WO2006013801A1 - 新規カルボニル還元酵素、その遺伝子、およびその利用法 - Google Patents

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WO2006013801A1
WO2006013801A1 PCT/JP2005/014006 JP2005014006W WO2006013801A1 WO 2006013801 A1 WO2006013801 A1 WO 2006013801A1 JP 2005014006 W JP2005014006 W JP 2005014006W WO 2006013801 A1 WO2006013801 A1 WO 2006013801A1
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polypeptide
tert
dna
seq
chloro
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PCT/JP2005/014006
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Noriyuki Kizaki
Miho Yano
Masahiro Funaki
Teruaki Takesue
Yoshihiko Yasohara
Souichi Morikawa
Takahisa Nakai
Michihiko Kataoka
Sakayu Shimizu
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Kaneka Corporation
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/002—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by oxidation/reduction reactions

Definitions

  • the present invention also provides an optically active alcohol using the polypeptide or the transformant, particularly (2R, 3S) -1 chloro-3-tert butoxycark represented by the above formula (2).
  • the present invention relates to a process for producing bollamino 4 phenyl 2 butanol.
  • (2S, 3S) -1 is produced by allowing a microorganism belonging to the genus Candida or the like to act on a (3S) -1-halo-4 amino-4 ferru-2-butanone derivative.
  • a method for producing a halo-3amino-4phenol-2 butanol derivative Patent Document 2
  • (3S) -1-halo-2-oxo-3-protected amino-4-substituted butanes to the genus Rhodococcus, etc.
  • Patent Document 3 A method for producing (2R, 3S) -1-no, 1-hydroxy-1, 3-protected amino-4-substituted butane by contacting the microorganism to which it belongs (Patent Document 3, Non-Patent Document 2) is known. However, in these methods, the concentration of the product that can be accumulated in the reaction solution is not practically sufficient.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 2-42048
  • Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 9285
  • Patent Document 3 WO2002Z014528
  • Non-patent literature l Tetrahedoron, 50, 6333 (1994)
  • Non-Patent Document 2 Tetrahedoron: Asymmetry, 14, 3105 (2003)
  • the present invention provides a polypeptide useful for the production of (2R, 3S) -1 chloro-3-tert-butoxycarbo-lumino 4 phenyl 2 butanol, DNA encoding the polypeptide, It is an object of the present invention to provide a vector containing DNA and a transformant transformed with the vector. [0011]
  • the present invention also relates to various polypeptides, including (2R, 3S) -1-tert-butoxycarbonylamino4phenyl-2-butanol, using the polypeptide or the transformant.
  • An object of the present invention is to provide an efficient method for producing an optically active alcohol of the present invention.
  • the present inventors asymmetrically reduced (3S) -1 black mouth 3-tert-butoxycarbo-lamino 1 4 phenol 2 butanone and (2R, 3S) -1 chloro 3-
  • a polypeptide having the activity was isolated from a microorganism having the activity to produce tert-butoxycarbonylamine 4 phenol 2 butanol.
  • the nucleotide sequence of the DNA encoding the polypeptide was clarified, and by using this, a transformant that produced the polypeptide at a high yield was successfully created.
  • various useful compounds such as (2R, 3S) -1 1-tert-butoxycarbo-lamino 4-phenol 2-butanol are available.
  • the inventors have found that optically active alcohols can be produced efficiently, and have completed the present invention.
  • the present invention relates to (3S) -1 chloro-3-tert-butoxycarbolamino 4 4-feru 2 butanone asymmetrically reduced to give (2R, 3S) -1 chloro 3-tert —Polypeptide with activity to produce butoxycarboxylic 4-phenol 2 butanol.
  • the present invention also relates to DNA encoding the polypeptide.
  • the present invention is also a vector containing the DNA.
  • this invention is a transformant containing this vector.
  • the present invention relates to the production of optically active alcohols such as (2R, 3S) -1-chloro-tert-tert butoxycarbolamamino 4 phenol 2 butanol using the polypeptide or the transformant. Is the method.
  • the present invention provides a practical method for producing useful optically active alcohols such as (2R, 3S) -1 black mouth 3-tert butoxycarbo-lamino-4-phenyl 2-butanol. .
  • FIG. 1 shows the construction method and structure of the recombinant vector pNTOM4Gl.
  • the (3S) -1 chloro-3-tert-butoxycarbo-lamino-4-phenyl-2-butanone described in the present specification is, for example, disclosed in JP-A-62-126158 or JP-A-2-42048. It can be prepared by the method disclosed in the publication. In addition, unless otherwise specified, genetic manipulations such as DNA isolation, vector preparation, and transformation described in this specification include Molecular Cloning 2nd Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), etc. It can be carried out by the method described in the book. Furthermore,% used in the description of the present specification means% (wZv) unless otherwise specified.
  • the polypeptide of the present invention comprises (3S) -1 chloro-3-tert-butoxycarbo-lamino-4 ferro-2 butanone asymmetrically reduced, and (2R, 3S) -1 tert Polypeptide having activity to produce butoxycarbolamino 4 phenol 2 butanol.
  • Such a polypeptide can be isolated from a microorganism having the activity.
  • the microorganism that is the origin of the polypeptide of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include yeasts belonging to the genus Ogataea, and particularly preferred are as follows. (Ogataea minuta var. Minuta) List NBRC0975 strain.
  • the microorganisms can be hand-manufactured from the National Institute of Biotechnology, Biotechnology Headquarters (NBRC: 2-5-8 Kisarazu Kazusa Kamasa, Chiba Prefecture 292-0818).
  • a medium for culturing the microorganism that is the origin of the polypeptide of the present invention as long as the microorganism grows, a normal liquid nutrient medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, organic nutrients, and the like Can be used.
  • Isolation of the polypeptide having the microbial strength that is the origin of the polypeptide of the present invention can be carried out by appropriately combining commonly known protein purification methods. For example, it can be implemented as follows.
  • the microorganism is cultured in a suitable medium, and the culture solution is centrifuged or filtered. Collect more cells.
  • the obtained microbial cells are crushed by an ultrasonic crusher or a physical method using glass beads and the like, and the microbial cell residue is removed by centrifugation to obtain a cell-free extract.
  • salting out (ammonium sulfate precipitation, sodium phosphate precipitation, etc.), solvent precipitation (protein fraction precipitation with acetone or ethanol), dialysis, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, reverse phase chromatography
  • the polypeptide of the present invention is isolated from the cell-free extract by using a technique such as ultrafiltration alone or in combination.
  • the DNA of the present invention is a DNA encoding the above-described polypeptide of the present invention, and any DNA can be used as long as the polypeptide can be expressed in a host cell introduced according to the method described below. Any untranslated region may be included. If the polypeptide can be obtained, such a DNA can be obtained by a person skilled in the art from a microorganism that is the origin of the polypeptide by a known method. For example, it can be acquired by the method shown below.
  • the isolated polypeptide of the present invention is digested with an appropriate endopeptidase, and the resulting peptide fragment is fractionated by reverse phase HPLC. Then, for example, a part or all of the amino acid sequences of these peptide fragments are determined by ABI492 type sequencer (Applied Biosystems).
  • D encoding the polypeptide Synthesize PCR (Polymerase Chain Reaction) primers to amplify part of NA.
  • the chromosomal DNA of the microorganism that is the origin of the polypeptide is prepared from a conventional DNA isolation method, for example, the method of Visser et al. (Appl. Microbiol. Biotechno L, 53, 415 (2000)).
  • PCR is performed using the PCR primers described above, a part of the DNA encoding the polypeptide is amplified, and the base sequence is determined.
  • the base sequence can be determined using, for example, ABI373A type DNA Sequencer (manufactured by Applied Biosystems).
  • Examples of the DNA of the present invention thus obtained include DNA containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and DNA containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. be able to. It is a DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, and (3S) -1 — Tert-Butoxycarbo-lamino- 4-polynitro 2-butane is asymmetrically reduced to produce (2R, 3S) -1 chloro-3-tert-butoxycalpo-lamino 4-phenyl 2-butanol Encoding DNA is also encompassed by the DNA of the present invention.
  • DNA complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 in the sequence listing and DNA hybridized under stringent conditions are the same as the one-to-one hybridization method, plaque 'When hybridization method or Southern hybridization method is performed, it is specifically hybridized with DNA having a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2 in the sequence listing Say the DNA that forms.
  • stringent conditions include, for example, 75 mM trisodium quenate, 750 mM sodium chloride, 0.5% sodium dodecyl sulfate, 0.1% ushi serum albumin, 0.1% polypyrrolidone. And after hybridization at 65 ° C. in an aqueous solution composed of 0.1% Ficoll 400 (Amersham Bioscience Co., Ltd.), 15 mM trisodium citrate, 150 mM sodium chloride, And 0.1% sodium dodecyl sulfate This is the condition under which cleaning is performed at 60 ° C using an aqueous solution that also has a compositional power.
  • an aqueous solution having a compositional power of 15 mM trisodium citrate, 150 mM sodium chloride sodium salt, and 0.1% sodium dodecyl sulfate is used at 65 ° C.
  • polypeptide of the present invention examples include a polypeptide having the amino acid sequence ability shown in SEQ ID NO: 3 of the sequence listing encoded by the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and SEQ ID NO: of the sequence listing A polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 of the sequence listing encoded by the base sequence shown in 2 can be exemplified.
  • polypeptides that have the ability to reduce (2R, 3S) -1 black mouth 3-tert-butoxycarbo-lamino- 4-feruol 2-butanol simultaneously function with these two polypeptides. And are included in the present invention.
  • sequence homology is obtained by, for example, using two homology search programs FASTA (WR Pearson & DJ Lipman; Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 2444-2448 (1988)).
  • FASTA WR Pearson & DJ Lipman; Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 2444-2448 (1988)
  • the acid sequence is comparatively analyzed, it is represented by the Identity value for the entire sequence.
  • a polypeptide equivalent to the polypeptide shown in SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 in the sequence listing it has a homology of at least 78% (with the polypeptide of SEQ ID NO: 3).
  • Such a polypeptide includes, for example, a DNA complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2 in the above sequence listing and a DNA that hybridizes under stringent conditions. After ligation to an appropriate vector, it is obtained by introducing it into an appropriate host cell and expressing it. For example, Current Protocols in Molecular Biology (J ohn Wiley and Sons, Inc., 1989), etc., according to known methods, amino acid substitution, insertion, deletion, or addition to the polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 4 in the sequence listing. Can also be obtained by generating
  • polypeptides obtained by the latter technique include, in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, the 42nd alanine as glycine, the 43rd glutamic acid as alanine, and the 46th lysine. And a polypeptide obtained by substituting Z for glutamic acid and Z or 49th asparagine for lysine.
  • a polypeptide having all these four mutations is shown in SEQ ID NO: 16 in the Sequence Listing, and a DNA encoding this polypeptide (mutant DNA 1) is shown in SEQ ID NO: 15 in the Sequence Listing.
  • the vector used for introducing the DNA of the present invention into the host microorganism and expressing it in the introduced host microorganism can be any one that can express the gene encoded by the DNA in an appropriate host microorganism.
  • examples of such vectors include plasmid vectors, phage vectors, cosmid vectors, and shuttle vectors that can exchange genes with other host strains can also be used.
  • Such a vector usually contains regulatory elements such as lacUV5 promoter, trp promoter, trc promoter, tac promoter, lpp promoter, tufB promoter, recA promoter, pL promoter, and can operate with the DNA of the present invention. It can be suitably used as an expression vector comprising an expression unit linked to the.
  • pUCNT WO94 / 03613 publication
  • pUCNT WO94 / 03613 publication
  • regulatory element refers to a base sequence having a functional promoter and any related transcription element (eg, enhancer, CCAAT box, TATA box, SPI site, etc.).
  • operably linked is linked to various regulatory elements such as a promoter that regulates the expression of a gene, such as an enzyme, in a state where it can operate in a host cell. That means. It is a matter well known to those skilled in the art that the type and kind of the control factor can vary depending on the host.
  • the expression vector of the present invention includes pNTOM3 in which the DNA shown in SEQ ID NO: 1 is introduced into pUCNT, pNTOM4 in which the DNA shown in SEQ ID NO: 2 is introduced, and SEQ ID NO: 15 described later.
  • Examples include pNTOM5 into which the DNA shown is introduced.
  • the host cell into which the vector containing the DNA of the present invention is introduced includes bacteria, yeast, filamentous fungi, plant cells, animal cells, etc., but bacteria are preferred because of the ease of introduction and Z or culture. E. coli is particularly preferred.
  • the vector containing the DNA of the present invention can be introduced into a host cell by a known method. When using Escherichia coli as the host cell, the vector can be introduced into the host cell by using, for example, a commercially available E. coli HB101 competent cell (manufactured by Takara Bio Inc.).
  • Examples of the transformant of the present invention include E. coli HB101 (pNTMO3) FERM BP-10368 in which the above pNTM03 was introduced into E. coli HB101, and E. coli HB101 (pNTOM4 in which the above pNTM04 was introduced). ) FERM BP-10369, E. coli HB101 (pNTOM5) FERM BP-10370 introduced with the above pNTM05, and the like. These transformants have been deposited at the Patent Organism Depositary of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (IPOD: Tsukuba Sakai Higashi 1 1 1 Chuo No. 6), Ibaraki 305-8566. (The original deposit date of June 3, 2004 was transferred to the international deposit under the Budapest Treaty (July 6, 2005)).
  • coenzyme regeneration ability a polypeptide having the ability to convert the oxidized coenzyme into a reduced form
  • polypeptide having coenzyme regeneration ability examples include hydrogenase, formate dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, aldehyde dehydrogenase, glucose 6-phosphate dehydrogenase, and glucose dehydrogenase.
  • glucose dehydrogenase is used.
  • the production of an optically active alcohol using the polypeptide of the present invention can be carried out as follows. First, a compound having a carbocyclic group serving as a substrate, a coenzyme such as NADPH, and the polypeptide are added to a suitable solvent, and the reaction is carried out with stirring under pH adjustment. Main departure When the reaction is carried out by combining a light polypeptide and a polypeptide having a coenzyme regeneration ability, the above reaction composition contains a polypeptide having a coenzyme regeneration ability (for example, glucose dehydrogenase) and its substrate. Further compound (eg glucose) is added.
  • a coenzyme regeneration ability for example, glucose dehydrogenase
  • an aqueous solvent may be used, or a mixture of an aqueous solvent and an organic solvent may be used.
  • the organic solvent include toluene, ethyl acetate, n-butyl acetate, hexane, isopropanol, diisopropyl ether, methanol, acetone, dimethyl sulfoxide and the like.
  • the reaction is carried out at a temperature of 10 ° C to 70 ° C, and the pH of the reaction solution is maintained at 4-10.
  • the reaction can be carried out batchwise or continuously. In the batch mode, the reaction substrate is added at a feed concentration of 0.1% to 70% (wZv).
  • the compound having a carbocyclic group as a substrate include (3S) -1 chloro-3-tert butoxycarbolamamino 4 ferro 2 butanone. If it is converted, it will not be specifically limited.
  • the reaction can be similarly carried out by using a transformant containing a DNA encoding the polypeptide or a processed product thereof instead of the polypeptide of the present invention.
  • the same reaction can be carried out using a transformant containing both the DNA encoding the polypeptide of the present invention and the DNA encoding the polypeptide capable of coenzyme regeneration, or a processed product thereof.
  • the “transformed product” refers to, for example, cells treated with a surfactant or an organic solvent, dried cells, crushed cells, crude cell extracts, and the like by known means. It means something fixed.
  • a transformant containing both a DNA encoding the polypeptide of the present invention and a DNA encoding a polypeptide having a coenzyme regeneration ability, a DNA encoding the polypeptide of the present invention, and Both of the DNAs that encode polypeptides that have the ability to regenerate coenzymes are incorporated into the same vector and introduced into host cells. These two types of DNA are different from each other in the incompatibility group. Embed in each of the two vectors, They can also be obtained by introducing the two vectors into the same host cell.
  • Examples of vectors in which both the DNA encoding the polypeptide of the present invention and the DNA encoding the polypeptide having coenzyme regenerating ability are incorporated include the expression vectors pNTOM3, pNTOM4, and pNTOM5, respectively.
  • Examples include pNTOM3Gl, pNTOM4Gl, pNTOM5Gl, etc., into which a megathorium-derived dalcose dehydrogenase gene has been introduced.
  • E. coli HB101 was transformed with these vectors.
  • E. coli HB101 (pNTOM4Gl) E. coli HB101 (pNTOM5Gl) and the like.
  • the activity of the polypeptide having a coenzyme regeneration ability in the transformant can be measured by a conventional method.
  • the activity of glucose dehydrogenase is determined by adding lOO mM glucose, 2 mM coenzyme NADP or NAD, and enzyme to 1 M Tris-HCl buffer (pH 8.0) and reacting at 25 ° C for 1 minute. Then, it can be calculated from the rate of increase in absorbance at a wavelength of 340 nm.
  • the optically active alcohol generated by the reaction can be purified by a conventional method.
  • the optically active alcohol produced in the reaction is (2R, 3S) -1 chloro-3-tert butoxycarbolamamino 4 phenol 2 butanol
  • the reaction solution is extracted with an organic solvent such as ethyl acetate or toluene. And the organic solvent is removed under reduced pressure.
  • it can be purified by crystallization or chromatographic treatment.
  • (3S) 1—Black mouth 3— tert-Butoxycarbolamino 1 —Fue-Lu 2 butanone and (2R, 3S) — 1—Black mouth— 3—tert-Butoxycarboluamino — 4—Ferrolu 2-Butanol quantification and (2R, 3S) —1 Chloro-3-tert-butoxycarbo-lamino 4 Phenyl 2-butanol diastereomeric excess was determined by high performance liquid chromatography (column: COSMOSIL 5C8 -MS (4.6 mm x 25
  • the polypeptide of the present invention can be efficiently produced, and by using this, (2R, 3S) -1 chloro-3-tert-butoxycarbo- An excellent method for producing a variety of useful optically active alcohols is provided, including luamino-4-phenyl-2-butanol.
  • This medium was inoculated with 180 ml of the culture medium of Ogataea minuta var. Minuta NBRC0975 strain that had been precultured in the same medium in advance, and the stirring speed was 250 rpm. Aeration rate 5. Cultured for 48 hours under conditions of ONL / min, 28 ° C.
  • Bacteria were collected from the culture broth by centrifugation and washed with 2000 ml of 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) to obtain 907 g of the strain. Suspend this cell in 1800 ml of 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 0. ImM dithiothreitol (DTT), and use UH-600 type ultrasonic disperser (manufactured by SMT). Was crushed. The cell residue was removed from the crushed material by centrifugation to obtain a cell-free extract.
  • DTT ImM dithiothreitol
  • Active fraction obtained by DEAE-Sephacel column chromatography was pre-equilibrated with lOmM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 0. ImM DTT. MonoQ HR The column was applied to an ⁇ column (Amersham Bioscience Co., Ltd.) to adsorb the active fraction. After washing the column with the same buffer, the active fraction was eluted with a sodium chloride linear gradient (from 0 M to 1 M). Active fractions were collected and dialyzed overnight in the same buffer.
  • the active fraction obtained by MonoQ HR column chromatography sodium chloride was dissolved to a final concentration of 4M, and 10mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 4M sodium chloride and 0. ImM DTT. Then, it was applied to a Phenyl-Superose HR 10/10 column (manufactured by Amersham Bioscience Co., Ltd.) that had been equilibrated in advance to adsorb the active fraction. After washing the column with the same buffer, the active fraction was eluted with a linear sodium chloride gradient (from 4M to 0M). The active fractions were collected and dialyzed overnight against 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 0. ImM DTT.
  • the active fraction obtained by the above MonoQ HR column chromatography was pre-equilibrated with 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 0.2 M sodium chloride and 0. ImM DTT.
  • the sample was applied to an HR 10/30 column (Amersham Bioscience Co., Ltd.), and the active fraction was eluted with a flow rate of 0.5 mlZ using the same buffer.
  • the active fraction was concentrated using Centricon YM-10 (Millipore). Further, this was applied to a Superdex 200 HR 10/30 column (manufactured by Amersham Neosciences) pre-equilibrated with the same buffer as above, and was activated at a flow rate of 0.5 mlZ using the same buffer. Fractions were eluted.
  • the active fraction was collected and used as a purified polypeptide preparation. [0069] (Example 2) Gene cloning
  • the purified polypeptide obtained in Example 1 was denatured in the presence of 8M urea and then digested with lysyl endopeptidase (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) derived from achromobacter.
  • the amino acid sequence of the obtained peptide fragment was ABI492 Type protein sequencer (manufactured by PerkinElmer).
  • This DNA fragment is cloned into the plasmid pT7Blue T—Vector (Novagen) and used with ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin Elmer) and ABI 373A DNA Sequencer (Perkin Elmer)
  • the base sequence was analyzed. As a result, it was found that two types of DNA fragments with different base sequences were amplified by this PCR. Their base sequences are shown in SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 in the sequence listing.
  • the entire base sequence of the gene containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 8 was determined in the same manner, and the result is shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
  • the amino acid sequence encoded by the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is shown in SEQ ID NO: 3
  • the amino acid sequence encoded by the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 is shown in SEQ ID NO: 4, respectively.
  • Primer 3 5,-gtgcatatgaccaagactgtttatttca-3 '( ⁇ self ⁇ U table's U number 9) and primer 4: 5, 1 gtcgaattcttattaaaatggaatgtcgaa— 3, (distribution U table's U number 10) PCR was performed using the chromosomal DNA of Ogataea minuta var. Minuta NBRC0975 strain obtained in Example 2 as a saddle type.
  • the 125th C in the gene with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing is A mutant gene was prepared by substituting the 128th A with C, the 136th A with G, and the 147th C with G.
  • This mutant gene is SEQ ID NO: In the amino acid sequence shown in Fig. 4, the 42nd alanine is replaced with glycine, the 43rd glutamic acid is replaced with alanine, the 46th lysine is replaced with glutamic acid, and the 49th asparagine is replaced with lysine.
  • the encoded polypeptide is provided by Takara Bio Inc.
  • This mutant gene was inserted into the vector pUCNT in the same manner as in Example 3 to construct a recombinant vector pNTOM5.
  • Use puffer 7 5-gccgaattctaaggaggttaacaatgtataaa-3 (Eye ⁇ U table eye ⁇ ⁇ U number top 3) and primer 8: 3,-gcggtcgacttatccgcgtcctgcttgg-5 '(SEQ ID NO: 14 in the sequence listing) (Eur. J. Biochem., 186, 389 (1989)) was used for PCR, and the start codon of the glucose dehydrase (hereinafter referred to as GDH) gene derived from Bacillus megaterium IAM1030 strain. A double-stranded DNA was obtained in which an Escherichia coli ribosome binding sequence was added 5 bases upstream of it, an EcoRI breakpoint was added immediately before it, and a Sail breakpoint was added immediately after the stop codon.
  • GDH glucose dehydrase
  • Fig. 1 shows the fabrication method and structure of PNTOM4G1.
  • E. coli HB101 combination cells (Takara Bio) were transformed, and E. coli HB101 (pNTOM3) E. coli HB101 (pNTOM4) and E. coli HB101 (pNTOM5) were obtained.
  • These transformants were deposited with the Patent Organism Depositary (IPOD), National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, under the accession number FERM BP-10368, the accession number FERM BP-10369, and the accession number FERM BP—10370, respectively. ing.
  • E. coli HB101 competent cells Takara
  • E. coli HB101 pNTOM3Gl
  • E. coli HB101 pNTOM4G1
  • E. coli HB101 pNTOM5Gl
  • E. coli HB101 (pUCNT), a transformant containing the six transformants obtained in Example 6 and the vector plasmid pUCNT, was added to 2 XYT medium ( ⁇ ⁇ Lipton 1) containing 200 ⁇ g / ml ampicillin. 6%, yeast extract 1.0%, NaClO. 5%, pH 7.0) was inoculated into 50 ml, and cultured with shaking at 37 ° C for 24 hours. The cells were collected by centrifugation and suspended in 50 ml of 100 mM phosphate buffer (pH 6.5). This was crushed using a UH-50 type ultrasonic homogenizer (manufactured by SMT), and the cell residue was removed by centrifugation to obtain a cell-free extract.
  • Table 3 shows the specific activity of (3S) -1 chloro-3-tert-butoxycarbo-lamino-4 phenyl-2-butanone reducing activity and GDH activity of this cell-free extract.
  • expression of (3S) -1-chloroguchi 3-tert-butoxycarbo-lamino-4-ferrue-2 butanone reducing activity was observed. It was.
  • expression of GDH activity was also observed in E. coli HBlOKp NTOM3Gl), E. coli HB101 (pNTOM4Gl), and E. coli HBlOKpNT OM5G1) containing the GDH gene.
  • Ecoli HB101 (pNTOM5G1) 9.0 122
  • the cell-free extract of E. coli HB101 (pNTOM4) prepared in Example 7 was added to 22.5 ml of glucose dehydrogenase (manufactured by Amano Enzyme) 1250 U, glucose 3 g, NADP 4 mg, (3S) — 0.25 g of 3-tert-butoxycarbolumino 4 phenyl 2 butanone was added, and the mixture was stirred at 30 ° C. while adjusting the pH to 6.5 by dropwise addition of 5M sodium hydroxide.
  • glucose dehydrogenase manufactured by Amano Enzyme

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Abstract

　本発明は、オガタエア（Ogataea）属に属する微生物より単離された、（３Ｓ）－１－クロロ－３－ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ－４－フェニル－２－ブタノンを不斉的に還元して（２Ｒ，３Ｓ）－１－クロロ－３－ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ－４－フェニル－２－ブタノールを生成する活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードするＤＮＡおよび該ポリペプチドを生産する形質転換体。並びに、該ポリペプチドまたは該形質転換体を利用して、（２Ｒ，３Ｓ）－１－クロロ－３－ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ－４－フェニル－２－ブタノールを製造する方法に関する。 　本発明のポリペプチドまたは形質転換体を用いることにより、（２Ｒ，３Ｓ）－１－クロロ－３－ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ－４－フェニル－２－ブタノール等の光学活性アルコールを効率的に製造することができる。                                                                                     

Description

新規カルボニル還元酵素、その遺伝子、およびその利用法 技術分野
[0001] 本発明は、下記式（1) :
[0002] [化 3]
Figure imgf000002_0001
[0003] で表される（3S)—1 クロロー 3—tert ブトキシカルボ-ルァミノー 4 フエ-ルー
2—ブタノンを不斉的に還元して、下記式 (2) :
[0004] [化 4]
Figure imgf000002_0002
[0005] で表される（2R, 3S)—1 クロロー 3—tert ブトキシカルボ-ルァミノー 4 フエ- ルー 2—ブタノールを生成する活性を有する微生物より単離された、該活性を有する ポリペプチド (カルボ-ル還元酵素）、該ポリペプチドをコードする DNA、該 DNAを 含むベクター、および該ベクターで形質転換された形質転換体に関する。
[0006] 本発明はまた、該ポリペプチド、または、該形質転換体を用いた、光学活性アルコ ール、とりわけ前記式 (2)で表される（2R, 3S)— 1 クロロー 3— tert ブトキシカル ボ-ルァミノ 4 フエニル 2 ブタノールの製造法に関する。
[0007] (2R, 3S)— 1—クロ口— 3— tert—ブトキシカルボ-ルァミノ— 4—フエ-ルー 2— ブタノールは、医薬等の合成原料として有用な化合物である。
背景技術
[0008] (2R, 3S)— 1—クロ口 3— tert—ブトキシカルボ-ルァミノ— 4—フエ-ルー 2— ブタノールの製造法としては、ァミノ基が保護された（3S)—1—ハロー 3 アミノー 4 フエニル 2—ブタノン誘導体を、水素化ほう素ナトリゥム等の還元剤で化学的に 還元する方法が知られている (特許文献 1、非特許文献 1)。しかし、本方法は比較的 高価な還元剤を用いる必要があり、その立体選択性も実用上十分とは言えない。
[0009] また、微生物を用いる方法として、（3S)—1—ハロー 3 アミノー 4 フエ-ルー 2 ーブタノン誘導体にキャンディダ (Candida)属等に属する微生物を作用させて、（2R , 3S)— 1 ハロー 3 アミノー 4 フエ-ルー 2 ブタノール誘導体を製造する方法 (特許文献 2)、および、（3S)—1—ハロ一 2—ォキソ 3—保護アミノ一 4 置換ブタ ンにロドコッカス（Rhodococcus)属等に属する微生物を接触させて、（2R, 3S)—1— ノ、口一 2 ヒドロキシ一 3—保護アミノー 4 置換ブタンを製造する方法 (特許文献 3、 非特許文献 2)が知られている。しかし、これらの方法では、反応液中に蓄積させるこ とができる生成物の濃度が実用上十分とは言えない。
特許文献 1：特開平 2— 42048号公報
特許文献 2：特開平 9 285号公報
特許文献 3： WO2002Z014528号公報
非特許文献 l : Tetrahedoron, 50, 6333 (1994)
非特許文献 2 : Tetrahedoron:Asymmetry, 14, 3105 (2003)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0010] 上記に鑑み、本発明は、（2R, 3S)—1 クロロー 3—tert ブトキシカルボ-ルァ ミノー 4 フエニル 2 ブタノールの製造に有用なポリペプチド、該ポリペプチドをコ ードする DNA、該 DNAを含むベクター、および該ベクターで形質転換された形質 転換体を提供することを課題とする。 [0011] また、本発明は、該ポリペプチド、または、該形質転換体を用いた、 (2R, 3S)— 1 —クロ口一 3 tert -ブトキシカルボニルァミノ 4 フエニル 2 ブタノールを始め とする種々の光学活性アルコールの効率的な製造方法を提供することを課題とする 課題を解決するための手段
[0012] 本発明者らは、（3S)—1 クロ口一 3— tert—ブトキシカルボ-ルァミノ一 4 フエ 二ルー 2 ブタノンを不斉的に還元し、 (2R, 3S)—1 クロロー 3—tert ブトキシカ ルポニルァミノー4 フエ二ルー 2 ブタノールを生成する活性を有する微生物より、 該活性を有するポリペプチドを単離した。さらに、該ポリペプチドをコードする DNAの 塩基配列を明らかにし、これを利用して、該ポリペプチドを高生産する形質転換体を 創製することに成功した。そして、該ポリペプチドまたは該形質転換体を利用すること により、（2R, 3S)—1 クロ口一 3— tert—ブトキシカルボ-ルァミノ一 4 フエ-ル 2—ブタノールを始めとする種々の有用な光学活性アルコールを効率良く製造す ることが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
[0013] 即ち、本発明は、（3S)—1 クロロー 3—tert ブトキシカルボ-ルァミノー 4ーフ ェ-ルー 2 ブタノンを不斉的に還元して、（2R, 3S)—1 クロロー 3—tert—ブトキ シカルボ-ルァミノ 4 フエ-ル 2 ブタノールを生成する活性を有するポリぺプ チドである。
[0014] また、本発明は、該ポリペプチドをコードする DNAである。また、本発明は、該 DN Aを含むベクターである。また、本発明は、該ベクターを含む形質転換体である。さら に、本発明は、該ポリペプチドまたは該形質転換体を用いた、 (2R, 3S)— 1—クロ口 3 tert ブトキシカルボ-ルァミノ 4 フエ-ル 2 ブタノールを始めとする 光学活性アルコールの製造方法である。
発明の効果
[0015] 本発明により、 (2R, 3S)—1 クロ口 3— tert ブトキシカルボ-ルァミノ— 4— フエニル 2—ブタノールを始めとする、有用な光学活性アルコールの実用的な製造 方法が提供される。
図面の簡単な説明 [0016] [図 1]組換えベクター pNTOM4Glの作製法および構造を示す
発明を実施するための最良の形態
[0017] 以下、本発明を詳細に説明する。
本明細書において記述されている、（3S)— 1 クロロー 3— tert ブトキシカルボ- ルァミノ— 4 フエニル— 2 ブタノンは、例えば、特開昭 62— 126158号公報、また は、特開平 2— 42048号公報に開示された方法により調製できる。また、本明細書に おいて記述されている、 DNAの単離、ベクターの調製、形質転換等の遺伝子操作 は、特に明記しない限り、 Molecular Cloning 2nd Edition (Cold Spring Harbor Labora tory Press, 1989)等の成書に記載されている方法により実施できる。さらに、本明細 書の記述に用いられる％は、特に断りのない限り、％(wZv)を意味する。
[0018] 本発明のポリペプチドは、（3S)—1 クロロー 3—tert ブトキシカルボ-ルァミノ —4 フエ-ルー 2 ブタノンを不斉的に還元し、 (2R, 3S)— 1—クロ口 3— tert ブトキシカルボ-ルァミノ 4 フエ-ル 2 ブタノールを生成する活性を有する ポリペプチドである。このようなポリペプチドは、当該活性を有する微生物から単離す ることがでさる。
[0019] 本発明のポリペプチドの起源となる微生物は、特に限定されないが、例えばォガタ エア（Ogataea)属に属する酵母が挙げられ、特に好まし 、ものとしてはォガタエア ·ミ ニュータ'パ ~ ·ミニユータ（Ogataea minuta var. minuta) NBRC0975株を挙げること 力 Sできる。当該微生物は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー 本部生物遺伝資源部門（NBRC :〒 292-0818 千葉県木更津巿かずさ鎌足 2-5-8) より人手することができる。
[0020] 本発明のポリペプチドの起源となる微生物を培養するための培地としては、その微 生物が増殖する限り、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む 液体栄養培地を用いることができる。
[0021] 本発明のポリペプチドの起源となる微生物力もの該ポリペプチドの単離は、通常公 知の蛋白質精製法を適当に組み合わせて用いることにより実施できる。例えば、以下 のように実施できる。
[0022] まず、当該微生物を適当な培地で培養し、培養液から遠心分離、あるいは、濾過に より菌体を集める。得られた菌体を、超音波破砕機、あるいは、グラスビーズ等を用い た物理的手法で破砕した後、遠心分離にて菌体残さを除き、無細胞抽出液を得る。 そして、塩析 (硫酸アンモ-ゥム沈殿、リン酸ナトリウム沈殿など）、溶媒沈殿 (アセトン またはエタノールなどによる蛋白質分画沈殿法）、透析、ゲル濾過クロマトグラフィー 、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、限外濾過等の手法を単独で 、または組み合わせて用いることにより、該無細胞抽出液から、本発明のポリペプチド を単離する。
[0023] (3S)—1—クロ口一 3— tert—ブトキシカルボ-ルァミノ一 4—フエ-ルー 2 ブタノ ンを還元する活性は、例えば、 0. 33% (v/v)のジメチルスルホキシドを含む 100m Mリン酸緩衝液（pH6. 5)〖こ、 0. 2mMの基質（3S)— 1—クロ口 3— tert—ブトキ シカルボ-ルァミノ— 4—フエ-ルー 2 ブタノン、 0. 25mMの補酵素 NADPH、お よび粗酵素を添加し、 30°Cで 1分間反応させた際の、波長 340nmにおける吸光度 の減少速度力 算出できる。
[0024] また、上記反応において生成した、（3S)— 1 クロロー 3— tert ブトキシカルボ- ルァミノー 4 フエ-ルー 2 ブタノールの絶対配置の決定、および、ジァステレオマ 一過剰率の測定は、高速液体クロマトグラフィー（カラム： COSMOSIL 5C8— MS ( φ 4. 6mm X 250mm;ナカライテスタ社製）、溶離液： 10mMリン酸水溶液 Zァセト 二トリル = lZl (vZv)、流速： lmlZmin、検出： 210nm)を用いて実施できる。
[0025] 本発明の DNAは、上述の本発明のポリペプチドをコードする DNAであり、後述す る方法に従って導入された宿主細胞内で該ポリペプチドを発現し得るものであれば いかなるものでもよぐ任意の非翻訳領域を含んでいてもよい。該ポリペプチドが取得 できれば、該ポリペプチドの起源となる微生物より、当業者であれば公知の方法で、 このような DNAを取得できる。例えば、以下に示した方法で取得できる。
[0026] まず、単離された本発明のポリペプチドを適当なエンドべプチダーゼを用いて消化 し、生じたペプチド断片を逆相 HPLCにより分取する。そして、例えば、 ABI492型プ 口ティンシークェンサ一（Applied Biosystems社製）により、これらのペプチド断片 のアミノ酸配列の一部または全部を決定する。
[0027] このようにして得られたアミノ酸配列情報をもとにして、該ポリペプチドをコードする D NAの一部を増幅するための PCR (Polymerase Chain Reaction)プライマーを 合成する。次に、通常の DNA単離法、例えば、 Visser等の方法 (Appl. Microbiol. Bi otechnoL, 53, 415 (2000))〖こより、該ポリペプチドの起源となる微生物の染色体 DNA を調製する。この染色体 DNAを铸型として、先述の PCRプライマーを用いて PCRを 行い、該ポリペプチドをコードする DNAの一部を増幅し、その塩基配列を決定する。 塩基配列の決定は、例えば、 ABI373A型 DNA Sequencer (Applied Biosys tems社製)等を用いて行うことができる。
[0028] 該ポリペプチドをコードする DNAの一部の塩基配列が明らかになれば、例えば、 i — PCI^¾ (Nucl.Acids Res., 16, 8186 (1988))によりその全体の配列を決定すること ができる。
[0029] このようにして得られる本発明の DNAの例としては、配列表の配列番号 1に示す塩 基配列を含む DNA、および、配列表の配列番号 2に示す塩基配列を含む DNAを 挙げることができる。また、配列表の配列番号 1または配列番号 2に示す塩基配列と 相補的な塩基配列力 なる DNAとストリンジヱントな条件下でハイブリダィズする DN Aであって、かつ、（3S)— 1—クロ口 3— tert—ブトキシカルボ-ルァミノ— 4 フエ 二ルー 2 ブタノンを不斉的に還元し、 (2R, 3S)—1 クロロー 3—tert ブトキシカ ルポ-ルァミノ 4 フエニル 2 ブタノールを生成する活性を有するポリペプチド をコードする DNAも、本発明の DNAに包含される。
[0030] 配列表の配列番号 1または配列番号 2に示す塩基配列と相補的な塩基配列力 な る DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNAとは、コ口-一'ハイブリ ダイゼーシヨン法、プラーク 'ハイブリダィゼーシヨン法、あるいはサザンハイブリダィゼ ーシヨン法等を実施した際、配列表の配列番号 1または配列番号 2に示す塩基配列 と相補的な塩基配列を有する DNAと特異的にハイブリッドを形成する DNAを言う。
[0031] ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば、 75mMクェン酸三ナトリウム、 750mM 塩化ナトリウム、 0. 5%ドデシル硫酸ナトリウム、 0. 1%ゥシ血清アルブミン、 0. 1%ポ リビュルピロリドン、および、 0. l%Ficoll 400 (アマシャムバイオサイエンス株式会 社製）の組成からなる水溶液中、 65°Cでハイブリダィゼーシヨンを行った後に、 15m Mクェン酸三ナトリウム、 150mM塩化ナトリウム、および 0. 1%ドデシル硫酸ナトリウ ムの組成力もなる水溶液を用いて、 60°Cで洗浄が行われる条件を言う。好ましくは、 上記条件でハイブリダィゼーシヨンを行った後に、 15mMクェン酸三ナトリウム、 150 mM塩ィ匕ナトリウム、および 0. 1%ドデシル硫酸ナトリウムの組成力もなる水溶液を用 いて、 65°Cで洗浄が行われる条件を表す。より好ましくは、前記と同様にハイブリダィ ゼーシヨンを行った後に、 1. 5mMクェン酸三ナトリウム、 15mM塩化ナトリウム、およ び 0. 1%ドデシル硫酸ナトリウムの組成力もなる水溶液を用いて、 65°Cで洗浄が行 われる条件である。
[0032] 本発明のポリペプチドの例としては、配列表の配列番号 1に示す塩基配列によって コードされる、配列表の配列番号 3に示すアミノ酸配列力 なるポリペプチド、および 、配列表の配列番号 2に示す塩基配列によってコードされる、配列表の配列番号 4に 示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを挙げることができる。
[0033] また、これら 2種のポリペプチドのいずれかと一定値以上の相同性を有し、かつ、（3 S)— 1—クロ口一 3— tert -ブトキシカルボニルァミノ 4 フエニル 2 ブタノンを 不斉的に還元し、 (2R, 3S)—1 クロ口 3— tert—ブトキシカルボ-ルァミノ— 4— フエ-ルー 2—ブタノールを生成する活性を有するポリペプチドは、これら 2種のポリ ペプチドと機能的に同等であり、本発明に含まれる。
[0034] ここで配列の相同性は、例えば、相同性検索プログラム FASTA (W.R. Pearson & D.J. Lipman; Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 2444-2448 (1988))を用いて 2つのアミノ 酸配列を比較解析した場合に、配列全体に対する Identityの値で表される。配列表 の配列番号 3または配列番号 4に示すポリペプチドと同等なポリペプチドとしては、こ れら 2種のポリペプチドのいずれかとの相同性力 78%以上（配列番号 3のポリぺプ チドと配列番号 4のポリペプチドの相同性が 78%である）、好ましくは 80%以上、より 好ましくは 85%以上、さらに好ましくは 90%以上であるポリペプチドを挙げることがで きる。
[0035] このようなポリペプチドは、例えば、先述の配列表の配列番号 1または配列番号 2に 示す塩基配列と相補的な塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件下でハイブ リダィズする DNAを、適当なベクターに連結した後、適当な宿主細胞に導入して発 現させることにより得られる。また、例えば、 Current Protocols in Molecular Biology (J ohn Wiley and Sons, Inc., 1989)等に記載の公知の方法に従い、配列表の配列番号 3または配列番号 4に示すアミノ酸配列力 なるポリペプチドに、アミノ酸の置換、挿 入、欠失または付加を生じさせることによつても取得できる。
[0036] 後者の手法により取得したポリペプチドの例としては、配列表の配列番号 4に示す アミノ酸配列において、 42番目のァラニンをグリシンに、 43番目のグルタミン酸をァラ ニンに、 46番目のリジンをグルタミン酸に、および Zまたは、 49番目のァスパラギンを リジンに置換して得られるポリペプチドを挙げることができる。これら 4つの変異全てを 有するポリペプチド（変異ポリペプチド 1)を配列表の配列番号 16に、このポリべプチ ドをコードする DNA (変異 DNA1)を配列表の配列番号 15に示した。
[0037] 本発明の DNAを宿主微生物内に導入し、導入された宿主微生物内で発現させる ために用いられるベクターは、適当な宿主微生物内で該 DNAがコードする遺伝子を 発現できるものであれば特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、プ ラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられ、さらに、他の宿 主株との間での遺伝子交換が可能なシャトルベクターも使用できる。
[0038] このようなベクターは、通常、 lacUV5プロモーター、 trpプロモーター、 trcプロモー ター、 tacプロモーター、 lppプロモーター、 tufBプロモーター、 recAプロモーター、 p Lプロモーター等の制御因子を含み、本発明の DNAと作動可能に連結された発現 単位を含む発現ベクターとして好適に使用できる。例えば、 pUCNT(WO94/036 13公報）が好適に使用できる。
[0039] 本明細書で用いる用語「制御因子」は、機能的プロモーター及び、任意の関連する 転写要素（例えばェンハンサー、 CCAATボックス、 TATAボックス、 SPI部位など） を有する塩基配列をいう。
[0040] 本明細書で用いる用語「作動可能に連結」は、遺伝子の発現を調節するプロモー ター、ェンノヽンサ一等の種々の調節エレメントと遺伝子力 宿主細胞中で作動し得る 状態で連結されることをいう。制御因子のタイプ及び種類力 宿主に応じて変わり得 ることは、当業者に周知の事項である。
[0041] 本発明の発現ベクターとしては、後述する、 pUCNTに配列番号 1に示す DNAを 導入した pNTOM3、配列番号 2に示す DNAを導入した pNTOM4、配列番号 15に 示す DNAを導入した pNTOM5等を挙げることができる。
[0042] 本発明の DNAを含むベクターを導入する宿主細胞としては、細菌、酵母、糸状菌 、植物細胞、動物細胞などが挙げられるが、導入及び Z又は培養の容易さから細菌 が好ましぐ大腸菌が特に好ましい。本発明の DNAを含むベクターは、公知の方法 により宿主細胞に導入できる。宿主細胞として大腸菌を用いる場合、例えば、市販の E. coli HB101コンビテントセル（タカラバイオ社製）を用いることにより、当該べクタ 一を宿主細胞に導入できる。
[0043] 本発明の形質転換体としては、後述する、 E. coli HB101に前記 pNTM03を導 入した E. coli HB101 (pNTMO3) FERM BP— 10368、前記 pNTM04を導 入した E. coli HB101 (pNTOM4) FERM BP— 10369、前記 pNTM05を導 入した E. coli HB101 (pNTOM5) FERM BP— 10370等が挙げられる。これ ら形質転換体は、それぞれ前記の受託番号にて、独立行政法人産業技術総合研究 所特許生物寄託センター (IPOD：〒 305-8566 茨城県つくば巿東 1 1 1 中央 第 6)に寄託されている (原寄託日 2004年 6月 3日の国内寄託株をブダペスト条約に 基づく国際寄託へ移管（2005年 7月 6日））。
[0044] 本発明のポリペプチドを用いて、カルボ-ル基を有する化合物を不斉的に還元し、 光学活性アルコールを生産する場合、 NADH、 NADPH等の補酵素が必要となる。 しかし、酸化された該補酵素を還元型に変換する能力（以後、補酵素再生能と呼ぶ) を有するポリペプチド、および、当該ポリペプチドの基質となる化合物を、本発明のポ リペプチドと共存させて反応を行うことにより、高価な補酵素の使用量を大幅に削減 できる。
[0045] 補酵素再生能を有するポリペプチドとしては、例えば、ヒドロゲナーゼ、ギ酸脱水素 酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、グルコース 6—リン酸脱水 素およびグルコース脱水素酵素などを使用できる。好適には、グルコース脱水素酵 素が使用される。
[0046] 本発明のポリペプチドを用いた、光学活性アルコールの製造は、以下のように実施 できる。まず、適当な溶媒中に、基質となるカルボ-ル基を有する化合物、 NADPH 等の補酵素、および該ポリペプチドを添加し、 pH調整下、攪拌して反応を行う。本発 明のポリペプチドと補酵素再生能を有するポリペプチドを組み合わせて反応を行う場 合は、上記反応組成に、補酵素再生能を有するポリペプチド (例えば、グルコース脱 水素酵素）と、その基質となる化合物 (例えば、グルコース)をさらに添加する。
[0047] 反応には水系溶媒を用いてもよいし、水系と有機系の溶媒を混合して用いてもよい 。有機系溶媒としては、例えば、トルエン、酢酸ェチル、酢酸 n—ブチル、へキサン、 イソプロパノール、ジイソプロピルエーテル、メタノール、アセトン、ジメチルスルホキシ ド等が挙げられる。反応は 10°C〜70°Cの温度で行われ、反応液の pHは 4〜10に維 持する。反応は、バッチ方式あるいは連続方式で実施できる。バッチ方式の場合、反 応基質は 0. 1%から 70% (wZv)の仕込み濃度で添加される。基質となるカルボ- ル基を有する化合物としては、例えば、（3S)— 1 クロロー 3— tert ブトキシカル ボ-ルァミノ 4 フエ-ルー 2 ブタノンが挙げられる力 上述の反応条件において 還元され、光学活性アルコールに変換されるものであれば、特に限定されない。
[0048] 本発明のポリペプチドの代わりに、該ポリペプチドをコードする DNAを含む形質転 換体またはその処理物を使用しても、同様に反応を行うことができる。また、本発明の ポリペプチドをコードする DNA、および、補酵素再生能を有するポリペプチドをコー ドする DNAの両者を含む形質転換体またはその処理物を使用しても、同様に反応 を行うことができる。なお、「形質転換体の処理物」とは、例えば、界面活性剤や有機 溶媒で処理した細胞、乾燥細胞、破砕処理した細胞、細胞の粗抽出液等のほか、公 知の手段でそれらを固定ィ匕したものを意味する。
[0049] なかでも、本発明のポリペプチドをコードする DNA、および、補酵素再生能を有す るポリペプチドをコードする DNAの両者を含む形質転換体またはその処理物を使用 した場合には、補酵素を再生するための酵素を別途調製 ·添加する必要がなぐ光 学活性アルコールの製造を効率よく行!、得る。
[0050] 本発明のポリペプチドをコードする DNA、および、補酵素再生能を有するポリぺプ チドをコードする DNAの両者を含む形質転換体は、本発明のポリペプチドをコード する DNA、および、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードする DNAの両者を 、同一のベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入することにより得られるほ力、こ れら 2種の DNAを不和合性グループの異なる 2種のベクターにそれぞれ組み込み、 それら 2種のベクターを同一の宿主細胞に導入することによつても得られる。
[0051] 本発明のポリペプチドをコードする DNA及び補酵素再生能を有するポリペプチド をコードする DNAの両者が組込まれたベクターとしては、前記発現ベクター pNTO M3、 pNTOM4、及び pNTOM5のそれぞれに、バシラス'メガテリゥム由来のダルコ ース脱水素酵素遺伝子を導入した、 pNTOM3Gl、 pNTOM4Gl、 pNTOM5Gl 等が挙げられる。本発明のポリペプチドをコードする DNA、および、補酵素再生能を 有するポリペプチドをコードする DNAの両者を含む形質転換体としては、 E. coli H B101をこれらのベクターで形質転換した E. coli HB101 (pNTOM3Gl)、 E. coli HB101 (pNTOM4Gl)、 E. coli HB101 (pNTOM5Gl)等が挙げられる。
[0052] 形質転換体中の補酵素再生能を有するポリペプチドの活性は、常法により測定す ることができる。例えば、グルコース脱水素酵素の活性は、 1Mのトリス塩酸緩衝液 (p H8. 0)に、 lOOmMのグルコース、 2mMの補酵素 NADPまたは NAD、および酵素 を添加し、 25°Cで 1分間反応させた際の、波長 340nmにおける吸光度の増加速度 から算出できる。
[0053] 本発明のポリペプチドをコードする DNAを含む形質転換体の培養は、それが増殖 する限り、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培 地を用いて実施できる。
[0054] 反応で生じた光学活性アルコールは、常法により精製できる。例えば、反応で生じ た光学活性アルコールが（2R, 3S)—1 クロロー 3—tert ブトキシカルボ-ルアミ ノー 4 フエ-ルー 2 ブタノールである場合、反応液を酢酸ェチル、トルエン等の有 機溶媒で抽出し、有機溶媒を減圧下で除去する。さらに、晶析またはクロマトグラフィ 一等の処理を行うことにより、精製できる。
[0055] (3S)—1—クロ口一 3— tert—ブトキシカルボ-ルァミノ一 4—フエ-ルー 2 ブタノ ンと、 (2R, 3S)— 1—クロ口— 3— tert—ブトキシカルボ-ルァミノ— 4—フエ-ルー 2 ーブタノールの定量、および、（2R, 3S)—1 クロロー 3—tert ブトキシカルボ- ルァミノ 4 フエニル 2 ブタノールのジァステレオマー過剰率の測定は、高速 液体クロマトクロマトグラフィー（カラム： COSMOSIL 5C8-MS ( 4. 6mm X 25
Omm;ナカライテスタ社製）、溶離液： 10mMリン酸水溶液 Zァセトニトリル = 1Z1、 流速： lmlZmin、検出： 210nm)を用いて行うことができる。
[0056] 以上のように、本発明に従えば、本発明のポリぺフチドの効率的生産が可能であり 、それを利用することにより、 (2R, 3S)—1 クロロー 3—tert ブトキシカルボ-ル アミノー 4—フエニル 2 ブタノールを始めとする、種々の有用な光学活性アルコ一 ルの優れた製造法が提供される。
実施例
[0057] 以下、実施例で本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるもの ではない。なお、以下の実施例において用いた組み換え DNA技術に関する詳細な 操作方法などは、次の成書に記載されている：
Molecularし loning 2nd Edition (し old Spring Harbor Laboratory Press, 1989 J、 Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publishing Associates and Wiley— Int erscience) 0
[0058] (実施例 1)ポリペプチドの精製
以下の方法に従って、ォガタエア 'ミニユータ 'バ^ ~ ·ミニユータ（Ogataea minuta var . minuta) NBRC0975株より、（3S)— 1 クロ口 3— tert—ブトキシカルボ-ルアミ ノ一 4—フエ-ル 2 ブタノンを不斉的に還元して（2R, 3S)— 1—クロ口一 3— tert ブトキシカルボ-ルァミノ 4 フエ-ル 2 ブタノールを生成する活性を有する ポリペプチドを単一に精製した。特に断りのない限り、精製操作は 4°Cで行った。
[0059] (3S)—1—クロ口一 3— tert—ブトキシカルボ-ルァミノ一 4—フエ-ルー 2 ブタノ ンに対する還元活性は、 0. 33% (vZv)のジメチルスルホキシドを含む lOOmMリン 酸緩衝液 (PH6. 5)に、基質（3S)—1—クロ口— 3— tert—ブトキシカルボ-ルァミノ 4ーフヱ-ルー 2 ブタノンを終濃度 0. 2mM、補酵素 NADPHを終濃度 0. 25m Mとなるよう溶解し、さらに粗酵素液を添加して 30°Cで 1分間反応を行った際の、当 該反応液の波長 340nmにおける吸光度の減少速度力も算出した。本反応条件にお いて、 1分間に: molの NADPHを NADPに酸化する活性を、 lunitと定義した。
[0060] (微生物の培養）
30Lジャーフアーメンター（丸菱バイオェンジ社製）に、グルコース 5%、ポリペプトン 0. 5%、イーストエキス 0. 1%、リン酸水素-カリウム 0. 1%、リン酸-水素カリウム 0. 2%、硫酸マグネシウム ·七水和物 0. 02%、 (pH6. 5)からなる液体培地 18Lを調製 し、 120°Cで 20分間蒸気殺菌をおこなった。
[0061] この培地に、予め同培地にて前培養しておいたォガタエア 'ミニユータ 'バ一'ミニュ ータ（Ogataea minuta var. minuta) NBRC0975株の培養液を 180ml接種し、攪拌 回転数 250rpm、通気量 5. ONL/min, 28°Cの条件で、 48時間培養した。
[0062] (無細胞抽出液の調整）
上記の培養液から遠心分離により菌体を集め、 10mMトリス塩酸緩衝液 (pH7. 5) 2000mlを用いて菌体を洗浄し、該菌株の菌体 907gを得た。この菌体を 0. ImMの ジチオスレィトール（DTT)を含む 10mMトリス塩酸緩衝液（pH7. 5) 1800mlに懸 濁し、 UH— 600型超音波分散機 (SMT社製)を用いて菌体を破砕した。この破砕 物から遠心分離にて菌体残渣を除き、無細胞抽出液を得た。
[0063] (硫酸アンモニゥム分画）
上記で得た無細胞抽出液の pHを、アンモニア水を用いて 7. 5に調整した後、同 p Hを維持しながら、 40%飽和となるように硫酸アンモ-ゥムを添加、溶解し、生じた沈 殿を遠心分離により除いた。先と同様 pH7. 5を維持しながら、この遠心上清に 60% 飽和となるようさらに硫酸アンモ-ゥムを添加、溶解し、生じた沈殿を遠心分離により 集めた。この沈殿を 0. ImMの DTTを含む lOmMトリス塩酸緩衝液 (pH7. 5)に溶 解した後、同一緩衝液で 1夜透析し、活性画分を得た。
[0064] (DEAE— Sephacelカラムクロマトグラフィー）
硫酸アンモ-ゥム分画により得られた活性画分を、 0. ImMの DTTを含む lOmM トリス塩酸緩衝液（pH7. 5)にて予め平衡化した DEAE— Sephacel (アマシャムバイ ォサイエンス株式会社製)カラム（ φ 29 X 290mm)に供し、活性画分を吸着させた。 同一緩衝液でカラムを洗浄した後、 塩ィ匕ナトリウムのリニアグラジェント（0Mから 1M まで）により活性画分を溶出させた。活性画分を集め、同一緩衝液にて 1夜透析を行 つた o
[0065] (MonoQ HRカラムクロマトグラフィー）
DEAE— Sephacelカラムクロマトグラフィーにより得られた活性画分を、 0. ImM の DTTを含む lOmMトリス塩酸緩衝液（pH7. 5)にて予め平衡化した MonoQ HR ιοζιοカラム (アマシャムバイオサイエンス株式会社製）に供し、活性画分を吸着 させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、 塩ィ匕ナトリウムのリニアグラジェント (0M から 1Mまで）により活性画分を溶出させた。活性画分を集め、同一緩衝液にて 1夜 透析を行った。
[0066] (Phenyl— Superoseカラムクロマトグラフィー）
MonoQ HRカラムクロマトグラフィーにより得られた活性画分に、終濃度が 4Mと なるよう塩化ナトリウムを溶解し、 4Mの塩化ナトリウムと 0. ImMの DTTを含む 10m Mトリス塩酸緩衝液（pH7. 5)にて予め平衡化した Phenyl— Superose HR 10/ 10カラム (アマシャムバイオサイエンス株式会社製）に供し、活性画分を吸着させた。 同一緩衝液でカラムを洗浄した後、 塩ィ匕ナトリウムのリニアグラジェント (4Mから 0M まで）により活性画分を溶出させた。活性画分を集め、 0. ImMの DTTを含む 10m Mトリス塩酸緩衝液 (pH7. 5)にて 1夜透析を行った。
[0067] (MonoQ HRカラムクロマトグラフィー）
Phenyl— Superoseカラムクロマトグラフィーにより得られた活性画分を、 0. ImM の DTTを含む 10mMトリス塩酸緩衝液（pH7. 5)にて予め平衡化した MonoQ HR
5Z5カラム (アマシャムバイオサイエンス株式会社製）に供し、活性画分を吸着させ た。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、 塩ィ匕ナトリウムのリニアグラジェント（0Mから 1Mまで）により活性画分を溶出させた。活性画分嫌め、 Centricon YM— 10 (ミ リポア社製)を用いて濃縮した。
[0068] (ゲルろ過クロマトグラフィー）
上述の MonoQ HRカラムクロマトグラフィーにより得られた活性画分を、 0. 2Mの 塩ィ匕ナトリウムと 0. ImMの DTTを含む 10mMトリス塩酸緩衝液（pH7. 5)にて予め 平衡化した Superdex 200 HR 10/30カラム（アマシャムバイオサイエンス株式 会社製）に供し、同一緩衝液を用いて、 0. 5mlZ分の流速で活性画分を溶出させた 。活性画分^^め、 Centricon YM— 10 (ミリポア社製)を用いて濃縮した。さらに 、これを、同上緩衝液にて予め平衡化した Superdex 200 HR 10/30カラム（ァ マシャムノィォサイエンス株式会社製）に供し、同上緩衝液を用いて、 0. 5mlZ分の 流速で活性画分を溶出させた。活性画分を集め、ポリペプチドの精製標品とした。 [0069] (実施例 2) 遣伝子のクローニング
(PCRプライマーの作成）
実施例 1で得られた精製ポリペプチドを 8M尿素存在下で変性した後、ァクロモバク ター由来のリシルエンドべプチダーゼ (和光純薬工業株式会社製)で消化し、得られ たペプチド断片のアミノ酸配列を ABI492型プロテインシーケンサー（パーキンエル マー社製）により決定した。このアミノ酸配列から予想される DNA配列に基づき、該 ポリペプチドをコードする遺伝子の一部を PCRにより増幅するためのプライマー 1 : 5' - acngtntayttyathgcngg - 3 ' (配列表の配列番号 5)、および、プライマー 2 : 5，一 atn ggdatrtcraaytgrtc- 3' (配列表の配列番号 6)を合成した。
[0070] (PCRによる遺伝子の増幅）
実施例 1と同様に培養したォガタエア ·ミニユータ ·バ一'ミニユータ（Ogataea minuta var. minuta) NBRC0975株の菌体から Visser等の方法（Appl. Microbiol. Biotechn ol.， 53, 415 (2000))に従って染色体 DNAを抽出した。次に、上記で調製した DNA プライマー 1および 2を用い、得られた染色体 DNAを铸型として PCRを行ったところ 、 目的遺伝子の一部と考えられる約 700bpの DNA断片が増幅された。 PCRは、 DN Aポリメラ一ゼとして TaKaRa Ex Taq (タカラバイオ社製)を用いて行い、反応条件 はその取り扱い説明書に従った。この DNA断片を、プラスミド pT7Blue T—Vecto r (Novagen社製）にクローユングし、 ABI PRISM Dye Terminator Cycle S equencing Ready Reaction Kit (Perkin Elmer社製）および ABI 373A D NA Sequencer (Perkin Elmer社製）を用いてその塩基配列を解析した。その結 果、本 PCRにより、塩基配列の異なる 2種類の DNA断片が増幅されていることが判 明した。それらの塩基配列を、配列表の配列番号 7、および、配列番号 8に示した。
[0071] (i PCR法による目的遺伝子の全長配列の決定）
上記で調製したォガタエア 'ミニユータ 'バ^ ~ ·ミニユータ（Ogataea minuta var. minut a) NBRC0975株の染色体 DNAを、制限酵素 Xbalで完全消化し、得られた DNA 断片の混合物を T4リガーゼにより分子内環化させた。これを铸型として用い、 i PC R法（Nucl. Acids Res., 16, 8186 (1988))〖こより、上述の配列番号 7に示す塩基配列 を含む遺伝子の全塩基配列を決定した。その結果を、配列表の配列番号 1に示した 。 i— PCRは、 DNAポリメラ一ゼとして TaKaRa LA Taq (タカラバイオ社製）を用い て行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。上述の配列番号 8に示す塩基配 列を含む遺伝子の全塩基配列も、同様の操作で決定し、その結果を配列表の配列 番号 2に示した。また、配列番号 1に示した塩基配列がコードするアミノ酸配列を配列 番号 3に、配列番号 2に示した塩基配列がコードするアミノ酸配列を配列番号 4に、そ れぞれ示した。
[0072] (実施例 3) 発現ベクターの構築
プライマー 3 : 5， - gtgcatatgaccaagactgtttatttca - 3 ' (酉己歹 U表の酉己歹 U番号 9)と、プラ イマ一 4 : 5，一 gtcgaattcttattaaaatggaatgtcgaa— 3，（配歹 U表の配歹 U番号 10)を用い、 実施例 2で得たォガタエア 'ミニユータ'バー 'ミニユータ（Ogataea minuta var. minuta ) NBRC0975株の染色体 DNAを铸型として PCRを行った。その結果、配列表の配 列番号 2に示す塩基配列からなる遺伝子の開始コドン部分に Ndel認識部位が付カロ され、かつ終始コドンの直後に EcoRI認識部位が付加された二本鎖 DNAを得た。 P CRは、 DNAポリメラ一ゼとして TaKaRa LA Taq (タカラバイオ社製）を用いて行 い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。この DNAを Ndel及び EcoRIで消化 し、プラスミド pUCNT (WO94Z03613公報）の lacプロモーターの下流の Ndel認 識部位と EcoRI認識部位の間に挿入し、組換えベクター PNTOM4を構築した。
[0073] 同様に、プライマー 5 : 5， - gtgcatatggctaagactgtctatttca - 3 ' (配列表の配列番号 1 1)と、プライマー 6 : 5， - gtcgaattcttactagaatggaatgtcaaa - 3 ' (配列表の配列番号 12 )を用い、配列表の配列番号 1に示す塩基配列力 なる遺伝子の開始コドン部分に Ndel認識部位が付加され、かつ終始コドンの直後に EcoRI認識部位が付加された 、二本鎖 DNAを得た。この DNAを、先と同様、プラスミド pUCNTに挿入し、組換え ベクター PNTOM3を構築した。
[0074] (実施例 4) 栾¾遺伝子の作製
Mutan- SuperExpress Km (タカラバイオ社製）を用いて、その取扱い説明書 に記された操作方法に従 、、配列表の配列番号 2に示した塩基配列力 なる遺伝子 中の 125番目の Cを G【こ、 128番目の Aを C【こ、 136番目の Aを G【こ、そして、 147番 目の Cを Gに置換した変異遺伝子を作製した。本変異遺伝子は、配列表の配列番号 4に示したアミノ酸配列中の、 42番目のァラニンがグリシンに置換され、 43番目のグ ルタミン酸がァラニンに置換され、 46番目のリジンがグルタミン酸に置換され、 49番 目のァスパラギンがリジンに置換されたポリペプチドをコードする。本変異遺伝子の 塩基配列を配列表の配列番号 15に、当該遺伝子にコードされる変異ポリペプチドの アミノ酸配列を、配列表の配列番号 16に示す。本変異遺伝子を、実施例 3と同様に ベクター pUCNTに挿入し、組換えベクター pNTOM5を構築した。
[0075] (実施例 5) グルコース脱水素酵素遣伝子をさらに含む発現ベクターの構築
プフ マ一 7 : 5 ― gccgaattctaaggaggttaacaatgtataaa— 3 (目己歹 U表の目 ΰ歹 U番号上 3) と、プライマー 8 : 3， - gcggtcgacttatccgcgtcctgcttgg - 5 ' (配列表の配列番号 14)を 用い、プラスミド pGDKl (Eur. J. Biochem., 186, 389 (1989))を铸型として PCRを行 い、バシラス'メガテリゥム（Bacillus megaterium) IAM1030株由来のグルコース脱水 素酵素（以後、 GDHと呼ぶ)遺伝子の開始コドンから 5塩基上流に大腸菌のリボゾ一 ム結合配列が、さらにその直前に EcoRI切断点が付加され、かつ、終止コドンの直後 に Sail切断点が付加された、二本鎖 DNAを取得した。
[0076] 得られた DNA断片を EcoRIおよび Sailで消化し、実施例 3および 4において構築 した pNTOM3、 pNTOM4、および、 pNTOM5の EcoRI、 Sail部位にそれぞれ揷 入した組み換えプラスミド pNTOM3Gl、 pNTOM4Gl、および、 pNTOM5Glを 構築した。 例として、 PNTOM4G1の作製法および構造を図 1に示す。
[0077] ( me) 形皙転橼体の作製
実施例 3および 4で構築した組換えベクター ρΝΤΟΜ3、 ρΝΤΟΜ4、および、 ρΝΤ ΟΜ5をそれぞれ用いて、 E. coli HB101コンビテントセル（タカラバイオ社製）を形 質転換し、 E. coli HB101 (pNTOM3)、 E. coli HB101 (pNTOM4)、および、 E. coli HB101 (pNTOM5)を得た。これらの形質転換体は、それぞれ、受託番号 FERM BP— 10368、受託番号 FERM BP— 10369、受託番号 FERM BP— 1 0370として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター (IPOD)に 寄託されている。
[0078] また、同様に、実施例 5で構築した組換えベクター pNTOM3Gl、 pNTOM4Gl、 および、 PNTOM5G1をそれぞれ用いて、 E. coli HB101コンビテントセル（タカラ バイオ社製）を形質転換し、 E. coli HB101 (pNTOM3Gl)、 E. coli HB101 (p NTOM4G1)、および、 E. coli HB101 (pNTOM5Gl)を得た。
[0079] (実施例 7) 形皙転椽体における遣伝早の 現
実施例 6で得た 6種の形質転換体、および、ベクタープラスミド pUCNTを含む形質 転換体である E. coli HB101 (pUCNT)を、 200 μ g/mlのアンピシリンを含む 2 XYT培地（卜リプトン 1. 6%、イーストエキス 1. 0%, NaClO. 5%、 pH7. 0) 50mlに 接種し、 37°Cで 24時間振盪培養した。遠心分離により菌体を集め、 50mlの 100m Mリン酸緩衝液 (pH6. 5)に懸濁した。これを、 UH— 50型超音波ホモゲナイザー（ SMT社製)を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液 を得た。この無細胞抽出液の（3S)—1 クロロー 3—tert ブトキシカルボ-ルァミノ —4 フエニル— 2 ブタノン還元活性、および、 GDH活性を測定し、比活性として 表したものを、表 1に示した。実施例 6で得られた 6種の形質転換体のいずれにおい ても、（3S)—1—クロ口 3— tert—ブトキシカルボ-ルァミノ— 4—フエ-ルー 2 ブ タノン還元活性の発現が認められた。また、 GDH遺伝子を含む E. coli HBlOKp NTOM3Gl)、E. coli HB101 (pNTOM4Gl)、および、 E. coli HBlOKpNT OM5G1)では、 GDH活性の発現も認められた。 （3S)—1 クロロー 3—tert ブト キシカルボニルァミノ 4 フエニル 2 ブタノン還元活性は、実施例 1に記載の方 法で測定した。 GDH活性は、 1Mトリス塩酸緩衝液 (pH8. 0)に、グルコース 0. 1M 、補酵素 NADP2mM、および粗酵素液を添加して 25°Cで 1分間反応を行い、波長 340nmにおける吸光度の増加速度より算出した。この反応条件において、 1分間に ： molの NADPを NADPHに還元する酵素活性を lunitと定義した。また、無細胞 抽出液中の蛋白質濃度は、プロテインアツセィキット (BIO—RAD社製)を用いて測 し 7こ。
[0080] [表 1] 歯袪名 CBPB還元活性 GDH活性
CU/mg) CU/mg)
£co/ HB101(pUCNT) 0.0 0
Ecoli HB101(pNTOM3) 6.3 0
£co// HB101(pNTO 4) 5.0 0
£co// HB101(pNTO 5) 14.0 0
Ecoli HB101(pNTO 3G1) 5.7 119
Ecoli HB101(pNTOM4G1) 3.5 157
Ecoli HB101(pNTOM5G1) 9.0 122
CBPB*: (3S)-1 -ク叩- 3~tert -: 7'トキシカル木 'ニルアミノ- 4 -フエ二ル- 2-ブタノン
[0081] (実施例 8) 形皙転椽体を用いた反
実施例 7で調製した E. coli HB101 (pNTOM3)の無細胞抽出液 50mlに、グル コース脱水素酵素（天野ェンザィム社製） 2000U、グルコース 2g、 NADP6mg、 (3 S)— 1—クロ口一 3— tert -ブトキシカルボ-ルァミノ 4 フエニル 2 ブタノン 2 . 5gを添加し、 5Mの水酸化ナトリウムの滴下により pH6. 5に調整しつつ、 30°Cで 2 2時間攪拌した。反応終了後、反応液をトルエンで抽出し、脱溶剤した後、抽出物を 分析した。その結果、収率 86. 3%でジァステレオマー過剰率 96. 4%d. e. の（2R , 3S)—1—クロ口一 3— tert—ブトキシカルボ-ルァミノ一 4—フエ-ルー 2 ブタノ ールが得られた。
[0082] (3S)—1—クロ口一 3— tert—ブトキシカルボ-ルァミノ一 4—フエ-ルー 2 ブタノ ンと（3S)— 1—クロ口一 3— tert -ブトキシカルボニルァミノ 4 フエニル 2 ブタ ノールの定量、および、 （2R, 3S)— 1 クロロー 3—tert ブトキシカルボ-ルァミノ 4 フエ-ル 2 ブタノールのジァステレオマー過剰率の測定は、高速液体クロ マトクロマトグラフィー（カラム： COSMOSIL 5C8 -MS ( 4. 6mm X 250mm;ナ 力ライテスタ社製）、溶離液： 10mMリン酸水溶液 Zァセトニトリル = 1/1,流速： 1ml Zmin、検出： 210nm)で行った。
[0083] WM9) 形皙転橼体 用いた
実施例 7で調製した E. coli HB101 (pNTOM4)の無細胞抽出液 22. 5mlに、グ ルコース脱水素酵素（天野ェンザィム社製） 1250U、グルコース 3g、 NADP4mg、 (3S)— 1—クロ口一 3— tert -ブトキシカルボ-ルァミノ 4 フエニル 2 ブタノン 0. 25gを添カロし、 5Mの水酸ィ匕ナ卜リウムの滴下により pH6. 5に調整しつつ、 30°C で攪拌した。反応開始力 2時間後、 4時間後、 6時間後に 0. 25g、 8時間後に 1. 2 5gの（3S)— 1—クロ口 3— tert—ブトキシカルボ-ルァミノ— 4—フエ-ルー 2 ブ タノンを追加し、 31時間反応させた。反応終了後、反応液をトルエンで抽出し、脱溶 剤した後、抽出物を実施例 8と同様に分析した。その結果、収率 99. 0%で、ジァス テレオマー過剰率 99. 8%d. e.の（2R, 3S)— 1—クロ口 3— tert—ブトキシカル ボ-ルァミノ 4 フエ-ル 2 ブタノールが得られた。
[0084] (実施例 10) 形皙転椽体を用いた反
実施例 7と同様に培養した E. coli HB101 (pNTOM4Gl)の培養液 25mlに、グ ルコース 3g、 NADP3mgゝ トルエン 0. 25ml, (3S)—1—クロ口一 3— tert—ブトキ シカルボ-ルァミノ一 4—フエ-ルー 2 ブタノン 2. 5gを添加し、 5Mの水酸化ナトリ ゥムの滴下により pH6. 5に調整しつつ、 30°Cで 40時間攪拌した。反応終了後、反 応液をトルエンで抽出し、脱溶剤した後、抽出物を実施例 8と同様に分析した。その 結果、収率 99. 1%で、ジァステレオマー過剰率 99. 8%d. e.の（2R, 3S)— 1ーク ロロ 3 tert ブトキシカルボ-ルァミノ 4 フエニル 2 ブタノールが得られ た。
[0085] m ) 形皙転橼体 用いた ]^
実施例 7と同様に培養した E. coli HB101 (pNTOM5Gl)の培養液 50mlに、グ ルコース 6g、 NADP1. 4mgゝ トルエン 0. 25ml、 （3S)— 1 クロ口一 3— tert—ブト キシカルボ-ルァミノ— 4—フエ-ルー 2 ブタノン 2. 5gを添加し、 5Mの水酸化ナト リウムの滴下により pH6. 5に調整しつつ、 30°Cで攪拌した。反応開始から 1時間後 に 2. 5gの（3S)—1—クロ口 3— tert—ブトキシカルボ-ルァミノ— 4—フエ-ルー 2—ブタノンを追加し、 20時間反応させた。反応終了後、反応液をトルエンで抽出し 、脱溶剤した後、抽出物を実施例 8と同様に分析した。その結果、収率 99. 6%で、 ジァステレオマー過剰率 99. 8%d. e.の（2R, 3S)— 1 クロ口 3— tert—ブトキ シカルボ-ルァミノ 4 フエニル 2 ブタノールが得られた。
[0086] (実施例 12) ポリペプチドの某晳特異性
0. 33% (vZv)のジメチルスルフォキシドを含む lOOmMリン酸緩衝液（pH6. 5) に、基質となるカルボ-ルイ匕合物を終濃度 lmM、補酵素 NADPHを終濃度 0. 25m Mとなるようそれぞれ溶解した。これに、実施例 7で調製した E. coli HBlOKpNT OM4)、または、 E. coli HB101 (pNTOM3)の無細胞抽出液を添カ卩し、 30°Cで 1 分間反応を行った。当該反応液の波長 340nmにおける吸光度の減少速度から、各 カルボ二ルイ匕合物に対する還元活性を算出し、これを（3S)— 1—クロ口 3— tert -ブトキシカルボ-ルァミノ 4 フエニル 2 ブタノンに対する活性を 100%とし た場合の相対値で表し、表 2に示した。当該形質転換体により生産された、配列表の 配列番号 3および配列番号 4に示したアミノ酸配列からなるポリペプチドは、 、ずれも 広範なカルボ二ルイ匕合物に対して還元活性を示した。
[表 2] 形質転換体が生産するポリぺプチドの基質特異性
Figure imgf000022_0002
Figure imgf000022_0001
Figure imgf000022_0003
(3S) -1 -3-tert-7* ^vM' 7ΐ -7ι^-2-7'

Claims

請求の範囲 以下の（a)又は（b)の DNA： (a)配列表の配列番号 1に示す塩基配列を含む DNA、 (b)配列表の配列番号 1に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなる DNAとストリ ンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ、下記式 (1)
[化 1]
Figure imgf000023_0001
で表される（3S)—1 クロ口 3— tert—ブトキシカルボ-ルァミノ— 4—フエ-ルー 2—ブタノンを不斉的に還元して、下記式 (2)
[化 2]
Figure imgf000023_0002
で表される（2R, 3S)—1 クロロー 3—tert ブトキシカルボ-ルァミノー 4 フエ- ルー 2—ブタノールを生成する活性を有するポリペプチドをコードする DNA。
以下の（a)又は（b)の DNA：
(a)配列表の配列番号 2に示す塩基配列を含む DNA、
(b)配列表の配列番号 2に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなる DNAとストリ ンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ、前記式 (1)で表される（3S)— 1—クロ口 3 tert ブトキシカルボ-ルァミノ 4 フエニル 2 ブタノンを不斉的に還元 して、前記式 (2)で表される（2R, 3S)— 1 クロロー 3— tert ブトキシカルボ-ルァ ミノー 4 フエニル 2 ブタノールを生成する活性を有するポリペプチドをコードす る DNA。
[3] 請求項 1又は 2記載の DNAにコードされ、かつ、前記式 (1)で表される（3S)— 1—ク ロロ一 3 tert -ブトキシカルボニルァミノ 4 フエ-ル 2 ブタノンを不斉的に 還元して、前記式 (2)で表される（2R, 3S)— 1 クロロー 3— tert ブトキシカルボ- ルァミノ 4 フエニル 2 ブタノールを生成する活性を有するポリペプチド。
[4] 以下の（a)又は（b)のポリペプチド：
(a)配列表の配列番号 3に示すアミノ酸配列力 なるポリペプチド。
(b)配列表の配列番号 3に示すアミノ酸配列と 78%以上の相同性を有するアミノ酸 配列からなり、かつ、前記式 (1)で表される（3S)— 1 クロロー 3— tert ブトキシカ ルポニルァミノ 4 フエニル 2 ブタノンを不斉的に還元して、前記式 (2)で表さ れる（2R, 3S)—1—クロ口 3— tert—ブトキシカルボ-ルァミノ— 4—フエ-ルー 2 ブタノールを生成する活性を有するポリペプチド。
[5] 以下の（a)又は（b)のポリペプチド：
(a)配列表の配列番号 4に示すアミノ酸配列力 なるポリペプチド。
(b)配列表の配列番号 4に示すアミノ酸配列と 78%以上の相同性を有するアミノ酸 配列からなり、かつ、前記式 (1)で表される（3S)— 1 クロロー 3— tert ブトキシカ ルポニルァミノ 4 フエニル 2 ブタノンを不斉的に還元して、前記式 (2)で表さ れる（2R, 3S)—1—クロ口 3— tert—ブトキシカルボ-ルァミノ— 4—フエ-ルー 2 ブタノールを生成する活性を有するポリペプチド。
[6] 配列表の配列番号 4に示すアミノ酸配列において、以下の 1)〜4)のうちの、少なくと も 1つの変異を有するポリペプチド：
1) 42番目のァラニンがグリシンに置換されて 、る、
2) 43番目のグルタミン酸がァラニンに置換されて!、る、
3) 46番目のリジンがグルタミン酸に置換されて!、る、
4) 49番目のァスパラギンがリジンに置換されて!、る。
[7] 前記 1)〜4)の全ての変異を有する請求項 6記載のポリペプチド。
[8] 請求項 4〜7の!、ずれかに記載のポリペプチドをコードする DNA。
[9] 請求項 1、 2、又は 8記載の DNAを含むベクター。
[10] プラスミド pNTOM3である請求項 9記載のベクター。
[11] プラスミド pNTOM4である請求項 9に記載のベクター。
[12] プラスミド pNTOM5である請求項 9に記載のベクター。
[13] グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードする DNAをさらに含む、請 求項 9に記載のベクター。
[14] 前記グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドがバシラス'メガテリゥム (Badll us megaterium)由来のグルコース脱水素酵素である、請求項 13記載のベクター。
[15] 請求項 9〜 14のいずれかに記載のベクターにより、宿主細胞を形質転換して得られ る形質転換体。
[16] 前記宿主細胞が大腸菌である、請求項 15記載の形質転換体。
[17] E. coli HB101 (pNTOM3) FERM BP— 10368である、請求項 16記載の形質 転換体。
[18] E. coli HB101 (pNTOM4) FERM BP— 10389である、請求項 16記載の形質 転換体。
[19] E. coli HB101 (pNTOM5) FERM BP— 10370である、請求項 16記載の形質 転換体。
[20] 請求項 3〜7のいずれかに記載のポリペプチド、または、請求項 15〜 19のいずれか に記載の形質転換体、またはその処理物を、カルボ二ル基を有する化合物と反応さ せることを特徴とする光学活性アルコールの製造方法。
[21] 前記カルボ二ル基を有する化合物力 前記式 (1)で表される（3S)— 1 クロロー 3 t ert ブトキシカルボ-ルァミノ 4 フエニル 2 ブタノンであり、前記光学活性ァ ルコールが、前記式 (2)で表される（2R, 3S)— 1 クロロー 3— tert ブトキシカルボ -ルァミノ 4 フエニル 2 ブタノールである、請求項 20記載の製造方法。
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