JPWO2019078359A1 - ステロールの製造法 - Google Patents
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Description
[1]
ラビリンチュラ類微生物であって、
ステロール生産能を有し、
オーランチオキトリウム(Aurantiochytrium)sp.1であり、
24−デヒドロコレステロールレダクターゼの活性が非改変株と比較して低下するように改変されており、
前記ステロールが、植物ステロールおよび真菌ステロールから選択される少なくとも1種のステロールである、微生物。
[2]
24−デヒドロコレステロールレダクターゼをコードする遺伝子の発現を低下させることにより、または該遺伝子を破壊することにより、24−デヒドロコレステロールレダクターゼの活性が低下した、前記微生物。
[3]
24−デヒドロコレステロールレダクターゼのアミノ酸配列の一部または全部の欠失により、24−デヒドロコレステロールレダクターゼの活性が低下した、前記微生物。
[4]
前記ステロールが、スティグマステロールおよび/またはブラシカステロールである、前記微生物。
[5]
ラビリンチュラ類微生物であって、
ステロール生産能を有し、
オーランチオキトリウム(Aurantiochytrium)sp.1であり、
7−デヒドロコレステロールレダクターゼの活性が非改変株と比較して低下するように改変されており、
前記ステロールが、7−デヒドロコレステロールおよび/またはエルゴステロールである、微生物。
[6]
7−デヒドロコレステロールレダクターゼをコードする遺伝子の発現を低下させることにより、または該遺伝子を破壊することにより、7−デヒドロコレステロールレダクターゼの活性が低下した、前記微生物。
[7]
7−デヒドロコレステロールレダクターゼのアミノ酸配列の一部または全部の欠失により、7−デヒドロコレステロールレダクターゼの活性が低下した、前記微生物。
[8]
さらに、ステロール24−C−メチルトランスフェラーゼの活性が非改変株と比較して低下するように改変されている、前記微生物。
[9]
ラビリンチュラ類微生物であって、
ステロール生産能を有し、
オーランチオキトリウム(Aurantiochytrium)sp.1であり、
ステロール24−C−メチルトランスフェラーゼの活性が非改変株と比較して低下するように改変されており、
前記ステロールが、動物ステロールから選択される少なくとも1種のステロールである、微生物。
[10]
前記ステロール24−C−メチルトランスフェラーゼが、下記(a)、(b)、または(c)に記載のタンパク質である、前記微生物:
(a)配列番号38または56に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(b)配列番号38または56に示すアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、ステロール24−C−メチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質;
(c)配列番号38または56に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、ステロール24−C−メチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
[11]
ステロール24−C−メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の発現を低下させることにより、または該遺伝子を破壊することにより、ステロール24−C−メチルトランスフェラーゼの活性が低下した、前記微生物。
[12]
ステロール24−C−メチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列の一部または全部の欠失により、ステロール24−C−メチルトランスフェラーゼの活性が低下した、前記微生物。
[13]
前記ステロールが、コレステロールおよび/または7−デヒドロコレステロールである、前記微生物。
[14]
前記ステロールが、コレステロールである、前記微生物。
[15]
さらに、下記性質(A)、(B)、および(C)から選択される少なくとも1つの性質を有する、前記微生物:
(A)前記微生物が、ステロールC−22デサチュラーゼの活性が非改変株と比較して低下するように改変されている;
(B)前記微生物が、24−デヒドロコレステロールレダクターゼの活性が非改変株と比較して増大するように改変されている;
(C)前記微生物が、7−デヒドロコレステロールレダクターゼの活性が非改変株と比較して増大するように改変されている。
[16]
前記ステロールC−22デサチュラーゼが、下記(a)、(b)、または(c)に記載のタンパク質である、前記微生物:
(a)配列番号42に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(b)配列番号42に示すアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、ステロールC−22デサチュラーゼ活性を有するタンパク質;
(c)配列番号42に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、ステロールC−22デサチュラーゼ活性を有するタンパク質。
[17]
前記24−デヒドロコレステロールレダクターゼが、下記(a)、(b)、または(c)に記載のタンパク質である、前記微生物:
(a)配列番号40に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(b)配列番号40に示すアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、24−デヒドロコレステロールレダクターゼ活性を有するタンパク質;
(c)配列番号40に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、24−デヒドロコレステロールレダクターゼ活性を有するタンパク質。
[18]
前記7−デヒドロコレステロールレダクターゼが、下記(a)、(b)、または(c)に記載のタンパク質である、前記微生物:
(a)配列番号39に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(b)配列番号39に示すアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、7−デヒドロコレステロールレダクターゼ活性を有するタンパク質;
(c)配列番号39に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、7−デヒドロコレステロールレダクターゼ活性を有するタンパク質。
[19]
18S rDNAの塩基配列が、配列番号3に対して97%以上の同一性を有する、前記微生物。
[20]
Aurantiochytrium sp.1 AJ7869株(FERM BP-22342)、AJ7868株(FERM BP-22290)、またはAJ7879株(FERM BP-22367)に由来する改変株である、前記微生物。
[21]
ステロールの製造方法であって、
前記微生物を培地で培養すること、および
前記培養により生成した菌体から前記ステロールを回収すること、
を含む、方法。
[22]
前記ステロールが、遊離型のステロール、ステロールエステル、ステリルグルコシド、アシルステリルグルコシド、またはそれらの混合物である、前記方法。
本発明の微生物は、DHCR24、DHCR7、またはSMT1の活性が低下するように改変された、ステロール生産能を有するラビリンチュラ類微生物である。
本発明において用いられるラビリンチュラ類微生物は、Aurantiochytrium sp.1である。「Aurantiochytrium sp.1」とは、Aurantiochytrium属の特定の1種をいい、具体的には、Aurantiochytrium sp.1 AJ7869株(FERM BP-22342)が属する種をいう。言い換えると、「Aurantiochytrium sp.1」とは、具体的には、Aurantiochytrium sp.1 AJ7869株および同株と同種に属する株で構成される一群の微生物をいう。Aurantiochytrium sp.1 AJ7869株と同種に属する株としては、18S rDNAの塩基配列が、Aurantiochytrium sp.1 AJ7869株の18S rDNAの塩基配列(配列番号3)に対して97%以上の同一性を有する株が挙げられる。Aurantiochytrium sp.1として、具体的には、例えば、AJ7869株に加えて、AJ7867株(FERM BP-22304)、AJ7868株(FERM BP-22290)、AJ7879株(FERM BP-22367)、BURABG162株、SKE217株、SKE218株が挙げられる。また、上記例示したAurantiochytrium sp.1に属する株に由来する株(例えば改変株)は、いずれも、Aurantiochytrium sp.1に包含される。
本発明の微生物は、ステロール生産能を有する。「ステロール生産能を有する微生物」とは、培地で培養したときに、目的とするステロールを生成し、回収できる程度に菌体内に蓄積する能力を有する微生物をいう。
本発明の微生物は、DHCR24、DHCR7、またはSMT1の活性が低下するように改変されている。本発明の微生物は、具体的には、DHCR24、DHCR7、またはSMT1の活性が非改変株と比較して低下するように改変されている。DHCR24、DHCR7、またはSMT1の活性が低下するようにラビリンチュラ類微生物を改変することにより、同微生物のステロール生産能を向上させることができる、すなわち、同微生物によるステロールの生産を増大させることができる。ステロール生産の増大としては、ステロール生産量の増大、ステロール生産速度の増大、ステロール収率の増大が挙げられる。ステロール生産量の増大としては、菌体重量当たりのステロール生産量の増大や、培養液量当たりのステロール生産量の増大が挙げられる。また、ステロール生産の増大としては、ステロールの総生産量に対する目的のステロールの生産量の比率の増大も挙げられる。ステロールの総生産量に対する目的のステロールの生産量の比率は、例えば、50%(w/w)以上、70%(w/w)以上、80%(w/w)以上、85%(w/w)以上、90%(w/w)以上、95%(w/w)以上、97%(w/w)以上、または99%(w/w)以上であってよい。具体的には、DHCR24の活性低下により、植物ステロールおよび/または真菌ステロールの生産を増大させることができる。また、具体的には、DHCR7の活性低下により、プロビタミンD類の生産を増大させることができる。また、具体的には、SMT1の活性低下により、動物ステロールの生産を増大させることができる。
本発明の微生物は、ステロール生産能が損なわれない限り、さらに、その他の改変を有していてもよい。その他の改変としては、ステロール生産能が増強される改変が挙げられる。その他の改変として、具体的には、ステロールC−22デサチュラーゼ(sterol C-22 desaturase)の活性の低下、DHCR24の活性の増大、およびDHCR7の活性の増大が挙げられる。これらの改変により、ステロール生産能が増強され得る。これらの改変は、製造するステロールの種類等の諸条件に応じて適宜選択できる。これらの改変は、単独で、あるいは適宜組み合わせて、利用することができる。すなわち、本発明の微生物は、これらの改変から選択される1つまたはそれ以上の改変を有していてよい。
以下に、DHCR24、DHCR7、SMT1、sterol C-22 desaturase等のタンパク質の活性を低下させる手法について説明する。
以下に、DHCR24やDHCR7等のタンパク質の活性を増大させる手法について説明する。
本発明の方法は、本発明の微生物を培地で培養すること、および前記培養により生成した菌体からステロールを回収すること、を含む、ステロールの製造方法である。本発明の方法においては、1種のステロールが製造されてもよく、2種またはそれ以上のステロールが製造されてもよい。本発明の微生物が有する改変と製造されるステロールの組み合わせの例は、ステロール生産能の説明において上述した通りである。
沖縄県の川の水を含んだ葉の腐敗物のサンプルを採取した。サンプルに松の花粉(宮崎県で採取)を適量添加し、室温で8日間静置した。0.5×人工海水で調製した0.1×ライヒマニ保存用培地(ニッスイ)に終濃度がそれぞれ50mg/LとなるようにペニシリンGカルシウムやストレプトマイシン硫酸塩を加え、さらに終濃度がそれぞれ2mg/L、0.01mg/L、0.01mg/LとなるようにビタミンB1(ナカライ)、ビタミンB2(ナカライ)、及びビタミンB12(ナカライ)を加えた培地のプレートに、前記静置後のサンプルを100μl播種した。各々のプレートを、28℃で4日間培養し、得られたコロニーを同培地で画線分離し、コロニーの純化を実施した。このようにして取得した株をAJ7869株(FERM BP-22342)と命名した。また、同様の手順で、AJ7868株(FERM BP-22290)を得た(WO2017/065293)。また、同様の手順で、AJ7879株(FERM BP-22367)を得た。尚、1×ライヒマニ保存用培地(ニッスイ)と1×人工海水の組成は以下のとおりである。
酵母エキス 8.5 g
ペプトン 8.5 g
グルコース 11 g
リン酸二水素カリウム 2.0 g
トマトジュース末 3.7 g
ポリソルベート80 1.0 g
寒天 15 g
超純水 1000 ml
NaCl 30 g
KCl 0.7 g
MgCl2・6H2O 10.8 g
MgSO4・7H2O 5.4 g
CaCl2・2H2O 1 g
超純水 1000 ml
上記のようにして単離されたAJ7869株について、ラビリンチュラの18S rDNA領域増幅用ユニバーサルプライマー(配列番号1、2)を用いて、18S rDNA領域の塩基配列を決定した。また、AJ7868株及びAJ7879株について、イルミナ社製のMiseqによる解析から18SrDNA領域の塩基配列を決定した。AJ7869株の18S rDNA領域の塩基配列を、配列番号3に示す。AJ7868株の18S rDNA領域の塩基配列を、配列番号43に示す。AJ7879株の18S rDNA領域の塩基配列を、配列番号44に示す。AJ7869株、AJ7868株、及びAJ7879株の18S rDNAは、いずれも、Aurantiochytrium sp. BURABG162株(配列番号4)、Aurantiochytrium sp. SKE217株(配列番号5)、及びAurantiochytrium sp. SKE218株(配列番号6)の18S rDNAの塩基配列とそれぞれ99%、98%、及び99%の高い同一性を示した。上記の3株は上田らの報告でAurantiochytrium sp.1に属することが報告されている(Mayumi Ueda, et al., Seasonal dynamics of culturable thraustochytrids (Labyrinthulomycetes, Stramenopile) in estuarine and coastal waters., Aquatic Microbial Ecology. 2015 ;74:187-204)。この結果、AJ7869株、AJ7868株、及びAJ7879株はAurantiochytrium sp.1と類縁関係にあることが明らかになったため、これらの株を、それぞれ、Aurantiochytrium sp.1 AJ7869株、AJ7868株、及びAJ7879株と命名した。
AJ7869株を親株として、以下の手順で、smt1遺伝子(配列番号7)の欠損株を構築した。
(A区)
グルコース 30 g/L
(B区)
酵母エキス 10 g/L
(C区)
ビタミンB1 2 mg/L
ビタミンB2 0.01 mg/L
ビタミンB12 0.01 mg/L
(D区)
PIPES 13.6 g/L
B区はHClを用いてpH6.5に調整した後、A区はpH無調整にて、それぞれ120℃で10分オートクレーブした。D区はNaOHを用いてpH6.5に調整した後、C区はpH無調整にて、それぞれフィルター濾過を行った。A区とB区を室温に冷却後、4区を混合した。
(A区)
グルコース 50 g/L
(B区)
トリプトン 10 g/L
酵母エキス 5 g/L
(C区)
ビタミンB1 2 mg/L
ビタミンB2 0.01 mg/L
ビタミンB12 0.01 mg/L
(D区)
PIPES 13.6 g/L
B区はHClを用いてpH6.5に調整した後、A区はpH無調整にて、それぞれ120℃で10分オートクレーブした。D区はNaOHを用いてpH6.5に調整した後、C区はpH無調整にて、それぞれフィルター濾過を行った。A区とB区を室温に冷却後、4区を混合した。
AJ7869株とAJ7870株を親株として、以下の手順で、dhcr7遺伝子(配列番号18)の欠損株を構築した。
AJ7869株を親株として、以下の手順で、dhcr24遺伝子(配列番号29)の欠損株を構築した。
AJ7879株およびAJ7868株を親株として、以下の手順で、smt1遺伝子(配列番号55)の欠損株を構築した。
AJ7870を親株として、以下の手順で、dhcr24遺伝子(配列番号29)とdhcr7遺伝子(配列番号18)の二重強化株を構築した。
AJ7882株(dhcr24遺伝子とdhcr7遺伝子の二重発現強化株)を親株として、以下の手順で、sterol C-22 desaturaseをコードするcyp710a遺伝子(配列番号41)の欠損株を構築した。
配列番号1〜2:プライマー
配列番号3:Aurantiochytrium sp.1 AJ7869株の18S rDNA領域の塩基配列
配列番号4:Aurantiochytrium sp.1 BURABG162株の18S rDNA領域の塩基配列
配列番号5:Aurantiochytrium sp.1 SKE217株の18S rDNA領域の塩基配列
配列番号6:Aurantiochytrium sp.1 SKE218株の18S rDNA領域の塩基配列
配列番号7:Aurantiochytrium sp.1 AJ7869株のSMT1遺伝子の塩基配列
配列番号8〜17:プライマー
配列番号18:Aurantiochytrium sp.1 AJ7869株のDHCR7遺伝子の塩基配列
配列番号19〜28:プライマー
配列番号29:Aurantiochytrium sp.1 AJ7869株のDHCR24遺伝子の塩基配列
配列番号30〜37:プライマー
配列番号38:Aurantiochytrium sp.1 AJ7869株のSMT1のアミノ酸配列
配列番号39:Aurantiochytrium sp.1 AJ7869株のDHCR7のアミノ酸配列
配列番号40:Aurantiochytrium sp.1 AJ7869株のDHCR24のアミノ酸配列
配列番号41:Aurantiochytrium sp.1 AJ7869株のcyp710a遺伝子の塩基配列
配列番号42:Aurantiochytrium sp.1 AJ7869株のCYP710Aのアミノ酸配列
配列番号43:Aurantiochytrium sp.1 AJ7868株の18S rDNA領域の塩基配列
配列番号44:Aurantiochytrium sp.1 AJ7879株の18S rDNA領域の塩基配列
配列番号45:ネオマイシン耐性遺伝子‐dhcr7遺伝子発現カセットの塩基配列
配列番号46:ゼオシン耐性遺伝子‐dhcr24遺伝子の発現カセットの塩基配列
配列番号47〜54:プライマー
配列番号55:Aurantiochytrium sp.1 AJ7868株およびAJ7879株のSMT1遺伝子の塩基配列
配列番号56:Aurantiochytrium sp.1 AJ7868株およびAJ7879株のSMT1のアミノ酸配列
Claims (22)
- ラビリンチュラ類微生物であって、
ステロール生産能を有し、
オーランチオキトリウム(Aurantiochytrium)sp.1であり、
24−デヒドロコレステロールレダクターゼの活性が非改変株と比較して低下するように改変されており、
前記ステロールが、植物ステロールおよび真菌ステロールから選択される少なくとも1種のステロールである、微生物。 - 24−デヒドロコレステロールレダクターゼをコードする遺伝子の発現を低下させることにより、または該遺伝子を破壊することにより、24−デヒドロコレステロールレダクターゼの活性が低下した、請求項1に記載の微生物。
- 24−デヒドロコレステロールレダクターゼのアミノ酸配列の一部または全部の欠失により、24−デヒドロコレステロールレダクターゼの活性が低下した、請求項1または2に記載の微生物。
- 前記ステロールが、スティグマステロールおよび/またはブラシカステロールである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の微生物。
- ラビリンチュラ類微生物であって、
ステロール生産能を有し、
オーランチオキトリウム(Aurantiochytrium)sp.1であり、
7−デヒドロコレステロールレダクターゼの活性が非改変株と比較して低下するように改変されており、
前記ステロールが、7−デヒドロコレステロールおよび/またはエルゴステロールである、微生物。 - 7−デヒドロコレステロールレダクターゼをコードする遺伝子の発現を低下させることにより、または該遺伝子を破壊することにより、7−デヒドロコレステロールレダクターゼの活性が低下した、請求項5に記載の微生物。
- 7−デヒドロコレステロールレダクターゼのアミノ酸配列の一部または全部の欠失により、7−デヒドロコレステロールレダクターゼの活性が低下した、請求項5または6に記載の微生物。
- さらに、ステロール24−C−メチルトランスフェラーゼの活性が非改変株と比較して低下するように改変されている、請求項5〜7のいずれか一項に記載の微生物。
- ラビリンチュラ類微生物であって、
ステロール生産能を有し、
オーランチオキトリウム(Aurantiochytrium)sp.1であり、
ステロール24−C−メチルトランスフェラーゼの活性が非改変株と比較して低下するように改変されており、
前記ステロールが、動物ステロールから選択される少なくとも1種のステロールである、微生物。 - 前記ステロール24−C−メチルトランスフェラーゼが、下記(a)、(b)、または(c)に記載のタンパク質である、請求項8または9に記載の微生物:
(a)配列番号38または56に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(b)配列番号38または56に示すアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、ステロール24−C−メチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質;
(c)配列番号38または56に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、ステロール24−C−メチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。 - ステロール24−C−メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の発現を低下させることにより、または該遺伝子を破壊することにより、ステロール24−C−メチルトランスフェラーゼの活性が低下した、請求項8〜10のいずれか一項に記載の微生物。
- ステロール24−C−メチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列の一部または全部の欠失により、ステロール24−C−メチルトランスフェラーゼの活性が低下した、請求項8〜11のいずれか一項に記載の微生物。
- 前記ステロールが、コレステロールおよび/または7−デヒドロコレステロールである、請求項9〜12のいずれか一項に記載の微生物。
- 前記ステロールが、コレステロールである、請求項9〜13のいずれか一項に記載の微生物。
- さらに、下記性質(A)、(B)、および(C)から選択される少なくとも1つの性質を有する、請求項9〜14のいずれか一項に記載の微生物:
(A)前記微生物が、ステロールC−22デサチュラーゼの活性が非改変株と比較して低下するように改変されている;
(B)前記微生物が、24−デヒドロコレステロールレダクターゼの活性が非改変株と比較して増大するように改変されている;
(C)前記微生物が、7−デヒドロコレステロールレダクターゼの活性が非改変株と比較して増大するように改変されている。 - 前記ステロールC−22デサチュラーゼが、下記(a)、(b)、または(c)に記載のタンパク質である、請求項15に記載の微生物:
(a)配列番号42に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(b)配列番号42に示すアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、ステロールC−22デサチュラーゼ活性を有するタンパク質;
(c)配列番号42に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、ステロールC−22デサチュラーゼ活性を有するタンパク質。 - 前記24−デヒドロコレステロールレダクターゼが、下記(a)、(b)、または(c)に記載のタンパク質である、請求項1〜4、15、および16のいずれか一項に記載の微生物:
(a)配列番号40に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(b)配列番号40に示すアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、24−デヒドロコレステロールレダクターゼ活性を有するタンパク質;
(c)配列番号40に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、24−デヒドロコレステロールレダクターゼ活性を有するタンパク質。 - 前記7−デヒドロコレステロールレダクターゼが、下記(a)、(b)、または(c)に記載のタンパク質である、請求項5〜8および15〜17のいずれか一項に記載の微生物:
(a)配列番号39に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(b)配列番号39に示すアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、7−デヒドロコレステロールレダクターゼ活性を有するタンパク質;
(c)配列番号39に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、7−デヒドロコレステロールレダクターゼ活性を有するタンパク質。 - 18S rDNAの塩基配列が、配列番号3に対して97%以上の同一性を有する、請求項1〜18のいずれか一項に記載の微生物。
- Aurantiochytrium sp.1 AJ7869株(FERM BP-22342)、AJ7868株(FERM BP-22290)、またはAJ7879株(FERM BP-22367)に由来する改変株である、請求項1〜19のいずれか一項に記載の微生物。
- ステロールの製造方法であって、
請求項1〜20のいずれか一項に記載の微生物を培地で培養すること、および
前記培養により生成した菌体から前記ステロールを回収すること、
を含む、方法。 - 前記ステロールが、遊離型のステロール、ステロールエステル、ステリルグルコシド、アシルステリルグルコシド、またはそれらの混合物である、請求項21に記載の方法。
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