CZ20012792A3 - Polypeptid, polynukleotid kódující polypeptid, expresní vektor, transformant a způsob přípravy - Google Patents
Polypeptid, polynukleotid kódující polypeptid, expresní vektor, transformant a způsob přípravy Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20012792A3 CZ20012792A3 CZ20012792A CZ20012792A CZ20012792A3 CZ 20012792 A3 CZ20012792 A3 CZ 20012792A3 CZ 20012792 A CZ20012792 A CZ 20012792A CZ 20012792 A CZ20012792 A CZ 20012792A CZ 20012792 A3 CZ20012792 A3 CZ 20012792A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- polypeptide
- chloro
- butyl
- target
- dihydroxyhexanoate
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 80
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 78
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 77
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 title claims description 51
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 title claims description 51
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 title claims description 51
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 title claims description 19
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 45
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 44
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 25
- FIKPWJZUGTVXCO-SFYZADRCSA-N tert-butyl (3r,5s)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoate Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CCl FIKPWJZUGTVXCO-SFYZADRCSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 238000007792 addition Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 45
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 45
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 44
- UXNDSXNDEPGLAY-VIFPVBQESA-N butyl (5s)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoate Chemical compound CCCCOC(=O)CC(=O)C[C@H](O)CCl UXNDSXNDEPGLAY-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 27
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 25
- POXZJNFSZVURGY-BDAKNGLRSA-N butyl (3r,5s)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoate Chemical compound CCCCOC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CCl POXZJNFSZVURGY-BDAKNGLRSA-N 0.000 claims description 24
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 24
- 108010050375 Glucose 1-Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 22
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 claims description 17
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 claims description 16
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 14
- 241000222292 [Candida] magnoliae Species 0.000 claims description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 6
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 claims description 4
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 claims description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 claims description 2
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 claims 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 56
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 49
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 26
- WLRFCPQXWBDLRG-QMMMGPOBSA-N tert-butyl (5s)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoate Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)CC(=O)C[C@H](O)CCl WLRFCPQXWBDLRG-QMMMGPOBSA-N 0.000 abstract description 8
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 21
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 16
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 14
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 13
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 12
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 description 11
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 108010029645 galactitol 2-dehydrogenase Proteins 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- 102100031126 6-phosphogluconolactonase Human genes 0.000 description 8
- 108010000445 Glycerate dehydrogenase Proteins 0.000 description 8
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 7
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 6
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 6
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 6
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 4
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical class N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- 108010053229 Lysyl endopeptidase Proteins 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 101150019455 gdh gene Proteins 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 2
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- WMBWREPUVVBILR-WIYYLYMNSA-N (-)-Epigallocatechin-3-o-gallate Chemical compound O([C@@H]1CC2=C(O)C=C(C=C2O[C@@H]1C=1C=C(O)C(O)=C(O)C=1)O)C(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 WMBWREPUVVBILR-WIYYLYMNSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RLSSGSSUNJVPLJ-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-3,5-dihydroxyhexanoic acid Chemical compound ClC(C(=O)O)C(CC(C)O)O RLSSGSSUNJVPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BDCLDNALSPBWPQ-UHFFFAOYSA-N 3-oxohexanoic acid Chemical compound CCCC(=O)CC(O)=O BDCLDNALSPBWPQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010029731 6-phosphogluconolactonase Proteins 0.000 description 1
- 241000590020 Achromobacter Species 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 102000005369 Aldehyde Dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108020002663 Aldehyde Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical class [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 1
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M Fluoride anion Chemical compound [F-] KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108090000698 Formate Dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- WMBWREPUVVBILR-UHFFFAOYSA-N GCG Natural products C=1C(O)=C(O)C(O)=CC=1C1OC2=CC(O)=CC(O)=C2CC1OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 WMBWREPUVVBILR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010018962 Glucosephosphate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000002794 Glucosephosphate Dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 229940121710 HMGCoA reductase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108010020056 Hydrogenase Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 101100401686 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) mis19 gene Proteins 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 1
- 101150056072 TUFB gene Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 239000012024 dehydrating agents Substances 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- FESAXEDIWWXCNG-UHFFFAOYSA-N diethyl(methoxy)borane Chemical compound CCB(CC)OC FESAXEDIWWXCNG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 239000002471 hydroxymethylglutaryl coenzyme A reductase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Chemical class 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- OAHKWDDSKCRNFE-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl chloride Chemical compound ClS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 OAHKWDDSKCRNFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940096701 plain lipid modifying drug hmg coa reductase inhibitors Drugs 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 101150079601 recA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 101150099542 tuf gene Proteins 0.000 description 1
- 101150071165 tuf1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150010742 tuf2 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
- C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
- C07K14/40—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts from Candida
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
- C12P41/002—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by oxidation/reduction reactions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/62—Carboxylic acid esters
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
TRANSFORMANT A ZPŮSOB PŘÍPRAVY
Oblast techniky
Předmětný vynález se vztahuje k novému polypeptidu, genu kódujícímu polypeptid, expresnímu vektoru pro expresi polypeptidu, transformantu získanému transformováním hostitelské buňky pomocí expresního vektoru a způsobu přípravy sloučeniny, která je užitečná jako materiál pro syntézu léků a pesticidů, použitím transformantu. Konkrétněji se předmětný vynález vztahuje k polypeptidu izolovanému z mikroorganismu, který má enzymovou aktivitu asymetricky redukovat terč, butyl (S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoát na terč, butyl (3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoát, k polynukleotidu kódujícímu polypeptid, k expresnímu vektoru včetně polynukleotidu a k transformantu transformovanému expresním vektorem.
Dosavadní stav techniky
Předmětný vynález se také vztahuje ke způsobu přípravy terč, butyl (3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoátu. Způsob zahrnuje kroky, kterými jsou reagování transformantu nebo jeho procesního produktu s terč, butyl (S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoátem a shromáždění produkovaného terč, butyl (3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoátu.
Terč, butyl (3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoát je sloučenina, která je užitečná jako materiál pro syntézu léků a pesticidů, konkrétně inhibitorů HMG-CoA reduktasy.
Způsob přípravy terč, butyl (3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoátu asymetrickým redukováním terč, butyl (S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoátu, který byl uveden, používá pouze diethylmethoxyboran a tetrahydroboritan sodný (US patent č. 52 783 131). Problémy s touto technikou spočívají v tom, že je vyžadována reakční nádoba pro reakci při velmi nízké teplotě, která dosahuje až -78 °C. Proto musí být použity drahé materiály apod. Existuje zde tedy požadavek na reakční postup v praxi.
Podstata vynálezu
Autoři předmětného vynálezu nalezli polypeptid mikrobiálního původu, který asymetricky redukuje terč, butyl (S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoát za vzniku terč, butyl (3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoátu, naznačili způsob, kterým může být účinně
♦ · produkován terč, butyl (3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoát a případně dosáhli předmětného vynálezu.
Předmětem předmětného vynálezu je poskytnout polypetid, který je schopen asymetricky redukovat terč, butyl (S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoát za vzniku terč, butyl (3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoátu. Jiným předmětem předmětného vynálezu je poskytnout způsob účinné produkce polypeptidu pomocí rekombinantní DNA technologie. Ještě jiným předmětem předmětného vynálezu je poskytnout tranformant, který může produkovat zmíněný polypeptid a současně poskytnout polypetid, který má glukosadehydrogenasovou aktivitu. Ještě jiným předmětem předmětného vynálezu je poskytnout praktický způsob přípravy terč, butyl (3R, 5S)-6-chloro-3,5-díhydroxyhexanoátu pomocí transformantu.
Předmětný vynález se vztahuje k polypeptidu, který má enzymovou aktivitu asymetricky redukovat terč, butyl (S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoát na terč, butyl (3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoát. Polypetid obsahuje aminokyselinovou sekvenci reprezentovanou v seznamu sekvencí sekvencí s identifikačním číslem 1 (SEQ ID NO. 1) nebo aminokyselinovou sekvenci, která má substituci, inserci, deleci nebo adici alespoň jedné aminokyseliny.
Peptid může výhodněji pocházet z mikroorganismu, který patří do rodu Candida. Ještě výhodněji může být mikroorganismem Candida magnoliae IFO 0705.
Z jednoho hlediska se předmětný vynález vztahuje k polynukleotidu, který kóduje výše popsaný polypeptid.
Z jednoho hlediska se předmětný vynález vztahuje k polynukleotidu, který kóduje polypeptid, který má enzymovou aktivitu asymetricky redukovat terč, butyl (S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoát na terč, butyl (3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoát. Polynukleotid je za stringentních podmínek hybridizován s nukleotidovou sekvencí, která je reprezentována v seznamu sekvencí SEQ ID NO. 2.
Z jednoho hlediska se předmětný vynález vztahuje k expresnímu vektoru, který zahrnuje výše popsaný polynukleotid. Expresním vektorem může výhodněji být plasmid pNTCR.
V jednom provedení může výše popsaný expresní vektor dále zahrnovat polynukleotid kódující polypeptid, který má glukosadehydrogenasovou aktivitu.
Polypeptidem, který má glukosadehydrogenasovou aktivitu, může být výhodněji glukosadehydrogenasa pocházející z mikroorganismu Bacillus megaterium.
Expresním vektorem může být výhodněji plasmid pNTCRG.
Z jednoho hlediska se předmětný vynález vztahuje k transformantu získanému transformováním hostitelské buňky pomocí výše popsaného expresního vektoru.
• · ·
Hostitelskou buňkou může být výhodněji Escherichia coli. Ještě výhodněji může transformant být E. coli HB101 (pNTCR) nebo E. coli HB101 (pNTCRG).
Z jednoho hlediska se předmětný vynález vztahuje ke způsobu produkce terč, butyl (3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoátu. Způsob zahrnuje kroky, kterými jsou reakce výše popsaného transformantu a/nebo jeho procesního produktu s terč, butyl (S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoátem a shromáždění produkovaného terč, butyl (3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoátu.
Krok zahrnující reakci je výhodněji proveden v přítomnosti systému regenerujícího koenzym.
Předmětný vynález bude dále popsán podrobněji. Jako polypeptid předmětného vynálezu může být použit jakýkoliv polypeptid, který má enzymovou aktivitu asymetricky redukovat terč, butyl (S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoát podle vzorce (I.) za vzniku terč, butyl (3R, 5S)-6chloro-3,5-dihydroxyhexanoátu podle vzorce (II.)
OH 0
COOtBu (O terč, butyl (S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoát
OH OH
Cl
terč, butyl (3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoát
Mezi příklady těchto polypeptidů patří polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedenou v seznamu sekvencí jako SEQ ID NO. 1 a polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci, která má substituci, inserci, deleci nebo adici alespoň jedné aminokyseliny nebo její část a který má enzymovou aktivitu asymetricky redukovat terč, butyl (S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoát za vzniku terč, butyl (3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoátu.
Polypeptid předmětného vynálezu může být získán z mikroorganismu, který má aktivitu asymetricky redukovat terč, butyl (S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoát za vzniku terč, butyl (3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoátu. Mikroorganismus použitý jako zdroj polypeptidů může tedy být, ale není tím jakkoliv limitován, kvasinka (rod Candida) a nej výhodněji pak Candida magnoliae IFO 0705. Tento kmen byl mikroorganismus prvně uložený pod číslem CBS166 ve sbírce Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS; Oosterstraat 1, Postbus 273,
NL-3740 AG Baarn, Nizozemsko) a isolace a vlastnosti tohoto kmene jsou popsány v „The
Yeasts, a Taxonomie Study. 3. vyd., str. 731 (1984)“. Mikroorganismy, které produkují polypeptidy podle předmětného vynálezu, mohou být divoké nebo to mohou být typy varianty • · · ♦ • 9 9 · • · ·♦
9 9 kmene. Příležitostně mohou být použity geneticky upravené mikroorganismy (pomocí buněčné fuze, genové manipulace atd.). Mikroorganismy geneticky upravené tak, aby produkovaly peptidy podle předmětného vynálezu, je možno získat způsobem, který zahrnuje následující kroky: isolaci a/nebo přečištění těchto enzymů a stanovení jejich úplné nebo částečné aminokyselinové sekvence; určení nukleotidových sekvencí kódujících polypeptidy na bázi jejich aminokyselinových sekvencí; získání nukleotidových sekvencí kódujících polypeptidy na bázi jejich aminokyselinových sekvencí; začlenění nukleotidových sekvencí do jiných mikroorganismů s cílem získat rekombinantní mikroorganismy; a kultivaci rekombinantních mikrorganismů s cílem získat enzymy podle předmětného vynálezu.
Kultivačním médiem pro mikroorganismy produkující polypeptidy podle předmětného vynálezu může být libovolné kapalné nutriční médium obsahující typický zdroj uhlíku, dusíku, minerálních solí, organických živin apod., které umožňují mikroorganismům růst.
Termín „mikrobiální kultura“, který je zde používán, se vztahuje k mikroorganismu samotnému nebo ke kapalné kultuře obsahující mikroorganismus a „jeho procesní produkt“ se vztahuje k produktu, který je získán extrakcí nebo přečištěním mikroorganismu samotného nebo kapalné kultury obsahující mikrorganismus.
Polypeptidy podle předmětného vynálezu mohou být přečištěny od mikroorganismů obsahujících polypeptidy pomocí vhodných postupů. Například, mikroorganismus je kultivován ve vhodném médiu a kultura je odstředěna. Cílem je mikroorganismus sklidit. Mikroorganismus je dezintegrován např. v zařízení Dyno milí (výrobce Willy A., Bachofen Co., Ltd.) a poté je odstředěn. Cílem tohoto kroku je odstranit buněčné zbytky a tím získat bezbuněčný extrakt. Bezbuněčný extrakt je poté podroben technikám jako jsou např. vysolování (např. srážení síranem amonným a srážení fosforečnanem sodným), srážení rozpouštědlem (frakcionace proteinů acetonem, ethanolem apod.), dialýza, gelová filtrace, ionexová chromatografie, kolonová chromatografie (např. chromatografie na reversní fázi) a ultrafiltrace. Techniky mohou být použity jednotlivě nebo v kombinaci jedna s druhou. Jejich úkolem je přečistit polypeptidy. Enzymová aktivita může být stanovena měřením poklesu absorbance při vlnové délce 340 nm při teplotě 30 °C, kdy jsou ke 100 mM fosfátovému pufru (pH 6,5) přidány 5 mM terč, butyl (S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoát jako substrát, 0,33 mMNADPHjako koenzym a enzym.
Polypeptidy předmětného vynálezu mohou zahrnovat aminokyselinovou sekvenci uvedenou v seznamu sekvencí jako SEQ ID NO. 1. Polypeptidy, které mají aminokyselinovou
• · ·
·· · sekvenci se substitucí, insercí, delecí nebo adicí alespoň jedné aminokyseliny nebo její část a které mají enzymovou aktivitu asymetricky redukovat terč, butyl (S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoát na terč, butyl (3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoát, mohou být připraveny z polypeptidu, který má aminokyselinovou sekvenci uvedenou v seznamu sekvencí jako SEQ ID NO. 1, známým způsobem, který je popsán v Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc,,1989) apod. Do rozsahu předmětného vynálezu spadá libovolný polypeptid, který má enzymovou aktivitu asymetricky redukovat terč, butyl (S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoát na terč, butyl (3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoát.
Polynukleotidem předmětného vynálezu může být libovolný polynukleotid kódující jakýkoliv z výše popsaných polypeptidů. Příkladem polynukleotidu předmětného vynálezu je polynukleotid, který má nukleotidovou sekvenci v seznamu sekvencí uvedenou jako SEQ ID NO. 2 a polynukleotid, který je schopen za stringentních podmínek s tímto polynukleotidem hybridizovat.
Polynukleotid, který je schopen za stringentních podmínek hybridizovat s polynukleotidem, který má nukleotidovou sekvenci uvedenou v seznamu sekvencí jako SEQ ID NO. 2, značí polynukleotid získaný hybridizací kolonií, hybridizací plaků, southem hybridizací apod. a to tehdy, je-li nukleotidová sekvence SEQ ID NO. 2 použita jako DNA próba. Podrobněji, polynukleotid může být identifikován následujícím způsobem. Filtr, na který jsou imobilizovány polynukleotidy pocházející z kolonie nebo plaku, je podroben hybridizací s nukleotidovou sekvencí SEQ ID NO. 2 v 0,7 až 1,0 M NaCl při teplotě 65 °C a poté je filtr promyt při teplotě 65 °C roztokem SSC, který má 0,1 až 2 násobnou koncentraci (jedno násobná koncentrace roztoku SSC obsahuje 150 mM chlorid sodný a 15 mM citrát sodný).
Hybridizace může být provedena v souladu s postupem, který je popsán v Molecular Cloning, A Laboratory Manual, druhé vydání (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) apod. Konkrétněji, mezi příklady polynukleotidu, který je schopen výše popsané hybridizace, patří polynukleotid, který má alespoň 60% sekvenční totožnost s nukleotidovou sekvencí SEQ ID NO. 2, výhodněji alespoň 80% sekvenční totožnost, ještě výhodněji alespoň 90% sekvenční totožnost, ještě více výhodněji alespoň 95% sekvenční totožnost a nejvýhodněji alespoň 99% sekvenční totožnost.
Polynukleotidy předmětného vynálezu kódující polypeptidy, které mají enzymovou aktivitu asymetricky redukovat terč, butyl (S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoát na terč, butyl (3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoát, zahrnují polynukleotidy, který má alespoň 60% sekvenční totožnost s nukleotidovou sekvencí SEQ ID NO. 2, výhodněji alespoň 80% sekvenční totožnost, ještě výhodněji alespoň 90% sekvenční totožnost, ještě více výhodněji alespoň 95%
·
• 9 ♦
»*· ·· sekvenční totožnost a nej výhodněji alespoň 99% sekvenční totožnost a to do té míry dokud mají kódované polypeptidy výše popsanou enzymovou aktivitu. Termín „sekvenční totožnost“ znamená, že dvě polynukleotidové sekvence, které jsou porovnávány, jsou totožné a procento (%) sekvenční totožnosti mezi dvěma polynukleotidy, které jsou porovnávány, je vypočítáno následovně. Nejdříve jsou dvě polynukleotidové sekvence, které jsou porovnávány, optimálním způsobem seřazeny. Je spočítán počet míst, ve kterých je přítomna stejná báze nukleové kyseliny (např. A, T, C, G, U nebo I) v obou sekvencích (počet shodných míst) a počet shodných míst je vydělen celkovým počtem bází nukleové kyseliny v polynukleotidu. Výsledná hodnota je vynásobena 100. Sekvenční totožnost může být vypočítána pomocí následujícího programu pro sekvenční analýzu, např: Unix-based GCG Wisconsin Package (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, září 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, Wisconsin, USA53711; Rice P. (1996) Program Manual for EGCG Package, Peter Rice, The Sanger Centre, Hinxton Halí, Cambridge,CB10 IRQ, Velká Británie) a ExPASy World Wide Web server pro molekulární biologii (Geneva University Hospital a University of Geneva, Ženeva, Švýcarsko).
Polynukleotidy předmětného vynálezu mohou být získány z mikroorganismů, které mají enzymovou aktivitu asymetricky redukovat terč, butyl (S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoát na terč, butyl (3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoát. Mikroorganismem, který je použit jako zdroj polynukleotidu, může být, ale není tím nijak limitován, kvasinka (rod Candida) a nejvýhodněji Candida magnoliae IFO 0705.
Dále bude popsán způsob přípravy polynukleotidu předmětného vynálezu z mikroorganismů, které mají enzymovou aktivitu asymetricky redukovat terč, butyl (S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoát na terč, butyl (3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoát. Předmětný vynález není omezen pouze na toto.
Nejdříve jsou aminokyselinové sekvence přečištěného polypeptidu a peptidové fragmenty získané naštěpením polypeptidu příslušnou endopeptidasou sekvenovány postupem podle Edmana. Na základě informací o aminokyselinové sekvenci je syntetizován nukleotidový primer. Potom je z mikroorganismu připravena chromozomální DNA ze které pochází polynukleotid. K tomu je použit klasický způsob isolace nukleotidu (např. způsob podle Hereforda popsaný v Cell, 18, 1261 (1979)). Pomocí výše popsaného nukleotidového primerů a této chromozomální DNA jakožto templátu je provedeno PCR, jehož cílem je amplifikovat část polypeptidového genu. Amplifikovaná část polypeptidového genu je označena způsobem náhodného značení primerů, který je popsán např. v Anal. Biochem., 132, 6 (1983) s cílem připravit nukleotidovou próbu. Chromozomální DNA mikroorganismu je naštěpena příslušným restrikčním enzymem.
• φ φφ • · « ~ Φ Φ ·· / φφφ φ φ φ φφ φφ
Výsledné fragmenty jsou začleněny do vektoru, který je začleněn do příslušné hostitelské buňky, čímž je vytvořena DNA knihovna chromozomální DNA mikroorganismu.Tato DNA knihovna je testována pomocí výše popsané nukleotidové próby v souladu s postupem hybridizace kolonií, hybridizace plaků nebo podobných, čímž je získána DNA včetně polypeptidového genu. Nukleotidová sekvence takto získaného DNA fragmentu včetně polypetidového genu může být sekvenována dideoxy sekvenační metodou, metodou dideoxyřetězové terminace nebo podobnými. Sekvenování nukleotidové sekvence může být provedeno například pomocí soupravy ABI PRISM Dye Terminátor Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (výrobce Perkin Elmer Co., Ltd.) a sekvenátoru ABI 373 A DNA Sequencer (výrobce Perkin Elmer Co., Ltd.).
Vektory pro začlenění polynukleotidu předmětného vynálezu do hostitelských mikroorganismů, ve kterých jsou polynukleotidy exprimovány, mohou být jakékoliv vektory, kdy může být enzymový gen v příslušném hostitelském mikroorganismu exprimován. Mezi příklady těchto vektorů patří plasmidový vektor, fágový vektor a kosmidový vektor. Může být použit kyvadlový vektor, který může vyměnit gen mezi hostitelskými kmeny. Tento vektor většinou zahrnuje kontrolní prvek, jako je promotor lacUV5, trp promotor, trc promotor, tac promotor, lpp promotor, tufB promotor, recA promotor nebo pL promotor a je výhodněji používán jako expresní vektor včetně expresní jednotky operativně připojené k polynukleotidu předmětného vynálezu.
Termín „kontrolní prvek“, který je zde používán, se vztahuje k funkčnímu promotoru a nukleotidové sekvenci, která má přičleněný jakýkoliv transkripční prvek (např. zesilovač, CCAAT box, TATA box, SPI místo).
Výraz „operativně připojený“, který je zde používán, se vztahuje ktomu, že polynukleotid je spojen s kontrolními prvky, jako je promotor a zesilovač, které kontrolují expresi polynukleotidu tím způsobem, že kontrolní prvky mohou fungovat tak, aby byl gen exprimován. Odborníkům v dané oblasti techniky je dobře známé, že typy kontrolních prvků se mohou v závislosti na hostitelské buňce lišit.
Mezi příklady hostitelských buněk, do nichž je začleňován vektor, který má polynukleotid předmětného vynálezu, patří bakterie, kvasinky, plísně, rostlinné buňky a živočišné buňky. Konkrétně je výhodnější Escherichia coli. Polynukleotid předmětného vynálezu může být začleněn do hostitelské buňky pomocí vhodných postupů. Je-li jako hostitelská buňka použita E. coli, může být polynukleotid předmětného vynálezu začleněn např. pomocí postupu s použitím chloridu vápenatého.
Při přípravě terč, butyl (3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoátu asymetrickou redukcí terč, butyl (S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoátu pomocí polypeptidu předmětného vynálezu je vyžadován koenzym jako je např. NADPH a NADH. Enzym, který je schopen převést oxidovaný koenzym na redukovaný koenzym (dále uváděno jako schopnost regenerovat koenzym) však může být použit spolu s příslušným substrátem tzn. že v reakci je použit systém pro regeneraci koenzymu v kombinaci s polypetidem předmětného vynálezu, čímž je sníženo množství použitého drahého koenzymu. Mezi příklady enzymů, které mají schopnost regenerovat koenzym patří hydrogenasa, formiátdehydrogenasa, alkoholdehydrogenasa, aldehyddehydrogenasa, glukosa-6-fosfátdehydrogenasa a glukosadehydrogenasa. Výhodněji je používána glukosadehydrogenasa. Tato reakce může být provedena přídavkem systému pro regeneraci koenzymu k asymetrickému reakčnímu systému. Je-li jako katalyzátor použit transformant transformovaný jak polynukleotidem kódujícím polypeptid, který má enzymovou aktivitu asymetricky redukovat terč, butyl (S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoát za vzniku terč, butyl (3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoátu tak i polynukleotidem kódujícím polypeptid, který má glukosadehydrogenasovou aktivitu, mohou být reakce úspěšně provedeny bez přípravy enzymu, který má schopnost regenerovat koenzym a bez přídavku enzymu do reakčního systému. Tento transformant může být získán začleněním polynukleotidu kódujícího polypeptid, který má enzymovou aktivitu asymetricky redukovat terč, butyl (S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoát na terč, butyl (3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoát a polynukleotidu kódujícího polypeptid, který má glukosadehydrogenasovou aktivitu, do stejného vektoru a začleněním tohoto vektoru do hostitelské buňky. Transformant může být získán také začleněním těchto dvou polynukleotidů do dvou vektorů pocházejících z neslučitelných skupin a začleněním těchto polynukleotidů do stejné hostitelské buňky.
Glukosadehydrogenasová aktivita transformantu může být stanovena měřením vzrůstu absorbance při vlnové délce 340 nm při teplotě 25 °C, kdy jsou k 1 M Tris EIC1 pufru (pH 8,0) přidány 0,1 M glukosa jako substrát, 2 mMNADP jako koenzym a enzym.
Příprava terč, butyl (3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoátu pomocí transformantu předmětného vynálezu může být uskutečněna následovně.
Nejdříve jsou terč, butyl (S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoát jako substrát, koenzym jako je NADP a kultura tranformantu nebo jeho procesního produktu přidány do příslušného rozpouštědla a následuje úprava pH. Aby reakce proběhla, je výsledná směs míchána. Reakce je prováděna při teplotě 10 °C až 70 °C a pH reakčního roztoku je udržováno v rozmezí 4 až 10. Reakce je prováděna buď vsádkově nebo kontinuálně. V případě vsádkového uspořádání, je substrát, který má zreagovat, přidán tak, aby byla připravena koncentrace 0,1% hmotn. až 70% hmotn. Procesní produkt transformantu a podobné, které jsou uvedeny výše, se vztahují k surovému extraktu, kultivovaným mikrorganismům, lyofilizovaným organismům, organismům <9
9 9 · » · ··
9 9 · • 9 · ·
vysušeným acetonem, homogenátům těchto mikroorganismů apod. Tyto procesní produkty mohou být použity v situaci, kdy jsou známými způsoby imobilizovány jako enzymy nebo mikroorganismy. Jestliže je reakce provedena pomocí transformantu, který produkuje polypeptid předmětného vynálezu a glukosadehydrogenasy, umožňuje přídavek glukosy do reakčního systému značně snížit množství koenzymů.
Produkovaný terč, butyl (3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoát může být přečištěn příslušnými technikami. Například je terč, butyl (3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoát podroben odstředění, filtraci a jiným postupům, které jsou nutné k odstranění suspendovaných složek jako jsou mikroorganismy. Výsledný produkt je podroben extrakci organickým rozpouštědlem jako je ethylacetát a toluen a je dehydratován dehydratačnim činidlem jako je síran sodný. Organické rozpouštědlo je odstraněno za sníženého tlaku. Výsledný produkt je poté podroben krystalizaci, chromatografii nebo podobným postupům s cílem produkt přečistit.
V reakci je terč, butyl (S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoát jakožto substrát připraven způsobem, který je popsán v US patentu č. 52 783 131, který je zde začleněn jako odkaz.
Kvantifikace terč, butyl (S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoátu a terč, butyl (3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoátu a stanovení diastereomerního poměru terč, butyl (3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoátu mohou být provedeny vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii (kolona: COSMOSIL 5CN-R, 4,6 x 250 mm, výrobce Nacalai Tesque Co., Ltd., eluent: 1 mM fosfát/acetonitril = 5/1, průtok: 0,7 ml/min., detekce: 210 nm, teplota kolony: 30 °C).
Jak je popsáno výše, je podle předmětného vynálezu možno účinně připravit polypeptid předmětného vynálezu. Pomocí tohoto polypeptidu může být poskytnut excelentní způsob přípravy terč, butyl (3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoátu. Dále bude předmětný vynález popsán pomocí ilustrativních příkladů s odkazem na přiložené obrázky. Předmětný vynález není těmito příklady nijak limitován.
Přehled obrázků ve výkresech
Obrázek 1 je schéma ukazující sekvenci polynukleotidu podle předmětného vynálezu a jeho předpokládanou aminokyselinovou sekvenci.
Obrázek 2 je diagram ukazující způsob přípravy rekombinantního plasmidu pNTCRG.
«· ·· • ««44 <· · ·♦ • 4 4 4· • · · · «44 44 ·
Příklady provedení vynálezu
Detaily manipulačních způsobů, které se vztahují k rekombinantním DNA technikám používaným v následujících příkladech, jsou popsány v následujících textech.
Molecular Cloning 2nd Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publíshing Associates and Wiley-Interscience)
Příklad 1 Přečištění polypeptidu, který má enzymovou aktivitu asymetricky redukovat
Polypeptid, který má enzymovou aktivitu asymetricky redukovat terč, butyl (S)-ó-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoát na terč, butyl (3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoát, je z Candida magnoliae IFO 0705 přečištěn jednoduše následujícím způsobem.
Kultivace Candida magnoliae IFO 0705
1 tekutého média, které má níže uvedené složení, bylo připraveno v 30 1 fermentoru (výrobce Marubishi Bioeng Co., Ltd.) a bylo sterilizováno parou při teplotě 120 °C po dobu 20 min.
Složení média: vodovodní voda, glukosa 4,0%, kvasničný extrakt 0,5%, KH2PO4 0,1%, (NH4)2HPO4 0,65%, NaCl 0,1%, MgSO4.7H2O 0,8%, ZnSO4.7H2O 0,06%, FeSO4.7H2O 0,09%, CuSO4.5H2O 0,005%, MnSO4.4-6H2O 0,01% a Adecanol™ LG-109 (výrobce NOF Corporation) 0,02% (pH 7,0).
Výše uvedené médium bylo inokulováno kulturou Candida magnoliae IFO 0705 (180 ml/fermentor), která byla předkultivována v médiu. Kultivace probíhala při teplotě 33 °C za stálého míchání při otáčkách 295 rpm a při rychlosti vzdušnění 5,0 ml/min. Spodní hranice pH byla prostřednictvím přikapávání 30% hmotn. vodného hydroxidu sodného udržována na hodnotě 6,5. 22 h a 25 h po zahájení kultivace bylo přidáno 655 g 55% hmotn. vodného roztoku glukosy. Kultivace probíhala 30 hodin.
Příprava bezbuněčného extraktu
Mikroorganismy byly z 10 1 výsledné kultury odděleny odstředěním a následným promytím fyziologickým roztokem, čímž bylo získáno 1350 g vlhkých mikroorganismů. Vlhké mikroorganismy byly suspendovány ve 2 700 ml 100 mM fosfátového pufru (pH 6,7) a byl přidán 2-merkaptoethanol a fenylmethyisulfonylfluorid a to do konečné koncentrace 5 mM pro
2-merkaptoethanol a 0,1 mM pro fenylmethylsulfonylchlorid. Mikroorganismy byly dezintegrovány pomocí zařízení Dyno milí (výrobce Willy A. Bachofen Co., Ltd.). Porušené mikroorganismy byly odstředěny s cílem odstranit buněčné zbytky. Tím bylo získáno 2 880 ml bezbuněčného extraktu.
Frakcionace síranem amonným
K bezbuněčnému extraktu byl přidán síran amonný a to tak, aby bylo dosaženo 60% nasycení a poté byl síran rozpuštěn. Vznikající sraženiny byly odstraněny odstředěním (v tomto případě bylo pH bezbuněčného extraktu udržováno pomocí amoniakální vody na hodnotě 6,7). K supernatantu byl dále přidán síran amonný s cílem dosáhnout 75% nasycení a pH bylo stejným způsobem udržováno na hodnotě 6,7. Výsledné sraženiny byly shromážděny odstředěním. Sraženiny byly rozpuštěny a dialyzovány přes noc v 10 mM fosfátovém pufru (pH 7,0) obsahujícím 2 mM 2-merkaptoethanol.
Chromatografie na koloně DEAE-TOYOPEARL
Výše získaný surový enzymový roztok byl aplikován na kolonu DEAE-TOYOPEARL 650M (500 ml; výrobce Tosoh Corporation), která byla ekvilibrována 10 mM fosfátovým pufřem (pH 7,0) obsahujícím 2 mM 2-merkaptoethanol. Aplikace byla provedena tak, že polypeptidy, které mají enzymovou aktivitu, byly adsorbovány na kolonu. Kolona byla promyta stejným pufrem. Aktivní frakce byly eluovány pomocí lineárního gradientu NaCl (od 0 M do 0,5 M). Aktivní frakce byly spojeny a poté dialyzovány přes noc proti 10 mM fosfátovému pufru (pH 7,0) obsahujícímu 2 mM 2-merkaptoethanol.
Chromatografie na koloně Phenyl Sepharose
Síran amonný byl rozpuštěn ve výše vzniklém surovém enzymovém roztoku do konečné koncentrace 1 M (pH bylo pomocí amoniakální vody udržováno na hodnotě 7,0). Poté byl roztok aplikován na kolonu Phenyl Sepharose CL-4B (140 ml; výrobce Pharmacia Biotech Co., Ltd ), která byla ekvilibrována 10 mM fosfátovým pufrem (pH 7,0) obsahujícím 2 mM
2-merkaptoethanol a 1 mM síran amonný. Aplikace byla provedena tak, že polypeptidy, které mají enzymovou aktivitu, byly adsorbovány na kolonu. Kolona byla promyta stejným pufrem.
Aktivní frakce byly eluovány pomocí lineárního gradientu síranu amonného (od 1 M do 0 M).
Aktivní frakce byly spojeny a poté dialyzovány přes noc v 10 mM fosfátovému pufru (pH 7,0) obsahujícím 2 mM 2-merkaptoethanol.
Chromatografíe na koloně Blue Sepharose
Výše získaný surový enzymový roztok byl aplikován na kolonu Blue Sepharose CL-6B (40 ml; výrobce Pharmacia Biotech Co., Ltd.), která byla ekvilibrována 10 mM fosfátovým pufrem (pH 7,0) obsahujícím 2 mM 2-merkaptoethanol. Aplikace byla provedena tak, že polypeptidy, které mají enzymovou aktivitu, byly adsorbovány na kolonu. Kolona byla promyta stejným pufrem. Aktivní frakce byly eluovány pomocí lineárního gradientu NaCl (od 0 M do 1 M). Aktivní frakce byly spojeny a poté dialyzovány přes noc v 10 mM fosfátovému pufru (pH 7,0) obsahujícím 2 mM 2-merkaptoethanol.
Chromatografíe na koloně SuperQ-TOYOPEARL
Výše získaný surový enzymový roztok byl aplikován na kolonu SuperQ-TOYOPEARL 650S (12 ml; výrobce Tosoh Corporation), která byla ekvilibrována 10 mM fosfátovým pufrem (pH 7,0) obsahujícím 2 mM 2-merkaptoethanol. Aplikace byla provedena tak, že polypeptidy, které mají enzymovou aktivitu, byly adsorbovány na kolonu. Kolona byla promyta stejným pufrem. Aktivní frakce byly eluovány pomocí lineárního gradientu NaCl (od 0 M do 0,4 M). Aktivní frakce byly spojeny a poté dialyzovány přes noc v 10 mM fosfátovém pufru (pH 7,0) obsahujícím 2 mM 2-merkaptoethanol. Tímto byl získán vzorek čistého polypeptidů, který' je elektroforeticky čistý (dále označován jako CR enzym).
Příklad 2 Klonování genu CR enzymu
Příprava syntetické oligonukleotidové próby
Přečištěný CR enzym získaný v příkladu 1 byl denaturován v přítomnosti 8 M močoviny a poté byl naštěpen lysylendopeptidasou pocházející z Achromobacter (výrobce Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Aminokyselinové sekvence vzniklých peptidových fragmentů byly určeny pomocí sekvenátoru proteinů ABI492 (výrobce Perkin Elmer Co., Ltd.). Na základě aminokyselinových sekvencí byly příslušným způsobem syntetizovány dva nukleotidové primery (SEQ ID NO. 3 a 4).
Amplifíkace genu CR enzymu pomocí PCR
Chromozomální DNA byla extrahována z nakultivované Candida magnoliae IFO 0705 postupem podle Hereforda (Cell, 18, 1261 (1979)). PCR bylo provedeno pomocí výše připraveného nukleotidového primerů a chromozomální DNA jakožto templátu, čímž byl amplifíkován nukleotidový fragment o velikosti asi 350 bp, o němž se předpokládá, že je částí genu CR enzymu.
Příprava knihovny chromozomální DNA
Chromozomální DNA z Candida magnoliae IFO 0705 byla zcela naštěpena restrikčním enzymem Apal a naštěpené fragmenty byly separovány elektroforesou v agarosovém gelu. Poté byl s použitím výše získaného 350 bp velkého DNA fragmentu proveden southem blot (J. Mol. Biol., 98, 503 (1975)). Cílem bylo analyzovat naštěpené fragmenty chromozomální DNA (značení a detekce nukleotidové próby bylo provedeno pomocí Gene Images Labeling and Detection Systém (výrobce Amersham Co., Ltd.)). Bylo zjištěno, že nukleotidový fragment o velikosti asi 5,5 kb byl s nukleotidovou próbou hybridizován.
Na základě tohoto faktu byly naštěpené fragmenty separovány elektroforesou v agarosovém gelu a poté byly shromážděny nukleotidové fragmenty o velikosti 4,3 kb až
6,2 kb. Tylo nukleotidové fragmenty byly začleněny do místa Apal plasmidového vektoru pBluescriptlI KS(-) (výrobce STRATAGENE Co., Ltd ). Plasmid byl začleněn do E. coli JM109. Byla připravena knihovna chromozomální DN A tohoto kmene.
Testování a výběr knihovny chromozomální DNA
Takto získaný nukleotidový fragment byl v souladu s metodou hybridizace kolonií (značení a detekce nukleotidové próby byly provedeny pomocí Gene Images Labeling and Detection Systém (výrobce Amersham Co., Ltd.)) použit jako proba pro testování knihovny chromozomální DNA. Experiment byl proveden podle postupů popsaných v návodech pro tento systém. Jako výsledek byla získána jediná pozitivní kolonie. Rekombinantní plasmidy získané z pozitivní kolonie, do nichž byla insertována DNA o velikosti asi 5,5 kb, byly naštěpeny • · ·
enzymy EcoRI a SphI. Naštěpené fragmenty byly analyzovány pomocí southern blotu, který je uveden výše. Výsledkem byla hybridizace nukleotidových fragmentů o velikosti asi 1,0 kb, které byly získány naštěpením restrikčními enzymy, spróbou. Na základě tohoto faktu byl nukleotidový fragment o velikosti asi 1,0 kb insertován do místa EcoRI-Sphl v plasmidu pUC19 (výrobce Takara Shuzo Co., Ltd.) s cílem vytvořit rekombinantní plasmid pUC-ES a poté byl vybrán jako klon chromozomální DNA včetně genu CR enzymu.
Stanovení sekvence bází
Výše uvedený rekombinantní plasmid pUC-ES byl naštěpen různými restrikčními enzymy a naštěpené fragmenty produkované během reakce byly analyzovány s cílem připravit restrikční mapu. Poté byly různé DNA fragmenty získané v průběhu analýzy insertovány do multiklonovacích míst plasmidu pUC19. Cílem bylo vytvořit rekombinantní plasmidy. Za použití těchto rekombinantních plasmidů byly pomocí soupravy ABI PRISM Dye Terminátor Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (výrobce Perkin Elmer Co., Ltd.) a sekvenátoru ABI 373A DNA Sequencer (výrobce Perkin Elmer Co., Ltd.) analyzovány nukleotidové sekvence příslušných insertovaných fragmentů. Výsledkem bylo stanovení celé sekvence bází DNA fragmentu o velikosti asi 1,0 kb, o němž se předpokládá, že zahrnuje gen sledovaného enzymu. Tuto stanovenou sekvenci bází ukazuje obr. 2. Aminokyselinová sekvence navržená na základě nukleotidové sekvence pro část strukturálního genu nukleotidové sekvence je rovněž ukázána na obr. 1 pod příslušnou nukleotidovou sekvencí. Aminokyselinová sekvence byla porovnána s částečnou aminokyselinovou sekvencí lysylendopeptidasou naštěpeného peptidového fragmentu přečištěného CR enzymu. Bylo zjištěno, že částečná aminokyselinová sekvence přečištěného CR enzymu existuje celá v aminokyselinové sekvenci předpovězené z nukleotidové sekvence a zcela se s ní shoduje (naznačeno jako podtržené části v aminokyselinové sekvenci na obr. 1). DNA fragment je tudíž považován za fragment, který zahrnuje gen CR enzymu.
Příklad 3 Příprava rekombinantního plasmidu nesoucího gen CR enzymu
Dvouřetězcová DNA, která má. Ndel místo připojené k části iniciačního kodónu strukturálního genu CR enzymu; a nový terminační kodón (TAA) a EcoRI místo připojené bezprostředně po terminačním kodónu; a T nahrazený G na šestém nukleotidu od 5' konce genu ve snaze porušit Sáli místo genu, aniž by byl modifikován aminokyselinový kód, byla získána následujícím postupem. N-koncový nukleotidový primer, který má Ndel místo přidané k části ·· 9« · ·· ·· ···· · · · · · • · ·· · * · · • · ···· · · · · · · ·· ·· · · · · · · · · · · iniciačního kodónu strukturálního genu CR enzymu a T nahrazený G v šestém nukleotidu od 5' konce genu, byl syntetizován na základě nukleotidové sekvence určené v příkladu 2. C-koncový nukleotidový primer, který má nový terminační kodón (TAA) a EcoRI místo přidané bezprostředně po terminačním kodónu strukturálního genu CR enzymu, byl syntetizován na základě nukleotidové sekvence určené v příkladu 2. Nukleotidové sekvence těchto dvou primerů jsou reprezentovány sekvencemi SEQ ID NO. 5 a 6. Pomocí dvou syntetických DNA primerů a pomocí plasmidu pUC-ES získaného v příkladu 2 jako templátu byla PCR amplifikována dvouřetězcová DNA. Vzniklý DNA fragment byl naštěpen Ndel a EcoRI a insertován do míst Ndel a EcoRI, nacházejících se downstream (proti směru transkripce) od lac promotoru plasmidu pUCNT (WO 94/03 613). Cílem bylo získat rekombinantní plasmid pNTCR.
Příklad 4 Příprava rekombinantního plasmidu včetně genu CR enzymu i genu glukosadehydrogenasy
Dvouřetězcová DNA, která má: Shine-Dalgarnovu sekvenci (9 nukleotidů) E. coli přidanou 5 nukleotidů upstream (po směru transkripce) od iniciačního kodónu genu glukosadehydrogenasy (dále označována jako GDH) pocházející z Bacillus megaterium IAM 1030; EcoRI místo přidané bezprostředně před tím a SA1I místo bezprostředně po terminačním kodónu, byla získána následujícím postupem. Na základě informací o nukleotidové sekvenci genu GDH byly příslušnou metodou syntetizovány N-koncový nukleotidový primer mající Shine-Dalgarnovu sekvenci (9 nukleotidů) E. coli přidanou 5 nukleotidů upstream od iniciačního kodónu strukturálního genu GDH a EcoRI místo přidané bezprostředně před tím a C-koncový nukleotidový primer mající SA1I místo přidané bezprostředně po terminačním kodónu. Nukleotidové sekvence těchto dvou primerů jsou reprezentovány sekvencemi SEQ ID NO. 7 a 8. Pomocí těchto dvou syntetických DNA primerů byla syntetizována dvouřetězcová DNA. Bylo použito PCR s plasmidem pGDK 1 (Eur. J. Biochem 186, 389 (1989) jako templátem. Výsledný DNA fragment byl naštěpen EcoRI a Sáli a byl insertován do EcoRI a Sáli míst pNTCR, který byl zkonstruován v příkladu 3 (existující downstream od genu CR enzymu). Cílem bylo získat rekombinantní plasmid pNTCRG. Způsob přípravy a struktura pNTCRG jsou uvedeny na obr. 2.
Příklad 5 Příprava rekombinantní E. coli
E. coli HB101 (výrobce Takara Shuzo Co., Ltd.) byla transformována pomocí rekombinantního plasmidu pNTCR, který byl získán v příkladu 3 a rekombinantního plasmidu * · ·«·· · · 4 · • · · · · ♦ · pNTCRG, který byl získán v příkladu 4. Cílem bylo získat rekombinantní E. coli HB101 (pNTCR) a HB101 (pNTCRG). Takto získané transformanty E.coli HB101 (pNTCR) a HB101 (pNTCRG) byly za účelem patentování 28. září 1999 uloženy v souladu s dohodou Budapest Treaty of the Intemational Recognition of the Deposit of Microorganisms u Ministry of Intemational Trade and Industry, Agency of Industrial Science and Technology, National Institute of Bioscience and Human Technology (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonsko) pod příslušnými depositními čísly FERM BP-6897 a FERM BP-6898.
Příklad 6 Exprese CR enzymu v rekombinantní E. coli
Rekombinantní E. coli HB101 (pNTCR) získaná v příkladu 5 byla kultivována v 2xYT médiu, které obsahovalo 120 pg/ml ampicilinu, poté byla shromážděna dohromady, suspendována ve 100 mM fosfátovém pufru (pH 6,5) a podrobena působení ultrazvuku za účelem získat bezbuněČný extrakt. Aktivita CR enzymu v bezbuněčném extraktu byla měřena následujícím způsobem. Tj. 5 mM terč, butyl (S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoát jako substrát, 0,333 mM NADPH jako koenzym a enzym byly přidány ke 100 mM fosfátovému pufru (pH 6,5). Byl měřen pokles absorbance při vlnové délce 340 nm při teplotě 30 °C. Za těchto reakčních podmínek je oxidace 1 pmol NADPH na NADP za jednu minutu definována jako jedna jednotka enzymové aktivity. Takto změřená aktivita CR enzymu v bezbuněčném extraktu představovala specifickou aktivitu a byla srovnána se stejnou aktivitou transformantu, který nese pouze vektorový plasmid. Rovněž bylo provedeno srovnání s aktivitou CR enzymu v bezbuněčném extraktu mikroorganismu Candida magnoliae 1FO 0705, který byl připraven podstatně stejným způsobem jako je popsán v příkladu 1. Tyto výsledky jsou ukázány vtab. 1 níže.
Tabulka 1 Exprese CR enzymu v rekombinantní E. coli
| mikroorganismus | specifická aktivita CR enzymu (U/mg) |
| HB101 (pUCNT) | 0,12 |
| HB101 (pNTCR) | 3,76 |
| Candida magnoliae IFO 0705 | 0,11 |
• · ·« · ·· ·· • · · · 9 · ♦ * · ♦ ♦ ···· · ♦ · · · • · · ······ • · ··· · · ·· · · ·
Jak je patrné z tab. 1 vykazovala E. coli HB101 (pNTCR) jednoznačné zvýšení aktivity CR enzymu ve srovnání sE. coli HB101 (pUCNT), která byla transformována pouze vektorovým plasmidem a vykazovala aktivitu asi 34 krát vyšší než je aktivita Candida magnoliae IFO 0705.
Příklad 7 Současná exprese CR enzymu a GDH v rekombinantní E. coli
Aktivita GDH bezbuněčného extraktu získaného zpracováním rekombinantní E. coli HB101 (pNTCRG) získané v příkladu 5 postupem, který je popsán v příkladu 6, byla měřena následovně. 0,1 M glukosa jako substrát, 2 mM NADP jako koenzym a enzym byly přidány k 1 M Tris-HCl pufru (pH 8,0). Byl měřen nárůst absorbance při vlnové délce 340 nm při teplotě 25 °C. Za těchto reakčních podmínek je redukce 1 gmol NADP na NADPH za jednu minutu definována jako jedna jednotka enzymové aktivity. Aktivita CR enzymu byla měřena stejně jako v příkladu 5. Takto změřená aktivita CR enzymu a aktivita enzymu GDH v bezbuněčném extraktu představovaly specifické aktivity a byly srovnány s těmito aktivitami E. coli HB101 (pNTCR) a transformantu HB101 (pUCNT), který má pouze vektor. Výsledky jsou uvedeny v tab. 2 níže.
Tabulka 2 Současná exprese CR enzymu a GDH v rekombinantní E. coli
| mikroorganismus | specifická aktivita CR enzymu (U/mg) | specifická aktivita GDH (U/mg) |
| HB101 (pUCNT) | 0,12 | <0,01 |
| HB101 (pNTCR) | 3,76 | <0,01 |
| HB101 (pNTCRG) | 2,16 | 87,8 |
Jak je patrné z tab. 2 vykazovala E. coli HB101 (pNTCRG) jednoznačné zvýšení aktivity CR enzymu a aktivity GDH ve srovnání sE. coli HB101 (pUCNT), která byla transformována pouze pomocí vektorového plasmidu.
• · · ♦ • · « ♦ ···· · · · · · · • ······ • · «· · · · · · · · ·
Příklad 8 Syntéza terč, butyl (3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoátu z terč, butyl (S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoátu pomocí rekombinantní E. coli, která má začleněný gen CR enzymu
Rekombinantní E. coli HB101 (pNTCR) získaná v příkladu 5 byla inokulována v 50 ml 2xYT média (Bacto tripton 1,6 % hmotn., kvasničný extrakt Bacto 1,0 % hmotn., NaCl 0,5 % hmotn., pH 7,0) sterilizovaného v 500 ml Sakaguchiově baňce a byla kultivována za stálého třepání při teplotě 37 °C po dobu 16 h. Ke 25 ml výsledné kultury bylo přidáno 680 U GDH (výrobce Amano Pharmaceutical Co., Ltd.), 5,0 g glukosy, 3,0 mg NADP a 4,5 g terč, butyl (S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoátu. Kultura byla míchána při teplotě 30 °C po dobu 40 h a pH bylo upraveno 5 M vodným roztokem hydroxidu sodného na hodnotu 6,5. Po reakci byl reakční roztok podroben extrakci ethylacetátem a extrakt byl po odstranění rozpouštědla analyzován. Výsledkem bylo zjištění, že terč, butyl (3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoát byl produkován ve výtěžku 96,9 %. Procento přebytku diastereoisomeru terč, butyl (3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoátu bylo 98,2 % de.
Kvantifikace terč, butyl (S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoátu a terč, butyl (3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoátu a měření podílu diastereoisomeru terč, butyl (3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoátu byly provedeny pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografíe (kolona: COSMOSDL 5CN-R (4,6 x 250 mm) výrobce Nacalai Tesque Co. Ltd., eluent: 1 mM fosfátový roztok/acetonitril = 5/1, průtok: 0,7 ml/min., detekce: 210 nm, teplota kolony: 30 °C).
Příklad 9 Syntéza terč, butyl (3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoátu z terč, butyl (S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoátu pomocí rekombinantní E. coli se současně exprimovanými CR enzymem a GDH
Rekombinantní E. coli HB101 (pNTCRG) získaná v příkladu 4 byla inokulována ve 100 ml 2xYT média (Bacto tripton 1,6 % hmotn., kvasničný extrakt Bacto 1,0 % hmotn., NaCl 0,5 % hmotn., pH 7,0) sterilizovaného v 500 ml Sakaguchiově baňce a byla kultivována za stálého třepání při teplotě 37 °C po dobu 16 h. Ke 25 ml výsledné kultury bylo přidáno 5,0 g glukosy,
1,5 mg NADP a 5,0 g terč, butyl (S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoátu. Kultura byla míchána při teplotě 30 °C po dobu 24 h a pH bylo upraveno 5 M vodným roztokem hydroxidu sodného na hodnotu 6,5. Po reakci byl reakční roztok podroben extrakci ethylacetátem a extrakt byl po odstranění rozpouštědla analyzován. Výsledkem bylo zjištění, že terč, butyl (3R, 5S)-6-chloro- « « • ·· φ ♦♦ ·· · ♦·♦ ♦ · X··
..... :::.:: :
···· · · · · · ·
9 ·♦ «·· ·· Φ « ···
-3,5-dihydroxyhexanoát byl produkován ve výtěžku 97,2 %. Procento přebytku diastereoisomeru terč, butyl (3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoátu bylo 98,5 % de.
Průmyslová využitelnost
Je možné klonovat geny polypeptidů, které mají enzymovou aktivitu asymetricky redukovat terč, butyl (S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoát na terč, butyl (3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoát a získat transformanty, které mají velkou schopnost produkovat polypeptidy, analýzou nukleotidových sekvencí genů. Dále je možné získat transformanty schopné současně produkovat velké množství polypeptidů a glukosadehydrogenasy. Dále je možné syntetizovat terč, butyl (3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoát z terč, butyl (S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoátu pomocí transformantu.
Claims (16)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Polypeptid, který má enzymovou aktivitu asymetricky redukovat terč, butyl (S)-ó-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoát na terč, butyl (3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoát, kde polypeptid obsahuje aminokyselinovou sekvenci reprezentovanou v seznamu sekvencí SEQ ID NO. 1 nebo aminokyselinovou sekvenci, která má substituci, inserci, deleci nebo adici alespoň jedné aminokyseliny.
- 2. Polypeptid podle nároku 1, kde peptid pochází z mikroorganismu patřícího do rodu Candida.
- 3. Polypeptid podle nároku 2, kde mikroorganismem je Candida magnoliae IFO 0705.
- 4. Polynukleotid kódující polypeptid podle jakéhokoliv z nároků 1 až 3.
- 5. Polynukleotid kódující polypeptid, který má enzymovou aktivitu asymetricky redukovat terč, butyl (S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoát na terč, butyl (3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoát, kde polynukleotid je za stringentních podmínek hybridizován s nukleotidovou sekvencí reprezentovanou v seznamu sekvencí SEQ ID NO. 2.
- 6. Expresní vektor zahrnující polynukleotid podle nároků 4 nebo 5.
- 7. Expresní vektor podle nároku 6, kde expresním vektorem je plasmid pNTCR.
- 8. Expresní vektor podle nároku 6, kde dále zahrnuje polynukleotid kódující polypeptid, který má glukosadehydrogenasovou aktivitu.
- 9. Expresní vektor podle nároku 8, kde polypeptidem, který má glukosadehydrogenasovou aktivitu je glukosadehydrogenasa pocházející z Bacillus megaterium.
- 10. Expresní vektor podle nároku 9, kde expresním vektorem je plasmid pNTCRG.
- 11. Transformant, vyznačující se tím, že je získán transformováním hostitelské buňky pomocí expresního vektoru podle jakéhokoliv z nároků 6 až 10.21-¼ c ♦ í
- 12. Transformant podle nároku 11,vyznačující se tím, že hostitelskou buňkou je Escherichia coli.
- 13. Transformant podle nároku 12, vyznačující se tím, že transformantem je E. coli HB101 (pNTCR).
- 14. Transformant podle nároku 12, v y z n a č u j í c í se t í m, že transformantem je E. coli HB101 (pNTCRG).
- 15. Způsob přípravy terč, butyl (3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoátu, vyznačující se t í m, že zahrnuje kroky, kterými jsou reakce transformantu podle jakéhokoliv z nároků 11 až 14 nebo jeho procesních produktů s terč, butyl (S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoátem a shromáždění produkovaného terč, butyl (3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoátu.
- 16. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že reakce je provedena v přítomnosti systému regeneruj ícího koenzym.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34554199 | 1999-12-03 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20012792A3 true CZ20012792A3 (cs) | 2002-03-13 |
Family
ID=18377296
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20012792A CZ20012792A3 (cs) | 1999-12-03 | 2000-11-24 | Polypeptid, polynukleotid kódující polypeptid, expresní vektor, transformant a způsob přípravy |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6645746B1 (cs) |
| EP (1) | EP1152054B1 (cs) |
| JP (1) | JP4510351B2 (cs) |
| KR (1) | KR100512080B1 (cs) |
| AT (1) | ATE291616T1 (cs) |
| AU (1) | AU1551701A (cs) |
| CA (1) | CA2360376C (cs) |
| CZ (1) | CZ20012792A3 (cs) |
| DE (1) | DE60018909T2 (cs) |
| ES (1) | ES2240205T3 (cs) |
| HU (1) | HUP0105331A3 (cs) |
| MX (1) | MXPA01007858A (cs) |
| NO (1) | NO20013801L (cs) |
| SI (1) | SI20642A (cs) |
| WO (1) | WO2001040450A1 (cs) |
Families Citing this family (57)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE60336324D1 (de) * | 2002-08-09 | 2011-04-21 | Codexis Inc | Enzymatische verfahren zur herstellung 4-substituierter 3-hydroxybuttersäure-derivate |
| WO2004052829A1 (ja) * | 2002-12-06 | 2004-06-24 | Kaneka Corporation | 光学活性３−ヒドロキシプロピオン酸エステル誘導体の製造法 |
| US7824898B2 (en) | 2003-08-11 | 2010-11-02 | Codexis, Inc. | Halohydrin dehalogenases and related polynucleotides |
| CA2533838A1 (en) * | 2003-08-11 | 2005-02-24 | Codexis, Inc. | Improved ketoreductase polypeptides and related polynucleotides |
| US7541171B2 (en) * | 2003-08-11 | 2009-06-02 | Codexis, Inc. | Halohydrin dehalogenases and related polynucleotides |
| US7588928B2 (en) * | 2003-08-11 | 2009-09-15 | Codexis, Inc. | Halohydrin dehalogenases and related polynucleotides |
| KR20060064620A (ko) * | 2003-08-11 | 2006-06-13 | 코덱시스, 인코포레이티드 | 개선된 글루코스 데히드로게나제 폴리펩티드 및 관련폴리뉴클레오티드 |
| KR20060071397A (ko) * | 2003-08-11 | 2006-06-26 | 코덱시스, 인코포레이티드 | 4-치환된 3-히드록시부티르산 유도체 및 이웃자리 시아노,히드록시 치환된 카르복실산 에스테르의 효소적 제조 방법 |
| DE10345772A1 (de) * | 2003-10-01 | 2005-04-21 | Basf Ag | Verfahren zur Herstellung von 3-Methylamino-1-(thien-2-yl)-propan-1-ol |
| WO2006046455A1 (ja) * | 2004-10-27 | 2006-05-04 | Kaneka Corporation | 新規カルボニル還元酵素、その遺伝子、およびその利用法 |
| DE102005044736A1 (de) * | 2005-09-19 | 2007-03-22 | Basf Ag | Neue Dehydrogenasen, deren Derivate und ein Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven Alkanolen |
| AT503017B1 (de) * | 2005-12-19 | 2007-07-15 | Iep Gmbh | Verfahren zur enantioselektiven enzymatischen reduktion von hydroxyketoverbindungen |
| US8304216B2 (en) | 2006-03-31 | 2012-11-06 | Kaneka Corporation | Method for production of erythro-or threo-2-amino-3-hydroxypropionic acid ester, novel carbonyl reductase, gene for the reductase, vector, transformant, and method for production of optically active alcohol using those |
| WO2008042876A2 (en) | 2006-10-02 | 2008-04-10 | Codexis, Inc. | Compositions and methods for producing stereoisomerically pure statins and synthetic intermediates therefor |
| AT504542B1 (de) * | 2006-12-07 | 2008-09-15 | Iep Gmbh | Verfahren zur enantioselektiven enzymatischen reduktion von secodionderivaten |
| WO2008103248A1 (en) | 2007-02-08 | 2008-08-28 | Codexis, Inc. | Ketoreductases and uses thereof |
| WO2009029554A2 (en) | 2007-08-24 | 2009-03-05 | Codexis, Inc. | Improved ketoreductase polypeptides for the stereoselective production of (r)-3-hydroxythiolane |
| WO2009036404A2 (en) | 2007-09-13 | 2009-03-19 | Codexis, Inc. | Ketoreductase polypeptides for the reduction of acetophenones |
| TWI601825B (zh) * | 2007-09-27 | 2017-10-11 | Ｉｅｐ有限公司 | 對映異構選擇性酶催化還原中間產物之方法 |
| KR20100061571A (ko) | 2007-09-28 | 2010-06-07 | 코덱시스, 인코포레이티드 | 케토리덕타제 폴리펩티드 및 이의 용도 |
| CN101883846A (zh) | 2007-10-01 | 2010-11-10 | 科德克希思公司 | 用于生成氮杂环丁酮的还原酶多肽 |
| US8288141B2 (en) | 2008-08-27 | 2012-10-16 | Codexis, Inc. | Ketoreductase polypeptides for the production of 3-aryl-3-hydroxypropanamine from a 3-aryl-3-ketopropanamine |
| ES2560459T3 (es) | 2008-08-27 | 2016-02-19 | Codexis, Inc. | Polipéptidos cetorreductasa para la producción de una 3-aril-3-hidroxipropanamina a partir de una 3-aril-3-cetopropanamina |
| US8288131B2 (en) * | 2008-08-27 | 2012-10-16 | Codexis, Inc. | Ketoreductase polypeptides and uses thereof |
| EP2329014B1 (en) | 2008-08-29 | 2014-10-22 | Codexis, Inc. | Ketoreductase polypeptides for the stereoselective production of (4s)-3[(5s)-5(4-fluorophenyl)-5-hydroxypentanoyl]-4-phenyl-1,3-oxazolidin-2-one |
| SG172231A1 (en) | 2008-12-18 | 2011-07-28 | Codexis Inc | Recombinant halohydrin dehalogenase polypeptides |
| EP2226386A1 (de) | 2009-03-05 | 2010-09-08 | IEP GmbH | Verfahren zur stereoselektiven enzymatischen Reduktion von Ketoverbindungen |
| CN102482648B (zh) | 2009-06-22 | 2014-12-10 | 科德克希思公司 | 酮还原酶介导的产生α氯代醇的立体选择性途径 |
| EP2445890B1 (en) * | 2009-06-22 | 2015-05-06 | SK Biopharmaceuticals Co., Ltd. | Method for preparation of carbamic acid (r)-1-aryl-2-tetrazolyl-ethyl ester |
| ES2575560T3 (es) | 2009-08-19 | 2016-06-29 | Codexis, Inc. | Polipéptidos cetorreductasa para preparar fenilefrina |
| US8404461B2 (en) | 2009-10-15 | 2013-03-26 | SK Biopharmaceutical Co. Ltd. | Method for preparation of carbamic acid (R)-1-aryl-2-tetrazolyl-ethyl ester |
| US9080192B2 (en) | 2010-02-10 | 2015-07-14 | Codexis, Inc. | Processes using amino acid dehydrogenases and ketoreductase-based cofactor regenerating system |
| US9040262B2 (en) | 2010-05-04 | 2015-05-26 | Codexis, Inc. | Biocatalysts for ezetimibe synthesis |
| EP2639216B1 (en) | 2010-11-09 | 2018-07-11 | Kaneka Corporation | Halogenated indenones and method for producing optically active indanones or optically active indanols by using same |
| CN102676596A (zh) * | 2011-03-16 | 2012-09-19 | 苏州国镝医药科技有限公司 | 生物酶手性合成立普妥中间体ats-7 |
| CN104053771B (zh) | 2011-11-18 | 2016-11-09 | 科德克希思公司 | 用于制备羟基取代的氨基甲酸酯的生物催化剂 |
| EP2812440B1 (de) | 2012-02-07 | 2019-06-26 | Annikki GmbH | Verfahren zur herstellung von furanderivaten aus glucose |
| TW201343623A (zh) | 2012-02-07 | 2013-11-01 | Annikki Gmbh | 使氧化還原輔因子經酶催化再生之方法 |
| WO2013117251A1 (de) | 2012-02-07 | 2013-08-15 | Annikki Gmbh | Verfahren zur enzymatischen regenerierung von redoxkofaktoren |
| DE102012017026A1 (de) | 2012-08-28 | 2014-03-06 | Forschungszentrum Jülich GmbH | Sensor für NADP(H) und Entwicklung von Alkoholdehydrogenasen |
| KR101446551B1 (ko) | 2013-02-26 | 2014-10-06 | 주식회사 아미노로직스 | (2rs)-아미노-(3s)-히드록시-부티르산 또는 이의 유도체의 제조방법 |
| US10253340B2 (en) | 2013-03-27 | 2019-04-09 | Annikki Gmbh | Method for the isomerisation of glucose |
| EP3134519B1 (en) | 2014-04-22 | 2018-06-06 | c-LEcta GmbH | Ketoreductases |
| CN104328148A (zh) * | 2014-11-04 | 2015-02-04 | 尚科生物医药（上海）有限公司 | 酶法制备(3r,5s)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯 |
| DK3256577T3 (da) | 2015-02-10 | 2020-09-14 | Codexis Inc | Ketoreduktase polypeptider til syntesen af chirale forbindelser |
| CN104830921B (zh) * | 2015-04-27 | 2019-07-02 | 上海工业生物技术研发中心 | 一种酶法制备他汀类化合物中间体的方法 |
| CN105087684A (zh) * | 2015-09-16 | 2015-11-25 | 连云港宏业化工有限公司 | 一种（3r，5s）-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的制备方法 |
| CN105087685A (zh) * | 2015-09-16 | 2015-11-25 | 连云港宏业化工有限公司 | 一种合成（3r，5s）-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的方法 |
| CN106011092A (zh) * | 2016-06-20 | 2016-10-12 | 苏州汉酶生物技术有限公司 | 一种工程化酮还原酶多肽及其用于制备孟鲁斯特中间体的方法 |
| CN106011095B (zh) * | 2016-07-27 | 2021-02-26 | 苏州汉酶生物技术有限公司 | 工程化酮还原酶多肽及使用其制备依替米贝中间体的方法 |
| WO2018200214A2 (en) | 2017-04-27 | 2018-11-01 | Codexis, Inc. | Ketoreductase polypeptides and polynucleotides |
| EP3652328A1 (en) | 2017-07-14 | 2020-05-20 | c-LEcta GmbH | Ketoreductases |
| CN108441523A (zh) * | 2018-03-22 | 2018-08-24 | 南京工业大学 | （3r,5s）-6-氯-3,5,-二羟基己酸叔丁酯的制备方法 |
| CN110387359B (zh) * | 2018-04-17 | 2021-04-20 | 湖州颐盛生物科技有限公司 | 羰基还原酶突变体及其应用 |
| EP3587393B1 (en) | 2018-06-21 | 2024-01-17 | F.I.S.- Fabbrica Italiana Sintetici S.p.A. | Enzymatic process for the preparation of droxidopa |
| EP4313986A1 (en) | 2021-04-02 | 2024-02-07 | Genentech, Inc. | Processes for making bicyclic ketone compounds |
| CN114875081A (zh) * | 2022-06-07 | 2022-08-09 | 湖北迅达药业股份有限公司 | 一种瑞舒伐他汀关键中间体的绿色工业化生产方法 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5278313A (en) | 1992-03-27 | 1994-01-11 | E. R. Squibb & Sons, Inc. | Process for the preparation of 1,3-dioxane derivatives useful in the preparation of HMG-COA reductase inhibitors |
| GB9512837D0 (en) * | 1995-06-23 | 1995-08-23 | Zeneca Ltd | reduction of ketone groups |
| CA2329893A1 (en) * | 1998-04-30 | 1999-11-11 | Kaneka Corporation | Process for producing 6-cyanomethyl-1,3-dioxane-4-acetic acid derivatives |
| JP3803551B2 (ja) | 1998-08-05 | 2006-08-02 | 株式会社カネカ | 光学活性２−［６−（ヒドロキシメチル）−１，３−ジオキサン−４−イル］酢酸誘導体の製造法 |
| DE19857302C2 (de) | 1998-12-14 | 2000-10-26 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Verfahren zur enantioselektiven Reduktion von 3,5-Dioxocarbonsäuren, deren Salze und Ester |
| WO2001004336A1 (de) | 1999-07-09 | 2001-01-18 | Forschungszentrum Jülich GmbH | Verfahren zur reduktion von keto-carbonsäuren und deren estern |
-
2000
- 2000-11-24 US US09/890,821 patent/US6645746B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-24 MX MXPA01007858A patent/MXPA01007858A/es active IP Right Grant
- 2000-11-24 EP EP00977938A patent/EP1152054B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-24 CA CA002360376A patent/CA2360376C/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-11-24 ES ES00977938T patent/ES2240205T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-24 JP JP2001542518A patent/JP4510351B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-11-24 HU HU0105331A patent/HUP0105331A3/hu unknown
- 2000-11-24 AU AU15517/01A patent/AU1551701A/en not_active Abandoned
- 2000-11-24 AT AT00977938T patent/ATE291616T1/de active
- 2000-11-24 CZ CZ20012792A patent/CZ20012792A3/cs unknown
- 2000-11-24 DE DE60018909T patent/DE60018909T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-24 WO PCT/JP2000/008321 patent/WO2001040450A1/ja active IP Right Grant
- 2000-11-24 SI SI200020017A patent/SI20642A/sl not_active IP Right Cessation
- 2000-11-24 KR KR10-2001-7009856A patent/KR100512080B1/ko not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-08-02 NO NO20013801A patent/NO20013801L/no not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1152054A1 (en) | 2001-11-07 |
| EP1152054B1 (en) | 2005-03-23 |
| WO2001040450A1 (fr) | 2001-06-07 |
| SI20642A (sl) | 2002-02-28 |
| EP1152054A4 (en) | 2002-11-20 |
| US6645746B1 (en) | 2003-11-11 |
| DE60018909T2 (de) | 2006-03-30 |
| MXPA01007858A (es) | 2003-07-14 |
| HUP0105331A3 (en) | 2005-10-28 |
| CA2360376A1 (en) | 2001-06-07 |
| AU1551701A (en) | 2001-06-12 |
| ES2240205T3 (es) | 2005-10-16 |
| KR20020008116A (ko) | 2002-01-29 |
| NO20013801D0 (no) | 2001-08-02 |
| CA2360376C (en) | 2005-04-26 |
| HUP0105331A2 (hu) | 2002-05-29 |
| KR100512080B1 (ko) | 2005-09-02 |
| NO20013801L (no) | 2001-10-03 |
| DE60018909D1 (de) | 2005-04-28 |
| ATE291616T1 (de) | 2005-04-15 |
| JP4510351B2 (ja) | 2010-07-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ20012792A3 (cs) | Polypeptid, polynukleotid kódující polypeptid, expresní vektor, transformant a způsob přípravy | |
| JP5357011B2 (ja) | 遺伝的に操作された微生物株を用いる、スフィンゴイド塩基の改善された生産 | |
| EP1473368A1 (en) | Alpha-substituted-alpha, beta-unsaturated carbonyl compound reductase gene | |
| EP2022852B1 (en) | Method for production of optically active amine compound, recombinant vector, and transformant carrying the vector | |
| WO2006013801A1 (ja) | 新規カルボニル還元酵素、その遺伝子、およびその利用法 | |
| SK105699A3 (en) | Novel carbonyl reductase, gene that encodes the same, and method of utilizing these | |
| KR20110049907A (ko) | 광학 활성인 아민 유도체를 제조하기 위한 방법 | |
| AU2003221082B2 (en) | Novel carbonyl reductase, gene encoding it and process for producing optically active alcohols using the same | |
| EP2374882B1 (en) | Novel amino acid dehydrogenase, and process for producing l-amino acid, 2-oxo acid or d-amino acid | |
| EP2623593B1 (en) | Novel aminotransferase and gene encoding same, and use of the aminotransferase and the gene | |
| EP1882740B1 (en) | N-acetyl-(R,S)-B-amino acid acylase gene | |
| EP2623595B1 (en) | Novel transaminase showing high activity for glutamic acid, gene encoding same, and method for utilization thereof | |
| US7172894B2 (en) | Reductase gene and use of the same | |
| EP2128258B1 (en) | Novel amidase, gene for the same, vector, transformant, and method for production of optically active carboxylic acid amide and optically active carboxylic acid by using any one of those items | |
| EP1306438B1 (en) | Novel carbonyl reductase, gene thereof and method of using the same | |
| JP4295531B2 (ja) | 新規カルボニル還元酵素及びこれをコードするｄｎａ、ならびにこれらを利用した光学活性アルコールの製造方法 | |
| WO2005123921A1 (ja) | 新規グリセロール脱水素酵素、その遺伝子、及びその利用法 | |
| JP4729919B2 (ja) | 微生物の培養方法及び光学活性カルボン酸の製造方法 | |
| EP1371731B1 (en) | Aminoketone asymmetric reductase and nucleic acid thereof | |
| JP7194960B2 (ja) | 脂肪族アルコール合成細菌及び脂肪族アルコールの製造方法 | |
| JP2006055131A (ja) | 新規なｄ−アミノアシラーゼおよびその遺伝子 | |
| WO2008047819A1 (fr) | Nouvelle ester hydrolase, gène codant pour ladite enzyme et utilisation | |
| US20130122556A1 (en) | PROCESS FOR PRODUCING SULFUR-CONTAINING alpha- AMINO ACID COMPOUND | |
| JP2002320491A (ja) | 新規なｄ−アミノアシラーゼをコードするｄｎａおよびそれを用いたｄ−アミノ酸の製造方法 |