ES2575560T3 - Polipéptidos cetorreductasa para preparar fenilefrina - Google Patents

Polipéptidos cetorreductasa para preparar fenilefrina Download PDF

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ES2575560T3 ES10810597.4T ES10810597T ES2575560T3 ES 2575560 T3 ES2575560 T3 ES 2575560T3 ES 10810597 T ES10810597 T ES 10810597T ES 2575560 T3 ES2575560 T3 ES 2575560T3
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Abstract

Polipéptido manipulado capaz de convertir la 1-(3-hidroxifenil)-2-(metilamino)etanona en (R)-fenilefrina, en el que la secuencia de aminoácidos del polipéptido tiene una identidad de al menos un 70% con la SEQ ID NO: 4 y comprende la diferencia de residuo M206C.

Description

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equivalentes a la hibridación en formamida al 50%, 5X solución de Denhart, 5X SSPE, SDS al 0,2% a 42°C, seguido de lavado en 0,2 X SSPE, SDS al 0,2%, a 42°C. Pueden proporcionarse condiciones de alta rigurosidad ejemplares, por ejemplo, mediante hibridación en condiciones equivalentes a formamida al 50%, 5X solución de Denhart, 5X SSPE, SDS al 0,2% a 42°C, seguido de lavado en 0,1X SSPE, y SDS al 0,1% a 65°C. Otra condición de alta rigurosidad es la hibridación en condiciones equivalentes a la hibridación en 5X SSC que contiene SDS al 0,1% (p:v) a 65°C y lavado en 0,1X SSC que contiene SDS al 0,1% a 65°C. Se describen otras condiciones de hibridación de alta rigurosidad, así como condiciones moderadamente rigurosas, en las referencias citadas anteriormente.
"Con optimización de codones" se refiere a cambios en los codones del polinucleótido que codifica una proteína a los utilizados preferentemente en un organismo concreto, de manera que la proteína codificada se exprese de manera eficaz en el organismo de interés. Aunque el código genético está degenerado en cuanto a que la mayoría de los aminoácidos están representados por varios codones llamados codones “sinónimos”, es bien sabido que el uso de codones por organismos concretos no es aleatorio y está sesgado hacia tripletes de codones concretos. Este sesgo en el uso de codones puede ser mayor en referencia a un determinado gen, genes de función común o de origen ancestral, proteínas altamente expresadas frente a proteínas con bajo número de copias, y las regiones codificantes de proteínas totales del genoma de un organismo. En algunas formas de realización, los polinucleótidos que codifican un polipéptido con actividad cetorreductasa de la divulgación pueden tener optimización de codones para la producción óptima a partir del organismo hospedador seleccionado para la expresión.
"Codones con sesgo en el uso de codones elevado, óptimo y preferente" se refiere indistintamente a los codones que se utilizan con mayor frecuencia en las regiones codificantes de proteínas que otros codones que codifican el mismo aminoácido. Los codones preferentes pueden determinarse con relación al uso de codones en un solo gen, un conjunto de genes de función o de origen común, genes altamente expresados, la frecuencia codónica en las regiones codificantes de proteínas totales de todo el organismo, la frecuencia codónica en las regiones codificantes de proteínas totales de organismos relacionados, o combinaciones de los mismos. Los codones cuya frecuencia aumenta en función del nivel de expresión génica son por lo general los codones óptimos para la expresión. Se conocen diversos métodos para determinar la frecuencia codónica (por ejemplo, el uso de codones, el uso relativo de codones sinónimos) y la preferencia codónica en organismos específicos, incluido el análisis multivariante, por ejemplo, mediante análisis por conglomerados o análisis de correspondencia, y el número efectivo de codones utilizados en un gen (véase GCG CodonPreference, Genetics Computer Group Wisconsin Package; CodonW, John Peden, Universidad de Nottingham; McInerney, J. O, 1998, Bioinformatics 14: 372-73; Stenico et al., 1994, Nucleic Acids Res. 222437-46; Wright, F., 1990, Gene 87:23-29). Se dispone de tablas de uso de codones para una lista creciente de organismos (véase, por ejemplo, Wada et al., 1992, Nucleic Acids Res. 20:2111-2118; Nakamura et al., 2000, Nucl. Acids Res. 28:292; Duret, et al., supra; Henaut y Danchin, "Escherichia coli and Salmonella", 1996, Neidhardt, et al. eds., ASM Press, Washington D.C., p. 2047-2066 La fuente de datos para obtener el uso de codones puede basarse en cualquier secuencia nucleotídica disponible capaz de codificar una proteína. Estos conjuntos de datos incluyen secuencias de ácidos nucleicos que de hecho se sabe codifican proteínas expresadas (por ejemplo, secuencias codificantes de proteínas completas-CDS), marcadores de secuencia expresada (ESTS), o regiones codificantes predichas de las secuencias genómicas (véase, por ejemplo, Mount, D., Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis, capítulo 8, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 2001; Uberbacher, E.C., 1996, Methods Enzymol. 266:259-281; Tiwari et al., 1997, Comput. Appl. Biosci. 13:263-270).
"Secuencia de control" se refiere a todos los componentes que son necesarios o ventajosos para la expresión de un polinucleótido y/o polipéptido de interés. Cada secuencia de control puede ser original o extraña a un polinucleótido que codifica el polipéptido. Tales secuencias de control incluyen, pero no se limitan a, una secuencia líder, secuencia de poliadenilación, secuencia de propéptido, promotor, secuencia de péptido señal, y terminador de la transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor, y señales de terminación de la transcripción y de la traducción. Las secuencias de control pueden estar provistas de conectores con el fin de introducir sitios de restricción específicos que faciliten la ligación de las secuencias de control con la región codificante del polinucleótido que codifica un polipéptido.
"Unido operativamente" se refiere a una configuración en la que una secuencia de control se coloca apropiadamente en una posición con respecto a un polinucleótido (por ejemplo, en una relación funcional) de manera que la secuencia de control dirija o regule la expresión de un polinucleótido y/o polipéptido.
"Secuencia promotora" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que es reconocida por una célula hospedadora para la expresión de un polinucleótido de interés (por ejemplo, una región codificante). La secuencia de control puede comprender una secuencia promotora apropiada. La secuencia promotora contiene secuencias de control de la transcripción, que intervienen en la expresión del polipéptido. El promotor puede ser cualquier secuencia de ácido nucleico que presente actividad transcripcional en la célula hospedadora de elección, incluidos promotores mutantes, truncados e híbridos, y puede obtenerse a partir de genes que codifican polipéptidos extracelulares o intracelulares ya sea homólogos o heterólogos a la célula hospedadora.
B. Polipéptidos manipulados
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Tabla 4: polipéptidos cetorreductasa, diferencias de residuo específicas, y actividades relativas para convertir el compuesto (2) en compuesto (1)
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SEQ ID NO: (nt/aa)
Diferencia de residuo (con respecto a la SEQ ID NO: 2) Nº de mutaciones codificantes en comparación con WT FIOP (SEQ ID NO: 4) Actividad relativa en comparación con WT
1/2
- - - -
3/4
E145A, F147L, Y190C 3 1 +
5/6
V95M; E145A; F147L; Y190C; A202F; M206C 6 7,3 +
7/8
V95M; E145A; F147L; Y190G; A202F; M206C 6 14,6 ++
9/10
V95M; S96L; E145A; F147L; Y190G; A202F; M206C; Y249F 8 29,2 ++
11/12
T2S; T76I; V95M; S96L; E145A; F147L; V148I; Y190G; A202F; M206C; Y249F 11 46,7 ++
13/14
T76I; V95M; S96L; E145A; F147L; V148I; T152A; L153M; Y190G; A202F; M206C; Y249F 12 74,75 ++
15/16
A64V; T76I; V95M; S96L; V99L; E145A; F147L; V148I; T152A; L153M; S159T; Y190G; D197A; E200P; A202F; M206C; Y249F 17 112,1 +++
17/18
I11L; A64V; T76I; V95M; S96L; V99L; E145A; F147L; V148I; T152A; L153M; S159T; Y190G; D197A; E200P; A202F; M206C; Y249F 18 134,6 +++
19/20
I11L; A64V; T76I; V95M; S96L; V99L; E145A; F147I; V148I; T152A; L153M; S159T; Y190G; D197A; E200P; A202F; M206C; Y249F 18 161,5 +++
21/22
V95M; E145A; F147L; Y190C 4 1,4 +
23/24
E145A; F147L; Y190C; M206C 4 1,6 +
25/26
E145A; F147L; Y190C; A202F 4 2,9 +
27/28
V95M; E145A; F147L; Y190C; A202F 5 5,0 +
29/30
V95M; E145A; F147L; Y190C; A202F; M206C; Y249F 7 11,9 ++
31/32
V95M; E145A; F147L; Y190G; A202F; M206C; Y249F 7 26,3 ++
33/34
T2S; V95M; E145A; F147L; Y190G; A202F; M206C 7 19,0 ++
45 En algunas formas de realización, el polipéptido cetorreductasa manipulado puede comprender una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% a una secuencia de aminoácidos de referencia de cualquiera de las SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 ó 34 y en el que los aminoácidos en las posiciones de diferencias de residuo indicadas en la Tabla 4 (supra) no están cambiados y el polipéptido tiene actividad cetorreductasa. Por consiguiente, en algunas formas de realización, los polipéptidos manipulados son capaces de convertir la 1-(3-hidroxifenil)-2-(metilamino)etanona en (R)-fenilefrina y comprenden una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos un 70% a la SEQ ID NO: 4 y comprenden adicionalmente la combinación de diferencias de residuo de cualquiera de las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 ó 34, en
55 comparación con la SEQ ID NO: 2.
En algunas formas de realización, estos polipéptidos manipulados pueden tener adicionalmente (es decir, además de las diferencias de residuo de las mutaciones mostradas en la Tabla 4) de aproximadamente 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 16, 1-7, 1-8, 1-9, 1-10, 1-11, 1-12, 1-14, 1-15, 1-16, 1-18, 1-20, 1-22, 1-24, 1-26, 1-30, 1-35, 1-40, 1-45, 1-50, 1-55 ó 1-60 diferencias de residuo en comparación con la secuencia de referencia. En algunas formas de realización, el número de diferencias de residuo puede ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 30, 35, 40, 45, 50, 55 ó 60 diferencias en comparación con la secuencia de referencia. Las diferencias de residuo pueden comprender inserciones, deleciones o sustituciones, o combinaciones de las mismas. En algunas formas de realización, las diferencias de residuo comprenden sustituciones conservadoras en comparación con la secuencia de
65 referencia.
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En algunas formas de realización, un polipéptido cetorreductasa manipulado comprende una secuencia de aminoácidos correspondiente a la SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 ó 34.
En algunas formas de realización, el polipéptido cetorreductasa es capaz de convertir de manera estereoespecífica la 1-(3-hidroxifenil)-2-(metilamino)etanona en (R)-fenilefrina en condiciones de reacción de pH de aproximadamente 7,0 (reduciéndose a 6,75 durante aproximadamente 2 horas) y una temperatura de aproximadamente 30°C en un tiempo de reacción de aproximadamente 20-25 horas con aproximadamente 0,7 g/l a aproximadamente 1,0 g/l de un polipéptido cetorreductasa de la divulgación. En una forma de realización, la reacción se inicia a un pH de aproximadamente 7,0 y se reduce a un pH de aproximadamente 6,75 después de 2 horas. En una forma de realización adicional, el pH se mantiene a aproximadamente 6,75 de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 24 horas o hasta que la reacción está sustancialmente finalizada o se agota el sustrato. En algunas formas de realización, el polipéptido cetorreductasa capaz de convertir de manera estereoespecífica al menos un 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más, de la 1-(3-hidroxifenil)-2-(metilamino)etanona en (R)-fenilefrina en condiciones de reacción de pH de aproximadamente 7,0 (reduciéndose hasta aproximadamente 6,75) y aproximadamente 30°C en aproximadamente 20-24 horas comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre las SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 ó 34.
En algunas formas de realización, una enzima cetorreductasa manipulada puede comprender deleciones de 1-20 aminoácidos por lo general en el extremo N-terminal o C-terminal. Por lo tanto, para todas y cada una de las formas de realización de los polipéptidos cetorreductasa de la divulgación, las deleciones pueden comprender uno o más aminoácidos, 2 o más aminoácidos, 3 o más aminoácidos, 4 o más aminoácidos, 5 o más aminoácidos, 6 o más aminoácidos, 8 o más aminoácidos, 10 o más aminoácidos, 15 o más aminoácidos, ó 20 o más aminoácidos, hasta un 10% del número total de aminoácidos, hasta un 20% del número total de aminoácidos, o hasta un 30% del número total de aminoácidos de los polipéptidos cetorreductasa, siempre que se mantenga la actividad funcional de la cetorreductasa. En algunas formas de realización, el número de deleciones puede ser 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 1-10, 1-11, 1-12, 1-14, 1-15, 1-16, 1-18, 1-20, 1-22, 1-24, 1-26, 1-30, 1-35, 1-40, 1-45, 1-50, 1-55 ó 1-60 aminoácidos. En algunas formas de realización, el número de deleciones puede ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 29 ó 30 residuos de aminoácidos.
En algunas formas de realización, la presente divulgación proporciona un polipéptido manipulado capaz de convertir el compuesto (2) en compuesto (1) con una actividad al menos 1,2 veces, al menos 1,5 veces, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 25 veces, al menos 40 veces, al menos 60 veces mayor, o más, con respecto a la actividad del polipéptido de la SEQ ID NO: 2 ó 4, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos un 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% con un polipéptido de referencia de la SEQ ID NO: 2 ó 4, a condición de que se excluya la secuencia de aminoácidos de uno cualquiera o más de los polipéptidos cetorreductasa descritos en una cualquiera o más de las siguientes publicaciones de patente: publicaciones de patente de EE.UU. nº 20080318295A1, 20090093031A1, 20090155863A1, 20090162909A1, 20090191605A1, 20100055751A1 y 20100062499A1; o publicaciones PCT nº WO/2010/025238A2 y WO/2010/025287A1.
En algunas formas de realización, los polipéptidos descritos en el presente documento no están limitados a los aminoácidos codificados genéticamente y pueden estar compuestos, ya sea en su totalidad o en parte, por aminoácidos naturales y/o no codificados sintéticos. Determinados aminoácidos no codificados que se encuentran comúnmente de los que pueden estar compuestos los polipéptidos descritos en el presente documento incluyen, pero no se limitan a: los D-estereoisómeros de los aminoácidos codificados genéticamente; ácido 2,3diaminopropiónico (Dpr); ácido α-aminoisobutírico (Aib); ácido ε-aminohexanoico (Aha); ácido δ-aminovalérico (Ava); N-metilglicina o sarcosina (MeGly o Sar); ornitina (Orn); citrulina (Cit); t-butilalanina (Bua); t-butilglicina (Bug); Nmetilisoleucina (MeIle); fenilglicina (Phg); ciclohexilalanina (Cha); norleucina (Nle); naftilalanina (Nal); 2clorofenilalanina (Ocf); 3-clorofenilalanina (Mcf); 4-clorofenilalanina (Pcf); 2-fluorofenilalanina (Off); 3fluorofenilalanina (Mff); 4-fluorofenilalanina (Pff); 2-bromofenilalanina (Obf); 3-bromofenilalanina (Mbf); 4bromofenilalanina (Pbf); 2-metilfenilalanina (Omf); 3-metilfenilalanina (Mmf); 4-metilfenilalanina (Pmf); 2nitrofenilalanina (Onf); 3-nitrofenilalanina (Mnf); 4-nitrofenilalanina (Pnf); 2-cianofenilalanina (Ocf); 3-cianofenilalanina (Mcf); 4-cianofenilalanina (Pcf); 2-trifluorometilfenilalanina (Otf); 3-trifluorometilfenilalanina (Mtf); 4trifluorometilfenilalanina (Ptf); 4-aminofenilalanina (Paf); 4-yodofenilalanina (Pif); 4-aminometilfenilalanina (Pamf); 2,4-diclorofenilalanina (Opef); 3,4-diclorofenilalanina (Mpcf); 2,4-difluorofenilalanina (Opff); 3,4-difluorofenilalanina (Mpff); pirid-2-ilalanina (2pAla); pirid-3-ilalanina (3pAla); pirid-4-ilalanina (4pAla); naft-1-ilalanina (1nAla); naft-2ilalanina (2nAla); tiazolilalanina (taAla); benzotienilalanina (bAla); tienilalanina (tAla); furilalanina (fAla); homofenilalanina (hPhe); homotirosina (hTyr); homotriptófano (hTrp); pentafluorofenilalanina (5ff); estirilkalanina (sAla); autrilalanina (aAla); 3,3-difenilalanina (Dfa); ácido 3-amino-5-fenilpentanoico (Afp); penicilamina (Pen); ácido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina-3-carboxílico (Tic); β-2-tienilalanina (Thi); sulfóxido de metionina (Mso); N(w)nitroarginina (nArg); homolisina (hLys); fosfonometilfenilalanina (pmPhe); fosfoserina (pSer); fosfotreonina (pThr); ácido homoaspártico (hAsp); ácido homoglutánico (hGlu); ácido 1-aminociclopent-(2 ó 3)-eno-4-carboxílico; ácido pipecólico (PA), ácido azetidin-3-carboxílico (ACA); ácido 1-aminociclopentano-3-carboxílico; alilglicina (aOly); propargilglicina (pgGly); homoalanina (hAla); norvalina (nVal); homoleucina (hLeu), homovalina (hVal); homoisoleucina (hIle); homoarginina (hArg); N-acetil lisina (AcLys); ácido 2,4-diaminobutírico (Dbu); ácido 2,3diaminobutırico (Dab); N-metilvalina (MeVal); homocisteína (hCys); homoserina (hSer); hidroxiprolina (Hyp) y
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Claims (1)

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