DE60018909T2

DE60018909T2 - Neue carbonyl-reduktase, gen davon und verfahren der anwendung derselben

Info

Publication number: DE60018909T2
Application number: DE60018909T
Authority: DE
Inventors: Noriyuki Kizaki; Yukio Yamada; Yoshihiko Yasohara; Junzo Hasegawa
Original assignee: Kaneka Corp
Current assignee: Kaneka Corp
Priority date: 1999-12-03
Filing date: 2000-11-24
Publication date: 2006-03-30
Anticipated expiration: 2020-11-25
Also published as: CA2360376C; US6645746B1; MXPA01007858A; KR20020008116A; WO2001040450A1; NO20013801D0; CZ20012792A3; CA2360376A1; HUP0105331A3; ES2240205T3; KR100512080B1; DE60018909D1; EP1152054B1; NO20013801L; AU1551701A; EP1152054A4; ATE291616T1; SI20642A; JP4510351B2; EP1152054A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Polypeptid, ein das Polypeptid codierendes Gen, einen Expressionsvektor zur Expression des Polypeptids, einen durch Transformation einer Wirtszelle unter Verwendung des Expressionsvektors erhaltenen Transformanten und ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung, die als Material zur Synthese von Medikamenten und Pestiziden nützlich ist, unter Verwendung des Transformanten. Genauer ausgedrückt betrifft die vorliegende Erfindung ein Polypeptid, das aus einem Mikroorganismus isoliert wurde, mit einer Enzymaktivität zur asymmetrischen Reduktion von tert-Butyl-(S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoat zu tert-Butyl-(3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoat, ein das Polypeptid codierendes Polynucleotid, einen das Polynucleotid beinhaltenden Expressionsvektor und einen mit dem Expressionsvektor transformierten Transformanten.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von tert-Butyl-(3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoat. Das Verfahren umfasst die Schritte der Umsetzung des Transformanten oder eines davon prozessierten Produkts mit tert-Butyl-(S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoat und des Sammelns des hergestellten tert-Butyl-(3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoat.
Tert-Butyl-(3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoat ist eine Verbindung, die als Material zur Synthese von Medikamenten und Pestiziden, insbesondere von HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren, nützlich ist.
FACHLICHER HINTERGRUND
Im einzigen Verfahren zur Herstellung von tert-Butyl-(3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoat durch asymmetrische Reduktion von tert-Butyl-(S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoat, von dem bislang berichtet wurde, wird Dietylmethoxyboran und Natriumborhydrid verwendet (US-Patent Nr. 52,783,131). Probleme mit diesem Verfahren liegen darin, dass ein Reaktionsgefäß für sehr niedrige Temperaturen wie –78°C benötigt wird, dass teure Materialien verwendet werden müssen und Ähnliches.
Wada et al. (Biosci. Biotechnol. Biochem. 62(1998), 280–285) beschreiben eine NADPH-abhängige Carbonyl-Reduktase, die bei der Reduktion von Ethyl-4-chloro-3-oxobutanoat eine Rolle spielt.
Es gab einen Bedarf für ein praktikables Reaktionsverfahren zur Herstellung von tert-Butyl-(3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoat.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung fanden ein Polypeptid, das aus einem Mikroorganismus stammt und asymmetrisch tert-Butyl-(S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoat zur Herstellung von tert-Butyl-(3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoat reduziert, sie sahen ein Verfahren vor, mit dem tert-Butyl-(3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoat effizient hergestellt werden kann, und erzielten schließlich die vorliegende Erfindung.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Polypeptids, das in Lage ist, tert-Butyl-(S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoat asymmetrisch zur Herstellung von tert-Butyl-(3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoat zu reduzieren. Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur effizienten Herstellung des Polypeptids unter Verwendung von rekombinanter DNA-Technologie. Noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Transformanten, der gleichzeitig das Polypeptid und ein Polypeptid, das eine Glucose-Dehydrogenase-Aktivität besitzt, in großem Maßstab herstellen kann. Darüber hinaus ist noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung eines praktischen Verfahrens zur Herstellung von tert-Butyl-(3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoat unter Verwendung des Transformanten.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Polynucleotid, das ein Polypeptid codiert, welches eine Enzymaktivität zur asymmetrischen Reduktion von tert-Butyl-(S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoat zu tert-Butyl-(3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoat besitzt. Das Polynucleotid wird mit einer Nucleotidsequenz unter stringenten Bedingungen hybridisiert, die durch SEQ ID NR.2 des Sequenzprotokolls dargestellt wird.
In einer Hinsicht betrifft die vorliegende Erfindung ein Polypeptid, welches die Enzymaktivität zur asymmetrischen Reduktion von tert-Butyl-(S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoat zu tert-Butyl-(3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoat besitzt. Das Polypeptid umfasst die Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NR. 1 des Sequenzprotokolls dargestellt wird, oder die Aminosäuresequenz des vorstehend erwähnten Polynucleotids.
Vorzugsweise kann das Peptid aus einem der Gattung Candida zugehörigen Mikroorganismus gewonnen werden. Stärker bevorzugt kann der Mikroorganismus Candida magnoliae IFO 0705 sein.
In einer Hinsicht betrifft die vorliegende Erfindung einen Expressionsvektor, umfassend das vorstehend beschriebene Polynucleotid. Vorzugsweise kann der Expressionsvektor das Plasmid pNTCR sein, wie im E. coli-Stamm enthalten, der als FERM BP-6897 hinterlegt ist.
In einer Ausführungsform kann der vorstehend beschriebene Expressionsvektor weiterhin ein Polynucleotid umfassen, das ein Polypeptid mit einer Glucose-Dehydrogenase-Aktivität codiert.
Vorzugsweise kann das Polypeptid mit einer Glucose-Dehydrogenase-Aktivität eine Glucose-Dehydrogenase aus Bacillus megaterium sein.
Vorzugsweise kann der Expressionsvektor das Plasmid pNTCRG sein, wie im E. coli-Stamm enthalten, der als FERM BP-6898 hinterlegt ist.
In einer Hinsicht betrifft die vorliegende Erfindung einen Transformanten, der durch die Transformation einer Wirtszelle unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Expressionsvektors erhalten wird.
Vorzugsweise kann die Wirtszelle Escherichia coli sein. Stärker bevorzugt kann der Transformant E. coli HB101 (pNTCR) (FERM BP-6897) oder E. coli HB101 (pNTCRG) (FERM BP-6898) sein.
In einer Hinsicht betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von tert-Butyl-(3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoat. Das Verfahren umfasst die Schritte der Umsetzung des vorstehend beschriebenen Transformanten und/oder eines davon prozessierten Produkts mit tert-Butyl-(S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoat und das Sammeln des hergestellten tert-Butyl-(3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoat.
Vorzugsweise erfolgt der Reaktionsschritt in Gegenwart eines Coenzym-Regenerationssystems.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein Diagramm, welches die Sequenz eines erfindungsgemäßen Polynucleotids und die vorhergesagte Aminosäuresequenz davon zeigt.
2 ist ein Diagramm, welches ein Verfahren zur Herstellung des rekombinanten Plasmids pNTCRG zeigt.
BESTES VERFAHREN ZUR AUSFÜHRUNG DER ERFINDUNG
Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung genau beschrieben. Als ein erfindungsgemäßes Polypeptid kann ein beliebiges Polypeptid verwendet werden, solange es eine Enzymaktivität zur asymmetrischen Reduktion von tert-Butyl-(S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoat, dargestellt durch die folgende Formel (I), zur Herstellung von tert-Butyl-(3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoat, dargestellt durch die folgende Formel (II), aufweist.
tert-Butyl-(S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoat
tert-Butyl-(3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoat
Beispiele für solche Polypeptide beinhalten ein Polypeptid, umfassend die Aminosäuresequenz von SEQ ID NR. 1 des Sequenzprotokolls und mit einer Enzymaktivität zur asymmetrischen Reduktion von tert-Butyl-(S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoat zur Herstellung von tert-Butyl-(3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoat.
Ein erfindungsgemäßes Polypeptid kann aus einem Mikroorganismus mit Aktivität zur asymmetrischen Reduktion von tert-Butyl-(S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoat zur Herstellung von tert-Butyl-(3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoat erhalten werden. Daher kann der als Quelle des Polypeptids verwendete Mikroorganismus, ohne darauf beschränkt zu sein, Hefe (Gattung Candida) und am stärksten bevorzugt Candida magnoliae IFO 0705 sein. Dieser Stamm war ein Mikroorganismus, der ursprünglich unter der Hinterlegungsnummer CBS166 beim Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS, Oosterstraat 1, Postbus 273, NL-3740 AG Baarn, Niederlande) hinterlegt wurde, und die Isolierung und Eigenschaften des Stamms werden in „The Yeasts, a Taxonomic Study. 3. Ausgabe, Seite 731 (1984)" beschrieben. Mikroorganismen, die erfindungsgemäße Polypeptide produzieren, können ein Wildtyp- oder ein Variantentyp-Stamm sein. Alternativ können gentechnisch veränderte (unter Verwendung von Zellfusionen, Genmanipulation etc.) Mikroorganismen verwendet werden. Mikroorganismen, die gentechnisch zur Herstellung von erfindungsgemäßen Peptiden manipuliert wurden, können durch ein Verfahren erhalten werden, umfassend die Schritte: Isolierung und/oder Reinigung dieser Enzyme und Bestimmung der gesamten oder teilweisen Aminosäuresequenz davon, Bestimmung der die Polypeptide codierenden Nukleotidsequenzen basierend auf den Aminosäuresequenzen davon, Erhalt der die Polypeptide codierenden Nukleotidsequenzen basierend auf den Aminosäuresequenzen davon, Einführung der Nukleotidsequenzen in andere Mikroorganismen, um rekombinante Mikroorganismen zu erhalten, und Kultivierung der rekombinanten Mikroorganismen, um die erfindungsgemäßen Enzyme zu erhalten.
Ein Kulturmedium für Mikroorganismen, welche die erfindungsgemäßen Polypeptide herstellen, kann ein beliebiges flüssiges Nährmedium sein, enthaltend eine typische Kohlenstoffquelle, Stickstoffquelle, Mineralsalzquelle, eine Quelle für organische Nährstoffe und Ähnliches, solange die Mikroorganismen wachsen können.
Der Begriff „Mikroorganismus-Kultur", wie er hierin gebraucht wird, bezieht sich auf einen Mikroorganismus selbst oder eine flüssige Kultur, enthaltend den Mikroorganismus, und „sein prozessiertes Produkt" bezieht sich auf ein Produkt, erhalten durch Extraktion oder Reinigung des Mikroorganismus selbst oder der flüssigen Kultur, enthaltend den Mikroorganismus.
Erfindungsgemäße Polypeptide können unter Verwendung eines herkömmlichen Verfahrens aus Mikroorganismen gereinigt werden, die die Polypeptide enthalten. Zum Beispiel wird ein Mikroorganismus in einem geeigneten Medium gezüchtet und die Kultur wird zentrifugiert, um den Mikroorganismus zu ernten. Der Mikroorganismus wird zum Beispiel mittels einer Dyno-Mühle (hergestellt durch Willy A. Bachofen Co., Ltd.) aufgebrochen und zentrifugiert, um die Zelltrümmer zu entfernen und so einen zellfreien Extrakt zu erhalten. Der zellfreie Extrakt wird dann Verfahren wie Aussalzen (z. B. Ammoniumsulfatpräzipitation und Natriumphosphatpräzipitation), Lösungsmittelpräzipitation (ein Protein-Fraktionierungs-Präzipitationsverfahren unter Verwendung von Aceton, Ethanol oder Ähnlichem), Dialyse, Gelfiltration, Ionenaustausch, Säulenchromatographie (z. B. Umkehrphasenchromatographie) und Ultrafiltration allein oder in Kombination unterzogen, um die Polypeptide zu reinigen. Die Enzymaktivität kann durch Messung der Verminderung der Absorption bei einer Wellenlänge von 340 nm bei 30°C bestimmt werden, wobei 5 mM tert-Butyl-(S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoat als ein Substrat, 0,33 mM NADPH als ein Coenzym und ein Enzym zu 100 mM Phosphatpuffer (pH 6,5) zugegeben werden.
Erfindungsgemäße Polypeptide können die Aminosäuresequenz von SEQ ID NR. 1 des Sequenzprotokolls oder die durch ein nachstehend beschriebenes Polynucleotid codierte Aminosäuresequenz umfassen.
Erfindungsgemäße Polynucleotide können ein Polynucleotid mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NR. 2 des Sequenzprotokolls und ein Polynucleotid sein, das in der Lage ist, mit diesem Polynucleotid unter stringenten Bedingungen zu hybridisieren.
Das Polynucleotid, das in der Lage ist, mit diesem Polynucleotid mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NR. 2 des Sequenzprotokolls unter stringenten Bedingungen hybridisiert zu werden, bedeutet ein Polynucleotid, das mit einem Koloniehybridisierungsverfahren, einem Plaquehybridisierungsverfahren, einem Southern-Hybridisierungsverfahren oder Ähnlichem erhalten wird, wenn die Nukleotidsequenz von SEQ ID NR. 2 als eine DNA-Sonde verwendet wird. Spezifisch kann das Polynucleotid wie folgt identifiziert werden. Ein Filter, auf dem die aus einer Kolonie oder einem Plaque erhaltenen Polynucleotide immobilisiert werden, wird einer Hybridisierung mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NR. 2 in 0,7 bis 1,0 M NaCl bei 65°C unterzogen, und danach wird der Filter mit einer SSC-Lösung mit 0,1- bis 2-facher Konzentration (eine einfach konzentrierte SSC-Lösung enthält 150 mM Natriumchlorid und 15 mM Natriumcitrat) bei 65°C gewaschen.
Die Hybridisierung kann in Übereinstimmung mit dem Verfahren durchgeführt werden, das in Molecular Cloning, A laboratory manual, zweite Ausgabe (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) beschrieben wird, oder ähnlichen. Spezifisch umfassen Beispiele eines Polynucleotids, das zur vorstehend beschriebenen Hybridisierung in der Lage ist, ein Polynucleotid mit mindestens 60% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NR. 2, vorzugsweise mindestens 80% Sequenzidentität, stärker bevorzugt mindestens 90% Sequenzidentität, noch stärker bevorzugt mindestens 95% Sequenzidentität und am stärksten bevorzugt mindestens 99% Sequenzidentität.
Erfindungsgemäße Polynucleotide, die Polypeptide mit einer Enzymaktivität zur asymmetrischen Reduktion von tert-Butyl-(S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoat zu tert-Butyl-(3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoat codieren, umfassen ein Polynucleotid mit mindestens 60% Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NR. 2, vorzugsweise mindestens 80% Sequenzidentität, stärker bevorzugt mindestens 90% Sequenzidentität, noch stärker bevorzugt mindestens 95% Sequenzidentität und am stärksten bevorzugt mindestens 99% Sequenzidentität, solange die codierten Polypeptide die vorstehend beschriebene Enzymaktivität aufweisen. Der Begriff „Sequenzidentität" bedeutet, dass zwei zu vergleichende Polynucleotidsequenzen zueinander identisch sind und der Grad (%) der Sequenzidentität zwischen zwei zu vergleichenden Polynucleotiden wie folgt berechnet wird. Zuerst werden zwei zu vergleichende Polynucleotidsequenzen in optimaler Weise aneinander ausgerichtet. Die Anzahl der Positionen, an denen dieselbe Nukleinsäure-Base (z. B. A, T C, G, U oder I) in beiden Sequenzen vorhanden ist (die Anzahl der übereinstimmenden Positionen) wird gezählt und die Anzahl der übereinstimmenden Positionen wird durch die Gesamtzahl der Nukleinsäure-Basen im Polynucleotid dividiert. Der resultierende Wert wird mit 100 multipliziert. Die Sequenzidentität kann unter Verwendung des folgenden Sequenzanalysewerkzeugs berechnet werden, zum Beispiel: Unix-basiertes GCG Wisconsin Package (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, September, 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, Wisconsin, USA53711; Rice P. (1996) Program Manual for the EGCG Package, Peter Rice, The Sanger Centre, Hinxton Hall, Cambridge, CB10 1RQ, England) und der ExPASy World Wide Web-Server für Molekularbiologie (Universitätskrankenhaus Genf und Universität Genf, Genf, Schweiz).
Die erfindungsgemäßen Polynucleotide können aus Mikroorganismen mit der Enzymaktivität zur asymmetrischen Reduktion von tert-Butyl-(S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoat zu tert-Butyl-(3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoat erhalten werden. Der als Quelle des Polynucleotids verwendete Mikroorganismus kann, ohne darauf beschränkt zu sein, Hefe (Gattung Candida) und am stärksten bevorzugt Candida magnoliae IFO 0705 sein.
Im Folgenden wird ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Polynucleotids aus Mikroorganismen mit der Enzymaktivität zur asymmetrischen Reduktion von tert-Butyl-(S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoat zu tert-Butyl-(3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoat beschrieben. Die vorliegende Erfindung ist nicht darauf beschränkt.
Zuerst werden die Aminosäuresequenzen der gereinigten Polypeptide und der durch Spaltung des Polypeptids mit einer geeigneten Endopeptidase erhaltenen Peptidfragmente mit dem Edmanverfahren sequenziert. Basierend auf dieser Aminosäure-Sequenzinformation wird ein Nucleotidprimer synthetisiert. Danach wird chromosomale DNA unter Verwendung eines typischen Nukleotid-Isolierungsverfahrens (z. B. Hereford-Verfahren, beschrieben in Cell, 18, 1261 (1979)) aus einem Mikroorganismus präpariert, von dem das Polynucleotid stammt. Die PCR wird unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Nucleotidprimers und dieser chromosomalen DNA als Matrize durchgeführt, um einen Teil des Polypeptidgens zu amplifizieren. Weiterhin wird der amplifizierte Teil des Polypeptidgens zum Beispiel mit einem Zufallsprimer-Markierungsverfahren, beschrieben in Anal. Biochem., 132, 6 (1983), markiert, um eine Nukleotidsonde herzustellen. Die chromosomale DNA des Mikroorganismus wird mit einem geeigneten Restriktionsenzym gespalten. Die entstandenen Fragmente werden in einen Vektor eingebaut, der wiederum in eine geeignete Wirtszelle eingeführt wird, wodurch eine DNA-Genbank der chromosomalen DNA des Mikroorganismus konstruiert wird. Diese DNA-Genbank wird unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Nukleotidsonde in Übereinstimmung mit einem Koloniehybridisierungsverfahren, einem Plaque-Hybridisierungsverfahren oder ähnlichen durchmustert, wodurch eine das Polypeptidgen umfassende DNA erhalten wird. Die Nukleotidsequenz des so erhaltenen, das Polypeptidgen umfassenden DNA-Fragments kann mit einem Didesoxy-Sequenzierungsverfahren, einem Didesoxy-Kettenabbruchverfahren oder ähnlichen sequenziert werden. Zum Beispiel kann die Sequenzierung der Nukleotidsequenz unter Verwendung des ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (hergestellt durch Perkin Elmer Co., Ltd.) und des ABI 373A DNA-Sequencer (hergestellt durch Perkin Elmer Co., Ltd.) durchgeführt werden.
Vektoren zur Einführung von erfindungsgemäßen Polynucleotiden in den Wirtsmikroorganismus, in dem die Polynucleotide exprimiert werden, können beliebige Vektoren sein, solange das Enzymgen in dem geeigneten Wirtsmikroorganismus exprimiert werden kann. Beispiele für solche Vektoren schließen einen Plasmidvektor, einen Phagenvektor und einen Cosmidvektor ein. Ein Shuttlevektor, der in der Lage ist, ein Gen zwischen Wirtsstämmen auszutauschen, kann verwendet werden. Ein solcher Vektor umfasst typischerweise ein Kontrollelement wie einen lacUV5-Promoter, einen trp-Promoter, einen trc-Promoter, einen tac-Promoter, einen lpp-Promoter, einen tufB-Promoter, einen recA-Promoter oder einen pL-Promoter und wird vorzugsweise als Expressionsvektor einschließlich einer Expressionseinheit, die funktionell mit dem erfindungsgemäßen Polynucleotid verbunden ist, angewendet.
Der Begriff „Kontrollelement", wie er hier gebraucht wird, bezieht sich auf einen funktionellen Promoter und eine Nucleotidsequenz mit einem beliebigen assoziierten Transkriptionselement (z. B. Enhancer, CCAAT-Box, TATA-Box, SPI-Stelle).
Der Ausdruck „funktionell verbunden", wie er hier gebraucht wird, bezieht sich darauf, dass ein Polynucleotid mit Kontrollelementen wie einen Promoter und einen Enhancer, welche die Expression eines Polynucleotids derart kontrollieren, dass die Kontrollelemente zur Expression des Gens funktionieren können, verbunden ist. Es ist dem Fachmann wohlbekannt, dass die Typen von Kontrollelementen abhängig von der Wirtszelle variieren können.
Beispiele von Wirtszellen, in die ein Vektor mit einem erfindungsgemäßen Polynucleotid eingeführt wird, schließen Bakterien, Hefe, Schimmelpilze, Pflanzenzellen und Tierzellen ein. Escherichia coli ist besonders zu bevorzugen. Ein erfindungsgemäßes Polynucleotid kann unter Verwendung eines konventionellen Verfahrens in eine Wirtszelle eingeführt werden. Wenn E. coli als Wirtszelle verwendet wird, kann ein erfindungsgemäßes Polynucleotid zum Beispiel unter Verwendung eines Calciumchloridverfahrens eingeführt werden.
Wenn tert-Butyl-(3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoat durch asymmetrische Reduktion von tert-Butyl-(S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoat unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Polypeptids hergestellt wird, wird ein Coenzym wie NADPH und NADH benötigt. Ein Enzym, das in der Lage ist, ein oxidiertes Coenzym zu einem reduzierten Coenzym (im Folgenden als Coenzym-Regenerationsfähigkeit bezeichnet) umzuwandeln, kann jedoch zusammen mit einem entsprechenden Substrat verwendet werden; d. h. ein Coenzym-Regenerationssystem wird in Kombination mit einem erfindungsgemäßen Polypeptid in der Reaktion verwendet, wodurch die Menge des verwendeten teuren Coenzyms reduziert wird. Beispiele von Enzymen, die eine Coenzym-Regenerationsfähigkeit haben, schließen Hydrogenase, Formiat-Dehydrogenase, Alkohol-Dehydrogenase, Aldehyd-Dehydrogenase, Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase und Glucose-Dehydrogenase ein. Vorzugsweise wird Glucose-Dehydrogenase verwendet. Eine solche Reaktion kann durch Zugabe eines Coenzym-Regenerationssystems zu einem asymmetrischen Reaktionssystem ausgeführt werden. Wenn als Katalysator ein Transformant verwendet wird, der sowohl mit einem Polynucleotid, das ein Polypeptid mit der Enzymaktivität zur asymmetrischen Reduktion von tert-Butyl-(S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoat zur Herstellung von tert-Butyl-(3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoat codiert, als auch einem Polynucleotid, das ein Polypeptid mit einer Glucose-Dehydrogenase-Aktivität codiert, transformiert ist, können die Reaktionen effizient ausgeführt werden, ohne dass ein Enzym, welches eine Coenzym-Regenerationsfähigkeit hat, hergestellt und das Enzym zum Reaktionssystem zugegeben wird. Ein solcher Transformant kann durch Einbau eines Polynucleotids, das ein Polypeptid mit der Enzymaktivität zur asymmetrischen Reduktion von tert-Butyl-(S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoat zur Herstellung von tert-Butyl-(3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoat codiert, und eines Polynucleotids, codierend ein Polypeptid mit einer Glucose-Dehydrogenase-Aktivität, in denselben Vektor und Einführung des Vektors in eine Wirtszelle erhalten werden. Alternativ kann der Transformant durch Einbau dieser beiden Polynucleotide in zwei Vektoren aus unverträglichen Gruppen und Einführung dieser Polynucleotide in dieselbe Wirtszelle erhalten werden.
Die Glucose-Dehydrogenase-Aktivität des Transformanten kann durch Messung eines Anstiegs der Absorption bei einer Wellenlänge von 340 nm bei 25°C gemessen werden, wobei 0,1 M Glucose als ein Substrat, 2 mM NADP als ein Coenzym und ein Enzym zu einem 1 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) gegeben werden.
Die Herstellung von tert-Butyl-(3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoat unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Transformanten kann wie folgt ausgeführt werden.
Zunächst wird tert-Butyl-(S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoat als ein Substrat, ein Coenzym wie NADP und die Kultur des Transformanten oder ein prozessiertes Produkt davon zu einem geeigneten Lösungsmittel zugegeben, gefolgt von der Einstellung des pH-Werts. Das entstandene Gemisch wird gerührt, um umgesetzt zu werden. Die Reaktion wird bei einer Temperatur von 10°C bis 70°C ausgeführt, wobei der pH-Wert der Reaktionslösung im Bereich von 4 bis 10 gehalten wird. Die Reaktion wird in einem Batch-Verfahren oder in einem kontinuierlichen Verfahren ausgeführt. Im Falle des Batch-Verfahrens wird das umzusetzende Substrat zugegeben, um eine Konzentration von 0,1 % bis 70% (Gew./Vol.) herzustellen. Das prozessierte Produkt eines Transformanten und ähnliches, wie vorstehend erwähnt, bezieht sich auf den Rohextrakt, gezüchtete Mikroorganismen, lyophilisierte Organismen, mit Aceton getrocknete Organismen, Homogenate von solchen Mikroorganismen und ähnliches. Solche prozessierten Produkte und ähnliches können im Zustand der Immobilisierung als Enzyme oder Mikroorganismen, so wie sie sind, mit bekannten Mitteln verwendet werden. Wenn die Reaktion unter Verwendung eines Transformanten, der ein erfindungsgemäßes Polypeptid herstellt, und einer Glucose-Dehydrogenase ausgeführt wird, ermöglicht die Zugabe von Glucose zum Reaktionssystem die weitgehende Verminderung der Menge an Coenzymen.
Durch die Reaktion hergestelltes tert-Butyl-(3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoat kann mit einem konventionellen Verfahren gereinigt werden. Zum Beispiel wird tert-Butyl-(3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoat einer Zentrifugation, Filtration und anderen Verfahren, die benötigt werden, um suspendierte Substanzen wie Mikroorganismen zu entfernen, unterzogen. Das entstehende Produkt wird einer Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel wie Ethylacetat und Toluol unterzogen und mit einem Trocknungsmittel wie Natriumsulfat dehydratisiert. Das organische Lösungsmittel wird unter Dekompression entfernt. Das entstandene Produkt wird dann der Kristallisierung, Chromatographie oder ähnlichem unterzogen, um es zu reinigen.
In der Reaktion wird tert-Butyl-(S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoat als Substrat mit einem Verfahren hergestellt, das im US-Patent Nr. 52,783,131 beschrieben wird, das hier durch Bezugnahme eingebunden wird.
Die Quantifizierung von tert-Butyl-(S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoat und tert-Butyl-(3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoat und die Messung des Verhältnisses der Diastereomeren von tert-Butyl-(3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoat kann durch Hochleistungsflüssigchromatographie (Säule: COSMOSIL 5CN-R (ID 4,6 × 250 mm), hergestellt durch Nacalai Tesque Co., Ltd., Elutionsmittel: 1 mM Phosphatlösung/Acetonitril = 5/1, Flussrate: 0,7 ml/Min., Detektion: 210 nm; Säulentemperatur: 30°C) durchgeführt werden.
Wie vorstehend beschrieben wird, ist es gemäß der vorliegenden Erfindung möglich, ein erfindungsgemäßes Polypeptid effizient herzustellen. Mit einem solchen Polypeptid kann ein ausgezeichnetes Verfahren zur Herstellung von tert-Butyl-(3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoat bereitgestellt werden. Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung durch verdeutlichende Beispiele mit Bezug auf die begleitenden Zeichnungen beschrieben. Die vorliegende Erfindung ist nicht auf solche Beispiele beschränkt.
(Beispiele)
Die Details der Manipulationsverfahren, bezogen auf die rekombinanten DNA-Techniken, die in den folgenden Beispielen angewendet werden, werden in den folgenden Texten beschrieben.

Molecular Cloning zweite Ausgabe (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)
Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience)

(Beispiel 1: Reinigung eines Polypeptids mit Enzymaktivität zur asymmetrischen Reduktion)
Aus Candida magnoliae IFO 0705 wird ein Polypeptid mit der Enzymaktivität zur asymmetrischen Reduktion von tert-Butyl-(S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoat zu tert-Butyl-(3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoat alleinig in der folgenden Weise gereinigt.
(Kultivierung von Candida magnoliae IFO 0705)
18 L Flüssigmedium mit der folgenden Zusammensetzung wurden in einem 30 L Kesselfermenter (hergestellt durch Marubishi Bioeng Co., Ltd.) hergestellt und mit Dampf bei 120°C für 20 Minuten sterilisiert.
Zusammensetzung des Mediums: Leitungswasser, 4,0% Glucose, 0,5% Hefeextrakt, 0,1 % KH₂PO₄, 0,65% (NH₄)₂HPO₄, 0,1 % NaCl, 0,8% MgSO₄·7N₂O, 0,06% ZnSO₄·7H₂O, 0,09% FeSO₄·7H₂O, 0,005% CuSO₄·5H₂O, 0,01 % MnSO₄·4-6H₂O und 0,02% Adecanol^TM LG-109 (hergestellt durch NOF Corporation) (pH 7,0).
Das vorstehende Medium wurde mit einer Kultur von Candida magnoliae IFO 0705, die in dem Medium vorgezüchtet wurde, mit 180 ml/Fermenter beimpft und bei 33°C unter Rühren bei 295 UpM bei einer Belüftungsrate von 5,0 NL/Min. gezüchtet, wobei die untere Grenze des pH-Wertes bei 6,5 durch Zutropfen von 30% (Gew./Gew.) wässrigem Natriumhydroxid gehalten wird. 655 g einer 55% (Gew./Gew.) wässrigen Glucoselösung wurden 22 und 25 Stunden nach dem Beginn der Züchtung zugegeben. Die Züchtung wurde für 30 Stunden durchgeführt.
(Herstellung eines zellfreien Extrakts)
Aus 10 l der entstandenen Kultur wurden die Mikroorganismen durch Zentrifugation gesammelt und dann mit einer physiologischen Salzlösung gewaschen, wodurch 1350 g feuchte Mikroorganismen erhalten wurden. Die feuchten Mikroorganismen wurden in 2700 ml eines 100 mM Phosphatpuffers (pH 6,7) suspendiert und 2-Mercaptoethanol und Phenylmethylsulfonylfluorid wurden zu Endkonzentrationen von 5 mM beziehungsweise 0,1 mM zugegeben. Die Mikroorganismen wurden durch eine Dyno-Mühle (hergestellt durch Willy A. Bachofen Co., Ltd.) aufgeschlossen. Die aufgeschlossenen Mikroorganismen wurden zentrifugiert, um die Zelltrümmer zu entfernen, wodurch 2880 ml eines zellfreien Extrakts erhalten wurden.
(Ammoniumsulfatfraktionierung)
Ammoniumsulfat wurde zum zellfreien Extrakt zugegeben und darin gelöst, so dass 60% Sättigung erhalten wurden. Die entstandenen Präzipitate wurden durch Zentrifugation entfernt (in diesem Fall wurde der pH-Wert des zellfreien Extraktes mit Ammoniumwasser bei 6.7 gehalten). Ammoniumsulfat wurde weiter zum Überstand gegeben, um 75% Sättigung zu erhalten, während gleichzeitig der pH-Wert bei 6,7 gehalten wurde. Die entstandenen Präzipitate wurden durch Zentrifugation gesammelt. Die Präzipitate wurden gelöst und über Nacht in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0), enthaltend 2 mM 2-Mercaptoethanol, dialysiert.
(DEAE-TOYOPEARL Säulenchromatographie)
Die vorstehende entstandene Rohenzymlösung wurde auf eine DEAE-TOYOPEARL 650M-Säule (500 ml, hergestellt durch Tosoh Corporation), die mit 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0), enthaltend 2 mM 2-Mercaptoethanol, äquilibriert wurde, aufgetragen, so dass Polypeptide mit Enzymaktivität an die Säule adsorbiert wurden. Die Säule wurde mit demselben Puffer gewaschen. Aktive Fraktionen wurden unter Verwendung eines linearen Gradienten von NaCl (von 0 M bis 0,5 M) eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt und dann über Nacht in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0), enthaltend 2 mM 2-Mercaptoethanol, dialysiert.
(Phenylsepharose-Säulenchromatographie)
Ammoniumsulfat wurde in der vorstehenden entstandenen Rohenzymlösung zu einer Endkonzentration von 1 M gelöst (während der pH-Wert mit Ammoniumwasser bei 7,0 gehalten wurde) und dann auf eine Phenylsepharose-CL-4B-Säule (140 ml, hergestellt durch Pharmacia Biotech Co., Ltd.), die mit 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0), enthaltend 2 mM 2-Mercaptoethanol und 1 M Ammoniumsulfat, äquilibriert wurde, aufgetragen, so dass Polypeptide mit Enzymaktivität an die Säule adsorbiert wurden. Die Säule wurde mit demselben Puffer gewaschen. Aktive Fraktionen wurden unter Verwendung eines linearen Gradienten von Ammoniumsulfat (von 1 M bis 0 M) eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt und dann über Nacht in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0), enthaltend 2 mM 2-Mercaptoethanol, dialysiert.
(Blaue Sepharose-Säulenchromatographie)
Die vorstehende entstandene Rohenzymlösung wurde auf eine Blaue Sepharose-CL-6B-Säule (40 ml, hergestellt durch Pharmacia Biotech Co., Ltd.), die mit 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0), enthaltend 2 mM 2-Mercaptoethanol, äquilibriert wurde, aufgetragen, so dass Polypeptide mit Enzymaktivität an die Säule adsorbiert wurden. Die Säule wurde mit demselben Puffer gewaschen. Aktive Fraktionen wurden unter Verwendung eines linearen Gradienten von NaCl (von 0 M bis 1 M) eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt und dann über Nacht in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0), enthaltend 2 mM 2-Mercaptoethanol, dialysiert.
(SuperQ-TOYOPEARL-Säulenchromatographie)
Die vorstehende entstandene Rohenzymlösung wurde auf eine SuperQ-TOYOPEARL 650S-Säule (12 ml, hergestellt durch Tosoh Corporation), die mit 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0), enthaltend 2 mM 2-Mercaptoethanol, äquilibriert wurde, aufgetragen, so dass Polypeptide mit Enzymaktivität an die Säule adsorbiert wurden. Die Säule wurde mit demselben Puffer gewaschen. Aktive Fraktionen wurden unter Verwendung eines linearen Gradienten von NaCl (von 0 M bis 0,4 M) eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt und dann über Nacht in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0), enthaltend 2 mM 2-Mercaptoethanol, dialysiert. So wurde eine reine Polypeptidprobe erhalten, die elektrophoretisch einheitlich ist (nachfolgend als CR-Enzym bezeichnet).
(Beispiel 2: Clonierung des CR-Enzymgens)
(Herstellung einer synthetischen Oligonucleotidsonde)
Das in Beispiel 1 erhaltene gereinigte CR-Enzym wurde in Gegenwart von 8 M Harnstoff denaturiert und dann mit Lysyl-Endopeptidase aus Achromobacter (hergestellt durch Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) gespalten. Die Aminosäuresequenzen der entstandenen Peptidfragmente wurden unter Verwendung des ABI492-Proteinsequenziergeräts (hergestellt durch Perkin Elmer Co., Ltd.) bestimmt. Ausgehend von den Aminosäuresequenzen wurden zwei Nucleotidprimer (SEQ ID NR. 3 und 4) mit einem konventionellen Verfahren synthetisiert.
(Amplifizierung des CR-Enzymgens durch PCR)
Chromosomale DNA wurde aus gezüchtetem Candida magnoliae IFO 0705 in Übereinstimmung mit dem Hereford-Verfahren (Cell, 18, 1261 (1979)) extrahiert. Danach wurde die PCR unter Verwendung der vorstehend hergestellten Nucleotidprimer und der entstandenen chromosomalen DNA als Matrize durchgeführt, wodurch ein Nukleotidfragment von etwa 350 bp amplifiziert wurde, das als Teil des CR-Enzymgens angesehen wird.
(Herstellung einer chromosomalen DNA-Genbank)
Die chromosomale DNA von Candida magnoliae IFO 0705 wurde vollständig mit dem Restriktionsenzym ApaI gespalten und die gespaltenen Fragmente wurden mittels Agarose-Gelelektrophorese getrennt. Danach wurde ein Southern-Verfahren (J. Mol. Biol., 98, 503 (1975)) unter Verwendung des vorstehend erhaltenen 350-bp DNA-Fragments ausgeführt, um die gespaltenen Fragmente der chromosomalen DNA zu analysieren (die Markierung und der Nachweis einer Nukleotidsonde wurde unter Verwendung des Gene Images Labeling and Detection System (hergestellt durch Amersham Co., Ltd.)) ausgeführt. Als Ergebnis wurde gefunden, dass ein Nukleotidfragment von etwa 5,5 kb mit der Nukleotidsonde hybridisiert hatte.
Basierend auf dieser Tatsache wurden Nukleotidfragmente von 4,3 kb bis 6,2 kb gesammelt, nachdem die gespaltenen Fragmente durch Agarosegelelektrophorese getrennt worden waren. Diese Nukleotidfragmente wurden in die ApaI-Stelle des Plasmidvektors pBluescriptII KS(–) (hergestellt durch STRATAGENE Co., Ltd.) eingeführt. Das Plasmid wurde in E. coli JM109 eingeführt. Die chromosomale DNA-Genbank dieses Stammes wurde hergestellt.
(Durchmustern der chromosomalen DNA-Genbank)
Das so erhaltene Nukleotidfragment wurde als Sonde verwendet, um die chromosomale DNA-Genbank in Übereinstimmung mit einem Koloniehybridisierungsverfahren (die Markierung und der Nachweis einer Nukleotidsonde wurden unter Verwendung des Gene Images Labeling and Detection Systems (hergestellt durch Amersham Co., Ltd.) durchgeführt, und das Experiment wurde in Übereinstimmung mit den im Anleitungshandbuch des Systems beschriebenen Verfahren durchgeführt) zu durchmustem. Als Ergebnis wurde eine einzelne positive Kolonie erhalten. Danach wurden die rekombinanten Plasmide aus der positiven Kolonie, in welche die DNA mit etwa 5,5 kb eingeführt worden war, mit EcoRI und SphI doppelt gespalten. Die gespaltenen Fragmente wurden mit dem Southern-Verfahren, wie vorstehend beschrieben, analysiert. Als Ergebnis wurden die durch Spaltung unter Verwendung von Restriktionsenzymen hergestellten Nukleotidfragmente von etwa 1,0 kb mit der Sonde hybridisiert. Basierend auf dieser Tatsache wurde das Nukleotidfragment von etwa 1,0 kb in die EcoRI-SphI-Stelle des Plasmids pUC19 (hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd.) eingesetzt, um das rekombinante Plasmid pUC-ES zu konstruieren, und wurde als ein chromosomaler DNA-Clon, beinhaltend das CR-Enzymgen, ausgewählt.
(Bestimmung der Basensequenz)
Das vorstehende rekombinante Plasmid pUC-ES wurde mit einer Vielzahl von Restriktionsenzymen gespalten und die während der Reaktion entstandenen gespaltenen Fragmente wurden zur Erstellung einer Restriktionskarte analysiert. Dann wurden verschiedene DNA-Fragmente, die während der Analyse erhalten wurden, in die Multiclonierungsstellen von pUC19 eingefügt, um rekombinante Plasmide zu konstruieren. Unter Verwendung dieser rekombinanten Plasmide wurden die Nukleotidsequenzen der jeweiligen eingefügten Fragmente unter Verwendung des ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (hergestellt durch Perkin Elmer Co., Ltd.) und des ABI 373A DNA Sequencer (hergestellt durch Perkin Elmer Co., Ltd.) analysiert. Als Ergebnis wurde die gesamte Basensequenz des DNA-Fragments von etwa 1,0 kb bestimmt, von dem angenommen wurde, dass es ein gewünschtes Enzymgen beinhaltet. 2 zeigt die so bestimmte Basensequenz. Eine aus der Nukleotidsequenz abgeleitete Aminosäuresequenz für den Strukturgenanteil der Nukleotidsequenz wird unter der zugehörigen Nukleotidsequenz in 1 ebenfalls gezeigt. Die Aminosäuresequenz wurde mit der Aminosäure-Teilsequenz eines mit Lysyl-Endopeptidase gespaltenen Peptidfragments des gereinigten CR-Enzyms verglichen. Als Ergebnis wurde gefunden, dass die Aminosäure-Teilsequenz des gereinigten CR-Enzyms vollständig in der Aminosäuresequenz, die aus der Nukleotidsequenz abgeleitet wurde, existiert und vollständig mit ihr übereinstimmt (als ein unterstrichener Teil der Aminosäuresequenz in 1 dargestellt). Daher wurde von dem DNA-Fragment angenommen, dass es das CR-Enzymgen beinhaltet.
(Beispiel 3: Herstellung eines rekombinanten, das CR-Enzymgen tragenden Plasmids)
Eine doppelsträngige DNA mit: einer NdeI-Stelle, angefügt an den Teil eines Strukturgens des CR-Enzyms mit Initiationscodon; und einem neuen Terminationscodon (TAA) sowie einer EcoRI-Stelle, angefügt unmittelbar nach einem Terminationscodon; und einer Substitution eines T für ein G am sechsten Nukleotid vom 5'-Ende des Gens zur Zerstörung einer SalI-Stelle des Gens ohne eine Änderung des Aminosäurecodes wurde in der folgenden Weise erhalten. Ein N-terminaler Nucleotidprimer mit einer NdeI-Stelle, angefügt an den Teil eines Strukturgens des CR-Enzyms mit Initiationscodon, und einer Substitution eines T für ein G am sechsten Nukleotid vom 5'-Ende des Gens wurde basierend auf der in Beispiel 2 bestimmten Nukleotidsequenz synthetisiert. Weiterhin wurde ein C-terminaler Nucleotidprimer mit einem neuen Terminationscodon (TAA) und einer EcoRI-Stelle, angefügt unmittelbar nach dem Terminationscodon des Strukturgens des CR-Enzyms, basierend auf der in Beispiel 2 bestimmten Nukleotidsequenz synthetisiert. Die Nukleotidsequenzen dieser beiden Primer werden durch die SEQ ID NR. 5 und 6 dargestellt. Unter Verwendung der beiden synthetischen DNA-Primer wurde eine doppelsträngige DNA mittels PCR unter Verwendung des in Beispiel 2 erhaltenen Plasmids pUC-ES als Matrize amplifiziert. Das entstandene DNA-Fragment wurde mit NdeI- und EcoRI gespalten und in die NdeI- und EcoRI-Stellen stromabwärts des lac-Promoters des Plasmids pUCNT (WO94/03613) eingefügt, um das rekombinante Plasmid pNTCR zu erhalten.
(Beispiel 4: Herstellung des rekombinanten Plasmids, beinhaltend sowohl das CR-Enyzmgen als auch das Glucose-Dehydrogenasegen)
Eine doppelsträngige DNA mit: einer Shine-Dalgarno-Sequenz (9 Nukleotide) von E. coli, eingefügt 5 Nukleotide stromaufwärts des Initiationscodons des Gens der Glucose-Dehydrogenase (im Folgenden als GDH bezeichnet) aus Bacillus megaterium IAM 1030; einer EcoRI-Stelle, eingefügt unmittelbar davor; und einer SalI-Stelle unmittelbar nach dem Terminationscodon wurde in folgender Weise erhalten. Basierend auf der Nukleotidsequenzinformation des GDH-Gens wurden ein N-terminaler Nucleotidprimer mit einer Shine-Dalgarno-Sequenz (9 Nukleotide) von E. coli, eingefügt 5 Nukleotide stromaufwärts des Initiationscodons des GDH-Strukturgens, und der EcoRI-Stelle, eingefügt unmittelbar davor, und ein C-terminaler Nucleotidprimer mit einer SalI-Stelle, eingefügt unmittelbar nach dem Terminationscodon, mit einem konventionellen Verfahren synthetisiert. Die Nukleotidsequenzen dieser beiden Primer werden durch die SEQ ID Nr. 7 und 8 dargestellt. Unter Verwendung der beiden synthetischen DNA-Primer wurde eine doppelsträngige DNA mittels PCR unter Verwendung des Plasmids pGDK1 (Eur. J. Biochem. 186, 389 (1989)) als Matrize synthetisiert. Das entstandene DNA-Fragment wurde mit EcoRI und SalI gespalten und in die EcoRI- und SalI-Stellen des im Beispiel 3 konstruierten pNTCR eingefügt (stromabwärts des CR-Enzymgens vorhanden), um das rekombinante Plasmid pNTCRG zu erhalten. Das Herstellungsverfahren und die Struktur von pNTCRG werden in 2 gezeigt.
(Beispiel 5: Herstellung von rekombinanten E.coli)
E. coli HB101 (hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd.) wurde unter Verwendung des in Beispiel 3 erhaltenen rekombinanten Plasmids pNTCR und des in Beispiel 4 erhaltenen rekombinanten Plasmids pNTCRG transformiert, um rekombinante E. coli HB101 (pNTCR) beziehungsweise HB101 (pNTCRG) zu erhalten. Die so erhaltenen Transformanten E. coli HB101 (pNTCR) und HB101 (pNTCRG) wurden beim Ministry of International Trade and Industry, Agency of Industrial Science and Technology, National Institute of Bioscience and Human Technology (1–3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan) unter den entsprechenden Hinterlegungsnummern FERM BP-6897 und FERM BP-6898 am 28. September 1999 gemäß dem Budapester Abkommen über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zwecke von Patentverfahren hinterlegt.
(Beispiel 6: Expression des CR-Enzyms in rekombinantem E. coli)
Der in Beispiel 5 erhaltene rekombinante E. coli HB 101 (pNTCR) wurde in 2xYT Medium, enthaltend 120 μg/mlAmpicillin, gezüchtet, gesammelt, in einem 100 mM Phosphatpuffer (pH 6,5) suspendiert und einer Ultraschallbehandlung unterworfen, um einen zellfreien Extrakt zu erhalten. Die CR-Enzymaktivität des zellfreien Extrakts wurde in der folgenden Weise gemessen. Das heißt, 5 mM tert-Butyl-(S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoat als ein Substrat, 0,333 mM NADPH als ein Coenzym und das Enzym wurden zu einem 100 mM Phosphatpuffer (pH 6,5) gegeben und die Verminderung der Absorption bei einer Wellenlänge von 340 nm wurde bei 30°C gemessen. Unter diesen Reaktionsbedingungen wurde die Oxidation von 1 μmol NADPH in NADP in einer Minute als eine Einheit Enzymaktivität definiert. Die so gemessene CR-Enzymaktivität im zellfreien Extrakt wurde als spezifische Aktivität dargestellt und mit der eines Transformanten verglichen, der nur ein Vektorplasmid enthielt. Ebenso wurde die CR-Enzymaktivität in einem zellfreien Extrakt von Candida magnoliae IFO 0705, hergestellt in grundsätzlich derselben Weise wie der in Beispiel 1 beschriebene, verglichen. Die Ergebnisse werden in der nachstehenden Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1 Expression des CR-Enzyms in rekombinantem E. coli
Wie aus Tabelle 1 ersichtlich ist, zeigte E. coli HB101 (pNTCR) einen deutlichen Anstieg der CR-Enzymaktivität im Vergleich zu E. coli HB101 (pUCNT), welcher unter Verwendung nur eines Vektorplasmids transformiert wurde, und zeigte eine Aktivität, die etwa 34-fach höher lag als die von Candida magnoliae IFO 0705.
(Beispiel 7: Gleichzeitige Expression des CR-Enzyms und von GDH in rekombinantem E. coli)
Die GHD-Aktivität eines zellfreien Extraktes, erhalten durch Prozessierung rekombinanter, in Beispiel 5 erhaltener E. coli HB101 (pNTCRG), wie in Beispiel 6 beschrieben, wurde wie folgt gemessen. 0,1 M Glucose als Substrat, 2 mM NADP als ein Coenzym und das Enzym wurden zu einem 1 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) gegeben und ein Anstieg der Absorption bei einer Wellenlänge von 340 nm wurde bei 25°C gemessen. Unter diesen Reaktionsbedingungen wurde die Reduktion von 1 μmol NADP zu NADPH in einer Minute als eine Einheit der Enzymaktivität definiert. Die CR-Enzymaktivität wurde auch wie in Beispiel 5 gemessen. Die so gemessene CR-Enzymaktivität und GDH-Enzymaktivität im zellfreien Extrakt wurden als spezifische Aktivitäten dargestellt und mit jenen von E. coli HB101 (pNTCR) und einem Transformanten HB101 (pUCNT) unter Verwendung nur eines Vektors verglichen. Die Ergebnisse werden in der nachstehenden Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2 Gleichzeitige Expression des CR-Enzyms und von GDH in rekombinantem E. coli
Wie aus Tabelle 2 ersichtlich ist, zeigte E. coli HB101 (pNTCRG) einen deutlichen Anstieg der CR-Enzymaktivität und der GDH-Aktivität im Vergleich zu E. coli HB101 (pUCNT), welcher unter Verwendung nur eines Vektorplasmids transformiert wurde.
(Beispiel 8: Synthese von tert-Butyl-(3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoat aus tert-Butyl-(S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoat unter Verwendung von rekombinantem E. coli mit einem darin eingeführten CR-Enzymgens)
Der in Beispiel 5 erhaltene rekombinante E. coli HB101 (pNTCR) wurde in 50 ml 2xYT-Medium (1,6% (Gew./Vol.) Bacto-Trypton, 1,0% (Gew./Vol.) Bacto-Hefeextrakt, 0,5% (Gew./Vol.) NaCl, pH 7,0), das in einer 500-ml-Sakaguchi-Flasche sterilisiert wurde, geimpft und unter Schütteln bei 37°C für 16 Stunden gezüchtet. 680 Einheiten GHD (hergestellt durch Amano Pharmaceutical Co., Ltd.), 5,0 g Glucose, 3,0 mg NADP und 4,5 g tert-Butyl-(S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoat wurden zu 25 ml der entstandenen Kultur zugegeben. Die Kultur wurde bei 30°C für 40 Stunden gerührt, während der pH-Wert mit einer 5 M wässrigen Natriumhydroxidlösung auf 6,5 eingestellt wurde. Nach der Umsetzung wurde die Reaktionslösung einer Extraktion unter Verwendung von Ethylacetat unterzogen und ein Extrakt wurde nach der Entfernung des Lösungsmittels analysiert. Als Ergebnis wurde gefunden, dass tert-Butyl-(3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoat mit einer Ausbeute von 96,9% hergestellt wurde. Der Überschussanteil des Diastereomers tert-Butyl-(3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoat war 98,2% de.
Die Quantifizierung von tert-Butyl-(S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoat und tert-Butyl-(3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoat und die Messung des Diastereomeren-Verhältnis von tert-Butyl-(3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoat wurden mit Hochleistungflüssigchromatographie (Säule: COSMOSIL 5CN-R (ID 4,6 × 250 nm), hergestellt durch Nacalai Tesque Co., Ltd.; Elutionsmittel: 1 mM Phosphatlösung/Acetonitril = 5/1; Flussrate: 0,7 ml/min, Detektion: 210 nm; Säulentemperatur: 30°C) durchgeführt.
(Beispiel 9: Synthese von tert-Butyl-(3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoat aus tert-Butyl-(S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoat unter Verwendung von rekombinantem E. coli mit gleichzeitiger Expression von CR-Enzym und GDH)
Der in Beispiel 4 erhaltene rekombinante E. coli HB101 (pNTCRG) wurde in 100 ml 2xYT-Medium (1,6% (Gew./Vol.) Bacto-Trypton, 1,0% (Gew./Vol.) Bacto-Hefeextrakt, 0,5% (Gew./Vol.) NaCl, pH 7,0), das in einer 500-ml-Sakaguchi-Flasche sterilisiert wurde, geimpft und unter Schütteln bei 37°C für 16 Stunden gezüchtet. 5,0 g Glucose, 1,5 mg NADP und 5,0 g tert-Butyl-(S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoat wurden zu 25 ml der entstandenen Kultur zugegeben. Die Kultur wurde bei 30°C für 24 Stunden gerührt, während der pH-Wert mit einer 5 M wässrigen Natriumhydroxidlösung auf 6,5 eingestellt wurde. Nach der Umsetzung wurde die Reaktionslösung einer Extraktion unter Verwendung von Ethylacetat unterzogen und ein Extrakt wurde nach der Entfernung des Lösungsmittels analysiert. Als Ergebnis wurde gefunden, dass tert-Butyl-(3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoat mit einer Ausbeute von 97,2% hergestellt wurde. Der Überschussanteil des Diastereomers tert-Butyl-(3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoat war 98,5% de.
INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
Es ist möglich, Gene von Polypeptiden mit Enzymaktivität zur asymmetrischen Reduktion von tert-Butyl-(S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoat zu tert-Butyl-(3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoat zu clonieren und durch Analyse der Nukleotidsequenzen der Gene Transformanten mit einem hohem Grad an Leistungsfähigkeit zur Herstellung der Polypeptide zu erhalten. Weiterhin ist es möglich, Transformanten zu erhalten, die in der Lage sind, die Polypetide und Glucose-Dehydrogenase gleichzeitig in einem großen Ausmaß zu erhalten. Des weiteren ist es möglich, tert-Butyl-(3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoat aus tert- Butyl-(S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoat unter Verwendung der Transformanten zu synthetisieren.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Polynucleotid, das ein Polypeptid mit einer Enzymaktivität zur asymmetrischen Reduktion von tert-Butyl-(S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoat zu tert-Butyl-(3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoat codiert, wobei das Polynucleotid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) Polynucleotiden, die ein Polypeptid codieren, das die Aminosäuresequenz dargestellt durch SEQ ID NR:1 des Sequenzprotokolls umfasst; (b) Polynucleotiden, die die Nukleotidsequenz von SEQ ID NR:2 des Sequenzprotokolls umfassen; und (c) Polynucleotiden, die mit der Nukleotidsequenz, dargestellt durch SEQ ID NR:2 des Sequenzprotokolls, unter stringenten Bedingungen hybridisieren.
Expressionsvektor, der ein Polynucleotid nach Anspruch 1 umfasst.
Expressionsvektor nach Anspruch 2, wobei der Expressionsvektor das Plasmid pNTCR ist wie im E. coli-Stamm enthalten, der als FERM BP-6897 hinterlegt ist.
Expressionsvektor nach Anspruch 2, der weiterhin ein Polynucleotid einschließt, das ein Polypeptid mit Glucose-Dehydrogenase-Aktivität codiert.
Expressionsvektor nach Anspruch 4, wobei das Polypeptid mit Glukose-Dehydrogenase-Aktivität eine Glukose-Dehydrogenase aus Bacillus megaterium ist.
Expressionsvektor nach Anspruch 5, wobei der Expressionsvektor das Plasmid pNTCRG ist wie im E. coli-Stamm enthalten, der als FERM BP-6898 hinterlegt ist.
Transformant, der durch Transformation einer Wirtszelle unter Verwendung eines Expressionsvektors nach einem der Ansprüche 2 bis 6 erhalten wird.
Transformant nach Anspruch 7, wobei die Wirtszelle Escherichia coli ist.
Transformant nach Anspruch 8, wobei der Transformant E, coli HB101 (pNTCR) (FERM BP-6897) ist.
Transformant nach Anspruch 8, wobei der Transformant E. coli HB101 (pNTCRG) (FERM BP-6898) ist.
Polypeptid, das durch ein Polynucleotid nach Anspruch 1 codiert wird.
Verfahren zur Herstellung von tert-Butyl-(3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoat umfassend die Schritte: Reaktion eines Transformanten nach einem der Ansprüche 7 bis 10 oder eines davon prozessierten Produkts mit tert-Butyl-(S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoat, und das Sammeln des hergestellten tert-Butyl-(3R, 5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoats.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei der Reaktionsschritt in Gegenwart eines Coenzym-Reaktivierungs-Systems erfolgt.