホスホリルセラミド(mannosyldiinositol phosphorylceramide)が挙げられる。セラミドとしては、PHSのセラミドに相当するフィトセラミド(phytoceramide)、DHSのセラミドに相当するジヒドロセラミド(dihydroceramide)、6−ヒドロキシスフィンゴシンのセラミドに相当する6−ヒドロキシセラミド(6-hydroxyceramide)が挙げられる。スフィンゴ脂質を構成するアシル鎖の長さや不飽和度は、可変である。アシル鎖の長さは、例えば、C14、C16、C18、C20、C22、C24、C26等のC14〜C26であってよい。アシル鎖は、1つまたはそれ以上の不飽和二重結合を有していてよい。アシル鎖は、1つまたはそれ以上の官能基、例えば水酸基、を有していてもよい。
utilis)等のキャンディダ属、ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)等のハンゼヌラ属、シゾサッカロマイセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)等のシゾサッカロマイセス属に属する酵母が挙げられる。Pichia属のいくつかの種は、Wickerhamomyces属(Int J Syst Evol Microbiol. 2014 Mar;64(Pt 3):1057-61)に再分類されている。よって、例えば、Pichia ciferriiおよびPichia sydowiorumは、それぞれ、Wickerhamomyces ciferriiおよびWickerhamomyces sydowiorumとも呼ばれる。本発明において、「Pichia」には、かつてPichia属に分類されていた種であって、Wickerhamomyces等の他の属に再分類されたものも包含されるものとする。
Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America)、EUROpean Saccharomyces Cerevisiae ARchive for Functional Analysis(EUROSCARF, Address: Institute for Molecular Biosciences, Johann Wolfgang Goethe-University Frankfurt, Max-von-Laue Str. 9; Building N250, D-60438 Frankfurt, Germany)、National Collection of Yeast Cultures(NCYC, Address: Institute of Food Research, Norwich Research Park, Norwich, NR4 7UA, UK)、または各
寄託株に対応する寄託機関から入手することができる。すなわち、例えば、ATCC株の場合、各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して注文することができる(http://www.atcc.org/参照)。各菌株に対応する登録番号は、American Type Culture Collectionのカタログに記載されている。
パク質の発現および/または活性が増大するように改変されていてもよく、且つ/又は、LCB4、LCB5、ELO3、CKA2、ORM2、CHA1、およびYPC1遺伝子にコードされるタンパク質から選択される1種またはそれ以上のタンパク質の発現および/または活性が低下するように改変されていてもよい。「LCB1、LCB2、TSC10、SUR2、SLI1、ATF2、LAG1、LAC1、LIP1、およびUGCG遺伝子にコードされるタンパク質から選択される1種またはそれ以上のタンパク質の活性が増大する」とは、具体的には、LCB1、LCB2、TSC10、SUR2、SLI1、ATF2、LAG1、LAC1、LIP1、およびUGCG遺伝子から選択される1種またはそれ以上の遺伝子の発現が増大することを意味してよい。「LCB4、LCB5、ELO3、CKA2、ORM2、CHA1、およびYPC1遺伝子にコードされるタンパク質から選択される1種またはそれ以上のタンパク質の活性が低下する」とは、具体的には、LCB4、LCB5、ELO3、CKA2、ORM2、CHA1、およびYPC1遺伝子から選択される1種またはそれ以上の遺伝子の発現が弱化することを意味してもよく、LCB4、LCB5、ELO3、CKA2、ORM2、CHA1、およびYPC1遺伝子から選択される1種またはそれ以上の遺伝子が破壊されることを意味してもよい。
(DHS;スフィンガニン)のヒドロキシル化によるフィトスフィンゴシン(PHS)の形成、DHSを含むセラミド(ジヒドロセラミド)のヒドロキシル化によるPHSを含むセラミド(フィトセラミド)の形成を触媒してよい。SUR2遺伝子にコードされるタンパク質を、「Sur2p」ともいう。SUR2遺伝子としては、S. cerevisiaeやPichia ciferrii等の酵母のものが挙げられる。S. cerevisiae S288CのSUR2遺伝子の塩基配列を配列番号7に、同遺伝子にコードされるSur2pのアミノ酸配列を配列番号8に示す。Pichia ciferriiのSUR2遺伝子の塩基配列を配列番号37に、同遺伝子にコードされるSur2pのアミノ酸配列を配列番号38に示す。Sur2pの活性は、例えば、PHSやフィトセラミドを製造する場合に増大させてよい。Sur2pの活性の増大は、具体的には、スフィンゴシンヒドロキシラーゼ活性の増大を意味してよい。スフィンゴシンヒドロキシラーゼ活性は、例えば、酵素をDHSまたはジヒドロセラミドとインキュベートし、酵素依存的なPHSまたはフィトセラミドの生成を測定することにより、測定することができる。
サブユニットLag1pおよびLac1pのそれぞれと結合し、セラミドシンターゼ活性に必須である。Lag1p、Lac1p、およびLip1pのいずれかの活性を単独で増大させてもよく、Lag1pおよびLac1pのいずれか一方の活性をLip1pと組み合わせて増大させてもよく、Lag1pおよびLac1pの両方の活性を増大させてもよく、Lag1p、Lac1p、およびLip1pの全ての活性を増大させてもよい。Lag1p、Lac1p、およびLip1pの1つまたはそれ以上の活性は、例えば、フィトセラミドやグルコシルセラミド等のスフィンゴ脂質を製造する場合に増大させてよい。Lag1p、Lac1p、およびLip1pの1つまたはそれ以上の活性の増大は、具体的には、セラミドシンターゼ活性の増大を意味してよい。セラミドシンターゼ活性は、例えば、公知の方法(Guillas, Kirchman, Chuard, Pfefferli, Jiang, Jazwinski and Conzelman (2001) EMBO J. 20, 2655-2665; Schorling, Vallee, Barz, Reizman and Oesterhelt (2001) Mol. Biol. Cell 12, 3417-3427; Vallee and Riezman (2005) EMBO J. 24, 730-741)により測定することができる。
う(EC 2.3.1.199)。同活性を、「脂肪酸エロンガーゼIII活性」ともいう。C26-CoAは、好ましくは、セラミドシンターゼによって触媒されるセラミドの合成に用いられてよい。ELO3遺伝子にコードされるタンパク質を、「Elo3p」ともいう。S. cerevisiae S288CのELO3遺伝子の塩基配列を配列番号27に、同遺伝子にコードされるElo3pのアミノ酸配列を配列番号28に示す。Elo3pの活性は、例えば、PHS等のスフィンゴイド塩基を製造する場合に低下させてよい。Elo3pの活性の低下は、具体的には、脂肪酸エロンガーゼIII活性の低下を意味してよい。脂肪酸エロンガーゼIII活性は、例えば、公知の方法(J Biol Chem. 1997 Jul 11;272(28):17376-84.)により測定することができる。
c1pの活性の低下は、具体的には、フィトセラミダーゼ活性の低下を意味してよい。フィトセラミダーゼ活性は、例えば、公知の方法(J Biol Chem. 2000 Mar 10;275(10):6876-84.)により測定することができる。
的タンパク質が複数のサブユニットからなる複合体として機能する場合、標的タンパク質についての「元の機能が維持されている」とは、タンパク質のバリアントが、他の適切なサブユニットとの組み合わせで対応する機能(例えば上記例示した活性や性質)を発揮することであってもよい。すなわち、例えば、Lcb1pについての「元の機能が維持されている」とは、タンパク質のバリアントが、適切なLcb2pとの組み合わせでセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を有することであってもよく、Lcb2pについての「元の機能が維持されている」とは、タンパク質のバリアントが、適切なLcb1pとの組み合わせでセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を有することであってもよい。また、Lag1pまたはLac1pについての「元の機能が維持されている」とは、タンパク質のバリアントが、適切なLip1pとの組み合わせでセラミドシンターゼ活性を有することであってもよく、Lip1pについての「元の機能が維持されている」とは、タンパク質のバリアントが、適切なLag1pまたはLac1pとの組み合わせでセラミドシンターゼ活性を有することであってもよい。
以下に、タンパク質の活性を増大させる手法について説明する。
し、同遺伝子を発現させることを含む。
Acids Res., 28, 292 (2000))に開示されている。
al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual/Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001)。mRNAの量は、例えば、非改変株の、1.5倍以上、2倍以上、または3倍以上に上昇してよい。
以下に、タンパク質の活性を低下させる手法について説明する。
とには、同タンパク質が全く存在していない場合が含まれる。また、「タンパク質の分子当たりの機能が低下している」ことには、同タンパク質の分子当たりの機能が完全に消失している場合が含まれる。タンパク質の活性の低下の程度は、タンパク質の活性が非改変株と比較して低下していれば特に制限されない。タンパク質の活性は、例えば、非改変株の、50%以下、20%以下、10%以下、5%以下、または0%に低下してよい。
本発明の方法は、目的物質の製造方法であって、目的物質との会合、目的物質との結合、目的物質の可溶化、および/または目的物質の捕捉が可能な添加剤を含有する培地で本発明の酵母を培養すること、および前記酵母の菌体および/または前記培地から目的物質を回収することを含む方法である。本発明においては、1種の目的物質が製造されてもよく、2種またはそれ以上の目的物質が製造されてもよい。
よく、2種またはそれ以上の添加剤を組み合わせて用いてもよい。
S. cerevisiae EYS3762株を、BY4742株(MATalpha his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0,
EUROSCARF Y10000)より、LCB4およびLCB5遺伝子を順に欠失させることにより構築した。これは、まず、同株を、プライマーEV4024およびEV4025を用いてプラスミド鋳型pEVE698からPCR増幅された欠失構築物(LCB4遺伝子の在来(native)のプロモーターおよびターミネーターに相同な欠失構築物の配列に導入された、loxP部位で挟まれたhygromycin耐性遺伝子HygMX(hph)を含む)で形質転換することによって実施した。形質転換により、在来のLCB4オープンリーディングフレーム全体が組換え断片に置換された。形質転換体は、300 mg/L hygromycinを含有するYPD寒天プレート(10 g/l yeast extract, 20 g/L bacto-peptone, 20 g/L glucose, 20 g/L agar)で選抜した。クローンについて、欠失構築物が適切に挿入されているかをPCR試験により確認した。
プロモーターおよびCYC1ターミネーターの下でPichia ciferriiのアセチルトランスフェラーゼ遺伝子ATF2を発現する発現カセットを有する。このプラスミドは、HIS3選択マーカーも含む。プラスミドpEVE3908は、S. cerevisiaeのGPD1プロモーターおよびCYC1ターミネーターの下でPichia ciferriiのアセチルトランスフェラーゼ遺伝子SLI1を発現する発現カセットを有する。使用したSLI1およびATF2遺伝子の塩基配列は、S. cerevisiaeのコドン使用に最適化されたものである。このプラスミドは、LEU2選択マーカーも含む。これら2つのプラスミドの存在は、アミノ酸であるヒスチジンおよびロイシンを欠く選択SCプレート(1.546 g/L SC-mix without histidine and leucine, 6.7 g/L yeast nitrogen base, 20 g/L glucose, pH 5.8)(SC mixについては表11を参照)でのEYS4300の生育により確認した。
yeast nitrogen base w/o amino acids, 2.0 g/L complete SC mixture, 20 g/L glucose, 20 g/L agar)で選抜した。クローンについて、発現構築物が正しく挿入されているかをPCR試験により確認した。EYS3805株を、先に挿入したnourseothricinおよびhygromycin用の選択マーカーであるnat1およびhphを除去することにより構築した。これは、Creリコンビナーゼの発現カセットを含むURA3選択プラスミドpEVE0078で形質転換することにより実施した。Creリコンビナーゼは、2つのloxP部位間での部位特異的組み換えを触媒し、以て、loxP部位で挟まれた選択マーカーが除去された。Creリコンビナーゼを発現するクローンを選抜し、各選択プレートに播種することによりloxP部位で挟まれた選択マーカーの喪失を試験した。URA3選択下にあるCreリコンビナーゼ保有プラスミドpEVE0078は、5’−フルオロオロチン酸(これはURA3遺伝子にコードされる酵素の活性により毒性化合物に変化する)の存在下で各株を生育させることにより除去した。このプラスミドを失ったクローンのみが、選択培地上で増殖することができた。
欠失(start-to-stop-codon deletion)を生じるPCRベースの欠失ストラテジーにより実施した。CHA1遺伝子は、配列番号76の欠失構築物に置換された。同構築物は、loxP部位で挟まれたKanMX遺伝子と、プライマーEV3782およびEV3783を用いたPCRによって付加されたCHA1遺伝子の在来のプロモーターおよびターミネーターに相同な配列を含む。形質転換体は、100 mg/L G418を含有するYPD寒天プレートで選抜した。クローンについて、欠失構築物が適切に挿入されているかをPCR試験により確認した。LCB4遺伝子の欠失は、オープンリーディングフレームの開始コドンから終始コドンまでの欠失(start-to-stop-codon deletion)を生じるPCRベースの欠失ストラテジーにより実施した。LCB4遺伝子は、配列番号77の欠失構築物に置換された。同構築物は、loxP部位で挟まれたNatMX遺伝子と、プライマーEV4024およびEV4025を用いたPCRによって付加されたLCB4遺伝子の在来のプロモーターおよびターミネーターに相同な配列を含む。形質転換体は、100 mg/L nourseothricinを含有するSC寒天プレートで選抜した。クローンについて、欠失構築物が適切に挿入されているかをPCR試験により確認した。ORM2遺伝子の欠失は、オープンリーディングフレームの開始コドンから終始コドンまでの欠失(start-to-stop-codon deletion)を生じるPCRベースの欠失ストラテジーにより実施した。ORM2遺伝子は、配列番号78の欠失構築物に置換された。同構築物は、loxP部位で挟まれたNatMX遺伝子と、プライマーEV4215およびEV4216を用いたPCRによって付加されたORM2遺伝子の在来のプロモーターおよびターミネーターに相同な配列を含む。形質転換体は、100 mg/L nourseothricinを含有するSC寒天プレートで選抜した。クローンについて、欠失構築物が適切に挿入されているかをPCR試験により確認した。CKA2遺伝子の欠失は、オープンリーディングフレームの開始コドンから終始コドンまでの欠失(start-to-stop-codon deletion)を生じるPCRベースの欠失ストラテジーにより実施した。CKA2遺伝子は、配列番号79の欠失構築物に置換された。同構築物は、loxP部位で挟まれたKanMX遺伝子と、プライマーEV4740およびEV4741を用いたPCRによって付加されたCKA2遺伝子の在来のプロモーターおよびターミネーターに相同な配列を含む。形質転換体は、100 mg/L G418を含有するSC寒天プレートで選抜した。クローンについて、欠失構築物が適切に挿入されているかをPCR試験により確認した。LCB1、LCB2、TSC10、およびSUR2遺伝子の過剰発現は、プラスミドpEVE3105、pEVE2932、およびpEVE4321によるものとした。プラスミドpEVE3105は、HIS3選択マーカーと、GPD1プロモーターおよびCYC1ターミネーターの下でLCB1遺伝子を発現するための発現カセット、並びにPGK1プロモーターおよびADH2ターミネーターの下でLCB2遺伝子を発現するための発現カセットを含む。プラスミドpEVE2932は、KEX2プロモーターおよびADH1ターミネーターの下でS. cerevisiaeのTSC10遺伝子を発現するための発現カセットを含む。このプラスミドは、URA3選択マーカーも含む。プラスミドpEVE4321は、GPD1プロモーターおよびCYC1ターミネーターの下でPichia ciferriiのSUR2遺伝子を発現するための発現カセットを含む。このプラスミドは、LEU2選択マーカーも含む。これら3つのプラスミドの存在は、アミノ酸であるヒスチジンおよびロイシン、並びにヌクレオ塩基であるウラシルを欠く選択プレート(1.47 g/L SC-mix without histidine and leucine, 6.7 g/L yeast nitrogen base, 20 g/L
glucose, pH 5.8)でのEYS4423の生育により確認した。
、配列番号76の欠失構築物に置換された。同構築物は、loxP部位で挟まれたKanMX遺伝子と、プライマーEV3782およびEV3783を用いたPCRによって付加されたCHA1遺伝子の在来のプロモーターおよびターミネーターに相同な配列を含む。形質転換体は、100 mg/L G418を含有するYPD寒天プレートで選抜した。YPC1遺伝子の欠失は、オープンリーディングフレームの開始コドンから終始コドンまでの欠失(start-to-stop-codon deletion)を生じるPCRベースの欠失ストラテジーにより実施した。YPC1遺伝子は、プラスミド鋳型pEVE698からPCR増幅された欠失構築物に置換された。同構築物は、loxP部位で挟まれたhygromycin耐性遺伝子HygMX(hph)と、プライマーEV4018およびEV4019を用いたPCRによって付加されたYPC1遺伝子の在来のプロモーターおよびターミネーターに相同な配列を含む。形質転換体は、hygromycinを含有するSC寒天プレートで選抜した。クローンについて、欠失構築物が適切に挿入されているかをPCR試験により確認した。LAG1、LAC1、およびLIP1遺伝子の挿入は、組込み遺伝子座YORW22Δへの三重発現構築物の挿入により実施した。同構築物は、(1)loxP部位で挟まれたNourseothricin耐性遺伝子NatMX(nat1);(2)S. cerevisiaeのGPD1プロモーターおよびそれに続くS. cerevisiaeのLAG1オープンリーディングフレームとS. cerevisiaeのCYC1ターミネーター;(3)S. cerevisiaeのPGK1プロモーターおよびそれに続くS. cerevisiaeのLAC1オープンリーディングフレームとS. cerevisiaeのADH2ターミネーター;(4)S. cerevisiaeのTEF1プロモーターおよびそれに続くS. cerevisiaeのLIP1オープンリーディングフレームとS. cerevisiaeのENO2ターミネーター;(5)選択マーカーの上流およびLIP1発現カセットの下流の組込み遺伝子座YORW22Δに相同な配列からなる。形質転換体は、nourseothricinを含有するSC寒天プレートで選抜した。次に、先に挿入した選択マーカーを、Creリコンビナーゼ酵素の発現カセットを含むURA3選択プラスミドpEVE0078で形質転換することにより除去した。Creリコンビナーゼは、hph選択マーカーを挟む2つのloxP部位間での部位特異的組み換えを触媒し、同時にそれを除去した。Creリコンビナーゼを発現するクローンを、ウラシルを含まないSC寒天プレートで選択した。いくつかのクローンを選抜し、各選択プレートに播種することによりloxP部位で挟まれた選択マーカーの喪失を試験した。Creリコンビナーゼ保有プラスミドpEVE0078は、5’−フルオロオロチン酸(これはURA3遺伝子にコードされる酵素の活性により毒性化合物に変化する)の存在下で各株を生育させることにより除去した。このプラスミドを失ったクローンのみが、選択培地上で増殖することができた。
以下の実験は、シクロデキストリンがスフィンゴイド塩基を可溶化するか否か、およびどの程度まで可溶化するかを決定するために行った。そのために、過剰量のフィトスフィンゴシンを、3種の異なるタイプのシクロデキストリン種(α−シクロデキストリン、2−ヒドロキシプロピル−α−シクロデキストリン、2−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン)の溶液と、それらシクロデキストリン種の濃度を増加させながらインキュベートした。上清中の可溶化したフィトスフィンゴシンは、同じシクロデキストリン溶液で調製した標準物質を用いた液体クロマトグラフィー−質量分析(LC-MS)によって定量した。その結果、試験したシクロデキストリンは、それらシクロデキストリンの濃度に応じてフィトスフィンゴシンを種々の濃度まで用量依存的に可溶化することが示された(図1)。印象深いことには、9 g/L超のフィトスフィンゴシンが、2−ヒドロキシプロピル
−α−シクロデキストリンにより可溶化されることが示された。
S. cerevisiae EYS3399株を、スフィンゴイド塩基生産を向上させるための基本株として使用した。EYS3399株は、出願人による命名であり、National Collection of Yeast CulturesのNCYC 3608株(S288CのMatα誘導体;genotype MATalpha gal2 ho::HygMX ura3::KanMX)と同一株である。上述の通り、EYS3399株において長鎖塩基キナーゼをコードするLCB4遺伝子およびカゼインキナーゼ2のαサブユニットをコードするCKA2遺伝子を欠失することにより、別の株であるEYS5009を構築した。EYS5009株は、EYS3399株と比較して、スフィンゴイド塩基の生合成の増大を示した(図2)。両株(EYS3399およびEYS5009)を、20 g/Lのα−シクロデキストリンを含む、または含まない合成完全(synthetic complete;SC)培地(2.0 g/L SC-mix, 6.7 g/L YNB, 20 g/L glucose, pH 5.8)で、30℃で24時間、振盪フラスコ培養により生育させた。上清をLC-MSで分析し、3-ケトスフィンガニン、スフィンガニン、およびフィトスフィンゴシンを定量した(図2)。シクロデキストリン(CD)を含まない試料は希釈せず、CDを含む試料はメタノールで50倍に希釈した。その結果、両株(EYS3399およびEYS5009)について、シクロデキストリンの曝露によりスフィンゴイド塩基の生産が増強されることが示された。このシクロデキストリンの効果は、3-ケトスフィンガニンまたはスフィンガニンと比較して、フィトスフィンゴシンについてより顕著であった。また、このシクロデキストリンの効果は、EYS3399株と比較して、EYS5009株においてより顕著であった。これら酵母株および他の酵母株で他のシクロデキストリン種について試験したところ、同様の効果が認められた。
EYS4928株を、EYS3399からいくつかの工程により構築した。EYS3399は、S288CのMatα誘導体であるNCYC 3608株(genotype MATalpha gal2 ho::HygMX ura3::KanMX)と同一株である。選択マーカーHygMXは、まず、loxPで挟まれたURA3遺伝子をEYS3399のho遺伝子座(Chromosome IV 46271..48031)に挿入し、次いで、pEVE0078を用いたCreリコンビナーゼの発現によってURA3遺伝子を除去することにより、除去した。次いで、選択マーカーKanMXを、同様の手順でURA3遺伝子座から除去した。こうして得られた株は、さらなる遺伝子操作を可能にするために、LEU2およびHIS3のオープンリーディングフレーム全体を除去することによりこれらの遺伝子について栄養要求性にした。バイオリアクタでの生育のために、こうして得られた栄養要求性株を2つの発現プラスミド(HIS3およびLEU2遺伝子を有する第1のプラスミドおよびURA3遺伝子を有する第2のプラスミド)の形質転換により原栄養性にし、EYS4928株を得た。
ammonium formateおよび0.2% formic acidの水溶液(移動相A)と、1 mM ammonium formateおよび0.2% formic acidを含有するacetonitrileおよびmethanolの1:1混合物(移動相
B)を用いた。グラジエントは、1分間で移動相Bを50%から85%にし、次いで、3分間で移動相Bを100%にした。移動相Bを1分間100%に維持し、次いで、移動相B 50%での再調整工程を1分間実施した。カラム温度は50℃に保ち、流速は0.4 ml/minとした。質量スペクトル分析は、キャピラリー電圧4.5 kV、ソース温度180℃、ネブライザー圧1.6 barで、エレクトロスプレーポジティブモードで実施した。質量スペクトルは、100〜1400の質量電荷比(m/z)から得た。フィトスフィンゴシンの濃度は、サンプルに対応するマトリックス(例えば、メタノールで10倍に希釈したシクロデキストリンを含有する培地)中のフィトスフィンゴシン(Santa Cruz Biotechnology)の検量線(4 mg/L, 2 mg/L, 1 mg/L, 500 μg/L, 250 μg/L, 125 μg/L, 62.5 μg/L, 31.25 μg/L)に従って決定した。
S. cerevisiae EYS4061株(同株は、Wickerhamomyces ciferrii(Pichia ciferrii)由来のアセチルトランスフェラーゼ遺伝子ATF2およびSLI1を過剰発現する)をさらなる遺伝子改変、すなわち、長鎖塩基キナーゼ遺伝子LCB4およびLCB5の欠失、並びにLCB1、LCB2、およびTSC10遺伝子の過剰発現に供することにより、EYS4300株を構築した。同様の対照株EYS4299(同株は、選択マーカーHIS3およびLEU2をそれぞれ有するプラスミドpEVE2152およびpEVE2159を含むが、アセチルトランスフェラーゼ遺伝子を有さない)も構築した。両株を、30℃で48時間、選択SC培地を用いた振盪フラスコ培養で生育させ、バイオマスおよび培養上清を、長鎖塩基であるフィトスフィンゴシン、スフィンガニン、およびテトラアセチルフィトスフィンゴシンレベルの分析および定量に供した。LC-MS分析は、サンプルを希釈しなかったこと以外は、実施例4に記載した通りに実施した。テトラアセチルフィトスフィンゴシン(TAPS)の濃度は、サンプルに対応するマトリックス(例えば、メタノールで希釈したシクロデキストリンを含有する培地)中の精製TAPSの検量線に従って決定した。
フィトスフィンゴシンおよびアセチル化フィトスフィンゴシン(アセチルフィトスフィンゴシン)の生産の活性化を、以下に示す2株のS. cerevisiaeと2株のWickerhamomyces
ciferriiの培養上清中で評価した:
EYS2958 (野生株)
EYS4423 (フィトスフィンゴシン生産株)
EYS3062 (Wickerhamomyces ciferrii)
EYS3063 (Wickerhamomyces sydowiorum)
SC10][PcSUR2])は、フィトスフィンゴシン生産株であり、これも前述のものである。EYS3062株は、Wickerhamomyces ciferrii(Pichia ciferrii)の株(EXT. PRODUCER: ATCC, NOTES: Wickerhamomyces ciferrii Y-1031 (ATCC 14091))である。EYS3063株は、Wickerhamomyces sydowiorum(Pichia sydowiorum)の株(XT. PRODUCER: ATCC, NOTES: Wickerhamomyces sydowiorum Y-7130 (ATCC 58369))である。これら異なる4つの株を、10 g/Lのα−シクロデキストリンの存在下または非存在下で、30℃で48時間、SC培地で振盪フラスコ培養により2連で生育させた。EYS4423については、ヒスチジン、ロイシン、およびウラシルをSC培地に添加しなかった。バイオマスの量を図4に示す。培養液(培地+菌体)は、メタノールで希釈し、遠心分離してから、フィトスフィンゴシン、またはモノ−、ジ−、トリ−、およびテトラアセチルフィトスフィンゴシンの存在について分析した。LC-MS分析は、サンプルをメタノールで20倍希釈したこと以外は、実施例4に記載した通りに実施した。テトラアセチルフィトスフィンゴシン(TAPS)の濃度は、サンプルに対応するマトリックス(例えば、メタノールで希釈したシクロデキストリンを含有する培地)中の精製TAPSの検量線に従って決定した。モノアセチル−、ジアセチル−、およびトリアセチルフィトスフィンゴシンのピーク面積は、抽出したそれぞれのマスクロマトグラムに基づいて測定した。モノ−、ジ−、およびトリアセチルフィトスフィンゴシンについては、標準物質がないために絶対量の定量ができなかった。一方、テトラアセチルフィトスフィンゴシンについては、適切な標準物質があったため定量ができた。
Wickerhamomyces ciferrii EYS3062株の流加発酵を、15 g/Lのα−シクロデキストリンを添加した、または添加していないSC培地を回分および流加培地に用いて、30℃で実施した。発酵中の種々の時点でサンプルを採取し、モノアセチル−、ジアセチル−、トリアセ
チル−、およびテトラアセチルフィトスフィンゴシンの存在についてLC-MSによって分析した。LC-MS分析は、サンプルをメタノールで2000倍希釈したこと以外は、実施例4に記載した通りに実施した。テトラアセチルフィトスフィンゴシン(TAPS)の濃度は、サンプルに対応するマトリックス(例えば、メタノールで希釈したシクロデキストリンを含有する培地)中の精製TAPSの検量線に従って決定した。モノアセチル−、ジアセチル−、およびトリアセチルフィトスフィンゴシンのピーク面積は、抽出したそれぞれのマスクロマトグラムに基づいて測定した。
BY4742株(wt)、EYS4022株(cha1Δ ypc1Δ lcb4Δ LAG1 LAC1 LIP1)、およびEYS4798株(cha1Δ ypc1Δ lcb4Δ LAG1 LAC1 LIP1、およびプラスミドpEVE4782から発現するXenopus laevis UGT21-M)を、200 g/lのメチル−β−シクロデキストリンを含む選択SC培地で、30℃で48時間、振盪フラスコ培養により生育させた。上清をLC-MSに供し、フィトセラミドおよびグルコシルフィトセラミドの存在について分析した。LC-MS分析は、Waters Ultra Performance Liquid Chromatography(UPLC)をBruker Micro Q-TOF II質量分析計と併用して実施した。典型的には、5 μlのサンプルをAcquity BEH UPLC C8 2.1 x 100
mm 1.7 μm column(Waters)に注入した。移動相には、2 mM ammonium formateおよび0.2% formic acidの水溶液(移動相A)と、1 mM ammonium formateおよび0.2% formic aci
dを含有するacetonitrileおよびmethanolの1:1混合物(移動相B)を用いた。グラジエントは、1分間で移動相Bを50%から85%にし、次いで、3分間で移動相Bを100%にした。移動相Bを3分間100%に維持し、次いで、移動相B 50%での再調整工程を2分間実施した。カラム温度は50℃に保ち、流速は0.4 ml/minとした。質量スペクトル分析は、キャピラリー電圧4.5 kV、ソース温度180℃、ネブライザー圧1.6 barで、エレクトロスプレーポジティブモードで実施した。質量スペクトルは、100〜1400の質量電荷比(m/z)から得た。フィトスフィンゴシン、C24-フィトセラミド、およびグリコシル-C26-フィトセラミドの濃度は、サンプルに対応するマトリックス(例えば、メタノールで10倍に希釈したシクロデキストリンを含有する培地)中のフィトスフィンゴシン標準品(Santa Cruz Biotechnology)、C24-フィトセラミド標準品(Avanti Polar Lipids Inc.)、およびα-ガラクトシル-C26-フィトセラミド標準品(Larodan Fine Chemicals AB)の検量線に従って決定した。C26-フィトセラミドの濃度は、C24-フィトスフィンゴシン検量線を用いて推定した。
実施例に用いた材料を表5〜11に示す。
配列番号1:Saccharomyces cerevisiaeのLCB1遺伝子の塩基配列
配列番号2:Saccharomyces cerevisiaeのLcb1タンパク質のアミノ酸配列
配列番号3:Saccharomyces cerevisiaeのLCB2遺伝子の塩基配列
配列番号4:Saccharomyces cerevisiaeのLcb2タンパク質のアミノ酸配列
配列番号5:Saccharomyces cerevisiaeのTSC10遺伝子の塩基配列
配列番号6:Saccharomyces cerevisiaeのTsc10タンパク質のアミノ酸配列
配列番号7:Saccharomyces cerevisiaeのSUR2遺伝子の塩基配列
配列番号8:Saccharomyces cerevisiaeのSur2タンパク質のアミノ酸配列
配列番号9:Saccharomyces cerevisiaeのSLI1遺伝子の塩基配列
配列番号10:Saccharomyces cerevisiaeのSli1タンパク質のアミノ酸配列
配列番号11:Saccharomyces cerevisiaeのATF2遺伝子の塩基配列
配列番号12:Saccharomyces cerevisiaeのAtf2タンパク質のアミノ酸配列
配列番号13:Saccharomyces cerevisiaeのLAG1遺伝子の塩基配列
配列番号14:Saccharomyces cerevisiaeのLag1タンパク質のアミノ酸配列
配列番号15:Saccharomyces cerevisiaeのLAC1遺伝子の塩基配列
配列番号16:Saccharomyces cerevisiaeのLac1タンパク質のアミノ酸配列
配列番号17:Saccharomyces cerevisiaeのLIP1遺伝子の塩基配列
配列番号18:Saccharomyces cerevisiaeのLip1タンパク質のアミノ酸配列
配列番号19:Xenopus laevisのugcg-a遺伝子(mRNA)の塩基配列
配列番号20:Xenopus laevisのUgcg-aタンパク質のアミノ酸配列
配列番号21:Xenopus laevisのugcg-b遺伝子(mRNA)の塩基配列
配列番号22:Xenopus laevisのUgcg-bタンパク質のアミノ酸配列
配列番号23:Saccharomyces cerevisiaeのLCB4遺伝子の塩基配列
配列番号24:Saccharomyces cerevisiaeのLcb4タンパク質のアミノ酸配列
配列番号25:Saccharomyces cerevisiaeのLCB5遺伝子の塩基配列
配列番号26:Saccharomyces cerevisiaeのLcb5タンパク質のアミノ酸配列
配列番号27:Saccharomyces cerevisiaeのELO3遺伝子の塩基配列
配列番号28:Saccharomyces cerevisiaeのElo3タンパク質のアミノ酸配列
配列番号29:Saccharomyces cerevisiaeのCKA2遺伝子の塩基配列
配列番号30:Saccharomyces cerevisiaeのCka2タンパク質のアミノ酸配列
配列番号31:Saccharomyces cerevisiaeのORM2遺伝子の塩基配列
配列番号32:Saccharomyces cerevisiaeのOrm2タンパク質のアミノ酸配列
配列番号33:Saccharomyces cerevisiaeのCHA1遺伝子の塩基配列
配列番号34:Saccharomyces cerevisiaeのCha1タンパク質のアミノ酸配列
配列番号35:Saccharomyces cerevisiaeのYPC1遺伝子の塩基配列
配列番号36:Saccharomyces cerevisiaeのYpc1タンパク質のアミノ酸配列
配列番号37:Pichia ciferriiのSUR2遺伝子の塩基配列
配列番号38:Pichia ciferriiのSur2タンパク質のアミノ酸配列
配列番号39:Pichia ciferriiのSLI1遺伝子(一部)の塩基配列
配列番号40:S. cerevisiaeのコドン使用に最適化されたPichia ciferriiのSLI1遺伝子の塩基配列
配列番号41:Pichia ciferriiのSli1タンパク質のアミノ酸配列
配列番号42:Pichia ciferriiのATF2遺伝子の塩基配列
配列番号43:S. cerevisiaeのコドン使用に最適化されたPichia ciferriiのATF2遺伝子の塩基配列
配列番号44:Pichia ciferriiのAtf2タンパク質のアミノ酸配列
配列番号45〜56:プライマー
配列番号57〜69:プラスミド
配列番号70,71:プロモーター
配列番号72,73:ターミネーター
配列番号74,75:LoxP配列
配列番号76〜79:遺伝子欠失構築物
配列番号80,81:プロモーター
配列番号82,83:ターミネーター
Claims (13)
- 目的物質の製造方法であって、
目的物質との会合、目的物質との結合、目的物質の可溶化、および/または目的物質の捕捉が可能な添加剤を含有する培地で目的物質を生産する能力を有する酵母を培養すること、および
前記酵母の菌体および/または前記培地から目的物質を回収すること、
を含み、
前記目的物質が、スフィンゴイド塩基およびスフィンゴ脂質からなる群より選択され、
前記添加剤が、シクロデキストリンである、方法。 - 前記シクロデキストリンが、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、およびそれらの誘導体からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記誘導体が、メチル−α−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−α−シクロデキストリン、およびヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンからなる群より選択される、請求項2に記載の方法。
- 前記目的物質が、フィトスフィンゴシン(PHS)、スフィンゴシン、6−ヒドロキシスフィンゴシン、スフィンガニン(DHS)、テトラアセチルフィトスフィンゴシン(TAPS)、トリアセチルフィトスフィンゴシン、ジアセチルフィトスフィンゴシン、フィトセラミド、ジヒドロセラミド、6−ヒドロキシセラミド、およびグルコシルセラミドからなる群より選択される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記目的物質が、フィトスフィンゴシン(PHS)、スフィンガニン(DHS)、テトラアセチルフィトスフィンゴシン(TAPS)、フィトセラミド、およびグルコシルセラミドからなる群より選択される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記フィトスフィンゴシンが、C16 PHS、C18 PHS、C20 PHS、C18:1 PHS、C20:1 PHS、4−(ヒドロキシメチル)−2−メチル−6−テトラデカニル−1,3−オキサジナン−5−オール、および4−(ヒドロキシメチル)−2−メチル−6−ヘキサデカニル−1,3−オキサジナン−5−オールからなる群より選択される、請求項5に記載の方法。
- 前記酵母が、LCB1、LCB2、TSC10、SUR2、SLI1、ATF2、LAG1、LAC1、LIP1、およびUGCG遺伝子にコードされるタンパク質から選択される1種またはそれ以上のタンパク質の発現および/または活性が増大するように改変されている、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記1種またはそれ以上のタンパク質の活性が、該タンパク質をコードする遺伝子の発現を増大させることにより、増大した、請求項7に記載の方法。
- 前記酵母が、LCB4、LCB5、ELO3、CKA2、ORM2、CHA1、およびYPC1遺伝子にコードされるタンパク質から選択される1種またはそれ以上のタンパク質の発現および/または活性が低下するように改変されている、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記1種またはそれ以上のタンパク質の活性が、該タンパク質をコードする遺伝子の発現を弱化させることにより、または該タンパク質をコードする遺伝子を破壊することにより、低下した、請求項9に記載の方法。
- 前記酵母が、サッカロマイセス(Saccharomyces)属またはピヒア(Pichia)属に属する、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記酵母が、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)またはピチア・シフェリイ(Pichia ciferrii)(ウィッカーハモマイセス・シフェリイ(Wickerhamomyces ciferrii))である、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記酵母による前記目的物質の生産量が、前記添加物の非存在下と比較して、前記添加物の存在下で増大する、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
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